KR20210028292A

KR20210028292A - 코리네박테리움 글루타미쿰에 푸코실락토오스 수송체 도입과 gdp-l-푸코오스 생합성 경로의 최적화를 통한 2'-푸코실락토오스 생산 증대

Info

Publication number: KR20210028292A
Application number: KR1020190108301A
Authority: KR
Inventors: 서진호; 이도행
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2019-09-02
Filing date: 2019-09-02
Publication date: 2021-03-12
Also published as: KR102268092B1

Abstract

본원발명은 대사공학적으로 설계된 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) 균주에 푸코실락토오스 수송체를 도입하고, GDP-L-푸코오스 생합성 경로를 최적화함으로써 2'- 푸코실락토오스의 생산량을 증대시키기 위한 재조합 미생물의 제조 및 이를 이용하여 2'-푸코실락토오스를 생산하는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 의하면, GRAS 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) 균주를 사용하여 2'-푸코실락토오스를 생산할 수 있는데, 종래의 대장균을 이용한 기술에 비해 식품 소재 및 의약품 소재로 활용하기 위해 2'-푸코실락토오스를 생산하는데 적합하며, 종래의 코리네박테리움 글루타미쿰을 이용한 기술에 비해 훨씬 더 고농도, 고수율, 고생산성으로 2'-푸코실락토오스를 생산할 수 있다.

Description

코리네박테리움 글루타미쿰에 푸코실락토오스 수송체 도입과 GDP-L-푸코오스 생합성 경로의 최적화를 통한 2'-푸코실락토오스 생산 증대 {Enhanced production of 2'-fucosyllactose in Corynebacterium Glutamicum through introduction of fucosyllactose transporter and opimization of GDP-L-fucose biosynthetic pathway}

본 발명은 코리네박테리움 글루타미쿰에 푸코실락토오스 수송체 도입과 GDP-L-푸코오스 생합성 경로의 최적화를 통한 2'-푸코실락토오스 생산 증대에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 대사공학적으로 설계된 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) 균주에 푸코실락토오스 수송체를 도입하고, GDP-L-푸코오스 생합성 경로를 최적화함으로써 2'- 푸코실락토오스의 생산량을 증대시키기 위한 재조합 미생물의 제조 및 이를 이용하여 2'-푸코실락토오스를 생산하는 방법에 관한 것이다.

인간의 모유에는 200~300여 종류에 이르는 인간모유올리고당 (Human Milk Oligosaccharides, HMOs)이 존재하며, 이는 다른 포유류의 젖과는 다르게 고농도 (5~15g/L)로 존재한다. HMO는 50~80% 가량이 푸코실화 되어 있는 푸코실올리고당 (Fucosyloligosaccharide)으로, 푸코실올리고당은 프리바이오틱 (Prebiotic) 효과, 병원균 및 이들이 분비하는 장내독소 (Enterotoxin)가 장내상피에 달라붙는 것을 막아줌으로써 감염을 방지하는 효과 및 면역반응 조절기능이 있는 것으로 알려졌으며, 신생아의 초기 성장단계에서 장내 미생물총의 형성에 기여하는 역할을 하는 것으로 알려졌다.

한편, 푸코실올리고당 중 2'-푸코실락토오스는 가장 높은 함량으로 존재하고, 앞서 언급한 다양한 생물학적 기능을 나타내는 물질임이 밝혀져 이를 기능성 식품 소재로써 활용하기 위한 연구들이 진행되고 있다.

2'-푸코실락토오스를 생산할 수 있는 방법은 크게 화학적 합성법, 효소반응을 이용한 합성법, 미생물 발효를 이용하여 생산하는 방법 등이 있다. 우선 화학적 합성법은 고가의 기질, 낮은 이성질체 선택성 (Stereo-selectivity) 및 생산 수율, 독성 유기용매의 사용 등의 문제가 존재한다. 효소적 합성법은 푸코오스의 공여체 (Donor)로 이용되는 GDP-L-fucose가 매우 고가이고, 푸코오스 전이효소 (fucosyltransferase)를 정제하는데 많은 비용이 든다는 단점이 있다.

반면 미생물 발효를 이용한 생물공학적 방법은, 대형 생물배양기 (Bioreactor)를 이용하여 산업규모의 대량생산에 적합하며, 값싼 원료를 이용하여 2'-푸코실락토오스를 생산할 수 있기 때문에 기능성 식품 소재 및 의약품 소재로써 2'-푸코실락토오스를 생산하기 위해 가장 적절한 방법으로 여겨지고 있다.

그러나 미생물을 이용한 2'-푸코실락토오스 생산에 관한 종래의 기술은 대부분 재조합 대장균을 이용한 생산기술로, 실험용으로 이용되는 대장균은 실제로는 병원균이 아니지만 소비자들에게는 해로운 균이라는 인식이 강하고, 세포막 성분이 엔도톡신으로 작용할 수 있기 때문에 분리 정제의 비용이 많이 소비되는 단점이 있어, 식품 및 의약품 소재인 2'-푸코실락토오스를 생산하는 숙주세포로써 대장균을 이용하기에는 어려움이 있는 실정이다.

대한민국등록특허 제10-1731263호(2017. 04. 24.)에는 코리네박테리움 글루타미쿰을 이용한 2'-푸코실락토오스의 생산방법에 관하여 기재되어 있다.

종래의 2'-푸코실락토오스 생산기술은 만들어진 2'-푸코실락토오스의 상당량이 세포 내에 존재하고 있어, 이를 세포 밖으로 내보낼 수 있는 방법이 요구되며, 2'-푸코실락토오스 합성반응의 최종 기질인 GDP-L-푸코오스를 생합성하는데 이용되는 글루코오스가 대부분 세포의 생장과 관련이 있는 해당과정 (Glycolysis)에 사용되고 있기 때문에 GDP-L-푸코오스의 생합성 경로를 강화할 수 있는 방법이 필요하다.

따라서, 보 발명은 상기한 두 문제점을 개선한 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 제조하여, 2'-푸코실락토오스를 더욱 고농도, 고수율, 고생산성으로 생산하는 방법을 개발하여 제공하고자 한다.

본 발명은 α-1,2-푸코오스 전이효소 (α-1,2- fucosyltransferase)가 발현되도록 형질전환되며, GDP-D-만노오스-4,6-데하이드라타아제 (GDP-D-mannose-4,6-dehydratase)가 발현되도록 형질전환되고, GDP-L-푸코오스 신타아제 (GDP-L-fucose synthase)가 발현되도록 형질전환되며, 락토오즈 퍼미아제 (lactose permease)가 발현되도록 형질전환되고, ABC 트랜스포터 퍼미아제(transporter permease)가 발현되도록 형질전환되며, 포스포만노뮤타아제 (Phosphomannomutase) 및 GTP-만노오스-1-포스페이트 구아닐릴트랜스퍼라아제 (GTPmannose-1-phosphate guanylyltransferase)를 보유하고 있는 것을 특징으로 하는 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)을 제공한다.

한편, 본 발명은 α-1,2-푸코오스 전이효소 (α-1,2- fucosyltransferase)가 발현되도록 형질전환되며, GDP-D-만노오스-4,6-데하이드라타아제 (GDP-D-mannose-4,6-dehydratase)가 발현되도록 형질전환되고, GDP-L-푸코오스 신타아제 (GDP-L-fucose synthase)가 발현되도록 형질전환되며, 락토오즈 퍼미아제 (lactose permease)가 발현되도록 형질전환되고, 포스포프럭토키나아제 A (Phosphofructokinase A, PfkA) 유전자가 제거되거나 부분 파쇄되어 그 기능이 소실되도록 형질전환되며, 포스포만노뮤타아제 (Phosphomannomutase) 및 GTP-만노오스-1-포스페이트 구아닐릴트랜스퍼라아제 (GTPmannose-1-phosphate guanylyltransferase)를 보유하고 있는 것을 특징으로 하는 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)을 제공한다. 이때, 상기 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰은, 일 예로, ABC 트랜스포터 퍼미아제(transporter permease)가 발현되도록 추가로 형질전환된 것일 수 있다.

