WO2023182528A1 - α１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質及びラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰＩ）の製造方法 - Google Patents

α１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質及びラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰＩ）の製造方法 Download PDF

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dna
strain
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protein
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彩花 釜井
智惇 杉田
史 山▲崎▼
和貴 中村
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キリンホールディングス株式会社
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    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds

Definitions

  • the present invention relates to a protein having ⁇ 1,2-fucosyltransferase activity and a method for producing lacto-N-fucopentaose I (LNFPI).
  • HMO Human milk oligosaccharide
  • Lacto-N-fucopentaose I (hereinafter referred to as LNFPI) is a type of HMO, and is a pentasaccharide HMO in which fucose is ⁇ 1,2-linked to the galactose 2 position of lacto-N-tetraose (hereinafter referred to as LNT). .
  • LNFPI is abundant in breast milk next to 2'-fucosyllactose (hereinafter referred to as 2'FL) and lacto-N-difucohexaose (hereinafter referred to as LNDFHI), and is also a pentasaccharide. It is known that the content in breast milk is higher than that of lacto-N-fucopentaose II (hereinafter referred to as LNFPII) and lacto-N-fucopentaose III (hereinafter referred to as LNFPII), which are known as Patent Document 2).
  • LNFPII lacto-N-fucopentaose II
  • LNFPII lacto-N-fucopentaose III
  • Non-Patent Documents 3 and 4 Bifidobacterium infantis, which has a high occupancy rate in the intestines of newborns, is attracting attention for its function as a prebiotic, as it has been found to grow preferentially in LNFPI.
  • Patent Documents 1 and 2 and Non-Patent Documents 4, 5 and 6 include Thermosynechococcus elongatus, Sideroxydans lithotrophicus, or Helicobacter.
  • oligosaccharides such as LNFPI are produced by overexpressing ⁇ 1,2-fucosyltransferase in Escherichia coli and using LNT and GDP-fucose as substrates by fermentation or continuous enzymatic reaction.
  • Methods for reducing by-products include an enzymatic reaction method using purified, highly pure LNT as a substrate (Patent Document 1, Non-Patent Document 5), and a method using ⁇ 1,2-fucosyltransferase when the initial raw material lactose is depleted.
  • a method for producing LNFPI by inducing the expression of LNFPI has been disclosed (Non-Patent Document 6).
  • an object of the present invention is to provide a protein having ⁇ 1,2-fucosyltransferase activity and a method for producing LNFPI with excellent LNFPI productivity.
  • LNFPI can be produced more efficiently than conventional methods by using a microorganism that has the ability to produce a protein with ⁇ 1,2-fucosyltransferase activity consisting of a specific amino acid sequence.
  • the present invention has been completed. Furthermore, we have discovered for the first time a fucosyltransferase derived from the genus Neisseria or Francisella that is suitable for the production of fucosylated oligosaccharides such as LNFPI or fucosyllactose.
  • the present invention is as follows. 1. The protein according to any one of [1] to [3] below, which has fucosyl group transfer activity to lacto-N-tetraose (LNT). [1] A protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 14, 18 or 26. [2] The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 14, 18 or 26 consists of an amino acid sequence in which 1 to 20 amino acids are deleted, substituted, inserted or added, and a mutant protein having ⁇ 1,2-fucosyltransferase activity.
  • [3] Consists of an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 14, 18 or 26, and has ⁇ 1,2-fucosyltransferase activity Homologous protein.
  • 4. A transformant obtained by transforming a host cell with the recombinant DNA described in 3 above. 5. 4.
  • the transformant according to 4 above which is a microorganism in which the activity of the protein according to any one of [1] to [3] described in 1 above and the productivity of fucose-containing carbohydrates are enhanced. 6. 5. The transformant according to 5 above, wherein the microorganism is E. coli. 7. A method for producing a fucose-containing saccharide, which comprises preparing the transformant according to any one of 4 to 6 above, and producing a fucose-containing saccharide in a culture using the transformant. 8. 7. The production method according to 7 above, wherein the fucose-containing carbohydrate is lacto-N-fucopentaose I (LNFPI).
  • LNFPI lacto-N-fucopentaose I
  • the protein of the present invention has an ⁇ 1,2-fucosyltransferase activity that can transfer sugars to the non-reducing terminal galactose site of LNT due to its specific amino acid sequence.
  • FIG. 1 shows the biosynthetic pathway of LNFPI in one embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 shows the results of the total LNFPI production amount of the supernatant and intracellular fraction (Example 2).
  • the protein of the present invention is a protein according to any one of [1] to [3] below, which has an activity of transferring a fucosyl group to lacto-N-tetraose (LNT).
  • a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 14, 18 or 26.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 14, 18 or 26 consists of an amino acid sequence in which 1 to 20 amino acids are deleted, substituted, inserted or added, and a mutant protein having ⁇ 1,2-fucosyltransferase activity.
  • proteins consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, 6, 8, 14, 18 or 26 are preferred, and more Preferably, it is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 18.
  • the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is derived from Gramella sp., which will be described later in Examples. This is ⁇ 1,2-fucosyltransferase GsFucT derived from the MAR_2010_147 strain.
  • the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is derived from Francisella sp., which will be described later in Examples. This is ⁇ 1,2-fucosyltransferase FsFucT derived from FSC1006 strain.
  • the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 is ⁇ 1,2-fucosyltransferase NbFucT1 derived from Neisseriaceae bacterium DSM 100970 strain, which will be described later in the Examples.
  • the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 is ⁇ 1,2-fucosyltransferase MtFucT derived from Methylobacter tundripaludum strain, which will be described later in the Examples.
  • the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 is ⁇ 1,2-fucosyltransferase AjFucT derived from Amphritea japonica strain, which will be described later in the Examples.
  • the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 is ⁇ 1,2-fucosyltransferase SbFucT derived from Sterolibacteriaceae bacterium J5B strain, which will be described later in the Examples.
  • the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18 is ⁇ 1,2-fucosyltransferase NbFucT2 derived from Neisseriales bacterium strain, which will be described later in the Examples.
  • the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 is ⁇ 1,2-fucosyltransferase HMFT derived from Helicobacter mustelae ATCC43772 strain, which will be described later in the Examples.
  • mutant protein refers to a protein obtained by artificially deleting or substituting an amino acid residue in a source protein, or inserting or adding an amino acid residue into the protein.
  • deletion, substitution, insertion, or addition of amino acids means that 1 to 20 amino acids are deleted, substituted, inserted, or added at any position in the same sequence. Good too.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted, inserted or added is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, still more preferably 1 to 8, and most preferably 1 to 5.
  • the amino acids to be deleted, substituted, inserted, or added may be natural or non-natural.
  • Natural amino acids include L-alanine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-glutamine, L-glutamic acid, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L-arginine, L- - Methionine, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-valine, L-cysteine and the like.
  • Group A Leucine, isoleucine, norleucine, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, O-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexylalanine
  • Group B aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid, Isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosuberic acid
  • Group C asparagine, glutamine
  • D Lysine, arginine, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid
  • Group E Proline, 3 -Hydroxyproline, 4-hydroxyproline
  • F group serine, threonine, homoserine
  • G group phenylalanine
  • examples of the amino acid residue to be substituted include the 17th asparagine residue.
  • a homologous protein is a protein whose structure and function are similar to that of the original protein, so that the gene encoding the protein is thought to have the same evolutionary origin as the gene encoding the original protein.
  • Homologous proteins include, for example, amino acid sequences that preferably have an identity of 90% or more, more preferably 93% or more, still more preferably 95% or more, particularly preferably 97% or more, with the amino acid sequence of the target protein. Can be mentioned.
  • the fucosyl group transfer activity to LNT refers to the N-acetyl group transfer activity of LNT from the donor substrate GDP-fucose to the receptor substrate carbohydrate (hereinafter referred to as "acceptor carbohydrate"). Refers to the activity of transferring fucose residues to glucosamine hydroxyl groups.
  • LNFPI is generated by transferring a fucose residue from GDP-fucose to the N-acetylglucosamine hydroxyl group.
  • the biosynthetic pathway of LNFPI in one embodiment of the present invention is shown in FIG.
  • ⁇ 1,2-fucosyltransferase activity refers to transferring a fucose residue from GDP-fucose, a donor substrate, to the N-acetylglucosamine hydroxyl group of an acceptor carbohydrate through an ⁇ 1,2-linkage.
  • LNT is preferred as the receptor carbohydrate.
  • LNFPI is preferred as the fucose-containing carbohydrate.
  • the above-mentioned mutant protein or homologous protein has ⁇ 1,2-fucosyltransferase activity, for example, by the following method.
  • a recombinant DNA containing DNA encoding a mutant protein or homologous protein whose activity is to be confirmed is prepared by the method described below.
  • a transformant having higher activity of the protein than the parent strain is produced, and the fucose produced and accumulated in the culture medium of the parent strain or the transformant is This can be confirmed by comparing the amount of carbohydrates contained.
  • a specific example of the fucose-containing carbohydrate is LNFPI.
  • parent strain refers to the original strain that is subject to genetic modification, transformation, etc.
  • the parent strain is preferably a prokaryotic or yeast strain, more preferably Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Pseudomonas, etc.
  • Escherichia coli MG1655 Escherichia coli XL1 -Blue, Escherichia coli XL2-Blue, Escherichia coli DH1, Escherichia coli MC1000, Escherichia coli KY3276, Escherichia coli erichia coli W1485, Escherichia coli JM109, Escherichia coli HB101, Escherichia coli No.
  • Prokaryotes such as D-0110, or Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Trichosporon pullulans, Yeast strains such as Schwanniomyces alluvius, Pichia pastoris, or Candida utilis can be mentioned.
  • the parent strain may be a wild strain as long as it is a microorganism that produces GDP-fucose and/or LNT. If the wild strain does not have the ability to produce GDP-fucose and/or LNT, a bred strain may be artificially endowed with the ability to supply GDP-fucose and/or LNT.
  • microorganisms used as parent strains include the following 1) and 2). 1) A microorganism that has been artificially endowed with or enhanced the ability to supply GDP-fucose, which is a reaction substrate for ⁇ 1,2-fucosyltransferase.2) A microorganism that has an artificial ability to supply LNT, which is a reaction substrate for ⁇ 1,2-fucosyltransferase. Microorganisms that have been endowed with or enhanced by microorganisms will be explained below.
  • a microorganism used as a parent strain that has been artificially endowed with or enhanced the ability to supply GDP-fucose which is a reaction substrate for ⁇ 1,2-fucosyltransferase.
  • a parent strain preferably, a reaction substrate for ⁇ 1,2-fucosyltransferase is used.
  • Examples include microorganisms that have been artificially endowed or enhanced with the ability to supply GDP-fucose.
  • Specific examples of methods for imparting or enhancing the ability to supply GDP-fucose in a microorganism used as a parent strain include known methods such as various genetic manipulation methods (Metabolic Engineering (2017) 41:23-38). .
  • the ability to supply GDP-fucose includes the ability to produce GDP-fucose from sugar.
  • methods for artificially imparting or enhancing the ability to produce GDP-fucose from sugar to a microorganism used as a parent strain include the following methods (1a) to (1d). These methods may be used alone or in combination.
  • (1a) A method for relaxing or canceling at least one of the mechanisms controlling the biosynthetic pathway that generates GDP-fucose from sugar (1b) At least one of the enzymes involved in the biosynthetic pathway that generates GDP-fucose from sugar (1c) A method for increasing the copy number of at least one gene encoding an enzyme involved in the biosynthetic pathway that produces GDP-fucose from sugar.
  • (1d) A method for enhancing the expression of a biosynthetic pathway that produces GDP-fucose from sugar.
  • mechanisms that control the biosynthetic pathway that generates GDP-fucose from sugars include known mechanisms such as control mechanisms by transcriptional regulatory factors (e.g., RcsA, etc.) involved in controlling the biosynthetic pathway. It will be done.
  • RcsA is a regulatory factor that upregulates the entire colanic acid biosynthetic pathway with GDP-fucose as an intermediate. As described below, by strengthening rcsA while blocking the pathway downstream of GDP-fucose in the colanic acid biosynthesis pathway, a large amount of GDP-fucose can be accumulated.
  • enzymes involved in the biosynthetic pathway that generates GDP-fucose from sugar include mannose-6-phosphate isomerase, phosphomannomutase, mannose-1-phosphate guanylyltransferase, and GDP-mannose- Known enzymes include 4,6-dehydratase and GDP-L-fucose synthase.
  • the supply of GDP-fucose can be increased by blocking WcaJ, WzxC, WcaK, WcaL, or WcaM, which are downstream of GDP-fucose in the colanic acid biosynthesis pathway.
  • the microorganism used as a parent strain may be modified to promote the import of exogenous L-fucose across its cell membrane. For example, by expressing or overexpressing the base sequence encoding FucP (accession number AIZ90162), the uptake of exogenous L-fucose across the cell membrane into cells can be improved, thereby producing GDP-fucose. can increase the amount of fucose.
  • the microorganism used as a parent strain has a deletion of the genes fucI and/or fucK encoding L-fucose isomerase and L-fucrose kinase, respectively, and the nucleotide sequence of fucI and/or fucK inhibits the enzymatic activity of the corresponding polypeptide. It may be modified to irreversibly inactivate it or to impair expression of fucI and/or fucK. Eliminating intracellular synthesis of FucI and/or FucK abolishes fucose metabolism in the cell, which may increase the amount of fucose for producing GDP-fucose.
  • a microorganism used as a parent strain that is artificially endowed or enhanced with the ability to supply LNT, which is a reaction substrate for ⁇ 1,2-fucosyltransferase A method for artificially imparting the ability to supply LNT to a microorganism used as a parent strain Examples of the method include methods (2a) to (2h) below, and these methods can be used alone or in combination.
  • enzymes involved in the biosynthetic pathway that generates LNT from sugar include ⁇ 1,4-galactosyltransferase (hereinafter referred to as galT) activity, which is involved in the biosynthetic pathway that generates LNT from glucose and lactose. and enzymes having ⁇ 1,3-N-acetylglucosamine transferase (hereinafter referred to as lgtA) activity.
  • galT ⁇ 1,4-galactosyltransferase
  • lgtA enzymes having ⁇ 1,3-N-acetylglucosamine transferase
  • Specific examples of the mechanism for decomposing LNT or its substrate sugar include known enzymes such as ⁇ -galactosidase, which catalyzes the hydrolysis of lactose, which is a substrate of LNT, to produce glucose and galactose.
  • ⁇ -galactosidase which catalyzes the hydrolysis of lactose, which is a substrate of LNT, to produce glucose and galactose.
  • lacZ ⁇ -galactosidase
  • enzymes involved in the cellular uptake of LNT or its substrate sugar include known enzymes such as lactose permease, which is involved in the cellular uptake of lactose, which is the substrate of LNT.
  • the microorganism to which the ability to supply LNT has been imparted or enhanced has, for example, lactose permease (hereinafter referred to as lacY) activity, ⁇ 1,4-galactosyltransferase (galT) activity, ⁇ 1,3-N-acetylglucosamine transferase (lgtA) activity, glutamine fructose-6-phosphate transaminase (hereinafter referred to as glmS) activity, phosphoglucosamine mutase (hereinafter referred to as glmM) activity and N-acetylglucosamine-1-phosphate Acid uridyltransferase/glucosamine-1-phosphate acetyltransferase (hereinafter referred to as glmU) activity, phosphoglucomutase (hereinafter referred to as pgm) activity, UTP glucose-1-phosphate uridylyltransfera
  • lacY is a membrane protein that takes lactose, a substrate of LNT, into cells.
  • galT is an enzyme involved in the production of LNT from lacto-N-triose II (LNTII).
  • LNT is a precursor of LNFPI.
  • LgtA is an enzyme involved in the production of LNTII from lactose and uridine diphosphate-N-acetylglucosamine (hereinafter referred to as UDP-GlcNAc).
  • LNTII is a precursor of LNT.
  • glmS, glmM, and glmU are enzymes involved in the biosynthetic pathway that produces LNTII.
  • Pgm, galU, galE, and galF are enzymes involved in the pathway that produces uridine diphosphate galactose (hereinafter referred to as UDP-Gal).
  • Pgi is an enzyme involved in the pathway that produces LNTII.
  • microorganism is a microorganism capable of producing GDP-fucose and/or LNT means that the microorganism is cultured in a medium, and the GDP-fucose and/or LNT accumulated in the culture is analyzed using a sugar analyzer or a high-speed liquid liquid as described below. This can be confirmed by detection using a general technique such as a chromatography mass spectrometer.
  • the microorganism used as the parent strain of the present invention is preferably a microorganism to which the ability to supply GDP-fucose and/or LNT, which is a reaction substrate for ⁇ 1,2-fucosyltransferase, is artificially imparted or enhanced.
  • the base sequence encoding rcsA (accession number BAA15776.1), the base sequence encoding mannose-6-phosphate isomerase (accession number BAA15361.1), phosphoman Base sequence encoding Nomutase (accession number BAA15901.1), base sequence encoding mannose-1-phosphate guanylyltransferase (accession number BAA15905.1), encoding GDP mannose-4,6-dehydratase (accession number BAA15909.1), a base sequence that encodes GDP-L-fucose synthase (accession number BAA15908.1), a base sequence that encodes lacY (accession number BAE76125.1), and a base sequence that encodes galT.
  • rcsA accession number BAA15776.1
  • the base sequence encoding mannose-6-phosphate isomerase (accession number BAA15361.1)
  • phosphoman Base sequence encoding Nomutase (ac
  • nucleotide sequence encoding lgtA (SEQ ID NO: 29), nucleotide sequence encoding lgtA (SEQ ID NO: 31), nucleotide sequence encoding glmS (accession number BAE77559.1), nucleotide sequence encoding glmM (accession number BAE77220.1) , a base sequence encoding glmU (accession number BAE77558.1), a base sequence encoding Pgm (accession number BAA35337.1), a base sequence encoding galU (accession number BAA36104.1), a base sequence encoding galE At least one base sequence selected from the base sequence (accession number BAA35421.1), the base sequence encoding galF (accession number BAA15896.1), and the base sequence encoding pgi (accession number BAE78027.1). It is preferable to use a genetically modified microorganism containing the parent strain as
  • a genetically modified microorganism as a parent strain, preferably containing a base sequence encoding lacY, a base sequence encoding rcsA, a base sequence encoding galT, and a base sequence encoding lgtA.
