CN112295007A - 一种细菌纤维素/还原氧化石墨烯复合材料的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种细菌纤维素/还原氧化石墨烯复合材料的制备方法，其特征在于，将活化后的细菌纤维素生长菌接入种子培养基培养，然后将种子培养基接入发酵培养基中，充分混合均匀后，放置在恒温培养箱中静置发酵，获得细菌纤维素湿膜；将细菌纤维素湿膜碱洗后通过机械方法打浆成均相悬浮液；用L(+)抗坏血酸将氧化石墨烯溶液进行原位还原；将还原氧化石墨烯溶液与均相悬浮液混合，超声分散后制成均相混合液，静置分层，冷冻干燥后分离出细菌纤维素/还原氧化石墨烯复合材料。本发明工艺简单，将还原氧化石墨烯与细菌纤维素复合，该复合物具有良好的抗菌性能，可以广泛地应用在柔性功能敷料，组织工程等领域。

Description

一种细菌纤维素/还原氧化石墨烯复合材料的制备方法
技术领域
本发明涉及一种细菌纤维素/还原氧化石墨烯抗菌性复合材料的制备方法，属于医用敷料技术领域。
背景技术
细菌纤维素(Bacterial cellulose，BC)是由细菌分泌到胞外的产物，是一种由葡萄糖组成的很有前途的天然高聚物，最早是在1886年由英国科学家Brown在静态培养木醋杆菌时发现的，他观察到在培养基表面形成了一层白色的纤维状的凝胶类物质，后经分析并确认此类物质具有纤维素的结构和化学性质。由于
BC的纤维结构单一且缺乏抗菌活性限制了其在生物医学领域的应用，因此将细菌纤维素引入抗菌活性物质制备成抗菌材料加以运用。
还原氧化石墨烯(rGO)是一种具有广阔的比表面积和大量羟基、羧基等表面基团的新型纳米材料，因其相对低廉的成本和较低的对人和环境的毒性并且具有抑菌性而引起广泛关注。同时，还原氧化石墨烯具有各种独特的性能，包括优异的化学稳定性、机械性能、生物相容性、优异的亲水性以及良好的抗菌性能，其抗菌机制主要是由于氧化石墨烯纳米微粒与微生物细胞的相互作用，对细胞进行直接接触，破坏细胞膜，使其失去完整性，特别涉及到氧化石墨烯与细胞相互作用后引起不可逆转的细胞破坏。可以用于伤口敷料、细胞/组织培养的支架材料等方面。
发明内容
本发明所要解决的是：现有的细菌纤维素/还原氧化石墨烯复合材料大部分采用原位培养或者吸附浸泡，采用原位培养存在耗时较长的问题，吸附浸泡存在浸泡不完全等一系列问题，基于此，采用打浆共混的方法制备细菌纤维素/还原氧化石墨烯复合材料。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：
一种细菌纤维素/还原氧化石墨烯复合材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1)：将活化后的细菌纤维素生长菌接入种子培养基培养，然后将种子培养基接入发酵培养基中，充分混合均匀后，放置在恒温培养箱中静置发酵，获得细菌纤维素湿膜；
步骤2)：将步骤1)所得细菌纤维素湿膜碱洗后通过机械方法打浆成均相悬浮液；
步骤3)：采用改良Hummers法制备氧化石墨烯，用绿色还原剂L(+)抗坏血酸将氧化石墨烯溶液进行原位还原；
步骤4)：将步骤3)所得还原氧化石墨烯溶液与步骤2)所得均相悬浮液混合，超声分散后制成均相混合液；
步骤5)：将步骤4)所得均相混合液静置分层，冷冻干燥后分离出细菌纤维素/还原氧化石墨烯复合材料。
优选地，所述步骤1)中的细菌纤维素生长菌采用醋酸菌属中的木醋杆菌。本发明中所采用的木醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum)购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCCNo.1.1812。
优选地，所述步骤1)中种子培养基的接种量为发酵培养基质量的8％。
优选地，所述步骤1)中恒温培养箱的温度为30℃，静置发酵的时间为1周。
优选地，所述步骤2)所得均相悬浮液的浓度为50-100g/L。
优选地，所述步骤3)中氧化石墨烯溶液的浓度为0.2-1g/L。