본 발명의 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)에 있어, 상기 α-1,2-푸코오스 전이효소 (α-1,2-fucosyltransferase)는, 바람직하게 서열번호 5에 기재된 핵산서열로 암호화된 것이 좋다.

본 발명의 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)에 있어, 상기 ABC 트랜스포터 퍼미아제(transporter permease)는, 바람직하게 서열번호 6에 기재된 핵산서열로 암호화된 것이 좋다.

본 발명의 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)에 있어, 상기 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰은, 바람직하게 포스포만노뮤타아제 (Phosphomannomutase)가 과발현되도록 형질전환되고, GTP-만노오스-1-포스페이트 구아닐릴트랜스퍼라아제 (GTP-mannose-1-phosphate guanylyltransferase)가 과발현되도록 형질전환된 것이 좋다.

한편, 본 발명은 락토오스(lactose) 및 글루코오스(glucose)가 첨가된 배지에, α-1,2-푸코오스 전이효소 (α-1,2- fucosyltransferase)가 발현되도록 형질전환되며, GDP-D-만노오스-4,6-데하이드라타아제 (GDP-D-mannose-4,6-dehydratase)가 발현되도록 형질전환되고, GDP-L-푸코오스 신타아제 (GDP-L-fucose synthase)가 발현되도록 형질전환되며, 락토오즈 퍼미아제 (lactose permease)가 발현되도록 형질전환되고, ABC 트랜스포터 퍼미아제(transporter permease)가 발현되도록 형질전환되며, 포스포만노뮤타아제 (Phosphomannomutase) 및 GTP-만노오스-1-포스페이트 구아닐릴트랜스퍼라아제 (GTPmannose-1-phosphate guanylyltransferase)를 보유하고 있는 것을 특징으로 하는 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)을 배양하는 것을 특징으로 하는 2'-푸코실락토오스의 생산방법을 제공한다.

한편, 본 발명은 락토오스(lactose), 글루코오스(glucose) 및 프럭토오스(fructose)가 첨가된 배지에, 본 발명은 α-1,2-푸코오스 전이효소 (α-1,2- fucosyltransferase)가 발현되도록 형질전환되며, GDP-D-만노오스-4,6-데하이드라타아제 (GDP-D-mannose-4,6-dehydratase)가 발현되도록 형질전환되고, GDP-L-푸코오스 신타아제 (GDP-L-fucose synthase)가 발현되도록 형질전환되며, 락토오즈 퍼미아제 (lactose permease)가 발현되도록 형질전환되고, 포스포프럭토키나아제 A (Phosphofructokinase A, PfkA) 유전자가 제거되거나 부분 파쇄되어 그 기능이 소실되도록 형질전환되며, 포스포만노뮤타아제 (Phosphomannomutase) 및 GTP-만노오스-1-포스페이트 구아닐릴트랜스퍼라아제 (GTPmannose-1-phosphate guanylyltransferase)를 보유하고 있는 것을 특징으로 하는 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)을 배양하는 것을 특징으로 하는 2'-푸코실락토오스의 생산방법을 제공한다.

본 발명의 2'-푸코실락토오스의 생산방법에 있어, 상기 푸코실락토오스의 생산방법은, 바람직하게 프럭토오스, 글루코오스 또는 락토오스를 추가로 공급하는 유가식 배양인 것이 좋다.

본 발명에 의하면, GRAS 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) 균주를 사용하여 2'-푸코실락토오스를 생산할 수 있는데, 종래의 대장균을 이용한 기술에 비해 식품 소재 및 의약품 소재로 활용하기 위해 2'-푸코실락토오스를 생산하는데 적합하며, 종래의 코리네박테리움 글루타미쿰을 이용한 기술에 비해 훨씬 더 고농도, 고수율, 고생산성으로 2'-푸코실락토오스를 생산할 수 있다.

도 1은 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에서 GDP-L-푸코오스 및 2'-푸코실락토오스를 생합성하기 위하여 도입한 대사경로를 도식화한 것이다.
도 2는 2'-푸코실락토오스의 생산능력을 증대시키기 위하여 pfkA가 녹아웃된 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 (△P harboring pVBCLE and pEGWTT(CO))에 글루코오스와 프럭토오스 혼합당을 이용하는 더욱 강화된 GDP-L-푸코오스 생합성 경로를 도식화한 것이다.
도 3은 파쇄된 pfkA를 DNA 조각 크기로 확인한 전기영동 사진이다 1041 bp로 표시되어 있는 것은 원래의 pfkA이고 693 bp로 표시되어 있는 것이 가운데 부분이 삭제된 pfkA이다.
도 4는 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 (대조군(C. glutamicum harboring pVBCL and pEGWTT(CO)) 및 Exporter 도입 균주(C. glutamicum harboring pVBCLE and pEGWTT(CO)))를 이용한 플라스크 회분식 배양결과를 나타낸 그래프이다. 광학밀도 (OD₆₀₀)가 약 0.8에 도달했을 때, IPTG와 락토오스를 최종 농도가 각각 1.0 mM, 10 g/L (화살표)이 되도록 첨가하였다. 그래프 중 기호는 다음과 같다: ●: 건조세포중량 (DCW), ■: 글루코오스 (Glucose), ▲: 락토오스 (Lactose), ◆: 2'-푸코실락토오스 (2'-FL), ▼: 락테이트 (Lactate).
도 5는 도 4에서의 대조군과 수송체 도입 균주 간의 세포 내 (Intracellular) 2'-푸코실락토오스 양과 세포 밖 (Extracellular)의 2'-푸코실락토오스의 양을 비교한 그래프이다.
도 6은 도 4에서의 대조군과 수송체 도입 균주 간의 세포 내 2'-푸코실락토오스 분비 능력을 비교한 그래프이다.
도 7은 pfkA가 녹아웃되고 Exporter가 도입된 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 (△P harboring pVBCLE and pEGWTT(CO))의 플라스크 회분식 배양 결과를 나타낸 그래프이다. 광학밀도 (OD₆₀₀)가 약 0.8에 도달했을 때, IPTG와 락토오스, 글루코오스 농도가 각각 1.0mM, 10g/L, 10g/L (화살표)가 되도록 첨가하였다. 그래프 중 기호는 다음과 같다: ●: 건조세포중량 (DCW), ■: 글루코오스 (Glucose), ▲: 락토오스 (Lactose), ◆: 2'-푸코실락토오스 (2'-FL), ▼: 락테이트 (Lactate), X: 프럭토오스 (Fructose).
도 8은 pfkA가 녹아웃되고 Exporter가 도입된 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 (△P harboring pVBCLE and pEGWTT(CO))의 유가식 배양 결과를 나타낸 그래프이다. 광학밀도 (OD₆₀₀)가 20에 이르렀을 때, 프럭토오스를 연속식으로 공급하였고 (Continuous feeding), 글루코오스는 10~20g/L 수준으로 유지하고자 배양 중간에 첨가하였다. 배양 중에 수행했던 조치들은 화살표로 표시 및 설명하였다. 그래프 중 기호는 다음과 같다. ●: 건조세포중량 (DCW), ■: 글루코오스 (Glucose), ▲: 락토오스 (Lactose), ◆: 2'-푸코실락토오스 (2'-FL), ▼: 락테이트 (Lactate), X: 프럭토오스 (Fructose).
도 9는 도 8의 배양에서 84시간 때의 HPLC 피크 프로파일(peak profile)이다. 화살표로 표시한 것이 트레할로스 (Trehalose) 피크로 락토오스의 피크와 겹쳐져 있음을 확인할 수 있다.

본 발명자들은 이전에 대한민국 특허등록번호 제10-1544184호(2015.08.06.)를 통해, 대장균을 이용한 2'-푸코실락토오스 (2'-fucosyllactose) 생산방법을 등록받은 바 있으나, 대장균이 갖는 안전성에 대한 한계가 존재하였다. 이에, 본 발명자들은 2'-푸코실락토오스를 기능성 식품 소재 및 의약품 소재에 활용하기에 더욱 적합하도록, 안전하다고 인정받는 (Generally Recognized As Safe, GRAS) 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰을 숙주세포로 이용하여 2'-푸코실락토오스를 생산하는 기술을 개발하여 대한민국 특허등록번호 제10-1731263호(2017.04.24.)를 등록받은 바 있다.

