CN107686843A - 一种基于腺病毒AdC6的表达载体及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种制备腺病毒表达载体的方法，所述方法包括：以野生型腺病毒AdC6基因组为基础，通过基因组直接克隆方法，删除E1编码区和E3编码区，在E1删除区插入I‑Ceu I和PI‑Sce I酶切位点，获得复制缺陷性的重组腺病毒表达载体。本发明通过in‑fusion连接的方法，构建大片段质粒，不受限制性酶切位点的限制，可以用于任何大片段载体的构建；本发明通过几次连接可以构建完成腺病毒表达载体，步骤简单；本发明删除E1和E3区，通过PCR扩增DNA片段的过程中就能够完成删除；本发明在细菌水平筛选阳性克隆更加容易、快捷，而且缩短了腺病毒载体构建时间。

Description

一种基于腺病毒AdC6的表达载体及其构建方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种用于基因治疗和疫苗载体的重组腺病毒载体及其构建方法。

背景技术

腺病毒 （adenovirus, Ad）作为基因表达载体的研制起始于20世纪60年代初，当时病毒学家观察到腺病毒基因组可与猴类病毒 40（SV40）基因组杂交，说明腺病毒基因组可承载异源性基因。此后腺病毒逐步发展成一种重要的载体系统。

目前，已经鉴别了57种不同的腺病毒血清型，重组腺病毒载体在基因治疗和疫苗载体方面得到了很多的应用，尤其是人血清5型腺病毒，它也是当前肿瘤基因治疗和人类免疫缺陷病毒（HIV）疫苗的研究的主要病毒载体。另外，诸如乙肝病毒、疟疾、结核等病原体的疫苗研制也都十分重视5型腺病毒载体的应用。

然而，由于人体内普遍存在抗Ad5腺病毒本身的免疫反应，这种预存的免疫反应包括抗腺病毒中和抗体和针对腺病毒的杀伤性T细胞，从而抑制其进入机体细胞而其所携带的目的基因就得不到预期水平的表达甚至是完全不表达，此外具有交叉性的针对腺病毒载体的细胞免疫反应会杀死已经感染了腺病毒载体的靶细胞从而阻断外源基因的持续表达。总之，预存免疫反应会大大降低基于腺病毒载体的疫苗免疫或者基因治疗的效果。

为了克服预存免疫反应对腺病毒载体的影响，研究者们尝试了多种方法：（1）利用新方法运载重组Ad5载体；（2）对Ad5载体进行基因工程改造；（3）从其它人体腺病毒血清型甚至其他动物种属中开发新的重组腺病毒载体。由于人群中一般不会含有抗黑猩猩型腺病毒的中和抗体，因此基于黑猩猩型腺病毒的疫苗载体，其免疫效果显著优于以人血清型腺病毒构建的疫苗载体。该方法具体是以源于黑猩猩型腺病毒6型，改造为复制缺陷型的腺病毒载体

构建重组腺病毒载体的方法有三种。传统的方法是在包装病毒细胞系中进行外源基因和野生型病毒的同源重组，从而获得重组腺病毒，但这种方法操作复杂，不容易获得单一的重组腺病毒；第二种方法是基于在大肠杆菌中同源重组，其缺点是相对费时，容易发生突变；第三种方法是将像病毒基因组直接克隆到质粒载体，然后线性化转染包装细胞系，包装出腺病毒。

发明内容

为了弥补已有技术的缺陷，本发明提供一种基于腺病毒AdC6的表达载体及其构建方法。

本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现：

一种制备腺病毒表达载体的方法，所述方法包括：以野生型腺病毒AdC6基因组为基础，通过基因组直接克隆方法，删除E1编码区和E3编码区，在E1删除区插入I-Ceu I和PI-Sce I酶切位点，获得复制缺陷性的重组腺病毒表达载体；其中，野生型腺病毒AdC6基因组的genebank登录号为AY530877。

进一步地，所述的删除E1编码区是指删除野生型AdC6基因组中第492-3022位的碱基序列。

进一步地，所述的删除E3编码区是指删除野生型AdC6基因组中第17895-31909位的碱基序列。

进一步地，制备腺病毒表达载体的方法包括：

（1）PCR扩增AdC6腺病毒基因组的LITR片段(1-492)（基于genebank登录号AY530877的序列计算序列位点），用PmeI和BatApI酶切pNEB193质粒和PCR产物，连接形成质粒pNEB193-PB；

（2）用SnaBI和NdeI酶切PUC57-linker和pNEB193-PB，连接，获得质粒为Pneb193-PB+linker；

（3）PCR扩增AdC6腺病毒基因组从3022位至9022位片段，PCR扩增AdC6腺病毒基因组从9002位至16002位片段和PCR扩增AdC6腺病毒基因组从15982位至22000位片段（基于genebank登录号AY530877的序列计算序列位点），用NdeI 和MluI酶切质粒Pneb193-PB +linker，通过Takara的快速连接试剂盒连接4个片段，获得质粒pNEB193-DE1；

（4）PCR扩增AdC6腺病毒基因组从21980位至27895位片段和PCR扩增AdC6腺病毒基因组从31909位至36604位片段，用EcoRV和HpaI酶切线性化质粒pNEB193-DE1，通过Takara的快速连接试剂盒连接3个DNA片段，获得质粒pNEB193-DE1E3，即为复制缺陷型的重组腺病毒表达载体。

在本发明的另一方面，提供一种腺病毒表达载体，所述表达载体在野生型腺病毒AdC6基因组基础上删除E1和E3编码区，并且在E1删除区插入I-Ceu I和PI-Sce I酶切位点。

进一步地，所述腺病毒表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示。

在另外的一选例中，所述表达载体的酶切位点I-Ceu I和PI-Sce I之间，还包括外源的抗原编码基因。

进一步地，所述外源的抗原是丙肝病毒的非结构蛋白NS3的抗原。

在本发明的另外一方面，提供一种制备疫苗的方法，所述方法包括：

（1）提供所述的腺病毒表达载体；

（2）将外源的抗原编码基因插入到（1）中腺病毒表达载体的酶切位点I-Ceu I和PI-SceI之间；

（3）将步骤（2）的重组表达载体转染包装病毒细胞，病毒在细胞内包装完成，从而获得具有免疫原性的疫苗。

本发明具有如下有益效果：

（1）本发明人经过深入的研究，设计了一种有效的方法，成功地基于黑猩猩型腺病毒AdC6构建成一种新型表达载体，所述的疫苗载体可应用于制备高效表达且具有良好免疫原性的病毒疫苗。

（2）本发明通过in-fusion连接的方法，构建大片段质粒，不受限制性酶切位点的限制，可以用于任何大片段载体的构建；本发明通过几次连接可以构建完成腺病毒表达载体，步骤简单；本发明在删除E1和E3区，在 PCR扩增DNA片段的过程中就能够完成；本发明在细菌水平筛选阳性克隆更加容易、快捷，而且缩短了腺病毒载体构建时间。

（3）本发明的载体构建的方法可以适用于一切腺病毒载体的构建，能被普遍推广应用于所有生物医学实验室，并且对腺病毒内部序列可以进行优化改造，构建各种特异的腺病毒载体。

附图说明

图1为AdC6基因组DNA的酶切鉴定结果。

图2为重组腺病毒载体pNEB193-DE1E3的酶切鉴定结果。

图3为构建重组腺病毒AdC6-eGFP，其中

A：重组腺病毒载体AdC6-eGFP的酶切鉴定结果；

B: 重组腺病毒AdC6-eGFP的噬斑形成。

图4为构建重组腺病毒AdC6-NS3，其中，

A: pNEB193-DE1E3-NS3的酶切鉴定结果；

B:检测NS3蛋白的表达。

图5为构建复制缺陷性腺病毒载体pNEB193-DE1E3的流程图。

具体实施方式

本发明提供了一种腺病毒表达载体，所述表达载体包括：在野生型腺病毒AdC6基因组基础上删除E1和E3编码区，且在E1删除区插入酶切位点I-Ceu I和PI-Sce I。

经过仔细的分析AdC6基因组，最终确认应用酶切位点I-Ceu I和PI-Sce I作为外源基因的插入位点，此酶切位点不存在于腺病毒表达载体的其它位置。

黑猩猩型腺病毒AdC6，即SadV23，从黑猩猩体内分离得到。本发明以野生型AdC6为基础，通过基因组直接克隆方法，删除E1和E3编码区，在E1删除区插入酶切位点I-Ceu I和PI-Sce I，最终获得复制缺陷性的AdC6重组腺病毒表达载体。

本发明还提供了一种制备腺病毒表达载体的方法，所述方法包括：以野生型腺病毒AdC6基因组为基础，删除E1和E3编码区，在E1删除区插入酶切位点I-Ceu I和PI-Sce I，最终获得复制缺陷性的AdC6重组腺病毒表达载体。

作为本发明的优选方式，克隆步骤包括： （1）PCR扩增AdC6腺病毒基因组的LITR片段（约450bp），用PmeI和BatApI酶切pNEB193质粒和PCR产物，连接形成质粒pNEB193-PB；（2）用SnaBI和NdeI酶切PUC57-linker和pNEB193-PB质粒，连接成质粒Pneb193-PB +linker；（3） PCR分别扩增AdC6腺病毒基因组从3022位至9022位片段，从9002位至16002位片段和15982位至22000位片段，用NdeI 和MluI酶切质粒Pneb193-PB +linker，通过Takara的快速连接试剂盒连接4个DNA片段，获得质粒pNEB193-DE1；（4） PCR分别扩增AdC6腺病毒基因组从21980位至27895位片段和从31909位至36604位DNA片段，用EcoRV和HpaI酶切线性化质粒pNEB193-DE1，通过Takara的快速连接试剂盒连接3个DNA片段，获得质粒pNEB193-DE1E3。

获得腺病毒表达载体之后，将其转染入包装病毒细胞，进行病毒的扩增。转染一段时间后，可以收获病毒。收获的病毒可以反复感染病毒包装细胞系，持续传代。

本发明的复制缺陷性的腺病毒载体作为一种表达载体平台，适用于表达多种抗原，从而制备病毒疫苗。

为了验证AdC6的有效性，本发明将绿色荧光蛋白基因克隆入AdC6载体，研究显示AdC6载体能高表达抗原基因，证明本发明获得了一种新型的腺病毒载体，可用于疫苗研发以及其它生物医学基础研究，为新型疫苗研发提供一种新型的载体平台。

