DK170307B1 - Termostabil cyclodextringlycosyltransferase, fremstilling og anvendelse deraf samt mikroorganisme t il dannelse heraf - Google Patents

Description

DK 170307 B1

Denne opfindelse vedrører en cyclodextringlycosyltransferase, en fremgangsmåde til dens fremstilling, en mikrobiel stamme, som er i stand til at fremstille den og dens anvendelse i stivelsesforflydning og i cyclodextrinfremstilling.

Cyclodextringlycosyltransferase (1,4-a-D-glucan 4-aD-(1,4-a-D-glucano)-5 transferase, E.C. 2.4.119), herefter betegnet cyclodextringlycosyltransferase eller CGTase er et enzym, som kendetegnes ved sin evne til at danne cyclodextriner ved ringslutning af stivelse eller stivelseshydrolysat.

De enzymatiske ringslutningsreaktioner danner således cyclodextriner (forkortet som CD og også kendt som Schardinger-dextriner), idet disse er 1 o ringformede molekyler, der består af 6,7 eller 8 α-D-glucopyranose-enheder forbundet ved a-1,4 bindinger. De kendes som α-, 8 eller γ-cyclodextriner afhængigt af antallet af glucoseenheder som er henholdsvis 6, 7 eller 8.

Cyclodextriner er hidtil typisk blevet fremstillet ved variationer af metoden beskrevet af E.B. Tilden og C.S. Hudson (J. American Chemical Society) 15 64:1432[1942]; denne metode omfatter behandling af forflydet stivelse med et cyclodextringlycosyltransferase (CGTase) enzym fra Bacillus macerans. Alle variationer af denne proces har en række ulemper. For det første må stivelsen forbehandles, f.eks. med en α-amylase, for at opløseliggøre stivelsen, eftersom CGTasen ikke er tilstrækkelig varmestabi! til at anvendes over stivelsesforklistrings-20 temperatur. Det er vigtigt, at stivelsen forflydes til en relativt lav DE (Dextroseækvi-valent) så efter udførelse af stivelsesforflydningen må det benyttede middel, normalt en α-amylase, inaktiveres for at få et godt udbytte af cyclodextrin. For det andet er Bacillus macerans CGTase ikke tilstrækkelig stabil til at anvendes ved forhøjet temperatur, og følgelig udføres den enzymatiske cyclodextrinisering ved omkring 25 50°C, hvor den er udsat for mikrobiel infektion. For det tredje kræver omdannelse af stivelse til cyclodextriner (ved 50°C, pH 7,0) med Bacillus macerans CGTase lang reaktionstid, før rimelige udbytter opnås.

De hidtil kendte CGTase-enzymer fremstilles af mikroorganismer såsom Bacillus macerans, Bacillus circulans, Bacillus stearothermophilus, Bacillus 30 megaterium, Bacillus ohbensis, alkalofil Bacillus sp., Micrococcus luteus, Micrococcus varians og Klebsiella phenumoniae. Ingen af CGTase-enzymerne, der 2 DK 170307 B1 M.

dannes af disse mikroorganismer er imidlertid tilstrækkeligt stabile over 60°C til at kunne anvendes til fremstilling af cyclodextriner ved tilstrækkelig høj temperatur til at undgå muligheden for mikrobiel infektion.

Enzymatisk forflydning af vandig stivelsesopslemning anvendes i stor 5 udstrækning i første trin i omdannelsen af stivelse til dextrose (glucose).

Stivelsesindustrien har i vidt omfang indført forflydningsprocessen ifølge US

3,921,590. Typiske betingelser er jetkogning ved 105°C i 5 minutter efterfulgt af ophold i 90 minutter ved 95°C, ved en stivelseskoncentration på 35% DS (tørstof)

R

efter vægt. Enzymet, der anvendes i denne proces, er TERMAMYL (produkt fra 10 Novo Nordisk A/S), en a-amylase fra Bacillus licheniformis. Forflydningen udføres ved pH omkring 6,0, efterfulgt af forsukring med giucoamylase ved et pH på . omkring 4,5-5,0.

Man har længe søgt efter stivelsesforflydningsenzymer, der er i stand til at forflyde ved pH 4,5 for at undgå behovet for den mellemliggende pH-justering. a- 15 amylase fra Bacillus stearothermophilus er blevet foreslået til dette formål, men data i denne ansøgning viser, at den ikke forfiyder godt ved pH helt nede på 4,5. US 4,578,532 og US 4,613,570 beskriver syrebestandig a-amylaser fra Clostridium, men data i de pågældende patenter viser, at deres stabilitet ved 100°C og derover ved pH 4,5 er utilstrækkelig.

20 Det er et formål med denne opfindelse at tilvejebringe en cyclodextringlycosyltransferase med tilstrækkelig varmestabilitet til at kunne anvendes til CD fremstilling ved 60°C og derover, hvor risikoen for mikrobiel infektion er ringe og endog at kunne anvendes til stivelsesforflydning over 90°C, hvor stivelsen er fuld forklistret.

25 Det er også et formål med opfindelsen at tilvejebringe et enzym, der er i stand til at forfiyde stivelse ved pH 4,5 og en temperatur over 100°C.

Andre formål med opfindelsen er at tilvejebringe en fremgangsmåde til at fremstille det pågældende varmestabile enzym og en mikrobiel stamme, der er i stand til at fremstille det. Det er endvidere et formål at tilvejebringe en fremgangs- <? 30 måde, der anvender det nævnte enzym til at fremstille CD ved 60°C og derover og en fremgangsmåde, der anvender det nævnte enzym til stivelsesforflydning ved pH omkring 4,5-5,0.

3 DK 170307 B1

Opfinderne har isoleret et antal termofile, obligat anaerobe stammer, der fremstiller CGTaser med overraskende varmestabilitet.

Følgelig tilvejebringer opfindelsen i sit første aspekt en cyclodextringlycosyltransferase (CGTase), der er kendetegnet ved, at den er afledt 5 af en CGTasedannende stamme af Thermoanaerobacter eller Thermoanaerobium, og at den har et temperaturoptimum målt ved pH 5,0 på omkring 95°C; et pH optimum på omkring 5,0; og en restaktivitet efter 40 minutters inkubering ved 80°C og pH 5,0 på omkring 95% uden tilstedeværelse af stivelse og Ca++.

Et andet aspekt ved opfindelsen tilvejebringer en fremgangsmåde til 1 o fremstilling af cyclodextringlycosyltransferasen ifølge opfindelsen, der er kendetegnet ved, at en CGTasedannende stamme af Thermoanaerobacter eller Thermoanaerobium dyrkes under anaerobe betingelser, hvorefter CGTasen udvindes fra gæringsmediet.

Et tredje aspekt ved opfindelsen tilvejebringer en fremgangsmåde til 15 fremstilling af cyclodextringlycosyltransferase ifølge opfindelsen, der er kendetegnet ved, at en transformeret værtsorganisme, der indeholder den relevante genetiske information fra Thermoanaerobacter eller Thermoanaerobium, dyrkes under aerobe betingelser i et egnet næringsmedium, hvorefter CGTasen udvindes fra gæringsmediet.

20 Et fjerde aspekt af opfindelsen tilvejebringer en biologisk ren kultur af en stamme af Thermoanaerobacter eller Thermoanaerobium til brug ved ovenfor angivne fremgangsmåde, kendetegnet ved, at stammen er ATCC 53627, eller én af stammerne NCIB 40053 til NCIB 40059 eller en mutant deraf, som er i stand til at danne cyclodextringlycosyltransferase, der har et temperaturoptimum målt ved pH 25 5,0 på omkring 95°C; et pH optimum på omkring 5,0; og en restaktivitet efter 40 minutters inkubering ved 80eC og pH 5,0 på omkring 95% uden tilstedeværelse af stivelse og Ca++.

Et femte aspekt ifølge opfindelsen tilvejebringer en fremgangsmåde til forflydning af stivelse, kendetegnet ved, at man udsætter en vandig 30 stivelsesopslemning for enzymatisk forflydning i tilstedeværelse af CGTasen ifølge opfindelsen ved pH i området fra ca. 4,0-5,5, fortrinsvis ved en temperatur over 100°C.

4 DK 170307 B1

Et sjette aspekt ifølge opfindelsen tilvejebringer en fremgangsmåde til fremstilling af dextrose, kendetegnet ved, at man udsætter en vandig stivelsesopsiemning for enzymatisk forflydning i tilstedeværelse af CGTasen ifølge opfindelsen ved pH i området fra ca. 4,0-5,5 (fortrinsvis ved en temperatur over 5 100°C), hvorefter man forsukrer den forflydede stivelsesopsiemning i tilstedeværelse af glucoamylase, i det væsentlige uden en mellemliggende pH-justering.

Et syvende aspekt ifølge opfindelsen tilvejebringer en fremgangsmåde til fremstilling af cyclodextrin, kendetegnet ved, at man behandler en forflydet stivelsesopløsning med cyclodextringlycosyltransferasen ifølge opfindelsen ved en 10 temperatur på over 60°C og derefter udvinder et cyclodextrinprodukt fra reaktionsblandingen.

Endelig tilvejebringer et ottende aspekt ifølge opfindelsen en fremgangsmåde til fremstilling af cyclodextrin, kendetegnet ved, at man behandler en vandig stivelsesopsiemning med cyclodextringlycosyltransferasen ifølge 15 opfindelsen ved en temperatur på over ca. 100°C og ved et pH i området 4,0-5,5, fortrinsvis i det væsentlig uden tilsætning af et kalciumsalt, og derefter holder den dannede sirup ved en temperatur i området 80°-90°C i ikke mere end 28 timer, hvorved siruppen er i området 20-30 DS i i hvert fald en del af den nævnte opholdstid, og at man derefter udvinder et cyclodextrinprodukt· fra 20 reaktionsblandingen.

