JPS6374490A - 培養におけるセルラ−ゼ製剤の使用及びセルロ−ス生産微生物の使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、例えばアセトバクター・キシリヌム（Ａｃｅ
ｔｏｂａｃｔｅｒ　ｘｙｌｉｎｕｍ）のようなセルロー
ス生産微生物によってセルロースが生産されながらそれ
を分解するセルロース加水分解酵素の作用に関する。本
発明に関する理論的根拠は多種にわたる。

多量のセルロースを生産するアセトバクター属のような
生物は、細胞が厚いセルロース薄膜中でしばしばからみ
合うようになることから、１つの接種原から次の接種原
に移すことがやや困難である。

セルロースの大規模生産の場合には、多量の接種原が最
終大規模セルロース生産工程において必要である。セル
ラーゼ酵素製剤は細胞増殖を阻害しないが、増殖培地に
加えられるセルラーゼ製剤が適度の濃度である場合には
、セルロースは全く観察されない。この系を用いた場合
、セルラーゼ製剤が栄養培地から希釈又は除去されさえ
すれば、セルロースを合成する上で生理学上完全かつ十
分に有効な多量の細胞を得ることができる。

かかる環境下でのセルラーゼ製剤の使用におけるもう１
つの利点は、セルロース全部を分解しないほどの極度に
低い濃度のセルラーゼ酵素であってもポリマーの結晶性
を変化させ、かつより速い速度でセルロース合成を進行
させるようになることである。この理論的根拠は、セル
ロース結晶性に影響を与えかつセルロース合成を促進さ
せるカルコフルオル（Ｃａｌｃｏｆ　Ｉｕｏｒ）及びフ
ルオレセイン色素に関しての初期研究と関連がある。

ディリンガム（Ｄｉ　Ｉ　Ｉ　ｉ　ｎｇｈａＩｌｌ）ら
（１９６１年、バクテリオロジカル・プロシーデインダ
ス（Ｂａｃ−ｔｃｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｐｒｏｃｅｅ
ｄｉｎｇｓ）　、第６７巻〕によるアブストラクト“ア
セトバクター・キシリヌムによるセルラーゼ及び無セル
ロース細胞生産“は、アセトバクターセルロース生産に
関するセルラーゼの効果について記載していたが、しか
しながら、−’／　　　− 更に文献を調査した限りでは、更に詳細に説明を加えた
関連文献はその後において発見されなかった。このアブ
ストラクトにおいて、ディリンガムらは次のように述べ
ている： 通常の培養では白色セルロース薄膜下にほとんど又は全
く混濁を生じていない。セルラーゼ存在下では、薄膜が
生成せず、しかも典型的混濁細胞懸濁液が生じる（通常
の培養における３０時間で１１２Ｘ１０５個と比較し、
生育数が１０．０ＸＩＯ７個）。

このデータは、ミロセシウム拳ベルカリア（Ｍｙｒｏｔ
ｈｃｃｉｕＩＩｌｖｅｒｒｕｃａｒｉａ）由来部分精製
セルラーゼの存在に起因して、細胞密度が約９倍増加し
たことを示している。本発明は、栄養培地中のセルラー
ゼ製剤をはじめとする関数としてみた場合に５０〜１０
０倍の増殖増加がみられるセルロース生産微生物の増殖
促進技術からなる。しかも、かかる増殖促進はその後の
本発明の方法と合わせて利用される。

セルロース生産微生物の濃培養物は、本発明の−８一 方法による様々な目的のために生産されかつ使用される
。最初にセルラーゼ製剤を含有したセルロール生産微生
物用の栄養培地が調製される。次いで栄養培地にセルロ
ース生産微生物が接種される。

しかる後接種培地は、微生物の増殖及び実質上セルロー
ス薄膜非含有製微生物培養物の生産を促進させるために
、好気性条件下でインキュベートされる。この濃培養物
は多量の栄養培地用の接種原として使用されるか、又は
回収されて、この回収微生物が例えば細胞成分源として
使用される。多量の栄養培地に接種された場合、接種培
地のその後における好気性インキュベーションによって
セルロールの大規模生産を促進させる。

栄養培地が、生産されるセルロースの結晶性に影響を与
えるには十分に高濃度であるが、但し上記セルロールの
すべてを実質上加水分解させるには不十分な濃度でセル
ラーゼ製剤を含有する場合には、培養微生物によるセル
ロース合成速度は高まり、しかも生産されるセルロール
はより非晶質の特性を有するようになる。

ある場合には、セルロース生産微生物の培養は気体透過
性物質壁を有する構造体中で行なわれ、該構造体は液体
を収容することができる。壁は酸素含有気体と接触する
ように適合された第一側壁及び構造体に収容された液体
と接触するように適合された第二側壁を有する。かかる
状況において、培養される微生物は構造体をセルロース
薄膜で満たすようになる。