本发明通过腺病毒基因组直接克隆的方法，利用HOST08大肠杆菌稳定转化体系，极大程度上降低了腺病毒发生突变的可能，获得的重组腺病毒载体遗传稳定性好。因此，医用本发明构建的腺病毒载体表达外源基因将更稳定。本发明利用体外in-fusion的PCR的方法构建腺病毒载体，在细菌水平筛选阳性克隆更加容易、快捷，而且缩短了腺病毒载体构建时间。而且本发明的载体构建的方法可以适用于一切腺病毒载体的构建，能被普遍推广应用于所以生物医学实验室，并且对腺病毒内部序列可以进行优化改造，构建各种特异的腺病毒载体。因此，本发明不仅提供了一种新的腺病毒表达载体，而且提供了一种新型的腺病毒构建方法，有利于促进腺病毒载体在生物医学基础研究领域和临床开发方面的应用。

下面结合具体实例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不是限制本发明的范围。下列实例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J. 萨姆布鲁克等编著的分子克隆指南第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或者按照试剂的说明书的条件。

材料

1.1病毒株和细胞

野生型腺病毒AdC6购于ATCC(VR-592 )；293A细胞株本实验室保存，培养基为10%胎牛血清（FBS）的DMEM。

限制性内切酶、菌种和质粒

限制性内切酶购自New England Biolabs；DH5α感受态购自于天根生化科技有限公司；E.coli HST08感受态购自于Takara。

pHAGE-CMV-MCS-eGFP质粒由实验室保存。

pDC315-NS3-5B (HCV)质粒由实验室保存。

pShuttle2-CMV-Flag载体购于Addgene。

pUC57-Linker质粒：linker序列（SEQ ID NO：1）由北京华大基因合成并克隆至pUC57载体上，获得pUC57-Linker。

快速连接试剂盒

In-Fusion 快速克隆试剂盒购自Takara （货号：638912）

2方法

2.1 腺病毒的扩增与纯化

293A细胞在含有10%FBS的DMEM培养基培养，AdC6腺病毒在293A细胞中培养增值，当细胞全部表现出病毒病变（CPE）后，收集感染的细胞，离心，用DMEM重悬，反复冻融细胞三次，使细胞裂解释放出病毒。病毒经过CsCl密度梯度离心纯化，加入甘油保存于-80摄氏度。

提取腺病毒基因组DNA

AdC6腺病毒纯化后，用标准方法提取基因组DNA。用AgeI酶切鉴定基因组DNA。

构建复制缺陷性的的腺病毒载体

2.3.1 构建质粒pNEB193

用限制性内切酶EcoRI和HindIII消化pUC19质粒，通过梯度降温连接如下的含有多克隆位点的DNA片段，获得pNEB193质粒。多克隆位点的DNA序列如下：

F:5-AATTCGAGCTCGGTACCCGGGGGCGCGCCGGATCCTTAATTAAGTCTAGAGTCGACTGTTTAAACCTGCAGGCATGCA-3（SEQ ID NO：2）

R:5-AGCTTGCATGCCTGCAGGTTTAAACAGTCGACTCTAGACTTAATTAAGGATCCGGCGCGCCCCCGGGTACCGAGCTCG-3（SEQ ID NO：3）

2.3.2 构建质粒pNEB193-PB

以AdC6腺病毒基因组为模版，用如下的引物PCR扩增得到PmeI到BatApI约450bp，用PmeI和BatApI酶切PCR产物和pNEB193，连接，获得质粒：pNEB193-PB。含有限制性内切酶位点PmeI和BatApI的引物如下：

F:5-GGGTTTAAACCCGCGATCGCGCATCATCAATAATATACCTCAAAC-3（SEQ ID NO：4）

R:5-AAGGGCACCATCTGCACGCGTCGCCATATGGAATACGTAAAAACACCGGACTTTG-3（SEQ ID NO：5）

2.3.3 构建质粒pNEB193-PB +linker

用SnaBI和NdeI酶切PUC57-linker和pNEB193-PB质粒，连接成质粒Pneb193-PB +linker。

构架质粒pNEB193-DE1

以AdC6腺病毒基因组为模版，用引物1和2 PCR扩增3022位至9022位DNA片段，用引物3和4 PCR扩增从9002位至16002位DNA片段，用引物5和6 （表1）PCR扩增从15982位至22000位（基于genebank登录号AY530877的序列计算序列位点）DNA片段，再用NdeI 和MluI酶切质粒pNEB193-PB +linker，胶回收四段DNA片段，用Takara的快速连接试剂盒连接获得质粒pNEB193-DE1。

表1

2.3.5 构建质粒pNEB193-DE1E3

以AdC6腺病毒基因组为模版，用引物D1和D2 PCR扩增AdC6腺病毒基因组从21980位至27895位DNA片段，用引物D3和D4 （表2） PCR扩增AdC6腺病毒基因组从31909位至36604位（基于genebank登录号AY530877的序列计算序列位点）DNA片段，用EcoRV和HpaI酶切线性化质粒pNEB193-DE1，分别胶回收三段DNA片段，用Takara的快速连接试剂盒连接获得质粒pNEB193-DE1E3。

pNEB193-DE1E3的核苷酸序列如SEQ ID NO：16。

表2

2.4 构建重组腺病毒pNEB193-DE1E3-eGFP（AdC6-eGFP）

2.4.1 将eGFP基因克隆至pNEB193-DE1E3

以EcoRI和BamHI分别双酶切pHAGE-CMV-MCS-eGFP和pShuttle2-CMV-Flag质粒，琼脂糖凝胶回收目的片段，连接获得载体pShuttle2-CMV-eGFP。用I-Ceu I和PI-Sce I分别酶切pShuttle2-CMV-eGFP和pNEB193-DE1E3，琼脂糖凝胶电泳回收DNA片段，连接，转化，鉴定，获得pNEB193-DE1E3-eGFP

2.4.2 包装AdC6-eGFP重组腺病毒

用SgfI酶切线性化pNEB193-DE1E3-eGFP质粒（eGFP核苷酸序列SEQ ID NO：17）。用293A细胞铺六孔板，当细胞融合度到70%-80%时，用X-tremeGENE(Roche)转染约2ug已线性化的pNEB193-DE1E3-eGFP。每天观察细胞荧光的情况。

2.5构建重组腺病毒pNEB193-DE1E3-NS3(AdC6-NS3)

2.5.1 将HCV的NS3基因克隆至pNEB193-DE1E3

用EcoRI和BamHI双酶切pShuttle2-CMV-Flag质粒，胶回收载体部分片段，以pDC315-NS3-5B质粒为模版，用引物E1和E2 （表3）PCR扩增NS3的基因片段，通过Takara的快速连接试剂盒，连接，转化，鉴定，获得pShuttle2-CMV-NS3（NS3核苷酸序列SEQ ID NO：18）。用I-Ceu I和PI-Sce I分别酶切pShuttle2-CMV-NS3和pNEB193-DE1E3，琼脂糖凝胶电泳回收DNA片段，连接，转化，鉴定，获得pNEB193-DE1E3-NS3。

2.5.2包装AdC6-NS3重组腺病毒

用SgfI酶切线性化pNEB193-DE1E3-NS3质粒。用293A细胞铺六孔板，当细胞融合度到70%-80%时，用X-tremeGENE(Roche)转染约2ug已线性化的pNEB193-DE1E3-NS3。每天观察细胞是否有病变。

扩增与纯化重组腺病毒AdC6-NS3

293A细胞在含有10%FBS的DMEM培养基培养，AdC6-NS3腺病毒在293A细胞中培养扩增。重组腺病毒感染293A细胞后，当细胞全部出现细胞病变（CPE），收集被感染的细胞，离心。用DMEM重悬细胞，反复冻融细胞三次，使细胞裂解。病毒经过CsCl密度梯度离心纯化，然后用病毒保存液冻存于-80℃冰箱。

酶切鉴定AdC6-NS3

AdC6-NS3腺病毒纯化之后，用标准方法提取基因组DNA。用AgeI、HindIII和SphI分别酶切做鉴定。

检测HCV的NS3的表达

用293A细胞铺六孔板。当细胞融合度达到80-90%时，用AdC6-NS3病毒去感染细胞，同时用AdC6病毒去感染细胞，24小时之后收细胞，western blot 检测NS3的表达。

实施例

实施例1、腺病毒的扩增、纯化与腺病毒基因组的提取

野生型AdC6在293A细胞中增值，经过CsCl密度梯度离心得到纯化的病毒，之后提取病毒基因组DNA，用AgeI酶切鉴定，进行琼脂糖电泳，结果显示扩增和纯化的病毒是AdC6的腺病毒，实验结果请参阅图1。

实施例2构建复制缺陷性的腺病毒载体

按照图5所示的流程图，PCR扩增AdC6腺病毒基因组的LITR片段（约450bp），用PmeI和BatApI酶切pNEB193质粒和PCR产物，连接形成质粒pNEB193-PB。

用SnaBI和NdeI酶切PUC57-linker和pNEB193-PB质粒，连接成质粒Pneb193-PB+linker。

PCR分别扩增AdC6腺病毒基因组从3022位至9022位片段，从9002位至16002位片段和15982位至22000位片段，用NdeI 和MluI酶切质粒Pneb193-PB +linker，通过Takara的快速连接试剂盒连接4个DNA片段，获得质粒pNEB193-DE1。

PCR分别扩增AdC6腺病毒基因组从21980位至27895位片段和从31909位至36604位DNA片段，用EcoRV和HpaI酶切线性化质粒pNEB193-DE1，通过Takara的快速连接试剂盒连接3个DNA片段，获得质粒pNEB193-DE1E3。

用AgeI、HindIII和SphI分别酶切pNEB193-DE1E3，进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果显示pNEB193-DE1E3为正确目的载体。实验结果请参阅图2。

实施例3、构建重组腺病毒AdC6-eGFP

将eGFP基因片段克隆至pNEB193-DE1E3之后，重组腺病毒载体AdC6-eGFP的 酶切鉴定结果请参阅图3A。

参阅图3B，重组载体AdC6-eGFP线性化之后转染293A细胞，第十天出现细胞病变，随后细胞病变逐渐扩大。

实施例4、构建重组腺病毒AdC6-NS3

将HCV的NS3基因克隆至pNEB193-DE1E3之后，线性化质粒转染如293A细胞，包装出病毒。扩增、纯化病毒之后，提基因组酶切鉴定，请参阅图4A。

用重组的复制缺陷性的AdC6-NS3和空载的AdC6病毒分别感染293A细胞，24小时之后，收集细胞，Weatern blot的检测NS3的表达，请参阅图4B。

结论

通过以上病毒基因组直接克隆的方法，本发明将野生型腺病毒AdC6构建成能稳定表达外源基因的载体。因此本发明为新型疫苗的研发以及生物医学的基础研究提供了一种基于AdC6的新型表达载体，同时提供了一种新型的构建腺病毒载体的方法。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 南方医科大学