Mikroorganismerne ifølge opfindelsen er termofile, obligat anaerobe bakterier, der tilhører slægten Thermoanaerobacter (J. Wiegel og L.G. Ljungdahl,

Arch. Microbiol. [1981] 128:343-348) eller slægten Thermoanaerobium (J.G. Zeikus et al., Arch. Microbiol., 122, 41-48 [1979]). Taxonomien for disse slægter er ikke 25 fastlagt, og det anses for sandsynligt, at de to slægter egentligt burde klassificeres som én og samme slægt, eftersom de ligner hinanden så meget, at selv en ekspert i området ikke kan skelne dem.

I modsætning til kendte stammer af Thermoanaerobacter og Thermoanaerobium kendetegnes de mikrobielle stammer ifølge opfindelsen ved * 30 evnen til at danne CGTase og ved at være ikke-motile. Nogle stammer ifølge opfindelsen er også indolpositive i modsætning til kendte stammer. De kendte 5 DK 170307 B1 stammer T. ethanolicus DSM 3389 og T. finii DSM 2246 har vist sig ikke at danne termostabil CGTase.

8 stammer blev isoleret af opfinderne og blev deponeret ved American Type Culture Collection (ATCC) og The National Collections of Industrial Marine 5 Bacteria (NCIB) til patenteringsformål under Budapesttraktatens betingelser som følger:

Deponerinasnr. Deponerinasdato Deponentens reference 1. ATCC 53,627 3. juni 1987 ANO-15-7-5A2-70 2. NCIB 40,053 6. oktober 1988 ANO-16-7-2A-70 10 3. NCIB 40,054 6. oktober 1988 ANO-16-7-4A-70 Γ 4. NCIB 40,055 6. oktober 1988 ANO-36-7-1 5. NCIB 40,056 6. oktober 1988 ANO-38-7-1 6. NCIB 40,057 6. oktober 1988 ANO-44-5-1-55 7. NCIB 40,058 6. oktober 1988 ANO-51-7-1-70 15 8. NCIB 40,059 6. oktober 1988 ANO-55-7-1-70

Mutanter af de ovennævnte stammer med væsentlig samme egenskaber er også indenfor opfindelsens omfang.

Disse 8 stammer blev alle klassificeret af NCIB, Skotland som Thermoanaerobacter sp. eller Thermoanaerobium sp., idet det ikke kunne afgøres, 20 hvilken af disse to slægter, der var tale om. Øvrige taksonomiske data er angivet nedenfor.

3 6 DK 170307 B1

Stammenr. 12345678 inkubering ved "C 55 60 60 60 60 60 60 60 5 _—----------

Cellemorphologi (a) (b)

Gram ------- var.

Sporer --------

Motilitet -------- 10

Koloni- morphologi (c) (d) (d) (d) (d) Vækst 30’C (e) 15 37°C ND ND + 50° C +

Viscøs ved KOH test + + + + + + + + '20 Vækst i (+)+ + + + -- + glucose Ye Vækst i TYG + ND ND + ND - - + 25

Catalase --------

Oxidase, Kovacs ------- P-W-S (f) 30

Chloramphenicol-sensitivitet + Hæmolyse på 35 hesteblodagar

Lakmusmælk- +

reduktion PNPG

40 H2S dannelse +

Se noter (a) - (f) på næste side 7 DK 170307 B1

Noter: (a) Granulære stave af variende længde, i kæder.

(b) Regelmæssige stave, "granulær" farvning, enkelte eller i kort kæder.

(c) (Stivelsesagar, 3 dage): rund, regelmæssig, hel, glat, lav (?), konveks s (?), uklar, gulbrun, 2,5 mm diameter (d) (R.C.M., 3 dage): rund, regelmæssig, hel, glat, skinnende, gennemsigtig, flad, hvid, 3 mm diameter.

(e) + (langsom 7 dage).

(f) Pepton vand sukker: ingen syre eller gas.

} 10 ND Ikke bestemt.

8 DK 170307 B1

API 20A Anaerob test 24 timer 60°C

5 Stammenr. 12345678

Indol + ---

Urease NC NC - - - NC NC

10 Syre fra:

Glucose ---

Mannitol ---

Lactose --- 15 Sucrose + --

Maltose +-+

Salicin +--

Xylose +++ t Arabinose --+ 20 Glycerol ---

Cellobiose ± - +

Mannose +-+

Melezitose -

Raffinose --- 25 Sorbitol ---

Rhamnose --+

Trehalose ± (+) +

Gelatinase* -++

Aesculin 30 hydrolyse +++ NC Ingen ændring efter inkubering ± Svag reaktion * Kan være fejlreaktion på grund af høj temperatur 35 CGTase-enzymet kan fremstilles ved at dyrke en mikrobiel stamme ifølge opfindelsen (f.eks. ATCC 53,627) under anaerobe betingelser i et medium, der indeholder maltodextrin som C-kilde, gærekstrakt og mineralopløsninger. Optimal pH og temperatur for dannelse af CGTase er pH 7,0 og 67°C. Enzymet udskilles i gæringsmediet, hvilket viser, at det er et ekstracellulært enzyme.

40 Alternativt kan CGTase ifølge opfindelsen fremstilles ved aerob dyrkning af en transformant, der indeholder den relevante genetiske information. I almindelighed vil denne fremstillingsmåde omfatte følgende trin: 9 DK 170307 B1 (a) tilvejebringelse af en egnet rekombinant DNA kloningsvektor, der omfatter DNA sekvenser, der koder for funktioner, som letter genudtryk, og en DNA sekvens, der koder for CGTasen fra en ThermoanaerobactereWer Termoanaerobium stamme; 5 (b) transformation af en egnet værtsorganisme med kloningsvektoren fra trin (a); (c) dyrkning af den transformerede værtsorganisme under aerobe betingelser i et egnet næringsmedium og derefter udvinding af CGTasen fra mediet.

Eksempier på egnede værtsorganismer er stammer af Escherichia, to Streptomyces, Bacillus eller Aspergillus, fortrinsvis en stamme af £ coli, B. subtilis, B. licheniformis eller A. oryzae.

CGTasen kan udvindes ved at fjerne cellerne fra gæringsmediet og derefter koncentrere gæringsvæsken, f.eks. ved ultrafiltrering.

Med henblik på at kendetegne CGTasen blev det rå præparat fra ATCC 15 53,627 oprenset til homogenitet ved DEAE-Sepharosechromatografi, Chromatofocusing®, og acarbose-Sepharoseaffinitetschromatografi. Tre komponenter betegnet I, II og III blev oprenset. Kun én CGTase-komponent blev fundet i de rå præparater fra de andre stammer, baseret på SDS-polyacrylamid-gel-elektroforese.

20 CGTaserne ifølge opfindelsen er kendetegnet ved en termostabilitet, der er langt bedre end tidligere kendte enzymer. Efter inkubering i 5% Lintner-stivelse -0,1 M natriumacetat pH 5,0 (50 ppm Ca++) - i 50 minutter ved 95°C bevarer CGTase ifølge opfindelsen (ATCC 53,627) næsten 100% af sin aktivitet.

Figur 3 viser restaktiviteten af rå CGTase fra ATCC 53,627 efter 40 25 minutters inkubering ved forskellige temperaturer ved pH 5,0 uden tilstedeværelse af substrat og Ca++. Som vist bevarer den ca. 95% af sin aktivtet ved 80°C under disse betingelser. Til sammenligning vises også data for to tidligere kendte □ forflydningsenzymer: α-amylase fra Bacillus licheniformis (Termanyl ) og a-amylase fra Bacillus stearothermophilus.

30 Komponenterne I, II og III har tilsvarende termostabilitet som den rå CGTase fra ATCC 53,627. Til sammenligning er det rapporteret, at Bacillus 1° DK 170307 B1 macerans CGTase kun er stabil ved temperaturer under 50°C og hurtigt mister aktivitet over 50°C (Stavn, A. og Granum, P.E. i "Carbohydrate Research", 75 [1979]243).

Temperaturens indflydelse på CGTase-aktiviteten blev undersøgt. CGTasen fra ATCC 53,627 har et temperaturoptimum på 95°C ved pH 5,0 i 0,1M 5 natriumacetat - 100 ppm Ca++ (se figur 1). Dette optimum står i modsætning til optimum for Bacillus macerans CGTase, som er rapporteret tii 55°C ved pH 6,0 (Stavn, A. og Granum, P.E. i "Carbohydrate Research", 75[1979]243).

pH’s indflydelse på CGTase-aktiviteten blev undersøgt ved 60°C. pH-optimum for CGTase fra ATCC 53,627 er 5,0 med bred aktivitet i det sure område 10 ved afprøvning i et puffersystem af citratphosphat-0,5% Lintner-stiveise-100 ppm Ca++ (se figur 2). Denne værdi svarer til pH-optimum på 5,2-5,7, der er rapporteret for Bacillus macerans CGTase (Stavn, A. og Granum, P.E. i "Carbohydrate Research", 75 [1979]243).

Molekylvægten for CGTaserne bestemt ved SDS-poiyacrylamid-gel-15 eiektroforese efterfulgt af et overtræk med 0,8% Lintner-stiveise-iod Gelrite® ved pH

6,0, 55°C var som følger: ATCC 53,627 I 117.000 Daltons ATCC 53,627 II 110.000- ATCC 53,627 III 108.000- 20 NCIB 40,053 99.000 - NCIB 40,054 106.000- NCIB 40,055 104.000- NCIB 40,056 101.000- NCIB 40,057 126.000 - 25 NCIB 40,058 210.000 - NCIB 40,059 154.000 -

Disse resultater viser, at CGTaserne alle er forskellige. «

Isoelektrisk fokusering med en LKB Ampholine PAG plade pH 3,5-9,5 efterfulgt af overtræk med 0,8% Lintner-stivelse iodagar ved pH 6,0, 55eC har vist, 30 at de isoelektriske punkter for CGTase I, II og lil er henholdsvis 4,55, 4,50 og 4,50.