他の状況下にあっては、多量の非晶質セルロースの生産
が望まれる。セルロース生産微生物の濃培養物は、セル
ラーゼ製剤含有栄養培地中での培養によって生産される
。この濃培養物は多量の培地に接種するために使用され
る。多量の接種培地は実質上０．　５ガウス以」二の磁
場の影響下におかれる。磁場存在下で生産されるセルロ
ースは、通常生産されるものよりも実質上無秩序化され
るか又は非晶質化される。

本発明は、栄養培地中に含まれるセルラーゼ製剤による
セルロース生産微生物の刺激に関する。

通常５０〜１００倍のこの促進化は好気性培養条件下で
達成される。セルロース生産微生物の濃培養物は容易に
生産され、かかる微生物の細胞成分源として又は引き続
いての微生物培養用の接種原として使用される。

本発明の実施に際して使用可能なセルロース生産微生物
としては、アセトバクター・リゾビウム（Ａｃｅｔｏｂ
ａｃｔｅｒ　Ｒｈｊｚｏｂｊｕｍ）、アグロバクテリウ
ム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス（
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ−ａｓ）又はアルカリゲ°ネス（Ａ
ｌｃａｌ　ｉｇｅｎｅｓ）属のものがある。セルラーゼ
製剤含有無菌栄養培地が調製される。栄養培地成分とし
て使用可能なセルラーゼ製剤は酵素セルラーゼ（β−１
，４−グルカンやグルカンヒドロラーゼ、　　ＥＣ３，
２，１，４）からなるべきであるが、所望であればセロ
ビオヒドロラーゼ又はβ−グルコシダーゼ（β−Ｄ−グ
ルコシド・グルコヒドロラーゼ、　　ＥＣ３，２，１゜
２１）を含有していてもよい。セルラーゼ製剤は、ミロ
セシウム（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ）、トリコデルマ（
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）又はポリポルス（Ｐｏｌｙｐ
ｏｒｕｓ）属のもののような生物から得られる。更に具
体的には、セルラーゼ製剤はミロセシウム番ベル力リア
（Ｍｙｒｏｔｈｃｃｉｕｍ　ｖｃｒｒｕｃａｒｉａ）　
、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｊｅｈｏｄｅｒｎ＋ａ　
ｖｊｒｊｄｃ）　、）リコデルマ・レエセイ（Ｔｒｊｅ
ｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｃｊ）又はポリポルス・ベル
シコロル（Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ　ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ
）種の生物から得られる。セルラーゼ製剤含有栄養培地
（通常セルラーゼ約０．０００３７５〜０．０１５単位
／ｍ１）はセルロース生産微生物で接種される。

次いでこの接種培地は好気性条件下でかつ通常約２０〜
約４０℃の温度でインキュベートされる。

セルロース生産微生物培養用の栄養培地は、約３〜約７
のｐＨであることが好ましい。セルロース生産微生物の
培養に適した栄養培地としては、単純もしくは複合炭水
化物、窒素源、無機物及びビタミンを含有したもののよ
うに、当該技術分野で周知の各種多様の培地がある。ア
セトバクター用の窒素、炭素等の多数の適当な供給源は
、プレイ、バーシーズ・マニュアル拳オブ・システマテ
ィ・ツク・バクテリオロジー、第１巻、第２６８−２７
４頁、１９８４年、ウィリアムス及びウィル＝　　１２
　− キンス、ボルナモア／ロンドン（Ｄｅ　Ｌｅｙ。

Ｂｃｒｇｃｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍ
ａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ。

Ｖｌ、ｐｐ２Ｅ１８−２７４（１９８４）　Ｗｊｌｌｊ
ａｍｓ　ａｎｄ　Ｗｊｌｋｊｎｓ、Ｂａｌ−Ｎｍｏｒｃ
／Ｉ、ｏｎｄｏｎ　）に示されている。

セルロール生産微生物の濃培養物が求められる場合には
、栄養培地中のセルラーゼ製剤レベルは生産される実質
上すべての微生物セルロースを加水分解するために十分
高濃度であることが好ましい。部分的加水分解により変
化をうけた微生物セルロースの生産が求められる場合に
は、栄養培地中のセルラーゼ製剤レベルは生産される実
質上すべてのセルロースを加水分解するために十分な濃
度よりも低いことが好ましい。

上記方法により生産される濃微生物培養物は、多量栄養
培地用の接種原として使用される。あるいは、細胞はそ
こから回収され、例えば特定タンパク質又は核酸のよう
な細胞成分源として使用される。かかる濃培養物からの
細胞回収は、セルロースのイン・ビトロ合成において活
性な十分量の酵素を得る上で重要である。このような濃
細菌培異物は、例えばセルロース合成に必要な成分とし
てＤＮＡ又はタンパク質等の細胞成分の抽出のために、
容易に利用可能な量の細菌をも提供する。