<120> 一种基于腺病毒AdC6的表达载体及其构建方法

<141> 2017-09-11

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 165

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgctacgtac gatatcattt ccccgaaagt gccacctgac cgtaactata acggtcctaa 60

ggtagcgaag catctatgtc gggtgcggag aaagaggtaa tgaaatggca ttatgggtat 120

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<210> 2

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aattcgagct cggtacccgg gggcgcgccg gatccttaat taagtctaga gtcgactgtt 60

taaacctgca ggcatgca 78

<210> 3

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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aagggcacca tctgcacgcg tcgccatatg gaatacgtaa aaacaccgga ctttg 55

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<212> DNA

<213> 人工序列

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gacgaagaag tacatgatcc 20

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acctgggctc ccgccgaggc atgttcatgc cctaccagtg caacatgcaa tttgtgaagg 1020

tgctgctgga gcccgatgcc atgtccagag tgagcctgac gggggtgttt gacatgaatg 1080

tggagctgtg gaaaattctg agatatgatg aatccaagac caggtgccgg gcctgcgaat 1140

gcggaggcaa gcacgccagg cttcagcccg tgtgtgtgga ggtgacggag gacctgcgac 1200

ccgatcattt ggtgttgtcc tgcaacggga cggagttcgg ctccagcggg gaagaatctg 1260

actagagtga gtagtgtttg gggctgggtg tgagcctgca tgaggggcag aatgactaaa 1320

atctgtggtt ttctgtgtgt tgcagcagca tgagcggaag cgcctccttt gagggagggg 1380

tattcagccc ttatctgacg gggcgtctcc cctcctgggc gggagtgcgt cagaatgtga 1440

tgggatccac ggtggacggc cggcccgtgc agcccgcgaa ctcttcaacc ctgacctacg 1500

cgaccctgag ctcctcgtcc gtggacgcag ctgccgccgc agctgctgct tccgccgcca 1560

gcgccgtgcg cggaatggcc ctgggcgccg gctactacag ctctctggtg gccaactcga 1620

gttccaccaa taatcccgcc agcctgaacg aggagaagct gctgctgctg atggcccagc 1680

tcgaggccct gacccagcgc ctgggcgagc tgacccagca ggtggctcag ctgcaggcgg 1740

agacgcgggc cgcggttgcc acggtgaaaa ccaaataaaa aatgaatcaa taaataaacg 1800

gagacggttg ttgattttaa cacagagtct tgaatcttta tttgattttt cgcgcgcggt 1860

aggccctgga ccaccggtct cgatcattga gcacccggtg gatcttttcc aggacccggt 1920

agaggtgggc ttggatgttg aggtacatgg gcatgagccc gtcccggggg tggaggtagc 1980

tccattgcag ggcctcgtgc tcggggatgg tgttgtaaat cacccagtca tagcaggggc 2040

gcagggcgtg gtgctgcacg atgtccttga ggaggagact gatggccacg ggcagcccct 2100

tggtgtaggt gttgacgaac ctgttgagct gggagggatg catgcggggg gagatgagat 2160

gcatcttggc ctggatcttg agattggcga tgttcccgcc cagatcccgc cgggggttca 2220

tgttgtgcag gaccaccagc acggtgtatc cggtgcactt ggggaatttg tcatgcaact 2280

tggaagggaa ggcgtgaaag aatttggaga cgcccttgtg accgcccagg ttttccatgc 2340

actcatccat gatgatggcg atgggcccgt gggcggcggc ctgggcaaag acgtttcggg 2400

ggtcggacac atcgtagttg tggtcctggg tgagctcgtc ataggccatt ttaatgaatt 2460

tggggcggag ggtgcccgac tgggggacga aggtgccctc gatcccgggg gcgtagttgc 2520

cctcgcagat ctgcatctcc caggccttga gctcggaggg ggggatcatg tccacctgcg 2580

gggcgatgaa aaaaacggtt tccggggcgg gggagatgag ctgggccgaa agcaggttcc 2640

ggagcagctg ggacttgccg caaccggtgg ggccgtagat gaccccgatg accggctgca 2700

ggtggtagtt gagggagaga cagctgccgt cctcgcggag gaggggggcc acctcgttca 2760

tcatctcgcg cacatgcatg ttctcgcgca cgagttccgc caggaggcgc tcgcccccca 2820

gcgagaggag ctcttgcagc gaggcgaagt ttttcagcgg cttgagtccg tcggccatgg 2880

gcattttgga gagggtctgt tgcaagagtt ccagacggtc ccagagctcg gtgatgtgct 2940

ctagggcatc tcgatccagc agacctcctc gtttcgcggg ttggggcgac tgcgggagta 3000

gggcaccagg cgatgggcgt ccagcgaggc cagggtccgg tccttccagg gccgcagggt 3060

ccgcgtcagc gtggtctccg tcacggtgaa ggggtgcgcg ccgggctggg cgcttgcgag 3120

ggtgcgcttc aggctcatcc ggctggtcga gaaccgctcc cggtcggcgc cctgcgcgtc 3180

ggccaggtag caattgagca tgagttcgta gttgagcgcc tcggccgcgt ggcccttggc 3240

gcggagctta cctttggaag tgtgtccgca gacgggacag aggagggact tgagggcgta 3300

gagcttgggg gcgaggaaga cggactcggg ggcgtaggcg tccgcgccgc agctggcgca 3360

gacggtctcg cactccacga gccaggtgag gtcggggcgg ttggggtcaa aaacgaggtt 3420

tcctccgtgc tttttgatgc gtttcttacc tctggtctcc atgagctcgt gtccccgctg 3480

ggtgacaaag aggctgtccg tgtccccgta gaccgacttt atgggccggt cctcgagcgg 3540

ggtgccgcgg tcctcgtcgt agaggaaccc cgcccactcc gagacgaagg cccgggtcca 3600

ggccagcacg aaggaggcca cgtgggaggg gtagcggtcg ttgtccacca gcgggtccac 3660

cttctccagg gtatgcaagc acatgtcccc ctcgtccaca tccaggaagg tgattggctt 3720

gtaagtgtag gccacgtgac cgggggtccc ggccgggggg gtataaaagg gggcgggccc 3780

ctgctcgtcc tcactgtctt ccggatcgct gtccaggagc gccagctgtt ggggtaggta 3840

ttccctctcg aaggcgggca tgacctcggc actcaggttg tcagtttcta gaaacgagga 3900

ggatttgata ttgacggtgc cgttggagac gcctttcatg agcccctcgt ccatttggtc 3960

agaaaagacg atctttttgt tgtcgagctt ggtggcgaag gagccgtaga gggcgttgga 4020

gagcagcttg gcgatggagc gcatggtctg gttcttttcc ttgtcggcgc gctccttggc 4080

ggcgatgttg agctgcacgt actcgcgcgc cacgcacttc cattcgggga agacggtggt 4140

gagctcgtcg ggcacgattc tgacccgcca gccgcggttg tgcagggtga tgaggtccac 4200

gctggtggcc acctcgccgc gcaggggctc gttggtccag cagaggcgcc cgcccttgcg 4260

cgagcagaag gggggcagcg ggtccagcat gagctcgtcg ggggggtcgg cgtccacggt 4320

gaagatgccg ggcaggagct cggggtcgaa gtagctgatg caggtgccca gattgtccag 4380

cgccgcttgc cagtcgcgca cggccagcgc gcgctcgtag gggctgaggg gcgtgcccca 4440

gggcatgggg tgcgtgagcg cggaggcgta catgccgcag atgtcgtaga cgtagagggg 4500

ctcctcgagg acgccgatgt aggtggggta gcagcgcccc ccgcggatgc tggcgcgcac 4560

gtagtcgtac agctcgtgcg agggcgcgag gagccccgtg ccgaggttgg agcgttgcgg 4620

cttttcggcg cggtagacga tctggcggaa gatggcgtgg gagttggagg agatggtggg 4680

cctttggaag atgttgaagt gggcgtgggg caggccgacc gagtccctga tgaagtgggc 4740

gtaggagtcc tgcagcttgg cgacgagctc ggcggtgacg aggacgtcca gggcgcagta 4800

gtcgagggtc tcttggatga tgtcatactt gagctggccc ttctgcttcc acagctcgcg 4860

gttgagaagg aactcttcgc ggtccttcca gtactcttcg agggggaacc cgtcctgatc 4920

ggcacggtaa gagcccacca tgtagaactg gttgacggcc ttgtaggcgc agcagccctt 4980

ctccacgggg agggcgtaag cttgcgcggc cttgcgcagg gaggtgtggg tgagggcgaa 5040

ggtgtcgcgc accatgacct tgaggaactg gtgcttgaag tcgaggtcgt cgcagccgcc 5100

ctgctcccag agttggaagt ccgtgcgctt cttgtaggcg gggttaggca aagcgaaagt 5160

aacatcgttg aagaggatct tgcccgcgcg gggcatgaag ttgcgagtga tgcggaaagg 5220

ctggggcacc tcggcccggt tgttgatgac ctgggcggcg aggacgatct cgtcgaagcc 5280

gttgatgttg tgcccgacga tgtagagttc cacgaatcgc gggcggccct tgacgtgggg 5340

cagcttcttg agctcgtcgt aggtgagctc ggcggggtcg ctgagcccgt gctgctcgag 5400

ggcccagtcg gcgacgtggg ggttggcgct gaggaaggaa gtccagagat ccacggccag 5460

ggcggtctgc aagcggtccc ggtactgacg gaactgttgg cccacggcca ttttttcggg 5520

ggtgacgcag tagaaggtgc gggggtcgcc gtgccagcgg tcccacttga gctggagggc 5580

gaggtcgtgg gcgagctcga cgagcggcgg gtccccggag agtttcatga ccagcatgaa 5640

ggggacgagc tgcttgccga aggaccccat ccaggtgtag gtttccacat cgtaggtgag 5700

gaagagcctt tcggtgcgag gatgcgagcc gatggggaag aactggatct cctgccacca 5760

gttggaggaa tggctgttga tgtgatggaa gtagaaatgc cgacggcgcg ccgagcactc 5820

gtgcttgtgt ttatacaagc gtccgcagtg ctcgcaacgc tgcacgggat gcacgtgctg 5880

cacgagctgt acctgggttc ctttggcgag gaatttcagt gggcagtgga gcgctggcgg 5940

ctgcatctcg tgctgtacta cgtcttggcc atcggcgtgg ccatcgtctg cctcgatggt 6000

ggtcatgctg acgagcccgc gcgggaggca ggtccagacc tcggctcgga cgggtcggag 6060