11 DK 170307 B1 NPLC mec*Aminex® HPX-42A (Bio-Rad) med brydningsindeksdetektor viste, at reaktionsmønstrene, der dannes ved nedbrydelse af Lintner-stivelse med hvert enkelt CGTase fra ATCC 53,627, var ens (se figur 4). De tre CGTaser er derfor katalytisk ens. De tre toppe til højre fremkommer efter hydrolyse og har ved NMR 5 vist sig at være (fra venstre til højre) henholdsvis a, γ og B-cyclodextrin.

I figur 7 sammenlignes reaktionsmønsteret, der dannes ved CGTase ifølge opfindelsen (ATCC 53,627) med et kendt forflydningsenzym, nemlig a-amyiase fra Bacillus stearothermophilus.

Bestemmelse af % omdannelse til α, γ og B-cyclodextrin under 10 forflydningen med CGTase fra ATCC 53,627 ved en standardosering på 4,46

Phadebas U7G DS er vist nedenfor. Betingelserne var 35% DS majsstivelse ved pH

4,5 med primær forflydning ved 105°C i 14 minutter og sekundær forflydning ved 90°C i 4 timer. Desuden vises % omdannelse med CGTase (6,8 Phadebas U/g DS) 2+ med 5% DS Lintner-stivelse - 0,1 M natriumacetat (50 ppm Ca ) ved pH 5,0 og 15 95°C i 50 minutter. Ved forflydning dannes ligelige mængder af α og γ-cyclodextrin men næsten dobbelt så meget B-cyclodextrin. Ved reaktionen med Lintner-stivelse dannes dobbelt så meget B-cyclodextrin som γ-cyclodextrin men 3 gange så meget α-cyclodextrin som γ-cyclodextrin.

20 Reaktion Cyclodextrin

a-CD γ-CD β-CD

Lintner-stivelse 13,8 4,4 9,3 25

Forflydning 3,8 3,6 6,4

En sammenligning af CGTase ifølge opfindelsen med offentliggjorte data for en række kendte CGTaser vises i tabellen nedenfor. En række tydelige forskelle 30 træder frem, især temperaturoptimum og -stabilitet DK 170307 B1 _ ——— 3 <« ϋ Ό O — — O o · o in o o· vo o in ' O ' π u ft hoo vo t** ό «η· g 0 οι n cm o ιιοο K P U ins in h ms 2 o o w m ft ό λ 5 -η ε-< « ^ in η ^ § _«__<__ S η — <<3 8» oj co ο ο — 3 ο ο ' ο ιη ο ο ι-l« Η «3* Ο · f' ' ' 0 ' Β na μ·*· ο ιη co ο t" S -πω ο tn co in s i i vo do a co ft in in κ * (0 Eh '— ' ' a w _β__<__» t» >-- 2 in a — — □ SCO O Of' o 9 η (0 σι ο o u * o - a η ρ «ψνοο · vo m «vo n -ho n in i in

a O O o m· .tn in a cm in S

2 id id ft > ft' ft § CQ g H _^ in_-- o — , m m vo ο o — S to c σι - Ο- o g 3 id <n vo •t'O O' *** η η σι in I · t' h 3 o w a o in ο- -ho oo ft ' in a S O h Eh co '-'f' ft H «5 -H <3 ^ 2 CQ o in § g o £3 co — —

S 01 -Η ' Ο O CM O

2 3 P VOO O'' O' g η a) o · i*. vo · t" 5 h -p ' m i m rj h (ti r- in in k cm in £ goov or« ft' ft g id a) ' ^ in ^ g CQ g «ο 0 -----

g L

S ai — — £5 οι λ ω o o o s 3·Ρ3οοο O' O' GHOHOinO · t' O · F·

d Η Ρ -Η I Ο ' O

□ riidi o m1 co r'ffivo ins doaiftEn vo ft ft S m-ρο ^ ^ g CQ M g___ S a t" m SI oi cm m ο ο o — — g H VO'OOO o o fj Ο n «i* OOO Ο ' O O' w ό in « . . « in «in c Ο'ωοΓ'ΐη in o 3 -η ο ο ο η η σ x ω κ *· Ί-l Eh in H H H ft ft tu ft «< ' ^ w H * fc p Π -P -p

5 * g *H

S G 3 H<*>

P 3 g *H O

S ft H sx O

5 P Id H p

S * ft P I «J

w οι p o oi m — ρ HCJV p g P en Ρ P i

P 8 3 3 3 , <U W

-P > -P g Ρ Ρ Ρ Λ .¾ H id -H <d 0) -H 3 <U>1 P P PP>01 H^i— a> ft <3 rtJ -η o> a> w ft o ft > p c o hq g i gal.*« in 0 CO 0) s 4) Λ <0 Ό

Hg'-' El ft H ^ 3 - ——--- Hl 13 DK 170307 B1

Forflydningen af stivelse tjener til delvis at depolymerisere og opløseliggøre stivelse, således at den bliver modtagelig for den efterfølgende enzymatiske forsukring, f.eks. med glucoamylase. Industrien har i stort omfang valgt at bruge forflydningsprocessen ifølge US 3,921,590. Typiske betingelser er opvarmning til 105°C, f.-5 eks. ved jetkogning, ophold i 5 minutter ved den temperatur efterfulgt af et 90 minutters ophold ved 95°C med B. licheniformis a-amylase ved ca. pH 6. Eftersom glucoamylase anvendes ved et pH omkring 4,0-5,5, har man ønsket at forflyde ved et pH i dette område, α-amylase fra B. stearothermophilus forflyder godt ved pH 5,8, men begge de nævnte a-amylaser er ude af stand til at forflyde under pH 5,0. Forflydni-10 ngsprocessen ifølge denne opfindelse udføres ved omkring pH 4,0-5,5 (fortrinsvis 4,5-5,5), hvorved efterfølgende forsukring kan udføres uden mellemliggende pH-just-, ering.

CGTasen ifølge denne opfindelse kræver ikke Ca++ af hensyn til stabiliteten selv ved lavt pH, så tilsætning af calciumsalt er normalt ikke nødvendigt.

15 Passende forflydningsbetingelser er ca. 1 -60 minutter ved ca. 100-115°C, fortrinsvis efterfulgt af ophold i ca. 50 minutter til 4 timer ved ca. 80-100°C. En kontinuert proces foretrækkes og opvarmningen sker fortrinsvis ved jetkogning. CGTasen ifølge opfindelsen forflyder stivelse godt ved doseringsniveauer ved 2-5 Phadebas U (se nedenfor) pr. gram stivelse DS (tørstof). Stivelseskoncentrationen vil som regel 20 være i området 15-40% DS (vægt-% tørstof) oftets 25-35% DS.

a-amylasekatalyseret hydrolyse af stivelse resulterer i en reduktion af viskositeten samtidigt med en forøgelse i reducerende sukker. CGTase nedbryder også stivelse men stort set uden dannelse af reducerende sukker. De enzymatiske reaktioner nedsætter polymerisationsgraden betydeligt og frembringer derved en oplø-25 sning, der indeholder højmolekylære maltodextriner sammen med et betydeligt indhold af a-, 8- og γ-cyclodextriner. Omdannelsen af 35% DS majsstivelse ved pH 4,5 fra forflydning ved 105°C i 14 minutter og en opholdsperiode ved 90°C på 4 timer til a-, 8- og γ-cyclodextrin er således henholdsvis 3, 8%, 6,4% og 3,6%.

Forflydningsprocessen ifølge opfindelsen kan anvendes til at fremstille 30 dextrose (glucose) i højt udbytte fra vådformalet majsstivelse eller anden raffineret stivelse ved forflydning med CGTasen efterfulgt af forsukring med glucoamylase alene eller sammen med pullulanase.

14 DK 170307 B1

Forflydningsprocessen ifølge opfindelsen kan også anvendes til at fremstille ethanol udfra stivelsesholdig biomasse. I dette tilfælde forflydes biomassen med CGTase ved et pH på 4,5-5,5 efterfulgt af forsukring med glucoamylase til dannelse af glucose og samtidig eller efterfølgende gæring af glucosen til ethanol med gær.

5 Derefter kan alkoholen udvindes ved kendte metoder. Fortrinsvis udføres hele processen ved et pH omkring 5,0 uden nogen mellemliggende pH-justering, og samtidig forsukring og gæring udføres ved ca. 30°C i op til 72 timer. Forffydningen kan udføres enten ved lave DS niveauer (DS 15-20%) eller høje DS niveauer (DS 20-40%). I processerne ved højt DS må DS niveauet reduceres til ca. 20% forud for gæring for 10 at opnå en maksimal gærtolerance på ca. 10 volumen-% alkohol.

Råmaterialet til alkoholfremstilling kan omfatte raffineret stivelse, såsom vådformalet majsstivelse; rå, ubehandlede materialer, såsom majs, hvede, ris, sorghum, cassawa og katofler (hvis stivelsesindhold kan variere fra 15-80%); og andre stivelsesholdige materialer, såsom affalds- og biprodukter fra industrien. I tilfælde af raf-15 fineret stivelse omfatterforflydningsprocessen fortrinsvis en forbehandling over 100°C efterfulgt af et ophold ved en lavere temperatur for at fuldende forflydningen. I tilfælde af andre råmaterialer (med lavere stivelsesindhold) udføres forflydningen fortrinsvis i området 60-100°C.

Denne opfindelse tilvejebringer en fremgangsmåde til fremstilling af cyclo-20 dextriner med termostabil CGTase. I processen ifølge denne opfindelse behandles forflydet stivelse enzymatisk med CGTasen ved en temperatur over ca. 60°C, fortrinsvis i ikke mere end 24 timer og derefter udvindes cyclodextrinerne fra reaktionsblandingen.