  • the genetically modified microorganism has an increased ability to produce GDP-fucose and/or LNT compared to a non-genetically modified parent strain.
  • microorganisms has at least one activity selected from lacY activity, rcsA activity, galT activity, lgtA activity, glmS activity, glmM activity and glmU activity, pgm activity, galU activity, galE activity, galF activity, pgi activity, or Any known method may be used to produce microorganisms with enhanced activity. Specific examples include methods using various genetic manipulations (Syst Microbiol Biomanufact, 2021, 1, 291).
  • the parent strain further has reduced or deleted lacZ activity and/or colanic acid synthesis activity as described above.
  • lacZ activity and/or colanic acid synthesis activity are preferably reduced or deleted, and more preferably, the base sequence encoding lacZ and/or the colanic acid production-related protein is encoded. It is preferable to use a genetically modified microorganism as a parent strain that does not contain a base sequence encoding the wcaJ, wzxC, wcaK, wcaL, or wcaM gene.
  • the genetically modified microorganism has an increased ability to produce GDP-fucose and/or LNT compared to a non-genetically modified parent strain.
  • E. coli in which ⁇ -galactosidase activity and/or colanic acid synthesis activity is reduced or lost.
  • Specific examples include methods using various genetic manipulations (Metabolic Engineering, 2017, 41:23-38).
  • the parent microorganism is transformed with a recombinant DNA containing DNA encoding the protein.
  • examples include microorganisms that have an increased number of copies of the gene than the parent strain, which are obtained by doing so.
  • the copy number of the gene is increased compared to the parent strain, which is obtained by transforming a parent strain microorganism with a recombinant DNA containing a DNA encoding the protein according to any one of [1] to [3] above.
  • a microorganism by transforming a parent microorganism with a recombinant DNA containing a DNA encoding the protein according to any one of [1] to [3] above, the number of copies of the gene can be determined on the chromosomal DNA. Examples include microorganisms in which the gene has been increased, and microorganisms in which the gene is carried outside of the chromosomal DNA as plasmid DNA.
  • the DNA encoding the protein according to any one of [1] to [3] above may be any DNA encoding a protein having the activity of the protein according to any one of [1] to [3] above.
  • any DNA may be used, a specific example is DNA 1 selected from the group consisting of [4] to [7] below.
  • DNA encoding the protein according to any one of [1] to [3] above [5] DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 13, 17 or 25
  • hybridize means that DNA hybridizes to DNA having a specific base sequence or a part of the DNA. Therefore, DNA having the specific base sequence or a portion thereof can be used as a probe for Northern or Southern blot analysis, and can also be used as an oligonucleotide primer for PCR analysis.
  • DNA used as a probe examples include DNA with at least 100 bases or more, preferably 200 bases or more, and more preferably 500 bases or more.
  • the DNA used as a primer can be at least 10 bases or more, preferably 15 bases or more.
  • DNA that hybridizes under stringent conditions can also be obtained by following the instructions attached to a commercially available hybridization kit.
  • commercially available hybridization kits include the Random Primed DNA Labeling Kit (manufactured by Roche Diagnostics), which prepares probes by the random prime method and performs hybridization under stringent conditions.
  • the above stringent conditions mean that the DNA-immobilized filter and the probe DNA are mixed in 50% formamide, 5x SSC (750 mmol/L sodium chloride, 75 mmol/L sodium citrate), and 50 mmol/L phosphoric acid. After overnight incubation at 42°C in a solution containing sodium (pH 7.6), 5x Denhardt's solution, 10% dextran sulfate, and 20 ⁇ g/L denatured salmon sperm DNA, e.g. Conditions for washing the filter in a 0.2 ⁇ SSC solution can be mentioned.
  • DNAs that can be hybridized under the above-mentioned stringent conditions include SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 13, Examples include DNAs having at least 95% or more, preferably 97% or more, more preferably 98% or more, and most preferably 99% or more identity with DNA consisting of the base sequence represented by 17 or 25.
  • the DNA encoding the protein of [1] above can be produced using a microorganism, preferably a probe DNA that can be designed based on the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 13, 17 or 25. is obtained by Southern hybridization on a chromosomal DNA library of a microorganism or by PCR using the chromosomal DNA of the microorganism as a template [PCR Protocols, Academic Press (1990)] using primer DNA that can be designed based on the base sequence. can.
  • the origin of the chromosomal DNA of the microorganism used in the operation is not particularly limited, but for example, the genus Neisseria (Neisseriaceae, Neisseriales), the genus Francisella, the genus Methylobacter, the genus Amphritea, the genus Sterolibacteriaceae, or the genus He Examples include bacteria of the genus licobacter. Among these, Francisella sp.
  • FSC1006 strain Neisseriaceae bacterium DSM 100970 strain, Methylobacter tundripaludum strain, Amphritea japonica strain, Sterolibacte riaceae bacterium J5B strain, Neisseriales bacterium strain, or Helicobacter mustelae ATCC43772 strain.
  • strains are available from public institutions, for example, Francisella sp. Strain FSC1006 is available from the Swedish Defense Research Agency. Additionally, Neisseriaceae bacterium DSM 100970 strain is available from the University of Malaya. Furthermore, Methylobacter tundripaludum strain, Amphritea japonica strain, and Helicobacter mustelae ATCC43772 strain were collected from the American Type Culture Collection (American Type Cult. ure Collection, ATCC).
  • the DNA encoding the mutant protein of [2] above is subjected to error-prone PCR, etc. using, for example, DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 13, 17, or 25 as a template. It can be obtained by
  • PCR using a pair of PCR primers each having a nucleotide sequence at the 5' end designed to introduce the desired mutation (deletion, substitution, insertion, or addition) [Gene, 77, 51 (1989 )] can also obtain DNA encoding the mutant protein of [2] above.
  • the DNA can also be obtained by following the instructions attached to a commercially available partial-specific mutagenesis kit.
  • a commercially available part-specific mutagenesis kit for example, PrimeSTAR (registered trademark) Mutagenesis Basal Kit (manufactured by Takara Bio Inc.), which can introduce mutations (deletion, substitution, insertion, or addition) into the desired mutation position, is available. Can be mentioned.
  • a pair of mutation-introducing primers with 15 bases overlapping on the 5' side is designed. do. At this time, the overlapped portion contains the desired mutation.
  • PCR is performed using the mutation introduction primer and a plasmid having the nucleotide sequence into which the desired mutation is to be introduced as a template.
  • the DNA encoding the homologous protein in [3] above, and the DNA in [6] and [7] above are, for example, SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 13, 17 in various gene sequence databases. or search for a nucleotide sequence having an identity of 95% or more, preferably 97% or more, more preferably 98% or more, and most preferably 99% or more with the nucleotide sequence represented by 95% or more, preferably 97% or more, more preferably 98% or more, most preferably 99% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 14, 18 or 26.
  • a method for obtaining the above DNA using a probe DNA or primer DNA that can be designed based on the nucleotide sequence or amino acid sequence obtained by the search, and a microorganism having the DNA. can be obtained using the same method.
  • the obtained DNA according to any one of [4] to [7] above is inserted into a vector by a conventional method, either as it is or after being cut with an appropriate restriction enzyme, and the obtained recombinant DNA is introduced into a host cell.
  • a commonly used base sequence analysis method such as the dideoxy method [Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 74, 5463 (1977)] or by analysis using a base sequence analyzer such as Applied Biosystems 3500 Genetic Analyzer or Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer (both manufactured by Thermo Fisher Scientific).
  • the base sequence of the DNA can be determined.
  • Any host cell that can be used to determine the base sequence of the DNA may be any cell that can be introduced with the vector and propagated; for example, Escherichia coli DH5 ⁇ , Escherichia coli HST08 Premium, Escherichia coli HST02.
  • Examples of the above vectors include pBluescript II KS (+), pPCR-Script Amp SK (+) (all manufactured by Agilent Technologies), pT7Blue (manufactured by Merck Millipore), and pCRII (manufactured by Thermo Fisher Scientific). ), pCR-TRAP (manufactured by Gene Hunter), and pDIRECT (Nucleic Acids Res., 18, 6069, 1990).
  • Any method for introducing recombinant DNA into host cells can be used, such as a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 69, 2110 (1972)], protoplast method (Japanese Unexamined Patent Publication No. 63-248394), electroporation method [Nucleic Acids Res. , 16, 6127 (1988)].
  • full-length DNA can be obtained by Southern hybridization of a chromosomal DNA library using the partial-length DNA as a probe.
  • the desired DNA can also be prepared by chemical synthesis based on the determined DNA base sequence using an NTS M series DNA synthesizer manufactured by Nippon Techno Service Co., Ltd., or the like.
  • a recombinant DNA containing a DNA encoding a protein according to any one of [1] to [3] above means that the DNA is capable of autonomous replication or integration into the chromosome in the parent strain, and It refers to recombinant DNA that has been incorporated into an expression vector that contains a promoter at a location where the DNA can be transcribed.
  • the recombinant DNA is a recombinant DNA that can be integrated into the chromosome, it does not need to contain a promoter.
  • the copy number of the gene is increased compared to the parent strain, which is obtained by transforming a parent strain microorganism with a recombinant DNA containing a DNA encoding the protein according to any one of [1] to [3] above.
  • Microorganisms can be obtained by the following method.
  • a suitable length of DNA containing a portion encoding the protein is prepared.
  • bases in the base sequence of the portion encoding the protein so that it becomes the optimal codon for expression in the host cell, a transformant with improved production rate can be obtained.
  • Recombinant DNA is produced by inserting the DNA fragment downstream of the promoter of an appropriate expression vector.
  • the recombinant DNA is composed of a promoter, a ribosome binding sequence, the DNA described in any one of [4] to [7] above, and a transcription termination sequence.
  • a promoter a ribosome binding sequence
  • the DNA described in any one of [4] to [7] above and a transcription termination sequence.
  • it is a recombinant DNA.
  • a gene that controls a promoter may be included.
  • a plasmid in which the distance between the Shine-Dalgarno sequence, which is a ribosome binding sequence, and the start codon is adjusted to an appropriate distance (for example, 6 to 18 bases).
  • an appropriate distance for example, 6 to 18 bases.
  • a transcription termination sequence is not necessarily required for expression of the DNA, it is preferable to place the transcription termination sequence immediately below the structural gene.
  • expression of a protein with ⁇ 1,2-fucosyltransferase activity can be achieved by substituting bases in the base sequence of the part encoding the protein with ⁇ 1,2-fucosyltransferase activity so that it becomes the optimal codon for expression in the host. quantity can be improved.
  • proteins having ⁇ 1,2-fucosyltransferase activity include the proteins described in any one of [1] to [3] above. Information on codon usage in the parent strain used in the present invention is available through public databases.
  • the expression vector is not particularly limited as long as it is an appropriate nucleic acid molecule for introducing, propagating, and expressing the target DNA into a host, and includes not only plasmids but also artificial chromosomes, vectors using transposons, and cosmids. It's okay.
  • expression vectors such as pColdI, pSTV28, pSTV29, pUC118 (all manufactured by Takara Bio), pMW118, pMW119 (all manufactured by Nippon Gene), pET21a, pCOLADuet- 1, pCDFDuet-1, pCDF-1b, pRSF-1b (all manufactured by Merck Millipore), pMAL-c5x (manufactured by New England Biolabs), pGEX-4T-1, pTrc99A (all manufactured by GE Healthcare Biosciences) pTrcHis, pSE280 (all manufactured by Thermo Fisher Scientific), pGEMEX-1 (manufactured by Promega), pQE-30, pQE80L (all manufactured by Qiagen), pET-3, pBluescript II SK (+) , pBluescriptII
  • any promoter may be used as long as it functions in the cells of microorganisms belonging to the genus Escherichia.
  • promoters of genes involved in amino acid biosynthesis such as trp promoter and ilv promoter Promoters derived from Escherichia coli, phages, etc., such as , uspA promoter, lac promoter, PL promoter, PR promoter, and PSE promoter, can be used.
  • examples include promoters that have been artificially designed and modified, such as a promoter in which two trp promoters are arranged in series, a tac promoter, a trc promoter, a lacT7 promoter, and a letI promoter.
  • expression vectors such as pCG1 (Japanese Unexamined Patent Publication No. 57-134500), pCG2 (Japanese Unexamined Patent Publication No. 58-35197), pCG4 (Japanese Unexamined Patent Publication No. 57-183799), pCG11 (Japanese Unexamined Patent Application No. 57-134500), pCG116, pCE54, pCB101 (all Japanese Unexamined Patent Application No. 58-105999), pCE51, pCE52 , pCE53 [both Molecular and General Genetics, 196, 175 (1984)].
  • any promoter may be used as long as it functions in the cells of a microorganism belonging to the genus Corynebacterium.
  • the P54-6 promoter [Appl. Microbiol. Biotechnol. , 53, 674-679 (2000)] can be used.
  • examples of expression vectors include YEp13 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419), pHS19, pHS15, and the like.
  • any promoter may be used as long as it functions in the cells of the yeast strain, such as PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, gal1 promoter, gal10 promoter, heat promoter, etc.
  • promoters such as shock polypeptide promoter, MF ⁇ 1 promoter, and CUP1 promoter.
  • Recombinant DNA used in the production method of the present invention can be produced by inserting the DNA fragment described in any one of [4] to [7] above into the downstream of the promoter of an appropriate expression vector.
  • a method for introducing the recombinant DNA into the parent strain as a plasmid capable of autonomous replication for example, a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 69, 2110 (1972)], the protoplast method (Japanese Unexamined Patent Publication No. 63-248394) and the electroporation method [Nucleic Acids Res. , 16, 6127 (1988)].
  • Examples of methods for integrating recombinant DNA into the chromosome of host cells include homologous recombination.
  • Examples of the homologous recombination method include a method using a plasmid for homologous recombination that can be prepared by ligating with plasmid DNA having a drug resistance gene that cannot autonomously replicate within the host cell into which the drug is to be introduced.
  • Examples of methods using homologous recombination frequently used in Escherichia coli include, for example, a method of introducing recombinant DNA using a lambda phage homologous recombination system [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 6640-6645 (2000)].
  • the recombinant DNA has been introduced into the parent strain as a plasmid capable of autonomous replication or has been integrated into the chromosome of the parent strain means that, for example, the microorganism amplifies the gene originally contained in the chromosomal DNA.
  • the gene introduced by transformation can be confirmed by a method such as confirming the amplification product by PCR using an amplifiable primer set.
  • an increase in the amount of transcription of the DNA or the amount of production of the protein encoded by the DNA can be determined by measuring the amount of transcription of the gene of the microorganism by Northern blotting or by Western blotting of the amount of production of the protein by the microorganism. This can be confirmed by comparing it with that of the parent strain.
  • the microorganism created by the above method is a microorganism in which the activity of the protein according to any one of [1] to [3] above is enhanced and the productivity of LNFPI is improved compared to the parent strain
  • the culture solution is appropriately diluted and centrifuged, and the LNFPI contained in the supernatant or the bacterial cells is analyzed using a sugar analyzer or high-performance liquid chromatograph mass spectrometer described below, and compared with that of the parent strain. This can be confirmed by
  • the above-mentioned microorganism selectively transfers fucose to the N-acetylglucosamine site of LNT by enhancing the activity of the protein described in any one of [1] to [3] above compared to the parent strain, The productivity of LNFPI can be improved.
  • Such microorganisms include, for example, the NNN/pGsFucT strain with enhanced expression of the GsFucT gene, which will be described later in Examples, the NNN/pFsFucT strain with enhanced expression of the FsFucT gene, the NNN/pNbFucT1 strain with enhanced expression of the NbFucT1 gene, NNN/pMtFucT strain with enhanced expression of MtFucT gene, NNN/pAjFucT strain with enhanced expression of AjFucT gene, NNN/pSbFucT strain with enhanced expression of SbFucT gene, NNN/pPsFucT strain with enhanced expression of PsFucT gene, NbFucT2 gene Examples include the NNN/pNbFucT2 strain with enhanced expression of the HMFT gene, and the NNN/pHMFT strain with enhanced expression of the HMFT gene.
  • microorganisms such as microorganisms with enhanced expression of GsFucT, FsFucT, NbFucT1, MtFucT, AjFucT, SbFucT, NbFucT2, or HMFT
  • ⁇ 1,2- which can selectively transfer fucose to N-acetylglucosamine sites. Fucose transferase activity is enhanced and LNFPI productivity can be improved. Therefore, LNFPI can be efficiently produced by using these microorganisms.
  • these microorganisms can also be used to produce fucosylated oligosaccharides other than LNFPI, such as fucosyllactose such as 2'FL and 3'FL.
  • the method for producing a fucose-containing carbohydrate of the present invention includes preparing the above-described transformant, and producing oligosaccharides in a culture using the transformant. Examples include a method for producing a fucose-containing carbohydrate.
  • the fucose-containing carbohydrate is preferably LNFPI.
  • the method for culturing the transformant described above can be carried out according to the usual methods used for culturing microorganisms.
  • the medium for culturing the transformant may be a natural medium, as long as it contains carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the microorganism, and can efficiently culture the transformant.
  • Either a synthetic medium or a synthetic medium may be used.
  • the carbon source may be anything that can be assimilated by microorganisms, such as glucose, fructose, sucrose, molasses containing these, sugars such as starch or starch hydrolysates, organic acids such as acetic acid or propionic acid, or , alcohols such as glycerol, ethanol, and propanol.
  • microorganisms such as glucose, fructose, sucrose, molasses containing these, sugars such as starch or starch hydrolysates, organic acids such as acetic acid or propionic acid, or , alcohols such as glycerol, ethanol, and propanol.