微生物セルロースが大規模に生産される場合には、セル
ロース生産微生物用に多量の栄養培地が調製され、上記
のように調製された接種原で接種される。次いで微生物
セルロースの生産が好気性インキュベーションによって
促進される。′好気性インキュベーション”という語か
らは、接種培地が例えば空気のような酸素含有気体に露
呈されていることが想像される。この露呈は、培地中に
気体を吹込むことにより、空気と接触する培地表面積を
最適化するように形造られた容器中に接種培地を入れる
ことにより、又は少なくとも１つの気体透過性物質壁を
もつ容器中に接種栄養培地を入れることにより行なわれ
る。

微生物セルロースのイン・ビトロ合成は、セルロール生
産微生物から生産されるセルロースを加水分解するため
に十分な量のセルラーゼ製剤を含有した栄養培地中にお
けるセルロース生産微生物の培養を伴う方法によって行
なうことが有利である。アセトバクター・キシリヌム細
胞のようなセルロール生産細胞はセルラーゼ製剤含有栄
養培地に接種され、濃細胞培養物の生産を促進させるた
めに好気的にインキュベートされる。細胞は回収され、
界面活性剤可溶性活性酵素成分及び生物学的活性残存粗
上澄を生産させるために処理する。

粗上澄及び界面活性剤可溶性酵素成分は次いでＵＤＰ−
グルコース含有溶液中で混合され、セルロースのイン・
ビトロ合成を促進させるためにインキュベートされる。

下記例は本発明の好ましい態様及び有用性を表わすため
に掲示されており、特許請求の範囲で他の記載がない限
り本発明を制限するものではない。

例１ セルラーゼによる高細胞密度生産 本発明の例を通して使用されるセルラーゼ製剤は他に特
記のない限すノボ争インダストリＡ／５（Ｎｏｖｏ　Ｉ
ｎｄｕｓｔｒｉ　Ａ／Ｓ）製造のセルクラスト（ｅｅｌ
　１ｕｃｌａｓｔ）であった。セルクラストは真菌ト＝
　　１５　− リコデルマ・レエセイ選択株の液内発酵により製造され
るセルラーゼ製剤である。セルクラストが例えばアビセ
ル（Ａｖｉｃｃｌ、微結晶木材セルロース）のようなセ
ルロース基質とインキュベートされた場合、反応生成物
は、主にグルコース、セロビオース及び高グルコースポ
リマーである。生じる反応生成物の相対屋は反応条件に
依存する。しかも、セルクラストは、例えばカルボキシ
メチルセルロース（、ＣＭＣ）及びβ−グルカン類のよ
うな可溶性セルロース基質に対する顕著な粘度低下作用
を有する。換言すれば、セルクラストは、その含有物と
しての、エキソ活性体たるセロビオヒドロラーゼ（ＥＣ
３，２，１，９１）及びエキソ−１゜４−β−Ｄ−グル
コシダーゼ（ＥＣ３，２，１゜７４）、並びにエンド活
性体たるエンド−１，４−β−Ｄ−グルカナーゼ （ＥＣ３，２，１，４）　　（セルラーゼ）に特徴があ
る。

使用される具体的セルクラストは、セルクラスト１．５
Ｌ　（１５０ＯＮＣＵ／ｇ）であった。１−　１６　　
＝ ノボセルクラスト単位（Ｎｏｖｏ　Ｃｅ１ｌｕｃｌａｓ
Ｌ　Ｕｎｉｔ。

ＮＣＩＩ）は、標準的条件下、グルコース１　μｍｏｌ
／ｍｉｎに相当する還元力でＣＭＣを還元炭水化物に分
解する酵素量である。

標準的条件 基　　質・・・・・・ＣＭＣ（バーキュリーズ（Ｉｌｅ
ｒｃｕｌｅｓ）　７　Ｌ　Ｆ　Ｄ）温　　度・・・・・
・４０℃ ｐＨ・・・・・・・・・・・・４．８ 反応時間・・・・・・２０分間 セルラーゼ製剤を濾過滅菌し、２５０ｍ１エルレンマイ
ヤーフラスコ中のシュラム・ヘストリン（Ｓｃｈｒａｍ
ｍ　Ｈｃｓｔｒｉｎ）培地〔シュラムら、１９５４年、
ジャーナル・オブ・ゼネラル・ミクロバイオロジー、第
１１巻、第１２３−１２９頁（Ｓｃｈｒａ−ｍｍ　ｅＬ
　ａｌ、（１９５４）　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒＧｅｎｅ
ｒａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ−Ｉｏｇｙ、　ＩＩ：ｐｌ）
＋２３−１２９）　）　　１００ｍｌに加えた。培地フ
ラスコにアセトバクター・キシリヌム細胞約１０４個を
接種した。接種培養物を回転式プラットホーム（ｐｌａ
ｔｆ’ｏｒＩＩＩ）　　（１００ｒｐｒｎ）上２８℃て
１週間増殖させた。第１表は、培地に増量させつつ加え
られたセルラーゼ製剤の関数として、培地中の細胞増加
数及びグルコース減少量を示す。