I en foretrukken udførelsesform omfatter processen forflydning af en sti-25 velsesopslemning med CGTase-enzymet ved ca. pH 5,0 ved en forbehandlingstemperatur over ca. 100°C, efterfulgt af omdannelse af den forflydede stivelse til cyclode-xtriner ved at holde den forflydede stivelse ved ca. 80-90°C i op til ca. 24 timer i et opholdstrin, fortrinsvis uden pH-justering og fortrinsvis uden at gendosere enzymet.

I modsætning til tidligere kendte processer anvender processen ifølge 30 denne opfindelse temperaturer, der er tilstrækkeligt høje til at undgå væsentlig risiko for mikrobiel infektion, hvilket selvfølgeligt er fordelagtigt. En anden fordel, der er knyttet dertil, er at den enzymatiske omdannelse foregår hurtigere med CGTasen ved 15 DK 170307 B1 de høje omdannelsestemperaturer. Behandlingstid på under ca. 24 timer på et allerede forflydet stivelsessubstrat påtænkes ved udøvelsen af denne opfindelse. På trods af de ovennævnte fordele er omdannelse af allerede forflydet stivelse ikke en særlig foretrukken udførelsesform. Det er langt mere fordelagtigt at begynde processen 5 med rå stivelse, f.eks. en stivelsesopslemning og anvende CGTasen til at danne forflydet stivelse derfra.

CGTase-enzymet kan anvendes til at forflyde stivelse (dvs. danne en hældbar sirup fra en stivelsesopslemning) i pH-området 4,0-5,5 uden tilstedeværelse af tilsat calcium og under standardbetingelser til stivelsesforflydning (som beskrevet 10 ovenfor). Brug af CGTasen til at forflyde en stivelsesopslemning og så til at omdanne den forflydede stivelse til cyclodextriner er en yderst fordelagtig proces og udgør den foretrukne udførelsesform.

Under forflydning af stivelse med CGTase foregår der samtidigt en omdannelse af stivelse til cyclodextriner. En betydelig mængde cyclodextriner er 15 således opnået og er tilstede i den forflydede stivelse, før denne omdannes enzymatisk til cyclodextriner.

Det opnåelige udbytte af cyclodextriner direkte fra stivelsesforflydningsprocessen anses generelt for at være utilstrækkeligt. Desuden forøges udbyttet af cyclodextriner betydeligt ved enzymatisk omdannelse af den 20 forflydede stivelse med CGTase.

Behandlingen af den (jet) kogte stivelse ved ophold ved høj temperatur som er en del af standardprocessen for stivelsesforflydning, kan udstrækkes til ca. 24 timer dog fortrinsvis ved ca. 90°C for at omdanne mere af den forflydede stivelse til cyclodextriner, idet der om ønsket kan udføres en vis fortynding af den forflydede 25 stivelse til et mere optimalt DS niveau under omdannelsen. Hvis en pH-justering ønskes af hensyn til optimal enzymatisk omdannelse til cyclodextriner kan den udføres enten i begyndelsen af stivelsesopslemningen eller samtidigt med fortyndingen. Gentilsætningen af mere CGTase-enzym efter stivelsesforflydningen har dog vist sig at være unødvendig.

30 På grund af termostabiliteten af cyclodextringlycosyltransferasen ifølge opfindelsen, som muliggør dens anvendelse ved højere enzymatisk omdannelsestemperaturer end med tidligere kendte enzymer (især højere end med 16 DK 170307 B1

Bacillus macerans enzymet, hvis temperaturgrænse er 50°C), kan den kombinerede forflydning- og omdannelsesproces udføres uden nogen væsentlig mellemliggende afkøling af siruppen. Med andre ord kan man på grund af denne evne til at danne cyciodextriner ved høj temperatur undgå de lange reaktionstider, der hidtil har været 5 anvendt, og ved udøvelsen af denne opfindelse påtænkes reaktionstider på under ca. 24 timer for den enzymatiske omdannelse af den forflydede stivelse. Stivelsen, der anvendes ved udøvelsen af opfindelsen, kan være af en hvilken som helst vegetabilsk oprindelse såsom glutinosusvarietet af majs, almindelig majs, hvede, sorghum, kartofler, tapioca, ris eller sago. Foruden umodificerede former af 10 stivelsesarterne kan modificerede former dannet ved behandling af stivelse med enzymer, syrer, alkalier o.s.v. også anvendes som substrater. Reaktionerne, der danner cyclodextrin, kan foregå på forflydet stivelse ved DS koncentrationer fra 1 til t 40% DS, men af hensyn til maksimal effektivitet i omdannelsen foretrækkes en opløsning med 20-30% DS. Om ønsket kan mere koncentrerede stivelsesopslem-15 ninger forflydes (idet standardbetingelser er 35% DS), og så fortyndes til 20-30% DS dextrinopløsninger til omdannelse til cyciodextriner.

For at sammenfatte betingelserne for hele processen med rå stivelse som udgangsmateriale kan CGTase ifølge opfindelsen anvendes ved mange forskellige betingelser, herunder de ret barske standardbetingelser for forflydning af 20 en 35% DS opslemning, nemlig jetkogning ved 105°C og 90 minutters ophold ved 95eC i pH-området 4,0-5,5 uden tilstedeværelsen af Ca++, efterfulgt af et længere ophold over 55°C i op til 24 timer. Af hensyn til maksimal omdannelse og/eller minimal brug af CGTase bør begge opholdstrin (som selvfølgelig kan være et enkelt forlænget ophold) udføres i området 80-90°C, og stivelseskoncentrationen bør være 25 i området 20-30% DS (enten i stivelsesopslemningen ved begyndelsen eller gennem fortynding af den forflydede stivelse.

For yderligere at sammenfatte kan cyclodextrinerne dannes ud fra forflydet stivelse ved inkubering af siruppen med CGTasen ifølge opfindelsen i temperaturområdet 50-95°C, fortrinsvis 80-90°C ved at reagere i ca. 24 timer eller 30 mindre i pH-området 4-9, fortrinsvis omkring pH 5,0. Cyclodextrinproduktet kan udvindes fra reaktionsopløsningen som hidtil. Desuden kan de udvundne cyciodextriner fraktioneres til a-, IB- og γ-cyclodextrin ifølge kendt teknik, f.eks. ved DK 170307 Bl 17 de metoder, der beskrives af D. French et al i Journal of American Chemical Society 71:353 (1949).

Batchvis omdannelse af stivelseshydrolysattil cyclodextriner med Bacillus macerans CGTase er hidtil ofte blevet udført i tilstedeværelse af en passende 5 kompleksdanner for at forskyde ligevægten i retning mod produktdannelse. Det er ønskværdigt at cyclodextrinclathrateme er uopløselige og derfor udfælder fra opløsning i reaktionsblandingen. Den kompleksbundne cyclodextrin kan udvindes ved filtrering eller centrifugering, og kompleksdanneren kan så udskilles ved kendte metoder. Egnede kompleksdannere for cyclodextrin omfatter cyclooctan, hexan, 1-10 butanol, 1-decanol o.s.v. Der kendes et antal kompleksdannere, der selektivt danner kompleks med a- eller B-formen (se US patentskrift nr. 3,640,847). Specielt er cyclooctan selektiv for B-cyclodextrin medens 1-decanol er selektiv for a-cyclodextrin. Ved udøvelsen af denne opfindelse påtænkes det at udføre omdannelse med CGTase i tilstedeværelse af kompleksdannere.

15 Aktiviteten til stivelsesdextrinisering af CGTasen måles med Pharmacia

Phadebas (R) Amylase Test ved pH 6,0, 60°C ved at inkubere 200 μ\ af enzymopløsningen med 4,0 ml 0,1 M natriumacetat (100 ppm Ca++) og en Phadebas Tablet i 15 minutter. Reaktionen stoppes med 0,5 ml af 1,0 N HCI.

Prøveopløsningen centrifugeres i 2 minutter i en Eppendorf centrifuge 20 ved stuetemperatur, og supernatantens absorbans måles ved 620 nm, hvorved en absorbansværdi på 1,0-3,0 bør opnås. En standardkurve, der anvender Bacillus licheniformis a-amylase som standard, blev opstillet, hvori én Phadebas-enhed defineres som mængden af enzym, der vil katalysere hydrolysen på 1,0 μ-mol af glucosidbindinger af Lintner-stivelse pr. minut ved 60°C, pH 6,0.

25 Udbytterne af α-, B og -y-cyclodextriner blev bestemt ved BioRad

Aminex® Carbohydrate HPX-42a High Performance Liquid Chromatography. To søjler (300 x 7,8 mm) blev anvendt i tandem ved 85°C med glas-destilleret vand som eluent ved en strømningshastighed på 0,6 ml/minut. Påvisning skete ved brydningsforhold. Standardkurver blev opstillet med autentiske prøver af α-, B og γ-30 cyclodextriner (Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri).

Figur 1 er en afbilding af relativ aktivitet mod temperatur for CGTasen fra ATCC 53,627.

18 DK 170307 B1

Figur 2 er en afbildning af relativ aktivitet mod pH for CGTasen fra ATCC

53,627.

Figur 3 er en afbildning af termostabiliteten af CGTase fra ATCC 53,627 i sammenligning med Bacillus stearothermophilus a-amylase og Termamyl®; 5 Figur 4 er HPLC-målingerne, der viser reaktionsmønsteret for CGTase I, II, III fra ATCC 53,627;

Figur 5 er en afbildning af viskositet mod tid, hvor stivelsesforflydning med CGTasenfra ATCC 53,627, Termamyl® og Bacillus stearothermophilus a-amylase sammenlignes; 10 Figur 6 viser en afbildning af vridningsmoment mod målingerne af omdrejningshastighed, der viser variationerne i viskositet af forflydede stivelsesopløsninger, der er opnået ved at variere doseringsniveauer af CGTase fra ATCC 53,627;

Figur 7 er HPLC-målingerne, hvor reaktionsmønsteret af CGTasen fra 15 ATCC 53,627 og a-amylasen og Bacillus stearothermophilus sammenlignes.

