WO2023153461A1 - ルイスｘ骨格を有するオリゴ糖の製造法 - Google Patents

ルイスｘ骨格を有するオリゴ糖の製造法 Download PDF

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WO2023153461A1
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智惇 杉田
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キリンホールディングス株式会社
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    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01065—3-Galactosyl-N-acetylglucosaminide 4-alpha-L-fucosyltransferase (2.4.1.65), i.e. alpha-1-3 fucosyltransferase

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing an oligosaccharide having a Lewis X skeleton.
  • Non-Patent Document 1 The oligosaccharides (HMO) contained in human breast milk are attracting attention as prebiotic materials, and their effects such as the development of cognitive function in infants, defense against infection, and improvement of the intestinal environment have been disclosed (Non-Patent Document 1).
  • Lacto-N-fucopentaose III (hereinafter referred to as LNFPIII) and lacto-N-neodifucohexaose II (LNnDFHII) are known as a type of oligosaccharide having a Lewis X backbone.
  • LNFPIII is a pentasaccharide HMO in which fucose is ⁇ 1,3-linked to N-acetylglucosamine 3-position of lacto-N-neotetraose (hereinafter referred to as LNnT).
  • LNFPIII is also a pentasaccharide and is known as an isomer of LNFPIII, lacto-N-fucopentaose I (hereinafter referred to as LNFPI) and lacto-N-fucopentaose II (hereinafter referred to as LNFPII). Many are included (Non-Patent Document 2).
  • LNFPIII has been suggested to have macrophage and NK cell activating effects and IL-10 and TNF ⁇ secretion-inducing effects, which are types of cytokines (Non-Patent Document 3), and its functionality is drawing attention.
  • Enzyme reaction methods using ⁇ 1,3-fucose transferase and microbial fermentation methods are known as methods for producing oligosaccharides having a Lewis X backbone, including LNFPIII.
  • Known ⁇ 1,3-fucose transferases include, for example, FucTIII derived from Helicobacter pylori (Non-Patent Document 4) and Bf13FT derived from Bacteroides fragilis (Non-Patent Document 5). ing.
  • Non-Patent Document 6 discloses a method of producing LNFPIII by fermentation using E. coli overexpressing ⁇ 1,3-fucose transferase, FutA or FutB derived from Helicobacter pylori.
  • LNFPVI lacto-N-fucopentaose VI
  • LNnDFHII lacto-N-neodifucohexaose II
  • Non-Patent Document 6 since the Helicobacter pylori-derived ⁇ 1,3-fucose transferase described in Non-Patent Document 6 can utilize not only LNnT but also lactose as a substrate, 3-fucosyllactose (hereinafter referred to as 3FL) is produced as a by-product. (Non-Patent Document 7), it is not suitable for the production of LNFPIII using lactose as the starting material.
  • the object of the present invention is to provide a microorganism with excellent productivity of oligosaccharides having a Lewis X backbone, particularly a microorganism with excellent productivity of oligosaccharides having a LNFPIII backbone.
  • the present inventors have identified Parabacteroides goldsteinii JCM 13446 GDP-fucosyltransferase 1 (hereinafter referred to as FucT1), Gramella sp. FucT-D of BOM4, Parabacteroides sp. Microorganisms with enhanced activity of FucT-A of BX2 or FucT-E of Lachnospiraceae bacterium NLAE-zl-G231 were found to have improved productivity of oligosaccharides having a Lewis X skeleton compared to the parent strain, and the present invention was established. completed.
  • the present invention is as follows. 1. A microorganism in which the activity of the protein according to any one of [1] to [6] below is enhanced and in which the productivity of oligosaccharides having a Lewis X skeleton is improved compared to the parent strain. [1] A protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:2. [2] A mutein consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO:2 in which 1 to 20 amino acids have been deleted, substituted, inserted or added, and having ⁇ 1,3-fucosyltransferase activity.
  • a homologous protein consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:2 and having ⁇ 1,3-fucosyltransferase activity.
  • a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:26. 2. The microorganism according to 1 above, wherein the oligosaccharide having a Lewis X backbone is an oligosaccharide having a lacto-N-fucopentaose III (LNFPIII) backbone. 3. 3.
  • the microorganism according to 2 above wherein the oligosaccharide having the LNFPIII backbone is at least one of LNFPIII and lacto-N-neodifucohexaose II (LNnDFHII).
  • the oligosaccharide having the Lewis X skeleton is an oligosaccharide in which L-fucose is ⁇ 1,3-linked to the 3-position of at least one N-acetylglucosamine contained in the paralacto-N-neohexaose (Para-LNnH) skeleton.
  • the microorganism according to 1 above. 5 A method for producing oligosaccharides, comprising preparing the microorganism according to any one of 1 to 4 above, and producing oligosaccharides in a culture using the microorganism.
  • the microorganism according to the present invention selectively transfers fucose to the N-acetylglucosamine site of the substrate by enhancing the activity of a specific protein, and produces by-products other than oligosaccharides having a Lewis X skeleton. can be reduced and the productivity of oligosaccharides having a Lewis X backbone can be improved.
  • FIG. 1 shows schematic diagrams of the structures of Lewis X, LNFPIII and paralacto-N-neohexaose (hereinafter referred to as Para-LNnH).
  • FIG. 2 shows a schematic diagram of biosynthetic pathways of LNFPIII, LNnDFHII, etc. in a microorganism according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 shows examples of oligosaccharides in which L-fucose is ⁇ 1,3-linked to the 3-position of at least one N-acetylglucosamine contained in the Para-LNnH backbone.
  • FIG. 1 shows schematic diagrams of the structures of Lewis X, LNFPIII and paralacto-N-neohexaose (hereinafter referred to as Para-LNnH).
  • FIG. 2 shows a schematic diagram of biosynthetic pathways of LNFPIII, LNnDFHII, etc. in a microorganism according to one embodiment
  • FIG. 4 shows an alignment of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 18, 20, 22, 24 and 26 encoded by homologous genes of PgsFucT1 represented by SEQ ID NOs: 17, 19, 21, 23 and 25, respectively.
  • FIG. 5 shows a schematic representation of the biosynthetic pathways of 3FL and LewisX.
  • FIG. 6 shows an alignment of the amino acid sequences encoding PgsFucT1, BfFucT1 and HpFutA, represented by SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:12 and SEQ ID NO:4 respectively.
  • Microorganisms with Improved Productivity of Oligosaccharides Having a Lewis X Skeleton of the present invention include the following microorganisms.
  • [1] A protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:2.
  • [2] A mutein consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO:2 in which 1 to 20 amino acids have been deleted, substituted, inserted or added, and having ⁇ 1,3-fucosyltransferase activity.
  • [5] A protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:18.
  • [6] A protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:26.
  • the oligosaccharide having a Lewis X skeleton may be any oligosaccharide as long as it has a Lewis X skeleton consisting of Gal- ⁇ 1,4(Fuc- ⁇ 1,3)GlcNAc shown in FIG. , an oligosaccharide having a LNFPIII skeleton or an oligosaccharide in which L-fucose is ⁇ 1,3-linked to the 3-position of at least one N-acetylglucosamine contained in the Para-LNnH skeleton.
  • an oligosaccharide having a LNFPIII skeleton may be any oligosaccharide as long as it has a LNFPIII skeleton, preferably LNFPIII or LNnDFHII, more preferably LNFPIII.
  • a schematic diagram of the structure of LNFPIII is shown in FIG.
  • FIG. 2 shows a schematic diagram of biosynthetic pathways of LNFPIII, LNnDFHII, etc. in a microorganism according to one embodiment of the present invention.
  • oligosaccharides in which L-fucose is ⁇ 1,3-linked to the 3-position of at least one N-acetylglucosamine contained in the Para-LNnH backbone include oligosaccharides having the structure shown in FIG. A schematic diagram of the structure of Para-LNnH is shown in FIG.
  • mutant protein refers to a protein obtained by artificially deleting or substituting amino acid residues in the original protein, or by inserting or adding amino acid residues into the protein.
  • Deletion, substitution, insertion or addition of amino acids in the mutein of [2] above means deletion, substitution, insertion or addition of 1 to 20 amino acids at any position in the same sequence. good too.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted, inserted or added is 1-20, preferably 1-10, more preferably 1-8, most preferably 1-5.
  • Amino acids to be deleted, substituted, inserted or added may be natural or non-natural.
  • Natural amino acids include L-alanine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-glutamine, L-glutamic acid, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L-arginine, L -methionine, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-valine, L-cysteine and the like.
  • Group A leucine, isoleucine, norleucine, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, O-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexylalanine
  • Group B aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid, Isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosuberic acid
  • Group C asparagine, glutamine
  • D lysine, arginine, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid
  • Group E proline, 3 -Hydroxyproline, 4-hydroxyproline
  • F group serine, threonine, homoserine
  • G group phenylalanine
  • the substituted amino acid residue includes, for example, the 17th asparagine residue.
  • homologous protein refers to a protein whose evolutionary origin is considered to be the same as that of the gene encoding the original protein due to similarity in structure and function to the original protein. It is a protein possessed by organisms existing in the natural world.
  • Homologous proteins include, for example, amino acid sequences having 90% or more, preferably 93% or more, more preferably 95% or more, and particularly preferably 97% or more identity with the amino acid sequence of the target protein.
  • ⁇ 1,3-fucosyltransferase activity refers to the activity from the donor substrate GDP-fucose to the N-acetylglucosamine 3-hydroxyl group of the acceptor substrate carbohydrate (hereinafter referred to as “acceptor carbohydrate”). It refers to the activity of transferring fucose through ⁇ 1,3-bonds to produce fucose-containing carbohydrates.
  • receptor carbohydrates include compounds having an N-acetyllactosamine (hereinafter referred to as LacNAc) backbone, such as LNnT, LNFPVI, para-LNnH or combinations thereof, and carbohydrate chains containing these as partial structures. is mentioned. Among these, LNnT is preferable.
  • LacNAc N-acetyllactosamine
  • acceptor substrate refers to a substance or a combination of substances on which ⁇ 1,3-fucosyltransferase can act to produce an oligosaccharide having a Lewis X backbone.
  • the parent strain refers to the original strain to be subjected to genetic modification, transformation, etc.
  • the parent strain of the microorganism having improved productivity of oligosaccharides having a Lewis X skeleton of the present invention includes genetic modification, transformation, etc. that enhances the activity of the protein according to any one of [1] to [6]. It refers to the stock before it is done.
  • the parent strain is preferably a prokaryotic or yeast strain, more preferably Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Pseudomonas, or the like.
  • Escherichia coli W3110 Escherichia coli NY49, Escherichia coli BL21 codon plus (manufactured by Stratagene), Escherichia coli W3110S3GK (NBRC114657), Serratia ficaria, Serrat ia fonticola, Serratia liquefaciens, Serratia marcescens, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Brevibacterium immariophilum ATCC14068, Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Corynebacterium glutamicum ATCC14067, Coryne Bacterium glutamicum ATCC 13869, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870, Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354, or Pseudomonas sp.
  • Prokaryotes such as D-0110, or Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Trichosporon pullulans, Schwanniomyces alluvius, Pichia pastoris or yeast strains such as Candida utilis.
  • the parent strain may be a wild strain as long as it is a microorganism that produces GDP-fucose and/or receptor carbohydrates. If the wild strain does not have the ability to produce GDP-fucose and/or receptor carbohydrates, it may be a breeding strain artificially endowed with the ability to supply GDP-fucose and/or receptor carbohydrates. .
  • Microorganisms used as parent strains that are artificially endowed or enhanced with the ability to supply GDP-fucose which is a reaction substrate for ⁇ 1,3-fucosyltransferase
  • Parent strains are preferably reaction substrates for ⁇ 1,3-fucosyltransferase and a microorganism artificially endowed or enhanced with the ability to supply GDP-fucose.
  • Specific examples of methods for conferring or enhancing the ability to supply GDP-fucose in microorganisms used as parent strains include known methods such as methods by various genetic manipulations (Metabolic Engineering (2017) 41: 23-38). .
  • the ability to produce GDP-fucose includes the ability to produce GDP-fucose from sugar.
  • Methods for artificially imparting or enhancing the ability to supply GDP-fucose from sugar to a microorganism used as a parent strain include, for example, the following methods (1a) to (1d). These methods may be used alone or in combination.
  • the mechanism controlling the biosynthetic pathway that produces GDP-fucose from sugar include known mechanisms such as a control mechanism by a transcriptional regulatory factor (e.g., RcsA, etc.) involved in the regulation of the biosynthetic pathway. be done.
  • RcsA is a regulator that upregulates the entire colanic acid biosynthetic pathway with GDP-fucose as an intermediate.
  • a large amount of GDP-fucose can be accumulated by enhancing rcsA in a state in which the pathway downstream of GDP-fucose in the colanic acid biosynthetic pathway is blocked.
  • enzymes involved in the biosynthetic pathway that produces GDP-fucose from sugar include mannose-6-phosphate isomerase, phosphomannommutase, mannose-1-phosphate guanylyltransferase, GDP-mannose- Known enzymes such as 4,6-dehydratase and GDP-L-fucose synthase can be mentioned.
  • the metabolic pathway branching from the biosynthetic pathway that produces GDP-fucose from sugar to metabolites other than the target substance include known metabolic pathways such as the metabolic pathway from GDP-fucose to colanic acid. be done.
  • the supply of GDP-fucose can be increased by blocking WcaJ, WzxC, WcaK, WcaL or WcaM, which are downstream pathways from GDP-fucose in the colanic acid biosynthetic pathway.
  • an acceptor saccharide which is a reaction substrate for ⁇ 1,3-fucosyltransferase
  • the method of artificially imparting for example, the following methods (2a) to (2h) can be mentioned, and these methods can be used alone or in combination.
  • enzymes involved in biosynthetic pathways that produce acceptor carbohydrates from sugars include ⁇ 1,4-galactosyltransferase (hereinafter referred to as galT), which is involved in biosynthetic pathways that produce LNnT from glucose and lactose. ) activity and an enzyme having ⁇ 1,3-N-acetylglucosamine transferase (hereinafter referred to as LgtA) activity.
  • galT ⁇ 1,4-galactosyltransferase
  • LgtA enzyme having ⁇ 1,3-N-acetylglucosamine transferase
  • Mechanisms that degrade acceptor carbohydrates or sugars that serve as substrates thereof include known enzymes such as ⁇ -galactosidase that catalyzes the hydrolysis of lactose, which is the substrate of LNnT, to produce glucose and galactose. be done.
  • a specific example thereof is ⁇ -galactosidase (hereinafter referred to as lacZ), which hydrolyzes lactose, which is a substrate of LNTII. Loss of lacZ activity can suppress a decrease in lactose supply.
  • enzymes involved in intracellular uptake of acceptor carbohydrates or their substrate sugars include known enzymes such as lactose permease, which is involved in intracellular uptake of lactose, which is a substrate of LNnT. .
  • the above-mentioned microorganisms endowed with or enhanced with the ability to supply receptor carbohydrates, specifically, for example, to supply LNnT, lactose permease (hereinafter referred to as lacY) activity, ⁇ 1,4-galactosyltransferase (hereinafter referred to as , galT) activity, ⁇ 1,3-N-acetylglucosaminetransferase (hereinafter, LgtA) activity, glutamine fructose-6-phosphate transaminase (hereinafter, glmS) activity, phosphoglucosamine mutase (hereinafter, glmM) activity and N-acetylglucosamine-1-phosphate uridyltransferase/glucosamine-1-phosphate acetyltransferase (hereinafter referred to as glmU) activity, phosphoglucosamine (hereinafter referred to as Pgm) activity,
  • it preferably has the activity of lacY, galT and lgtA, and more preferably has enhanced activity.
  • lacY is a membrane protein that takes up lactose, a substrate for receptor carbohydrates, into cells.
  • galT is the enzyme involved in the generation of LNnT from lacto-N-triose II (LNTII).
  • LNnT is the precursor of LNFPIII.
  • LgtA is the enzyme involved in the production of LNTII from lactose and uridine diphosphate-N-acetylglucosamine (hereafter referred to as UDP-GlcNAc).
  • LNTII is the precursor of LNnT.
  • glmS, glmM and glmU are enzymes involved in the biosynthetic pathway that produces LNTII.
  • Pgm, galU, galE, and galF are enzymes involved in the pathway that produces uridine diphosphate galactose (hereafter referred to as UDP-Gal).
  • Pgi is an enzyme involved in the pathway that produces LNTII.
  • the microorganism is a microorganism capable of producing receptor carbohydrates and/or GDP-fucose
  • the microorganism is cultured in a medium, and the receptor carbohydrates and/or GDP-fucose accumulated in the culture are treated by the method described below. It can be confirmed by detection using a general method such as a sugar analyzer or a high performance liquid chromatograph mass spectrometer.
  • the microorganism used as the parent strain of the present invention is preferably a microorganism artificially endowed or enhanced with the ability to supply GDP-fucose and/or receptor carbohydrates, which are reaction substrates for ⁇ 1,3-fucosyltransferase.
  • nucleotide sequence encoding rcsA (accession number BAA15776.1), the nucleotide sequence encoding mannose-6-phosphate isomerase (accession number BAA15361.1), phosphomann Nucleotide sequence encoding nomutase (accession number BAA15901.1), nucleotide sequence encoding mannose-1-phosphate guanylyltransferase (accession number BAA15905.1), encoding GDP mannose-4,6-dehydratase base sequence (accession number BAA15909.1), base sequence encoding GDP-L-fucose synthase (accession number BAA15908.1), base sequence encoding lacY (accession number BAE76125.1), encoding galT base sequence (SEQ ID NO: 29), base sequence encoding LgtA (SEQ ID NO: 31), base sequence encoding glmS (accession number
  • genetically modified microorganisms that preferably contain a nucleotide sequence encoding lacY, a nucleotide sequence encoding rcsA, a nucleotide sequence encoding galT and a nucleotide sequence encoding lgtA as the parent strain.
  • the genetically modified microorganism has an increased ability to produce GDP-fucose and/or receptor substrates compared to a parent strain that is not genetically modified. preferable.
  • a known method may be used as a method for producing a microorganism with enhanced activity. Specifically, for example, methods using various genetic manipulations (Syst Microbiol Biomanufact, 2021, 1, 291) and the like can be mentioned.
  • the parent strain further has reduced or deleted lacZ activity and/or colanic acid synthesis activity as described above.
  • the lacZ activity and/or colanic acid synthesis activity is preferably reduced or deleted, and more preferably a base sequence encoding lacZ and/or a colanic acid synthesis-related protein is encoded.
  • a parent strain is preferably a genetically modified microorganism that does not contain a nucleotide sequence encoding the nucleotide sequences wcaJ, wzxC, wcaK, wcaL or wcaM gene.
  • the genetically modified microorganism has increased receptor carbohydrate and/or GDP-fucose production capacity compared to a genetically unmodified parent strain. is preferred.
  • a known method may be used as a method for producing E. coli with reduced or lost ⁇ -galactosidase activity and/or colanic acid synthesis activity. Specific examples include methods using various genetic manipulations (Metabolic Engineering, 2017, 41: 23-38).