agcgaggacg agggcgcgca ggccggagct gtccagggtc ctgagacgct gcggagtcag 6120

gtcagtgggc agcggcggcg cgcggttgac ttgcaggagc ttttccaggg cgcgcgggag 6180

gtccagatgg tacttgatct ccacggcgcc gttggtggct acgtccacgg cttgcagggt 6240

gccgtgcccc tggggcgcca ccaccgtgcc ccgtttcttc ttgggcgctg cttccatgtc 6300

ggtcagaagc ggcggcgagg acgcgcgccg ggcggcaggg gcggctcggg gcccggaggc 6360

aggggcggca ggggcacgtc ggcgccgcgc gcgggcaggt tctggtactg cgcccggaga 6420

agactggcgt gagcgacgac gcgacggttg acgtcctgga tctgacgcct ctgggtgaag 6480

gccacgggac ccgtgagttt gaacctgaaa gagagttcga cagaatcaat ctcggtatcg 6540

ttgacggcgg cctgccgcag gatctcttgc acgtcgcccg agttgtcctg gtaggcgatc 6600

tcggtcatga actgctcgat ctcctcctcc tgaaggtctc cgcggccggc gcgctcgacg 6660

gtggccgcga ggtcgttgga gatgcggccc atgagctgcg agaaggcgtt catgccggcc 6720

tcgttccaga cgcggctgta gaccacggct ccgtcggggt cgcgcgcgcg catgaccacc 6780

tgggcgaggt tgagctcgac gtggcgcgtg aagaccgcgt agttgcagag gcgctggtag 6840

aggtagttga gcgtggtggc gatgtgctcg gtgacgaaga agtacatgat ccagcggcgg 6900

agcggcatct cgctgacgtc gcccagggct tccaagcgtt ccatggcctc gtagaagtcc 6960

acggcgaagt tgaaaaactg ggagttgcgc gccgagacgg tcaactcctc ctccagaaga 7020

cggatgagct cggcgatggt ggcgcgcacc tcgcgctcga aggccccggg gggctcctct 7080

tccatctcct cctcttcctc ctccactaac atctcttcta cttcctcctc aggaggcggt 7140

ggcgggggag gggccctgcg tcgccggcgg cgcacgggca gacggtcgat gaagcgctcg 7200

atggtctccc cgcgccggcg acgcatggtc tcggtgacgg cgcgcccgtc ctcgcggggc 7260

cgcagcatga agacgccgcc gcgcatctcc aggtggccgc cgggggggtc tccgttgggc 7320

agggagaggg cgctgacgat gcatcttatc aattgacccg tagggactcc gcgcaaggac 7380

ctgagcgtct cgagatccac gggatccgaa aaccgctgaa cgaaggcttc gagccagtcg 7440

cagtcgcaag gtaggctgag cccggtttct tgttcttcgg gtatttggtc gggaggcggg 7500

cgggcgatgc tgctggtgat gaagttgaag taggcggtcc tgagacggcg gatggtggcg 7560

aggagcacca ggtccttggg cccggcttgc tggatgcgca gacggtcggc catgccccag 7620

gcgtggtcct gacacctggc gaggtccttg tagtagtcct gcatgagccg ctccacgggc 7680

acctcctcct cgcccgcgcg gccgtgcatg cgcgtgagcc cgaacccgcg ctgcggctgg 7740

acgagcgcca ggtcggcgac gacgcgctcg gtgaggatgg cctgctggat ctgggtgagg 7800

gtggtctgga agtcgtcgaa gtcgacgaag cggtggtagg ctccggtgtt gatggtgtag 7860

gagcagttgg ccatgacgga ccagttgacg gtctggtggc cgggtcgcac gagctcgtgg 7920

tacttgaggc gcgagtaggc gcgcgtgtcg aagatgtagt cgttgcaggc gcgcacgagg 7980

tactggtatc cgacgaggaa gtgcggcggc ggctggcggt agagcggcca tcgctcggtg 8040

gcgggggcgc cgggcgcgag gtcctcgagc atgaggcggt ggtagccgta gatgtacctg 8100

gacatccagg tgatgccggc ggcggtggtg gaggcgcgcg ggaactcgcg gacgcggttc 8160

cagatgttgc gcagcggcag gaagtagttc atggtggccg cggtctggcc cgtgaggcgc 8220

gcgcagtcgt ggatgctcta gacatacggg caaaaacgaa agcggtcagc ggctcgactc 8280

cgtggcctgg aggctaagcg aacgggttgg gctgcgcgtg taccccggtt cgaatctcga 8340

atcaggctgg agccgcagct aacgtggtac tggcactccc gtctcgaccc aagcctgcta 8400

acgaaacctc caggatacgg aggcgggtcg ttttttggcc ttggtcgctg gtcatgaaaa 8460

actagtaagc gcggaaagcg gccgcccgcg atggctcgct gccgtagtct ggagaaagaa 8520

tcgccagggt tgcgttgcgg tgtgccccgg ttcgagcctc agcgctcggc gccggccgga 8580

ttccgcggct aacgtgggcg tggctgcccc gtcgtttcca agacccctta gccagccgac 8640

ttctccagtt acggagcgag cccctctttt tttttcttgt gtttttgcca gatgcatccc 8700

gtactgcggc agatgcgccc ccaccctcca ccacaaccgc ccctaccgca gcagcagcaa 8760

cagccggcgc ttctgccccc gccccagcag cagccagcca ctaccgcggc ggccgccgtg 8820

agcggagccg gcgttcagta tgacctggcc ttggaagagg gcgaggggct ggcgcggctg 8880

ggggcgtcgt cgccggagcg gcacccgcgc gtgcagatga aaagggacgc tcgcgaggcc 8940

tacgtgccca agcagaacct gttcagagac aggagcggcg aggagcccga ggagatgcgc 9000

gcctcccgct tccacgcggg gcgggagctg cggcgcggcc tggaccgaaa gcgggtgctg 9060

agggacgagg atttcgaggc ggacgagctg acggggatca gccccgcgcg cgcgcacgtg 9120

gccgcggcca acctggtcac ggcgtacgag cagaccgtga aggaggagag caacttccaa 9180

aaatccttca acaaccacgt gcgcacgctg atcgcgcgcg aggaggtgac cctgggcctg 9240

atgcacctgt gggacctgct ggaggccatc gtgcagaacc ccacgagcaa gccgctgacg 9300

gcgcagctgt ttctggtggt gcagcacagt cgggacaacg agacgttcag ggaggcgctg 9360

ctgaatatca ccgagcccga gggccgctgg ctcctggacc tggtgaacat tttgcagagc 9420

atcgtggtgc aggagcgcgg gctgccgctg tccgagaagc tggcggccat caacttctcg 9480

gtgctgagtc tgggcaagta ctacgctagg aagatctaca agaccccgta cgtgcccata 9540

gacaaggagg tgaagatcga cgggttttac atgcgcatga ccctgaaagt gctgaccctg 9600

agcgacgatc tgggggtgta ccgcaacgac aggatgcacc gcgcggtgag cgccagccgc 9660

cggcgcgagc tgagcgacca ggagctgatg cacagcctgc agcgggccct gaccggggcc 9720

gggaccgagg gggagagcta ctttgacatg ggcgcggacc tgcgctggca gcccagccgc 9780

cgggccttgg aagctgccgg cggttccccc tacgtggagg aggtggacga tgaggaggag 9840

gagggcgagt acctggaaga ctgatggcgc gaccgtattt ttgctagatg cagcaacagc 9900

caccgccgcc gcctcctgat cccgcgatgc gggcggcgct gcagagccag ccgtccggca 9960

ttaactcctc ggacgattgg acccaggcca tgcaacgcat catggcgctg acgacccgca 10020

atcccgaagc ctttagacag cagcctcagg ccaaccggct ctcggccatc ctggaggccg 10080

tggtgccctc gcgctcgaac cccacgcacg agaaggtgct ggccatcgtg aacgcgctgg 10140

tggagaacaa ggccatccgc ggtgacgagg ccgggctggt gtacaacgcg ctgctggagc 10200

gcgtggcccg ctacaacagc accaacgtgc agacgaacct ggaccgcatg gtgaccgacg 10260

tgcgcgaggc ggtgtcgcag cgcgagcggt tccaccgcga gtcgaacctg ggctccatgg 10320

tggcgctgaa cgccttcctg agcacgcagc ccgccaacgt gccccggggc caggaggact 10380

acaccaactt catcagcgcg ctgcggctga tggtggccga ggtgccccag agcgaggtgt 10440

accagtcggg gccggactac ttcttccaga ccagtcgcca gggcttgcag accgtgaacc 10500

tgagccaggc tttcaagaac ttgcagggac tgtggggcgt gcaggccccg gtcggggacc 10560

gcgcgacggt gtcgagcctg ctgacgccga actcgcgcct gctgctgctg ctggtggcgc 10620

ccttcacgga cagcggcagc gtgagccgcg actcgtacct gggctacctg cttaacctgt 10680

accgcgaggc catcggacag gcgcacgtgg acgagcagac ctaccaggag atcacccacg 10740

tgagccgcgc gctgggccag gaggacccgg gcaacctgga ggccaccctg aacttcctgc 10800

tgaccaaccg gtcgcagaag atcccgcccc agtacgcgct gagcaccgag gaggagcgca 10860

tcctgcgcta cgtgcagcag agcgtggggc tgttcctgat gcaggagggg gccacgccca 10920

gcgcggcgct cgacatgacc gcgcgcaaca tggagcccag catgtacgcc cgcaaccgcc 10980

cgttcatcaa taagctgatg gactacttgc atcgggcggc cgccatgaac tcggactact 11040

ttaccaacgc catcttgaac ccgcactggc tcccgccgcc cgggttctac acgggcgagt 11100

acgacatgcc cgaccccaac gacgggttcc tgtgggacga cgtggacagc agcgtgttct 11160

cgccgcgtcc aggaaccaat gccgtgtgga agaaagaggg cggggaccgg cggccgtcct 11220

cggcgctgtc cggtcgcgcg ggtgctgccg cggcggtgcc cgaggccgcc agccccttcc 11280

cgagcctgcc cttttcgctg aacagcgtgc gcagcagcga gctgggtcgg ctgacgcgac 11340

cgcgcctgct gggcgaggag gagtacctga acgactcctt gttgaggccc gagcgcgaga 11400

agaacttccc caataacggg atagagagcc tggtggacaa gatgagccgc tggaagacgt 11460

acgcgcacga gcacagggac gagccccgag ctagcagcgc aggcacccgt agacgccagc 11520

ggcacgacag gcagcgggga ctggtgtggg acgatgagga ttccgccgac gacagcagcg 11580

tgttggactt gggtgggagt ggtggtaacc cgttcgctca cctgcgcccc cgtatcgggc 11640

gcctgatgta agaatctgaa aaaataaaag acggtactca ccaaggccat ggcgaccagc 11700

gtgcgttctt ctctgttgtt tgtagtagta tgatgaggcg cgtgtacccg gagggtcctc 11760

ctccctcgta cgagagcgtg atgcagcagg cggtggcggc ggcgatgcag cccccgctgg 11820

aggcgcctta cgtgcccccg cggtacctgg cgcctacgga ggggcggaac agcattcgtt 11880