EKSEMPEL 1

Fremstilling af CGTase ved Anaerob dyrkning

Stammen ATCC 53,627 blev dyrket i et forreduceret flydende medium under argon ved et initialt pH på 7 omfattende nedenstående komponenter i gram 20 pr. liter:

Maltrin M-100, 5,0; KH2P04, 2,0; f^HPO,, 6,0; NaCI, 1,0; (NH4)2S04, 2,5;

MgS04.7H20,0,5; CaCI2.2H20,0,05; gærekstrakt, 2,0; Na^, 0,5; cystein-HCI, 0,5; resazurin (redoxindikator), 2 ng; og spormetaller 5,0 ml. Spormetalopløsningen bestod af nedenstående komponenter i gram pr. liter: FeCI3.6H20,5,40; ZnS04.7H20, 25 1,45; MnCI2.4H20,1,00; CuS04.5H20, 0,25; og H3B03, 0,10. Spormetalopløsningen blev omdannet til syre med koncentreret HCI for at opløse saltene.

Stammen blev inkuberet ved 67°C uden omrøring i 40 timer. Den maksimale aktivitet efter 40 timer var 200 Phadebas U pr. liter væske. Kulturvæsken 19 DK 170307 B1 blev centrifugeret, dernæst filtreret og endelig koncentreret til en volumetrisk aktivitet på 30-50 Phadebas U pr. ml ved anvendelse af et Millipore Minitan System.

Oprensning af CGTase fra ATCC 53,627 blev opnået ved på hinanden følgende trin med DEAE-Sepharose chromatografi, Chromatofokusering og 5 acarbose-Sepharose-affinitetschromatografi. DEAE-Sepharosechromatografi blev udført ved pH 7,5 i 10mM Tris-HCI (2,5 mM CaCy, 4°C under anvendelse af en lineær NaCI gradient 80-200mM). Chromatofokusering (Pharmacia) blev udført ved 4°C under anvendelse af en lineær pH gradient fra pH 7-5. Acarbose-affinitetschromatografi blev udført ved pH 6,0, 4°C, og eluering blev opnået ved en 10 0,1 M natriumacetat (100 ppm Ca++) puffervask. Tre særskilte CGTase-bestanddele betegnet I, II og III blev opnået ved Chromatofokusering, og oprenset til homo-geneitet ved acarboseaffinitetschromatografi. Den relative mængde af de tre CGTaser, fremkommet efter Chromatofokusering, var CGTase I - 20%, CGTase II -60% og CGTase III - 20%.

15 EKSEMPEL 2

Fremstilling af CGTase ved aerob dyrkning af en transformeret værtsorganisme Kromosomal DNA blev isoleret fra celler af stammerne ATCC 53,627 som følger. Celler (3,1 g våd vægt) blev suspenderet i 4,5 ml 25% sucrose - 50mM Tris pH 8,0 - 40mM EDTA. Suspensionen blev behandlet med lysozym (2 mg/ml) i 30 20 minutter på is efterfulgt af 30 minutter ved stuetemperatur. Pronase (1 mg/ml) blev tilsat og suspensionen blev inkuberet ved 37°C i 30 minutter. Lysatet blev ekstraheret to gange med 8 ml phenol i 30 minutter efter tilsætning af 3 ml 10mM Tris -1 mM EDTa pH 7,4 puffer. Den vandige fase blev dernæst ekstraheret to gange med 10 ml chloroform. DNA’et blev udfældet ved tilsætning af 0,45 ml 3M natriumacetat -25 1 mM EDTA pH 7,0 og 2,75 ml isopropanol og inkuberet på is i 5 minutter. DNA’et blev bragt i pilleform ved centrifugering og blev vasket én gang med 70% ethanol. Pillen blev tørret i 10 minutter under vakuum og dernæst genopløst i 15 ml 10mM Tris - 1mM EDTA pH 7,4 puffer.

20 DK 170307 B1 DNA-præparatet blev underkastet en centrifugering med cæsiumchlorid-gradient ved 15°C, 192.000 g i 40 timer. Det kromosomale DNA-bånd blev opsamlet, ekstraheret med isopropanol mættet med cæsiumchlorid tre gange og dialyseret overfor 10mM Tris - 1mM EDTA pH 7,4 puffer ved 4°C. En total mængde af 590 /jg 5 kromosomal DNA blev udvundet.

DNA’et blev delvist nedbrudt med restriktionsenzym EcoRI ved inkubering af 200 /tg med 33 enheder af EcoRI i 150 /ti af 50mM Tris pH 8,0 - 10mM MgCI2 - 100 mM NaCI i 12 minutter ved 37°C. Det delvist nedbrudte DNA blev underkastet en 10-40% sucrosegradient-centrifugering ved 135.000 g, 15°C i 16 10 timer. Fraktioner på 180 /il blev opsamlet og 5 /ti aliquoter blev analyseret ved 1% Agarose-gel-elektroforese. Fraktioner i størrelsesordenen fra 7 til 15 kb blev samlet, dialyseret overfor 1110mM Tris - 1mm EDTA pH 7,4 puffer, udfældet med ethanol, r og genopløst i 100 μ110 mM Tris - 1mM EDTA pH 7,4 puffer.

Vektoren pBR322 blev nedbrudt med EcoRI ved at inkubere 2,5 /tg med 15 30 enheder af EcoRI i 125 /ti af 50mM Tris pH 8,0 -10mM MgCI2 - 100mM NaCI i 2 timer ved 37°C. Analyse af DNA’et på en Agarose-gel viste, at nedbrydningen var fuldstændig. Den nedbrudte vektor blev ekstraheret to gange med phenol, én gang med ether og udfældet med ethanol.

Vektoren blev opløst i 100 /ti af 100mM Tris pH 8,0 -1mM MgCI2 og 20 dephosphoryleret med 20 enheder af alkalinsk phosphatase fra kalvetarme ved 37°C i 30 minutter. Den dephosphorylerede vektor blev ekstraheret med phenol to gange, ekstraheret med chloroform to gange og udfældet med ethanol. Det dephosphorylerede pBR322 blev opløst i 50 /ti 10mM Tris - 1mM EDTA pH 7,4 puffer.

Ugering af den nedbrudte pBR322 og stamme ATCC 53,627 DNA blev 25 udført ved at blande 0,4 /tg af den kromosomale DNA (7-15 kb), der var delvist nedbrudt med EcoRI og 0,1 /tg af pBR322, der var nedbrudt med EcoRI og dephosphoryleret med 10 enheder T4 DNA ligase i 20 /ti 50mM Tris pH 7,4-10 mM MgCI2 -20mM DTT -1mM ATP indeholdende 5 /tg BSA/ml og inkubation natten over ved 14°C.

30 Kompetente E. coli HB101 (ATCC 33,694) celler blev fremstillet til transformation ved metoden ifølge T. Maniatus, E.F. Fritsch, og J. Sambrook i "Molecular Cloning" - A Laboratory manual, side 250.

21 DK 170307 B1

Halvdelen af det ligerede DNA fremstillet som ovenfor blev transformeret i kompetente celler af E. coli HB101 i henhold til metoden ifølge Maniatus et al. (supra). Cellerne blev dyrket natten over ved 37°C på plader indeholdende Luria-Bertani (LB) medium og tetracyclin ved en koncentration på 15 /tg/ml. De tetracyclin-5 resistente kolonier blev dernæst overført på stivelsesplader indeholdende 1% amylopectin-LB medium og tetracyclin (15 øg/ml), og inkuberet natten over ved 37°C. Dannelse af CGTase blev afsluttet ved efter varmebehandlingen ved 70°C i 1 time at udsætte stivelsespladerne for iodinfordampning, hvor klaringszoner blev observeret.

10 En CGTase-positiv transformant betegnet E. coli NV601 blev udvundet fra over 5000 kolonier. Stammen var både ampicillin- og tetracyclinresistent. Udvinding af det rekombinante plasmid ved standard alkalinske spaltningsmetoder r og retransformering af kompetente E. coli HB101 celler gav CGTase-positive trans-formanter.

15 Restriktionsmapping af det rekombinante plasmid afslørede, at et DNA- fragment med en størrelse på 12,8 kb var blevet indsat i EcoRI-positionen af pBR322. "Deletion analysis" med restriktionsenzymet BamHI viste, at genet, der koder for CGTase, blev lokaliseret på et 6,0 kb BamHI-BamHI fragment.

CGTasen blev fremstillet ved dyrkning af E. coli NV601 i Luria-Bertani 20 medium indeholdende '\5μ2 tetracyclin pr. ml medium ved 37°C, 300 rpm i 24 timer. Cellerne blev opsamlet ved centrifugering og derefter nedbrudt sonisk.

Karakterisering af den rekombinante CGTase i forhold til den oprindelige (native) CGTase, hvad angår molekylvægt (SDS-PAGE), isoelektrisk punkt, termostabilitet,virkningsmønster,forflydningsaktivitetogcyclodextrinfremstilling,viste, 25 at der ingen forskel var mellem enzymerne. Den rekombinante CGTase krydsreagerede med antistof rejst mod den oprindelige CGT-ase (komponent II).