优选地，所述步骤3)中氧化石墨烯溶液与L(+)抗坏血酸的体积比为1:3。
优选地，所述步骤4)中均相悬浮液与还原氧化石墨烯溶液的体积比为(200-40):1。
本发明还提供了上述细菌纤维素/还原氧化石墨烯复合材料的制备方法制备的细菌纤维素/还原氧化石墨烯复合材料。
本发明工艺简单，将还原氧化石墨烯与细菌纤维素复合，该复合物具有良好的抗菌性能，可以广泛地应用在柔性功能敷料，组织工程等领域。
附图说明
图1为实施例1制备的细菌纤维素/还原氧化石墨烯复合材料的照片；
图2为实施例1制备的细菌纤维素/还原氧化石墨烯复合材料不同比例的电镜图；
图3为实施例1-3与细菌纤维素、还原氧化石墨烯不同条件下的转化率；
图4为实施例1制备的细菌纤维素/还原氧化石墨烯复合材料对金黄色葡萄球菌的抗菌效果；
图5为实施例1制备的细菌纤维素/还原氧化石墨烯复合材料对大肠杆菌的抗菌效果。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
实施例1
一种细菌纤维素/还原氧化石墨烯复合材料(BC-rGO1)的制备方法：
(1)将葡萄糖(20g/L)、酵母粉(5g/L)、蛋白胨(5g/L)、磷酸氢二钠(5g/L)、柠檬酸(1g/L)分别配制成100mL的种子培养基和200mL的发酵培养基，调节pH值为6.0。
(2)将种子培养基和发酵培养基放入灭菌锅中，温度为121℃、压强为0.1MPa，灭菌15分钟，待培养液冷却后将活化后的100mL木醋杆菌种子培养液以8wt％接种量接种至种子培养基中，在30℃和160rpm/min的摇床中培养24h。
(3)按照8wt％的接种量将种子培养液接种于发酵培养基中充分震荡使其混合均匀，然后30℃下静置培养1周，得到乳白色细菌纤维素膜。
(4)用去离子水冲洗细菌纤维素表面的残留物，然后浸泡在0.1M的NaOH溶液中，80℃加热搅拌2h，再用醋酸调节pH至6.0，最后用去离子水冲洗细菌纤维素膜。
(5)将5g细菌纤维素膜放入去离子水中，通过机械方法打浆成50mL均相悬浮液，得到细菌纤维素均相悬浮液，其浓度为100g/L。
(6)采用改良Hummers法制备氧化石墨烯，用绿色还原剂L(+)抗坏血酸原位还原氧化石墨烯，氧化石墨烯溶液与抗坏血酸的质量比为1:3，得到浓度为0.2g/L的还原氧化石墨烯溶液。
(7)将细菌纤维素均相悬浮液与还原氧化石墨烯溶液以200:1的体积比进行混合，搅拌均匀后超声处理30min(功率为300W)，得到均匀混合物。
(8)将混合物静置，最后-80℃真空冷冻干燥，得到细菌纤维素/还原氧化石墨烯复合材料(如图1所示)。
实施例2
本实施例与实施例1的不同之处在于，细菌纤维素均相悬浮液与还原氧化石墨烯溶液的体积比为100:1，制得BC-rGO2。
实施例3
本实施例与实施例1的不同之处在于，细菌纤维素均相悬浮液与氧化石墨烯溶液的体积比为200:3，制得BC-rGO3。
实施例4
本实施例与实施例1的不同之处在于，细菌纤维素均相悬浮液与氧化石墨烯溶液的体积比为50:1。
实施例5
本实施例与实施例1的不同之处在于，细菌纤维素均相悬浮液与氧化石墨烯溶液的体积比为40:1。
实施例6
本实施例与实施例1的不同之处在于，细菌纤维素均相悬浮液的浓度为80g/L，氧化石墨烯溶液的浓度为1g/L；细菌纤维素均相悬浮液与氧化石墨烯溶液按体积比为200:3。
实施例7
本实施例与实施例1的不同之处在于，细菌纤维素均相悬浮液的浓度为80g/L，氧化石墨烯溶液的浓度为1g/L；细菌纤维素均相悬浮液与氧化石墨烯溶液按体积比为50:1。
实施例8
本实施例与实施例1的不同之处在于，细菌纤维素均相悬浮液的浓度为50g/L，氧化石墨烯溶液的浓度为0.5g/L。细菌纤维素均相悬浮液与氧化石墨烯溶液的体积比为200:3。
实施例9
本实施例与实施例1的不同之处在于，细菌纤维素均相悬浮液的浓度为50g/L，氧化石墨烯溶液的浓度为0.5g/L；细菌纤维素均相悬浮液与氧化石墨烯溶液的体积比为50:1。
对实施例1中还原氧化石墨烯的抗菌性能进行测试，具体操作如下：