하지만, 상기 특허에 따르면, 코리네박테리움 글루타미쿰을 이용하여 유가식 배양 (Fed-batch culture)을 수행할 경우 배치(Batch) 당 8.1g/L의 2'-푸코실락토오스를 생산할 수 있는데, 이는 산업적으로 이용하기에는 생산성이 부족한 수준으로 더욱 고농도의 2'-푸코실락토오스를 생산하는 기술이 필요하였다.

이에, 본 발명은 α-1,2-푸코오스 전이효소 (α-1,2- fucosyltransferase)가 발현되도록 형질전환되며, GDP-D-만노오스-4,6-데하이드라타아제 (GDP-D-mannose-4,6-dehydratase)가 발현되도록 형질전환되고, GDP-L-푸코오스 신타아제 (GDP-L-fucose synthase)가 발현되도록 형질전환되며, 락토오즈 퍼미아제 (lactose permease)가 발현되도록 형질전환되고, ABC 트랜스포터 퍼미아제(transporter permease)가 발현되도록 형질전환되며, 포스포만노뮤타아제 (Phosphomannomutase) 및 GTP-만노오스-1-포스페이트 구아닐릴트랜스퍼라아제 (GTPmannose-1-phosphate guanylyltransferase)를 보유하고 있는 것을 특징으로 하는 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)을 제공한다.

즉, 본 발명에서는 GRAS 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰을 이용하여 종래의 기술보다 고농도로 2'-푸코실락토오스를 생산하는 기술을 개발하고자 하였다. 본 발명에서는 2'-푸코실락토오스를 생산하는 숙주세포로 코리네박테리움 글루타미쿰을 선정하였는데, 이 균주는 앞서 언급했듯이 GRAS로 인정된 균주일 뿐만 아니라, 그람양성균 (Gram positive bacteria)으로 내독소 (Endotoxin)를 생산하지 않으며, 이미 식품첨가물인 아미노산 및 핵산을 산업적으로 생산하는데 널리 이용되고 있다. 따라서 코리네박테리움 글루타미쿰은 기능성 식품 소재 및 의약품 소재를 생산하는데 적합한 균주라 할 수 있고, 안전성 측면에서 소비자의 우려를 불식시킬 수 있는 장점이 있다.

한편, 2'-푸코실락토오스를 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰을 제작하기 위해서는 2'-푸코실락토오스가 세포 내에서 어떤 대사경로 (Metabolic pathway)를 통해 만들어지는지를 알 필요가 있으며, 이를 위해, 도 1을 참고할 수 있다. 도 1에서 알 수 있듯이 2'-푸코실락토오스를 생산할 수 있는 코리네박테리움 글루타미쿰을 제작하기 위해서는 여러 효소들을 만들어 낼 수 있도록 형질전환시켜야 한다.

기본적으로 2'-푸코실락토오스를 생산하기 위해서는 α-1,2-푸코오스 전이효소 (α-1,2-fucosyltransferase)가 필요한데, 코리네박테리움 글루타미쿰은 이 효소를 암호화하는 유전자를 갖지 않기 때문에 외래 유전자를 도입해야 한다. α-1,2-푸코오스 전이효소는 GDP-L-푸코오스 (GDP-L-fucose)를 푸코오스 공여체 (Fucose Donor)로 이용하여, 락토오스 (Lactose)에 푸코오스를 붙이는 푸코실화 반응으로 2'-푸코실락토오스를 만든다.

야생형의 코리네박테리움 글루타미쿰은 GDP-D-만노오스 (GDP-D-Mannose)까지 합성할 수 있는 대사경로를 가지지만, GDP-D-만노오스에서 GDP-L-푸코오스를 만들 수 있는 대사경로가 없으므로 외래 유전자들을 도입하여 GDP-L-푸코오스 대사경로를 만들어 주어야 한다. 따라서, GDP-D-만노오스-4,6-데하이드라타아제 (GDP-D-mannose-4,6-dehydratase, Gmd)와 GDP-L-푸코오스 신타아제 (GDP-L-fucose synthase, 이 효소는 'GDP-4-keto-6-deoxy-mannose-3,5-epimerase-4-reductase'로도 불리며, 약어로는 'WcaG'로 불리는데, 이 효소를 암호화하는 유전자를 특히 'wcaG''로 부름)를 암호화하는 유전자를 도입해야 한다. 또한, 코리네박테리움 글루타미쿰은 락토오스 퍼미아제 (Lactose permease, LacY)를 만들 수 없어서 세포 밖의 락토오스를 세포 안으로 수송해올 수 없다. 따라서 락토오스 퍼미아제 유전자 역시 도입해야 한다.

α-1,2-푸코오스 전이효소 (α-1,2- fucosyltransferase, FucT2)를 암호화하는 유전자로는 헬리코박터 파일로리 (Helicobacter pylori) 유래의 fucT2를 사용하는 것이 좋은데, 바람직하게 서열번호 5에 기재된 핵산서열로 암호화된 것이 좋다. 이때, fucT2를 코리네박테리움 글루타미쿰의 코돈 편향 (Codon bias)을 고려하여 코돈 최적화한 유전자 서열을 적용하는 것이 좋다. 또한, 강하게 발현될 수 있도록 유전자 서열 앞에 tac 프로모터 (tac promoter)와 리보솜부착부위 (Ribosome Binding Site, RBS)를 위치시켜 독자적으로 발현될 수 있도록 할 수도 있다.

한편, GDP-D-만노오스-4.6-데하이드라타아제 (GDP-D-mannose-4,6-dehydratase, Gmd), GDP-L-푸코오스 신타아제 (GDP-L-fucose-synthase, WcaG) 및 락토오스 퍼미아제 (lactose permease, LacY)를 암호화하는 유전자는 대장균에서 유래한 것을 사용하는 것이 좋다. 한편, 코리네박테리움 글루타미쿰은 염색체상에 포스포만노뮤타아제 (Phosphomannomutase, ManB) 유전자와 GTP-만노오스-1-포스페이트 구아닐트랜스퍼라아제 (GTP-mannose-1-phosphate guanylyltransferase, ManC) 유전자가 존재하여 위 두 효소를 만들어 낼 수 있으나, 2'-푸코실락토오스의 대량생산을 위하여 과발현 (Overexpression)되도록 형질전환시키는 것이 좋다.

상기 효소들의 작용은 도 1을 통해서 확인할 수 있다. 다만, 락토오즈 퍼미아제 (lactose permease, LacY)에 관하여는 하기 본 발명의 실시예에서 대장균의 lac 오페론 (lac operon) 에서 lacZ가 제거된 lacYA 유전자를 도입하여 실험하였으나, 본 발명에서 lac 오페론의 도입 이유는 세포 밖의 락토오스를 세포 안으로 수송하기 위한 것이기 때문에, 굳이 lacA 유전자까지는 필요 없고 lacY 유전자만 도입시켜도 충분하다.

또한, 세포 안에서 만들어진 2'-푸코실락토오스를 세포 밖으로 원활하게 내보내기 위하여 푸코실락토오스 수송체 (Fucosyllactose exporter)를 도입하였다. 이를 위해 비피도박테리움 인팬티스 (Bifidobacterium infantis) 유래의 ABC 트랜스포터 퍼미아제(transporter permease) 유전자인 blon2204 -2204 유전자 카세트 (Cassette)를 도입하였다. 본 발명의 ABC 트랜스포터 퍼미아제(transporter permease)는, 본 발명에서 균체 내에서 생산된 2'-푸코실락토오스를 균체 밖으로 배출하는 역할을 수행하여, 통상적으로 익스포터(exporter)라고도 부른다.