  • the parent strain microorganism As a microorganism in which the activity of the protein according to any one of [1] to [6] is enhanced compared to the parent strain microorganism, the parent strain microorganism is transformed with a recombinant DNA containing the DNA encoding the protein.
  • a microorganism having an increased copy number of the gene compared to the parent strain obtained by the above.
  • the copy number of the gene is increased compared to the parent strain obtained by transforming the parent strain microorganism with the recombinant DNA containing the DNA encoding the protein according to any one of [1] to [6] above.
  • the copy number of the gene on the chromosomal DNA is increased by transforming the parent strain microorganism with the recombinant DNA containing the DNA encoding the protein according to any one of [1] to [6] above. and microorganisms carrying the gene outside the chromosomal DNA as plasmid DNA.
  • the DNA encoding the protein according to any one of [1] to [6] may be a DNA encoding a protein having the activity of the protein according to any one of [1] to [6]. Specifically, one DNA selected from the group consisting of [7] to [10] below can be mentioned.
  • DNA encoding the protein of any one of [1] to [6] above [8] DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, 23, 17 or 25 [9] a homologous protein that hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, 23, 17 or 25 and has ⁇ 1,3-fucosyltransferase activity; DNA that encodes [10] A nucleotide sequence having 95% or more, preferably 97% or more, more preferably 98% or more, and most preferably 99% or more identity with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, 23, 17 or 25 and encoding a homologous protein having ⁇ 1,3-fucosyltransferase activity
  • Hybridize in [9] above means that DNA hybridizes to a DNA having a specific base sequence or a part of the DNA. Therefore, the DNA having the specific base sequence or a portion thereof is a DNA that can be used as a probe for Northern or Southern blot analysis and as an oligonucleotide primer for PCR analysis.
  • DNAs used as probes include DNAs of at least 100 bases or more, preferably 200 bases or more, and more preferably 500 bases or more. DNAs of at least 10 bases or more, preferably 15 bases or more can be used as DNAs used as primers.
  • DNA that hybridizes under stringent conditions can also be obtained by following the instructions attached to the commercially available hybridization kit.
  • Commercially available hybridization kits include, for example, a random primed DNA labeling kit (manufactured by Roche Diagnostics) in which probes are prepared by the random prime method and hybridized under stringent conditions.
  • the above-mentioned stringent conditions are that the DNA-immobilized filter and the probe DNA are mixed with 50% formamide, 5 ⁇ SSC (750 mmol/L sodium chloride, 75 mmol/L sodium citrate), 50 mmol/L phosphoric acid. After incubation overnight at 42° C. in a solution containing sodium (pH 7.6), 5 ⁇ Denhardt's solution, 10% dextran sulfate, and 20 ⁇ g/L denatured salmon sperm DNA, e.g. Conditions for washing the filter in 0.2 ⁇ SSC solution can be mentioned.
  • 5 ⁇ SSC 750 mmol/L sodium chloride, 75 mmol/L sodium citrate
  • phosphoric acid 50 mmol/L phosphoric acid. After incubation overnight at 42° C. in a solution containing sodium (pH 7.6), 5 ⁇ Denhardt's solution, 10% dextran sulfate, and 20 ⁇ g/L denatured salmon sperm DNA, e.g. Conditions for washing
  • Examples of the DNA that can hybridize under the stringent conditions include the base represented by SEQ ID NO: 1, 23, 17 or 25 when calculated based on the parameters described above using BLAST, FASTA, etc.
  • a DNA having at least 95% or more, preferably 97% or more, more preferably 98% or more, and most preferably 99% or more identity with the DNA consisting of the sequence can be mentioned.
  • the DNA encoding the protein of [1], [4], [5] or [6] above and the DNA of [8] above are, for example, the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (FucT1 gene), SEQ ID NO: 23 gene (FucT-D gene), the gene represented by SEQ ID NO: 17 (FucT-A gene), or the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 25 (FucT-E gene).
  • Southern hybridization method for the chromosomal DNA library of the microorganism preferably a microorganism belonging to the genus Escherichia coli, more preferably Escherichia coli strain W3110, or a primer DNA that can be designed based on the base sequence, It can be obtained by PCR [PCR Protocols, Academic Press (1990)] using the chromosomal DNA of the above microorganism as a template.
  • the Escherichia coli W3110 strain can be obtained from the National Institute of Technology and Evaluation Biotechnology Center (NITE Biological Resource Center).
  • the DNA encoding the mutant protein of [2] above can be obtained, for example, by subjecting the DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, 23, 17 or 25 to error-prone PCR or the like as a template.
  • the DNA can also be obtained by following the instructions attached to the commercially available partial-specific mutagenesis kit.
  • a commercially available partial-specific mutagenesis kit for example, PrimeSTAR (registered trademark) Mutagenesis Basal Kit (manufactured by Takara Bio Inc.) that can introduce mutation (deletion, substitution, insertion or addition) at the position where the desired mutation is to be introduced is available. mentioned.
  • a pair of mutagenesis primers having a 15-base overlap on the 5' side is designed. do. At this time, the overlapping portion contains the desired mutation.
  • PCR is performed using a plasmid having a nucleotide sequence to be mutated as a template.
  • the DNA encoding the homologous protein of [3] above and the DNA of [9] and [10] above are, for example, base sequences represented by SEQ ID NO: 1, 23, 17 or 25 in various gene sequence databases. with 95% or more, preferably 97% or more, more preferably 98% or more, most preferably 99% or more, or search for a nucleotide sequence having an identity of 99% or more, or SEQ ID NO: 2, 24 for various protein sequence databases , 18 or 26 with 95% or more, preferably 97% or more, more preferably 98% or more, most preferably 99% or more, searching for an amino acid sequence having the same identity, and obtaining by the search It can be obtained by the same method as the method for obtaining the above DNA using probe DNA or primer DNA that can be designed based on the base sequence or amino acid sequence obtained and a microorganism having the DNA.
  • the obtained DNA described in any one of [7] to [10] above is used as it is or is cleaved with an appropriate restriction enzyme or the like, incorporated into a vector by a conventional method, and the resulting recombinant DNA is transferred to host cells. , and then subjected to a commonly used nucleotide sequence analysis method, such as the dideoxy method [Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 74, 5463 (1977)] or by analyzing using a base sequence analyzer such as Applied Biosystems 3500 Genetic Analyzer or Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer (both manufactured by Thermo Fisher Scientific) , the base sequence of the DNA can be determined.
  • a commonly used nucleotide sequence analysis method such as the dideoxy method [Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 74, 5463 (1977)] or by analyzing using a base sequence analyzer such as Applied Biosystems 3500 Genetic Analyzer or Applied Biosystem
  • any cell can be used as long as the vector can be introduced and proliferated.
  • Examples include Escherichia coli DH5 ⁇ , Escherichia coli HST08 Premium, Escherichia coli HST02, Escherichia coli HST04 dam-/dcm-, Escherichia coli JM109, Escherichia coli HB101, Escherichia coli CJ236, Escherichia coli BMH71-18 mutS, Escherichia coli MV11 84, Escherichia coli TH2 (both manufactured by Takara Bio Inc.), Escherichia coli XL1-Blue, Escherichia coli XL2-Blue (all manufactured by Agilent Technologies), Escherichia coli DH1, Escherichia coli MC1000, Escherichia coli W1485, Escherichia coli W3110, Escherichia
  • Examples of the above vectors include pBluescriptII KS (+), pPCR-Script Amp SK (+) (all manufactured by Agilent Technologies), pT7Blue (manufactured by Merck Millipore), pCRII (manufactured by Thermo Fisher Scientific) ), pCR-TRAP (manufactured by Gene Hunter), and pDIRECT (Nucleic Acids Res., 18, 6069, 1990).
  • any method for introducing DNA into host cells can be used.
  • a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 69, 2110 (1972)]
  • the protoplast method Japanese Patent Laid-Open No. 63-248394
  • the electroporation method [Nucleic Acids Res. , 16, 6127 (1988)] and the like.
  • full-length DNA can be obtained by Southern hybridization method etc. for the chromosomal DNA library using the partial length DNA as a probe.
  • the target DNA can also be prepared by chemical synthesis using an NTS M series DNA synthesizer manufactured by Nippon Techno Service Co., Ltd., or the like.
  • a recombinant DNA containing a DNA encoding the protein according to any one of [1] to [6] above is one in which the DNA is capable of autonomous replication or integration into the chromosome in the parent strain, and the Refers to a recombinant DNA incorporated into an expression vector containing a promoter at a position that allows transcription of the DNA.
  • the recombinant DNA is a recombinant DNA that can be integrated into the chromosome, it may not contain a promoter.
  • the copy number of the gene is increased compared to the parent strain obtained by transforming the parent strain microorganism with the recombinant DNA containing the DNA encoding the protein according to any one of [1] to [6] above.
  • Microorganisms can be obtained by the following method.
  • a DNA of an appropriate length containing a portion encoding the protein is prepared.
  • a transformant with an improved production rate can be obtained by substituting bases in the nucleotide sequence of the portion that encodes the protein so that the codons are optimal for expression in host cells.
  • a recombinant DNA is prepared by inserting the DNA fragment downstream of the promoter of an appropriate expression vector.
  • the recombinant DNA is composed of a promoter, a ribosome binding sequence, the DNA described in any one of [7] to [10] above, and a transcription termination sequence.
  • a promoter a ribosome binding sequence
  • the DNA described in any one of [7] to [10] above and a transcription termination sequence.
  • it is a recombinant DNA.
  • a gene controlling a promoter may be included.
  • a transcription termination sequence is not necessarily required for expression of the DNA, but it is preferred to place a transcription termination sequence immediately below the structural gene.
  • Proteins having ⁇ 1,3-fucosyltransferase activity include, for example, the proteins described in any one of [1] to [6] above. Information on codon usage in parent strains used in the present invention is available through public databases.
  • the expression vector is not particularly limited as long as it is a suitable nucleic acid molecule for introducing the target DNA into a host, proliferating, and expressing it. may
  • expression vectors include, for example, pColdI, pSTV28, pSTV29, pUC118 (all manufactured by Takara Bio), pMW118, pMW119 (all manufactured by Nippon Gene), pET21a, pCOLADuet- 1, pCDFDuet-1, pCDF-1b, pRSF-1b (manufactured by Merck Millipore), pMAL-c5x (manufactured by New England Biolabs), pGEX-4T-1, pTrc99A (both manufactured by GE Healthcare Biosciences) ), pTrcHis, pSE280 (both manufactured by Thermo Fisher Scientific), pGEMEX-1 (manufactured by Promega), pQE-30, pQE80L (both manufactured by Qiagen), pET-3, pBluescriptIISK (+)
  • any promoter can be used as long as it functions in the cells of microorganisms belonging to the genus Escherichia.
  • uspA promoter lac promoter, PL promoter, PR promoter, PSE promoter, and other promoters derived from Escherichia coli, phage, and the like can be used.
  • artificially designed and modified promoters such as two trp promoters in series, tac promoter, trc promoter, lacT7 promoter, and letI promoter can be used.
  • expression vectors include, for example, pCG1 (Japanese Patent Laid-Open No. 57-134500), pCG2 (Japanese Patent Laid-Open No. 58-35197), pCG4. (Japanese Patent Laid-Open No. 57-183799), pCG11 (Japanese Patent Laid-Open No. 57-134500), pCG116, pCE54, pCB101 (both Japanese Patent Laid-Open No. 58-105999), pCE51, pCE52 , pCE53 [both Molecular and General Genetics, 196, 175 (1984)] and the like.
  • any promoter that functions in the cells of microorganisms belonging to the genus Corynebacterium can be used as the promoter when using the above expression vector.
  • the P54-6 promoter [Appl. Microbiol. Biotechnol. , 53, 674-679 (2000)] can be used.
  • examples of expression vectors include YEp13 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419), pHS19, and pHS15.
  • any promoter can be used as long as it functions in cells of yeast strains.
  • Examples include PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, gal1 promoter, gal10 promoter, Promoters such as shock polypeptide promoter, MF ⁇ 1 promoter, and CUP1 promoter can be mentioned.
  • the recombinant DNA used in the production method of the present invention can be produced by inserting the DNA fragment described in any one of [7] to [10] above downstream of the promoter of an appropriate expression vector.
  • a method for introducing recombinant DNA into the parent strain as an autonomously replicable plasmid for example, a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 69, 2110 (1972)], the protoplast method (Japanese Patent Laid-Open No. 63-248394) and the electroporation method [Nucleic Acids Res. , 16, 6127 (1988)].
  • Methods for integrating recombinant DNA into the chromosome of host cells include, for example, homologous recombination.
  • the homologous recombination method includes, for example, a method using a plasmid for homologous recombination that can be prepared by ligating with a plasmid DNA having a drug resistance gene that cannot autonomously replicate in the host cell to be introduced.
  • a method using homologous recombination frequently used in Escherichia coli for example, a method of introducing recombinant DNA using the homologous recombination system of lambda phage [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 6640-6645 (2000)].
  • a selection method utilizing the sucrose sensitivity of Escherichia coli due to the Bacillus subtilis levansucrase integrated on the chromosome together with the recombinant DNA, and a method of incorporating a wild-type rpsL gene into Escherichia coli having a streptomycin-resistant mutant rpsL gene.
  • a selection method utilizing the sensitivity of E. coli to streptomycin [Mol. Microbiol. , 55, 137 (2005), Biosci. Biotechnol. Biochem. , 71, 2905 (2007)], etc., to obtain E. coli in which the target region on the chromosomal DNA of the host cell has been replaced with recombinant DNA.
  • Introduction of the recombinant DNA as an autonomously replicable plasmid in the parent strain or integration into the chromosome of the parent strain means, for example, amplification of the gene that the microorganism originally has on the chromosomal DNA.
  • the gene introduced by transformation can be confirmed by a method of confirming an amplified product by PCR using an amplifiable primer set.
  • the increase in the amount of transcription of the DNA or the amount of production of the protein encoded by the DNA can be confirmed by Northern blotting of the amount of transcription of the gene in the microorganism, or Western blotting of the amount of production of the protein in the microorganism. Therefore, it can be confirmed by a method of comparing with that of the parent strain.
  • a microorganism constructed by the above method has enhanced activity of the protein according to any one of [1] to [6] above, and has improved productivity of oligosaccharides having a Lewis X skeleton compared to the parent strain.
  • the culture solution is appropriately diluted and then centrifuged, and the oligosaccharides having a Lewis X skeleton contained in the supernatant or the cells are analyzed by a sugar analyzer or a high-performance liquid chromatograph mass spectrometer described later. It can be confirmed by comparing with that of the parent strain by analyzing in .
  • the term "productivity of oligosaccharides having a Lewis X skeleton” refers to the ability of microorganisms to accumulate oligosaccharides having a Lewis X skeleton produced by the microorganism inside and/or outside the cells.
  • the above-mentioned microorganism selectively transfers fucose to the N-acetylglucosamine site of the substrate by enhancing the activity of the protein according to any one of [1] to [6] above compared to the parent strain,
  • the productivity of oligosaccharides having a Lewis X skeleton can be improved.
  • microorganisms include TROS/pPgsFucT1 or FUC/pPgsFucT1 strains with enhanced FucT1 gene expression, FUC/pFucT-D strains with enhanced FucT-D gene expression, and FucT-A gene.
  • Microorganisms that have enhanced the activity of FucT1 protein, FucT-D protein, FucT-A protein or FucT-E protein, which are examples of such microorganisms, can selectively transfer fucose to the N-acetylglucosamine site ⁇ 1,3 -Fucose transferase activity is enhanced, and the productivity of oligosaccharides having a Lewis X skeleton can be improved.
  • Oligosaccharide Production Methods examples include the following methods. 1. A method for producing oligosaccharides, comprising preparing the microorganism described above in 1. and producing oligosaccharides in a culture using the microorganism.
  • the desired oligosaccharide is preferably an oligosaccharide having a Lewis X backbone, an oligosaccharide having a LNFPIII backbone, or at least one N-acetylglucosamine at the 3-position contained in a Para-LNnH backbone. It is more preferable that the oligosaccharide is ⁇ 1,3-linked to L-fucose.
  • the oligosaccharide when the desired oligosaccharide is an oligosaccharide having the LNFPIII skeleton, the oligosaccharide is preferably at least one of LNFPIII and LNnDFHII.
  • the desired oligosaccharide is an oligosaccharide in which L-fucose is ⁇ 1,3-linked to the 3-position of at least one N-acetylglucosamine contained in the Para-LNnH skeleton
  • Oligosaccharides having the structure shown in
  • the method of culturing the microorganisms described in 1. above can be carried out according to the usual methods used for culturing microorganisms.
  • any medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the microorganism and capable of efficiently culturing the transformant can be used as a natural medium.
  • Any of the synthetic media may be used.
  • Any carbon source can be used as long as it can be assimilated by the microorganism.
  • Examples include glucose, fructose, sucrose, molasses containing these, sugars such as starch and starch hydrolysates, organic acids such as acetic acid and propionic acid, Alternatively, alcohols such as glycerol, ethanol, propanol, and the like are included.
  • Nitrogen sources include, for example, ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium salts of inorganic or organic acids such as ammonium phosphate, other nitrogen-containing compounds, peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor. , casein hydrolysates, soybean meal, soybean meal hydrolysates, various fermented bacteria and their digests, and the like.
  • inorganic salts include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, and calcium carbonate.
  • a microorganism capable of producing glucose, lactose, lactose monohydrate, or the like may be used as the microorganism of the present invention used in the method for producing oligosaccharides.
  • glucose, lactose, lactose monohydrate, or the like may be added to the medium during culture.
  • the microorganism of the present invention used in the method for producing oligosaccharides does not have the ability to produce GDP-fucose and/or receptor saccharides, which are substrates for oligosaccharides having a Lewis X backbone, GDP-fucose and/or A receptor carbohydrate may be added to the medium.
  • glucose, lactose, lactose monohydrate, or receptor carbohydrates, etc. instead of adding glucose, lactose, lactose monohydrate, or receptor carbohydrates, etc. to the medium during the culture, glucose, lactose, lactose monohydrate, or By culturing a microorganism capable of producing an receptor carbohydrate or the like together with the microorganism of the present invention, glucose, lactose, lactose monohydrate, or an receptor carbohydrate or the like can be supplied to the microorganism of the present invention.
  • ⁇ -galactosidase and WcaJ are not present in the medium.
  • Cultivation is usually preferably carried out under aerobic conditions such as shaking culture, deep aeration stirring culture, or jar fermenter.
  • the culture temperature is usually 30-37° C., and the culture time is usually 24 hours to 3 days.
  • the pH of the culture solution during cultivation is usually maintained at 6.0-8.0.
  • the pH is adjusted using an inorganic or organic acid, alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia, or the like.
  • oligosaccharides can be produced by producing oligosaccharides in the culture.
  • oligosaccharides can be collected from the supernatant after centrifugation of the culture.
  • the cells are crushed by ultrasonic waves, and the oligosaccharides are collected from the supernatant obtained by removing the cells by centrifugation by an ion exchange resin method. can.