  • nitrogen sources include ammonium salts of inorganic or organic acids such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate or ammonium phosphate, other nitrogen-containing compounds, as well as peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor. , casein hydrolyzate, soybean meal, soybean meal hydrolyzate, various fermented microbial cells and digested products thereof, and the like.
  • inorganic salts include primary potassium phosphate, secondary potassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate, and the like.
  • a microorganism having the ability to produce glucose, lactose, lactose monohydrate, etc. may be used as a transformant in the method for producing a fucose-containing carbohydrate.
  • glucose, lactose, lactose monohydrate, etc. may be added to the medium during culturing.
  • GDP-fucose or LNT may be added to the medium.
  • glucose, lactose, lactose monohydrate, or LNT is added from the sugar to glucose, lactose, lactose monohydrate, or LNT.
  • Glucose, lactose, lactose monohydrate, LNT, etc. may be supplied to the transformant of the present invention by culturing a microorganism capable of producing the same as the transformant of the present invention. .
  • ⁇ -galactosidase and WcaJ are not present in the medium.
  • Cultivation is usually preferably carried out under aerobic conditions such as shaking culture, deep aeration agitation culture, or jar fermenter.
  • the culture temperature is usually 30 to 37°C, and the culture time is usually 24 hours to 3 days.
  • the pH of the culture solution during cultivation is usually maintained at 6.0 to 8.0.
  • the pH is adjusted using an inorganic or organic acid, alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia, or the like.
  • a fucose-containing carbohydrate can be produced by producing a fucose-containing carbohydrate in the culture.
  • fucose-containing carbohydrates can be collected from the supernatant.
  • fucose-containing carbohydrates accumulate in the bacterial cells, for example, the bacterial cells are disrupted by ultrasonication, and the cells are removed by centrifugation, and then the resulting supernatant is extracted using an ion exchange resin method. Carbohydrates can be collected.
  • a desired fucose-containing carbohydrate can also be produced by further adding other sugars to the fucose-containing carbohydrate in the culture or the collected fucose-containing carbohydrate.
  • [Analysis example] (1) Analysis and quantification of LNFPI, 2'FL, or lactose
  • analysis and quantification of LNFPI, 2'FL, or lactose were performed according to the procedures shown below.
  • the culture solution containing the microorganisms after culturing was centrifuged, and the supernatant was collected.
  • the precipitated bacterial cells were suspended in the same amount of water as the original culture solution, and an equal amount of chloroform was added to disrupt the bacterial cells, followed by centrifugation, and the resulting supernatant water phase was used as the bacterial intracellular fraction.
  • Example 1 Creation of microorganisms expressing various ⁇ 1,2-fucosyltransferases (1) Creation of host strains ⁇ Obtaining DNA fragments to be used as markers in gene deletion> PCR was performed using DNA consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 37 and 38 as a primer set and pCatSac (Appl Environ Microbiol (2013) 79, 3033-3039) as a template to detect the chloramphenicol resistant cat gene and sucrose sensitivity. A cat-sacB fragment containing the sacB gene was obtained.
  • DNA encoding ⁇ -galactosidase (hereinafter referred to as lacZ gene), DNA encoding lactose permease (hereinafter referred to as lacY gene), and DNA encoding colanic acid production-related proteins (hereinafter referred to as wcaJ, wzxC, wcaK). , wcaL or wcaM gene) was created by the following method.
  • lacZ and lacY (hereinafter referred to as lacZY), and wcaJ, wzxC, wcaK, wcaL, and wcaM (hereinafter referred to as wcaJ-wzxC-wcaKLM) each form an operon on the E. coli genome.
  • PCR was performed using DNA consisting of the base sequence shown in "Primer set" in Table 1 as a primer set, and each DNA fragment was amplified.
  • lacZ upstream 1 and lacZ upstream 2 include a region from the start codon of the lacZ gene to about 1000 bp upstream of the start codon.
  • lacY downstream 1 and lacY downstream 2 include a region from about 50 bp to about 1000 bp downstream of the stop codon of the lacY gene.
  • lacZY::cat-sacB A DNA fragment (hereinafter referred to as lacZY::cat-sacB) consisting of a sequence in which a cat-sacB fragment was inserted into the sequences surrounding the lacZ and lacY genes was obtained.
  • PCR was performed using DNA consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 40 and 42 as a primer set, and lacZ A DNA fragment (hereinafter referred to as ⁇ lacZY) consisting of a sequence in which upstream and lacY downstream were directly linked was obtained.
  • ⁇ lacZY lacZ A DNA fragment
  • lacZY::cat-sacB fragment was transferred to plasmid pKD46, which contains the gene encoding lambda recombinase [Datsenko, K. et al. A. , Warner, B. L. , Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, Vol. 97, 6640-6645 (2000)] into the W3110S3GK strain (NBRC114657) by electroporation, and a transformant (lacZY gene is lacZY::cat) that showed chloramphenicol resistance and sucrose sensitivity -sacB transformant) was obtained.
  • the ⁇ lacZY fragment was introduced into the transformant by electroporation to obtain a transformant exhibiting chloramphenicol sensitivity and sucrose resistance (a transformant in which lacZY::cat-sacB was replaced with ⁇ lacZY). Among them, transformants exhibiting ampicillin sensitivity (transformants in which pKD46 was eliminated) were obtained.
  • the transformant was named W3110S3GK ⁇ lacZY.
  • PCR was performed using the W3110 strain genomic DNA as a template and DNA consisting of the base sequence shown in "Primer Set" in Table 2 as a primer set to obtain each amplified DNA fragment.
  • wcaJ upstream 1 and wcaJ upstream 2 include a region from the start codon of the wcaJ gene to about 1000 bp upstream of the start codon.
  • wcaM downstream 1 and wcaM downstream 2 include a region from the stop codon of the wcaM gene to about 1000 bp downstream of the stop codon.
  • PCR was performed using DNA consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 46 and 48 as a primer set, and wcaJ A DNA fragment consisting of a cat-sacB fragment inserted into the sequence surrounding the -wzxC-wcaKLM operon (hereinafter referred to as wcaJ-wzxC-wcaKLM::cat-sacB) was obtained.
  • PCR was performed using DNA consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 46 and 48 as a primer set, and wcaJ-wzxC-wcaKLM was obtained.
  • a DNA fragment (hereinafter referred to as ⁇ wcaJ-wzxC-wcaKLM) consisting of a sequence in which wcaJ upstream and wcaM downstream were directly linked was obtained.
  • the wcaJ-wzxC-wcaKLM::cat-sacB fragment was introduced into the W3110S3GK ⁇ lacZY constructed above by electroporation, and a transformant (wcaJ-wzxC-wcaKLM) that showed chloramphenicol resistance and sucrose sensitivity was obtained.
  • a transformant in which wcaJ-wzxC-wcaKLM::cat-sacB was substituted was obtained.
  • the ⁇ wcaJ-wzxC-wcaKLM fragment was introduced into the transformant by electroporation, and a transformant showing chloramphenicol sensitivity and sucrose resistance (wcaJ-wzxC-wcaKLM::cat-sacB is ⁇ wcaJ-wzxC -wcaKLM) was obtained. Furthermore, a transformant exhibiting ampicillin sensitivity (transformant in which pKD46 was eliminated) was obtained. The transformant was named W3110S3GK ⁇ lacZY ⁇ wcaJM.
  • Cv ⁇ 3GalT Chromobacterium violaceum ATCC553 strain consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 34, and Neisseria polysaccharea ATCC represented by SEQ ID NO: 36.
  • Escherichia coli containing a plasmid for gene expression in which the gene encoding ⁇ 1,3-N-acetylglucosamine transferase (hereinafter referred to as NpLgtA) derived from the W3110 strain and the lacY gene derived from the W3110 strain were arranged was constructed by the following method.
  • PCR was performed using DNA consisting of the base sequence shown in “Primer Set” in Table 3 as a primer set and the DNA listed in “Template” in Table 3 as a template to obtain each amplified DNA fragment.
  • the DNA represented by SEQ ID NO: 33 was obtained from ACS Catal. 2019, 9(12), 10721-10726, the base sequence of the gene encoding ⁇ 1,3-galactosyltransferase Cv ⁇ 3GalT derived from Chromobacterium violaceum ATCC553 is codon-optimized for expression in E. coli, and is an artificial DNA. Prepared by synthesis.
  • the DNA represented by SEQ ID NO: 35 is obtained by codon-optimizing the base sequence of the gene encoding ⁇ 1,3-N-acetylglucosamine transferase NpLgtA derived from Neisseria polysaccharea ATCC 43768 strain represented by SEQ ID NO: 36 in order to express it in E. coli. This DNA was prepared by artificial synthesis.
  • the base sequences represented by SEQ ID NOs: 52 and 53 and SEQ ID NOs: 54 and 55 include complementary sequences at their respective 5' ends.
  • Cv ⁇ 3galT-NplgtA-lacY DNA consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 51 and 56 as a primer set, and the three fragments were ligated.
  • a DNA hereinafter referred to as Cv ⁇ 3galT-NplgtA-lacY
  • PCR was performed using plasmid pUAKQE31 (Appl. Environ. Microbiol. 2007, 73:6378-6385) as a template to obtain an approximately 4.7 kb vector. Got the pieces.
  • the base sequences represented by SEQ ID NOs: 51 and 57 and SEQ ID NOs: 56 and 58 include complementary sequences at their respective 5' ends.
  • the expression plasmid pUAKQE-Cv ⁇ 3galT-NplgtA-lacY was obtained by ligating the Cv ⁇ 3galT-NplgtA-lacY fragment obtained above and the vector fragment using In-Fusion HD Cloning Kit (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • E. coli having pUAKQE-Cv ⁇ 3galT-NplgtA-lacY was created and named strain NNN.
  • PCR was performed using DNA consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 59 and 60 as a primer set and W3110 strain prepared by a conventional method as a template to obtain an rcsA fragment.
  • PCR was performed using plasmid pSTV29 (manufactured by Takara Bio Inc.) as a template and DNA consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 61 and 62 as a primer set to obtain a vector fragment of approximately 2.9 kb.
  • the base sequences represented by SEQ ID NOs: 59 and 61 and SEQ ID NOs: 60 and 62 include complementary sequences at their respective 5' ends.
  • the expression vector pSTV-rcsA was obtained by ligating the rcsA fragment obtained above and the vector fragment using In-Fusion HD Cloning Kit (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • PCR was performed using DNA consisting of the base sequence shown in "Primer set” in Table 4 as a primer set and the DNA listed in "Template” in Table 4 as a template to obtain each amplified DNA fragment.
  • the DNA represented by SEQ ID NO: 1 is Gramella sp. represented by SEQ ID NO: 2. This is a DNA in which the base sequence of the gene encoding ⁇ 1,2-fucosyltransferase GsFucT derived from the MAR_2010_147 strain has been codon-optimized for expression in E. coli, and was prepared by artificial synthesis.
  • the DNA represented by SEQ ID NO: 3 is Francisella sp. represented by SEQ ID NO: 4. This is a DNA in which the base sequence of the gene encoding ⁇ 1,2-fucosyltransferase FsFucT derived from the FSC1006 strain has been codon-optimized for expression in E. coli, and was prepared by artificial synthesis.
  • the DNA represented by SEQ ID NO: 5 is a DNA obtained by codon-optimizing the base sequence of the gene encoding ⁇ 1,2-fucosyltransferase NbFucT1 derived from Neisseriaceae bacterium DSM strain 100970 represented by SEQ ID NO: 6 in E. coli. and was prepared by artificial synthesis.
  • the DNA represented by SEQ ID NO: 7 is a DNA obtained by codon-optimizing the base sequence of the gene encoding ⁇ 1,2-fucosyltransferase MtFucT derived from Methylobacter tundripaludum strain represented by SEQ ID NO: 8 in order to express it in E. coli. , prepared by artificial synthesis.
  • the DNA represented by SEQ ID NO: 9 is a DNA obtained by codon-optimizing the base sequence of the gene encoding ⁇ 1,2-fucosyltransferase AjFucT derived from Amphritea japonica strain represented by SEQ ID NO: 10 in order to express it in Escherichia coli. , prepared by artificial synthesis.
  • the DNA represented by SEQ ID NO: 11 is a DNA obtained by codon-optimizing the base sequence of the gene encoding ⁇ 1,2-fucosyltransferase PaFucT derived from Pseudohalocynthiibacter aestuariivens strain represented by SEQ ID NO: 12 in E. coli. , prepared by artificial synthesis.
  • the DNA represented by SEQ ID NO: 13 is a DNA obtained by codon-optimizing the base sequence of the gene encoding ⁇ 1,2-fucosyltransferase SbFucT derived from Sterolibacteriaceae bacteria J5B strain represented by SEQ ID NO: 14 in order to express it in Escherichia coli. Yes, it was prepared by artificial synthesis.
  • the DNA represented by SEQ ID NO: 15 is derived from Pedobacter sp. represented by SEQ ID NO: 16.
  • This DNA is a DNA in which the base sequence of the gene encoding ⁇ 1,2-fucosyltransferase PsFucT derived from strain CF074 is codon-optimized for expression in E. coli, and was prepared by artificial synthesis.
  • the DNA represented by SEQ ID NO: 17 is a DNA obtained by codon-optimizing the base sequence of the gene encoding ⁇ 1,2-fucosyltransferase NbFucT2 derived from Neisseriales bacterium strain represented by SEQ ID NO: 18 in order to express it in E. coli. , prepared by artificial synthesis.
  • the DNA represented by SEQ ID NO: 19 is a DNA in which the base sequence of the gene encoding ⁇ 1,2-fucosyltransferase CMfFucT derived from Candidatus Methylobacter favarea strain represented by SEQ ID NO: 20 is codon-optimized for expression in E. coli. Yes, it was prepared by artificial synthesis.
  • the DNA represented by SEQ ID NO: 21 is a DNA obtained by codon-optimizing the base sequence of the gene encoding ⁇ 1,2-fucosyltransferase WbwK derived from Escherichia coli O86 strain represented by SEQ ID NO: 22 in order to express it in Escherichia coli. Yes, it was prepared by artificial synthesis.
  • the DNA represented by SEQ ID NO: 23 is a DNA obtained by codon-optimizing the base sequence of the gene encoding ⁇ 1,2-fucosyltransferase WbiQ derived from Escherichia coli O127 strain represented by SEQ ID NO: 24 in order to express it in Escherichia coli. Yes, it was prepared by artificial synthesis.
  • the DNA represented by SEQ ID NO: 25 is the base sequence of the gene encoding ⁇ 1,2-fucosyltransferase HMFT derived from Helicobacter mustelae ATCC43772 strain represented by SEQ ID NO: 26, and was prepared by artificial synthesis.
  • PCR was performed to obtain a vector fragment of approximately 3.5 kb.
  • the base sequences represented by 82, 84, 86, 88 and 95 include complementary sequences at their respective 5' ends.
  • plasmids expressing various ⁇ 1,2-fucosyltransferases pGsFucT, pFsFucT, pNbFucT1, pMtFucT, pAjFucT, pPaFucT, pSbFucT, pPsFucT, pNbFucT2, pCMfFucT, pWbwK, pWbiQ and pHMFT were constructed.
  • NNN/pGsFucT strain NNN/pFsFucT strain, NNN/pNbFucT1 strain, NNN/pMtFucT strain, NNN/pAjFucT strain, NNN/pPaFucT strain, NNN/pSbFucT strain, NNN/pPsFucT strain, NNN/pNbFucT2.
  • strain NNN/pCMfFucT The strains were named NNN/pWbwK strain, NNN/pWbiQ strain, NNN/pHMFT strain, and NNN/pCtrl strain.
  • PCR was performed using DNA consisting of the base sequence shown in "Primer set” in Table 5 as a primer set and the DNA listed in “Template” in Table 5 as a template to obtain each amplified DNA fragment.
  • the DNA represented by SEQ ID NO: 27 is obtained by codon-optimizing the base sequence of the gene encoding ⁇ 1,2-fucosyltransferase FucT54 derived from Sideroxydans lithotrophicus ES-11 strain represented by SEQ ID NO: 28 for expression in E. coli. It is DNA and was prepared by artificial synthesis.
  • the DNA represented by SEQ ID NO: 29 is obtained by codon-optimizing the base sequence of the gene encoding ⁇ 1,2-fucosyltransferase Te2FT derived from Thermosynechococcus elongatus BP-1 strain represented by SEQ ID NO: 30 for expression in E. coli. It is DNA and was prepared by artificial synthesis.
  • the DNA represented by SEQ ID NO: 31 is the base sequence of the gene encoding the ⁇ 1,2-fucosyltransferase FutC derived from Helicobacter pylori strain 26695 represented by SEQ ID NO: 32, and was prepared by artificial synthesis.
  • PCR was performed using DNA consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 61 and 95 as a primer set, and a vector fragment of approximately 3.5 kb was obtained. Obtained.
  • the base sequences represented by SEQ ID NOs: 89, 91, 93, and 61, and SEQ ID NOs: 90, 92, 94, and 95 each include a complementary sequence at their 5' ends.
  • Example 1 (1) By using the ⁇ 1,2-fucosyltransferase expression plasmid obtained above to transform the NNN strain constructed in Example 1 (1), Escherichia coli having various plasmids were constructed, and NNN/pFucT54 strain, NNN/pFucT54 strain, and The strains were named NNN/pTe2FT strain and NNN/pFutC strain.
  • Example 2 Productivity evaluation of LNFPI NNN/pGsFucT strain, NNN/pFsFucT strain, NNN/pNbFucT1 strain, NNN/pMtFucT strain, NNN/pAjFucT strain, NNN/pPaFucT strain, obtained in Example 1 (2) above, The productivity of LNFPI was evaluated for the NNN/pSbFucT strain, NNN/pPsFucT strain, NNN/pNbFucT2 strain, NNN/pCMfFucT strain, NNN/pWbwK strain, NNN/pWbiQ strain, and NNN/pHMFT strain. As positive controls, the NNN/pTe2FT strain and NNN/pFutC strain constructed in the comparative example were used. As a negative control, the NNN/pCtrl strain constructed in Example 1 (2) was used.