第１表 １０　　３９．３　９７．０４　１．５９９　　３６．
１　８９．１　　１．６８７　　３２．８　８１．０　
　１．５４６　　２９．４　７２．５　　１．６８４　
　２４．３　６０．０　　１．５７３　　１８．５　４
５．６　　１．５５２　　２７．０　６６．７　　１．
６５１　　２６．７　６５．９　　１．５６０．５　１
９．２　４７．４１　　１．８１＊セルラーゼ存在下に
おけるｍ１当たりの細胞数／コントロールにおけるｍ１
当たりの細胞数（０，４０５） 上記データは、栄養培地中でのセルラーゼ製剤の存在が
１週間の増殖後において細胞数を８０倍以上増加させる
ことを示した。セルラーゼ処理で示される細胞数の増加
は、細胞のセルロース生産能の低下を伴わなかった。セ
ルラーゼ培地で増殖した細胞を遠心分離し、シュラム・
ヘストリン（ＳＨ）コントロール培地に加えたが、細胞
はコントロール細胞の場合と全く同様にセルロースを生
産した。細胞増加数を調べるためにプレート希釈を行な
った場合、粗面コロニーのみが観察されたが、このこと
は１００％の細胞がなおセルロースを生産していること
を示している（粗面コロニーはセルロース生産体であり
、一方多くの場合における平滑コロニーはセルロース合
成能を失ったアセトバクター細胞を表わす）。

例２ 高細胞密度、セルロース、温度及びｐＨ２５０ｍ１エル
レンマイヤーフラスコ中のシュラム・ヘストリン培地１
００ｍ１サンプルにアセトバクター・キシリヌム細胞１
．０３Ｘ１０’を接種した。コントロールの場合にはシ
ュラム・ヘストリン培地に接種され一実験の場合には精
製セルラーゼ製剤（ノボ・インダストリＡ／Ｓ）　１０
ＩＩ１ｇ／培地１００ｍ１含有のシュラム・ヘストリン
培地が使用された。フラスコ内容物を、２つの異なる温
度（２０℃及び２８℃）かつ２つの異なる開始ｐＨ値（
ｐＨ５，５及び６．０）で増殖させた。

第２表は得られたデータを要約している。

＝　　２０　− 第２表のデータから判明するように、１つのケースでは
セルラーゼ製剤含有ＳＨ培地においてコントロール培地
よりも６４倍多い細胞が生産された。この大増産はｐＨ
６，０かつ２８℃で起きた。

低倍率としてはｐＨ５，５かつ２８℃で開始した場合に
４．７×のみのセルラーゼ誘導細胞密度増加を示したが
、しかしながらこの場合にあってはコントロール細胞は
非常に急速に増殖していた。

この目的に最適の温度は確認できなかったが、しかしな
がらこれらのデータから、温度の上昇はコントロール対
セルラーゼ実験において細胞数を増加させることが判明
する。

例３ セルラーゼ及びインキュベート時間 セルラーゼ存在下で増殖せしめられたアセトバクターに
関して時間経過に伴い生じるものを調べるため、下記操
作を行なった。ＳＨフラスコにアセトバクターを接種し
た。これらフラスコの半分は培地１００ｍ１につきセル
ラーゼ製剤１０ｍｇを含有していたが、一方他の半分は
ＳＨ培地のみを含有していた。フラスコを４８時間にわ
たり試験し、細胞濃度及びグルコース濃度を調べた。開
始グルコース濃度は８．６ｇ／Ｌであった。フラスコに
最初に約１０，０００細胞／フラスコの非常に低濃度の
接種原で接種した。

第３表 セルラーゼ処理 ”ｒｌ　　　　４８　　　０．００２５６　７．９７Ｔ
２９６　　　０．５１　　　　７．４２Ｔ３　　１４４
　　２８．５　　　　１．６３Ｔ４１９２　　３０．７
　　　　１．５８コントロール（ＳＨ培地） Ｔ１　　　４８　　　０．００６８　　７．７８Ｔ２９
６　　　０．３９　　　　７．６２’ｒ３　　１４４　
　　０．７４　　　　７．５４Ｔ４　　１９２　　　０
．８５　　　　６．５７＊すべでの細胞を２８℃で増殖
させ、細胞をノボ・インダストリＡ／Ｓの精製酵素１３
２０Ｂ〔マーチン・シュライン博士（Ｄｒ、Ｍａｒｔｌ
ｎ　５ｃｈｕｌ−ｅｉｎ）の好意による〕で接種した。

すべてのフラスコをインキュベート時間中１０　Ｏｒｐ
ｍで回転振盪した。

第３表から判明するように、９６〜１４４時間目におい
て細胞数は驚異的に増加し、グルコース濃度はセルラー
ゼ製剤存在下で低下したが、一方コントロールにおいて
は細胞数の大きな増加はなく、しかも残留グルコース量
もさほど大きく減少しなかった。したがって、セルラー
ゼは細胞数増加に対し大きなインパクトを有していた。