  • the target oligosaccharide can also be produced by adding another sugar to the oligosaccharide in the culture or the collected oligosaccharide.
  • [Analysis example] (1) Analysis and quantification of LNFPIII, 3FL, LNFPVI or lactose
  • analysis and quantification of LNFPIII, 3FL, LNFPVI or lactose were performed according to the following procedures.
  • the culture solution containing the cultured microorganisms was centrifuged to recover the supernatant.
  • the precipitated cells were suspended in the same amount of water as the original culture medium, and the same amount of chloroform was added to disrupt the cells.
  • LNFPIII, 3FL, LNFPVI or lactose contained in the supernatant and/or intracellular fraction was analyzed with a sugar analyzer ICS-5000 (manufactured by Thermo Fisher Scientific).
  • LewisX or LNnDFHII Analysis and quantification of LewisX or LNnDFHII were performed according to the following procedures.
  • a supernatant and/or intracellular fraction was prepared from the culture solution containing the cultured microorganism in the same manner as in (1) above.
  • Lewis X or LNnDFHII contained in the supernatant and/or intracellular fraction was analyzed by UFLC & LCMS-8040 (manufactured by SHIMADZU).
  • Example 1 Acquisition of ⁇ 1,3-fucosyltransferases useful for LNFPIII production Screening for ⁇ 1,3-fucosyltransferases showing high substrate specificity for N-acetyllactosamine using the productivity of 3FL or Lewis X as an index did.
  • PCR was performed using DNA consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOS: 33 and 34 as a primer set and pCatSac (Appl Environ Microbiol (2013) 79, 3033-3039) as a template to obtain a chloramphenicol-resistant cat gene and a sucrose-sensitive gene. A cat-sacB fragment containing the sacB gene was obtained.
  • DNA encoding ⁇ -galactosidase (hereinafter referred to as lacZ gene), DNA encoding lactose permease (hereinafter referred to as lacY gene), and DNA encoding colanic acid production-related proteins (hereinafter wcaJ, wzxC, wcaK , wcaL or wcaM gene) was constructed by the following method.
  • lacZ and lacY (hereinafter referred to as lacZY) and wcaJ, wzxC, wcaK, wcaL and wcaM (hereinafter referred to as wcaJ-wzxC-wcaKLM) each form an operon on the E. coli genome.
  • PCR was performed using the DNA consisting of the nucleotide sequences shown in "Primer set" in Table 1 as a primer set to amplify each DNA fragment.
  • lacZ upstream 1 and lacZ upstream 2 include the region from the start codon of the lacZ gene to approximately 1000 bp upstream of the start codon.
  • lacY downstream 1 and lacY downstream 2 include regions from about 50 bp to about 1000 bp downstream of the stop codon of the lacY gene.
  • lacZY::cat-sacB DNA fragment consisting of a sequence in which the cat-sacB fragment was inserted into the sequences of the regions surrounding the lacZ and lacY genes was obtained.
  • PCR was performed using DNA consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOS: 36 and 38 as a primer set.
  • a DNA (hereinafter referred to as ⁇ lacZY) fragment consisting of a sequence in which the upstream and downstream of lacY were directly linked was obtained.
  • lacZY::cat-sacB fragment was transformed into plasmid pKD46 [Datsenko, K. et al. A. , Warner, B.; L. , Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, Vol. 97, 6640-6645 (2000)] was introduced into the W3110 strain by electroporation, and a transformant exhibiting chloramphenicol resistance and sucrose sensitivity (lacZY gene changed to lacZY::cat-sacB A transformed transformant with replacement) was obtained.
  • the ⁇ lacZY fragment was introduced into the transformant by electroporation to obtain a chloramphenicol-sensitive and sucrose-resistant transformant (a transformant in which lacZY::cat-sacB was replaced with ⁇ lacZY). . From these, a transformant exhibiting ampicillin sensitivity (a transformant lacking pKD46) was obtained. The transformant was named W3110 ⁇ lacZY.
  • PCR was performed using the genomic DNA of the W3110 strain as a template and DNA consisting of the base sequences shown in "primer set" in Table 2 as a primer set to obtain each amplified DNA fragment.
  • wcaJ upstream 1 and wcaJ upstream 2 include regions from the start codon of the wcaJ gene to about 1000 bp upstream of the start codon.
  • wcaM downstream 1 and wcaM downstream 2 include regions from the stop codon of the wcaM gene to about 1000 bp downstream of the stop codon.
  • a mixture of wcaJ upstream 1, wcaM downstream 1 and cat-sacB fragment in an equimolar ratio was used as a template, and PCR was performed using DNAs consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOS: 42 and 44 as a primer set.
  • a DNA fragment (hereinafter referred to as wcaJ-wzxC-wcaKLM::cat-sacB) consisting of a sequence in which the cat-sacB fragment was inserted into the sequence of the -wzxC-wcaKLM operon peripheral region was obtained.
  • PCR was performed using a mixture of wcaJ upstream 2 and wcaM downstream 2 at an equimolar ratio as a template, and DNA consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOS: 42 and 44 as a primer set to obtain wcaJ-wzxC-wcaKLM.
  • a DNA hereinafter referred to as ⁇ wcaJ-wzxC-wcaKLM) fragment consisting of a sequence in which the wcaJ upstream and the wcaM downstream are directly linked without the wcaJ was obtained.
  • a transformant (wcaJ-wzxC- A transformant in which wcaKLM was replaced with wcaJ-wzxC-wcaKLM::cat-sacB) was obtained.
  • the ⁇ wcaJ-wzxC-wcaKLM fragment was introduced into the transformant by electroporation, and a transformant exhibiting chloramphenicol sensitivity and sucrose resistance (wcaJ-wzxC-wcaKLM::cat-sacB was replaced with ⁇ yhbJ A transformed transformant) was obtained. Furthermore, a transformant exhibiting ampicillin sensitivity (a transformant lacking pKD46) was obtained. The transformant was named W3110 ⁇ lacZY ⁇ wcaJM strain.
  • ⁇ Creation of microorganisms with enhanced expression of transporter genes Escherichia coli having a gene expression plasmid encoding a transporter gene (hereinafter referred to as MdfA) belonging to the drug: H + antiporter-1 family derived from the W3110 strain consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 28 was prepared as follows. created by the method.
  • PCR was performed using the genomic DNA of the W3110 strain prepared by a conventional method as a template to obtain an mdfA fragment. PCR was performed using DNAs consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOS: 49 and 50 as a primer set and plasmid pMW118 (manufactured by Nippon Gene) as a template to obtain a vector fragment of about 4.1 kb.
  • the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 47 and 49 and SEQ ID NOs: 48 and 50 contain sequences complementary to their 5' ends.
  • E. coli harboring pMW118_mdfA was constructed by transforming the W3110 ⁇ lacZY ⁇ wcaJM strain constructed in Example 1(1) using the expression plasmid pMW118_mdfA, and named FUC strain.
  • rcsA-lacY DNA that ligated the two fragments
  • PCR was performed using plasmid pUAKQE31 (Appl. Obtained.
  • SEQ ID NOs: 51 and 53 and SEQ ID NOs: 52 and 56 contain sequences complementary to their 5' ends.
  • the rcsA-lacY fragment obtained above and the vector fragment were ligated using the In-Fusion HD Cloning Kit (manufactured by Takara Bio Inc.) to obtain the expression vector pUAKQE-rcsA-lacY.
  • PCR was performed using the DNA consisting of the nucleotide sequences shown in "Primer Set” in Table 4 as a primer set and the DNA shown in "Template” in Table 4 as a template to obtain each amplified DNA fragment.
  • the DNA represented by SEQ ID NO: 3 is the base sequence of the gene encoding the ⁇ 1,3-fucosyltransferase derived from Helicobacter pylori strain 26695 represented by SEQ ID NO: 4, and was prepared by artificial synthesis.
  • the DNA represented by SEQ ID NO: 15 is the Mediterranea sp. represented by SEQ ID NO: 16.
  • the base sequence of the gene encoding ⁇ 1,3-fucosyltransferase derived from strain An20 was codon-optimized for expression in E. coli, and was prepared by artificial synthesis.
  • PCR was performed using DNA consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 51 and 57 as a primer set to obtain a vector fragment of about 6.7 kb. Obtained.
  • nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 51, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 and 72, SEQ ID NOs: 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71 and 73 are 'Contains a sequence complementary to the end.
  • Plasmids expressing various ⁇ 1,3-fucosyltransferases, pHpFutA, pBnFucT, and pBsFucT, were obtained by ligating various amplified DNA fragments obtained above and vector fragments using In-Fusion HD Cloning Kit (manufactured by Takara Bio Inc.). , pPgsFucT1, pPgsFucT2, pBfFucT1, pBfFucT2 and pMFucT were constructed.
  • Example 1 ⁇ Construction of Escherichia coli having a plasmid for expressing ⁇ 1,3-fucosyltransferase> Using the ⁇ 1,3-fucosyltransferase expression plasmids obtained above, pHpFutA, pBnFucT, pBsFucT, pPgsFucT1, pPgsFucT2, pBfFucT1, pBfFucT2 and pMFucT, and pUAKQE-rcsA-lacY as a vector control, Example 1 (1) By transforming the FUC strain constructed in , Escherichia coli having various plasmids was constructed, and FUC/pHpFutA strain, FUC/pBnFucT strain, FUC/pBsFucT strain, FUC/pPgsFucT1 strain, FUC/pPgsFucT2 strain,
  • Each strain was cultured on an LB plate containing 100 mg/L kanamycin and 100 mg/L ampicillin for 17 hours at 37°C, and placed on a plastic plate containing 2 mL of LB medium containing 100 mg/L kanamycin and 100 mg/L ampicillin.
  • the strain was inoculated into a 14 mL tube manufactured by the manufacturer and cultured with shaking at 30° C. for 15 hours.
  • the resulting culture was then transferred to a production medium containing 100 mg/L kanamycin and 100 mg/L ampicillin [glucose 30 g/L, lactose monohydrate or N-acetyllactosamine 10 g/L, magnesium sulfate heptahydrate.
  • PgsFucT1 was selected as the ⁇ 1,3-fucosyltransferase for LNFPIII production and was subjected to the following tests.
  • Example 2 Evaluation of PgsFucT1 homolog gene The PgsFucT1 homolog gene selected in Example 1 was evaluated for usefulness in LNFPIII production.
  • E. coli having PgsFucT1 homologous gene was constructed by the following method. Five genes represented by SEQ ID NOs: 17 to 26 were used as homologous genes of PgsFucT1.
  • FIG. 4 shows the alignment of the amino acid sequences encoded by each homologous gene. PCR was performed using the DNA described in "Template” in Table 6 as a template and the DNA consisting of the base sequence represented in "Primer set” in Table 6 as a primer set to amplify each DNA fragment.
  • the DNA represented by SEQ ID NO: 17 is the Parabacteroides sp. represented by SEQ ID NO: 18.
  • the base sequence of the gene encoding the BX2 strain-derived ⁇ 1,3-fucosyltransferase was prepared by artificial synthesis.
  • the DNA represented by SEQ ID NO: 19 is the Parabacteroides sp. represented by SEQ ID NO: 20. This is the nucleotide sequence of the gene encoding the ⁇ 1,3-fucosyltransferase derived from the HGS0025 strain, which was prepared by artificial synthesis.
  • the DNA represented by SEQ ID NO: 21 is the nucleotide sequence of the gene encoding the ⁇ 1,3-fucosyltransferase derived from strain Marseille-P3763 of Parabacteroides pouches durhonensis strain represented by SEQ ID NO: 22, and was prepared by artificial synthesis.
  • the DNA represented by SEQ ID NO: 23 is the Gramella sp. represented by SEQ ID NO: 24. This is the base sequence of the gene encoding the ⁇ 1,3-fucosyltransferase derived from the BOM4 strain, which was prepared by artificial synthesis.
  • the DNA represented by SEQ ID NO: 25 is the nucleotide sequence of the gene encoding ⁇ 1,3-fucosyltransferase derived from Lachnospiraceae bacterium NLAE-zl-G231 strain represented by SEQ ID NO: 26, and was prepared by artificial synthesis.
  • nucleotide sequences represented by SEQ ID NOS: 51, 74, 76, 78, 80 and 82, SEQ ID NOS: 57, 75, 77, 79, 81 and 83 contain sequences complementary to their 5' ends. .
  • Various homologous genes are expressed by ligating the various amplified DNA fragments obtained above and the pUAKQE-rcsA-lacY vector fragment prepared in Example 1 using the In-Fusion HD Cloning Kit (manufactured by Takara Bio). Plasmids pFucT-A, pFucT-B, pFucT-C, pFucT-D and pFucT-E were constructed.
  • Example 1 The culture method and culture conditions followed the method described in Example 1 (3). After culturing, the culture medium was centrifuged and diluted appropriately, and 3FL or Lewis X contained in the supernatant was analyzed using a sugar analyzer ICS-5000 or UFLC&LCMS-8040. Table 7 shows the results.
  • Example 3 Identification of effective mutation points The crystal structures of known Helicobacter pylori-derived ⁇ 1,3-fucosyltransferases have been disclosed, and amino acid residues involved in interaction with N-acetyllactosamine have been predicted. (J. Biol. Chem. 2007, 282, 9973-9982). With reference to this, amino acid residues interacting with N-acetyllactosamine were identified by alignment of PgsFucT1 and BfFucT1 that showed high LewisX productivity in Example 1. Sequences in which the identified amino acid residues were reciprocally substituted with the corresponding amino acid residues of PgsFucT1 and BfFucT1 were evaluated for their effectiveness in LNFPIII production.
  • PCR was performed using the DNA consisting of the base sequence represented in "Primer set” in Table 8 as a primer set to amplify each DNA fragment.
  • a mixture of PgsFucT1 N17D upstream and PgsFucT1 N17D downstream fragments at an equimolar ratio was used as a template, and DNA consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 64 and 65 was used as a primer set to perform PCR.
  • a PgsFucT1 N17D fragment was obtained in which the 17th asparagine in the amino acid sequence of PgsFucT1 was substituted with aspartic acid.
  • a mixture of the PgsFucT1 S93L upstream fragment and the PgsFucT1 S93L downstream fragment at an equimolar ratio was used as a template, and PCR was performed using the DNA consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 64 and 65 as a primer set.
  • a PgsFucT1 S93L fragment in which serine at position 93 in the amino acid sequence of PgsFucT1 represented by 2 was substituted with leucine was obtained.
  • PCR was performed using a mixture of BfFucT1 D28N upstream and BfFucT1 D28N downstream fragments at an equimolar ratio as a template, and DNA consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOS: 68 and 69 as a primer set.
  • a BfFucT1 D28N fragment was obtained in which the 28th aspartic acid in the BfFucT1 amino acid sequence represented by 12 was substituted with asparagine.
  • PCR was performed using a mixture of BfFuc T1 L104S upstream and BfFuc T1 L104S downstream fragments at an equimolar ratio as a template, and DNA consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOS: 68 and 69 as a primer set.
  • a BfFucT1 L104S fragment was obtained in which the 104th leucine in the BfFucT1 amino acid sequence represented by 12 was replaced with serine.
  • Each fragment obtained above and the pUAKQE-rcsA-lacY vector fragment prepared in Example 1 are ligated using In-Fusion HD Cloning Kit (manufactured by Takara Bio Inc.) to express each mutant fragment.
  • the FUC strain constructed in Example 1 (3) was transformed to construct Escherichia coli having various plasmids, FUC/pPgsFucT1_N17D strain, FUC/pPgsFucT1_S93L strain, They were named FUC/pBfFucT1_D28N strain and FUC/pBfFucT1_L104S strain.
  • Example 9 The culture method and culture conditions followed the method described in Example 1 (3). After culturing, the culture medium was centrifuged and diluted appropriately, and 3FL or Lewis X contained in the supernatant was analyzed using a sugar analyzer ICS-5000 or UFLC&LCMS-8040. Table 9 shows the results.
  • HpgalT Helicobacter pylori-derived ⁇ 1,4-galactosyltransferase
  • NplgtA Neisseria polysaccharea-derived ⁇ 1,3-N- Escherichia coli carrying a gene-expressing plasmid containing a gene encoding acetylglucosamine transferase
  • PCR was performed using the DNA described in “Template” in Table 10 as a template and the DNA consisting of the base sequence represented in “Primer set” in Table 10 as a primer set to amplify each DNA fragment.
  • Genomic DNA of Helicobacter pylori strain NCTC11637 was prepared by a conventional method.
  • the DNA represented by SEQ ID NO: 31 was obtained by codon-optimizing the nucleotide sequence of the gene encoding ⁇ 1,3-N-acetylglucosamine transferase derived from Neisseria polysaccharia ATCC 43768 strain represented by SEQ ID NO: 32 in order to express it in E. coli.
  • DNA prepared by artificial synthesis.
  • the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 95 and 96 contain sequences complementary to their 5' ends.
  • HpgalT-NplgtA A DNA (hereinafter referred to as HpgalT-NplgtA) fragment was obtained.
  • a vector fragment of about 2.9 kb was obtained by PCR using the DNA consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOS: 92 and 93 as a primer set and the plasmid pSTV29 (manufactured by Takara Bio Inc.) as a template.
  • the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 92 and 94 and SEQ ID NOs: 93 and 97 contain sequences complementary to their 5' ends.
  • the HpgalT-NplgtA fragment obtained above and the vector fragment were ligated using the In-Fusion HD Cloning Kit (manufactured by Takara Bio Inc.) to obtain the expression plasmid pSTV_HpgalT-NplgtA.
  • E. coli harboring pSTV_HpgalT-NplgtA was constructed and named the TROS strain.
  • the above TROS strain was transformed with the pHpFutA, pPgsFucT1, pBfFucT1 and pUAKQE-rcsA-lacY plasmids constructed in Example 1 (2), and TROS/pHpFutA, TROS/pPgsFucT1, TROS/pBfFucT1 and TROS/Ctrl, respectively. acquired shares.
  • Example 5 Production of LNFPIII
  • the TROS/pHpFutA, TROS/pPgsFucT1, TROS/pBfFucT1, and TROS/Ctrl strains obtained in Example 4 were evaluated for LNFPIII and byproduct sugar productivity.
  • Each strain was cultured on an LB plate containing 100 mg/L kanamycin and 25 mg/L chloramphenicol at 37°C for 18 hours, and the LB plate containing 100 mg/L kanamycin and 25 mg/L chloramphenicol The strain was inoculated into a plastic 14 mL tube containing 2 mL of the medium and cultured with shaking at 30° C. for 15 hours. The resulting culture was then transferred to a production medium containing 100 mg/L kanamycin and 25 mg/L chloramphenicol [glucose 30 g/L, lactose monohydrate 10 g/L, magnesium sulfate heptahydrate 2 g/L.
  • LNFPIII, 3FL, LNnDFHII, or LNFPVI contained in the supernatant or cells was analyzed using a sugar analyzer ICS-5000 or UFLC&LCMS-8040. Table 11 shows the results. Both LNnDFHII and LNFPVI represent peak relative values (%).