EKSEMPEL 3 22 DK 170307 B1

Cvclodextrinfremstillina

En sammenligning blev gjort mellem cyciodextrinudbytterne fremstillet med CGTase ifølge opfindelsen (ATCC 53,627) og CGTasen fra Bacillus macerans, 5 Da Bacillus macerans CGTasen ikke er i stand til at forflyde stivelse under normale jetkogningsbetingelser, blev en forbehandlet stivelse, dvs. lintner-stivelse, anvendt. Man lod enzymerne reagere med 15% DS Lintner-stivelse (plus 40 ppm Ca++) ved 50°C og 90°C, pH 5,0 i 24 timer. Doseringen var 4,46 Phadebas U pr. gram DS stivelse. Man lod også CGTasen fra Bacillus macerans reagere ved pH 7,0 som 10 ovenfor som blindforsøg.

r

Cyclodextrinudbytte

CGTase pH Temp. α-CD y-CD β-CD Total Total CD

15 (*C) % % % CD, % g/100 ml

Opfindelse 5,0 50 14,9 7,0 15,3 37,2 5,6 5.0 90 14,9 6,6 14,6 36,1 5,4 20 Bacillus 5,0 50 10,2 5,7 13,8 29,7 4,5 macerans 5,0 90 0,3 0 0 0,3 0,1 7.0 50 10,1 5,4 14,5 30,0 4,5 7.0 90 0,5 0 0,5 1,0 0,2 25 --------

Resultaterne viser, at CGTase ifølge opfindelsen giver udmærket konvertering ved 50°C, hvilket er det optimale for det kendte B. macerans enzym. CGTasen ifølge opfindelsen viser i det væsentlige den samme høje konverteringsgrad ved 90°C, hvor man kan iagttage, at det kendte enzym næsten 30 er inaktivt. CGTasen ifølge opfindelsen danner a- 6- og γ-cyclodextrin i forholdet (ved 50°C) 0,74:1,0:0,41, dvs. relativt mere α-CD end B. macerans enzymet.

EKSEMPEL 4 23 DK 170307 B1

Stivelsesforflvdnina ved forskellige pH-værdier 35% DS majsstivelse med eller uden 40 ppm Ca++ blev forflydet ved 105°C i 14 minutter efterfulgt af 4 timer ved 90°C. Enzymdoseringen var 4,46 5 Phadebas U/g DS (60°C, pH 6,0). CGTase ifølge opfindelsen (ATCC 53,627) blev sammenlignet med Termamyl® (B. licheniformis a-amylase, der kan rekvireres fra Novo Nordisk A/S) og S. stearothermophilus a-amylase (der fås som G-Zyme® G995 fra Enzyme Bio-Systems, Ltd.).

Dextroseækvivalent (DE) blev målt efter forflydning, og stivelsen ansås 10 som forflydet, hvis stivelsessiruppen efter forflydningen var hældbar (hvilket viser en væsentlig reducering af viskositet).

Enzym pH Ca++ DE Forflydet 15 CGTase 4,5 + 0,51 Ja CGTase 4,5 - 0,44 Ja CGTase 5,0 + 0,73 Ja CGTase 5,0 - 0,69 Ja CGTase 5,5 + 1,10 Ja 20 CGTase 5,5 - 0,83 Ja BS Amylase 4,5 + Kan ikke bestemmes Nej BS Amylase 4,5 - Kan ikke bestemmes Nej BS Amylase 5,0 + 4,78 Ja* 25 BS Amylase 5,0 - Kan ikke bestemmes Nej BS Amylase 5,5 + 9,78 Ja BS Amylase 5,5 - 5,58 Ja BS Amylase 5,8 + 13,6 Ja 30 Termamyl 6,2 + 14,4 Ja * Anset som forflydet, men meget viskøs.

Det ses, at god forflydning kan opnås med CGTase ifølge opfindelsen selv ved pH så lavt som 4,5 uden tilsætning af Ca++, og i det væsentlige uden 35 dannelse af reducerende sukkerarter.

EKSEMPEL 5 24 DK 170307 B1

Stivelsesforflvdnina ved forskellige enzvmdoserinaer

35% DS majsstivelse blev forflydet med CGTase (ATCC 53,627) ved pH

4.5 uden tilsætning af Ca++. Enzymdoseringer på 0,223,0,446,0,892,2,23 og 4,46 5 Phadebas U/g DS blev anvendt. Til sammenligning blev Termamyl anvendt ved pH

6,2 og S. stearothermophilus amylase ved pH 5,8, begge ved 4,46 U/g DS og i tilstedeværelse med 40 ppm Ca++. Forflydningsbetingelser var 14 minutter ved 100°C eller 105°C (som nedenfor angivet), efterfulgt af 4 timer ved 90°C. Efter forflydning blev viskositet målt ved 60°C med en Haake Rotovisco RV12 viskometer 1 o med NV sensorsystem og M500 "measuring drive unit" ved de respektive pH-værdier for forflydning. Resultater fremgår af nedenstående og vises i fig. 6.

r

Enzym Dosering Tilsat pH Primær Viskositet (CP) U/g DS ++ forflyd,- ved omdrejnings 15 Ca + temp. hastighed 32 CGTase 0,223 - 4,5 100eC *) CGTase 0,446 - 4,5 100eC *) CGTase 0,892 - 4,5 105*C 208 20 CGTase 2,23 - 4,5 105°C 66,9 CGTase 4,46 - 4,5 105°C 42,4

Termamyl 4,46 40 ppm 6,2 105°c 41,6 BS amylase 4,46 40 ppm 5,8 105°C 34,1 25 *) Måling var ikke mulig ved denne hastighed

Resultaterne viser, at et doseringsniveau på 2-5 U/g DS af CGTase er egnet.

EKSEMPEL 6

Forsukrina af forflvdet stivelse 30 De forflydede stivelsesprøver fra eksempel 4 blev indstillet til pH 4,3 eller 4.5 ved 60°C og Dextrozyme® 150/50 blev tilsat med en dosering af 1,2 l/t DS.

DK 170307 B1 25

Dextrozyme® er en blanding af gluco-amylase fra Aspergillus niger og pullulanase fra Bacillus acidopullulyticus; dette kan rekvireres hos Novo Nordisk A/S. Forsukring blev udført i 48 timer ved 60°C, og dextrose blev bestemt ved Bio-Rad Aminex® HPX-87C HPLC.

5 -----

Enzym pH ved pH ved Ca 1 % Dextrose forflydn. forsukring CGTase 4,5 4,5 + 96,0 10 CGTase 4,5 4,5 - 96,0 CGTase 5,0 4,3 + 95,6 CGTase 5,0 4,3 - 95,5 CGTase 5,5 4,3 + 95,7 CGTase 5,5 4,3 - 95,8 15 » BS Amylase 4,5 4,3 + Kan ikke bestemmes BS Amylase 4,5 4,3 - Kan ikke bestemmes BS Amylase 5,0 4,3 + 96,0 BS Amylase 5,0 4,3 - Kan ikke bestemmes 20 BS Amylase 5,5 4,3 + 95,8 BS Amylase 5,5 4,3 - 95,9 BS Amylase 5,8 4,5 + 96,8

Termamyl 6,2 4,5 + 96,4 25 -----

Resultaterne viser god forsukringsevne af alle stivelsesarter, der er forflydet ifølge opfindelsen. Evnen til at forsukre stivelse forflydet ved pH 4,5 viser en klar fordel ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen i forhold til kendte forflydninger med α-amylase fra B. licheniformis eller B. stearothermophilus, da kun en lille eller 30 ingen pH-indstilling før forsukringen er nødvendig, når det drejer sig om stivelsesforflydning ifølge opfindelsen.

EKSEMPEL 7

Fremstilling af cvclodextrin ved forskellige stivelseskoncentrationer

Majsstivelsen blev varieret fra 15% til 40% DS. Opslemningerne blev først 35 forflydet ved pH 5,0 uden tilsætning af calcium ved en behandling i 14 minutter ved 105°C efterfulgt af ophold i 4 timer ved 90°C, hvor CGTasen (ATCC 53,627) blev DK 170307 Bl 26 anvendt ved en dosering på 4,46 Phadebas U pr. gram DS stivelse. Fremstillingen af cyclodextrin blev kontrolleret efter at henstandsperioden i stivelsesforflydningsprocessen fortsattes, således at dextrinopløsningen med enzym blev inkuberet i ekstra 24 timer ved pH 5,0 og 90°C. Cyclodextrinudbytter blev bestemt ved Bio-Rad 5 Aminex Carbohydrate HPX-42A HPLC. Resultater:

Cyclodextrinudbytte % DS a-CD γ-CD β-CD Total CD Total CD 10 % % % % g/100 ml 15 9,6 6,3 15,4 31,3 4,7 20 8,1 5,8 17,6 31,5 6,3 25 7,2 5,9 15,3 28,4 7,1 15 30 6,7 4,6 12,6 23,9 7,2 35 5,0 4,2 11,0 20,2 7,1 40 6,9 4,4 11,1 22,4 9,0

Konklusionen var, at en initial stivelseskoncentration på ca. 20-30% var 20 det optimale for fremstillingen af cyclodextriner, baseret på Total % CD og g CD/100 ml. En koncentration på 25% DS blev derfor valgt til yderligere eksempler. 6-cyclo-dextrin blev primært fremstillet ved alle stivelseskoncentrationer. Forholdet af β:α:γ-cyclodextriner var 1,0:0,47:0,39 ved 25% DS. Det højeste udbytte af cyclodextrin fra 25% DS stivelse, der blev observeret, var ca. 30%.

25 Gendosering med CGTase-enzymet og udvidelse af reaktionstiden til 48 timer forøgede ikke udbytterne.

EKSEMPEL 8

Fremstilling af cyclodextrin ved forskellige pH-værdier

Virkningen af pH på cyclodextrinfremstilling blev bestemt ved 30 anvendelsen af en 25% DS majsstivelsesopslemning. Stivelsesopslemningerne blev forflydede ved de angivne pH-værdier, men ellers som i eksempel 7, og de 27 DK 170307 B1 forflydede stivelsesprøver blev dernæst inkuberet i 24 timer ved 90°C ved de samme pH-værdier.

Resultaterne vist nedenfor viser, at pH 5,0 var optimum for den kombinerede proces af stivelsesforflydning og cyclodextrinfremstilling.