例４ ４つのルー（Ｒｏｕｘ　）ボトル内でアセトバクター・
キシリヌムの同等の接種原を増殖させた。２つのボトル
には、ノボ中インダストリＡ／Ｓの精製１３２０Ｂセル
ラーゼ製剤１０ｍｇ／　１００ｍｌを加え、２８℃で２
週間増殖させた。２つのコントロールボトルはセルラー
ゼのない標準ＳＨ培地を含有していた。

セルラーゼ処理細胞は増殖したが、接種後８〜１０口目
までは目に見えるほどのセルロースは存在しなかった。

この時期から２週間後までのサンプリング期間中に、製
薄膜が表面上で生成した。

これは光学濃度の点で非常に均一な薄膜であった。

フラスコの底には多数の細胞を観察することができた。

このように、セルラーゼ存在下において、多数の細胞は
静置培養物中で薄膜と分離している。

逆に、コントロールでは典型的な浮遊乳白色薄膜を生じ
、２週間後においてそれから分離した細胞が全く観察さ
れなかった。

したがって、静置培養の場合にはセルラーゼ製剤の作用
によって異なるタイプの薄膜を生じる、と結論づけられ
る。コントロールとは反対に、この異なる薄膜は増殖期
間中の非常に遅い時期になって生じるのみであった。

例５ 細胞を、１週間にわたりセルラーゼ１０ｍｇ／１００ｍ
１含有ＳＨ培地中で増殖（振盪培養、２８℃）させた後
、無菌的に回収した。次いでこれらの細胞を標準ＳＨ培
地に移し、好気性振盪培養で増殖させた。更に、セルラ
ーゼ増殖培養物からの上澄を回収し、残留セルラーゼ活
性の効果を調べるためにアセトバクター細胞で接種した
。この実験で用いられたセルラーゼは、ノボ・インダス
トリＡ／Ｓの精製セルクラスト１　Ｂ２０Ｂであった。

セルラーゼ存在下で増殖せしめられた細胞は振盪接種Ｓ
Ｈ培地フラスコ中で数千ものセルロース小球を産生ずる
ことが観察された。このように、セルラーゼ処理細胞は
無セルラーゼ製剤培地に移された場合にセルロースを十
分に生産することができた。

残留酵素活性を調べるためにアセトバクター細胞が接種
された上澄は不明瞭なセルロース生成物を生産したが、
しかしながらこの生産は新鮮セルラーゼが用いられた場
合よりも組織化されていた。

このことは、一部のセルラーゼ活性が失なわれていたが
、それにもかかわらず一部の活性が残存していることを
示していた。

アセトバクターは、１週間セルラーゼ存在下で増殖せし
められた後にも、セルロール生産に関し非常に活性があ
るようであった。これに関する別の証拠は関連した細胞
数からも明らかにされたが、それによるとプレート希釈
した場合に液体ＳＨ培地に移すとセルロースを十分合成
しうる粗面コロニーを生じた。

セルラーゼ１３２０Ｂ含有ＳＨ培地中で増殖しているア
セトバクター培養物は、しかしながら、培養３．５か列
後はどの遅い時期であってもセルロースを生じなかった
。したがって、セルラーゼ酵素が高濃度（１０■／１０
０ｍ１）である場合、酵素は長期間にわたりセルロール
形成を阻止する上で有効であった。

例６ 較 この操作の目的は、セルラーゼが濃度１０ｎ＋ｇ／１０
０ｍ１で培地に加えられた場合に、シュラム・ヘストリ
ン（ＳＨ）以外の栄養増殖培地が細胞をより多く増殖さ
せうるか否かについて調べることであった。セルラーゼ
を限外ン濾過により無菌化し、無菌培地に加えて、セル
ラーゼ濃度を１０ｍｇ／１００ｍ１とした。２つの培地
、即ちコーンスチープリカー及びシュラム・へストリン
を用いた。１週間後、細胞を計測した。

第６表 コーンスチープリ力−（開始ｐＨ−６，７７）（１）セ
ルラーゼ Ｂ　　　　６．７２　８０ｘｌＯ’ Ｃ６，７０２０ｘ１０４　平均＝４８ｘ１０４Ｄ　　　
　６．６９　８０ｘｌＯ’ Ｅ　　　　６．７１　２０Ｘ１０’ （２）コントロール Ａ　　　　６．７１　９５Ｘ１０３ Ｂ　　　　　６．７３　　２４Ｘ１０’　　平均−１８
Ｘ１０’第７表 シュラム・ヘストリン（開始ｐＨ−６，１４）Ｂ　　　
　　４．１２　　１６Ｘ１０６　平均−８７Ｘ１０６Ｃ
４，０１１７ｘ１．０７ （２）コントロール（セルラーゼない Ａ　　　　７’−夕なし　　３．９ｘｌＯ”Ｂ　　　　
デー９ｔ、にし　　４４Ｘ１０４　平均＝３８．５Ｘｌ
Ｏ’Ｃ４，６３３０Ｘ１０’ Ｄ　　　　４．５９　４０Ｘ１０’ Ｅ　　　　５．３６　６５Ｘ１０’ １週間後、シュラム中ヘストリンーセルラーゼ補充培地
はコーンスチープリ力−−セルラーゼ補充培地よりも多
く細胞を生産した。上記データは、ある株にとってコー
ンスチープリカーでの増殖が最適の培地ではないことを
示した。このデータは、シュラム・ヘストリン以外の他
の培地を使用することができ、かつそのものは細胞密度
を増加させるセルラーゼ製剤効果を示すことも証明した
。