  • PgsFucT1-expressing strain accumulated more LNFPIII both in the culture medium and in the cells, compared to the known ⁇ 1,3 fucosyltransferase HpFutA or BfFucT1-expressing strain.
  • PgsFucT1 can reduce by-products such as 3FL, LNnDFHII or LNFPVI.
  • SEQ ID NO: 1 base sequence of FucT1 derived from Parabacteroides goldsteinii JCM 13446
  • SEQ ID NO: 2 amino acid sequence of FucT1 derived from Parabacteroides goldsteinii JCM 13446
  • SEQ ID NO: 3 base sequence of FutA derived from Helicobacter pylori 26695
  • SEQ ID NO: 4 Helico Amino acid sequence of FutA from bacter pylori 26695
  • 5 base sequence of FucT derived from Bacteroides nordii JCM 12987
  • SEQ ID NO: 6 amino acid sequence of FucT derived from Bacteroides nordii JCM 12987
  • SEQ ID NO: 7 base sequence of FucT derived from Bacteroides salyersiae JCM 12988
  • SEQ ID NO: 8 Bacteroides salyersiae JCM 12988-derived FucT Amino acid sequence
  • SEQ ID NO: 9 base sequence of Fu
  • Nucleotide sequence of An20-derived FucT SEQ ID NO: 16 Mediterranea sp.
  • An20-derived FucT amino acid sequence SEQ ID NO: 17 Parabacteroides sp.
  • BX2-derived FucT-A nucleotide sequence SEQ ID NO: 18 Parabacteroides sp.
  • BX2-derived FucT-A amino acid sequence SEQ ID NO: 19 Parabacteroides sp.
  • Nucleotide sequence of FucT-B derived from HGS0025 SEQ ID NO: 20 Parabacteroides sp.
  • SEQ ID NO: 25 Lachnospiraceae bacterium NLAE-zl-G231-derived FucT-E base sequence
  • SEQ ID NO: 26 Lachnospiraceae bacterium NLAE-zl-G231-derived FucT-E amino acid sequence
  • SEQ ID NO: 27 E.
  • SEQ ID NO: 28 E. coli W3110 E.
  • SEQ ID NOS: 64 and 65 base sequences of primers for amplifying PgsFucT1 fragments
  • SEQ ID NOS: 66 and 67 base sequences of primers for amplifying PgsFucT2 fragments
  • SEQ ID NOS: 68 and 69 BfFucT1 fragment amplification
  • nucleotide sequences of FucT-B fragment amplification primers SEQ ID NOS: 78 and 79: nucleotide sequences of FucT-C fragment amplification primers SEQ ID NOS: 80 and 81: nucleotide sequences of FucT-D fragment amplification primers SEQ ID NO: 82 , 83: base sequence of FucT-E fragment amplification primer SEQ ID NO: 84: base sequence of PgsFucT1 N17D upstream amplification primer SEQ ID NO: 85: base sequence of PgsFucT1 N17D downstream amplification primer Nucleotide sequence SEQ ID NO: 87: PgsFucT1 S93L downstream amplification primer nucleotide sequence SEQ ID NO: 88: BfFucT D28N upstream amplification primer nucleotide sequence SEQ ID NO: 89: BfFucT D28N downstream amplification primer nucleo

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Abstract

本発明は、［１］配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、［２］配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する変異蛋白質、［３］配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する相同蛋白質、および［４］配列番号２４、１８または２６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質のいずれか１に記載の蛋白質の活性が増強され、かつ、親株に比べてルイスＸ骨格を有するオリゴ糖の生産性が向上した微生物に関する。

Description

ルイスＸ骨格を有するオリゴ糖の製造法
　本発明は、ルイスＸ骨格を有するオリゴ糖の製造法に関する。
　ヒトの母乳中に含まれるオリゴ糖（ＨＭＯ）はプレバイオティクス素材として注目され、乳幼児の認知機能発達や感染防御、腸内環境の改善などの効果が開示されている（非特許文献１）。
　ルイスＸ骨格を有するオリゴ糖の一種として、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩＩ（以下、ＬＮＦＰＩＩＩという。）やラクト－Ｎ－ネオジフコヘキサオースＩＩ（ＬＮｎＤＦＨＩＩ）などが知られている。このうちＬＮＦＰＩＩＩは、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース（以下、ＬＮｎＴという。）のＮ－アセチルグルコサミン３位にフコースがα１，３－結合した５糖のＨＭＯである。
　ＬＮＦＰＩＩＩは、同じく５糖でＬＮＦＰＩＩＩの異性体として知られるラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（以下、ＬＮＦＰＩという。）やラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩ（以下、ＬＮＦＰＩＩという。）などに次いで、ヒトの母乳中に多く含まれる（非特許文献２）。
　ＬＮＦＰＩＩＩは、マクロファージやＮＫ細胞の活性化作用、サイトカインの一種であるＩＬ－１０やＴＮＦαの分泌誘導作用が示唆されており（非特許文献３）、その機能性が注目されている。
　ＬＮＦＰＩＩＩをはじめとするルイスＸ骨格を有するオリゴ糖の製造法としては、α１，３－フコーストランスフェラーゼを使用した酵素反応法や微生物発酵法が知られている。α１，３－フコーストランスフェラーゼとしては、例えば、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ（ヘリコバクター・ピロリ）に由来するＦｕｃＴＩＩＩ（非特許文献４）や、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｆｒａｇｉｌｉｓ（バクテロイデス・フラジリス）に由来するＢｆ１３ＦＴ（非特許文献５）が知られている。
　また非特許文献６には、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉに由来するα１，３－フコーストランスフェラーゼ、ＦｕｔＡ又はＦｕｔＢを過剰発現させた大腸菌を用いた発酵法により、ＬＮＦＰＩＩＩを生産する方法が開示されている。
Ｉｎｔ　Ｊ　Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ（２０１９）２３９０２４０：１－８ Ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ（２０１９）１１，１２８２ Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｆｏｏｄｓ　７２（２０２０）１０４０７４ ＡＣＳ　Ｃａｔａｌ．（２０１９）９，１０７１２－１０７２０ ＡＣＳ　Ｃａｔａｌ．（２０１９）９，１２，１１７９４－１１８００ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．（２００４）２０，４１２－４１９ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　４１（２０１７）２３－３８
　上述のように、ルイスＸ骨格を有するオリゴ糖の製造法としては、α１，３－フコーストランスフェラーゼを使用した酵素反応法や微生物発酵法が知られている。しかしながら、非特許文献４、５および６等に記載された公知のα１，３－フコーストランスフェラーゼは、基質特異性が低いために、例えばＬＮＦＰＩＩＩの生産においては、ＬＮｎＴの還元末端側グルコース３位にフコースが結合したラクト－Ｎ－フコペンタオースＶＩ（以下、ＬＮＦＰＶＩという。）やラクト－Ｎ－ネオジフコヘキサオースＩＩ（以下、ＬＮｎＤＦＨＩＩという。）が副生物として生じてしまうという課題がある。
　また、非特許文献６に記載のＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ由来のα１，３－フコーストランスフェラーゼは、ＬＮｎＴだけではなくラクトースも基質として利用できるため、副生物として３－フコシルラクトース（以下、３ＦＬという。）が生成される（非特許文献７）ことから、ラクトースを初発原料とするＬＮＦＰＩＩＩの生産には適さない。
　ＬＮＦＰＩＩＩなどのルイスＸ骨格を有するオリゴ糖をより効率的に製造するためには、ＬＮｎＴなどの基質のＮ－アセチルグルコサミン部位へ選択的にフコースを転移できるα１，３－フコーストランスフェラーゼの探索が求められている。
　したがって、本発明は、ルイスＸ骨格を有するオリゴ糖の生産性に優れる微生物、特に、ＬＮＦＰＩＩＩ骨格を有するオリゴ糖の生産性に優れる微生物の提供を目的とする。
　本発明者は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｇｏｌｄｓｔｅｉｎｉｉ　ＪＣＭ　１３４４６のＧＤＰ－フコシルトランスフェラーゼ１（以下、ＦｕｃＴ１という。）、Ｇｒａｍｅｌｌａ　ｓｐ．ＢＯＭ４のＦｕｃＴ－Ｄ、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｓｐ．ＢＸ２のＦｕｃＴ－ＡまたはＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ＮＬＡＥ－ｚｌ－Ｇ２３１のＦｕｃＴ－Ｅの活性を増強した微生物は、親株に比べて、ルイスＸ骨格を有するオリゴ糖の生産性が向上することを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は以下の通りである。
１．　下記［１］～［６］のいずれか１に記載の蛋白質の活性が増強され、かつ、親株に比べてルイスＸ骨格を有するオリゴ糖の生産性が向上した微生物。
［１］配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
［２］配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する変異蛋白質。
［３］配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する相同蛋白質。
［４］配列番号２４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
［５］配列番号１８で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
［６］配列番号２６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
２．　前記ルイスＸ骨格を有するオリゴ糖が、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩＩ（ＬＮＦＰＩＩＩ）骨格を有するオリゴ糖である、前記１に記載の微生物。
３．　前記ＬＮＦＰＩＩＩ骨格を有するオリゴ糖が、ＬＮＦＰＩＩＩおよびラクト－Ｎ－ネオジフコヘキサオースＩＩ（ＬＮｎＤＦＨＩＩ）の少なくとも一方である、前記２に記載の微生物。
４．　前記ルイスＸ骨格を有するオリゴ糖が、パララクト－Ｎ－ネオへキサオース（Ｐａｒａ－ＬＮｎＨ）骨格に含まれる少なくとも１のＮ－アセチルグルコサミンの３位にＬ－フコースがα１，３－結合したオリゴ糖である、前記１に記載の微生物。
５．　前記１～４のいずれか１に記載の微生物を調製すること、および当該微生物を用いて培養物中にオリゴ糖を生成することを特徴とする、オリゴ糖の製造方法。
　本発明に係る微生物は、特定の蛋白質の活性が増強されていることで、基質のＮ－アセチルグルコサミン部位へ選択的にフコースを転移し、ルイスＸ骨格を有するオリゴ糖以外の副生成物の生成を低減させ、ルイスＸ骨格を有するオリゴ糖の生産性を向上し得る。
図１は、ルイスＸ、ＬＮＦＰＩＩＩおよびパララクト－Ｎ－ネオへキサオース（以下、Ｐａｒａ－ＬＮｎＨという。）の構造の模式図を示す。 図２は、本発明の一実施形態に係る微生物における、ＬＮＦＰＩＩＩ、ＬＮｎＤＦＨＩＩ等の生合成経路の模式図を示す。 図３は、Ｐａｒａ－ＬＮｎＨ骨格に含まれる少なくとも１のＮ－アセチルグルコサミンの３位にＬ－フコースがα１，３－結合したオリゴ糖の例を示す。 図４は、配列番号１７、１９、２１、２３および２５で表されるＰｇｓＦｕｃＴ１のホモログ遺伝子がそれぞれコードする、配列番号１８、２０、２２、２４および２６で表されるアミノ酸配列のアライメントを示す。 図５は、３ＦＬ及びＬｅｗｉｓＸの生合成経路の模式図を示す。 図６は、それぞれ配列番号２、配列番号１２および配列番号４で表される、ＰｇｓＦｕｃＴ１、ＢｆＦｕｃＴ１及びＨｐＦｕｔＡをコードするアミノ酸配列のアライメントを示す。
１．ルイスＸ骨格を有するオリゴ糖の生産性が向上した微生物
　本発明のルイスＸ骨格を有するオリゴ糖の生産性が向上した微生物としては、以下の微生物が挙げられる。
　下記［１］～［６］のいずれか１に記載の蛋白質の活性が増強され、かつ、親株に比べてルイスＸ骨格を有するオリゴ糖の生産性が向上した微生物。
［１］配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
［２］配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する変異蛋白質。
［３］配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する相同蛋白質。
［４］配列番号２４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
［５］配列番号１８で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
［６］配列番号２６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
　本明細書において、ルイスＸ骨格を有するオリゴ糖は、図１に示したＧａｌ－β１，４（Ｆｕｃ－α１，３）ＧｌｃＮＡｃからなるルイスＸ骨格を有していれば、いかなるオリゴ糖でもよいが、ＬＮＦＰＩＩＩ骨格を有するオリゴ糖またはＰａｒａ－ＬＮｎＨ骨格に含まれる少なくとも１のＮ－アセチルグルコサミンの３位にＬ－フコースがα１，３－結合したオリゴ糖であることが好ましい。
　本明細書において、ＬＮＦＰＩＩＩ骨格を有するオリゴ糖とは、ＬＮＦＰＩＩＩ骨格を有していればいかなるオリゴ糖でもよいが、ＬＮＦＰＩＩＩまたはＬＮｎＤＦＨＩＩであることが好ましく、ＬＮＦＰＩＩＩであることがさらに好ましい。ＬＮＦＰＩＩＩの構造の模式図を図１に示す。図２は、本発明の一実施形態に係る微生物における、ＬＮＦＰＩＩＩ、ＬＮｎＤＦＨＩＩ等の生合成経路の模式図を示す。
　本明細書において、Ｐａｒａ－ＬＮｎＨ骨格に含まれる少なくとも１のＮ－アセチルグルコサミンの３位にＬ－フコースがα１，３－結合したオリゴ糖としては、図３に示す構造のオリゴ糖が挙げられる。Ｐａｒａ－ＬＮｎＨの構造の模式図を図１に示す。
　本明細書において、変異蛋白質とは、元となる蛋白質中のアミノ酸残基を人為的に欠失若しくは置換、または該蛋白質中にアミノ酸残基を挿入若しくは付加して得られる蛋白質をいう。
　上記［２］の変異蛋白質において、アミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されていてもよい。欠失、置換、挿入または付加されるアミノ酸の数は１～２０個、好ましくは１～１０個、より好ましくは１～８個、最も好ましくは１～５個である。
　欠失、置換、挿入または付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、Ｌ－システインなどが挙げられる。
　以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２－アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ－メチルセリン、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２－アミノアジピン酸、２－アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４－ジアミノブタン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３－ヒドロキシプロリン、４－ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
　上記［２］の変異蛋白質において、置換されるアミノ酸残基として、例えば、１７番目のアスパラギン残基が挙げられる。
　本明細書において、相同蛋白質とは、元となる蛋白質と構造および機能が類似することにより、その蛋白質をコードする遺伝子が進化上の起源を元の蛋白質をコードする遺伝子と同一にすると考えられる蛋白質であって、自然界に存在する生物が有する蛋白質をいう。
　相同蛋白質としては、例えば、対象となる蛋白質が有するアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
　アミノ酸配列および塩基配列の同一性は、Ｋａｒｌｉｎ　ａｎｄ　ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　９０，　５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，　１８３，　６３　（１９９０）］を用いて決定できる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている［Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　２１５，　４０３（１９９０）］。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばＳｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
　本明細書におけるα１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性とは、ドナー基質であるＧＤＰ－フコースから受容体基質である糖質（以下、「受容体糖質」という。）のＮ－アセチルグルコサミン３位水酸基にα１，３－結合でフコースを転移し、フコース含有糖質を生成する活性をいう。
　受容体糖質としては、Ｎ－アセチルラクトサミン（以下、ＬａｃＮＡｃという。）骨格を有する化合物が挙げられ、例えば、ＬＮｎＴ、ＬＮＦＰＶＩ、ｐａｒａ－ＬＮｎＨまたはそれらの組合せ、およびそれらを部分構造として含む糖鎖が挙げられる。これらの中でも、ＬＮｎＴが好ましい。
　本明細書において、「受容体基質」とは、ルイスＸ骨格を有するオリゴ糖を生じさせるためにα１，３－フコシルトランスフェラーゼが作用し得る物質または該物質の組み合わせをいう。
　本明細書において、親株とは、遺伝子改変および形質転換等の対象となる元株のことをいう。特に、本発明のルイスＸ骨格を有するオリゴ糖の生産性が向上した微生物における親株とは、［１］～［６］のいずれか１に記載の蛋白質の活性を増強させる遺伝子改変および形質転換等がされる前の株のことをいう。
　本明細書において、親株としては、好ましくは原核生物または酵母菌株を、より好ましくは、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、若しくはシュードモナス属等に属する原核生物、またはサッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属、ピチア属、若しくはキャンディダ属等に属する酵母菌株を、最も好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＧ１６５５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ２－Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１　ｃｏｄｏｎ　ｐｌｕｓ（ストラタジーン社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０Ｓ３ＧＫ（ＮＢＲＣ１１４６５７）、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ　ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ　ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ　ＡＴＣＣ１５３５４、若しくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．　Ｄ－０１１０等の原核生物、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ　ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ　ａｌｌｕｖｉｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ、若しくはＣａｎｄｉｄａ　ｕｔｉｌｉｓ等の酵母菌株を挙げることができる。
　親株は、ＧＤＰ－フコース及び／又は受容体糖質を生成する微生物であれば、野生株であってもよい。野生株がＧＤＰ－フコース及び／又は受容体糖質を生成する能力を有しない場合は、ＧＤＰ－フコース及び／又は受容体糖質を供給する能力を人工的に付与した育種株であってもよい。
１）α１，３－フコシルトランスフェラーゼの反応基質であるＧＤＰ－フコースを供給する能力が人工的に付与又は増強された、親株として用いる微生物
　親株としては、好ましくは、α１，３－フコシルトランスフェラーゼの反応基質であるＧＤＰ－フコースを供給する能力を人工的に付与又は増強された微生物が挙げられる。親株として用いる微生物において、ＧＤＰ－フコースを供給する能力を付与又は増強する方法の具体例としては、各種遺伝子操作による方法（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２０１７）４１：２３－３８）等、公知の方法が挙げられる。