actcggagct ggcacccttg tacgatacca cccggttgta cctggtggac aacaagtcgg 11940

cagacatcgc ctcgctgaac taccagaacg accacagcaa cttcctgacc accgtggtgc 12000

agaacaacga tttcaccccc acggaggcca gcacccagac catcaacttt gacgagcgct 12060

cgcggtgggg cggccagctg aaaaccatca tgcacaccaa catgcccaac gtgaacgagt 12120

tcatgtacag caacaagttc aaggcgcggg tgatggtctc gcgcaagacc cccaacgggg 12180

tggatgatga ttatgatggt agtcaggacg agctgaccta cgagtgggtg gagtttgagc 12240

tgcccgaggg caacttctcg gtgaccatga ccatcgatct gatgaacaac gccatcatcg 12300

acaactactt ggcggtgggg cggcagaacg gggtgctgga gagcgacatc ggcgtgaagt 12360

tcgacacgcg caacttccgg ctgggctggg accccgtgac cgagctggtg atgccgggcg 12420

tgtacaccaa cgaggccttc caccccgaca tcgtcctgct gcccggctgc ggcgtggact 12480

tcaccgagag ccgcctcagc aacctgctgg gcatccgcaa gcggcagccc ttccaggagg 12540

gcttccagat cctgtacgag gacctggagg ggggcaacat ccccgcgctc ttggatgtcg 12600

aagcctacga gaaaagcaag gaggatagca ccgccgcggc gaccgcagcc gtggccaccg 12660

cctctaccga ggtgcggggc gataattttg ctagcgctgc ggcagcggcc gaggcggctg 12720

aaaccgaaag taagatagtc atccagccgg tggagaagga cagcaaggac aggagctaca 12780

acgtgctcgc ggacaagaaa aacaccgcct accgcagctg gtacctggcc tacaactacg 12840

gcgaccccga gaagggcgtg cgctcctgga cgctgctcac cacctcggac gtcacctgcg 12900

gcgtggagca agtctactgg tcgctgcccg acatgatgca agacccggtc accttccgct 12960

ccacgcgtca agttagcaac tacccggtgg tgggcgccga gctcctgccc gtctactcca 13020

agagcttctt caacgagcag gccgtctact cgcagcagct gcgcgccttc acctcgctca 13080

cgcacgtctt caaccgcttc cccgagaacc agatcctcgt ccgcccgccc gcgcccacca 13140

ttaccaccgt cagtgaaaac gttcctgctc tcacagatca cgggaccctg ccgctgcgca 13200

gcagtatccg gggagtccag cgcgtgaccg tcactgacgc cagacgccgc acctgcccct 13260

acgtctacaa ggccctgggc gtagtcgcgc cgcgcgtcct ctcgagccgc accttctaaa 13320

aaatgtccat tctcatctcg cccagtaata acaccggttg gggcctgcgc gcgcccagca 13380

agatgtacgg aggcgctcgc caacgctcca cgcaacaccc cgtgcgcgtg cgcgggcact 13440

tccgcgctcc ctggggcgcc ctcaagggcc gcgtgcgctc gcgcaccacc gtcgacgacg 13500

tgatcgacca ggtggtggcc gacgcgcgca actacacgcc cgccgccgcg cccgtctcca 13560

ccgtggacgc cgtcatcgac agcgtggtgg ccgacgcgcg ccggtacgcc cgcaccaaga 13620

gccggcggcg gcgcatcgcc cggcggcacc ggagcacccc cgccatgcgc gcggcgcgag 13680

ccttgctgcg cagggccagg cgcacgggac gcagggccat gctcagggcg gccagacgcg 13740

cggcctccgg cagcagcagc gccggcagga cccgcagacg cgcggccacg gcggcggcgg 13800

cggccatcgc cagcatgtcc cgcccgcggc gcggcaacgt gtactgggtg cgcgacgccg 13860

ccaccggtgt gcgcgtgccc gtgcgcaccc gcccccctcg cacttgaaga tgctgacttc 13920

gcgatgttga tgtgtcccag cggcgaggag gatgtccaag cgcaaataca aggaagagat 13980

gctccaggtc atcgcgcctg agatctacgg ccccgcggcg gcggtgaagg aggaaagaaa 14040

gccccgcaaa ctgaagcggg tcaaaaagga caaaaaggag gaggaagatg acggactggt 14100

ggagtttgtg cgcgagttcg ccccccggcg gcgcgtgcag tggcgcgggc ggaaagtgaa 14160

accggtgctg cggcccggca ccacggtggt cttcacgccc ggcgagcgtt ccggctccgc 14220

ctccaagcgc tcctacgacg aggtgtacgg ggacgaggac atcctcgagc aggcggtcga 14280

gcgtctgggc gagtttgcgt acggcaagcg cagccgcccc gcgcccttga aagaggaggc 14340

ggtgtccatc ccgctggacc acggcaaccc cacgccgagc ctgaagccgg tgaccctgca 14400

gcaggtgcta ccgagcgcgg cgccgcgccg gggcttcaag cgcgagggcg gcgaggatct 14460

gtacccgacc atgcagctga tggtgcccaa gcgccagaag ctggaggacg tgctggagca 14520

catgaaggtg gaccccgagg tgcagcccga ggtcaaggtg cggcccatca agcaggtggc 14580

cccgggcctg ggcgtgcaga ccgtggacat caagatcccc acggagccca tggaaacgca 14640

gaccgagccc gtgaagccca gcaccagcac catggaggtg cagacggatc cctggatgcc 14700

agcaccagct tccaccagca ctcgccgaag acgcaagtac ggcgcggcca gcctgctgat 14760

gcccaactac gcgctgcatc cttccatcat ccccacgccg ggctaccgcg gcacgcgctt 14820

ctaccgcggc tacaccagca gccgccgccg caagaccacc acccgccgcc gtcgtcgcag 14880

ccgccgcagc agcaccgcga cttccgcctt ggtgcggaga gtgtatcgca gcgggcgcga 14940

gcctctgacc ctgccgcgcg cgcgctacca cccgagcatc gccatttaac taccgcctcc 15000

tacttgcaga tatggccctc acatgccgcc tccgcgtccc cattacgggc taccgaggaa 15060

gaaagccgcg ccgtagaagg ctgacgggga acgggctgcg tcgccatcac caccggcggc 15120

ggcgcgccat cagcaagcgg ttggggggag gcttcctgcc cgcgctgatc cccatcatcg 15180

ccgcggcgat cggggcgatc cccggcatag cttccgtggc ggtgcaggcc tctcagcgcc 15240

actgagacac aaaaaagcat ggatttgtaa taaaaaaaaa aatggactga cgctcctggt 15300

cctgtgatgt gtgtttttag atggaagaca tcaatttttc gtccctggca ccgcgacacg 15360

gcacgcggcc gtttatgggc acctggagcg acatcggcaa cagccaactg aacgggggcg 15420

ccttcaattg gagcagtctc tggagcgggc ttaagaattt cgggtccacg ctcaaaacct 15480

atggcaacaa ggcgtggaac agcagcacag ggcaggcgct gagggaaaag ctgaaagaac 15540

agaacttcca gcagaaggtg gttgatggcc tggcctcagg catcaacggg gtggttgacc 15600

tggccaacca ggccgtgcag aaacagatca acagccgcct ggacgcggtc ccgcccgcgg 15660

ggtccgtgga gatgccccag gtggaggagg agctgcctcc cctggacaag cgcggcgaca 15720

agcgaccgcg tcccgacgcg gaggagacgc tgctgacgca cacggacgag ccgcccccgt 15780

acgaggaggc ggtgaaactg ggcctgccca ccacgcggcc cgtggcgcct ctggccaccg 15840

gagtgctgaa acccagcagc agccagcccg cgaccctgga cttgcctccg cctcgcccct 15900

ccacagtggc taagcccctg ccgccggtgg ccgtcgcgtc gcgcgccccc cgaggccgcc 15960

cccaggcgaa ctggcagagc actctgaaca gcatcgtggg tctgggagtg cagagtgtga 16020

agcgccgccg ctgctattaa aagacactgt agcgcttaac ttgcttgtct gtgtgtatat 16080

gtatgtccgc cgaccagaag gaggagtgtg aagaggcgcg tcgccgagtt gcaagatggc 16140

caccccatcg atgctgcccc agtgggcgta catgcacatc gccggacagg acgcttcgga 16200

gtacctgagt ccgggtctgg tgcagttcgc ccgcgccaca gacacctact tcagtctggg 16260

gaacaagttt aggaacccca cggtggcgcc cacgcacgat gtgaccaccg accgcagcca 16320

gcggctgacg ctgcgcttcg tgcccgtgga ccgcgaggac aacacctact cgtacaaagt 16380

gcgctacacg ctggccgtgg gcgacaaccg cgtgctggac atggccagca cctactttga 16440

catccgcggc gtgctggacc ggggccctag cttcaaaccc tactctggca ccgcctacaa 16500

cagcctagct cccaagggag ctcccaattc cagccagtgg gagcaagcaa aaacaggcaa 16560

tgggggaact atggaaacac acacatatgg tgtggcccca atgggcggag agaatattac 16620

aaaagatggt cttcaaattg gaactgacgt tacagcgaat cagaataaac caatttatgc 16680

cgacaaaaca tttcaaccag aaccgcaagt aggagaagaa aattggcaag aaactgaaaa 16740

cttttatggc ggtagagctc ttaaaaaaga cacaaacatg aaaccttgct atggctccta 16800

tgctagaccc accaatgaaa aaggaggtca agctaaactt aaagttggag atgatggagt 16860

tccaaccaaa gaattcgaca tagacctggc tttctttgat actcccggtg gcaccgtgaa 16920

cggtcaagac gagtataaag cagacattgt catgtatacc gaaaacacgt atttggaaac 16980

tccagacacg catgtggtat acaaaccagg caaggatgat gcaagttctg aaattaacct 17040

ggttcagcag tctatgccca acagacccaa ctacattggg ttcagggaca actttatcgg 17100

tcttatgtac tacaacagca ctggcaatat gggtgtgctt gctggtcagg cctcccagct 17160

gaatgctgtg gttgatttgc aagacagaaa caccgagctg tcctaccagc tcttgcttga 17220

ctctttgggt gacagaaccc ggtatttcag tatgtggaac caggcggtgg acagttatga 17280

ccccgatgtg cgcatcatcg aaaaccatgg tgtggaggat gaattgccaa actattgctt 17340

ccccttggac ggctctggca ctaacgccgc ataccaaggt gtgaaagtaa aagatggtca 17400

agatggtgat gttgagagtg aatgggaaaa tgacgatact gttgcagctc gaaatcaatt 17460

atgtaaaggt aacattttcg ccatggagat taatctccag gctaacctgt ggagaagttt 17520

cctctactcg aacgtggccc tgtacctgcc cgactcctac aagtacacgc cgaccaacgt 17580

cacgctgccg accaacacca acacctacga ttacatgaat ggcagagtga cacctccctc 17640

gctggtagac gcctacctca acatcggggc gcgctggtcg ctggacccca tggacaacgt 17700