5 --

Cyclodextrinudbytte pH a-CD γ-CD β-CD Total CD Total CD % % % % g/100 ml 10------ 4.0 2,5 1,0 2,0 5,5 1,4 4,5 5,0 4,3 8,4 17,7 4,4 5.0 7,4 5,5 16,7 29,6 7,4 6.0 8,0 5,3 14,9 28,2 7,1 15 7,0 8,4 5,0 12,9 26,3 6,6 , 8,0 8,4 5,0 13,4 26,8 6,7 9.0 6,3 4,5 8,5 19,3 4,8 EKSEMPEL 9 20 Fremstilling af cvclodextrin ved forskellige temperaturer

Effekten af temperatur på cyclodextrinfremstilling med CGTase ifølge opfindelsen (ATCC 53,627) blev undersøgt uden tilsætning af calcium ved udførelse af inkubationstrinnet i 24 timer ved pH 5,0 ved forskellige temperaturer, som nedenfor angivet. En 15% DS eller 25% DS opslemning af majsstivelse blev først 25 forflydet med CGTase under betingelserne i eksempel 7 ved en dosering på 4,46 Phadebas U pr. gram DS stivelse. Resultater:

15% DS

Cyclodextrinudbytte 30------

Temperatur a-CD 7-CD β-CD Total CD Total CD

"C % % % % g/100 ml 50 8,1 5,6 15,4 29,0 4,4 35 80 8,6 6,1 18,7 33,4 5,0 90 9,6 6,3 15,4 31,3 4,7 95 7,3 5,1 8,5 20,9 3,1 28 DK 170307 B1

25% DS

Cyclodextrinudbytte 5 Temperatur a-CD γ-CD β-CD Total CD Total CD eC % % % % g/100 ml 50 7,1 4,8 12,1 24,0 6,0 70 7,2 5,5 13,7 26,4 6,6 10 80 7,2 5,5 14,6 27,3 6,8 90 7,2 5,9 15,3 28,4 7,1 95 6,3 5,8 14,6 26,7 6,7

Resultaterne viser, at den optimale konverteringstemperatur er 80-90°C, is både ved 15% DS og 25% DS (efter inkubation i 24 timer). Sænkning af temperaturen til 50°C gav et mindre udbytte.

EKSEMPEL 10

Fremstilling af cyclodextrin ved høje temperaturer med og uden gendosering af enzvm_ 20 Muligheden for, at ligevægt ikke var blevet opnået, blev undersøgt ved 90°C og 95°C ved at gendosere reaktionsblandingerne i eksempel 9, hvori' blev anvendt 15% DS stivelse med CGTase før inkubation i 24 timer, og hvor man lod reaktionen fortsætte i yderligere 24 timer. Resultaterne (se nedenfor) viser, at ved 90°C opnåedes ligevægt. Ved 95°C var det nødvendigt at gendosere for at opnå de 25 samme udbytter af cyclodextriner, hvilket viser et lille tab af enzymaktivitet under forlænget inkubation ved 95°C.

29 DK 170307 B1

Cyclodextrinudbytte

Temp, Gendo- Tid a-CD γ-CD β-CD Total CD Total CD 5 (eC) sering (timer) % % % % g/100 ml 90 - 24 9,6 6,3 15,4 31,3 4,7 90 + 24 9,5 6,3 16,2 32,0 4,8 90 - 48 10,1 6,3 14,0 30,4 4,6 10 90 + 48 9,1 5,9 16,5 31,5 4,7 95 - 24 7,3 5,1 8,5 20,9 3,1 95 + 24 10,2 6,5 13,7 30,4 4,6 95 - 48 9,3 5,2 10,2 24,7 3,7 15 95 + 48 11,3 6,6 13,5 31,4 4,7 > EKSEMPEL 11

Fremstilling af cvclodextrin med og uden tilsætning af calcium

Effekten af calcium på cyclodextrinfremstilling blev undersøgt. En 25% 20 DS majsstivelsesopslemning blev forflydet med CGTase ifølge opfindelsen (ATCC 53,627) ved pH 5,0 med og uden tilsætning af 40 ppm calcium ved en dosering på 4,46 Phadebas U pr. gram DS stivelse. De forflydede stivelsesprøver blev derefter inkuberet i 24 timer ved 90°C. Resultaterne (se nedenfor) viser, at tilstedeværelsen af calciumion ingen effekt havde på det samlede udbytte.

25 --

Cyclodextrinudbytte

Calcium a-CD γ-CD B-CD Total CD Total CD % % % % g/100 ml 30------ 6,0 6,0 15,1 27,1 6,8 + 6,2 5,8 14,4 26,4 6,6 EKSEMPEL 12 DK 170307 B1 30

Fremstilling af cyclodextrin ved forskellige enzvmdoserinaer

Effekten på cyclodextrinudbytte af varierende CGTase-doseringer blev bestemt ved at anvende 25% DS majsstivelse. Doseringen blev varieret fra 2,23 til s 6,69 Phadebas U pr. gram DS stivelse. Stivelsen blev forflydet ved pH 5,0, hvor de nedenfor angivne doser blev anvendt i tilstedeværelsen af calcium med CGTasen fra ATCC 53,627. De forflydede stivelsesarter blev derefter inkuberet i 24 eller 48 timer ved 90°C, pH 5,0. Andre betingelser var som i eksempel 5.

Resultaterne (se nedenfor) viser, at efter 24 timer og 48 timer blev det 10 højeste udbytte nået ved doser på 4,46 og 3,35 Phadebas U pr. gram DS stivelse.

Cyclodextrin

Doser, Phadebas Tid, a-CD γ-CD β-CD Total CD Total CD 15 u pr. gram DS timer % % % % g/100 ml 2.23 24 5,8 5,9 13,0 24,7 6,2 3.35 24 6,3 5,8 14,9 27,0 6,8 4.46 24 6,0 6,0 15,1 27,1 6,8 20 6,69 24 5,9 5,2 10,5 21,6 5,4 2.23 48 6,7 6,7 14,8 28,2 7,1 3.35 48 6,7 6,5 15,3 28,5 7,1 4.46 48 6,7 6,1 15,8 28,6 7,1 25 6,69 48 6,6 5,6 13,7 25,9 6,5 EKSEMPEL 13

Fremstilling af cvclodextrin ved anvendelse af komoleksdannere

Effekten af cyclooctan som en β-cyclodextrin-kompleksdanner ved 30 konverteringen af cyclodextriner blev undersøgt. En 25% DS majsstivelsesopslemning blev forflydet ved pH 5,0 uden tilsætning af calcium med CGTasen fra ATCC 53,627 under betingelserne i eksempel 7 med en dosis på 4,46 Phadebas U pr. gram DS stivelse. Derefter fulgte en konvertering til cyclodextrin ved 31 DK 170307 B1 90°C i 24 timer, men cyclooctan blev tilsat i en størrelsesorden af 0,6 gram pr. gram DS stivelse før 24 timers inkubation påbegyndtes.

Konverteringsresultaterne (se nedenfor) viste, at tilsætningen af cyclooctan forøgede det færdige cyclodextrinudbytte, især hvad angår 6-5 cyciodextrin.

Cyclodextrinudbytte a-CD γ-CD β-CD Total CD Total CD 10 % % % % g/100 ml

Kontrol 7,2 5,9 15,3 28,4 7,1

Med cyclooctan: 15 Uden kompleks- 3,7 2,3 2,6 8,6 2,2 ! dannelse

Med kompleksdannelse 1,9 0,6 25,0 27,5 6,9 20 Total 5,6 2,9 27,6 36,1 9,1 EKSEMPEL 14

Fremtillina af cvclodextrin fra forskellige stivelsesarter

En sammenligning mellem adskillige stivelsesarter blev foretaget.

25 Opslemninger (25% DS) af stivelse fra majs, kartofler, hvede, ris og almindelig majs blev forflydet ved pH 5,0 uden tilsætning af calcium med CGTase ifølge opfindelsen (ATCC 53,627) med en dosis på 4,46 Phadebas U pr. gram DS stivelse under betingelserne i eksempel 7. De forflydede stivelsesopløsninger blev derefter inkuberet i 24 timer ved 90°C.

30 Resultaterne (se nedefor) viste, at der var forskel i det sluttelige cyclodextrinudbytte, og at β-cyclodextrin var det primære produkt i alle tilfældene.

32 DK 170307 B1

Stivelse Cyclodextrinudbytte α-CD 7“CD β-CD Total CD Total CD 5 % % % % g/100 ml

Majs 7,4 5,4 15,4 28,2 7,1

Kartoffel 9,3 5,6 14,6 29,5 7,4

Hvede 7,0 4,9 13,7 25,6 6,4 10 Ris 5,1 4,3 8,3 17,7 4,4

Aim. majs 7,1 4,5 11,9 23,5 5,9 EKSEMPEL 15

Ethanolaærina af forflvdet stivelse 15 En 31,5% DS opslemning af vådformalet majsstivelse blev forflydet med CGTase ifølge opfindelsen (ATCC 53,627) ved pH 5,0 uden tilsætning af calcium i 14 minutter ved 105°C efterfulgt af 4 timer ved 90°C. Et blindforsøg med Termamyl® blev også udført som beskrevet, men ved pH 6,2 i tilstedeværelsen af 40 ppm calcium. Enzymdosen i hvert tilfælde var 5,0 Phadebasenheder pr. gram DS stivelse. 20 Ved slutningen af forflydningen blev den hydrolyserede stivelse fortyndet til 22,4% DS med en gærnæringsblanding. Den færdige koncentration af komponenterne i næringsblandingen pr. liter var 4,0 g gærekstrakt, 1,6 g ammoniumphosphat, 0,4 g magnesiumsulfat, 3,2 g citronsyre og 0,6 g natriumcitrat. Den endelig pH var 5,2. AMG 200 L (Novo Nordisk Bioindustrials, Inc., Danbury, CT) 25 blev tilsat til en dosis på 0,44% wt/wt baseret på stivelsen. Penicillin G og streptomycinsulfat blev inkluderet i mængder på 200 ug/ml. Gæringsblandingeme blev inkuberet ved 30°C, 300 rpm i 64 timer.