　ＧＤＰ－フコースを生産する能力としては、糖からＧＤＰ－フコースを生産する能力が挙げられる。親株として用いる微生物に、糖からＧＤＰ－フコースを供給する能力を人工的に付与又は増強する方法としては、例えば、以下の（１ａ）～（１ｄ）の方法が挙げられる。これらの方法は単独または組み合わせて用いてもよい。
（１ａ）糖からＧＤＰ－フコースを生成する生合成経路を制御する機構の少なくとも１つを緩和又は解除する方法
（１ｂ）糖からＧＤＰ－フコースを生成する生合成経路に関与する酵素の少なくとも１つについて発現を増強する方法
（１ｃ）糖からＧＤＰ－フコースを生成する生合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法
（１ｄ）糖からＧＤＰ－フコースを生成する生合成経路から該目的物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化又は遮断する方法
　糖からＧＤＰ－フコースを生成する生合成経路を制御する機構の具体例としては、例えば、当該生合成経路の制御に関わる転写調節因子（例えば、ＲｃｓＡ等）による制御機構等、公知の機構が挙げられる。ＲｃｓＡは、ＧＤＰ－フコースを中間体とするコラン酸生合成経路全体をアップレギュレートする調節因子である。後述のようにコラン酸生合成経路のうちＧＤＰ－フコースより下流の経路を遮断した状態でｒｃｓＡを強化することで、ＧＤＰ－フコースを多く蓄積させることができる。
　糖からＧＤＰ－フコースを生成する生合成経路に関与する酵素の具体例としては、例えば、マンノース－６－リン酸イソメラーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－リン酸グアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰマンノース－４，６－デヒドラターゼ、ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼ等、公知の酵素が挙げられる。
　糖からＧＤＰ－フコースを生成する生合成経路から該目的物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の具体例としては、例えば、ＧＤＰ－フコースからコラン酸への代謝経路等、公知の代謝経路が挙げられる。特にコラン酸生合成経路のうちＧＤＰ－フコースより下流の経路であるＷｃａＪ、ＷｚｘＣ、ＷｃａＫ、ＷｃａＬ又はＷｃａＭを遮断することで、ＧＤＰ－フコースの供給を高めることができる。
２）α１，３－フコシルトランスフェラーゼの反応基質である受容体糖質を供給する能力を人工的に付与又は増強された、親株として用いる微生物
　親株として用いる微生物に、受容体糖質を供給する能力を人工的に付与する方法としては、例えば、下記（２ａ）～（２ｈ）などの方法を挙げることができ、これらの方法は単独又は組み合わせて用いることができる。
（２ａ）糖から受容体糖質を生成する生合成経路を制御する機構の少なくとも１つを緩和又は解除する方法
（２ｂ）糖から受容体糖質を生成する生合成経路に関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法
（２ｃ）糖から受容体糖質を生成する生合成経路に関与する酵素遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法
（２ｄ）受容体糖質又はその基質となる糖を分解する機構の少なくとも１つを緩和又は解除する方法
（２ｅ）受容体糖質又はその基質となる糖の細胞内取り込みに関与する酵素の少なくとも１つについて発現を増強する方法
（２ｆ）受容体糖質又はその基質となる糖の細胞内取り込みに関与する酵素をコードする遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法
（２ｇ）糖から受容体糖質を生成する生合成経路から該目的物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化又は遮断する方法
（２ｈ）野生型株に比べ、受容体糖質のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法
　糖から受容体糖質を生成する生合成経路に関与する酵素の具体例としては、例えば、グルコース及びラクトースからＬＮｎＴを生成する生合成経路に関与する、β１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ（以下、ｇａｌＴという）活性を有する酵素や、β１，３－Ｎ－アセチルグルコサミントランスフェラーゼ（以下、ＬｇｔＡという）活性を有する酵素等、公知の酵素が挙げられる。
　受容体糖質又はその基質となる糖を分解する機構の具体例としては、例えば、ＬＮｎＴの基質であるラクトースの加水分解を触媒しグルコース及びガラクトースを生成するβ－ガラクトシダーゼ等、公知の酵素が挙げられる。具体的には例えば、ＬＮＴＩＩの基質であるラクトースを加水分解するβ－ガラクトシダーゼ（以下、ｌａｃＺという）が挙げられ、ｌａｃＺの活性を喪失させることで、ラクトース供給の低下を抑制できる。
　受容体糖質又はその基質となる糖の細胞内取り込みに関与する酵素の具体例としては、例えば、ＬＮｎＴの基質であるラクトースの細胞内取り込みに関与するラクトースパーミアーゼ等、公知の酵素が挙げられる。
　上記、受容体糖質を供給する能力を付与又は増強された微生物は、具体的には例えばＬＮｎＴを供給するために、ラクトースパーミアーゼ（以下、ｌａｃＹという）活性、β１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ（以下、ｇａｌＴという）活性、β１，３－Ｎ－アセチルグルコサミントランスフェラーゼ（以下、ＬｇｔＡという）活性、グルタミン・フルクトース－６－リン酸トランスアミナーゼ（以下、ｇｌｍＳという）活性、ホスホグルコサミンムターゼ（以下、ｇｌｍＭという）活性およびＮ－アセチルグルコサミン－１－リン酸ウリジルトランスフェラーゼ／グルコサミン－１－リン酸アセチルトランスフェラーゼ（以下、ｇｌｍＵという）活性、ホスホグルコムターゼ（以下、Ｐｇｍという）活性、ＵＴＰグルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（以下、ｇａｌＵという）活性、ＵＤＰグルコース－４－エピメラーゼ（以下、ｇａｌＥという）活性、ＵＴＰグルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（以下、ｇａｌＦという）活性、グルコース－６－リン酸イソメラーゼ（以下、Ｐｇｉという）活性から選ばれる少なくとも１の活性を有していることが好ましく、その活性が強化されていることがより好ましい。
　このうち、ｌａｃＹ、ｇａｌＴおよびｌｇｔＡの活性を有していることが好ましく、その活性が強化されていることがさらに好ましい。
　ｌａｃＹは、受容体糖質の基質であるラクトースを細胞内に取り込む膜タンパク質である。ｇａｌＴは、ラクト－Ｎ－トリオースＩＩ（ＬＮＴＩＩ）からのＬＮｎＴの生成に関与する酵素である。ＬＮｎＴはＬＮＦＰＩＩＩの前駆体である。ＬｇｔＡは、ラクトースおよびウリジン二リン酸－Ｎ－アセチルグルコサミン（以下、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃという）からのＬＮＴＩＩの生成に関与する酵素である。ＬＮＴＩＩはＬＮｎＴの前駆体である。
　ｇｌｍＳ、ｇｌｍＭおよびｇｌｍＵは、ＬＮＴＩＩを生成する生合成経路に関与する酵素である。Ｐｇｍ、ｇａｌＵ、ｇａｌＥ、ｇａｌＦは、ウリジン二リン酸ガラクトース（以下、ＵＤＰ－Ｇａｌという）を生成する経路に関与する酵素である。Ｐｇｉは、ＬＮＴＩＩを生成する経路に関与する酵素である。
　微生物が受容体糖質及び／又はＧＤＰ－フコースを生成し得る微生物であることは、該微生物を培地に培養し、培養物中に蓄積した受容体糖質及び／又はＧＤＰ－フコースを、後述の糖分析装置または高速液体クロマトグラフ質量分析計等の一般的な手法を用いて検出することにより確認できる。
　本発明の親株として用いる微生物は、α１，３－フコシルトランスフェラーゼの反応基質であるＧＤＰ－フコース及び／又は受容体糖質を供給する能力が人工的に付与又は増強された微生物であることが好ましい。従って、本発明における１実施形態では、好ましくはｒｃｓＡをコードする塩基配列（アクセッション番号ＢＡＡ１５７７６．１）、マンノース－６－リン酸イソメラーゼをコードする塩基配列（アクセッション番号ＢＡＡ１５３６１．１）、ホスホマンノムターゼをコードする塩基配列（アクセッション番号ＢＡＡ１５９０１．１）、マンノース－１－リン酸グアニリルトランスフェラーゼをコードする塩基配列（アクセッション番号ＢＡＡ１５９０５．１）、ＧＤＰマンノース－４，６－デヒドラターゼをコードする塩基配列（アクセッション番号ＢＡＡ１５９０９．１）、ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼをコードする塩基配列（アクセッション番号ＢＡＡ１５９０８．１）、ｌａｃＹをコードする塩基配列（アクセッション番号ＢＡＥ７６１２５．１）、ｇａｌＴをコードする塩基配列（配列番号２９）、ＬｇｔＡをコードする塩基配列（配列番号３１）、ｇｌｍＳをコードする塩基配列（アクセッション番号ＢＡＥ７７５５９．１）、ｇｌｍＭをコードする塩基配列（アクセッション番号ＢＡＥ７７２２０．１）、ｇｌｍＵをコードする塩基配列（アクセッション番号ＢＡＥ７７５５８．１）、Ｐｇｍをコードする塩基配列（アクセッション番号ＢＡＡ３５３３７．１）、ｇａｌＵをコードする塩基配列（アクセッション番号ＢＡＡ３６１０４．１）、ｇａｌＥをコードする塩基配列（アクセッション番号ＢＡＡ３５４２１．１）、ｇａｌＦをコードする塩基配列（アクセッション番号ＢＡＡ１５８９６．１）、およびＰｇｉをコードする塩基配列（アクセッション番号ＢＡＥ７８０２７．１）から選ばれる少なくとも１の塩基配列を含む、遺伝的に改変された微生物を親株とすることが好ましい。
　特に、好ましくはｌａｃＹをコードする塩基配列、ｒｃｓＡをコードする塩基配列、ｇａｌＴをコードする塩基配列およびｌｇｔＡをコードする塩基配列を含む、遺伝的に改変された微生物を親株とすることがより好ましい。本発明の１実施形態において、前記遺伝的に改変された微生物は、ＧＤＰ－フコース及び／又は受容体基質の産生能が、遺伝的に改変されていない親株に比較して上昇していることが好ましい。
　ｌａｃＹ活性、ｒｃｓＡ活性、ｇａｌＴ活性、ＬｇｔＡ活性、ｇｌｍＳ活性、ｇｌｍＭ活性およびｇｌｍＵ活性、Ｐｇｍ活性、ｇａｌＵ活性、ｇａｌＥ活性、ｇａｌＦ活性、Ｐｇｉ活性から選ばれる少なくとも１の活性を有している、またはその活性が強化されている微生物を製造する方法としては公知の方法を用いればよい。具体的には例えば、各種遺伝子操作による方法（Ｓｙｓｔ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｂｉｏｍａｎｕｆａｃｔ，２０２１，１，２９１）等が挙げられる。
　また、親株ではさらに、前述のようにｌａｃＺ活性および／またはコラン酸合成活性が低下又は欠失していることが好ましい。
　従って、本発明の１実施態様では、好ましくはｌａｃＺ活性および／またはコラン酸合成活性が低下または欠失しており、より好ましくはｌａｃＺをコードする塩基配列および／またはコラン酸生成関連蛋白質をコードする塩基配列であるｗｃａＪ、ｗｚｘＣ、ｗｃａＫ、ｗｃａＬ又はｗｃａＭ遺伝子をコードする塩基配列を含まない、遺伝的に改変された微生物を親株とすることが好ましい。
　本発明の１実施形態において、前記遺伝的に改変された微生物は、受容体糖質及び／又はＧＤＰ－フコースの産生能が、遺伝的に改変されていない親株に比較して上昇していることが好ましい。
　β－ガラクトシダーゼ活性および／またはコラン酸合成活性が低下または喪失した大腸菌を製造する方法としては公知の方法を用いればよい。具体的には例えば、各種遺伝子操作による方法（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０１７，４１：２３－３８）等が挙げられる。
　親株の微生物に比べ前記［１］～［６］のいずれか１に記載の蛋白質の活性が増強した微生物としては、該蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより得られる、親株よりも該遺伝子のコピー数が増大した微生物が挙げられる。
　前記［１］～［６］のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより得られる、親株よりも該遺伝子のコピー数が増大した微生物としては、前記［１］～［６］のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより、染色体ＤＮＡ上において前記遺伝子のコピー数が増大した微生物、およびプラスミドＤＮＡとして染色体ＤＮＡ外に前記遺伝子を保有させた微生物を挙げることができる。
　前記［１］～［６］のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡとしては、前記［１］～［６］のいずれか１に記載の蛋白質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであればいずれでもよいが、具体的には以下の［７］～［１０］からなる群より選ばれる１のＤＮＡが挙げられる。
［７］前記［１］～［６］のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［８］配列番号１、２３、１７または２５で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［９］配列番号１、２３、１７または２５で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
［１０］配列番号１、２３、１７または２５で表される塩基配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、α１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
　上記［９］において「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズすることである。したがって、該特定の塩基配列を有するＤＮＡまたはその一部は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして用いることができ、またＰＣＲ解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できるＤＮＡである。
　プローブとして用いられるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡを挙げることができる。プライマーとして用いられるＤＮＡとしては、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡを上げることができる。
　ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えば当業者であれば本明細書に従い、ハイブリダイゼーションの条件を決定できる。該ハイブリダイゼーションの条件は、モレキュラー・クローニング第４版（２０１２年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｇｅｎｅｒａｌ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，　ＡＳＭ　Ｐｒｅｓｓ（１９９４）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｍａｎｕａｌ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　ｐｒｅｓｓ（１９９６）に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従っておこなうことができる。
　また、市販のハイブリダイゼーションキットに付属した説明書に従うことによっても、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを取得できる。市販のハイブリダイゼーションキットとしては、例えばランダムプライム法によりプローブを作製し、ストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションを行うランダムプライムドＤＮＡラベリングキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）などを挙げることができる。
　上記のストリンジェントな条件とは、ＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、７５ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸ナトリウム）、５０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン、および２０μｇ／Ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃にて一晩、インキュベートした後、例えば約６５℃の０．２×ＳＳＣ溶液中で該フィルターを洗浄する条件を挙げることができる。
　上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えばＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等を用いて上記したパラメータ等に基づいて計算したときに、配列番号１、２３、１７または２５で表される塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するＤＮＡを挙げることができる。
　上記［１］、［４］、［５］又は［６］の蛋白質をコードするＤＮＡ、および上記［８］のＤＮＡは、例えば、配列番号１で表される塩基配列（ＦｕｃＴ１遺伝子）、配列番号２３で表される遺伝子（ＦｕｃＴ－Ｄ遺伝子）、配列番号１７で表される遺伝子（ＦｕｃＴ－Ａ遺伝子）または配列番号２５で表される塩基配列（ＦｕｃＴ－Ｅ遺伝子）に基づき設計できるプローブＤＮＡを用いた、微生物、好ましくは、エシェリヒア・コリ属に属する微生物、より好ましくは、エシェリヒア・コリＷ３１１０株の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法、または該塩基配列に基づき設計できるプライマーＤＮＡを用いた、上記微生物の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ［ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　（１９９０）］により取得できる。
　エシェリヒア・コリＷ３１１０株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター（ＮＩＴＥ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅ　Ｃｅｎｔｅｒ）から入手できる。
　上記［２］の変異蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号１、２３、１７または２５で表される塩基配列からなるＤＮＡを鋳型としてエラープローンＰＣＲ等に供することにより取得できる。
　または、目的の変異（欠失、置換、挿入または付加）が導入されるように設計した塩基配列をそれぞれの５’端に持つ１組のＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲ［Ｇｅｎｅ，　７７，　５１（１９８９）］によっても、上記［２］のＤＮＡを取得できる。
　また、市販の部分特異的変異導入キットに付属した説明書に従うことによっても、該ＤＮＡを取得できる。市販の部分特異的変異導入キットとしては、例えば、目的の変異を導入したい位置に変異（欠失、置換、挿入又は付加）を導入できるＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｂａｓａｌ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）が挙げられる。
　すなわち、まず、目的の変異（欠失、置換、挿入又は付加）が導入されるように設計した塩基配列を有するプラスミドを鋳型に、５’側が１５塩基オーバーラップした一対の変異導入用プライマーを設計する。このとき、オーバーラップ部分には目的の変異を含む。次に、該変異導入用プライマーを用いて、目的の変異を導入したい塩基配列を有するプラスミドを鋳型にＰＣＲを行う。これにより得られた増幅断片を大腸菌に形質転換すると、目的の変異が導入された塩基配列を有するプラスミドが得られる。
　上記［３］の相同蛋白質をコードするＤＮＡ、並びに上記［９］および［１０］のＤＮＡは、例えば、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号１、２３、１７または２５で表される塩基配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列を検索し、または、各種の蛋白質配列データベースに対して配列番号２、２４、１８または２６で表されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列またはアミノ酸配列に基づいて設計できるプローブＤＮＡまたはプライマーＤＮＡ、および当該ＤＮＡを有する微生物を用いて、上記のＤＮＡを取得する方法と同様の方法によって取得できる。
　取得した上記の［７］～［１０］のいずれか１に記載のＤＮＡは、そのまま、または適当な制限酵素などで切断し、常法によりベクターに組み込み、得られた組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入した後、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　ＵＳＡ，　７４，　５４６３　（１９７７）］またはアプライド・バイオシステムズ３５００ジェネティックアナライザやアプライド・バイオシステムズ３７３０ＤＮＡアナライザ（いずれもサーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定できる。
　前記、ＤＮＡの塩基配列を決定する際に用いることができる宿主細胞としては、前記ベクターを導入し増殖可能なものであれば何でもよいが、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ５α、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＳＴ０８Ｐｒｅｍｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＳＴ０２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＳＴ０４　ｄａｍ－／ｄｃｍ－、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉＣＪ２３６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＭＨ７１－１８　ｍｕｔＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＶ１１８４、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＴＨ２（いずれもタカラバイオ社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ２－Ｂｌｕｅ（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＰ３４７、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２等が挙げられる。
　上記のベクターとしては、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＫＳ（＋）、ｐＰＣＲ－Ｓｃｒｉｐｔ　Ａｍｐ　ＳＫ（＋）（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（メルクミリポア社製）、ｐＣＲＩＩ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）、ｐＣＲ－ＴＲＡＰ（ジーンハンター社製）、及びｐＤＩＲＥＣＴ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１８，６０６９，１９９０）等が挙げられる。