例７ セルロース生産微生物の振盪培養におけるセルラーゼの
効果 下記操作では、セルロースに干渉せずに純粋な細胞培養
物を与えるセルラーゼ酵素の下限を調べた。この研究の
ために、液体セルクラストを２０倍希釈し、この希釈液
を開始貯蔵液として用いた。

増殖培地として１％グルコース補充標準シュラム・ヘス
トリン培地を用い、培養物を２８℃かつ回転振盪速度１
００　ｒｐｍで１週間増殖させた。これら操作の結果は
第８表に示されている。

第８表 最適セルラーゼ製剤濃度 ＳＨ培地１００ｍ１ につき添加された 貯蔵セルクラスト の量　　　　　　　　　　　　結　　　果２　　　　　
ｍｌ　　　　すべて細胞（セルロースが見られない）１
　　　　　ｍｌ　　　　すべて細胞（セルロースが一部
見られる）０．９ｍｌ　　　　すべて細胞（セルロース
が一部見られる）０．７ｍｌ　　　　すべて細胞（セル
ロースが一部見られる）０．５ｍｌ　　　　一部細胞（
セルロース球がいくつか見られ０．３ｍｌ　　　　多数
の透明な小セルロース球０、　０５　　ｍｌ　　　　奇
妙な形状の大セルロース球０．０２５ｍ１　　　　大セ
ルロース球細胞生産量の増加は、最高で、セルクラスト
２０倍希釈の約０．７ｍｌまで得られる。セルロース球
状物質は濃度約０．５ｍｌで生成し始める。

例８ 低濃度のセルラーゼで増大するセルロース生産アセトバ
クター・キシリヌムを濃度０．２５＋ｎｇ−３”Ｌ−Ｆ
ａｑ ／１００ｍ１培地の低濃度セルラーゼ（１２２０Ｂ。

ノボ・インダストリＡ／Ｓ）含有培地で増殖させた。２
８℃で１週間の回転振盪培養後、セルラーゼ培養下で生
産されたセルロース量はコントロール（セルラーゼなし
）培養時の量よりも約１．５倍多いことが観察された。

結果は第９表に示されている。

第９表 、　２９３４０−　　　、１５１８２ 、１７１１４　　　、１６５９３ 、２４５３０　　　、１６７２９ 、３０７４３　　　、１６９７８ 、１８３１２　　　、１４４９０ ．２６４０４平均　　　　、１５９９４平均低濃度で培
地に加えられたセルラーゼは微生物セルロースの収量を
高めた。このことは、開始アセトバクター接種原が非常
に低濃度（約１０，０００細胞／フラスコ）である場合
に妥当した。開始接種原の量が多いか又は培養物が１週
間以上増殖せしめられた場合には、コントロール以上の
セルロール生産の増加量はもっと少なくなり、ときには
コンロールと同等又はそれ以下にさえなってしまう。か
かる領域では更に限定を加え′　ることが必要であるが
、しかしここまでのところでは、生産されるセルロール
量がセルロース加水分解酵素の添加によりて調節されう
ろことを証明している。

例９ イン・ビトロセルロース生産のためのプロトコ−火 アセトバクター争キシリヌム種のセルロース生産微生物
〔例えば、米国基準培養寄託機関（Ａｍｅ−ｒｉｃａｎ
　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）
、ロックビル、メリーランド州のＡＴＣＣＮｏ、２３７
６９１を、セルロース合成能をもつ細胞成分源として使
用した。微生物サンプルをシュラム・ヘストリン寒天の
表面上に接種し、５〜７日間増殖させた。ｑｉ−コロニ
ーからの細胞をシュラム・ヘストリン栄養培地２００　
ｍｌ及びセルクラスト５０μｇ含有のフラスコに移した
。接種培地を１２　Ｏｒｐｍにセットしたロータリーシ
ェーカー上２８℃で３６時間インキュベートした。細胞
を、１０層のチーズクロス（目のあらい薄地の綿布）に
培地を通しかつ１０．０００ｘｇて１０分間遠心分離す
ることにより回収した。遠心分離された細胞を冷ＴＭＥ
緩衝液（５０ｍＭ）リス−ＨＣ１（ｐＩ（７，５）、１
０　ｍ　Ｍ　　Ｍ　ｇ　ＣＩ　２．１ｍＭ　　ＥＤＴＡ
）で２回洗浄し、セルクラストを除去した。各フラスコ
からの細胞をＴＭＥ５ｍｌに再懸濁し、６６０ｎｍで光
学濃度（ＯＤ）を調べた（４０μｇ−〇、０２　０Ｄ）
。上記操作による細胞収量は、無セルラーゼシュラム・
ヘストリン培地の場合より約５倍多く、静置ルーボトル
培養の場合より約１００倍多かった。１０，０００ｘｇ
で１０分間再遠心分離後、細胞ペレットを２０％ポリエ
チレングリコール含有ＴＭＥ　（ＴＭＥ−ＰＥＧ）に再
＝　　３５　− 懸濁した。乾燥細胞重量１ｎｇにっきＴＭＥ−Ｐ　ＥＧ
約１５ｍ１を用いて、この細胞懸濁液を調製した。