caaccccttc aaccaccacc gcaacgcggg cctgcgctac cgctccatgc tcctgggcaa 17760

cgggcgctac gtgcccttcc acatccaggt gccccaaaag tttttcgcca tcaagagcct 17820

cctgctcctg cccgggtcct acacctacga gtggaacttc cgcaaggacg tcaacatgat 17880

cctgcagagc tccctaggca acgacctgcg cacggacggg gcctccatcg ccttcaccag 17940

catcaacctc tacgccacct tcttccccat ggcgcacaac accgcctcca cgctcgaggc 18000

catgctgcgc aacgacacca acgaccagtc cttcaacgac tacctctcgg cggccaacat 18060

gctctacccc atcccggcca acgccaccaa cgtgcccatc tccatcccct cgcgcaactg 18120

ggccgccttc cgcggatggt ccttcacgcg cctgaagacc cgcgagacgc cctcgctcgg 18180

ctccgggttc gacccctact tcgtctactc gggctccatc ccctacctag acggcacctt 18240

ctacctcaac cacaccttca agaaggtctc catcaccttc gactcctccg tcagctggcc 18300

cggcaacgac cgcctcctga cgcccaacga gttcgaaatc aagcgcaccg tcgacggaga 18360

gggatacaac gtggcccagt gcaacatgac caaggactgg ttcctggtcc agatgctggc 18420

ccactacaac atcggctacc agggcttcta cgtgcccgag ggctacaagg accgcatgta 18480

ctccttcttc cgcaacttcc agcccatgag ccgccaggtc gtggacgagg tcaactacaa 18540

ggactaccag gccgtcaccc tggcctacca gcacaacaac tcgggcttcg tcggctacct 18600

cgcgcccacc atgcgccagg gccagcccta ccccgccaac tacccctacc cgctcatcgg 18660

caagagcgcc gtcgccagcg tcacccagaa aaagttcctc tgcgaccggg tcatgtggcg 18720

catccccttc tccagcaact tcatgtccat gggcgcgctc accgacctcg gccagaacat 18780

gctctacgcc aactccgccc acgcgctaga catgaatttc gaagtcgacc ccatggatga 18840

gtccaccctt ctctatgttg tcttcgaagt cttcgacgtc gtccgagtgc accagcccca 18900

ccgcggcgtc atcgaagccg tctacctgcg cacgcccttc tcggccggca acgccaccac 18960

ctaagccgct cttgcttctt gcaagatgac ggcgggctcc ggcgagcagg agctcagggc 19020

catcctccgc gacctgggct gcgggccctg cttcctgggc accttcgaca agcgcttccc 19080

tggattcatg gccccgcaca agctggcctg cgccatcgtg aacacggccg gccgcgagac 19140

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cgaccccttc gggttctcgg acgagcgcct caagcagatc taccagttcg agtacgaggg 19260

cctgctgcgt cgcagcgccc tggccaccga ggaccgctgc gtcaccctgg aaaagtccac 19320

ccagaccgtg cagggtccgc gctcggccgc ctgcgggctc ttctgctgca tgttcctgca 19380

cgccttcgtg cactggcccg accgccccat ggacaagaac cccaccatga acttactgac 19440

gggggtgccc aacggcatgc tccagtcgcc ccaggtggaa cccaccctgc gccgcaacca 19500

ggaagcgctc taccgcttcc tcaatgccca ctccgcctac tttcgctccc accgcgcgcg 19560

catcgagaag gccaccgcct tcgaccgcat gaatcaagac atgtaaaaaa ccggtgtgtg 19620

tatgtgaatg ctttattcat aataaacagc acatgtttat gccaccttct ctgaggctct 19680

gactttattt agaaatcgaa ggggttctgc cggctctcgg catggcccgc gggcagggat 19740

acgttgcgga actggtactt gggcagccac ttgaactcgg ggatcagcag cttgggcacg 19800

gggaggtcgg ggaacgagtc gctccacagc ttgcgcgtga gttgcagggc gcccagcagg 19860

tcgggcgcgg agatcttgaa atcgcagttg ggacccgcgt tctgcgcgcg agagttgcgg 19920

tacacggggt tgcagcactg gaacaccatc agggccgggt gcttcacgct tgccagcacc 19980

gtcgcgtcgg tgatgccctc cacgtccaga tcctcggcgt tggccatccc gaagggggtc 20040

atcttgcagg tctgccgccc catgctgggc acgcagccgg gcttgtggtt gcaatcgcag 20100

tgcaggggga tcagcatcat ctgggcctgc tcggagctca tgcccgggta catggccttc 20160

atgaaagcct ccagctggcg gaaggcctgc tgcgccttgc cgccctcggt gaagaagacc 20220

ccgcaggact tgctagagaa ctggttggtg gcgcagccgg cgtcgtgcac gcagcagcgc 20280

gcgtcgttgt tggccagctg caccacgctg cgcccccagc ggttctgggt gatcttggcc 20340

cggttggggt tctccttcag cgcgcgctgc ccgttctcgc tcgccacatc catctcgata 20400

gtgtgctcct tctggatcat cacggtcccg tgcaggcacc gcagcttgcc ctcggcttcg 20460

gtgcagccgt gcagccacag cgcgcagccg gtgcactccc agttcttgtg ggcgatctgg 20520

gagtgcgagt gcacgaagcc ctgcaggaag cggcccatca tcgcggtcag ggtcttgttg 20580

ctggtgaagg tcagcgggat gccgcggtgc tcctcgttca catacaggtg gcagatgcgg 20640

cggtacacct cgccctgctc gggcatcagc tggaaggcgg acttcaggtc gctctccacg 20700

cggtaccggt ccatcagcag cgtcatcact tccatgccct tctcccaggc cgaaacgatc 20760

ggcaggctca gggggttctt caccgccatt gtcatcttag tcgccgccgc cgaggtcagg 20820

gggtcgttct cgtccagggt ctcaaacact cgcttgccgt ccttctcgat gatgcgcacg 20880

gggggaaagc tgaagcccac ggccgccagc tcctcctcgg cctgcctttc gtcctcgctg 20940

tcctggctga tgtcttgcaa aggcacatgc ttggtcttgc ggggtttctt tttgggcggc 21000

agaggcggcg gcgatgtgct gggagagcgc gagttctcgt tcaccacgac tatttcttct 21060

tcttggccgt cgtccgagac cacgcggcgg taggcatgcc tcttctgggg cagaggcgga 21120

ggcgacgggc tctcgcggtt cggcgggcgg ctggcagagc cccttccgcg ttcgggggtg 21180

cgctcctggc ggcgctgctc tgactgactt cctccgcggc cggccattgt gttctcctag 21240

ggagcaacaa caagcatgga gactcagcca tcgtcgccaa catcgccatc tgcccccgcc 21300

gccaccgccg acgagaacca gcagcagaat gaaagcttaa ccgccccgcc gcccagcccc 21360

acctccgacg ccgcggcccc agacatgcaa gagatggagg aatccatcga gattgacctg 21420

ggctacgtga cgcccgcgga gcacgaggag gagctggcag cgcgcttttc agccccggaa 21480

gagaaccacc aagagcagcc agagcaggaa gcagagaacg agcagaacca ggctgggcac 21540

gagcatggcg actacctgag cggggcagag gacgtgctca tcaagcatct ggcccgccaa 21600

tgcatcatcg tcaaggacgc gctgctcgac cgcgccgagg tgcccctcag cgtggcggag 21660

ctcagccgcg cctacgagcg caacctcttc tcgccgcgcg tgccccccaa gcgccagccc 21720

aacggcacct gtgagcccaa cccgcgcctc aacttctacc cggtcttcgc ggtgcccgag 21780

gccctggcca cctaccacct ctttttcaag aaccaaagga tccccgtctc ctgccgcgcc 21840

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acctccttgg aagaggttcc caagatcttc gagggtctgg gcagcgacga gactcgggcc 21960

gcgaacgctc tgcaaggaag cggagaggag catgagcacc acagcgccct ggtggagttg 22020

gaaggcgaca acgcgcgcct ggcggtcctc aagcgcacgg tcgagctgac ccacttcgcc 22080

tacccggcgc tcaacctgcc ccccaaggtc atgagcgccg tcatggacca ggtgctcatc 22140

aagcgcgcct cgcccctctc ggaggaggag atgcaggacc ccgagagttc ggacgagggc 22200

aagcccgtgg tcagcgacga gcagctggcg cgctggctgg gagcgagtag caccccccag 22260

agcctggaag agcggcgcaa gctcatgatg gccgtggtcc tggtgaccgt ggagctggag 22320

tgtctgcgcc gcttctttgc cgacgcggag accctgcgca aggtcgagga gaacctgcac 22380

tacctcttca ggcacgggtt cgtgcgccag gcctgcaaga tctccaacgt ggagctgacc 22440

aacctggtct cctacatggg catcctgcac gagaaccgcc tggggcaaaa cgtgctgcac 22500

accaccctgc gcggggaggc ccgccgcgac tacatccgcg actgcgtcta cctgtacctc 22560

tgccacacct ggcagacggg catgggcgtg tggcagcagt gcctggagga gcagaacctg 22620

aaagagctct gcaagctcct gcagaagaac ctcaaggccc tgtggaccgg gttcgacgag 22680

cgtaccaccg cctcggacct ggccgacctc atcttccccg agcgcctgcg gctgacgctg 22740

cgcaacgggc tgcccgactt tatgagccaa agcatgttgc aaaactttcg ctctttcatc 22800

ctcgaacgct ccgggatcct gcccgccacc tgctccgcgc tgccctcgga cttcgtgccg 22860

ctgaccttcc gcgagtgccc cccgccgctc tggagccact gctacttgct gcgcctggcc 22920

aactacctgg cctaccactc ggacgtgatc gaggacgtca gcggcgaggg tctgctggag 22980

tgccactgcc gctgcaacct ctgcacgccg caccgctccc tggcctgcaa cccccagctg 23040

ctgagcgaga cccagatcat cggcaccttc gagttgcaag gccccggcga cggcgagggc 23100

aaggggggtc tgaaactcac cccggggctg tggacctcgg cctacttgcg caagttcgtg 23160

cccgaggact accatccctt cgagatcagg ttctacgagg accaatccca gccgcccaag 23220

gccgagctgt cggcctgcgt catcacccag ggggccatcc tggcccaatt gcaagccatc 23280

cagaaatccc gccaagaatt tctgctgaaa aagggccacg gggtctactt ggacccccag 23340

accggagagg agctcaaccc cagcttcccc caggatgccc cgaggaagca gcaagaagct 23400

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ggaggaggag atggaagact gggacagcac tcaggcagag gaggacagcc tgcaagacag 23520