ABC 트랜스포터 퍼미아제는 기질결합단백질(substrate binding protein)에 기질이 붙고, ATP가 소모되어 기질을 세포 안으로 들여오는 수송체로서, 여기서는 단지 푸코실락토오스가 지나다닐 수 있는 통로를 도입함으로써, 세포 내에서 만들어진 프코실락토오스가 세포 밖으로 빠져나갈 수 있는 길을 만들어 준 것이다. 본 발명에서는 하기 실험을 통해, 코리네박테리움 글루타미쿰에 푸코실락토오스 수송체를 도입하여 세포 내에 존재하는 2'-푸코실락토오스를 세포 밖으로 내보냄으로써 배양액에 존재하는 2'-푸코실락토오스의 농도를 높일 수 있었다.

다만, 본 발명에서는 ABC 트랜스포터 퍼미아제(transporter permease)로 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) 유래의 서열번호 6의 핵산서열로 암호화된 것을 사용하였으나, 비피도박테리움의 푸코실락토오스 수송에 관여하는 ABC 트랜스포터(transporter) 중에 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)을 가진 ABC 트랜스포터 퍼미아제가 푸코실락토오스가 지나갈 수 있는 통로로써 사용될 수 있기 때문에, 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) 유래의 서열번호 6의 암호화된 것 외에 ABC 트랜스포터 퍼미아제(transporter permease) 류에 속하는 것은 어느 것이나 동일한 효과가 발생할 것으로 추론할 수 있었다.

한편, GDP-L-푸코오스를 만들기 위해 사용되는 글루코오스는 세포 생장에 이용되는 주요한 탄소원으로, 도 1에 표시되어 있거나 혹은 표시되어 있지 않은 여러 대사 경로 중 해당과정으로의 대사 흐름 (metabilic flux)이 매우 강하다는 사실이 알려졌다. 따라서 2'-푸코실락토오스의 생산을 증대시키기 위해서는 GDP-L-푸코오스 생합성 경로의 흐름을 더욱 강화하는 것이 중요하며, 이를 위해, 도 2와 같이 글루코오스와 프럭토오스 (fructose) 혼합당을 이용하여 글루코오스는 GDP-L-푸코오스의 합성에, 프럭토오스는 세포 생장에 이용되도록 하는 이중경로 (Two track pathway) 시스템을 구축하였다.

한편, 글루코오스와 프럭토오스 혼합당을 이용하는 이중경로 시스템을 만들기 위해서는, 도 2에서 볼 수 있듯이 프럭토오스-6-포스페이트 (Fructose-6-phosphate)가 프럭토오스-1,6-비스포스페이트 (Fructose-1,6-bisphosphate)가 되어 해당과정으로 가는 경로를 차단해야 한다. 이는 코리네박테리움 글루타미쿰의 염색체에 존재하는 포스포프럭토키나아제 A (Phosphofructokinase A, PfkA) 유전자를 녹아웃시키거나 일부 파쇄시킴으로써 가능하다.

이에, 본 발명은 α-1,2-푸코오스 전이효소 (α-1,2- fucosyltransferase)가 발현되도록 형질전환되며, GDP-D-만노오스-4,6-데하이드라타아제 (GDP-D-mannose-4,6-dehydratase)가 발현되도록 형질전환되고, GDP-L-푸코오스 신타아제 (GDP-L-fucose synthase)가 발현되도록 형질전환되며, 락토오즈 퍼미아제 (lactose permease)가 발현되도록 형질전환되고, 포스포프럭토키나아제 A (Phosphofructokinase A, PfkA) 유전자가 제거되거나 부분 파쇄되어 그 기능이 소실되도록 형질전환되며, 포스포만노뮤타아제 (Phosphomannomutase) 및 GTP-만노오스-1-포스페이트 구아닐릴트랜스퍼라아제 (GTPmannose-1-phosphate guanylyltransferase)를 보유하고 있는 것을 특징으로 하는 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)을 제공한다. 이때, 상기 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰은, 일 예로, ABC 트랜스포터 퍼미아제(transporter permease)가 발현되도록 추가로 형질전환된 것일 수 있다.

한편, pfkA가 녹아웃된 균주에서는 글루코오스를 탄소원으로 이용하는 경우 Glucose-6-phosphate, Fructose-6-phosphate 등 당 인산(sugar phosphate)의 축적으로 세포생장저해가 나타날 수 있으며, 배양 시간을 길어지게 하는 원인이 될 수 있다. 그러므로 본격적인 2'-푸코실락토오스 생산을 위한 배양에 앞서 씨드세포를 준비하는 단계 (N-1 Seed cell culture)에서 글루코오스와 프럭토오스 혼합당 환경을 조성하여 세포를 미리 적응시키는 것이 좋다. 본 발명은 하기 이러한 구성의 도입을 통하여 종래의 기술에 비해 2배 이상 높은 고농도의 2'-푸코실락토오스를 생산할 수 있었다.

더욱 구체적으로, pfkA 녹아웃 균주에서 글루코스가 단일로 존재하였을 때는 40시간 동안 세포생장이 거의 이루어지지 못했다. 글루코스와 프럭토스가 5:5 비율로 존재하였을 때 역시 거의 생장이 이루어지지 못했고, 3:7 비율이었을 때 40시간 배양 시 최대 생장을 나타내긴 했으나, 당을 바로 소모하지 못하고 유도기(lag phase)가 10시간 이상 나타났다. 하기 실험에서 플라스크(flask) 배양 시, 글루코오스가 들어감과 동시에 다시 유도기가 꽤 긴 시간 동안 나타남을 확인할 수 있었다. 본 배양에서는 이를 해결하고자 씨드세포 배양단계에서 본 배양 (2'-FL을 생산하는 배양)과 비슷한 환경을 조성한 뒤, 세포가 중간 유도기(mid log phase)에 도달하였을 때 본 배양에 접종하였다. pfkA가 녹아웃됨으로써 F6P가 F1,6BP로 가는 경로가 차단되어 F6P, G6P가 세포 내에 축적되어 생장 저해가 나타날 수 있는데, pfkA 녹아웃 균주에서는 글루오코스를 이용하는 한 이런 생장저해가 나타날 수 있고, 배양 시간이 늘어나 생산성이 감소할 수 있어, 본 배양 전에 미리 세포 적응(cell adaptation) 과정을 추가한 것이다.

한편, 본 발명에서 사용하는 '발현'이라는 용어는, 본 발명의 코리네박테리움 글루타미쿰 균주가 자체적으로 만들 수 없는 효소를, 인위적으로 만들도록 하기 위해 외부 유래의 유전자를 균주 내로 도입하여 발현시키는 것을 의미하고, '과발현'이라는 용어는 본 발명의 코리네박테리움 글루타미쿰 균주가 자체적으로 해당 효소를 암호화하는 유전자를 가져, 스스로 발현시킬 수 있으나, 대량생산을 위한 목적으로 이의 발현량을 증대시키기 위해 인위적으로 해당 효소의 발현량을 증대시켜 과발현한 것을 의미한다.

한편, 본 발명자들은 상기에서 설명한 대사공학적 설계를 통하여 코리네박테리움 글루타미쿰에서 2'-푸코실락토오스를 대량 생산할 수 있음을 확인할 수 있었다. 본 발명에 있어서, 상기 푸코실락토오스 수송체로써 비피도박테리움 인팬티스 유래의 ABC 트랜스포터 퍼미아제(transporter permease) 유전자인 blon2204 -2203 유전자 카세트를 도입할 경우, 그렇지 않은 경우보다 세포 내에 존재하는 2'-푸코실락토오스의 양이 감소하여 2'-푸코실락토오스의 생산량이 증대되는 것을 확인하였다. 또한, 포스포프럭토키나아제 A 유전자가 녹아웃된 균주를 이용하고, 글루코오스와 프럭토오스 혼합당을 이용하여 2'-푸코실락토오스를 생산한 경우 훨씬 더 고농도의 2'-푸코실락토오스를 생산할 수 있음을 확인하였다.