Fremstillingen af ethanol blev indirekte målt ved carbondioxidudvikling, dvs. vægttab som en funktion af tid. De færdige ethanoludbytter blev bekræftet med 30 Bio-Rad Aminex HPX-42A High Performance Liquid Chromatography.

Efter 64 timer var udbyttet af ethanol baseret på carbondioxidfremstilling 87,3% og 89,7% for henholdsvis CGTase- og Termamyl-forflydede stivelsesarter. Disse udbytter blev verificeret med Bio-Rad Aminex HPX-42A HPLC. Det industrielle standardudbytte er sædvanligvis ca. 86-90%.

33 EKSEMPEL 16 DK 170307 B1

Fremstilling af CGTase ved anaerob dyrkning af NCIB 40.053 - 40.059

Stammerne NCIB 40,053 til 40,053 blev dyrket som beskrevet i eksempel 1 med undtagelse af, at temperaturen under dyrkningen var 55°C.

5 Det maksimale aktivitetniveau efter ca. 40 timers inkubation i

Phadebasenheder pr. liter væske varsom følger: NCIB 40,053:10, NCIB 40,054:53, NCIB 40,055: 26, NCIB 40,056: 22, NCIB 40,057: 27, NCIB 40,058: 78 og NCIB 40,059: 10. Kulturvæskerne blev centrifugeret, dernæst filtreret og til sidst koncentreret til en volumetrisk aktivitet på 30-50 Phadebasenheder pr. ml ved 10 anvendelsen af et Miilipore Minitansystem.

EKSEMPEL 17

Stivelsesforflvdning med CGTase fra NCIB 40.053 - 40.059 CGTase præparaterne fremstilles som I eksempel 16 blev sammenlignet hvad angår deres evne til at forflyde 35% DS majsstivelse ved pH 4,5. Stivelsen blev 15 forflydet ved 105°C 114 minutter efterfulgt af 4 timer ved 90°C ved en enzymdosis på 4,46 Phadebas U/g DS (60°C, pH 6,0).

Dextroseækvivalent blev målt efter forflydning og stivelsen blev regnet som forflydet, hvis siruppen efter forflydning var hældbar, hvilket angav en væsentlig reducering af viskositet.

20 Resultaterne viste, at alle CGTaserne kunne opnå god forflydning ved pH

4,5 ligesom CGTasen fra stamme ATCC 53,627. I alle tilfældene kunne der i det væsentlige ikke måles nogen DE, hvilket indikerer CGTase aktivitet.

Aminex® HPX-42A (Bio-Rad) HPLC, med anvendelse af brydnings-indeks, viste at reaktionsmønsteret dannet ved forflydning af majsstivelse var typisk for 25 CGTase, hvor de tre toppe var α-, γ- og 8-cyclodextrin. Der blev ikke observeret nogen betydelig forskel i det relative forhold af cyclodextrinerne fremstillet med hvert enzym sammenlignet med CGTasen fra ATCC 53,627.

EKSEMPEL 18 34 DK 170307 Bl

Forflvdnina med Klonet CGTase

En 35% majsstivelsesopslemning blev behandlet med klonet CGTase fremstillet som i eksempel 2 med en dosering på 8,92 Phadebas-enheder pr. g DS 5 ved pH 4,5 uden tilsætning af Ca++. Jetkogning blev udført ved 105°C i 5 minutter (primær forflydning) efterfulgt af henstand ved 95°C i 2 timer eller 90°C i 4 timer (sekundær forflydning). Under sekundær forflydning ved 95°C eller 90°C blev en hurtig reduktion i viskositet observeret. Ved 90°C blev viskositetsreduktionen med en målt tid ved anvendelse af et Nametre viskometer. Resultaterne viste, at der skete 10 en hurtig reduktion i viskositet til 400 centipoise x g/cm3 7 minutter inde i den sekundære forflydning. Reaktionsmønsteret af de forflydede stivelsesarter efter sekundær forflydning, der blev bestemt ved Bio-Rad Aminex HPX-42A HPLC viste det karakteristiske cyclodextrinmønster ved begge temperaturer. DE-værdier på < 1,0 blev opnået ved neocuproin-metoden, hvilket viser fraværelsen af reducerende ende-15 grupper i overensstemmelse med mekanismen for en CGTase.

EKSEMPEL 19

Forsukrina af stivelsesforflvdnina med klonet CGTase

Stivelsesopløsningerne forflydet med CGTase ved pH 4,5 i eksempel 18 blev forsukret med AMG og Dextrozyme ved pH 4,5, 60°C i 48 timer med en dosis 20 på 0,18 AG pr. gram DS. Dextroseudbytterne blev bestemt med Bio-Rad Aminex HPX-87C HPLC.

«β 35 DK 170307 B1 % Udbytte

Enzym Dextrose DP2 DP3 DP4+ 5----- 95°C Sekundær forflydnina

Dextrozyme 95,87 2,44 0,39 1,30 AMG 95,09 2,27 0,36 2,28 10 90°C Sekundær fgrflvdninq

Dextrozyme 95,37 3,34 0,40 0,89 AMG 95,36 3,21 0,38 1,05

Resultaterne viser et godt udbytte af dextrose i alle tilfældene. Det største 15 udbytte blev opnået ved sekundær forflydning ved 95°C og forsukring med Dextrozyme.

t

Claims (11)

1. Cyclodextringlycosyitransferase (CGTase), kendetegnet ved, at den er afledt af en CGTasedannende stamme af Thermoanaerobacter eller Thermo-anaerobium, og at den har et temperaturoptimum målt ved pH 5,0 på omkring 95°C; 5 et pH optimum på omkring 5,0; og en restaktivitet efter 40 minutters inkubering ved 80°C og pH 5,0 på omkring 95% uden tilstedeværelse af stivelse og Ca++.

2. Cyclodextringlycosyltransferase ifølge krav 1, kendetegnet ved, at stammen er ATCC 53,627 eller én af stammerne NCIB 40,053 til NCIB 40,059.

3. Fremgangsmåde til fremstilling af cyclodextringlycosyltransferasen 10 (CGTase) ifølge krav 1, kendetegnet ved, at en CGTasedannende stamme af Thermoanaerobacter eller Thermoanaerobium dyrkes under anaerobe betingelser, hvorefter CGTasen udvindes fra gæringsmediet.

4. Fremgangsmåde til fremstilling af cyclodextringlycosyl-transferasen (CGTase) ifølge krav 1, kendetegnet ved, at en transformeret værtsorganisme, der 15 indeholder den relevante genetiske information fra Thermoanaerobacter eller Thermoanaerobium, dyrkes under aerobe betingelser i et egnet næringsmedium, hvorefter CGTasen udvindes fra gæringsmediet.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at stammen er ATCC 53,627, én af stammerne NCIB 40,053 til NCIB 40,059 eller en mutant deraf med 20 væsentlig samme egenskaber.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at værtsorganismen er en stamme af Escherichia, Streptomyces, Bacillus eller Aspergillus, fortrinsvis en stamme af £ coli, B. subtilis, B. licheniformis eller A. oryzae. DK 170307 Bl

7. Biologisk ren kultur af en stamme af Thermoanaerobacter eller Thermoanaerobium til brug ved fremgangsmåden ifølge krav 3, kendetegnet ved, at stammen er ATCC 53627, eller én af stammerne NCIB 40053 til NCIB 40059 eller en mutant deraf, som er i stand til at danne cyclodextringlycosyltransferase, der har et 5 temperaturoptimum målt ved pH 5,0 på omkring 95°C; et pH optimum på omkring 5,0; og en restaktivitet efter 40 minutters inkubering ved 80°C og pH 5,0 på omkring 95% uden tilstedeværelse af stivelse og Ca++.

8. Fremgangsmåde til forflydning af stivelse, kendetegnet ved, at man udsætter en vandig stivelsesopslemning for enzymatisk forflydning i tilstedeværelse 10 af CGTasen ifølge krav 1 eller 2 ved pH i området fra ca. 4,0-5,5, fortrinsvis ved en temperatur over 100°C.

9. Fremgangsmåde til fremstilling af dextrose, kendetegnet ved, at man udsætter en vandig stivelsesopslemning for enzymatisk forflydning i tilstedeværelse af CGTasen ifølge krav 1 eller 2 ved pH i området fra ca. 4,0-5,5 (fortrinsvis ved en 15 temperatur over 100°C), hvorefter man forsukrer den forflydede stivelsesopslemning i tilstedeværelse af glucoamylase, i det væsentlige uden en mellemliggende pH-justering.

10. Fremgangsmåde til fremstilling af cyclodextrin, kendetegnet ved, at man behandler en forf lydet stivelsesopløsning med cyclodextringlycosyltransferasen ifølge 20 krav 1 ved en temperatur på over 60°C og derefter udvinder et cyclodextrinprodukt fra reaktionsblandingen.

11. Fremgangsmåde til fremstilling af cyclodextrin, kendetegnet ved, at man behandleren vandig stivelsesopslemning med cyclodextringlycosyltransferasen ifølge krav 1 ved en temperatur på over ca. 100°C og ved et pH i området 4,0-5,5, fortrins- 25 vis i det væsentlig uden tilsætning af et kalciumsalt, og derefter holder den dannede sirup ved en temperatur i området 80°-90°C i ikke mere end 28 timer, hvorved siruppen er i området 20-30 DS i i hvert fald en del af den nævnte opholdstid, og at man derefter udvinder et cyclodextrinprodukt fra reaktionsblandingen.