　組換え体ＤＮＡの導入方法としては、宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，　６９，　２１１０　（１９７２）］、プロトプラスト法（日本国特開昭６３－２４８３９４号公報）、エレクトロポレーション法［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　１６，　６１２７　（１９８８）］等が挙げられる。
　塩基配列を決定した結果、取得されたＤＮＡが部分長であった場合は、該部分長ＤＮＡをプローブに用いた、染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長ＤＮＡを取得できる。
　更に、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、日本テクノサービス社製ＮＴＳ　ＭシリーズＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することにより目的とするＤＮＡを調製することもできる。
　前記［１］～［６］のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡとは、該ＤＮＡが、親株において自律複製可能または染色体中への組込が可能で、該ＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有している発現ベクターに組み込まれている組換え体ＤＮＡをいう。
　組換え体ＤＮＡが、染色体への組込が可能な組換え体ＤＮＡである場合は、プロモーターを含有していなくてもよい。
　前記［１］～［６］のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより得られる、親株よりも該遺伝子のコピー数が増大した微生物は、以下の方法で取得できる。
　上記の方法で得られる前記［１］～［６］のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡをもとにして、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主細胞での発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、生産率が向上した形質転換体を取得できる。
　前記ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体ＤＮＡを作製する。該組換え体ＤＮＡで親株を形質転換することにより、親株よりも該蛋白質をコードする遺伝子のコピー数が増大した微生物を取得できる。
　細菌等の原核生物を親株として用いる場合は、該組換え体ＤＮＡは、プロモーター、リボソーム結合配列、上記の［７］～［１０］のいずれか１に記載のＤＮＡ、および転写終結配列により構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
　リボソーム結合配列であるシャイン－ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６～１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。該組換え体ＤＮＡにおいては、該ＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
　また、α１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードする部分の塩基配列を宿主の発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することにより、α１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質の発現量を向上させることができる。α１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質としては、例えば前記［１］～［６］のいずれか１に記載の蛋白質が挙げられる。本発明に用いられる親株におけるコドン使用頻度の情報は、公共のデータベースを通じて入手できる。
　発現ベクターとしては、目的ＤＮＡを宿主に導入し、増殖、発現させるための適当な核酸分子であれば特に限定されず、プラスミドのみならず、例えば、人工染色体、トランスポゾンを用いたベクター、コスミドを用いてもよい。
　親株にエシェリヒア属に属する微生物を用いる場合は、発現ベクターとしては、例えば、ｐＣｏｌｄＩ、ｐＳＴＶ２８、ｐＳＴＶ２９、ｐＵＣ１１８（いずれもタカラバイオ社製）、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ１１９（いずれもニッポンジーン社製）、ｐＥＴ２１ａ、ｐＣＯＬＡＤｕｅｔ－１、ｐＣＤＦＤｕｅｔ－１、ｐＣＤＦ－１ｂ、ｐＲＳＦ－１ｂ（いずれもメルクミリポア社製）、ｐＭＡＬ－ｃ５ｘ（ニューイングランドバイオラブス社製）、ｐＧＥＸ－４Ｔ－１、ｐＴｒｃ９９Ａ（いずれもジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製）、ｐＴｒｃＨｉｓ、ｐＳＥ２８０（いずれもサーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）、ｐＧＥＭＥＸ－１（プロメガ社製）、ｐＱＥ－３０、ｐＱＥ８０Ｌ（いずれもキアゲン社製）、ｐＥＴ－３、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＫＳ（－）（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、ｐＵＡＫＱＥ３１（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００７，７３：６３７８－６３８５）、ｐＫＹＰ１０（日本国特開昭５８－１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　４８，　６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　５３，　２７７　（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　ＵＳＡ，　８２，　４３０６　（１９８５）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＫＳ（－）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒＳ３０［エシェリヒア・コリ　ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５４０７）より調製］、ｐＴｒＳ３２［エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５４０８）より調製］、ｐＴＫ３１［ＡＰＰＬＩＥＤ　ＡＮＤ　ＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ　ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ、　２００７、　Ｖｏｌ．　７３、Ｎｏ．　２０、ｐ．６３７８－６３８５］、ｐＰＡＣ３１（国際公開第１９９８／１２３４３号）、ｐＵＣ１９［Ｇｅｎｅ，　３３，　１０３　（１９８５）］、ｐＰＡ１（日本国特開昭６３－２３３７９８号公報））ｐＫＤ４６［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９７，６６４０－６６４５（２０００）］等を挙げることができる。
　上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、エシェリヒア属に属する微生物の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、ｔｒｐプロモーターやｉｌｖプロモーター等のアミノ酸生合成に関与する遺伝子のプロモーター、ｕｓｐＡプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉやファージ等に由来するプロモーターを用いることができる。また、例えば、ｔｒｐプロモーターを２つ直列させたプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーターが挙げられる。
　親株にコリネバクテリウム属に属する微生物を用いる場合は、発現ベクターとしては、例えば、ｐＣＧ１（日本国特開昭５７－１３４５００号公報）、ｐＣＧ２（日本国特開昭５８－３５１９７号公報）、ｐＣＧ４（日本国特開昭５７－１８３７９９号公報）、ｐＣＧ１１（日本国特開昭５７－１３４５００号公報）、ｐＣＧ１１６、ｐＣＥ５４、ｐＣＢ１０１（いずれも日本国特開昭５８－１０５９９９号公報）、ｐＣＥ５１、ｐＣＥ５２、ｐＣＥ５３〔いずれもＭｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，　１９６，　１７５　（１９８４）〕等を挙げることがきる。
　上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、コリネバクテリウム属に属する微生物の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、Ｐ５４－６プロモーター［Ａｐｐｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，　５３，　６７４－６７９　（２０００）］を用いることができる。
　親株に酵母菌株を用いる場合には、発現ベクターとしては、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を挙げることができる。
　上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、酵母菌株の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等のプロモーターを挙げることができる。
　上記の［７］～［１０］のいずれか１に記載のＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、本発明の製造法に用いられる組換え体ＤＮＡを作製できる。
　組換え体ＤＮＡを親株において自律複製可能なプラスミドとして導入させる方法としては、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　ＵＳＡ，　６９，　２１１０　（１９７２）］、プロトプラスト法（日本国特開昭６３－２４８３９４号公報）およびエレクトロポレーション法［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　１６，　６１２７　（１９８８）］等の方法が挙げられる。
　組換え体ＤＮＡを宿主細胞の染色体中に組み込む方法としては、例えば、相同組換え法が挙げられる。相同組換え法としては、例えば、導入したい宿主細胞内では自律複製できない薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドＤＮＡと連結して作製できる相同組換え用プラスミドを用いる方法が挙げられる。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉで頻用される相同組換えを利用した方法としては、例えば、ラムダファージの相同組換え系を利用して、組換え体ＤＮＡを導入する方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，６６４０－６６４５（２０００）］が挙げられる。
　さらに、組換え体ＤＮＡと共に染色体上に組み込まれた枯草菌レバンシュークラーゼによって大腸菌がスクロース感受性となることを利用した選択法や、ストレプトマイシン耐性の変異ｒｐｓＬ遺伝子を有する大腸菌に野生型ｒｐｓＬ遺伝子を組み込むことによって大腸菌がストレプトマイシン感受性となることを利用した選択法［Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５５，１３７（２００５）、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７１，２９０５（２００７）］等を用いて、宿主細胞の染色体ＤＮＡ上の目的の領域が組換え体ＤＮＡに置換された大腸菌を取得できる。
　該組換え体ＤＮＡが、親株において自律複製可能なプラスミドとして導入されたこと、または親株の染色体中に組み込まれたことは、例えば、微生物が元来、染色体ＤＮＡ上に有する該遺伝子を増幅することはできないが、形質転換により導入された該遺伝子は増幅可能なプライマーセットを用いてＰＣＲにより増幅産物を確認する方法等により確認できる。また、該ＤＮＡの転写量若しくは該ＤＮＡがコードする蛋白質の生産量が増大したことは、該微生物の該遺伝子の転写量をノーザン・ブロッティングにより、または該微生物の該蛋白質の生産量をウェスタン・ブロッティングにより、親株のそれと比較する方法等により確認できる。
　上記の方法で造成した微生物が、上記［１］～［６］のいずれか１に記載の蛋白質の活性が増強され、かつ親株に比べてルイスＸ骨格を有するオリゴ糖の生産性が向上した微生物であることは、該微生物の培養後、培養液を適宜希釈後に遠心分離し、上清又は菌体内に含まれるルイスＸ骨格を有するオリゴ糖を後述の糖分析装置または高速液体クロマトグラフ質量分析計にて分析することにより、親株のそれと比較することにより確認できる。また、本明細書において「ルイスＸ骨格を有するオリゴ糖の生産性」とは、微生物が生産したルイスＸ骨格を有するオリゴ糖を菌体内及び／又は菌体外に蓄積する該微生物の能力のことをいう。
　上記した微生物は、親株よりも上記［１］～［６］のいずれか１に記載の蛋白質の活性が増強していることにより、基質のＮ－アセチルグルコサミン部位へ選択的にフコースを転移し、ルイスＸ骨格を有するオリゴ糖の生産性を向上し得る。このような微生物としては、例えば、実施例において後述するＦｕｃＴ１遺伝子の発現を強化したＴＲＯＳ／ｐＰｇｓＦｕｃＴ１またはＦＵＣ／ｐＰｇｓＦｕｃＴ１株、ＦｕｃＴ－Ｄ遺伝子の発現を強化したＦＵＣ／ｐＦｕｃＴ－Ｄ株、ＦｕｃＴ－Ａ遺伝子の発現を強化したＦＵＣ／ｐＦｕｃＴ－Ａ株、またはＦｕｃＴ－Ｅ遺伝子の発現を強化したＦＵＣ／ｐＦｕｃＴ－Ｅ株が挙げられる。
　このような微生物の例である、ＦｕｃＴ１蛋白質、ＦｕｃＴ－Ｄ蛋白質、ＦｕｃＴ－Ａ蛋白質またはＦｕｃＴ－Ｅ蛋白質の活性を増強した微生物では、Ｎ－アセチルグルコサミン部位へ選択的にフコースを転移できるα１，３－フコーストランスフェラーゼ活性が増強され、ルイスＸ骨格を有するオリゴ糖の生産性を向上させることができる。
２．オリゴ糖の製造方法
　本発明のオリゴ糖の製造方法（以下、本発明の方法とも略す）としては、以下の方法が挙げられる。
　１．で上記した微生物を調製すること、および当該微生物を用いて培養物中にオリゴ糖を生成することを含む、オリゴ糖の製造方法。
　本発明の方法において、前記所望のオリゴ糖は、ルイスＸ骨格を有するオリゴ糖であることが好ましく、ＬＮＦＰＩＩＩ骨格を有するオリゴ糖またはＰａｒａ－ＬＮｎＨ骨格に含まれる少なくとも１のＮ－アセチルグルコサミンの３位にＬ－フコースがα１，３－結合したオリゴ糖であることがさらに好ましい。
　本発明の方法において、前記所望のオリゴ糖が前記ＬＮＦＰＩＩＩ骨格を有するオリゴ糖である場合は、前記オリゴ糖はＬＮＦＰＩＩＩおよびＬＮｎＤＦＨＩＩの少なくとも一方であることが好ましい。
　本発明の方法において、前記所望のオリゴ糖が前記Ｐａｒａ－ＬＮｎＨ骨格に含まれる少なくとも１のＮ－アセチルグルコサミンの３位にＬ－フコースがα１，３－結合したオリゴ糖である場合は、図３に示す構造のオリゴ糖が挙げられる。
　１．で上記した微生物を培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
　該微生物を培養する培地としては、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地と合成培地のいずれを用いてもよい。
　炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプン若しくはデンプン加水分解物等の糖、酢酸若しくはプロピオン酸等の有機酸、又は、グリセロール、エタノール若しくはプロパノール等のアルコール類等が挙げられる。
　窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム又はリン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕、大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物等が挙げられる。
　無機塩としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。
　オリゴ糖の製造方法に用いる本発明の微生物として、グルコース、ラクトース、またはラクトース一水和物等を生成する能力を有する微生物を用いてもよい。
　オリゴ糖の製造方法において、培養中に、グルコース、ラクトースまたはラクトース一水和物等を培地に添加してもよい。
　オリゴ糖の製造方法に用いる本発明の微生物が、ルイスＸ骨格を有するオリゴ糖の基質であるＧＤＰ－フコース及び／又は受容体糖質を生成する能力を有していない場合は、ＧＤＰ－フコースや受容体糖質を培地に添加してもよい。
　また、オリゴ糖の製造方法において、培養中に、グルコース、ラクトース、ラクトース一水和物、または受容体糖質等を培地に添加する代わりに、糖からグルコース、ラクトース、ラクトース一水和物、または受容体糖質等を生成する能力を有する微生物を、本発明の微生物と同時に培養することにより、本発明の微生物にグルコース、ラクトース、またはラクトース一水和物、または受容体糖質等を供給してもよい。
　オリゴ糖の製造方法において、培地中にはβ－ガラクトシダーゼおよびＷｃａＪが存在しないことが好ましい。
　培養は、通常、振盪培養、深部通気撹拌培養またはジャーファーメンター等の好気的条件下で行うことが好ましい。培養温度は、通常３０～３７℃であり、培養時間は、通常２４時間～３日間である。培養中の培養液ｐＨは、通常６．０～８．０に保持する。ｐＨの調整は、無機又は有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
　上記の培養により、培養物中にオリゴ糖を生成することにより、オリゴ糖を製造できる。
　通常、該培養物の遠心分離後、上清よりオリゴ糖を採取できる。なお、菌体内にオリゴ糖が蓄積する場合には、例えば菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清からイオン交換樹脂法などによって、オリゴ糖を採取できる。
　また、培養物中のオリゴ糖又は採取したオリゴ糖に、さらに他の糖を付加することにより目的のオリゴ糖を製造することもできる。
［分析例］
（１）ＬＮＦＰＩＩＩ、３ＦＬ、ＬＮＦＰＶＩ又はラクトースの分析、定量
　実施例において、ＬＮＦＰＩＩＩ、３ＦＬ、ＬＮＦＰＶＩ又はラクトースの分析、定量は以下に示す手順で行った。
　培養後の微生物を含む培養液を遠心分離し、上清を回収した。また、沈殿菌体を元培養液と同量の水で懸濁し、さらに等量のクロロホルムを加えて菌体破砕した後に遠心分離し、上清水相を菌体内画分とした。該上清及び／又は菌体内画分に含まれるＬＮＦＰＩＩＩ、３ＦＬ、ＬＮＦＰＶＩ又はラクトースを糖分析装置ＩＣＳ－５０００（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）にて分析した。
［分析条件］
カラム：ＣａｒｂｏＰＡＣ　ＰＡ１
カラム温度：２５℃
移動相：
　　（移動相Ａ）水
　　（移動相Ｂ）５００ｍｍｏｌ／Ｌ　水酸化ナトリウム
　　（移動相Ｃ）３００ｍｍｏｌ／Ｌ　酢酸ナトリウム
移動相Ａ、移動相Ｂ及び移動相Ｃ混合比：
　　（０～１０分）８０：２０：０
　　（１０～１８分）８０：２０：０から７０：２０：１０の勾配
　　（１８～３５分）７０：２０：１０から０：２０：８０の勾配
　　（３５～４０分）０：２０：８０
　　（４０～５０分）８０：２０：０
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出器：パルスドアンペロメトリー検出器
（２）ＬｅｗｉｓＸ又はＬＮｎＤＦＨＩＩの分析、定量
　実施例において、ＬｅｗｉｓＸ又はＬＮｎＤＦＨＩＩの分析、定量は以下に示す手順で行った。
　上記（１）と同様に、培養後の微生物を含む培養液から上清及び／又は菌体内画分を調製した。該上清及び／又は菌体内画分に含まれるＬｅｗｉｓＸ又はＬＮｎＤＦＨＩＩをＵＦＬＣ＆ＬＣＭＳ－８０４０（ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製）にて分析した。
［分析条件］
カラム：Ｃｏｒｅｇｅｌ　８７Ｈ３（７．８×３００ｍｍ）
カラム温度：４０℃
移動相：０．１％ギ酸水
グラジエント条件：イソクラティック溶離
分析時間：２５分間
流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
注入量：１０μＬ
検出：ＳＩＭモード　
　以下に発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
［実施例１］ＬＮＦＰＩＩＩ生産に有用なα１，３－フコシルトランスフェラーゼの取得
　３ＦＬ又はＬｅｗｉｓＸの生産性を指標として、Ｎ－アセチルラクトサミンに対して高い基質特異性を示すα１，３－フコシルトランスフェラーゼをスクリーニングした。
（１）評価用宿主株の造成
＜遺伝子欠損の際にマーカーとして用いるＤＮＡ断片の取得＞
　配列番号３３及び３４で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、ｐＣａｔＳａｃ（Ａｐｐｌ　Ｅｎｖｉｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（２０１３）７９，３０３３－３０３９）を鋳型としてＰＣＲを行い、クロラムフェニコール耐性ｃａｔ遺伝子およびスクロース感受性ｓａｃＢ遺伝子を含む、ｃａｔ－ｓａｃＢ断片を得た。
＜β－ガラクトシダーゼ活性、ラクトースパーミアーゼ活性、及びコラン酸合成活性が喪失した大腸菌の造成＞
　β－ガラクトシダーゼをコードするＤＮＡ（以下、ｌａｃＺ遺伝子という。）、ラクトースパーミアーゼをコードするＤＮＡ（以下、ｌａｃＹ遺伝子という。）、及びコラン酸生成関連蛋白質をコードするＤＮＡ（以下、ｗｃａＪ、ｗｚｘＣ、ｗｃａＫ、ｗｃａＬ又はｗｃａＭ遺伝子という。）を欠損した大腸菌を、以下の方法で造成した。なお、ｌａｃＺ及びｌａｃＹ（以下、ｌａｃＺＹという。）、ならびに、ｗｃａＪ、ｗｚｘＣ、ｗｃａＫ、ｗｃａＬ及びｗｃａＭ（以下、ｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭという。）は大腸菌ゲノム上でそれぞれオペロンを形成している。
　常法により調製したエシェリヒア・コリ　Ｗ３１１０株のゲノムＤＮＡを鋳型として、表１の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、各ＤＮＡ断片を増幅した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　ｌａｃＺ上流１およびｌａｃＺ上流２は、ｌａｃＺ遺伝子の開始コドンから開始コドンの上流約１０００ｂｐまでの領域を含む。ｌａｃＹ下流１およびｌａｃＹ下流２は、ｌａｃＹ遺伝子の終止コドン下流約５０ｂｐから約１０００ｂｐまでの領域を含む。
　ｌａｃＺ上流１、ｌａｃＹ下流１、およびｃａｔ－ｓａｃＢ断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号３６及び３８で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｌａｃＺ及びｌａｃＹ遺伝子周辺領域の配列にｃａｔ－ｓａｃＢ断片が挿入された配列からなるＤＮＡ（以下、ｌａｃＺＹ：：ｃａｔ－ｓａｃＢという。）断片を得た。
　ｌａｃＺ上流２およびｌａｃＹ下流２を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号３６及び３８で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｌａｃＺＹを含まず、ｌａｃＺ上流とｌａｃＹ下流が直接連結した配列からなるＤＮＡ（以下、ΔｌａｃＺＹという。）断片を得た。