더욱 구체적으로, 익스포터인 ABC 트랜스포터 퍼미아제(transporter permease)가 발현되도록 형질전환된 본 발명의 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 이용할 경우, 락토오스(lactose) 및 글루코오스(glucose)가 첨가된 배지에 배양함으로써, 글루코오스와 락토오스가 동시에 존재하는 환경에서도 락토오스의 세포 내 수송이 가능하여 2'-푸코실락토오스를 생산할 수 있었다.

또한, 포스포프럭토키나아제 A (Phosphofructokinase A, PfkA) 유전자가 제거되거나 부분 파쇄되어 그 기능이 소실되도록 형질전환된 본 발명의 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 이용할 경우, 락토오스(lactose), 글루코오스(glucose) 및 프럭토오스(fructose)가 첨가된 배지에 배양함으로써, 글루코오스와 락토오스가 동시에 존재하는 환경에서도 락토오스의 세포 내 수송이 가능하며, 글루코오스는 GDP-L-푸코오스의 합성에, 프럭토오스는 세포 생장에 이용될 수 있다.

한편, 본 발명은 락토오스가 첨가된 배지에, 본 발명의 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰을 배양하는 것을 특징으로 하는 2'-푸코실락토오스의 생산방법을 제공한다. 본 발명의 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 이용할 경우, 고농도, 고수율, 고생산성으로 2'-푸코실락토오스를 생산할 수 있다.

한편, 상기 본 발명의 2-푸코실락토오스의 생산방법에 있어서, 배양 중에 글루코오스와 프럭토오스를 첨가해주는 것이 좋다. 이들 탄소원이 배지에 추가됨으로써 세포의 생장에 필수적인 에너지 생산 및 대사체의 합성이 원활해지고 이는 2'-푸코실락토오스 생산을 증대시킬 수 있다. 한편. 상기 본 발명의 2'-푸코실락토오스의 생산방법은, 회분식 또는 탄소원 및 락토오스를 추가로 공급하는 유가식 배양을 통해 수행될 수 있다. 회분식 또는 유가식 배양에 관한 세부 지엽적 기술들은 당업계의 공지 기술을 사용할 수 있으므로, 이에 대해서는 그 기재를 생략하기로 한다.

한편, 앞서 언급했듯이, 본 발명의 균주 코리네박테리움 글루타미쿰은 2'-푸코실락토오스 합성의 기질인 락토오스를 세포 내로 유입하기 위하여 락토오즈 퍼미아제 (lactose permease)를 만들 수 있도록 형질전환 되었다. 즉, 배지에 존재하는 락토오스를 세포 내로 수송할 수 있는 형질을 갖도록 변이시켜야 하는데, 본 발명의 균주는 이 효소로 형질전환 되었다.

그런데, 락토오즈 퍼미아제는 통상적으로 글루코오스가 존재할 때 활성이 저해되는 특징 (glucose repression effect)이 있다. 다시 말해서 글루코오스와 다른 탄소원 (예로서, 락토오스 또는 프럭토오스)가 동시에 존재할 때 락토오스 또는 프럭토오스의 세포 내 수송이 원활하지 못하고, 결과적으로 2'-푸코실락토오스를 생산하지 못하거나, 균체 성장이 이루어지지 못하게 된다. 하지만, 본 발명에서 사용한 코리네박테리움 글루타미쿰에서는 글루코오스 저해 작용이 일어나지 않아, 글루코오스와 락토오스, 프럭토오스가 동시에 존재하는 환경에서도 락토오스, 프럭토오스의 세포 내 수송이 가능하여 2'-푸코실락토오스 생산 및 균체 성장이 가능할 수 있었다.

한편, 본 발명의 코리네박테리움 글루타미쿰을 이용한 2'-푸코실락토오스의 생산방법은 2'-푸코실락토오스를 'Non-growth associated product'의 패턴으로 생산됨이 본 발명의 하기 실험을 통해 확인되었다. 대사산물의 생산이 숙주세포의 생육과 무관하게 생산되는 'Non-growth Associated Product'은 대사산물의 생산을 위한 숙주세포의 생장과 동반되어 생산되는 물질이 아니므로 숙주세포를 대량으로 배양한 후에 기질을 투입하여 단시간에 목적물질을 대량으로 생산할 수 있는 장점이 있다. 또한, 배양에 사용된 숙주세포를 수확하여 반복해서 사용할 수도 있기 때문에 세포 생장에 필요한 시간을 단축시켜 생산성을 극대화할 수 있는 장점도 있다. 따라서, 본 발명에서 코리네박테리움 글루타미쿰을 사용하여 구축한 2'-푸코실락토오스 생산방법은 산업적으로 2'-푸코실락토오스를 대량 생산하는데 적합한 방법인 것이다.

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

[ 실시예 1. 형질전환용 플라스미드 및 PfkA 결실 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 제작]

형질전환용 플라스미드 (Plasmid) 제작을 위한 클로닝 (cloning)을 위해서는 대장균 (Escherichia coli TOP10)을 이용하였다. 아울러, 형질전환 및 PfkA 결실을 위한 호스트로는 야생형의 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum ATCC13032)을 사용하였다.

포스포프럭토키나아제 A (Phosphofructokinase A, PfkA) 유전자가 녹아웃 (Knock-out)된 변이 균주인 △P (△pfkA , Phosphofurctokinase A 유전자가 녹아웃된 코리네박테리움 글루타미쿰) 균주를 제작하기 위하여는 하기에 기재된 녹아웃 과정을 수행하였다.

우선, 2'-푸코실락토오스 (2'-fucosyllactose)의 생산에 필요한 대사경로를 코리네박테리움 글루타미쿰에 구축하기 위해 다음과 같은 플라스미드 벡터를 이용 및 구축하였다. 선행연구에서 개발된 GDP-D-만노오스-4.6-데하이드라타아제 (GDP-D-mannose-4,6-dehydratase, Gmd) 유전자 gmd와 GDP-L-푸코오스 신타아제 (GDP-L-fucose-synthase, WcaG) 유전자 wcaG를 발현하고, 코리네박테리움 글루타미쿰에 최적화된 α-1,2-푸코오스 전이효소 (α-1,2- fucosyltransferase) 유전자인 COfucT2 (Codon-optimized fucT2, 코돈 최적화를 통해 fucT2의 일부 염기를 변형한 것)를 발현하는 플라스미드인 pEGWTT(CO)를 이용하였다. 이때, 상기 pEGWTT(CO)는 pEGWTT 유전자를 코리네박테리움에 맞도록 코돈최적화한 것을 의미한다.

또한, 포스포만노뮤타아제 (Phosphomannomutase) 유전자 manB와 GTP-만노오스-1-포스페이트 구아닐트랜스퍼라아제 (GTP-mannose-1-phosphate guanylyltransferase) 유전자인 manC 그리고 락토오스 퍼미아제를 도입하기 위한 lacYA를 발현하는 pVBCL 벡터에, 푸코실락토오스 수송체 (Fucosyllactose exporter) 유전자 카세트인 blon2204 -2203 카세트를 도입하여 pVBCLE 플라스미드를 구축하였다. 즉, 중합효소연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction, PCR)을 이용하여 blon2204-2203 카세트를 증폭시킬 수 있는 DNA 프라이머 (F_inf_ SpeⅠ _RBS_Exp, R_inf_ SpeⅠ_Exp)에 제한효소부위 및 리보솜부착부위 (Ribosome Binding Site, RBS)를 추가하여 blon2204 -2203 카세트를 PCR로 증폭하고, pVBCL 벡터에 SpeⅠ 제한효소를 이용하여 blon2204-2203 카세트를 삽입한 것이다. 상기 blon2204 -2203 카세트는 푸코실락토오스(fucosyllacose)의 수송관 관련된 ABC 트랜스포터 퍼미아제(transporter permease)이다.