  • Each strain was cultured at 37°C for 18 hours on LB plates containing 100 mg/L kanamycin and 25 mg/L chloramphenicol.
  • the cells were inoculated into a plastic test tube containing 2 mL of culture medium and cultured with shaking at 30° C. for 15 hours. Thereafter, the obtained culture solution was transferred to a production medium containing 100 mg/L kanamycin and 25 mg/L chloramphenicol [glucose 30 g/L, lactose monohydrate 10 g/L, magnesium sulfate heptahydrate 2 g/L].
  • the culture solution was centrifuged and diluted appropriately, and LNFPI, LNTII, or LNT contained in the supernatant and intracellular fraction was analyzed using UFLC & LCMS-8040. The results are shown in Table 6. Further, the results of the total LNFPI production amount of the supernatant and intracellular fraction are shown in FIG. 2.
  • NNN/pGsFucT strain compared to the strain expressing FutC or Te2FT, which is known as ⁇ 1,2-fucosyltransferase capable of producing LNFPI
  • NNN/pGsFucT strain compared to the strain expressing FutC or Te2FT, which is known as ⁇ 1,2-fucosyltransferase capable of producing LNFPI
  • NNN/pGsFucT strain NNN/pFsFucT strain
  • NNN/pNbFucT1 strain NNN/pMtFucT strain
  • NNN/pAjFucT strain NNN/pAjFucT strain It was found that the NNN/pSbFucT strain, NNN/pNbFucT2 strain, and NNN/pHMFT strain were able to accumulate a large amount of LNFPI both in the supernatant and within the bacterial cells.
  • FsFucT from FSC1006 and NbFucT2 from Neisseriales bacterium were selected as candidates for ⁇ 1,2-fucosyltransferase useful for LNFPI production.
  • Example 3 Production of LNFPI
  • the NNN/pFsFucT strain and the NNN/pNbFucT2 strain selected in Example 2, and the NNN/pFucT54 strain created in the comparative example as a positive control were treated with 100 mg/L of kanamycin and 25 mg/L, respectively.
  • a 2 L baffled Erlenmeyer flask containing 250 mL of sodium 5 g/L] was inoculated and cultured with shaking at 30° C. for 17 hours.
  • the obtained culture solution was transferred to a production medium containing 100 mg/L of kanamycin and 25 mg/L of chloramphenicol [glucose 20 g/L, ferrous sulfate heptahydrate 0.2 g/L, magnesium sulfate heptahydrate.
  • IPTG IPTG was added to a final concentration of 0.5 mM, and in subsequent cultures, 1-6 mL of 480 g/L glucose solution and 4 g/L lactose monohydrate were added. /h.
  • the NNN/pFsFucT strain and the NNN/pNbFucT2 strain produce fucosylated oligosaccharides 2'FL and LNFPI, indicating the possibility that FsFucT and NbFucT2 can be used for the production of these oligosaccharides.
  • the NNN/pFsFucT strain and the NNN/pNbFucT2 strain accumulate significantly more LNFPI in both the supernatant and inside the bacterial cells than the NNN/pFucT54 strain, which is a known ⁇ 1,2-fucosyltransferase-expressing strain.
  • NNN/pNbFucT2 strain produced about twice as much LNFPI as the NNN/pFucT54 strain.
  • the production of the byproduct 2'FL was significantly reduced in the NNN/pNbFucT2 strain compared to other strains, suggesting that NbFucT2 may be able to preferentially use LNT as a substrate. .
  • SEQ ID NO: 1 Gramella sp.
  • Base sequence of GsFucT derived from MAR_2010_147 SEQ ID NO: 2 Gramella sp.
  • Amino acid sequence of GsFucT derived from MAR_2010_147 SEQ ID NO: 3 Francisella sp.

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Abstract

ＬＮＦＰＩの生産性に優れるα１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質及びＬＮＦＰＩの製造法の提供を目的とする。ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）へのフコシル基転移活性を有する、配列番号２、４、６、８、１０、１４、１８又は２６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、又はその変異蛋白質若しくは相同蛋白質。

Description

α１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質及びラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰＩ）の製造方法
　本発明は、α１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質及びラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰＩ）の製造方法に関する。
　ヒトの母乳中に含まれるオリゴ糖（Ｈｕｍａｎ　Ｍｉｌｋ　Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、ＨＭＯ）はプレバイオティクス素材として注目されており、乳幼児の認知機能発達や感染防御、腸内環境の改善などに有効であることが示されている（非特許文献１）。
　ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（以下、ＬＮＦＰＩという。）はＨＭＯの一種であり、ラクト－Ｎ－テトラオース（以下、ＬＮＴという。）のガラクトース２位にフコースがα１，２－結合した５糖ＨＭＯである。
　ＬＮＦＰＩは、２’－フコシルラクトース（以下、２’ＦＬという。）やラクト－Ｎ－ジフコヘキサオース（以下、ＬＮＤＦＨＩという。）に次いで母乳中に多く含まれ、同じく５糖で、ＬＮＦＰＩの異性体として知られるラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩ（以下、ＬＮＦＰＩＩという。）やラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩＩ（以下、ＬＮＦＰＩＩＩという。）と比較して、母乳中の含量が高いことが知られている（非特許文献２）。
　ＬＮＦＰＩの機能性としては、髄膜炎起因菌グループＢストレプトコッカス（ＧＢＳ）に対する阻害効果やノロウイルス阻害効果などが知られている（非特許文献３、４）。また、新生児の腸内において占有率の高いＢiｆiｄｏｂａｃｔｅｒiｕｍ　iｎｆａｎｔiｓ（ビフィドバクテリウム・インファンティス）は、ＬＮＦＰＩ選択的に優位に生育が認められるという結果から、プレバイオティクスとしての機能も注目されている（非特許文献５）。
　ＬＮＦＰＩの製造方法としては、α１，２－フコシルトランスフェラーゼを使用した微生物発酵法や酵素反応法［Ｏｎｅ－ｐｏｔ　ｍｕｌｔｉｅｎｚｙｍｅ（ＯＰＭＥ）　ｓｙｓｔｅｍ］が広く使用されている。特許文献１および２並びに非特許文献４、５および６には、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｌｏｎｇａｔｕｓ（サーモシネココッカス・エロンゲータス）、Ｓｉｄｅｒｏｘｙｄａｎｓ　ｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ（シデロキシダンス・リトトロピクス）又はＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ　（ヘリコバクター・ピロリ）などの微生物に由来するα１，２－フコシルトランスフェラーゼを大腸菌で過剰発現させ、ＬＮＴおよびＧＤＰ－フコースを基質として、発酵法または連続酵素反応法によりＬＮＦＰＩなどのオリゴ糖を生産する方法が開示されている。
　しかしながら、前記発酵法または連続酵素反応法では、ＬＮＦＰＩ生産において、α１，２－フコシルトランスフェラーゼが所望の基質であるＬＮＴだけではなく共存するラクトースにも反応し副生物として２’ＦＬが生成することが課題となっている。
　副生物を低減させる方法としては、精製された高純度のＬＮＴを基質として用いる酵素反応法（特許文献１，非特許文献５）や、初発原料のラクトースが枯渇したタイミングでα１，２－フコシルトランスフェラーゼの発現を誘導することでＬＮＦＰＩを生産させる方法が開示されている（非特許文献６）。
国際公開第２０１７／１０６８６４号 国際公開第２０１９／００８１３３号
Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ（２０１９），Ａｒｔｉｃｌｅ　ＩＤ　２３９０２４０ Ｎｕｔｒ．Ｒｅｖ．（２０１７）７５，９２０－９３３ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０１７）２９２（２７）１１２４３－１１２４９ Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０２０）３１８，３１－３８ Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．（２０１６）５２，３８９９－３９０２ Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２３（２０１５）６７９９－６８０６
　上述のように、α１，２－フコシルトランスフェラーゼを使用した微生物発酵法や酵素反応法が知られている。しかしながら、特許文献１、２および非特許文献４、５、６に記載の微生物由来のα１，２－フコシルトランスフェラーゼは広範な糖基質を許容しうるため、ＬＮＦＰＩ生産において副生物として２’ＦＬが生成することが課題となる。
　一方で、より効率的にラクトースを初発原料としてＬＮＦＰＩを生産させるためには、ラクトースには糖転移せず、ＬＮＴの非還元末端ガラクトース部位に対し選択的に糖転移可能なα１，２－フコシルトランスフェラーゼが求められる。
　したがって、本発明は、ＬＮＦＰＩの生産性に優れるα１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質及びＬＮＦＰＩの製造方法の提供を目的とする。
　本発明者らは、特定のアミノ酸配列からなるα１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物を用いることにより、従来の方法と比して、効率的にＬＮＦＰＩを製造できることを見出し、本発明を完成させた。
　また、ＬＮＦＰＩ又はフコシルラクトース等のフコシル化オリゴ糖の製造に適したＮｅｉｓｓｅｒｉａ属又はＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ属由来のフコシルトランスフェラーゼを初めて見出した。
　すなわち、本発明は以下の通りである。
１．ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）へのフコシル基転移活性を有する、下記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質。
［１］配列番号２、４、６、８、１０、１４、１８又は２６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
［２］配列番号２、４、６、８、１０、１４、１８又は２６で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する変異蛋白質。
［３］配列番号２、４、６、８、１０、１４、１８又は２６で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する相同蛋白質。
２．配列番号１、３、５、７、９、１３、１７又は２５で表される塩基配列又はその相同配列からなり、かつ前記１に記載の［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
３．前記２に記載のＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ。
４．前記３に記載の組換え体ＤＮＡで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
５．前記１に記載の［１］～［３］のいずれか１の蛋白質の活性及びフコース含有糖質の生産性が増強された微生物である、前記４に記載の形質転換体。
６．前記微生物が大腸菌である、前記５に記載の形質転換体。
７．前記４～６のいずれか１に記載の形質転換体を調製すること、および該形質転換体を用いて培養物中にフコース含有糖質を生成することを含む、フコース含有糖質の製造方法。
８．前記フコース含有糖質がラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰＩ）である、前記７に記載の製造方法。
　本発明の蛋白質は、特定のアミノ酸配列からなることにより、ＬＮＴの非還元末端ガラクトース部位に対し糖転移可能なα１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する。本発明の蛋白質を生産する能力を有する微生物を用いることにより、従来と比して、副生物の生成を抑制し、効率的にＬＮＦＰＩを製造できる。
図１は、本発明の一実施形態におけるＬＮＦＰＩの生合成経路を示す。 図２は、上清および菌体内画分のＬＮＦＰＩ生産量の合算値の結果を示す（実施例２）。
＜蛋白質、ＤＮＡ、形質転換体＞
　本発明の蛋白質は、ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）へのフコシル基転移活性を有する以下の［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質である。
［１］配列番号２、４、６、８、１０、１４、１８又は２６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
［２］配列番号２、４、６、８、１０、１４、１８又は２６で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する変異蛋白質。
［３］配列番号２、４、６、８、１０、１４、１８又は２６で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する相同蛋白質。
　ＬＮＴへのフコシル基転移活性をより高める観点から、前記［１］に記載の蛋白質の中でも、配列番号４、６、８、１４、１８又は２６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質が好ましく、より好ましくは配列番号４又は１８で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質である。
　配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質は、実施例において後述するＧｒａｍｅｌｌａ　ｓｐ．　ＭＡＲ＿２０１０＿１４７株由来α１，２－フコシルトランスフェラーゼＧｓＦｕｃＴである。
　配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質は、実施例において後述するＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ　ｓｐ．　ＦＳＣ１００６株由来α１，２－フコシルトランスフェラーゼＦｓＦｕｃＴである。
　配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質は、実施例において後述するＮｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ＤＳＭ　１００９７０株由来α１，２－フコシルトランスフェラーゼＮｂＦｕｃＴ１である。
　配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質は、実施例において後述するＭｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｔｕｎｄｒｉｐａｌｕｄｕｍ株由来α１，２－フコシルトランスフェラーゼＭｔＦｕｃＴである。
　配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質は、実施例において後述するＡｍｐｈｒｉｔｅａ　ｊａｐｏｎｉｃａ株由来α１，２－フコシルトランスフェラーゼＡｊＦｕｃＴである。
　配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質は、実施例において後述するＳｔｅｒｏｌｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｊ５Ｂ株由来α１，２－フコシルトランスフェラーゼＳｂＦｕｃＴである。
　配列番号１８で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質は、実施例において後述するＮｅｉｓｓｅｒｉａｌｅｓ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ株由来α１，２－フコシルトランスフェラーゼＮｂＦｕｃＴ２である。
　配列番号２６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質は、実施例において後述するＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｍｕｓｔｅｌａｅ　ＡＴＣＣ４３７７２株由来α１，２－フコシルトランスフェラーゼＨＭＦＴである。
　本明細書において、変異蛋白質とは、元となる蛋白質中のアミノ酸残基を人為的に欠失若しくは置換、または該蛋白質中にアミノ酸残基を挿入若しくは付加して得られる蛋白質をいう。
　上記［２］の変異蛋白質において、アミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されていてもよい。欠失、置換、挿入または付加されるアミノ酸の数は好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～８個、最も好ましくは１～５個である。
　欠失、置換、挿入または付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、Ｌ－システインなどが挙げられる。
　以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２－アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ－メチルセリン、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２－アミノアジピン酸、２－アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４－ジアミノブタン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３－ヒドロキシプロリン、４－ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
　上記［２］の変異蛋白質において、置換されるアミノ酸残基として、例えば、１７番目のアスパラギン残基が挙げられる。
　本明細書において、相同蛋白質とは、元となる蛋白質と構造および機能が類似することにより、その蛋白質をコードする遺伝子が進化上の起源を元の蛋白質をコードする遺伝子と同一にすると考えられる蛋白質であって、自然界に存在する生物が有する蛋白質をいう。
　相同蛋白質としては、例えば、対象となる蛋白質が有するアミノ酸配列と好ましくは９０％以上、より好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
　アミノ酸配列および塩基配列の同一性は、Ｋａｒｌｉｎ　ａｎｄ　ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　９０，　５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，　１８３，　６３　（１９９０）］を用いて決定できる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている［Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　２１５，　４０３（１９９０）］。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばＳｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
　本明細書において、ＬＮＴへのフコシル基転移活性とは、ドナー基質であるＧＤＰ－フコースから、受容体基質である糖質（以下、「受容体糖質」という。）であるＬＮＴのＮ－アセチルグルコサミン水酸基にフコース残基を転移する活性をいう。
　ＧＤＰ－フコースからＮ－アセチルグルコサミン水酸基にフコース残基が転移することにより、ＬＮＦＰIが生成する。本発明の一実施形態におけるＬＮＦＰＩの生合成経路を図１に示す。
　本明細書において、α１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性とは、ドナー基質であるＧＤＰ－フコースから、受容体糖質のＮ－アセチルグルコサミン水酸基にα１，２－結合でフコース残基を転移し、フコース含有糖質を生成する活性をいう。受容体糖質としては、ＬＮＴが好ましい。フコース含有糖質としては、ＬＮＦＰＩが好ましい。
　上記した変異蛋白質又は相同蛋白質が、α１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有することは、例えば以下の方法により確認できる。