細胞懸濁液を１６．　０ＯＯｐｓｉ　　（１，１２０ｋ
ｇ／ｃＪ）でフレンチ（Ｆｒｅｎｃｈ）圧力セル中に徐
々に通過させた。得られたホモゲネートを４℃１２．０
００ｘｇで１０分間遠心分離した。こうして得られたペ
レットをＴＭＥ　（最初に用いたＴＭＥ−ＰＥＧの容量
の１／４）に再懸濁した。

゛この再懸濁液を４℃１８，０００ｘｇで２０分間遠心
分離し、上澄（ＳＦ）及びペレットを得た。

ペレットを５０　ｍ　Ｍ　）リス−ＨＣＩ（ｐ　Ｈ７，
５）　、２２ｍＭ　　Ｍｇ　ＣＩ　２．１ｍＭＥＤＴＡ
　（Ｓ−ＴＭＥ）（最初に用いたＴＭＥ−ＰＥＧの約１
／１６〜約３／３２の容量）に再懸濁し、再懸濁ペレッ
ト（ＭＦ）を調製した。粗調製物は、最初にＳＦｌｏｍ
ｌ、１０ｍＭ　　ＧＴＰｌ、２５ｍ１．０　、１　Ｍ　
Ｃａ　Ｃ１２１２５ｔｔ　ｉ’及びＴＭＥｌ、２５ｍ１
含有混合物を調製することにより得た。混合物を３７℃
で２時間しかる後約１００℃で３分間インキュベートし
た。凝集物質を除去するために遠心分離した後、上澄を
得（粗Ｇ　ｘ　）　、液体窒素で凍結し、−２０℃で貯
蔵した。

ジギトニン可溶性酵素成分を得るために、ＭＦ（再懸濁
ペレット）を用いた。ＭＦをＳ−ＴＭＥに懸濁し、ジギ
トニン界面活性剤と混合し、６、　２５＋Ｉ１ｇ／ｍ＋
の最終タンパク質濃度及び１％ジギトニンとした。この
混合物を４℃で５分間超音波処理し次いてこの温度で３
０分間静かに振盪した。得た混合物を次いで４℃１００
，０００ｘｇで１時間遠心分離した。得られた上澄は、
セルロースシンターゼ含有のジギトニン可溶性調製物（
ＤＳ）であった。

等量のＤＳ及び粗Ｇｘを混合し、ＵＤＰ−グルコースを
２０ｍＭの濃度まで加えた。この混合物をセルロースの
イン・ビトロ合成のために３０℃でインキュベートした
。これら操作法の更に詳細な説明については、リンら、
１９８５年、サイエンス、第２３０巻、第８２２−８２
５頁〔１、ｉｎ　ｅｔａｌ、（１９８５）、５ｃｉｅｎ
ｃｅ　Ｖ２３０．ｐｐ８２２−８２５）を参照のこと。

変更は、本明細書に記載された要素、生物及び操作法、
あるいは本明細書に記載された方法の工程又は工程順序
に関し、特許請求の範囲で規定されるような本発明の概
念及び範囲から逸脱しない限りで、行なうことができる
。例えば、アセトバクター・キシリヌムはアセトバクタ
ー・バスツーリアヌス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｐａ
ｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ）と改名されていることが明らか
にされた〔プレイ、１９８４年、バーシーズ・マニュア
ル中オブ・システマティック・バクテリオロジー、ウィ
リアムズ及びウィルキンス、ボルナモア／ロンドン、第
２６８−２７４頁参照〕。これらの名称は本発明の目的
からみて相互に代用可能であると考えられる。