　ｌａｃＺＹ：：ｃａｔ－ｓａｃＢ断片を、λリコンビナーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドｐＫＤ４６［Ｄａｔｓｅｎｋｏ，Ｋ．Ａ．，Ｗａｒｎｅｒ，Ｂ．Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９７，６６４０－６６４５（２０００）］を保持するＷ３１１０株に、エレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール耐性かつシュクロース感受性を示した形質転換体（ｌａｃＺＹ遺伝子がｌａｃＺＹ：：ｃａｔ－ｓａｃＢに置換した形質転換体）を得た。
　ΔｌａｃＺＹ断片を、当該形質転換体にエレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール感受性かつシュクロース耐性を示す形質転換体（ｌａｃＺＹ：：ｃａｔ－ｓａｃＢがΔｌａｃＺＹに置換した形質転換体）を得た。それらのうちからさらに、アンピシリン感受性を示す形質転換体（ｐＫＤ４６が脱落した形質転換体）を得た。当該形質転換体をＷ３１１０ΔｌａｃＺＹと命名した。
　同様に、Ｗ３１１０株のゲノムＤＮＡを鋳型として、表２の「プライマーセット」で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、各増幅ＤＮＡ断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　ｗｃａＪ上流１およびｗｃａＪ上流２は、ｗｃａＪ遺伝子の開始コドンから開始コドン上流約１０００ｂｐまでの領域を含む。ｗｃａＭ下流１およびｗｃａＭ下流２は、ｗｃａＭ遺伝子の終止コドンから終止コドン下流約１０００ｂｐまでの領域を含む。
　ｗｃａＪ上流１、ｗｃａＭ下流１およびｃａｔ－ｓａｃＢ断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号４２及び４４で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭオペロン周辺領域の配列にｃａｔ－ｓａｃＢ断片が挿入された配列からなるＤＮＡ（以下、ｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭ：：ｃａｔ－ｓａｃＢという。）断片を得た。
　ｗｃａＪ上流２およびｗｃａＭ下流２を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号４２及び４４で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭを含まず、ｗｃａＪ上流とｗｃａＭ下流が直接連結した配列からなるＤＮＡ（以下、ΔｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭという。）断片を得た。
　ｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭ：：ｃａｔ－ｓａｃＢ断片を、上記で造成したＷ３１１０ΔｌａｃＺＹ株に、エレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール耐性、かつシュクロース感受性を示した形質転換体（ｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭがｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭ：：ｃａｔ－ｓａｃＢに置換した形質転換体）を得た。
　ΔｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭ断片を、当該形質転換体にエレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール感受性かつシュクロース耐性を示す形質転換体（ｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭ：：ｃａｔ－ｓａｃＢがΔｙｈｂＪに置換した形質転換体）を得た。さらに、アンピシリン感受性を示す形質転換体（ｐＫＤ４６が脱落した形質転換体）を得た。当該形質転換体をＷ３１１０ΔｌａｃＺＹΔｗｃａＪＭ株と命名した。
＜トランスポーター遺伝子の発現を強化した微生物の造成＞
　配列番号２８で表されるアミノ酸配列からなるＷ３１１０株由来のドラッグ：Ｈ＋アンチポーター－１ファミリーに属するトランスポーター遺伝子（以下、ＭｄｆＡという。）をコードする遺伝子発現用プラスミドを有する大腸菌を、以下の方法で造成した。
　配列番号４７及び４８で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、常法により調製したＷ３１１０株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ｍｄｆＡ断片を得た。配列番号４９及び５０で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、プラスミドｐＭＷ１１８（ニッポンジーン社製）を鋳型にＰＣＲを行い、約４．１ｋｂのベクター断片を得た。配列番号４７及び４９、配列番号４８及び５０で表される塩基配列は、それぞれの５’末端に相補的な配列を含む。
　上記で得られたｍｄｆＡ断片とベクター断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて連結することにより、ＭｄｆＡ発現プラスミドｐＭＷ１１８＿ｍｄｆＡを得た。上記、発現プラスミドｐＭＷ１１８＿ｍｄｆＡを用いて、実施例１（１）で造成したＷ３１１０ΔｌａｃＺＹΔｗｃａＪＭ株を形質転換することで、ｐＭＷ１１８＿ｍｄｆＡを有する大腸菌を造成し、ＦＵＣ株と命名した。
（２）α１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する微生物の造成
　ｕｓｐＡプロモーター下に各種α１，３－フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を配置した、該遺伝子発現用プラスミドを有する大腸菌を、以下の方法で造成した。
＜発現ベクターの造成＞
　常法により調製したＷ３１１０株のゲノムＤＮＡを鋳型として、表３の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、各増幅ＤＮＡ断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　ｒｃｓＡ断片及びｌａｃＹ断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号５３及び５６で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、２断片を連結したＤＮＡ（以下、ｒｃｓＡ－ｌａｃＹという。）断片を得た。
　配列番号５１及び５２で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、プラスミドｐＵＡＫＱＥ３１（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００７，７３：６３７８－６３８５）を鋳型にＰＣＲを行い、約４．７ｋｂのベクター断片を得た。
　配列番号５１及び５３、配列番号５２及び５６で表される塩基配列は、それぞれの５’末端に相補的な配列を含む。
　上記で得られたｒｃｓＡ－ｌａｃＹ断片とベクター断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて連結することにより、発現ベクターｐＵＡＫＱＥ－ｒｃｓＡ－ｌａｃＹを得た。
＜α１，３－フコシルトランスフェラーゼ発現用プラスミドの造成＞
　表４の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、表４の「鋳型」に記載されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、各増幅ＤＮＡ断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　各種ゲノムＤＮＡは常法により調製した。配列番号３で表されるＤＮＡは、配列番号４で表されるＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ　２６６９５株由来α１，３－フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の塩基配列であり、人工合成により調製した。配列番号１５で表されるＤＮＡは、配列番号１６で表されるＭｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａ　ｓｐ．Ａｎ２０株由来α１，３－フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を、大腸菌で発現させるためにコドン最適化したＤＮＡであり、人工合成により調製した。
　上述の方法にて造成した発現ベクターｐＵＡＫＱＥ－ｒｃｓＡ－ｌａｃＹを鋳型として、配列番号５１及び５７で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、約６．７ｋｂのベクター断片を得た。
　配列番号５１、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０及び７２、配列番号５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１及び７３で表される塩基配列は、それぞれの５’末端に相補的な配列を含む。
　上記で得られた各種増幅ＤＮＡ断片とベクター断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて連結することにより、各種α１，３－フコシルトランスフェラーゼを発現するプラスミド、ｐＨｐＦｕｔＡ、ｐＢｎＦｕｃＴ、ｐＢｓＦｕｃＴ、ｐＰｇｓＦｕｃＴ１、ｐＰｇｓＦｕｃＴ２、ｐＢｆＦｕｃＴ１、ｐＢｆＦｕｃＴ２及びｐＭＦｕｃＴを造成した。
＜α１，３－フコシルトランスフェラーゼ発現用プラスミドを有する大腸菌の造成＞
　上記で得られたα１，３－フコシルトランスフェラーゼ発現用プラスミド、ｐＨｐＦｕｔＡ、ｐＢｎＦｕｃＴ、ｐＢｓＦｕｃＴ、ｐＰｇｓＦｕｃＴ１、ｐＰｇｓＦｕｃＴ２、ｐＢｆＦｕｃＴ１、ｐＢｆＦｕｃＴ２及びｐＭＦｕｃＴ、並びに、ベクターコントロールとしてｐＵＡＫＱＥ－ｒｃｓＡ－ｌａｃＹを用い、実施例１（１）で造成したＦＵＣ株を形質転換することで、各種プラスミドを有する大腸菌を造成し、それぞれＦＵＣ／ｐＨｐＦｕｔＡ株、ＦＵＣ／ｐＢｎＦｕｃＴ株、ＦＵＣ／ｐＢｓＦｕｃＴ株、ＦＵＣ／ｐＰｇｓＦｕｃＴ１株、ＦＵＣ／ｐＰｇｓＦｕｃＴ２株、ＦＵＣ／ｐＢｆＦｕｃＴ１株、ＦＵＣ／ｐＢｆＦｕｃＴ２株、ＦＵＣ／ｐＭＦｕｃＴ株及びＦＵＣ／Ｃｔｒｌ株と命名した。
（３）３ＦＬ又はＬｅｗｉｓＸの生産性評価
　上記（２）で得られたＦＵＣ／ｐＨｐＦｕｔＡ株、ＦＵＣ／ｐＢｎＦｕｃＴ株、ＦＵＣ／ｐＢｓＦｕｃＴ株、ＦＵＣ／ｐＰｇｓＦｕｃＴ１株、ＦＵＣ／ｐＰｇｓＦｕｃＴ２株、ＦＵＣ／ｐＢｆＦｕｃＴ１株、ＦＵＣ／ｐＢｆＦｕｃＴ２株、ＦＵＣ／ｐＭＦｕｃＴ株及びＦＵＣ／Ｃｔｒｌ株について、３ＦＬ又はＬｅｗｉｓＸの生産性を評価した。３ＦＬ及びＬｅｗｉｓＸの生合成経路を図５に示す。
　各菌株をそれぞれ１００ｍｇ／Ｌのカナマイシン及び１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢプレート上で３７℃にて１７時間培養し、１００ｍｇ／Ｌのカナマイシン及び１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地２ｍＬが入ったプラスチック製の１４ｍＬチューブに植菌して３０℃で１５時間、振盪培養した。その後、得られた培養液を１００ｍｇ／Ｌのカナマイシン及び１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含む生産培地［グルコース３０ｇ／Ｌ、ラクトース一水和物又はＮ－アセチルラクトサミン１０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物２ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１６ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１４ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２ｇ／Ｌ、クエン酸１ｇ／Ｌ、カザミノ酸５ｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩１０ｍｇ／Ｌ、硫酸第一鉄七水和物５０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン五水和物１０ｍｇ／Ｌ（グルコース、ラクトース一水和物、Ｎ－アセチルラクトサミン及び硫酸マグネシウム七水和物以外については、水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ　７．２に調整した後オートクレーブした）（グルコース、ラクトース一水和物、Ｎ－アセチルラクトサミン及び硫酸マグネシウム七水和物含有水溶液は別途調製した後オートクレーブし、それぞれ冷却後、混合した）］が４ｍＬ入った大型試験管に０．２ｍＬ植菌し、３０℃で２９時間振盪培養した。培養開始６．５時間後にはＩＰＴＧを終濃度１ｍＭとなるよう添加した。
　３ＦＬの生産性を評価する場合には、ラクトース一水和物を含む生産培地、ＬｅｗｉｓＸの生産性を評価する場合には、Ｎ－アセチルラクトサミン１０ｇ／Ｌを含む生産培地をそれぞれ使用した。
　培養終了後、培養液を遠心分離後に適宜希釈し、上清に含まれる３ＦＬ又はＬｅｗｉｓＸを糖分析装置ＩＣＳ－５０００又はＵＦＬＣ＆ＬＣＭＳ－８０４０にて分析した。結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　ほとんどの株で３ＦＬ、ＬｅｗｉｓＸいずれも生産できる若しくはいずれも生産できない結果であったが、ＦＵＣ／ｐＰｇｓＦｕｃＴ１株のみ、ＬｅｗｉｓＸを顕著に生産できる一方で３ＦＬは全く生産されなかった。このことから、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｇｏｌｄｓｔｅｉｎｉｉ由来のα１，３－フコシルトランスフェラーゼＰｇｓＦｕｃＴ１は、Ｎ－アセチルラクトサミンに対して高い基質特異性を示し、ラクトースは基質として利用できないことが示唆された。
　上記結果を踏まえ、ＬＮＦＰＩＩＩ生産のためのα１，３－フコシルトランスフェラーゼとしてＰｇｓＦｕｃＴ１を選定し、以下の試験に供することとした。
［実施例２］ＰｇｓＦｕｃＴ１ホモログ遺伝子の評価
　実施例１で選定したＰｇｓＦｕｃＴ１のホモログ遺伝子について、ＬＮＦＰＩＩＩ生産における有用性を評価した。
（１）ＰｇｓＦｕｃＴ１のホモログ遺伝子を有する微生物の造成
　ＰｇｓＦｕｃＴ１のホモログ遺伝子を有する大腸菌を、以下の方法で造成した。ＰｇｓＦｕｃＴ１のホモログ遺伝子としては、配列番号１７～２６で表される５種の遺伝子を使用した。各ホモログ遺伝子がコードするアミノ酸配列のアライメントを図４に示す。
　表６の「鋳型」に記載されたＤＮＡを鋳型として、表６の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、各ＤＮＡ断片を増幅した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　配列番号１７で表されるＤＮＡは、配列番号１８で表されるＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｓｐ．ＢＸ２株由来α１，３－フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の塩基配列であり、人工合成により調製した。配列番号１９で表されるＤＮＡは、配列番号２０で表されるＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｓｐ．ＨＧＳ００２５株由来α１，３－フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の塩基配列であり、人工合成により調製した。配列番号２１で表されるＤＮＡは、配列番号２２で表されるＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｂｏｕｃｈｅｓｄｕｒｈｏｎｅｎｓｉｓ　ｓｔｒａｉｎ　Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ－Ｐ３７６３株由来α１，３－フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の塩基配列であり、人工合成により調製した。配列番号２３で表されるＤＮＡは、配列番号２４で表されるＧｒａｍｅｌｌａ　ｓｐ．ＢＯＭ４株由来α１，３－フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の塩基配列であり、人工合成により調製した。配列番号２５で表されるＤＮＡは、配列番号２６で表されるＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ＮＬＡＥ－ｚｌ－Ｇ２３１株由来α１，３－フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の塩基配列であり、人工合成により調製した。
　このとき、配列番号５１、７４、７６、７８、８０及び８２、配列番号５７、７５、７７、７９、８１及び８３で表される塩基配列は、それぞれの５’末端に相補的な配列を含む。
　上記で得られた各種増幅ＤＮＡ断片と、実施例１で調製したｐＵＡＫＱＥ－ｒｃｓＡ－ｌａｃＹベクター断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて連結することにより、各種ホモログ遺伝子を発現するプラスミド、ｐＦｕｃＴ－Ａ、ｐＦｕｃＴ－Ｂ、ｐＦｕｃＴ－Ｃ、ｐＦｕｃＴ－Ｄ及びｐＦｕｃＴ－Ｅを造成した。
　上記で得られた５種のプラスミドを用い、実施例１（１）で造成したＦＵＣ株を形質転換することで、各種プラスミドを有する大腸菌を造成し、それぞれＦＵＣ／ｐＦｕｃＴ－Ａ株、ＦＵＣ／ｐＦｕｃＴ－Ｂ株、ＦＵＣ／ｐＦｕｃＴ－Ｃ株、ＦＵＣ／ｐＦｕｃＴ－Ｄ株及びＦＵＣ／ｐＦｕｃＴ－Ｅ株と命名した。
（２）３ＦＬ又はＬｅｗｉｓＸの生産性評価
　上記（１）で得たＦＵＣ／ｐＦｕｃＴ－Ａ株、ＦＵＣ／ｐＦｕｃＴ－Ｂ株、ＦＵＣ／ｐＦｕｃＴ－Ｃ株、ＦＵＣ／ｐＦｕｃＴ－Ｄ株及びＦＵＣ／ｐＦｕｃＴ－Ｅ株について、３ＦＬ又はＬｅｗｉｓＸの生産性を評価した。コントロールとして、実施例１（２）で造成したＦＵＣ／ｐＰｇｓＦｕｃＴ１株およびＦＵＣ／Ｃｔｒｌ株を使用した。
　培養方法、培養条件は、実施例１（３）に記載の方法に従った。培養終了後、培養液を遠心分離後に適宜希釈し、上清に含まれる３ＦＬ又はＬｅｗｉｓＸを糖分析装置ＩＣＳ－５０００又はＵＦＬＣ＆ＬＣＭＳ－８０４０にて分析した。結果を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　その結果、各ホモログ遺伝子を有する株はいずれもＰｇｓＦｕｃＴ１よりもＬｅｗｉｓＸ生産性が低いものの、いずれの株も３ＦＬ生産性を示さなかったことから、各ホモログ遺伝子によりコードされる蛋白質は、ＰｇｓＦｕｃＴ１と同様にラクトースを基質として利用できないことが示唆された。
［実施例３］有効変異点の特定
　既知のＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ由来α１，３－フコシルトランスフェラーゼは、結晶構造が開示されており、Ｎ－アセチルラクトサミンとの相互作用に関わるアミノ酸残基が予測されている（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２００７，　２８２，　９９７３－９９８２）。これを参考に、実施例１にて高いＬｅｗｉｓＸ生産性を示したＰｇｓＦｕｃＴ１及びＢｆＦｕｃＴ１について、アライメントによりＮ－アセチルラクトサミンと相互作用するアミノ酸残基を特定した。特定したアミノ酸残基を、ＰｇｓＦｕｃＴ１とＢｆＦｕｃＴ１との対応するアミノ酸残基で相互に置換した配列について、ＬＮＦＰＩＩＩ生産における有効性を評価した。
（１）変異型ＰｇｓＦｕｃＴ１及び変異型ＢｆＦｕｃＴ１を有する微生物の造成
　変異型ＰｇｓＦｕｃＴ１及び変異型ＢｆＦｕｃＴ１を有する大腸菌を、以下の方法で造成した。ＰｇｓＦｕｃＴ１、ＢｆＦｕｃＴ及びＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ由来α１，３－フコシルトランスフェラーゼをコードするアミノ酸配列のアライメントを図６に示す。
　表８の「鋳型」に記載されたＤＮＡを鋳型として、表８の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、各ＤＮＡ断片を増幅した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　ＰｇｓＦｕｃＴ１　Ｎ１７Ｄ上流およびＰｇｓＦｕｃＴ１　Ｎ１７Ｄ下流断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号６４及び６５で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、配列番号２で表されるＰｇｓＦｕｃＴ１のアミノ酸配列の１７番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換された、ＰｇｓＦｕｃＴ１　Ｎ１７Ｄ断片を得た。
　同様に、ＰｇｓＦｕｃＴ１　Ｓ９３Ｌ上流およびＰｇｓＦｕｃＴ１　Ｓ９３Ｌ下流断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号６４及び６５で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、配列番号２で表されるＰｇｓＦｕｃＴ１のアミノ酸配列の９３番目のセリンがロイシンに置換された、ＰｇｓＦｕｃＴ１　Ｓ９３Ｌ断片を得た。
　同様に、ＢｆＦｕｃＴ１　Ｄ２８Ｎ上流およびＢｆＦｕｃＴ１　Ｄ２８Ｎ下流断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号６８及び６９で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、配列番号１２で表されるＢｆＦｕｃＴ１のアミノ酸配列の２８番目のアスパラギン酸がアスパラギンに置換された、ＢｆＦｕｃＴ１　Ｄ２８Ｎ断片を得た。
　同様に、ＢｆＦｕｃＴ１　Ｌ１０４Ｓ上流およびＢｆＦｕｃＴ１　Ｌ１０４Ｓ下流断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号６８及び６９で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、配列番号１２で表されるＢｆＦｕｃＴ１のアミノ酸配列の１０４番目のロイシンがセリンに置換された、ＢｆＦｕｃＴ１　Ｌ１０４Ｓ断片を得た。
　上記で得られた各断片と、実施例１で調製したｐＵＡＫＱＥ－ｒｃｓＡ－ｌａｃＹベクター断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて連結することにより、各変異断片を発現するプラスミド、ｐＰｇｓＦｕｃＴ１＿Ｎ１７Ｄ、ｐＰｇｓＦｕｃＴ１＿Ｓ９３Ｌ、ｐＢｆＦｕｃＴ１＿Ｄ２８Ｎ及びｐＢｆＦｕｃＴ１＿Ｌ１０４Ｓを造成した。
　上記で得られた４種のプラスミドを用い、実施例１（３）で造成したＦＵＣ株を形質転換することで、各種プラスミドを有する大腸菌を造成し、それぞれＦＵＣ／ｐＰｇｓＦｕｃＴ１＿Ｎ１７Ｄ株、ＦＵＣ／ｐＰｇｓＦｕｃＴ１＿Ｓ９３Ｌ株、ＦＵＣ／ｐＢｆＦｕｃＴ１＿Ｄ２８Ｎ株、ＦＵＣ／ｐＢｆＦｕｃＴ１＿Ｌ１０４Ｓ株と命名した。
（２）３ＦＬ又はＬｅｗｉｓＸの生産性評価
　上記（１）で得たＦＵＣ／ｐＰｇｓＦｕｃＴ１＿Ｎ１７Ｄ株、ＦＵＣ／ｐＰｇｓＦｕｃＴ１＿Ｓ９３Ｌ株、ＦＵＣ／ｐＢｆＦｕｃＴ１＿Ｄ２８Ｎ株、ＦＵＣ／ｐＢｆＦｕｃＴ１＿Ｌ１０４Ｓ株について、３ＦＬ又はＬｅｗｉｓＸの生産性を評価した。コントロールとして、実施例１（２）で造成したＦＵＣ／ｐＰｇｓＦｕｃＴ１株、ＦＵＣ／ｐＢｆＦｕｃＴ１株およびＦＵＣ／Ｃｔｒｌ株を使用した。