　まず、後述の方法により、上記活性を確認しようとする変異蛋白質又は相同蛋白質をコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡを作製する。次に、該組換え体ＤＮＡで、親株を形質転換することにより該親株より該蛋白質の活性が高い形質転換体を作製し、該親株又は該形質転換体の培養液中に生成、蓄積したフコース含有糖質の量を比較することによって確認できる。フコース含有糖質としては、具体的には、ＬＮＦＰＩが挙げられる。
　本明細書において、「親株」とは、遺伝子改変及び形質転換等の対象となる元株をいう。
　本明細書において、親株としては、好ましくは原核生物または酵母菌株を、より好ましくは、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、若しくはシュードモナス属等に属する原核生物、またはサッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属、ピチア属、若しくはキャンディダ属等に属する酵母菌株を、最も好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＧ１６５５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ２－Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１　ｃｏｄｏｎ　ｐｌｕｓ（ストラタジーン社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０Ｓ３ＧＫ（ＮＢＲＣ１１４６５７）、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ　ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ　ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ　ＡＴＣＣ１５３５４、若しくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．　Ｄ－０１１０等の原核生物、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ　ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ　ａｌｌｕｖｉｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ、若しくはＣａｎｄｉｄａ　ｕｔｉｌｉｓ等の酵母菌株を挙げることができる。
　親株は、ＧＤＰ－フコース及び／又はＬＮＴを生成する微生物であれば、野生株であってもよい。野生株がＧＤＰ－フコース及び／又はＬＮＴを生成する能力を有しない場合は、ＧＤＰ－フコース及び／又はＬＮＴを供給する能力を人工的に付与した育種株であってもよい。
　親株として用いる微生物としては、例えば、以下の１）及び２）が挙げられる。
１）α１，２－フコシルトランスフェラーゼの反応基質であるＧＤＰ－フコースを供給する能力が人工的に付与又は増強された微生物
２）α１，２－フコシルトランスフェラーゼの反応基質であるＬＮＴを供給する能力を人工的に付与又は増強された微生物
　以下、説明する。
１）α１，２－フコシルトランスフェラーゼの反応基質であるＧＤＰ－フコースを供給する能力が人工的に付与又は増強された、親株として用いる微生物
　親株としては、好ましくは、α１，２－フコシルトランスフェラーゼの反応基質であるＧＤＰ－フコースを供給する能力を人工的に付与又は増強された微生物が挙げられる。親株として用いる微生物において、ＧＤＰ－フコースを供給する能力を付与又は増強する方法の具体例としては、各種遺伝子操作による方法（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２０１７）４１：２３－３８）等、公知の方法が挙げられる。
　ＧＤＰ－フコースを供給する能力としては、糖からＧＤＰ－フコースを生産する能力が挙げられる。親株として用いる微生物に、糖からＧＤＰ－フコースを生産する能力を人工的に付与又は増強する方法としては、例えば、以下の（１ａ）～（１ｄ）の方法が挙げられる。これらの方法は単独または組み合わせて用いてもよい。
（１ａ）糖からＧＤＰ－フコースを生成する生合成経路を制御する機構の少なくとも１つを緩和又は解除する方法
（１ｂ）糖からＧＤＰ－フコースを生成する生合成経路に関与する酵素の少なくとも１つについて発現を増強する方法
（１ｃ）糖からＧＤＰ－フコースを生成する生合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法
（１ｄ）糖からＧＤＰ－フコースを生成する生合成経路から該目的物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化又は遮断する方法
　糖からＧＤＰ－フコースを生成する生合成経路を制御する機構の具体例としては、例えば、当該生合成経路の制御に関わる転写調節因子（例えば、ＲｃｓＡ等）による制御機構等、公知の機構が挙げられる。ＲｃｓＡは、ＧＤＰ－フコースを中間体とするコラン酸生合成経路全体をアップレギュレートする調節因子である。後述のようにコラン酸生合成経路のうちＧＤＰ－フコースより下流の経路を遮断した状態でｒｃｓＡを強化することで、ＧＤＰ－フコースを多く蓄積させることができる。
　糖からＧＤＰ－フコースを生成する生合成経路に関与する酵素の具体例としては、例えば、マンノース－６－リン酸イソメラーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－リン酸グアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰマンノース－４，６－デヒドラターゼ、ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼ等、公知の酵素が挙げられる。
　糖からＧＤＰ－フコースを生成する生合成経路から該目的物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の具体例としては、例えば、ＧＤＰ－フコースからコラン酸への代謝経路等、公知の代謝経路が挙げられる。特にコラン酸生合成経路のうちＧＤＰ－フコースより下流の経路であるＷｃａＪ、ＷｚｘＣ、ＷｃａＫ、ＷｃａＬ又はＷｃａＭを遮断することで、ＧＤＰ－フコースの供給を高めることができる。
　親株として用いる微生物は、その細胞膜を横断する外因性Ｌ－フコースの移入を促進するように改変されていてもよい。例えば、ＦｕｃＰをコードする塩基配列(アクセッション番号ＡＩＺ９０１６２)を発現又は過剰発現させることにより、細胞膜を横断する外因性Ｌ－フコースの細胞への取り込みを向上し、これによりＧＤＰ－フコースを生産するためのフコース量を高め得る。
　親株として用いる微生物は、それぞれＬ－フコースイソメラーゼ及びＬ－フクロースキナーゼをコードする遺伝子ｆｕｃＩ及び／又はｆｕｃＫが欠失していて、ｆｕｃＩ及び／又はｆｕｃＫのヌクレオチド配列が対応するポリペプチドの酵素活性を不可逆的に不活性化するように変更されているか、又はｆｕｃＩ及び／又はｆｕｃＫの発現が損なわれているように改変されていてもよい。ＦｕｃＩ及び／又はＦｕｃＫの細胞内合成を消失させると、該細胞におけるフコース代謝が消失し、これによりＧＤＰ－フコースを生産するためのフコースの量を高め得る。
２）α１，２－フコシルトランスフェラーゼの反応基質であるＬＮＴを供給する能力を人工的に付与又は増強された、親株として用いる微生物
　親株として用いる微生物に、ＬＮＴを供給する能力を人工的に付与する方法としては、例えば、下記（２ａ）～（２ｈ）などの方法を挙げることができ、これらの方法は単独又は組み合わせて用いることができる。
（２ａ）糖からＬＮＴを生成する生合成経路を制御する機構の少なくとも１つを緩和又は解除する方法
（２ｂ）糖からＬＮＴを生成する生合成経路に関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法
（２ｃ）糖からＬＮＴを生成する生合成経路に関与する酵素遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法
（２ｄ）ＬＮＴ又はその基質となる糖を分解する機構の少なくとも１つを緩和又は解除する方法
（２ｅ）ＬＮＴ又はその基質となる糖の細胞内取り込みに関与する酵素の少なくとも１つについて発現を増強する方法
（２ｆ）ＬＮＴ又はその基質となる糖の細胞内取り込みに関与する酵素をコードする遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法
（２ｇ）糖からＬＮＴを生成する生合成経路から該目的物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化又は遮断する方法
（２ｈ）野生株に比べ、ＬＮＴのアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法
　糖からＬＮＴを生成する生合成経路に関与する酵素の具体例としては、例えば、グルコース及びラクトースからＬＮＴを生成する生合成経路に関与する、β１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ（以下、ｇａｌＴという）活性を有する酵素や、β１，３－Ｎ－アセチルグルコサミントランスフェラーゼ（以下、ｌｇｔＡという）活性を有する酵素等、公知の酵素が挙げられる。
　ＬＮＴ又はその基質となる糖を分解する機構の具体例としては、例えば、ＬＮＴの基質であるラクトースの加水分解を触媒しグルコース及びガラクトースを生成するβ－ガラクトシダーゼ等、公知の酵素が挙げられる。具体的には例えば、ＬＮＴの基質であるラクトースを加水分解するβ－ガラクトシダーゼ（以下、ｌａｃＺという）が挙げられ、ｌａｃＺの活性を喪失させることで、ラクトース供給の低下を抑制できる。
　ＬＮＴ又はその基質となる糖の細胞内取り込みに関与する酵素の具体例としては、例えば、ＬＮＴの基質であるラクトースの細胞内取り込みに関与するラクトースパーミアーゼ等、公知の酵素が挙げられる。
　上記、ＬＮＴを供給する能力を付与又は増強された微生物は、具体的には例えばＬＮＴを供給するために、ラクトースパーミアーゼ（以下、ｌａｃＹという）活性、β１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ（ｇａｌＴ）活性、β１，３－Ｎ－アセチルグルコサミントランスフェラーゼ（ｌｇｔＡ）活性、グルタミン・フルクトース－６－リン酸トランスアミナーゼ（以下、ｇｌｍＳという）活性、ホスホグルコサミンムターゼ（以下、ｇｌｍＭという）活性およびＮ－アセチルグルコサミン－１－リン酸ウリジルトランスフェラーゼ／グルコサミン－１－リン酸アセチルトランスフェラーゼ（以下、ｇｌｍＵという）活性、ホスホグルコムターゼ（以下、ｐｇｍという）活性、ＵＴＰグルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（以下、ｇａｌＵという）活性、ＵＤＰグルコース－４－エピメラーゼ（以下、ｇａｌＥという）活性、ＵＴＰグルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（以下、ｇａｌＦという）活性、グルコース－６－リン酸イソメラーゼ（以下、ｐｇｉという）活性から選ばれる少なくとも１の活性を有していることが好ましく、その活性が強化されていることがより好ましい。
　このうち、ｌａｃＹ、ｇａｌＴおよびｌｇｔＡの活性を有していることが好ましく、その活性が強化されていることがさらに好ましい。
　ｌａｃＹは、ＬＮＴの基質であるラクトースを細胞内に取り込む膜タンパク質である。ｇａｌＴは、ラクト－Ｎ－トリオースＩＩ（ＬＮＴＩＩ）からのＬＮＴの生成に関与する酵素である。ＬＮＴはＬＮＦＰＩの前駆体である。ＬｇｔＡは、ラクトースおよびウリジン二リン酸－Ｎ－アセチルグルコサミン（以下、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃという）からのＬＮＴＩＩの生成に関与する酵素である。ＬＮＴＩＩはＬＮＴの前駆体である。
　ｇｌｍＳ、ｇｌｍＭおよびｇｌｍＵは、ＬＮＴＩＩを生成する生合成経路に関与する酵素である。Ｐｇｍ、ｇａｌＵ、ｇａｌＥ、ｇａｌＦは、ウリジン二リン酸ガラクトース（以下、ＵＤＰ－Ｇａｌという）を生成する経路に関与する酵素である。Ｐｇｉは、ＬＮＴＩＩを生成する経路に関与する酵素である。
　微生物がＧＤＰ－フコース及び／又はＬＮＴを生成し得る微生物であることは、該微生物を培地に培養し、培養物中に蓄積したＧＤＰ－フコース及び／又はＬＮＴを、後述の糖分析装置または高速液体クロマトグラフ質量分析計等の一般的な手法を用いて検出することにより確認できる。
　本発明の親株として用いる微生物は、α１，２－フコシルトランスフェラーゼの反応基質であるＧＤＰ－フコース及び／又はＬＮＴを供給する能力が人工的に付与又は増強された微生物であることが好ましい。従って、本発明における１実施形態では、好ましくはｒｃｓＡをコードする塩基配列（アクセッション番号ＢＡＡ１５７７６．１）、マンノース－６－リン酸イソメラーゼをコードする塩基配列（アクセッション番号ＢＡＡ１５３６１．１）、ホスホマンノムターゼをコードする塩基配列（アクセッション番号ＢＡＡ１５９０１．１）、マンノース－１－リン酸グアニリルトランスフェラーゼをコードする塩基配列（アクセッション番号ＢＡＡ１５９０５．１）、ＧＤＰマンノース－４，６－デヒドラターゼをコードする塩基配列（アクセッション番号ＢＡＡ１５９０９．１）、ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼをコードする塩基配列（アクセッション番号ＢＡＡ１５９０８．１）、ｌａｃＹをコードする塩基配列（アクセッション番号ＢＡＥ７６１２５．１）、ｇａｌＴをコードする塩基配列（配列番号２９）、ｌｇｔＡをコードする塩基配列（配列番号３１）、ｇｌｍＳをコードする塩基配列（アクセッション番号ＢＡＥ７７５５９．１）、ｇｌｍＭをコードする塩基配列（アクセッション番号ＢＡＥ７７２２０．１）、ｇｌｍＵをコードする塩基配列（アクセッション番号ＢＡＥ７７５５８．１）、Ｐｇｍをコードする塩基配列（アクセッション番号ＢＡＡ３５３３７．１）、ｇａｌＵをコードする塩基配列（アクセッション番号ＢＡＡ３６１０４．１）、ｇａｌＥをコードする塩基配列（アクセッション番号ＢＡＡ３５４２１．１）、ｇａｌＦをコードする塩基配列（アクセッション番号ＢＡＡ１５８９６．１）、およびｐｇｉをコードする塩基配列（アクセッション番号ＢＡＥ７８０２７．１）から選ばれる少なくとも１の塩基配列を含む、遺伝的に改変された微生物を親株とすることが好ましい。
　特に、好ましくはｌａｃＹをコードする塩基配列、ｒｃｓＡをコードする塩基配列、ｇａｌＴをコードする塩基配列およびｌｇｔＡをコードする塩基配列を含む、遺伝的に改変された微生物を親株とすることがより好ましい。本発明の１実施形態において、前記遺伝的に改変された微生物は、ＧＤＰ－フコース及び／又はＬＮＴの産生能が、遺伝的に改変されていない親株に比較して上昇していることが好ましい。
　ｌａｃＹ活性、ｒｃｓＡ活性、ｇａｌＴ活性、ｌｇｔＡ活性、ｇｌｍＳ活性、ｇｌｍＭ活性およびｇｌｍＵ活性、ｐｇｍ活性、ｇａｌＵ活性、ｇａｌＥ活性、ｇａｌＦ活性、ｐｇｉ活性から選ばれる少なくとも１の活性を有している、またはその活性が強化されている微生物を製造する方法としては公知の方法を用いればよい。具体的には例えば、各種遺伝子操作による方法（Ｓｙｓｔ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｂｉｏｍａｎｕｆａｃｔ，２０２１，１，２９１）等が挙げられる。
　また、親株ではさらに、前述のようにｌａｃＺ活性および／またはコラン酸合成活性が低下又は欠失していることが好ましい。
　従って、本発明の一実施態様では、好ましくはｌａｃＺ活性および／またはコラン酸合成活性が低下または欠失しており、より好ましくはｌａｃＺをコードする塩基配列および／またはコラン酸生成関連蛋白質をコードする塩基配列であるｗｃａＪ、ｗｚｘＣ、ｗｃａＫ、ｗｃａＬ又はｗｃａＭ遺伝子をコードする塩基配列を含まない、遺伝的に改変された微生物を親株とすることが好ましい。
　本発明の一実施形態において、前記遺伝的に改変された微生物は、ＧＤＰ－フコース及び／又はＬＮＴの産生能が、遺伝的に改変されていない親株に比較して上昇していることが好ましい。
　β－ガラクトシダーゼ活性および／またはコラン酸合成活性が低下または喪失した大腸菌を製造する方法としては公知の方法を用いればよい。具体的には例えば、各種遺伝子操作による方法（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０１７，４１：２３－３８）等が挙げられる。
　親株の微生物に比べ前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質の活性が増強された微生物としては、該蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより得られる、親株よりも該遺伝子のコピー数が増大した微生物が挙げられる。
　前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより得られる、親株よりも該遺伝子のコピー数が増大した微生物としては、前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより、染色体ＤＮＡ上において前記遺伝子のコピー数が増大した微生物、およびプラスミドＤＮＡとして染色体ＤＮＡ外に前記遺伝子を保有させた微生物を挙げることができる。
　前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡとしては、前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであればいずれでもよいが、具体的には以下の［４］～［７］からなる群より選ばれる１のＤＮＡが挙げられる。
［４］前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［５］配列番号１、３、５、７、９、１３、１７又は２５で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［６］配列番号１、３、５、７、９、１３、１７又は２５で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
［７］配列番号１、３、５、７、９、１３、１７又は２５で表される塩基配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、α１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
　上記［６］において「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズすることである。したがって、該特定の塩基配列を有するＤＮＡまたはその一部は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして用いることができ、またＰＣＲ解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できるＤＮＡである。
　プローブとして用いられるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡを挙げることができる。プライマーとして用いられるＤＮＡとしては、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡを上げることができる。
　ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えば当業者であれば本明細書に従い、ハイブリダイゼーションの条件を決定できる。該ハイブリダイゼーションの条件は、モレキュラー・クローニング第４版（２０１２年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｇｅｎｅｒａｌ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，　ＡＳＭ　Ｐｒｅｓｓ（１９９４）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｍａｎｕａｌ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　ｐｒｅｓｓ（１９９６）に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従っておこなうことができる。
　また、市販のハイブリダイゼーションキットに付属した説明書に従うことによっても、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを取得できる。市販のハイブリダイゼーションキットとしては、例えばランダムプライム法によりプローブを作製し、ストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションを行うランダムプライムドＤＮＡラベリングキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）などを挙げることができる。
　上記のストリンジェントな条件とは、ＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、７５ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸ナトリウム）、５０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン、および２０μｇ／Ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃にて一晩、インキュベートした後、例えば約６５℃の０．２×ＳＳＣ溶液中で該フィルターを洗浄する条件を挙げることができる。
　上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えばＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等を用いて上記したパラメータ等に基づいて計算したときに、配列番号１、３、５、７、９、１３、１７又は２５で表される塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するＤＮＡを挙げることができる。
　上記［１］の蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号１、３、５、７、９、１３、１７又は２５で表される塩基配列に基づき設計できるプローブＤＮＡを用いた、微生物、好ましくは、微生物の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法、または該塩基配列に基づき設計できるプライマーＤＮＡを用いた、上記微生物の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ［ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　（１９９０）］により取得できる。前記操作に用いる微生物の染色体ＤＮＡの由来は特に限定されないが、例えばＮｅｉｓｓｅｒｉａ属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌｅｓ）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｍｐｈｒｉｔｅａ属、Ｓｔｅｒｏｌｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ属またはＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ属の細菌が挙げられる。これらの中でも、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ　ｓｐ．　ＦＳＣ１００６株、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ＤＳＭ　１００９７０株、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｔｕｎｄｒｉｐａｌｕｄｕｍ株、Ａｍｐｈｒｉｔｅａ　ｊａｐｏｎｉｃａ株、Ｓｔｅｒｏｌｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｊ５Ｂ株、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌｅｓ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ株またはＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｍｕｓｔｅｌａｅ　ＡＴＣＣ４３７７２株が好ましい。