出願人代理人　　佐　　藤　　−雄 手続補正書 昭和６２年１１月２０日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、セルラーゼ製剤含有栄養培地を調製し；上記栄養培
   地にセルロース生産微生物を接種し；実質上セルロース
   薄膜を含まない濃微生物培養物の生産を促進させるため
   、好気性条件下で接種培地をインキュベートし； セルロース生産微生物用のある量の栄養培地を調製し； 該量の栄養培地に接種するため、上記濃微生物培養物を
   利用し；及び 微生物セルロースの生産を促進させるため、該量の接種
   栄養培地を好気的にインキュベートする；こからなる微
   生物セルロースの生産方法。 ２、その培地で培養されるセルロース生産微生物から生
   産されるセルロースを加水分解するために有効なセルラ
   ーゼ製剤を含有した無菌栄養培地を調製し； 上記栄養培地にセルロース生産微生物を接種し；セルロ
   ース生産微生物の濃培養物を生産させるために、好気的
   条件下で接種培地をインキュベートし； 濃培養物からセルロース生産微生物を採取し；及び 採取した微生物から多量の細胞成分を得る；ことからな
   る、セルロース生産微生物細胞成分を多量に得るための
   方法。 ３、生産されるすべてのセルロースを実質上加水分解す
   るためには不十分であるが、セルロース結晶性を変化さ
   せかつこれによりセルロース生産速度を高めるためには
   十分な量でセルラーゼ製剤を含有する栄養培地中におい
   てセルロース生産微生物を培養することからなる、高い
   速度での微生物セルロースの生産方法。 ４、セルラーゼ製剤含有栄養培地からセルロース生産微
   生物の濃培養物を調製し； 気体透過性物質壁からなる構造体を用意し（該構造体は
   液体を収容することができ、しかも上記壁は酸素含有気
   体と接触するように適合された第一側壁及び構造体に収
   容された液体と接触するように適合された第二側壁を有
   する）； 上記構造体中にセルロース生産微生物用の栄養培地を収
   容し（上記栄養培地は濃培養物からのセルロース生産微
   生物で接種される）；及び 培地中において微生物セルロースの生産を促進させるた
   め、培地収容構造体をインキュベートする； ことからなる微生物セルロース生産方法。 ５、セルラーゼ製剤含有栄養培地中で増殖せしめられる
   セルロース生産微生物の接種原を調製し； セルロース生産微生物用の栄養培地に接種原を移し； 酸素存在下でかつ実質上０．５ガウス以上の磁場の影響
   下で接種培地をインキュベートする；ことからなる非晶
   質セルロース生産方法。 ６、セルロース生産微生物用の栄養培地を調製し（培地
   は、そこで培養されるセルロース生産微生物から生産さ
   れるセルロースを加水分解するためには十分な量のセル
   ラーゼ製剤を含有している）； 上記栄養培地にセルロース生産微生物を接種し；セルロ
   ース生産微生物の濃培養物を生産させるために、好気性
   条件下で接種培地をインキュベートし； 濃培養物からセルロース生産微生物を採取し；採取され
   た微生物を処理して界面活性剤可溶化活性酵素成分及び
   生物学的活性残存粗上澄を生産させ、；及び 微生物セルロースのイン・ビトロ合成を促進させるため
   に、ＵＤＰ−グルコース含有溶液中で粗上澄及び界面活
   性剤可溶化酵素成分を混合する；ことからなる、セルロ
   ース生産微生物の成分による微生物セルロースのイン・
   ビトロ合成方法。 ７、セルロース生産微生物がリゾビウム、アグロバクテ
   リウム、シュードモナス又はアルカリゲネス属に属する
   、特許請求の範囲第１、２、３、４、５又は６項記載の
   方法。 ８、セルロース生産微生物がアセトバクター属に属する
   、特許請求の範囲第１、２、３、４、５又は６項記載の
   方法。 ９、セルロース生産微生物が原核生物である、特許請求
   の範囲第１、２、３、４、５又は６項記載の方法。 １０、セルロース生産微生物がアセトバクター・キシリ
   ヌム種に属する、特許請求の範囲第１、２、３、４、５
   又は６項記載の方法。 １１、セルラーゼ製剤がミロセシウム、トリコデルマ又
   はポリポルス属の生物から生産されるようなセルラーゼ
   からなる、特許請求の範囲第１、２、３、４、５又は６
   項記載の方法。 １２、セルラーゼ製剤がミロセシウム・ベルカリア、ト
   リコデルマ・ビリデ、トリコデルマ・レエセイ又はポリ
   ポルス・ベルシコロル種の微生物から生産されるような
   セルラーゼからなる、特許請求の範囲第１、２、３、４
   、５又は６項記載の方法。 １３、セルラーゼ製剤がセルラーゼ、セロビオヒドロラ
   ーゼ及びβ−グルコシダーゼからなる、特許請求の範囲
   第１、２、３、４、５又は６項記載の方法。 １４、セルラーゼ製剤含有培地がセルラーゼ約０．００
   ０３７５単位／ｍｌ〜セルラーゼ約０．０１５単位／ｍ
   ｌを含有すると更に定義される、特許請求の範囲第１、
   ２、３、４、５又は６項記載の方法。 １５、インキュベートが約２０℃〜約４０℃の温度で行
   なわれる、特許請求の範囲第１、２、３、４、５又は６
   項記載の方法。 １６、栄養培地が約３〜約７のｐＨを有する、特許請求
   の範囲第１、２、３、４、５又は６項記載の方法。 １７、細胞成分がタンパク質又は核酸である、特許請求
   の範囲第２項記載の方法。 １８、細胞成分がＤＮＡである、特許請求の範囲第２項
   記載の方法。 １９、細胞成分がセルロース合成に関与しているもので
   ある、特許請求の範囲第２項記載の方法。