또한, △P (△pfkA , Phosphofurctokinase A 유전자가 녹아웃된 코리네박테리움 글루타미쿰) 균주를 구축하기 위하여, pK19mobsacB 플라스미드를 이용하는 이중교차파쇄방법 (Double crossover method)을 이용하였다. pfkA의 개시코돈에서 311 bp (Base pair), 종결코돈에서 거꾸로 382 bp DNA 조각을 서로 이어 붙여 파쇄된 pfkA를 만듦과 동시에 이를 증폭하기 위하여, 다음 DNA 프라이머들, F1_BamHⅠ_pfkA_dis, R1_pfkA_dis.ovl, F2_pfkA_dis.ovl, R2_EcoRⅠ_pfkA_dis로 오버랩중합효소연쇄반응 (Overlapping Polymerase Chain Reaction, Overlapping PCR)을 수행하였고, 이를 제한효소 BamHⅠ과 EcoRⅠ을 이용하여 pK19mobsacB 벡터에 삽입함으로써 pK19-△pfkA 벡터를 구축하였다. 이렇게 제작한 pK19-△pfkA 벡터를 전기천공법 (Electroporation)을 이용하여 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰에 삽입하였다. 그 후 pK19-△pfkA 벡터를 가지고 있는 코리네박테리움 글루타미쿰을 수크로스(Sucrose) 10%가 첨가된 LBG (Luria-Bertani, LB: 1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% Sodium chloride로 구성. LBG는 LB 배지에 0.5% Sodium acetate, 5g/L glucose가 추가된 배지) 아가 플레이트(agar plate)에 도말(Spreading)한 후, 형성된 콜로니를 취하여 F1_BamHⅠ_pfkA_dis, R2_EcoRⅠ_pfkA_dis 프라이머를 이용하는 콜로니 PCR을 통해 증폭된 pfkA 조각 사이즈를 비교하여 파쇄된 pfkA를 가지고 있는 △P 균주를 최종 선별하였다 (도 3). 도 3은 파쇄된 pfkA를 DNA 조각 크기로 확인한 전기영동 사진이다. 1041 bp로 표시되어 있는 것은 원래의 pfkA이고 693 bp로 표시되어 있는 것이 가운데 부분이 삭제된 pfkA이다.

한편, 상기에서 사용된 manB, manC, gmd, wcaG, lacYA, COfucT2, Fucosyllactose exporter 유전자 (blon2204 -2203), pfkA, △pfkA의 유전자 서열, 균주, 플라스미드 및 올리고뉴클레오티드를 하기 표 1 내지 3에 기재하였다.

유전자명	서열번호
manB	서열번호 1
manC	서열번호 2
gmd - wcaG	서열번호 3
lacYA	서열번호 4
COfucT2	서열번호 5
blon2204 -2203	서열번호 6
pfkA	서열번호 7
△pfkA	서열번호 8

균주	관련된 특징
E. coli TOP10	F^-, mcrA Δ(mrr - hsdRMS- mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 araD139 Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL (Str^R) endA1 nupG
C. glutamicum	Wild-type strain, ATCC13032
△P	C. glutmaicum ATCC13032 △pfkA
플라스미드	관련된 특징
pEKEX2	Km^R ;C . glutamicum/E. coli shuttle vector for regulated gene expression (P_tac,lacIq,pBL1, oriVC.g., oriVE.c.)
pVWEX2	Tc^R ;C . glutamicum/E. coli shuttle vector for regulated gene expression (P_tac,lacIq,pBL1, oriVC.g., oriVE.c.)
pK19mobsacB	Mobilizable vector, Km^R
pEGWTT(CO)	pEKEx2 + gmd - wcaG + COfucT2 w/ tac promoter
pVBCL	pVWEx2 + manB + manC + lacYA
pVBCLE	pVWEx2 + manB + manC + lacYA + Fucosyllactose exporter gene
pK19-βpfkA	pK19mobsacB + disrupted pfkA (311 bp from the start codon of pfkA - 382 bp from the middle of pfkA to stop codon)

프라이머 이름	서열(5'→2')	서열번호
F_inf_SpeI_RBS_Exp (pVBCLE)	TCGTCTGATCAGTAG ACTAGT AAGGAGATATACA ATGACAAATGCAACGGCGC	서열번호 9
R_inf_SpeI_Exp(pVBCLE)	CGGGGATCCGG ACTAGT TCACTGCTTGACAGAGCCG	서열번호 10
F1_BamHI_pfkA_dis(pK19-ΔpfkA)	CGGGATCC ATGGAAGACATGCGAATTGCTACT	서열번호 11
R1_pfkA_dis.ovl(pK19-ΔpfkA)	CCGCAACGACGATAATG ATTGGGATAAGGGCATCGATGC	서열번호 12
F2_pfkA_dis.ovl(pK19-ΔpfkA)	GATGCCCTTATCCCAAT CATTATCGTCGTTGCGGAAGG	서열번호 13
R2_EcoRI_pfkA_dis(pK19-ΔpfkA)	CGGAATTC CTATCCAAACATTGCCTGGGC	서열번호 14

* 이탤릭체로 표시된 서열은 RBS (Ribosome Binding Site) 및 스페이서(spacer)를 나타냄.

* 굵은 글씨체는 특정 제한효소의 인식 부위를 나타냄.

* 밑줄 표시 서열은 파쇄된 pfkA 조각을 구축하기 위한 오버랩되는(overlapped) 부위를 나타냄.

[실시예 2: 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰을 이용한 2-FL의 생산]

(1) 배양 조건 및 방법

씨드세포배양에는 항생제 (kanamycin 25㎍/㎖, tetracycline 5㎍/㎖)가 포함된 5㎖의 BHI (Brain Heart Infusion) 배지가 담긴 시험관을 이용하였고, 온도는 30℃, 교반 속도를 250rpm으로 유지하며 12시간 동안 배양하였다.

회분식 배양 (Batch culture)은 100㎖의 배지((NH₄)₂SO₄ 20g/L, urea 5g/L, KH₂PO₄ 1g/L, K₂HPO₄ 1g/L, MgSO₄ 0.25g/L, MOPS 42g/L, CaCl₂ 10㎎/L, Biotin 0.2㎎/L, Protocatechuic acid 30㎎/L, FeSO₄7H₂0 10㎎/L, MnSO₄H₂O 10㎎/L, ZnSO₄7H₂O 1㎎/L, CuSO₄ 0.2㎎/L, NiCl₂6H₂O 0.02㎎/L, pH7.0)가 담긴 250㎖ 플라스크에서 30℃로 수행하였다. 교반 속도는 250rpm으로 유지하며 배양하였다. 회분식 배양시에는 광학밀도 (OD₆₀₀)가 0.8에 도달한 시점에 tac 프로모터-매개 유전자 발현을 유도하여 2'-푸코실락토오스를 생산하기 위해 IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside), 락토오스를 최종 농도가 각각 1.0mM, 10g/L가 되도록 첨가하였다.

한편, 고농도 세포배양을 위해 유가식 배양 (Fed-batch culture)을 수행하였다. 유가식 배양에 접종하기 위한 씨드세포준비배양은 100㎖의 배지((NH₄)₂SO₄ 20g/L, urea 5g/L, KH₂PO₄ 1g/L, K₂HPO₄ 1g/L, MgSO₄ 0.25g/L, MOPS 42g/L, CaCl₂ 10㎎/L, Biotin 0.2㎎/L, Protocatechuic acid 30㎎/L, FeSO₄7H₂0 10㎎/L, MnSO₄H₂O 10㎎/L, ZnSO₄7H₂O 1㎎/L, CuSO₄ 0.2㎎/L, NiCl₂6H₂O 0.02㎎/L, pH7.0)가 담긴 250㎖ 플라스크에 프럭토오스가 40g/L가 되도록 첨가한 후, 30℃, 250rpm으로 교반을 수행하였고, 광학밀도 (OD₆₀₀)가 0.8에 도달한 시점에 IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside), 글루코오스, 락토오스를 최종 농도가 각각 1.0mM, 20g/L, 10g/L가 되도록 첨가하였다. 이후, 광학밀도 (OD₆₀₀)가 20에 도달한 시점에서 이를 이용하여 유가식 배양을 수행하였으며, 40g/L의 프럭토오스, 20g/L의 글루코오스, 20g/L의 락토오스 및 항생제 (kanamycin 25㎍/㎖, tetracycline 5㎍/㎖), IPTG 1.0mM를 포함하는 1.0L의 최소배지가 담긴 2.5L 용량의 세포배양기 (Bioreactor, Kobiotech, Incheon, Korea)에서 배양을 실시하였다.