　これらの株は、公的機関等から入手が可能であり、例えば、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ　ｓｐ．　ＦＳＣ１００６株は、スウェーデン国防省研究機関（Ｓｗｅｄｉｓｈ　Ｄｅｆｅｎｃｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ａｇｅｎｃｙ）から入手できる。また、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ＤＳＭ　１００９７０株は、マラヤ大学　（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｍａｌａｙａ）から入手できる。さらに、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｔｕｎｄｒｉｐａｌｕｄｕｍ株、Ａｍｐｈｒｉｔｅａ　ｊａｐｏｎｉｃａ株及びＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｍｕｓｔｅｌａｅ　ＡＴＣＣ４３７７２株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ）から入手できる。
　上記［２］の変異蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号１、３、５、７、９、１３、１７又は２５で表される塩基配列からなるＤＮＡを鋳型としてエラープローンＰＣＲ等に供することにより取得できる。
　または、目的の変異（欠失、置換、挿入または付加）が導入されるように設計した塩基配列をそれぞれの５’端に持つ１組のＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲ［Ｇｅｎｅ，　７７，　５１（１９８９）］によっても、上記［２］のの変異蛋白質をコードするＤＮＡを取得できる。
　また、市販の部分特異的変異導入キットに付属した説明書に従うことによっても、該ＤＮＡを取得できる。市販の部分特異的変異導入キットとしては、例えば、目的の変異を導入したい位置に変異（欠失、置換、挿入又は付加）を導入できるＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｂａｓａｌ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）が挙げられる。
　すなわち、まず、目的の変異（欠失、置換、挿入又は付加）が導入されるように設計した塩基配列を有するプラスミドを鋳型に、５’側が１５塩基オーバーラップした一対の変異導入用プライマーを設計する。このとき、オーバーラップ部分には目的の変異を含む。次に、該変異導入用プライマーを用いて、目的の変異を導入したい塩基配列を有するプラスミドを鋳型にＰＣＲを行う。これにより得られた増幅断片を大腸菌に形質転換すると、目的の変異が導入された塩基配列を有するプラスミドが得られる。
　上記［３］の相同蛋白質をコードするＤＮＡ、並びに上記［６］および［７］のＤＮＡは、例えば、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号１、３、５、７、９、１３、１７又は２５で表される塩基配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列を検索し、または、各種の蛋白質配列データベースに対して配列番号２、４、６、８、１０、１４、１８又は２６で表されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列またはアミノ酸配列に基づいて設計できるプローブＤＮＡまたはプライマーＤＮＡ、および当該ＤＮＡを有する微生物を用いて、上記のＤＮＡを取得する方法と同様の方法によって取得できる。
　取得した上記の［４］～［７］のいずれか１に記載のＤＮＡは、そのまま、または適当な制限酵素などで切断し、常法によりベクターに組み込み、得られた組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入した後、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　ＵＳＡ，　７４，　５４６３　（１９７７）］またはアプライド・バイオシステムズ３５００ジェネティックアナライザやアプライド・バイオシステムズ３７３０ＤＮＡアナライザ（いずれもサーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定できる。
　前記ＤＮＡの塩基配列を決定する際に用いることができる宿主細胞としては、前記ベクターを導入し増殖可能なものであれば何でもよいが、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ５α、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＳＴ０８Ｐｒｅｍｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＳＴ０２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＳＴ０４　ｄａｍ－／ｄｃｍ－、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉＣＪ２３６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＭＨ７１－１８　ｍｕｔＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＶ１１８４、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＴＨ２（いずれもタカラバイオ社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ２－Ｂｌｕｅ（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＰ３４７、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２等が挙げられる。
　上記のベクターとしては、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＫＳ（＋）、ｐＰＣＲ－Ｓｃｒｉｐｔ　Ａｍｐ　ＳＫ（＋）（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（メルクミリポア社製）、ｐＣＲＩＩ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）、ｐＣＲ－ＴＲＡＰ（ジーンハンター社製）、及びｐＤＩＲＥＣＴ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１８，６０６９，１９９０）等が挙げられる。
　組換え体ＤＮＡの導入方法としては、宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，　６９，　２１１０　（１９７２）］、プロトプラスト法（日本国特開昭６３－２４８３９４号公報）、エレクトロポレーション法［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　１６，　６１２７　（１９８８）］等が挙げられる。
　塩基配列を決定した結果、取得されたＤＮＡが部分長であった場合は、該部分長ＤＮＡをプローブに用いた、染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長ＤＮＡを取得できる。
　更に、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、日本テクノサービス社製ＮＴＳ　ＭシリーズＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することにより目的とするＤＮＡを調製することもできる。
　前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡとは、該ＤＮＡが、親株において自律複製可能または染色体中への組込が可能で、該ＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有している発現ベクターに組み込まれている組換え体ＤＮＡをいう。
　組換え体ＤＮＡが、染色体への組込が可能な組換え体ＤＮＡである場合は、プロモーターを含有していなくてもよい。
　前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより得られる、親株よりも該遺伝子のコピー数が増大した微生物は、以下の方法で取得できる。
　上記の方法で得られる前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡをもとにして、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主細胞での発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、生産率が向上した形質転換体を取得できる。
　前記ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体ＤＮＡを作製する。該組換え体ＤＮＡで親株を形質転換することにより、親株よりも該蛋白質をコードする遺伝子のコピー数が増大した微生物を取得できる。
　細菌等の原核生物を親株として用いる場合は、該組換え体ＤＮＡは、プロモーター、リボソーム結合配列、上記の［４］～［７］のいずれか１に記載のＤＮＡ、および転写終結配列により構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
　リボソーム結合配列であるシャイン－ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６～１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。該組換え体ＤＮＡにおいては、該ＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
　また、α１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードする部分の塩基配列を宿主の発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することにより、α１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質の発現量を向上させることができる。α１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質としては、例えば前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質が挙げられる。本発明に用いられる親株におけるコドン使用頻度の情報は、公共のデータベースを通じて入手できる。
　発現ベクターとしては、目的ＤＮＡを宿主に導入し、増殖、発現させるための適当な核酸分子であれば特に限定されず、プラスミドのみならず、例えば、人工染色体、トランスポゾンを用いたベクター、コスミドを用いてもよい。
　親株にエシェリヒア属に属する微生物を用いる場合は、発現ベクターとしては、例えば、ｐＣｏｌｄＩ、ｐＳＴＶ２８、ｐＳＴＶ２９、ｐＵＣ１１８（いずれもタカラバイオ社製）、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ１１９（いずれもニッポンジーン社製）、ｐＥＴ２１ａ、ｐＣＯＬＡＤｕｅｔ－１、ｐＣＤＦＤｕｅｔ－１、ｐＣＤＦ－１ｂ、ｐＲＳＦ－１ｂ（いずれもメルクミリポア社製）、ｐＭＡＬ－ｃ５ｘ（ニューイングランドバイオラブス社製）、ｐＧＥＸ－４Ｔ－１、ｐＴｒｃ９９Ａ（いずれもジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製）、ｐＴｒｃＨｉｓ、ｐＳＥ２８０（いずれもサーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）、ｐＧＥＭＥＸ－１（プロメガ社製）、ｐＱＥ－３０、ｐＱＥ８０Ｌ（いずれもキアゲン社製）、ｐＥＴ－３、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＫＳ（－）（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、ｐＵＡＫＱＥ３１（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００７，７３：６３７８－６３８５）、ｐＫＹＰ１０（日本国特開昭５８－１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　４８，　６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　５３，　２７７　（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　ＵＳＡ，　８２，　４３０６　（１９８５）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＫＳ（－）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒＳ３０［エシェリヒア・コリ　ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５４０７）より調製］、ｐＴｒＳ３２［エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５４０８）より調製］、ｐＴＫ３１［ＡＰＰＬＩＥＤ　ＡＮＤ　ＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ　ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ、　２００７、　Ｖｏｌ．　７３、Ｎｏ．　２０、ｐ．６３７８－６３８５］、ｐＰＡＣ３１（国際公開第１９９８／１２３４３号）、ｐＵＣ１９［Ｇｅｎｅ，　３３，　１０３　（１９８５）］、ｐＰＡ１（日本国特開昭６３－２３３７９８号公報）ｐＫＤ４６［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９７，６６４０－６６４５（２０００）］等を挙げることができる。
　上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、エシェリヒア属に属する微生物の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、ｔｒｐプロモーターやｉｌｖプロモーター等のアミノ酸生合成に関与する遺伝子のプロモーター、ｕｓｐＡプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉやファージ等に由来するプロモーターを用いることができる。また、例えば、ｔｒｐプロモーターを２つ直列させたプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーターが挙げられる。
　親株にコリネバクテリウム属に属する微生物を用いる場合は、発現ベクターとしては、例えば、ｐＣＧ１（日本国特開昭５７－１３４５００号公報）、ｐＣＧ２（日本国特開昭５８－３５１９７号公報）、ｐＣＧ４（日本国特開昭５７－１８３７９９号公報）、ｐＣＧ１１（日本国特開昭５７－１３４５００号公報）、ｐＣＧ１１６、ｐＣＥ５４、ｐＣＢ１０１（いずれも日本国特開昭５８－１０５９９９号公報）、ｐＣＥ５１、ｐＣＥ５２、ｐＣＥ５３〔いずれもＭｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，　１９６，　１７５　（１９８４）〕等を挙げることがきる。
　上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、コリネバクテリウム属に属する微生物の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、Ｐ５４－６プロモーター［Ａｐｐｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，　５３，　６７４－６７９　（２０００）］を用いることができる。
　親株に酵母菌株を用いる場合には、発現ベクターとしては、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を挙げることができる。
　上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、酵母菌株の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等のプロモーターを挙げることができる。
　上記の［４］～［７］のいずれか１に記載のＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、本発明の製造方法に用いられる組換え体ＤＮＡを作製できる。
　組換え体ＤＮＡを親株において自律複製可能なプラスミドとして導入させる方法としては、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　ＵＳＡ，　６９，　２１１０　（１９７２）］、プロトプラスト法（日本国特開昭６３－２４８３９４号公報）およびエレクトロポレーション法［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　１６，　６１２７　（１９８８）］等の方法が挙げられる。
　組換え体ＤＮＡを宿主細胞の染色体中に組み込む方法としては、例えば、相同組換え法が挙げられる。相同組換え法としては、例えば、導入したい宿主細胞内では自律複製できない薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドＤＮＡと連結して作製できる相同組換え用プラスミドを用いる方法が挙げられる。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉで頻用される相同組換えを利用した方法としては、例えば、ラムダファージの相同組換え系を利用して、組換え体ＤＮＡを導入する方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，６６４０－６６４５（２０００）］が挙げられる。
　さらに、組換え体ＤＮＡと共に染色体上に組み込まれた枯草菌レバンシュークラーゼによって大腸菌がスクロース感受性となることを利用した選択法や、ストレプトマイシン耐性の変異ｒｐｓＬ遺伝子を有する大腸菌に野生型ｒｐｓＬ遺伝子を組み込むことによって大腸菌がストレプトマイシン感受性となることを利用した選択法［Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５５，１３７（２００５）、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７１，２９０５（２００７）］等を用いて、宿主細胞の染色体ＤＮＡ上の目的の領域が組換え体ＤＮＡに置換された大腸菌を取得できる。
　該組換え体ＤＮＡが、親株において自律複製可能なプラスミドとして導入されたこと、または親株の染色体中に組み込まれたことは、例えば、微生物が元来、染色体ＤＮＡ上に有する該遺伝子を増幅することはできないが、形質転換により導入された該遺伝子は増幅可能なプライマーセットを用いてＰＣＲにより増幅産物を確認する方法等により確認できる。また、該ＤＮＡの転写量若しくは該ＤＮＡがコードする蛋白質の生産量が増大したことは、該微生物の該遺伝子の転写量をノーザン・ブロッティングにより、または該微生物の該蛋白質の生産量をウェスタン・ブロッティングにより、親株のそれと比較する方法等により確認できる。
　上記の方法で造成した微生物が、上記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質の活性が増強され、かつ親株に比べてＬＮＦＰＩの生産性が向上した微生物であることは、該微生物の培養後、培養液を適宜希釈後に遠心分離し、上清又は菌体内に含まれるＬＮＦＰＩを後述の糖分析装置または高速液体クロマトグラフ質量分析計にて分析することにより、親株のそれと比較することにより確認できる。
　上記した微生物は、親株よりも上記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質の活性が増強していることにより、ＬＮＴのＮ－アセチルグルコサミン部位へ選択的にフコースを転移し、ＬＮＦＰＩの生産性を向上し得る。このような微生物としては、例えば、実施例において後述するＧｓＦｕｃＴ遺伝子の発現を強化したＮＮＮ／ｐＧｓＦｕｃＴ株、ＦｓＦｕｃＴ遺伝子の発現を強化したＮＮＮ／ｐＦｓＦｕｃＴ株、ＮｂＦｕｃＴ１遺伝子の発現を強化したＮＮＮ／ｐＮｂＦｕｃＴ１株、ＭｔＦｕｃＴ遺伝子の発現を強化したＮＮＮ／ｐＭｔＦｕｃＴ株、ＡｊＦｕｃＴ遺伝子の発現を強化したＮＮＮ／ｐＡｊＦｕｃＴ株、ＳｂＦｕｃＴ遺伝子の発現を強化したＮＮＮ／ｐＳｂＦｕｃＴ株、ＰｓＦｕｃＴ遺伝子の発現を強化したＮＮＮ／ｐＰｓＦｕｃＴ株、ＮｂＦｕｃＴ２遺伝子の発現を強化したＮＮＮ／ｐＮｂＦｕｃＴ２株、ＨＭＦＴ遺伝子の発現を強化したＮＮＮ／ｐＨＭＦＴ株が挙げられる。
　このような微生物の例である、ＧｓＦｕｃＴ、ＦｓＦｕｃＴ、ＮｂＦｕｃＴ１、ＭｔＦｕｃＴ、ＡｊＦｕｃＴ、ＳｂＦｕｃＴ、ＮｂＦｕｃＴ２、またはＨＭＦＴの発現を増強した微生物では、Ｎ－アセチルグルコサミン部位へ選択的にフコースを転移できるα１，２－フコーストランスフェラーゼ活性が増強され、ＬＮＦＰＩの生産性を向上し得る。よってこれらの微生物を用いることで効率的にＬＮＦＰＩを製造することができる。また、これらの微生物を用いてＬＮＦＰＩ以外のフコシル化オリゴ糖、例えば２’ＦＬや３’ＦＬ等のフコシルラクトースを製造することもできる。
＜フコース含有糖質の製造方法＞
　本発明のフコース含有糖質の製造方法（以下、本発明の方法とも略す）としては、上記した形質転換体を調製すること、および該形質転換体を用いて培養物中にオリゴ糖を生成することを含む、フコース含有糖質の製造方法が挙げられる。本発明の方法において、フコース含有糖質は、ＬＮＦＰＩであることが好ましい。
　上記した形質転換体を培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。形質転換体を培養する培地としては、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地と合成培地のいずれを用いてもよい。
　炭素源としては、微生物が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプン若しくはデンプン加水分解物等の糖、酢酸若しくはプロピオン酸等の有機酸、又は、グリセロール、エタノール若しくはプロパノール等のアルコール類等が挙げられる。
　窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム又はリン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕、大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物等が挙げられる。
　無機塩としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。
　フコース含有糖質の製造方法に用いる形質転換体として、グルコース、ラクトース、またはラクトース一水和物等を生成する能力を有する微生物を用いてもよい。
　フコース含有糖質の製造方法において、培養中に、グルコース、ラクトースまたはラクトース一水和物等を培地に添加してもよい。
　フコース含有糖質の製造方法に用いる形質転換体が、ＧＤＰ－フコース及び／又はＬＮＴを生成する能力を有していない場合は、ＧＤＰ－フコースやＬＮＴを培地に添加してもよい。
　また、フコース含有糖質の製造方法において、培養中に、グルコース、ラクトース、ラクトース一水和物、またはＬＮＴ等を培地に添加する代わりに、糖からグルコース、ラクトース、ラクトース一水和物、またはＬＮＴ等を生成する能力を有する微生物を、本発明の形質転換体と同時に培養することにより、本発明の形質転換体にグルコース、ラクトース、またはラクトース一水和物、またはＬＮＴ等を供給してもよい。
　フコース含有糖質の製造方法において、培地中にはβ－ガラクトシダーゼおよびＷｃａＪが存在しないことが好ましい。
　培養は、通常、振盪培養、深部通気撹拌培養またはジャーファーメンター等の好気的条件下で行うことが好ましい。培養温度は、通常３０～３７℃であり、培養時間は、通常２４時間～３日間である。培養中の培養液ｐＨは、通常６．０～８．０に保持する。ｐＨの調整は、無機又は有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
　上記の培養により、培養物中にフコース含有糖質を生成することにより、フコース含有糖質を製造できる。
　通常、該培養物の遠心分離後、上清よりフコース含有糖質を採取できる。なお、菌体内にフコース含有糖質が蓄積する場合には、例えば菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清からイオン交換樹脂法などによって、フコース含有糖質を採取できる。
　また、培養物中のフコース含有糖質又は採取したフコース含有糖質に、さらに他の糖を付加することにより所望のフコース含有糖質を製造することもできる。
［分析例］
（１）ＬＮＦＰＩ、２’ＦＬ又はラクトースの分析、定量