tctggaggag gaagacgagg tggaggaggc agaggaagaa gcagccgccg ccagaccgtc 23580

gtcctcggcg gagaaagcaa gcagcacgga taccatctcc gctccgggtc ggggtcgcgg 23640

cggccgggcc cacagtaggt gggacgagac cgggcgcttc ccgaacccca ccacccagac 23700

cggtaagaag gagcggcagg gatacaagtc ctggcggggg cacaaaaacg ccatcgtctc 23760

ctgcttgcaa gcctgcgggg gcaacatctc cttcacccgg cgctacctgc tcttccaccg 23820

cggggtgaac ttcccccgca acatcttgca ttactaccgt cacctccaca gcccctacta 23880

ctgtttccaa gaagaggcag aaacccagca gcagcagaaa accagcggca gcagcagcta 23940

gaaaatccac agcggcggca ggtggactga ggatcgcggc gaacgagccg gcgcagaccc 24000

gggagctgag gaaccggatc tttcccaccc tctatgccat cttccagcag agtcgggggc 24060

aggagcagga actgaaagtc aagaaccgtt ctctgcgctc gctcacccgc agttgtctgt 24120

atcacaagag cgaagaccaa cttcagcgca ctctcgagga cgccgaggct ctcttcaaca 24180

agtactgcgc gctcactctt aaagagtagc ccgcgcccgc ccacacacgg aaaaaggcgg 24240

gaattacgtc accacctgcg cccttcgccc gaccatcatg agcaaagaga ttcccacgcc 24300

ttacatgtgg agctaccagc cccagatggg cctggccgcc ggcgccgccc aggactactc 24360

cacccgcatg aactggctca gtgccgggcc cgcgatgatc tcacgggtga atgacatccg 24420

cgcccaccga aaccagatac tcctagaaca gtcagcgatc accgccacgc cccgccatca 24480

ccttaatccg cgtaattggc ccgccgccct ggtgtaccag gaaattcccc agcccacgac 24540

cgtactactt ccgcgagacg cccaggccga agtccagctg actaactcag gtgtccagct 24600

ggccggcggc gccgccctgt gtcgtcaccg ccccgctcag ggtataaagc ggctggtgat 24660

ccgaggcaga ggcacacagc tcaacgacga ggtggtgagc tcttcgctgg gtctgcgacc 24720

tgacggagtc ttccaactcg ccggatcggg gagatcttcc ttcacgcctc gtcaggccgt 24780

cctgactttg gagagttcgt cctcgcagcc ccgctcgggc ggcatcggca ctctccagtt 24840

cgtggaggag ttcactccct cggtctactt caaccccttc tccggctccc ccggccacta 24900

cccggacgag ttcatcccga acttcgacgc catcagcgag tcggtggacg gctacgattg 24960

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cttccgctgc ttcgctcggg atctcgccga gtttgcctac tttgagctgc ccgaggagca 25080

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tactttgtac tgcatctgca accaccccgg cctgcatgaa agtctttgtt gtctgctgtg 25260

tactgagtat aataaaagct gagatcagcg actactccgg actcgattgt ggtgttcctg 25320

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gcgacaacga cggagtcctg ctgagcggcc ctgccaacct tactttttcc acccgcagaa 25500

gcaagctcca gctcttccaa cccttcctcc ccgggaccta tcagtgcgtc tcaggaccct 25560

gccatcacac cttccacctg atcccgaata ccacagcgcc gctccccgct actaacaacc 25620

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taatagcgct aggcctagtt gcgggtgggc ttttggttct ctgctaccta tacctccctt 25800

gctgttcgta cttagtggtg ctgtgttgct ggtttaagaa atggggaaga tcaccctagt 25860

gagctgcggt gcgctggtgg cggtgttgct ttcgattgtg ggactgggcg gcgcggctgt 25920

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gagaatcgag tacaataaca agactcggaa caatactctc gcgtccgtgt ggcagcccgg 26100

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taatactttc atttttgcgc acatgtgcaa cacggtcatg tggatgagca agcagtacga 26220

tatgtggccc cccacgaagg agaacatcgt ggtcttctcc atcgcttaca gcctgtgcac 26280

ggcgctaatc accgctatcg tgtgcctgag cattcacatg ctcatcgcta ttcgccccag 26340

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gggtgaattg ccgcgtacac ataaaactcc acttacattt agttgcagca ataataatct 26640

tacacttttt tcaattacaa aacaatatac tggtacttat tacagtacaa actttcatac 26700

aggacaagat aaatattata ctgttaaggt agaaaatcct accactccta gaactaccac 26760

caccaccact actgcaaagc ccactgtgaa aactacaact aggaccacca caactacaga 26820

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gaccactaat gatttgatcg ccctgctgca aaagggggat aacagcacca cttccaatga 26940

ggagataccc aaatccatga ttggcattat tgttgctgta gtggtgtgca tgttgatcat 27000

cgccttgtgc atggtgtact atgccttctg ctacagaaag cacagactga acgacaagct 27060

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ctcagtattt caaacaacac catttccctt aaaactgctg cccctttcta caacaacaat 28320