(1)选取革兰氏阴性菌大肠埃希菌(PTCC1330)和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(PTCC1112)为模型菌。首先分别将大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌接入LB培养液中，37℃培养10-14h，于对数中期停止。
(2)清洗菌体。取菌液于离心管中，4000rpm，离心5min，倒清液，加入等量生理盐水吹吸、离心，反复3次。
(3)将清洗后的菌液进行10倍梯度稀释，待用。取OD值为0.6的菌液。
(4)称量。用分析天平称取不同质量分数的还原氧化石墨烯，超声1h，分散成均质溶液，对照组为无石墨烯的生理盐水。
(5)取5mL菌液于不同浓度的还原氧化石墨烯溶液和对照组中，于37℃，220rpm，6h培养。
(6)培养后的溶液和对照组稀释涂布，37℃过夜培养，观察菌落数。每个浓度做2个平行样，3次重复试验。
如图4、5所示，还原氧化石墨烯溶液的浓度在2g/L时抗菌能力较强，金黄色葡萄球菌死亡率达66％；当还原氧化石墨烯溶液的浓度为2g/L时，复合材料对大肠杆菌的抗菌率可以达到95％。
本实验用平板菌落计数法验证了还原氧化石墨烯的抗菌能力，其抗菌效果与还原氧化石墨烯的浓度密切相关。

Claims (9)

1.一种细菌纤维素/还原氧化石墨烯复合材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1)：将活化后的细菌纤维素生长菌接入种子培养基培养，然后将种子培养基接入发酵培养基中，充分混合均匀后，放置在恒温培养箱中静置发酵，获得细菌纤维素湿膜；
步骤2)：将步骤1)所得细菌纤维素湿膜碱洗后通过机械方法打浆成均相悬浮液；
步骤3)：采用改良Hummers法制备氧化石墨烯，用绿色还原剂L(+)抗坏血酸将氧化石墨烯溶液进行原位还原；
步骤4)：将步骤3)所得还原氧化石墨烯溶液与步骤2)所得均相悬浮液混合，超声分散后制成均相混合液；
步骤5)：将步骤4)所得均相混合液静置分层，冷冻干燥后分离出细菌纤维素/还原氧化石墨烯复合材料。
2.如权利要求1所述的细菌纤维素/还原氧化石墨烯复合材料的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中的细菌纤维素生长菌采用醋酸菌属中的木醋杆菌。
3.如权利要求1所述的细菌纤维素/还原氧化石墨烯复合材料的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中种子培养基的接种量为发酵培养基质量的8％。
4.如权利要求1所述的细菌纤维素/还原氧化石墨烯复合材料的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中恒温培养箱的温度为30℃，静置发酵的时间为1周。
5.如权利要求1所述的细菌纤维素/还原氧化石墨烯复合材料的制备方法，其特征在于，所述步骤2)所得均相悬浮液的浓度为50-100g/L。
6.如权利要求1所述的细菌纤维素/还原氧化石墨烯复合材料的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中氧化石墨烯溶液的浓度为0.2-1g/L。
7.如权利要求1所述的细菌纤维素/还原氧化石墨烯复合材料的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中氧化石墨烯溶液与L(+)抗坏血酸的体积比为1:3。
8.如权利要求1所述的细菌纤维素/还原氧化石墨烯复合材料的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中均相悬浮液与还原氧化石墨烯溶液的体积比为(200-40):1。
9.权利要求1-8任意一项所述的细菌纤维素/还原氧化石墨烯复合材料的制备方法制备的细菌纤维素/还原氧化石墨烯复合材料。
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