　実施例において、ＬＮＦＰＩ、２’ＦＬ又はラクトースの分析、定量は以下に示す手順で行った。
　培養後の微生物を含む培養液を遠心分離し、上清を回収した。また、沈殿菌体を元培養液と同量の水で懸濁し、さらに等量のクロロホルムを加えて菌体破砕した後に遠心分離し、得られた上清水相を菌体内画分とした。該上清又は菌体内画分に含まれるＬＮＦＰＩ、２’ＦＬ及びラクトースを糖分析装置ＩＣＳ－５０００（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）にて分析した。
［分析条件］
カラム：ＣａｒｂｏＰＡＣ　ＰＡ１
カラム温度：２５℃
移動相：
　　　（移動相Ａ）水
　　　（移動相Ｂ）５００ｍｍｏｌ／Ｌ　水酸化ナトリウム
　　　（移動相Ｃ）３００ｍｍｏｌ／Ｌ　酢酸ナトリウム
移動相Ａ、移動相Ｂ及び移動相Ｃ混合比：
　　　（０～１０分）８０：２０：０
　　　（１０～１８分）８０：２０：０から７０：２０：１０の勾配
　　　（１８～３５分）７０：２０：１０から０：２０：８０の勾配
　　　（３５～４０分）０：２０：８０
　　　（４０～５０分）８０：２０：０
流速：１．０ｍＬ／ｍＩｎ
検出器：パルスドアンペロメトリー検出器
（２）ＬＮＦＰＩ、ＬＮＴＩＩ又はＬＮＴの分析、定量
　施例において、ＬＮＦＰＩ、ＬＮＴＩＩ又はＬＮＴの分析、定量は以下に示す手順で行った。
　上記（１）と同様に、培養後の微生物を含む培養液から上清及び菌体内画分を調製した。該上清又は菌体内画分に含まれるＬＮＦＰＩ、ＬＮＴＩＩ及びＬＮＴをＵＦＬＣ＆ＬＣＭＳ－８０４０（ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）にて分析した。
［分析条件］
カラム：Ｃｏｒｅｇｅｌ　８７Ｈ３（７．８×３００ｍｍ）
カラム温度：４０℃
移動相：０．１％ギ酸水、イソクラティック溶離
測定時間：２５分
流速：０．４ｍＬ／ｍＩｎ
注入量：１０μＬ
検出：ＳＩＭモード
　以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
［実施例１］各種α１，２－フコシルトランスフェラーゼを発現する微生物の造成
（１）宿主株の造成
＜遺伝子欠損の際にマーカーとして用いるＤＮＡ断片の取得＞
　配列番号３７及び３８で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、ｐＣａｔＳａｃ（Ａｐｐｌ　Ｅｎｖｉｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（２０１３）７９，３０３３－３０３９）を鋳型としてＰＣＲを行い、クロラムフェニコール耐性ｃａｔ遺伝子およびスクロース感受性ｓａｃＢ遺伝子を含む、ｃａｔ－ｓａｃＢ断片を得た。
＜β－ガラクトシダーゼ活性、ラクトースパーミアーゼ活性、及びコラン酸合成活性が喪失した大腸菌の造成＞
　β－ガラクトシダーゼをコードするＤＮＡ（以下、ｌａｃＺ遺伝子という。）、ラクトースパーミアーゼをコードするＤＮＡ（以下、ｌａｃＹ遺伝子という。）、及びコラン酸生成関連蛋白質をコードするＤＮＡ（以下、ｗｃａＪ、ｗｚｘＣ、ｗｃａＫ、ｗｃａＬ又はｗｃａＭ遺伝子という。）を欠損した大腸菌を、以下の方法で造成した。なお、ｌａｃＺ及びｌａｃＹ（以下、ｌａｃＺＹという。）、ならびに、ｗｃａＪ、ｗｚｘＣ、ｗｃａＫ、ｗｃａＬ及びｗｃａＭ（以下、ｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭという。）は大腸菌ゲノム上でそれぞれオペロンを形成している。
　常法により調製したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０株のゲノムＤＮＡを鋳型として、表１の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、各ＤＮＡ断片を増幅した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　ｌａｃＺ上流１およびｌａｃＺ上流２は、ｌａｃＺ遺伝子の開始コドンから開始コドンの上流約１０００ｂｐまでの領域を含む。ｌａｃＹ下流１およびｌａｃＹ下流２は、ｌａｃＹ遺伝子の終止コドン下流約５０ｂｐから約１０００ｂｐまでの領域を含む。
　ｌａｃＺ上流１、ｌａｃＹ下流１、およびｃａｔ－ｓａｃＢ断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号４０及び４２で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｌａｃＺ及びｌａｃＹ遺伝子周辺領域の配列にｃａｔ－ｓａｃＢ断片が挿入された配列からなるＤＮＡ（以下、ｌａｃＺＹ：：ｃａｔ－ｓａｃＢという。）断片を得た。
　ｌａｃＺ上流２およびｌａｃＹ下流２を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号４０及び４２で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｌａｃＺＹを含まず、ｌａｃＺ上流とｌａｃＹ下流が直接連結した配列からなるＤＮＡ（以下、ΔｌａｃＺＹという。）断片を得た。
　ｌａｃＺＹ：：ｃａｔ－ｓａｃＢ断片を、λリコンビナーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドｐＫＤ４６［Ｄａｔｓｅｎｋｏ，Ｋ．Ａ．，Ｗａｒｎｅｒ，Ｂ．Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９７，６６４０－６６４５（２０００）］を保持するＷ３１１０Ｓ３ＧＫ株（ＮＢＲＣ１１４６５７）に、エレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール耐性かつシュクロース感受性を示した形質転換体（ｌａｃＺＹ遺伝子がｌａｃＺＹ：：ｃａｔ－ｓａｃＢに置換した形質転換体）を得た。
　ΔｌａｃＺＹ断片を、当該形質転換体にエレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール感受性かつシュクロース耐性を示す形質転換体（ｌａｃＺＹ：：ｃａｔ－ｓａｃＢがΔｌａｃＺＹに置換した形質転換体）を得た。それらのうちからさらに、アンピシリン感受性を示す形質転換体（ｐＫＤ４６が脱落した形質転換体）を得た。当該形質転換体をＷ３１１０Ｓ３ＧＫΔｌａｃＺＹと命名した。
　同様に、Ｗ３１１０株のゲノムＤＮＡを鋳型として、表２の「プライマーセット」で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、各増幅ＤＮＡ断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　ｗｃａＪ上流１およびｗｃａＪ上流２は、ｗｃａＪ遺伝子の開始コドンから開始コドン上流約１０００ｂｐまでの領域を含む。ｗｃａＭ下流１およびｗｃａＭ下流２は、ｗｃａＭ遺伝子の終止コドンから終止コドン下流約１０００ｂｐまでの領域を含む。
　ｗｃａＪ上流１、ｗｃａＭ下流１およびｃａｔ－ｓａｃＢ断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号４６及び４８で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭオペロン周辺領域の配列にｃａｔ－ｓａｃＢ断片が挿入された配列からなるＤＮＡ（以下、ｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭ：：ｃａｔ－ｓａｃＢという。）断片を得た。
　ｗｃａＪ上流２およびｗｃａＭ下流２を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号４６及び４８で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭを含まず、ｗｃａＪ上流とｗｃａＭ下流が直接連結した配列からなるＤＮＡ（以下、ΔｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭという。）断片を得た。
　ｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭ：：ｃａｔ－ｓａｃＢ断片を、上記で造成したＷ３１１０Ｓ３ＧＫΔｌａｃＺＹに、エレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール耐性、かつシュクロース感受性を示した形質転換体（ｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭがｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭ：：ｃａｔ－ｓａｃＢに置換した形質転換体）を得た。
　ΔｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭ断片を、当該形質転換体にエレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール感受性かつシュクロース耐性を示す形質転換体（ｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭ：：ｃａｔ－ｓａｃＢがΔｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭに置換した形質転換体）を得た。さらに、アンピシリン感受性を示す形質転換体（ｐＫＤ４６が脱落した形質転換体）を得た。当該形質転換体をＷ３１１０Ｓ３ＧＫΔｌａｃＺＹΔｗｃａＪＭと命名した。
＜β１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ及びβ１，３－Ｎ－アセチルグルコサミントランスフェラーゼの発現を強化した微生物の造成＞
　ｕｓｐＡプロモーター下に、配列番号３４で表されるアミノ酸配列からなるＣｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｖｉｏｌａｃｅｕｍ　ＡＴＣＣ５５３株由来のβ１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ（以下、Ｃｖβ３ＧａｌＴという。）をコードする遺伝子、配列番号３６で表されるＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｅａ　ＡＴＣＣ４３７６８由来のβ１，３－Ｎ－アセチルグルコサミントランスフェラーゼ（以下、ＮｐＬｇｔＡという。）をコードする遺伝子及びＷ３１１０株由来のｌａｃＹ遺伝子を配置した、該遺伝子発現用プラスミドを有する大腸菌を、以下の方法で造成した。
　表３の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、表３の「鋳型」に記載されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、各増幅ＤＮＡ断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　配列番号３３で表されるＤＮＡは、ＡＣＳ　Ｃａｔａｌ．２０１９，９（１２），１０７２１－１０７２６に記載された、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｖｉｏｌａｃｅｕｍ　ＡＴＣＣ５５３株由来β１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼＣｖβ３ＧａｌＴをコードする遺伝子の塩基配列を大腸菌で発現させるためにコドン最適化したＤＮＡであり、人工合成により調製した。
　配列番号３５で表されるＤＮＡは、配列番号３６で表されるＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｅａ　ＡＴＣＣ４３７６８株由来β１，３－Ｎ－アセチルグルコサミントランスフェラーゼＮｐＬｇｔＡをコードする遺伝子の塩基配列を、大腸菌で発現させるためにコドン最適化したＤＮＡであり、人工合成により調製した。配列番号５２及び５３、配列番号５４及び５５で表される塩基配列は、それぞれの５’末端に相補的な配列を含む。
　Ｃｖβ３ｇａｌＴ断片、ＮｐｌｇｔＡ断片およびｌａｃＹ断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号５１及び５６で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、３断片を連結したＤＮＡ（以下、Ｃｖβ３ｇａｌＴ－ＮｐｌｇｔＡ－ｌａｃＹという。）断片を得た。
　配列番号５７及び５８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして、プラスミドｐＵＡＫＱＥ３１（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００７，７３：６３７８－６３８５）を鋳型にＰＣＲを行い、約４．７ｋｂのベクター断片を得た。配列番号５１及び５７、配列番号５６及び５８で表される塩基配列は、それぞれの５’末端に相補的な配列を含む。
　上記で得られたＣｖβ３ｇａｌＴ－ＮｐｌｇｔＡ－ｌａｃＹ断片とベクター断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて連結することにより、発現プラスミドｐＵＡＫＱＥ－Ｃｖβ３ｇａｌＴ－ＮｐｌｇｔＡ－ｌａｃＹを得た。上記、発現プラスミドｐＵＡＫＱＥ－Ｃｖβ３ｇａｌＴ－ＮｐｌｇｔＡ－ｌａｃＹを用いて、上記で造成したＷ３１１０Ｓ３ＧＫΔｌａｃＺＹΔｗｃａＪＭ株を形質転換することで、ｐＵＡＫＱＥ－Ｃｖβ３ｇａｌＴ－ＮｐｌｇｔＡ－ｌａｃＹを有する大腸菌を造成し、ＮＮＮ株と命名した。
（２）α１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する微生物の造成
　上記（１）で造成したＮＮＮ株を用いて、ｌａｃプロモーター下に各種α１，２－フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、Ｗ３１１０株由来のｒｃｓＡを配置した、該遺伝子発現用プラスミドを有する大腸菌を、以下の方法で造成した。
＜発現ベクターの造成＞
　配列番号５９及び６０で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、常法により調製したＷ３１１０株を鋳型としてＰＣＲを行い、ｒｃｓＡ断片を得た。プラスミドｐＳＴＶ２９（タカラバイオ社製）を鋳型に、配列番号６１及び６２で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、約２.９ｋｂのベクター断片を得た。このとき、配列番号５９及び６１、配列番号６０及び６２で表される塩基配列は、それぞれの５’末端に相補的な配列を含む。
　上記で得られたｒｃｓＡ断片とベクター断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて連結することにより、発現ベクターｐＳＴＶ－ｒｃｓＡを得た。
＜α１，２－フコシルトランスフェラーゼ発現用プラスミドの造成＞
表４の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、表４の「鋳型」に記載されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、各増幅ＤＮＡ断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　配列番号１で表されるＤＮＡは、配列番号２で表されるＧｒａｍｅｌｌａ　ｓｐ．　ＭＡＲ＿２０１０＿１４７株由来α１，２－フコシルトランスフェラーゼＧｓＦｕｃＴをコードする遺伝子の塩基配列を、大腸菌で発現させるためにコドン最適化したＤＮＡであり、人工合成により調製した。
　配列番号３で表されるＤＮＡは、配列番号４で表されるＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ　ｓｐ．　ＦＳＣ１００６株由来α１，２－フコシルトランスフェラーゼＦｓＦｕｃＴをコードする遺伝子の塩基配列を、大腸菌で発現させるためにコドン最適化したＤＮＡであり、人工合成により調製した。
　配列番号５で表されるＤＮＡは、配列番号６で表されるＮｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ＤＳＭ　１００９７０株由来α１，２－フコシルトランスフェラーゼＮｂＦｕｃＴ１をコードする遺伝子の塩基配列を、大腸菌で発現させるためにコドン最適化したＤＮＡであり、人工合成により調製した。
　配列番号７で表されるＤＮＡは、配列番号８で表されるＭｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｔｕｎｄｒｉｐａｌｕｄｕｍ株由来α１，２－フコシルトランスフェラーゼＭｔＦｕｃＴをコードする遺伝子の塩基配列を、大腸菌で発現させるためにコドン最適化したＤＮＡであり、人工合成により調製した。
　配列番号９で表されるＤＮＡは、配列番号１０で表されるＡｍｐｈｒｉｔｅａ　ｊａｐｏｎｉｃａ株由来α１，２－フコシルトランスフェラーゼＡｊＦｕｃＴをコードする遺伝子の塩基配列を、大腸菌で発現させるためにコドン最適化したＤＮＡであり、人工合成により調製した。
　配列番号１１で表されるＤＮＡは、配列番号１２で表されるＰｓｅｕｄｏｈａｌｏｃｙｎｔｈｉｉｂａｃｔｅｒ　ａｅｓｔｕａｒｉｉｖｉｖｅｎｓ株由来α１，２－フコシルトランスフェラーゼＰａＦｕｃＴをコードする遺伝子の塩基配列を、大腸菌で発現させるためにコドン最適化したＤＮＡであり、人工合成により調製した。
　配列番号１３で表されるＤＮＡは、配列番号１４で表されるＳｔｅｒｏｌｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｊ５Ｂ株由来α１，２－フコシルトランスフェラーゼＳｂＦｕｃＴをコードする遺伝子の塩基配列を、大腸菌で発現させるためにコドン最適化したＤＮＡであり、人工合成により調製した。
　配列番号１５で表されるＤＮＡは、配列番号１６で表されるＰｅｄｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．ＣＦ０７４株由来α１，２－フコシルトランスフェラーゼＰｓＦｕｃＴをコードする遺伝子の塩基配列を、大腸菌で発現させるためにコドン最適化したＤＮＡであり、人工合成により調製した。
　配列番号１７で表されるＤＮＡは、配列番号１８で表されるＮｅｉｓｓｅｒｉａｌｅｓ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ株由来α１，２－フコシルトランスフェラーゼＮｂＦｕｃＴ２をコードする遺伝子の塩基配列を、大腸菌で発現させるためにコドン最適化したＤＮＡであり、人工合成により調製した。
　配列番号１９で表されるＤＮＡは、配列番号２０で表されるＣａｎｄｉｄａｔｕｓ　Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｆａｖａｒｅａ株由来α１，２－フコシルトランスフェラーゼＣＭｆＦｕｃＴをコードする遺伝子の塩基配列を、大腸菌で発現させるためにコドン最適化したＤＮＡであり、人工合成により調製した。
　配列番号２１で表されるＤＮＡは、配列番号２２で表されるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｏ８６株由来α１，２－フコシルトランスフェラーゼＷｂｗＫをコードする遺伝子の塩基配列を、大腸菌で発現させるためにコドン最適化したＤＮＡであり、人工合成により調製した。
　配列番号２３で表されるＤＮＡは、配列番号２４で表されるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｏ１２７株由来α１，２－フコシルトランスフェラーゼＷｂｉＱをコードする遺伝子の塩基配列を、大腸菌で発現させるためにコドン最適化したＤＮＡであり、人工合成により調製した。
　配列番号２５で表されるＤＮＡは、配列番号２６で表されるＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｍｕｓｔｅｌａｅ　ＡＴＣＣ４３７７２株由来α１，２－フコシルトランスフェラーゼＨＭＦＴをコードする遺伝子の塩基配列であり、人工合成により調製した。
　上記で造成した発現ベクターｐＳＴＶ２９－ｒｃｓＡを鋳型として、配列番号６１及び９５で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、約３.５ｋｂのベクター断片を得た。
　配列番号６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７及び６１、配列番号６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８及び９５で表される塩基配列は、それぞれの５’末端に相補的な配列を含む。
　得られた各増幅ＤＮＡ断片とベクター断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて連結することにより、各種α１，２－フコシルトランスフェラーゼを発現するプラスミド、ｐＧｓＦｕｃＴ、ｐＦｓＦｕｃＴ、ｐＮｂＦｕｃＴ１、ｐＭｔＦｕｃＴ、ｐＡｊＦｕｃＴ、ｐＰａＦｕｃＴ、ｐＳｂＦｕｃＴ、ｐＰｓＦｕｃＴ、ｐＮｂＦｕｃＴ２、ｐＣＭｆＦｕｃＴ、ｐＷｂｗＫ、ｐＷｂｉＱ及びｐＨＭＦＴを造成した。
＜α１，２－フコシルトランスフェラーゼ発現用プラスミドを有する大腸菌の造成＞
　上記で得られたα１，２－フコシルトランスフェラーゼ発現用プラスミド、および、ベクターコントロールとしてｐＳＴＶ２９－ｒｃｓＡを用い、上記（１）で造成したＮＮＮ株を形質転換することで、各種プラスミドを有する大腸菌を造成し、それぞれＮＮＮ／ｐＧｓＦｕｃＴ株、ＮＮＮ／ｐＦｓＦｕｃＴ株、ＮＮＮ／ｐＮｂＦｕｃＴ１株、ＮＮＮ／ｐＭｔＦｕｃＴ株、ＮＮＮ／ｐＡｊＦｕｃＴ株、ＮＮＮ／ｐＰａＦｕｃＴ株、ＮＮＮ／ｐＳｂＦｕｃＴ株、ＮＮＮ／ｐＰｓＦｕｃＴ株、ＮＮＮ／ｐＮｂＦｕｃＴ２株、ＮＮＮ／ｐＣＭｆＦｕｃＴ株、ＮＮＮ／ｐＷｂｗＫ株、ＮＮＮ／ｐＷｂｉＱ株、ＮＮＮ／ｐＨＭＦＴ株及びＮＮＮ／ｐＣｔｒｌ株と命名した。
［比較例］公知α１，２－フコシルトランスフェラーゼを発現する微生物の造成
　ＬＮＦＰＩ生産が可能であることが知られているα１，２－フコシルトランスフェラーゼを発現する微生物を、下記の方法により造成した。
　表５の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、表５の「鋳型」に記載されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、各増幅ＤＮＡ断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　配列番号２７で表されるＤＮＡは、配列番号２８で表されるＳｉｄｅｒｏｘｙｄａｎｓ　ｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ　ＥＳ－１１株由来α１，２－フコシルトランスフェラーゼＦｕｃＴ５４をコードする遺伝子の塩基配列を、大腸菌で発現させるためにコドン最適化したＤＮＡであり、人工合成により調製した。
　配列番号２９で表されるＤＮＡは、配列番号３０で表されるＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｌｏｎｇａｔｕｓ　ＢＰ－１株由来α１，２－フコシルトランスフェラーゼＴｅ２ＦＴをコードする遺伝子の塩基配列を、大腸菌で発現させるためにコドン最適化したＤＮＡであり、人工合成により調製した。
　配列番号３１で表されるＤＮＡは、配列番号３２で表されるＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ　２６６９５株由来α１，２－フコシルトランスフェラーゼＦｕｔＣをコードする遺伝子の塩基配列であり、人工合成により調製した。
　実施例１（２）で造成した発現ベクターｐＳＴＶ－ｒｃｓＡを鋳型として、配列番号６１及び９５で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、約３.５ｋｂのベクター断片を得た。配列番号８９、９１、９３及び６１、配列番号９０、９２、９４及び９５で表される塩基配列は、それぞれの５’末端に相補的な配列を含む。
　上記で得られた各増幅ＤＮＡ断片とベクター断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて連結することにより、各種公知のα１，２－フコシルトランスフェラーゼを発現するプラスミド、ｐＦｕｃＴ５４、ｐＴｅ２ＦＴ及びｐＦｕｔＣを造成した。
　上記で得られたα１，２－フコシルトランスフェラーゼ発現用プラスミドを用い、実施例１（１）で造成したＮＮＮ株を形質転換することで、各種プラスミドを有する大腸菌を造成し、それぞれＮＮＮ／ｐＦｕｃＴ５４株、ＮＮＮ／ｐＴｅ２ＦＴ株及びＮＮＮ／ｐＦｕｔＣ株と命名した。
［実施例２］ＬＮＦＰＩの生産性評価
　上記実施例１（２）で得たＮＮＮ／ｐＧｓＦｕｃＴ株、ＮＮＮ／ｐＦｓＦｕｃＴ株、ＮＮＮ／ｐＮｂＦｕｃＴ１株、ＮＮＮ／ｐＭｔＦｕｃＴ株、ＮＮＮ／ｐＡｊＦｕｃＴ株、ＮＮＮ／ｐＰａＦｕｃＴ株、ＮＮＮ／ｐＳｂＦｕｃＴ株、ＮＮＮ／ｐＰｓＦｕｃＴ株、ＮＮＮ／ｐＮｂＦｕｃＴ２株、ＮＮＮ／ｐＣＭｆＦｕｃＴ株、ＮＮＮ／ｐＷｂｗＫ株、ＮＮＮ／ｐＷｂｉＱ株及びＮＮＮ／ｐＨＭＦＴ株について、ＬＮＦＰＩの生産性を評価した。ポジティブコントロールとして、比較例で造成した、ＮＮＮ／ｐＴｅ２ＦＴ株及びＮＮＮ／ｐＦｕｔＣ株を使用した。ネガティブコントロールとして、実施例１（２）で造成したＮＮＮ／ｐＣｔｒｌ株を使用した。