　培養方法、培養条件は、実施例１（３）に記載の方法に従った。培養終了後、培養液を遠心分離後に適宜希釈し、上清に含まれる３ＦＬ又はＬｅｗｉｓＸを糖分析装置ＩＣＳ－５０００又はＵＦＬＣ＆ＬＣＭＳ－８０４０にて分析した。結果を表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　ＦＵＣ／ｐＰｇｓＦｕｃＴ１＿Ｎ１７Ｄ株は、野生型ＰｇｓＦｕｃＴ１を有するＦＵＣ／ｐＰｇｓＦｕｃＴ１株と比較してＬｅｗｉｓＸの生産量が約２倍に増加したものの、３ＦＬが微量に検出された。一方、ＦＵＣ／ｐＰｇｓＦｕｃＴ１＿Ｓ９３Ｌ株は、ＬｅｗｉｓＸ及び３ＦＬいずれも検出されなかった。
　ＦＵＣ／ｐＢｆＦｕｃＴ１＿Ｄ２８Ｎ株およびＦＵＣ／ｐＢｆＦｕｃＴ１＿Ｌ１０４Ｓ株は、野生型ＢｆＦｕｃＴ１を有するＦＵＣ／ｐＢｆＦｕｃＴ１株と比較してＬｅｗｉｓＸの生産量が大きく低下し、ＬｅｗｉｓＸに対する相対的な３ＦＬ生成量の低下が見られた。
　以上の結果から、ＰｇｓＦｕｃＴ１のアミノ酸配列における１７番目のアスパラギン残基、若しくは、ＢｆＦｕｃＴ１のアミノ酸配列における２８番目のアスパラギン酸残基又は１０４番目のロイシン残基を他のアミノ酸に置換することで、ラクトースやＮ－アセチルラクトサミンに対する基質特異性を改変できることが示唆された。
［実施例４］ＬＮＦＰＩＩＩの生産に用いる微生物の造成
　ｌａｃプロモーター下に、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ由来のβ１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ（以下、ＨｐｇａｌＴという。）をコードする遺伝子及びＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｅａ由来のβ１，３－Ｎ－アセチルグルコサミントランスフェラーゼ（以下、ＮｐｌｇｔＡという。）をコードする遺伝子を配置した、該遺伝子発現用プラスミドを有する大腸菌を、以下の方法で造成した。
　表１０の「鋳型」に記載されたＤＮＡを鋳型として、表１０の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、各ＤＮＡ断片を増幅した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ　ＮＣＴＣ１１６３７株のゲノムＤＮＡは常法により調製した。配列番号３１で表されるＤＮＡは、配列番号３２で表されるＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｅａ　ＡＴＣＣ４３７６８株由来β１，３－Ｎ－アセチルグルコサミントランスフェラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を、大腸菌で発現させるためにコドン最適化したＤＮＡであり、人工合成により調製した。また、配列番号９５及び９６で表される塩基配列は、それぞれの５’末端に相補的な配列を含む。
　ＨｐｇａｌＴ断片及びＮｐｌｇｔＡ断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号９４及び９７で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ＨｐｇａｌＴ断片及びＮｐｌｇｔＡ断片を連結したＤＮＡ（以下、ＨｐｇａｌＴ－ＮｐｌｇｔＡという。）断片を得た。
　配列番号９２及び９３で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、プラスミドｐＳＴＶ２９（タカラバイオ社製）を鋳型にＰＣＲを行い、約２．９ｋｂのベクター断片を得た。配列番号９２及び９４、配列番号９３及び９７で表される塩基配列は、それぞれの５’末端に相補的な配列を含む。
　上記で得られたＨｐｇａｌＴ－ＮｐｌｇｔＡ断片とベクター断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて連結することにより、発現プラスミドｐＳＴＶ＿ＨｐｇａｌＴ－ＮｐｌｇｔＡを得た。
　上記、発現プラスミドｐＳＴＶ＿ＨｐｇａｌＴ－ＮｐｌｇｔＡを用いて、実施例１（２）で造成したＷ３１１０ΔｌａｃＺＹΔｗｃａＪＭ株を形質転換することで、ｐＳＴＶ＿ＨｐｇａｌＴ－ＮｐｌｇｔＡを有する大腸菌を造成し、ＴＲＯＳ株と命名した。
　実施例１（２）で造成したｐＨｐＦｕｔＡ、ｐＰｇｓＦｕｃＴ１、ｐＢｆＦｕｃＴ１及びｐＵＡＫＱＥ－ｒｃｓＡ－ｌａｃＹプラスミドを用いて、上記ＴＲＯＳ株を形質転換し、それぞれＴＲＯＳ／ｐＨｐＦｕｔＡ、ＴＲＯＳ／ｐＰｇｓＦｕｃＴ１、ＴＲＯＳ／ｐＢｆＦｕｃＴ１、及びＴＲＯＳ／Ｃｔｒｌ株を取得した。
［実施例５］ＬＮＦＰＩＩＩの製造
　実施例４で得られたＴＲＯＳ／ｐＨｐＦｕｔＡ、ＴＲＯＳ／ｐＰｇｓＦｕｃＴ１、ＴＲＯＳ／ｐＢｆＦｕｃＴ１、及びＴＲＯＳ／Ｃｔｒｌ株について、ＬＮＦＰＩＩＩ及び副生糖の生産性を評価した。
　各菌株をそれぞれ１００ｍｇ／Ｌのカナマイシン及び２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢプレート上で３７℃にて１８時間培養し、１００ｍｇ／Ｌのカナマイシン及び２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地２ｍＬが入ったプラスチック製の１４ｍＬチューブに植菌して３０℃で１５時間、振盪培養した。その後、得られた培養液を１００ｍｇ／Ｌのカナマイシン及び２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含む生産培地［グルコース３０ｇ／Ｌ、ラクトース一水和物１０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物２ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１６ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１４ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２ｇ／Ｌ、クエン酸１ｇ／Ｌ、カザミノ酸５ｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩１０ｍｇ／Ｌ、硫酸第一鉄七水和物５０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン五水和物１０ｍｇ／Ｌ（グルコース、ラクトース一水和物及び硫酸マグネシウム七水和物以外については、水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ７．２に調整した後オートクレーブした）（グルコース、ラクトース一水和物及び硫酸マグネシウム七水和物含有水溶液は別途調製した後オートクレーブし、それぞれ冷却後、混合した）］が４ｍＬ入った大型試験管に０．２ｍＬ植菌し、３０℃で２９時間振盪培養した。培養開始５時間後にはＩＰＴＧを終濃度１ｍＭとなるよう添加した。
　培養終了後、培養液を遠心分離後に適宜希釈し、上清又は菌体内に含まれるＬＮＦＰＩＩＩ、３ＦＬ、ＬＮｎＤＦＨＩＩ又はＬＮＦＰＶＩを糖分析装置ＩＣＳ－５０００又はＵＦＬＣ＆ＬＣＭＳ－８０４０にて分析した。結果を表１１に示す。なお、ＬＮｎＤＦＨＩＩ及びＬＮＦＰＶＩはいずれもピーク相対値（％）を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　その結果、ＰｇｓＦｕｃＴ１発現株は、公知のα１，３フコシルトランスフェラーゼであるＨｐＦｕｔＡ又はＢｆＦｕｃＴ１発現株と比較して、培養液中及び菌体内のいずれにおいてもＬＮＦＰＩＩＩを多く蓄積していることが分かった。また、ＰｇｓＦｕｃＴ１を使用することで、３ＦＬ、ＬＮｎＤＦＨＩＩ又はＬＮＦＰＶＩといった副生物を低減できることを示した。
　本発明を特定の態様を参照して詳細に説明したが、本発明の精神と範囲を離れることなく様々な変更および修正が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお、本出願は、２０２２年２月９日出願の日本特許出願（特願２０２２－０１９０２４）に基づくものであり、その全体が引用により援用される。また、ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。
配列番号１：Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｇｏｌｄｓｔｅｉｎｉｉ　ＪＣＭ　１３４４６由来ＦｕｃＴ１の塩基配列
配列番号２：Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｇｏｌｄｓｔｅｉｎｉｉ　ＪＣＭ　１３４４６由来ＦｕｃＴ１のアミノ酸配列
配列番号３：Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ　２６６９５由来ＦｕｔＡの塩基配列
配列番号４：Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ　２６６９５由来ＦｕｔＡのアミノ酸配列
配列番号５：Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｎｏｒｄｉｉ　ＪＣＭ　１２９８７由来ＦｕｃＴの塩基配列
配列番号６：Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｎｏｒｄｉｉ　ＪＣＭ　１２９８７由来ＦｕｃＴのアミノ酸配列
配列番号７：Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｓａｌｙｅｒｓｉａｅ　ＪＣＭ　１２９８８由来ＦｕｃＴの塩基配列
配列番号８：Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｓａｌｙｅｒｓｉａｅ　ＪＣＭ　１２９８８由来ＦｕｃＴのアミノ酸配列
配列番号９：Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｇｏｌｄｓｔｅｉｎｉｉ　ＪＣＭ　１３４４６由来ＦｕｃＴ２の塩基配列
配列番号１０：Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｇｏｌｄｓｔｅｉｎｉｉ　ＪＣＭ　１３４４６由来ＦｕｃＴ２のアミノ酸配列
配列番号１１：Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｆｒａｇｉｌｉｓ　ＡＴＣＣ　２５２８５由来ＦｕｃＴ１の塩基配列
配列番号１２：Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｆｒａｇｉｌｉｓ　ＡＴＣＣ　２５２８５由来ＦｕｃＴ１のアミノ酸配列
配列番号１３：Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｆｒａｇｉｌｉｓ　ＡＴＣＣ　２５２８５由来ＦｕｃＴ２の塩基配列
配列番号１４：Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｆｒａｇｉｌｉｓ　ＡＴＣＣ　２５２８５由来ＦｕｃＴ２のアミノ酸配列
配列番号１５：Ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａ　ｓｐ．　Ａｎ２０由来ＦｕｃＴの塩基配列
配列番号１６：Ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａ　ｓｐ．　Ａｎ２０由来ＦｕｃＴのアミノ酸配列
配列番号１７：Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｓｐ．　ＢＸ２由来ＦｕｃＴ－Ａの塩基配列
配列番号１８：Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｓｐ．　ＢＸ２由来ＦｕｃＴ－Ａのアミノ酸配列
配列番号１９：Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｓｐ．　ＨＧＳ００２５由来ＦｕｃＴ－Ｂの塩基配列
配列番号２０：Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｓｐ．　ＨＧＳ００２５由来ＦｕｃＴ－Ｂのアミノ酸配列
配列番号２１：Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｂｏｕｃｈｅｓｄｕｒｈｏｎｅｎｓｉｓ　ｓｔｒａｉｎ　Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ－Ｐ３７６３由来ＦｕｃＴ－Ｃの塩基配列
配列番号２２：Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｂｏｕｃｈｅｓｄｕｒｈｏｎｅｎｓｉｓ　ｓｔｒａｉｎ　Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ－Ｐ３７６３由来ＦｕｃＴ－Ｃのアミノ酸配列
配列番号２３：Ｇｒａｍｅｌｌａ　ｓｐ．　ＢＯＭ４由来ＦｕｃＴ－Ｄの塩基配列
配列番号２４：Ｇｒａｍｅｌｌａ　ｓｐ．　ＢＯＭ４由来ＦｕｃＴ－Ｄのアミノ酸配列
配列番号２５：Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ＮＬＡＥ－ｚｌ－Ｇ２３１由来ＦｕｃＴ－Ｅの塩基配列
配列番号２６：Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ＮＬＡＥ－ｚｌ－Ｇ２３１由来ＦｕｃＴ－Ｅのアミノ酸配列
配列番号２７：Ｅ．　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０由来ＭｄｆＡの塩基配列
配列番号２８：Ｅ．　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０由来ＭｄｆＡのアミノ酸配列
配列番号２９：Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ　ＮＣＴＣ　１１６３７由来ＧａｌＴの塩基配列
配列番号３０：Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ　ＮＣＴＣ　１１６３７由来ＧａｌＴのアミノ酸配列
配列番号３１：Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｅａ　ＡＴＣＣ　４３７６８由来ＬｇｔＡの塩基配列
配列番号３２：Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｅａ　ＡＴＣＣ　４３７６８由来ＬｇｔＡのアミノ酸配列
配列番号３３、３４：ｃａｔｓａｃＢ断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号３５、３６：ｌａｃＺ上流１増幅用プライマーの塩基配列
配列番号３７、３８：ｌａｃＹ下流１増幅用プライマーの塩基配列
配列番号３９：ｌａｃＺ上流２増幅用プライマーの塩基配列
配列番号４０：ｌａｃＹ下流２増幅用プライマーの塩基配列
配列番号４１、４２：ｗｃａＪ上流１増幅用プライマーの塩基配列
配列番号４３、４４：ｗｃａＭ下流１増幅用プライマーの塩基配列
配列番号４５：ｗｃａＪ上流２増幅用プライマーの塩基配列
配列番号４６：ｗｃａＭ下流２増幅用プライマーの塩基配列
配列番号４７、４８：ｍｄｆＡ断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号４９、５０：ｐＭＷ１１８断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号５１、５２：ｐＵＡＫＱＥ断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号５３、５４：ｒｃｓＡ断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号５５、５６：ｌａｃＹ断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号５７：ｐＵＡＫＱＥ－ｒｃｓＡ－ｌａｃＹ断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号５８、５９：ＨｐＦｕｔＡ断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号６０、６１：ＢｎＦｕｃＴ断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号６２、６３：ＢｓＦｕｃＴ断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号６４、６５：ＰｇｓＦｕｃＴ１断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号６６、６７：ＰｇｓＦｕｃＴ２断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号６８、６９：ＢｆＦｕｃＴ１断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号７０、７１：ＢｆＦｕｃＴ２断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号７２、７３：ＭＦｕｃＴ断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号７４、７５：ＦｕｃＴ－Ａ断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号７６、７７：ＦｕｃＴ－Ｂ断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号７８、７９：ＦｕｃＴ－Ｃ断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号８０、８１：ＦｕｃＴ－Ｄ断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号８２、８３：ＦｕｃＴ－Ｅ断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号８４：ＰｇｓＦｕｃＴ１　Ｎ１７Ｄ上流増幅用プライマーの塩基配列
配列番号８５：ＰｇｓＦｕｃＴ１　Ｎ１７Ｄ下流増幅用プライマーの塩基配列
配列番号８６：ＰｇｓＦｕｃＴ１　Ｓ９３Ｌ上流増幅用プライマーの塩基配列
配列番号８７：ＰｇｓＦｕｃＴ１　Ｓ９３Ｌ下流増幅用プライマーの塩基配列
配列番号８８：ＢｆＦｕｃＴ　Ｄ２８Ｎ上流増幅用プライマーの塩基配列
配列番号８９：ＢｆＦｕｃＴ　Ｄ２８Ｎ下流増幅用プライマーの塩基配列
配列番号９０：ＢｆＦｕｃＴ　Ｌ１０４Ｓ上流増幅用プライマーの塩基配列
配列番号９１：ＢｆＦｕｃＴ　Ｌ１０４Ｓ下流増幅用プライマーの塩基配列
配列番号９２、９３：ｐＳＴＶ２９断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号９４、９５：ＨｐｇａｌＴ断片増幅用プライマーの塩基配列
配列番号９６、９７：ＮｐｌｇｔＡ断片増幅用プライマーの塩基配列

Claims (5)

  1. 　下記［１］～［６］のいずれか１に記載の蛋白質の活性が増強され、かつ、親株に比べてルイスＸ骨格を有するオリゴ糖の生産性が向上した微生物。
    ［１］配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
    ［２］配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する変異蛋白質。
    ［３］配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する相同蛋白質。
    ［４］配列番号２４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
    ［５］配列番号１８で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
    ［６］配列番号２６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
  2. 　前記ルイスＸ骨格を有するオリゴ糖が、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩＩ（ＬＮＦＰＩＩＩ）骨格を有するオリゴ糖である、請求項１に記載の微生物。
  3. 　前記ＬＮＦＰＩＩＩ骨格を有するオリゴ糖が、ＬＮＦＰＩＩＩおよびラクト－Ｎ－ネオジフコヘキサオースＩＩ（ＬＮｎＤＦＨＩＩ）の少なくとも一方である、請求項２に記載の微生物。
  4. 　前記ルイスＸ骨格を有するオリゴ糖が、パララクト－Ｎ－ネオへキサオース（Ｐａｒａ－ＬＮｎＨ）骨格に含まれる少なくとも１のＮ－アセチルグルコサミンの３位にＬ－フコースがα１，３－結合したオリゴ糖である、請求項１に記載の微生物。
  5. 　請求項１～４のいずれか１に記載の微生物を調製すること、および当該微生物を用いて培養物中にオリゴ糖を生成することを特徴とする、オリゴ糖の製造方法。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019115349A (ja) * 2014-09-09 2019-07-18 グリコシン リミテッド ライアビリティー カンパニー フコシル化オリゴ糖の生産において使用するためのα（１，３）フコシルトランスフェラーゼ
WO2022168992A1 (ja) * 2021-02-08 2022-08-11 協和発酵バイオ株式会社 １，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質及びフコース含有糖質の製造法
WO2022168991A1 (ja) * 2021-02-08 2022-08-11 協和発酵バイオ株式会社 フコース含有糖質の輸送活性を有する蛋白質及びフコース含有糖質の製造法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019115349A (ja) * 2014-09-09 2019-07-18 グリコシン リミテッド ライアビリティー カンパニー フコシル化オリゴ糖の生産において使用するためのα（１，３）フコシルトランスフェラーゼ
WO2022168992A1 (ja) * 2021-02-08 2022-08-11 協和発酵バイオ株式会社 １，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質及びフコース含有糖質の製造法
WO2022168991A1 (ja) * 2021-02-08 2022-08-11 協和発酵バイオ株式会社 フコース含有糖質の輸送活性を有する蛋白質及びフコース含有糖質の製造法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE UniprotKB 22 May 2017 (2017-05-22), ANONYMOUS : "Glycosyltransferase family 10 (Fucosyltransferase) C-term", XP093083860, retrieved from Uniprot Database accession no. A0A1I3AU36 *
DATABASE UniprotKB 24 June 2015 (2015-06-24), ANONYMOUS : "Alpha-(1,3)-fucosyltransferase FucT N-terminal domain-containing protein", XP093083858, retrieved from Uniprot Database accession no. A0A0F5J8L9 *
SUGITA TOMOTOSHI; SAMPEI SOTARO; KOKETSU KENTO: "Efficient production of lacto-N-fucopentaose III in engineered Escherichia coli using α1,3-fucosyltransferase from Parabacteroides goldsteinii", JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY, ELSEVIER, AMSTERDAM NL, vol. 361, 9 December 2022 (2022-12-09), Amsterdam NL , pages 110 - 118, XP087235161, ISSN: 0168-1656, DOI: 10.1016/j.jbiotec.2022.12.002 *

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