세포가 지수생장기에 진입하였을 때, 800g/L의 프럭토오스 피딩용액 (Feeding solution)을 2.8g/L/h 속도의 연속식 (Continuous feeding)방법으로 공급하였다. 공급속도는 배양 동안의 평균 속도를 말하며, 세포가 폭발적으로 생장하는 시기와 이후 생장이 멈춘 시기에서의 공급속도는 다를 수 있다. 글루코오스는 배양액 속에 10~20g/L 수준으로 유지될 수 있도록 간헐적으로 첨가하였다. 배양 도중 배지의 pH가 설정포인트 (Set point)보다 더 낮아지면 자동으로 28%의 NH₄OH가 공급되고, 높아지면 2N HCl이 첨가되어 pH가 일정범위 (pH6.98~7.02)안에서 유지되도록 조절하였다. 배지의 pH는 pH 전극 (Mettler Toledo, USA)을 사용하여 실시간으로 측정되었다. 교반 속도 및 통기 속도는 산소결핍을 방지하기 위하여 각각 1000rpm 및 2vvm으로 유지하였다.

건조세포중량 (Dry Cell Weight, DCW)은 광학밀도 (Optical density, OD)에 미리 측정한 변환 상수 0.3을 곱해 결정하였다. 광학밀도 (OD)는 샘플을 적절하게 희석하여 0.1-0.5 사이의 범위에 맞춘 후에 분광광도계 (Spectrophotometer, Ultrospec 2000, Amersham Pharmacia Biotech, USA)를 사용하여 흡광도 600㎚에서 측정하였다.

2'-푸코실락토오스, 락토오스, 락테이트, 글루코오스 및 프럭토오스 농도는 'Carbohydrate Analysis column (Rezex ROA-organic acid, Phenomenex, USA)' 및 'RI (refractive index)' 검출기가 장착된 HPLC (High Performance Liquid Chromatography (Agilent 1100LC, USA))를 이용하여 측정하였다. 60℃로 유지되는 컬럼을 적용하여, 10배 희석된 20㎕의 세포배양액을 분석하였다. 0.6㎖/min 유속으로 5mM의 H₂SO₄ 용액을 이동상으로 사용하였다.

한편, 세포 안에 존재하는 2'-푸코실락토오스의 양을 측정하기 위하여 세포를 파괴하는데 두 가지 방법이 사용되었다. 배양이 끝난 후에 Triton X-100이 1%가 되도록 첨가한 후, 배양조건과 동일한 조건 (30℃, 250rpm)으로 10~12시간 동안 방치하였다. 이때 배양액에서 측정되는 2'-푸코실락토오스는 배양 종료 시점 당시 배양액 상에 존재하는 2'-푸코실락토오스와 세포 안에 존재하고 있던 2'-푸코실락토오스의 양을 합한 것이라 할 수 있다. 이 전체 양에서 배양 종료 당시 측정했던 배양액에 존재하는 2'-푸코실락토오스의 양을 빼면 세포 내부에 존재하고 있었던 2'-푸코실락토오스의 양을 확인할 수 있다 (Total 2'-FL - Extracellular 2'-FL = Intracellular 2'-FL).

다른 방법으로는 세포를 수확하여 상등액을 버리고 동일 양의 3차 증류수에 다시 풀어 (Resuspension) 끓는 물에 5분간 방치하여 세포를 파괴한 다음, 상등액을 분석하면 세포 내부에 존재하는 2'-푸코실락토오스의 양을 측정할 수 있다. 두 방법을 모두 사용하여 세포 내부의 2'-푸코실락토오스의 양을 측정하였으며, 두 방법으로 측정된 값에 유의미한 차이는 없었다. 본 발명에서 소개하는 결과값은 Triton X-100을 사용하여 측정한 값임을 알리는 바이다.

한편, 배양 중 푸코실락토오스를 세포 밖으로 내보내는 능력 (Fucosyllactose export)을 측정하기 위하여 다음 실험을 수행하였다. 100㎖ 수준의 회분식 배양을 수행하면서 IPTG 유도발현 이후 20시간이 지났을 때, 광학밀도 (OD₆₀₀) 100의 세포농도로 존재하는 10㎖의 세포액을 얻기 위해 적절한 양의 배양액을 취하여 세포를 수확하고, 이를 10㎖의 신선배지 (Fresh medium)에 풀었다. 그 다음 일정 시간 간격을 두고 샘플을 취하여 상등액에 존재하는 2'-푸코실락토오스를 측정하여 일정 시간 동안 세포 밖으로 빠져나온 양을 측정하였다.

(2) 실험 결과

1) 푸코실락토오스 수송체 (Fucosyllactose exporter, Exporter) 도입을 통한 2'-푸코실락토오스 생산량 증대

푸코실락토오스 수송체 (Fucosyllactose exporter, Exporter) 도입을 통하여 2'-푸코실락토오스의 생산량이 증대하는지 확인하고, 이것이 세포 내 존재하는 2'-푸코실락토오스를 세포 밖으로 내보낸 결과인지 여부를 확인하기 위하여, 수송체가 도입되지 않은 균주와 수송체를 도입한 균주를 가지고 회분식 배양을 진행하였다.

두 균주는 상기 실시예 1에서 제작된 플라스미드로 코리네박테리움 글루타미쿰을 형질전환함으로써 제작되었는데, 기본적으로 manB , manC , gmd , wcaG , COfucT2 및 lacZ가 제거된 lac 오페론 (lacYA)을 발현하여 2'-푸코실락토오스를 생산할 수 있는 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰이고, 수송체를 암호화하는 유전자가 도입된 경우와 그렇지 않은 경우의 2개 균주를 가지고 실험을 수행하였다. 대조군은 C. glutamicum harboring pVBCL and pEGWTT(CO)이었고, Exporter 도입 균주는 C. glutamicum harboring pVBCLE and pEGWTT(CO)이었다. 광학밀도 (OD₆₀₀)가 0.8에 도달한 시점에서 IPTG, 락토오스를 최종 농도가 각각 1.0mM, 10g/L가 되도록 첨가하여 위의 유전자들이 유도발현 되도록 하였다.

100㎖의 최소배지에서 플라스크 회분식 배양을 실시한 결과, 수송체가 없는 균주(이하, 대조군)에서는 0.60g/L의 2'-푸코실락토오스가 생산되었고, 수송체를 도입한 균주에서는 대조군보다 52% 증가한 0.83g/L의 2'-푸코실락토오스가 생산되었다. 이후, 세포 내의 2'-푸코실락토오스의 양을 확인하기 위하여, 1%가 되도록 Triton X-100을 배양이 끝난 배양액에 첨가하였으며, 측정된 전체 2'-푸코실락토오스의 양은 대조군에서 1.56g/L, 수송체를 도입한 균주에서 1.42g/L이었다. 이를 토대로 계산한 세포 내의 2'-푸코실락토오스 양은 대조군에서 0.96g/L, 수송체를 도입한 균주에서 0.59g/L이었다. 이를 건조세포중량 당 2'-푸코실락토오스의 양으로 비교해보면, 대조군은 7.32% 수준인데 반하여 수송체를 도입한 균주는 4.51% 수준으로 감소하였다. 이를 통하여 수송체의 도입으로 세포 안의 2'-푸코실락토오스가 세포 밖으로 분출되어 2'-푸코실락토오스의 생산량이 증대됨을 확인할 수 있었다(표 4, 도 4 내지 도 5). 도 4는 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 (대조군(C. glutamicum harboring pVBCL and pEGWTT(CO)) 및 Exporter 도입 균주(C. glutamicum harboring pVBCLE and pEGWTT(CO)))를 이용한 플라스크 회분식 배양결과를 나타낸 그래프이고 (광학밀도 (OD₆₀₀)가 약 0.8에 도달했을 때, IPTG와 락토오스를 최종 농도가 각각 1.0 mM, 10 g/L (화살표)이 되도록 첨가하였다. 그래프 중 기호는 다음과 같다: ●: 건조세포중량 (DCW), ■: 글루코오스 (Glucose), ▲: 락토오스 (Lactose), ◆: 2'-푸코실락토오스 (2'-FL), ▼: 락테이트 (Lactate)), 도 5는 도 4에서의 대조군과 수송체 도입 균주 간의 세포 내 (Intracellular) 2'-푸코실락토오스 양과 세포 밖 (Extracellular)의 2'-푸코실락토오스의 양을 비교한 그래프이다.