　各菌株をそれぞれ１００ｍｇ／Ｌのカナマイシン及び２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢプレート上にて３７℃で１８時間培養し、１００ｍｇ／Ｌのカナマイシン及び２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地２ｍＬが入ったプラスチック製試験管に植菌して３０℃で１５時間、振盪培養した。その後、得られた培養液を１００ｍｇ／Ｌのカナマイシン及び２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含む生産培地［グルコース３０ｇ／Ｌ、ラクトース一水和物１０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物２ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１６ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１４ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２ｇ／Ｌ、クエン酸１ｇ／Ｌ、カザミノ酸５ｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩１０ｍｇ／Ｌ、硫酸第一鉄七水和物５０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン五水和物１０ｍｇ／Ｌ（グルコース、ラクトース一水和物及び硫酸マグネシウム七水和物以外については、水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ７．２に調整した後オートクレーブした）（グルコース、ラクトース一水和物及び硫酸マグネシウム七水和物含有水溶液は別途調製した後オートクレーブし、それぞれ冷却後、混合した）］が４ｍＬ入った大型試験管に０．２ｍＬ植菌し、３０℃で２９時間振盪培養した。
　培養終了後、培養液を遠心分離後に適宜希釈し、上清及び菌体内画分に含まれるＬＮＦＰＩ、ＬＮＴＩＩ又はＬＮＴをＵＦＬＣ＆ＬＣＭＳ－８０４０にて分析した。結果を表６に示す。また、上清および菌体内画分のＬＮＦＰＩ生産量の合算値の結果を図２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　その結果、ＬＮＦＰＩ生産が可能なα１，２－フコシルトランスフェラーゼとして知られるＦｕｔＣ又はＴｅ２ＦＴ発現株と比較して、ＮＮＮ／ｐＧｓＦｕｃＴ株、ＮＮＮ／ｐＦｓＦｕｃＴ株、ＮＮＮ／ｐＮｂＦｕｃＴ１株、ＮＮＮ／ｐＭｔＦｕｃＴ株、ＮＮＮ／ｐＡｊＦｕｃＴ株、ＮＮＮ／ｐＳｂＦｕｃＴ株、ＮＮＮ／ｐＮｂＦｕｃＴ２株及びＮＮＮ／ｐＨＭＦＴ株は、上清及び菌体内のいずれにおいてもＬＮＦＰＩを多く蓄積できることが分かった。
　このうち、ＬＮＦＰＩの生産性が顕著に高かったＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ　ｓｐ．ＦＳＣ１００６由来のＦｓＦｕｃＴ及びＮｅｉｓｓｅｒｉａｌｅｓ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ由来のＮｂＦｕｃＴ２を、ＬＮＦＰＩ生産に有用なα１，２－フコシルトランスフェラーゼの候補として選定した。
［実施例３］ＬＮＦＰＩの製造
　実施例２で選定したＮＮＮ／ｐＦｓＦｕｃＴ株及びＮＮＮ／ｐＮｂＦｕｃＴ２株、並びに、ポジティブコントロールとして比較例で造成したＮＮＮ／ｐＦｕｃＴ５４株を、それぞれ１００ｍｇ／Ｌのカナマイシン及び２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢプレート上にて３０℃で２４時間培養し、１００ｍｇ／Ｌのカナマイシン及び２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含む培地［酵母エキス５ｇ／Ｌ、ペプトン１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ］が２５０ｍＬ入った２Ｌバッフル付き三角フラスコに植菌して３０℃で１７時間、振盪培養した。
　その後、得られた培養液を１００ｍｇ／Ｌのカナマイシン及び２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含む生産培地［グルコース２０ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄七水和物０．２ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物２ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム６ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム３ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、塩化アンモニウム１ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、硫酸マンガン五水和物１０ｍｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩１０ｍｇ／Ｌ、（グルコース、硫酸第一鉄七水和物及び硫酸マグネシウム七水和物含有水溶液は別途調製した後オートクレーブし、それぞれ冷却後、混合した）］が７６０ｍＬ入った３Ｌジャーファーメンター（ミツワフロンテック社製）に４０ｍＬ植菌し、３０℃、８００ｒｐｍで７２時間振盪培養した。１４％アンモニア水を添加して培養中ｐＨを６．９に調整した。
　初発グルコースが全て消費された時点で、ＩＰＴＧを終濃度が０．５ｍＭとなるように添加し、以降の培養においては、４８０ｇ／Ｌグルコース溶液及び４ｇ／Ｌのラクトース一水和物を１～６ｍＬ／ｈの速度で添加した。
　培養終了後、培養液を遠心分離後に適宜希釈し、上清に含まれるＬＮＦＰＩ、２’ＦＬ、ＬＮＴＩＩ又はＬＮＴを糖分析装置ＩＣＳ－５０００にて分析した。結果を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表７に示すように、ＮＮＮ／ｐＦｓＦｕｃＴ株及びＮＮＮ／ｐＮｂＦｕｃＴ２株は、フコシル化オリゴ糖である２’ＦＬおよびＬＮＦＰＩを生産することから、ＦｓＦｕｃＴおよびＮｂＦｕｃＴ２をこれらのオリゴ糖の製造に使用できる可能性が示唆された。また、ＮＮＮ／ｐＦｓＦｕｃＴ株およびＮＮＮ／ｐＮｂＦｕｃＴ２株は、公知のα１，２－フコシルトランスフェラーゼ発現株であるＮＮＮ／ｐＦｕｃＴ５４株と比較して、上清及び菌体内のいずれにおいてもＬＮＦＰＩを顕著に多く蓄積していることが分かった。特に、ＮＮＮ／ｐＮｂＦｕｃＴ２株は、ＮＮＮ／ｐＦｕｃＴ５４株よりもＬＮＦＰＩ生産量が約２倍であった。加えてＮＮＮ／ｐＮｂＦｕｃＴ２株は、他の株と比べて副生物である２’ＦＬの生産が大幅に低減されていたことから、ＮｂＦｕｃＴ２はＬＮＴを基質として優先的に使用できる可能性が示唆された。
　本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加え得ることは、当業者にとって明らかである。なお、本出願は、２０２２年３月２５日付けで出願された日本特許出願（特願２０２２－０５０７９８）に基づいており、その全体が引用により援用される。また、ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。
配列番号１：Ｇｒａｍｅｌｌａ　ｓｐ．　ＭＡＲ＿２０１０＿１４７由来ＧｓＦｕｃＴの塩基配列
配列番号２：Ｇｒａｍｅｌｌａ　ｓｐ．　ＭＡＲ＿２０１０＿１４７由来ＧｓＦｕｃＴのアミノ酸配列
配列番号３：Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ　ｓｐ．　ＦＳＣ１００６由来ＦｓＦｕｃＴの塩基配列
配列番号４：Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ　ｓｐ．　ＦＳＣ１００６由来ＦｓＦｕｃＴのアミノ酸配列
配列番号５：Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ＤＳＭ　１００９７０由来ＮｂＦｕｃＴ１の塩基配列
配列番号６：Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ＤＳＭ　１００９７０由来ＮｂＦｕｃＴ１のアミノ酸配列
配列番号７：Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｔｕｎｄｒｉｐａｌｕｄｕｍ由来ＭｔＦｕｃＴの塩基配列
配列番号８：Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｔｕｎｄｒｉｐａｌｕｄｕｍ由来ＭｔＦｕｃＴのアミノ酸配列
配列番号９：Ａｍｐｈｒｉｔｅａ　ｊａｐｏｎｉｃａ由来ＡｊＦｕｃＴの塩基配列
配列番号１０：Ａｍｐｈｒｉｔｅａ　ｊａｐｏｎｉｃａ由来ＡｊＦｕｃＴのアミノ酸配列
配列番号１１：Ｐｓｅｕｄｏｈａｌｏｃｙｎｔｈｉｉｂａｃｔｅｒ　ａｅｓｔｕａｒｉｉｖｉｖｅｎｓ由来ＰａＦｕｃＴの塩基配列
配列番号１２：Ｐｓｅｕｄｏｈａｌｏｃｙｎｔｈｉｉｂａｃｔｅｒ　ａｅｓｔｕａｒｉｉｖｉｖｅｎｓ由来ＰａＦｕｃＴのアミノ酸配列
配列番号１３：Ｓｔｅｒｏｌｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｊ５Ｂ由来ＳｂＦｕｃＴの塩基配列
配列番号１４：Ｓｔｅｒｏｌｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｊ５Ｂ由来ＳｂＦｕｃＴのアミノ酸配列
配列番号１５：Ｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．　ＣＦ０７４由来ＰｓＦｕｃＴの塩基配列
配列番号１６：Ｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．　ＣＦ０７４由来ＰｓＦｕｃＴのアミノ酸配列
配列番号１７：Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌｅｓ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ由来ＮｂＦｕｃＴ２の塩基配列
配列番号１８：Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌｅｓ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ由来ＮｂＦｕｃＴ２のアミノ酸配列
配列番号１９：Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ　Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｆａｖａｒｅａ由来ＣＭｆＦｕｃＴの塩基配列
配列番号２０：Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ　Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｆａｖａｒｅａ由来ＣＭｆＦｕｃＴのアミノ酸配列
配列番号２１：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｏ８６由来ＷｂｗＫの塩基配列
配列番号２２：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｏ８６由来ＷｂｗＫのアミノ酸配列
配列番号２３：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｏ１２７由来ｗｂｉＱの塩基配列
配列番号２４：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｏ１２７由来ｗｂｉＱのアミノ酸配列
配列番号２５：Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｍｕｓｔｅｌａｅ　ＡＴＣＣ４３７７２由来ＨＭＦＴの塩基配列
配列番号２６：Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｍｕｓｔｅｌａｅ　ＡＴＣＣ４３７７２由来ＨＭＦＴのアミノ酸配列
配列番号２７：Ｓｉｄｅｒｏｘｙｄａｎｓ　ｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ　ＥＳ－１１由来ＦｕｃＴ５４の塩基配列
配列番号２８：Ｓｉｄｅｒｏｘｙｄａｎｓ　ｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ　ＥＳ－１１由来ＦｕｃＴ５４のアミノ酸配列
配列番号２９：Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｌｏｎｇａｔｕｓ　ＢＰ－１由来Ｔｅ２ＦＴの塩基配列
配列番号３０：Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｌｏｎｇａｔｕｓ　ＢＰ－１由来Ｔｅ２ＦＴのアミノ酸配列
配列番号３１：Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ　２６６９５由来ＦｕｔＣの塩基配列
配列番号３２：Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ　２６６９５由来ＦｕｔＣのアミノ酸配列
配列番号３３：Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｖｉｏｌａｃｅｕｍ　ＡＴＣＣ５５３由来Ｃｖβ３ｇａｌＴの塩基配列
配列番号３４：Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｖｉｏｌａｃｅｕｍ　ＡＴＣＣ５５３由来Ｃｖβ３ｇａｌＴのアミノ酸配列
配列番号３５：Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｅａ　ＡＴＣＣ４３７６８由来ＮｐｌｇｔＡの塩基配列
配列番号３６：Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｅａ　ＡＴＣＣ４３７６８由来ＮｐｌｇｔＡのアミノ酸配列
配列番号３７：ｃａｔｓａｃＢ断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号３８：ｃａｔｓａｃＢ断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号３９：ｌａｃＺ上流１増幅用プライマーの塩基配列
配列番号４０：ｌａｃＺ上流１増幅用プライマーの塩基配列
配列番号４１：ｌａｃＹ下流１増幅用プライマーの塩基配列
配列番号４２：ｌａｃＹ下流１増幅用プライマーの塩基配列
配列番号４３：ｌａｃＺ上流２増幅用プライマーの塩基配列
配列番号４４：ｌａｃＹ下流２増幅用プライマーの塩基配列
配列番号４５：ｗｃａＪ上流１増幅用プライマーの塩基配列
配列番号４６：ｗｃａＪ上流１増幅用プライマーの塩基配列
配列番号４７：ｗｃａＭ下流１増幅用プライマーの塩基配列
配列番号４８：ｗｃａＭ下流１増幅用プライマーの塩基配列
配列番号４９：ｗｃａＪ上流２増幅用プライマーの塩基配列
配列番号５０：ｗｃａＭ下流２増幅用プライマーの塩基配列
配列番号５１：Ｃｖβ３ｇａｌＴ断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号５２：Ｃｖβ３ｇａｌＴ断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号５３：ＮｐｌｇｔＡ断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号５４：ＮｐｌｇｔＡ断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号５５：ｌａｃＹ断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号５６：ｌａｃＹ断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号５７：ｐＵＡＫＱＥ断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号５８：ｐＵＡＫＱＥ断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号５９：ｒｃｓＡ断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号６０：ｒｃｓＡ断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号６１：ｐＳＴＶ２９断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号６２：ｐＳＴＶ２９断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号６３：ＧｓＦｕｃＴ断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号６４：ＧｓＦｕｃＴ断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号６５：ＦｓＦｕｃＴ断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号６６：ＦｓＦｕｃＴ断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号６７：ＮｂＦｕｃＴ１断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号６８：ＮｂＦｕｃＴ１断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号６９：ＭｔＦｕｃＴ断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号７０：ＭｔＦｕｃＴ断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号７１：ＡｊＦｕｃＴ断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号７２：ＡｊＦｕｃＴ断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号７３：ＰａＦｕｃＴ断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号７４：ＰａＦｕｃＴ断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号７５：ＳｂＦｕｃＴ断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号７６：ＳｂＦｕｃＴ断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号７７：ＰｓＦｕｃＴ断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号７８：ＰｓＦｕｃＴ断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号７９：ＮｂＦｕｃＴ２断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号８０：ＮｂＦｕｃＴ２断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号８１：ＣＭｆＦｕｃＴ断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号８２：ＣＭｆＦｕｃＴ断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号８３：ＷｂｗＫ断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号８４：ＷｂｗＫ断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号８５：ＷｂｉＱ断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号８６：ＷｂｉＱ断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号８７：ＨＭＦＴ断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号８８：ＨＭＦＴ断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号８９：ＦｕｃＴ５４断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号９０：ＦｕｃＴ５４断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号９１：Ｔｅ２ＦＴ断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号９２：Ｔｅ２ＦＴ断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号９３：ＦｕｔＣ断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号９４：ＦｕｔＣ断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号９５：ｐＳＴＶ－ｒｃｓＡ断片増幅用プライマーの塩基配列

Claims (8)

  1. 　ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）へのフコシル基転移活性を有する、下記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質。
    ［１］配列番号２、４、６、８、１０、１４、１８又は２６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
    ［２］配列番号２、４、６、８、１０、１４、１８又は２６で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、
    かつα１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する変異蛋白質。
    ［３］配列番号２、４、６、８、１０、１４、１８又は２６で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する相同蛋白質。
  2. 　配列番号１、３、５、７、９、１３、１７又は２５で表される塩基配列又はその相同配列からなり、かつ請求項１に記載の［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
  3. 　請求項２に記載のＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ。
  4. 　請求項３に記載の組換え体ＤＮＡで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
  5. 　請求項１に記載の［１］～［３］のいずれか１の蛋白質の活性及びフコース含有糖質の生産性が増強された微生物である、請求項４に記載の形質転換体。
  6. 　前記微生物が大腸菌である、請求項５に記載の形質転換体。
  7. 　請求項４～６のいずれか１項に記載の形質転換体を調製すること、および該形質転換体を用いて培養物中にフコース含有糖質を生成することを含む、フコース含有糖質の製造方法。
  8. 　前記フコース含有糖質がラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰＩ）である、請求項７に記載の製造方法。
PCT/JP2023/012042 2022-03-25 2023-03-24 α１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質及びラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰＩ）の製造方法 WO2023182528A1 (ja)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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JP2015529453A (ja) * 2012-07-25 2015-10-08 グリコシン リミテッド ライアビリティー カンパニー フコシル化オリゴ糖の生産における使用に適したアルファ（１，２）フコシルトランスフェラーゼ
WO2022040411A2 (en) * 2020-08-19 2022-02-24 Conagen Inc. Biosynthetic production of 2-fucosyllactose

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