ggaactttaa gcctcaatgt ctccacacca ttagcagtat ttcccacatt taacacttta 28380

ggcataagtc ttggaaacgg tcttcagact tcaaataagt tgttgactgt acaactaact 28440

catcctctta cattcagctc aaatagcatc acagtaaaaa cagacaaagg gctatatatt 28500

aactccagtg gaaacagagg acttgaggct aatataagcc taaaaagagg actagttttt 28560

gacggtaatg ctattgcaac atatattgga aatggcttag actatggatc ttatgatagt 28620

gatggaaaaa caagacccgt aattaccaaa attggagcag gattaaattt tgatgctaac 28680

aaagcaatag ctgtcaaact aggcacaggt ttaagttttg actccgctgg tgccttgaca 28740

gctggaaaca aacaggatga caagctaaca ctttggacta cccctgaccc aagccctaat 28800

tgtcaattac tttcagacag agatgccaaa tttactctct gtcttacaaa atgcggtagt 28860

caaatactag gcactgtggc agtggcggct gttactgtag gatcagcact aaatccaatt 28920

aatgacacag tcaaaagcgc catagttttc cttagatttg attccgatgg tgtactcatg 28980

tcaaactcat caatggtagg tgattactgg aactttaggg agggacagac cactcaaagt 29040

gtagcctata caaatgctgt gggattcatg ccaaatatag gtgcatatcc aaaaacccaa 29100

agtaaaacac ctaaaaatag catagtcagt caggtatatt taactggaga aactactatg 29160

ccaatgacac taaccataac tttcaatggc actgatgaaa aagacacaac cccagttagc 29220

acctactcta tgacttttac atggcagtgg actggagact ataaggacaa aaatattacc 29280

tttgctacca actcattctc tttttcctac atcgcccagg aataatccca cccagcaagc 29340

caaccccttt tcccaccacc tttgtctata tggaaactct gaaacagaaa aataaagttc 29400

aagtgtttta ttgaatcaac agttttacag gactcgagca gttatttttc ctccaccctc 29460

ccaggacatg gaatacacca ccctctcccc ccgcacagcc ttgaacatct gaatgccatt 29520

ggtgatggac atgcttttgg tctccacgtt ccacacagtt tcagagcgag ccagtctcgg 29580

atcggtcagg gagatgaaac cctccgggca ctcccgcatc tgcacctcac agctcaacag 29640

ctgaggattg tcctcggtgg tcgggatcac ggttatctgg aagaagcaga agagcggcgg 29700

tgggaatcat agtccgcgaa cgggatcggc cggtggtgtc gcatcaggcc ccgcagcagt 29760

cgctgccgcc gccgctccgt caagctgctg ctcagggggt tcgggtccag ggactccctc 29820

agcatgatgc ccacggccct cagcatcagt cgtctggtgc ggcgggcgca gcagcgcatg 29880

cgaatctcgc tcaggtcact gcagtacgtg caacacagga ccaccaggtt gttcaacagt 29940

ccatagttca acacgctcca gccgaaactc atcgcgggaa ggatgctacc cacgtggccg 30000

tcgtaccaga tcctcaggta aatcaagtgg cgctccctcc agaagacgct gcccatgtac 30060

atgatctcct tgggcatgtg gcggttcacc acctcccggt accacatcac cctctggttg 30120

aacatgcagc cccggatgat cctgcggaac cacagggcca gcaccgcccc gcccgccatg 30180

cagcgaagag accccggatc ccggcaatga caatggagga cccaccgctc gtacccgtgg 30240

atcatctggg agctgaacaa gtctatgttg gcacagcaca ggcatatgct catgcatctc 30300

ttcagcactc tcagctcctc gggggtcaaa accatatccc agggcacggg gaactcttgc 30360

aggacagcga accccgcaga acagggcaat cctcgcacat aacttacatt gtgcatggac 30420

agggtatcgc aatcaggcag caccgggtga tcctccacca gagaagcgcg ggtctcggtc 30480

tcctcacagc gtggtaaggg ggccggccga tacgggtgat ggcgggacgc ggctgatcgt 30540

gttctcgacc gtgtcatgat gcagttgctt tcggacattt tcgtacttgc tgtagcagaa 30600

cctggtccgg gcgctgcaca ccgatcgccg gcggcggtct cggcgcttgg aacgctcggt 30660

gttaaagttg taaaacagcc actctctcag accgtgcagc agatctaggg cctcaggagt 30720

gatgaagatc ccatcatgcc tgatagctct gatcacatcg accaccgtgg aatgggccag 30780

gcccagccag atgatgcaat tttgttgggt ttcggtgacg gcgggggagg gaagaacagg 30840

aagaaccatg attaactttt aatccaaacg gtctcggagc acttcaaaat gaaggtcacg 30900

gagatggcac ctctcgcccc cgctgtgttg gtggaaaata acagccaggt caaaggtgat 30960

acggttctcg agatgttcca cggtggcttc cagcaaagcc tccacgcgca catccagaaa 31020

caagacaata gcgaaagcgg gagggttctc taattcctca accatcatgt tacactcctg 31080

caccatcccc agataatttt catttttcca gccttgaatg attcgaacta gttcctgagg 31140

taaatccaag ccagccatga taaaaagctc gcgcagagca ccctccaccg gcattcttaa 31200

gcacaccctc ataattccaa gatattctgc tcctggttca cctgcagcag attgacaagc 31260

ggaatatcaa aatctctgcc gcgatccctg agctcctccc tcagcaataa ctgtaagtac 31320

tctttcatat cgtctccgaa atttttagcc ataggacccc caggaataag agaagggcaa 31380

gccacattac agataaaccg aagtcccccc cagtgagcat tgccaaatgt aagattgaaa 31440

taagcatgct ggctagaccc ggtgatatct tccagataac tggacagaaa atcgggtaag 31500

caatttttaa gaaaatcaac aaaagaaaaa tcttccaggt gcacgtttag ggcctcggga 31560

acaacgatgg agtaagtgca aggggtgcgt tccagcatgg ttagttagct gatctgtaaa 31620

aaaacaaaaa ataaaacatt aaaccatgct agcctggcga acaggtgggt aaatcgttct 31680

ctccagcacc aggcaggcca cggggtctcc ggcgcgaccc tcgtaaaaat tgtcgctatg 31740

attgaaaacc atcacagaga gacgttcccg gtggccggcg tgaatgattc gagaagaagc 31800

atacaccccc ggaacattgg agtccgtgag tgaaaaaaag cggccgagga agcaatgagg 31860

cactacaacg ctcactctca agtccagcaa agcgatgcca tgcggatgaa gcacaaaatt 31920

ttcaggtgcg taaaaaatgt aattactccc ctcctgcaca ggcagcgaag ctcccgatcc 31980

ctccagatac acatacaaag tagcttaccg agcggcagca gcagcggcac acaacaggcg 32040

caagagtcag agaaaagact gagctctaac ctgtccgccc gctctctgct caatatatag 32100

ccccagatct acactgacgt aaaggccaaa gtctaaaaat acccgccaaa taatcacaca 32160

cgcccagcac acgcccagaa accggtgaca cactcagaaa aatacgcgca cttcctcaaa 32220

cggccaaact gccgtcattt ccgggttccc acgctacgtc atcaaaacac gactttcaaa 32280

ttccgtcgac cgttaaaaac atcacccgcc ccgcccctaa cggtcgccgc tcccgcagcc 32340

aatcaccttc ctccctcccc aaattcaaac agctcatttg catattaacg cgcaccaaaa 32400

gtttgaggta tattattgat gatgcgcgat cgccggaatt cactggccgt cgttttacaa 32460

cgtcgtgact gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc gccttgcagc acatccccct 32520

ttcgccagct ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc 32580

agcctgaatg gcgaatggcg cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt 32640

tcacaccgca tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata gttaagccag 32700

ccccgacacc cgccaacacc cgctgacgcg ccctgacggg cttgtctgct cccggcatcc 32760

gcttacagac aagctgtgac cgtctccggg agctgcatgt gtcagaggtt ttcaccgtca 32820

tcaccgaaac gcgcgagacg aaagggcctc gtgatacgcc tatttttata ggttaatgtc 32880

atgataataa tggtttctta gacgtcaggt ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc 32940

cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc 33000

tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc 33060

gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg 33120

gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat 33180

ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc 33240

acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta ttgacgccgg gcaagagcaa 33300

ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc agtcacagaa 33360

aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt 33420

gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct 33480

tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat 33540

gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg tagcaatggc aacaacgttg 33600

cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg 33660

atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt 33720

attgctgata aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg gtatcattgc agcactgggg 33780

ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga cggggagtca ggcaactatg 33840

gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg 33900

tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa 33960

aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt 34020

tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt 34080

tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt 34140

ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag 34200

ataccaaata ctgttcttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta 34260

gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat 34320

aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg 34380

ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg 34440

agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac 34500

aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga 34560

aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt 34620

ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta 34680

cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat 34740

tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg 34800

accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaaga 34838

<210> 17

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720

<210> 18

<211> 1893

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gcgcccatca cggcctattc ccaacagaca cggggcctac ttggctgcat catcactagc 60

ctgaccggcc gggacaagaa ccaggtcgag ggggaggttc aagtggtttc taccgcaaca 120

caatctttcc tggcaacctg cgtcaacggc gtgtgttgga ctgtctacca tggcgccggc 180

tcaaagaccc tagccggccc aaaaggccct atcacccaaa tgtacaccaa tgtagaccag 240

gacctcgtcg gttggcaggc gccccctggg gcgcgctcct tggcatcatg cacctgtggc 300

agctcggacc tctacttggt cacgagacac gctgacgtca ttccggtgcg ccggcgaggc 360

ggtggtaagg ggagcctact ctcccccagg cctgtctcct acctgaaggg ctcttcgggt 420

ggtccattgc tctgcccttc cgggcacgct gtgggcatct tccgggctgc tgtgtgcacc 480

cggggggtcg cgaaggcggt ggacttcgta ctcgttgagt ccatggaaac tactatgcgg 540

tctccggttt ttacagacaa ctcgtccccc ccggctgtac cgcagacttt ccaagtggcc 600

cacttacacg ctcctactgg cagcggcaag agcaccaagg tgccggccgc atatgcggcc 660

caagggtaca aggtgcttgt tctgaaccca accgttgccg ccaccttagg ctttggagcg 720

tatatgtcta aggcacatgg taccgaccct aacatcagaa ctgggataag gaccatcacc 780

acgggcgccc ccatcacgta ctccacctac ggcaagttcc tcgccgacgg tggttgctcc 840

gggggcgcct atgacatcat catgtgtgat gagtgccact caactgactc gactaccatc 900

ttgggcatcg gcacggtcct ggaccaagcg gagacggctg gagcgcggct tgtcgtgctc 960

gctaccgcca cacctccggg atcagtcacc gtgccacacc ccaacatcga ggaggtggct 1020

ttgtccaata ctggagagat tcccttctat ggcaaagcca tccccatcga gaccatcaag 1080

gggggaaggc atctcatttt ctgccattcc aagaagaagt gtgacgagct cgccgcaaag 1140

ctgtcaggcc tcggactcaa cgctgtagcg tattaccggg gccttgatgt gtccgtcata 1200

ccgactagtg gagacgtcgt tgtcgtggca acagacgccc taatgactgg ctttaccggc 1260

gactttgact cagtgatcga ctgcaacaca tgtgtcaccc aaacagtcga tttcagcttg 1320

gatcctacct ttaccattga gacgaccacc gtgccccaag acgcggtatc gcgctcacag 1380

cggcgaggta ggactggcag gagtaggagg ggcatctaca ggtttgtgac tccaggagaa 1440

cggccctcgg gcatgttcga ctcctcggtc ctgtgtgaat gctatgacgc gggctgtgct 1500

tggtacgagc tcacgcccgc cgagacctca gttaggctgc gggcttacct aaatacacca 1560

gggttgcccg tttgccagga ccacctggag ttttgggaga gcgtcttcac aggcctcacc 1620

cacatagatg cccatttctt gtcccagact aaacaggcag gggacaacct cccctacctg 1680

gtagcatacc aagccacagt gtgcgccagg gctcaggctc cacctccatc gtgggatcaa 1740

atgtggaagt gtctcatacg gctgaagcct acgctgcacg ggccaacgcc cctgctgtat 1800

aggctaggag ccgtccaaaa tgaggtcacc ctcacacacc ccataaccaa atacatcatg 1860

gcatgcatgt cagctgactt ggaggttgtc acc 1893

<210> 19

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

aattcagatc tggtagcgcc catcacggcc tattc 35

<210> 20

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

tacttaagct ggatcggtga caacctccaa gtcag 35

Claims (9)

1.一种制备腺病毒表达载体的方法，其特征在于，所述方法包括：

以野生型腺病毒AdC6基因组为基础，通过基因组直接克隆方法，删除E1和E3的编码区，在E1删除区插入I-Ceu I和PI-Sce I酶切位点，获得复制缺陷性腺病毒载体。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的删除E1的编码区是指删除野生型AdC6基因组中第492-3022位的序列。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的删除E3的编码区是指删除野生型AdC6基因组中第27895-31909位的序列。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述克隆方法包括：

（1）PCR扩增AdC6腺病毒基因组的LITR片段，用PmeI和BatApI酶切pNEB193质粒和PCR产物，连接形成质粒pNEB193-PB；

（2）用SnaBI和NdeI酶切PUC57-linker和pNEB193-PB质粒，连接成质粒Pneb193-PB +linker；

（3）PCR分别扩增AdC6腺病毒基因组从3022位至9022位片段，从9002位至16002位片段和15982位至22000位片段，用NdeI 和MluI酶切质粒Pneb193-PB +linker，通过Takara的快速连接试剂盒连接4个DNA片段，获得质粒pNEB193-DE1；

（4）PCR分别扩增AdC6腺病毒基因组从21980位至27895位片段和从31909位至36604位DNA片段，用EcoRV和HpaI酶切线性化质粒pNEB193-DE1，通过Takara的快速连接试剂盒连接3个DNA片段，获得质粒pNEB193-DE1E3。

5.一种腺病毒表达载体，其特征在于，其由权利要求1-4任一项所述方法制备得到。

6.如权利要求5所述的腺病毒表达载体，其特征在于，所述腺病毒表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示。

7.如权利要求5所述的腺病毒表达载体，其特征在于，所述表达载体的酶切位点I-CeuI和PI-Sce I之间，还包括外源的抗原基因。

8.如权利要求7所述的腺病毒表达载体，其特征在于，所述的外源的抗原是丙肝病毒的非结构蛋白NS3的抗原。

9.一种制备疫苗的方法，其特征在于，所述方法包括：

（1）提供权利要求5所述的腺病毒表达载体；

（2）将外源的抗原编码基因插入到（1）表达载体的酶切位点I-Ceu I和PI-Sce I之间；

（3）将（2）的重组表达载体感染病毒包装细胞，病毒在细胞内包装，从而获得具有免疫原性的疫苗。