재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 (대조군: C. glutamicum harboring pVBCL and pEGWTT(CO), Exporter 도입 균주: C. glutmaicum harboring pVBCLE and pEGWTT(CO))을 이용한 플라스크 회분식 배양 결과

	최대 건조 세포 중량 (g/L)	최대 2'-푸코실락토오스 농도^* (g/L)	수율^# (mole 2'-푸코실락토오스 /mole 락토오스)	생산성^# (mg/L/h)
대조군	13.1	0.60	0.76	8.33
Expoter 도입 균주	13.1	0.83	0.98	11.5

^* 2'-푸코실락토오스의 농도는 배양액 상에 있는 것만을 정량한 수치임.

^#수율과 생산성은 전체 배양시간을 기반으로 계산한 값임.

다음으로, 배양 중 특정 시점에서 2'-푸코실락토오스를 세포 밖으로 내보내는 능력을 비교해 보고자 하였다. 회분식 배양을 진행하면서 IPTG 유도발현 후 20시간이 지났을 때, 광학밀도 (OD₆₀₀) 100의 세포농도로 존재하는 10㎖의 세포액을 얻기 위해 적절한 양의 배양액을 취하여 세포를 수확하고, 이를 10㎖의 신선배지 (Fresh medium)에 풀었다. 그 다음 회분식 배양과 동일한 조건인 30℃, 250rpm에서 배양하면서 5분의 간격을 두고 샘플을 취하여 상등액에 존재하는 2'-푸코실락토오스를 측정하여 30분 동안 세포 밖으로 빠져나온 양을 측정하였다.

실험 결과, 30분 동안 대조군에서는 18.1㎎/L의 2'-푸코실락토오스가 측정되었고, 수송체 도입 균주에서는 28.5㎎/L의 2'-푸코실락토오스가 측정되었다 (도 6). 도 6은 도 4에서의 대조군과 수송체 도입 균주 간의 세포 내 2'-푸코실락토오스 분비 능력을 비교한 그래프이다.

이를 통해, 배양 중 2'-푸코실락토오스가 세포 밖으로 계속 분비되는 것을 확인할 수 있었다.

2) pfkA 가 녹아웃된 균주와 프럭토오스 , 글루코오스 혼합당을 이용한 2'- 푸코실락토오스의 생산 증대 확인

△P (△pfkA, Phosphofurctokinase A 유전자가 녹아웃된 코리네박테리움 글루타미쿰) 균주를 이용하여 2'-푸코실락토오스를 생산하기 위해 △P 균주에 pVBCLE 벡터와 pEGWTT(CO) 벡터를 도입하였다. 이렇게 제작된 재조합 균주는 pfkA가 녹아웃되고, 2-FL을 세포 밖으로 분비하는 수송체(exporter)가 도입된 균주이다.

이 재조합 균주를 가지고 프럭토오스와 글루코오스를 이용하여 회분식 배양과 유가식 배양을 수행하였다. 먼저, 회분식 배양은 상기에서 확인할 수 있듯이, 250㎖ 플라스크에 100㎖의 최소배지가 들어 있는 환경에서 수행하였다. 초기 당 조성은 프럭토오스 40g/L로 설정하였으며, 광학밀도 (OD₆₀₀)가 0.8에 도달하였을 때, 글루코오스, 락토오스, IPTG가 각각 10g/L, 10g/L, 1.0mM이 되도록 첨가하였다.

배양 결과, 2.05g/L의 2'-푸코실락토오스가 생산되었다 (표 5, 도 7). 도 7은 pfkA가 녹아웃되고 수송체가 도입된 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 (△P harboring pVBCLE and pEGWTT(CO))을 이용한 플라스크 회분식 배양 결과를 나타낸 그래프이다. 광학밀도 (OD₆₀₀)가 약 0.8에 도달했을 때, IPTG와 락토오스, 글루코오스 농도가 각각 1.0mM, 10g/L, 10g/L (화살표)가 되도록 첨가하였다. 그래프 중 기호는 다음과 같다: ●: 건조세포중량 (DCW), ■: 글루코오스 (Glucose), ▲: 락토오스 (Lactose), ◆: 2'-푸코실락토오스 (2'-FL), ▼: 락테이트 (Lactate), X: 프럭토오스 (Fructose).

pfkA가 녹아웃되고 수송체가 도입된 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 (△P harboring pVBCLE and pEGWTT(CO))을 이용한 플라스크 회분식 배양 결과

	최대 건조 세포 중량 (g/L)	최대 2'-푸코실락토오스 농도^* (g/L)	수율^# (mole 2'-푸코실락토오스 /mole 락토오스)	생산성^# (mg/L/h)
회분식 배양	13.4	2.05	0.81	21.4

^#수율과 생산성은 전체 배양시간을 기반으로 계산한 값임.

다음으로, 고농도의 세포배양을 통하여 2'-푸코실락토오스를 고농도로 생산하기 위하여, 유가식 배양을 수행하였다. 유가식 배양에 접종할 씨드세포를 준비하기 위하여, 250㎖ 플라스크에 100㎖의 최소배지가 담긴 상태에서 씨드세포배양을 수행하였고, 이때, 2'-푸코실락토오스를 생산하기 위한 배양환경을 미리 조성해줌으로써 세포가 2'-푸코실락토오스 생산 배지에 적응할 수 있도록 하였다. 세포적응단계의 과정은 다음과 같다. 프럭토오스 40g/L가 포함된 배지에서 배양을 시작하여 광학밀도 (OD₆₀₀)가 0.8에 도달하였을 때, 글루코오스, 락토오스, IPTG가 각각 20g/L, 10g/L, 1.0mM이 되도록 첨가하였다. 이후 세포가 환경에 적응한 뒤 중간지수생장기 (Mid-log phase)에 접어들었다고 판단되는 시점, 즉 광학밀도 (OD₆₀₀)가 20에 도달하였을 시점 (DCW: 6g/L)을 본격적인 2'-푸코실락토오스를 생산하기 위한 상태가 된 것으로 판단하였다.

유가식 배양은 2.5L 용량의 세포배양기 (Bioreactor)에서 실시하였다. 상기 방법으로 준비한 씨드세포를 프럭토오스 40g/L, 글루코오스 20g/L, 락토오스 20g/L, 항생제 (kanamycin 25㎍/㎖, tetracycline 5㎍/㎖), IPTG 1.0mM를 포함하는 최소배지 1.0L에 접종하였다. 이후 광학밀도 (OD₆₀₀)가 20에 도달하였을 때, 원활한 세포생장 및 2'-푸코실락토오스의 생산을 위하여 800g/L의 프럭토오스 피딩용액을 평균 2.8g/L/h의 속도의 연속식 방법 (Continuous feeding)으로 첨가하였으며, 동시에 글루코오스가 10-20g/L 수준으로 존재하도록 첨가해 주었다.

배양 결과, 최종적으로 21.5g/L의 농도로 2'-푸코실락토오스가 생산되었다 (표 6, 도 8). 도 8은 pfkA가 녹아웃되고 수송체가 도입된 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 (△P harboring pVBCLE and pEGWTT(CO))의 유가식 배양 결과를 나타낸 그래프이다. 광학밀도 (OD₆₀₀)가 20에 이르렀을 때, 프럭토오스를 연속식으로 공급하였고 (Continuous feeding), 글루코오스는 10~20g/L 수준으로 유지하고자 배양 중간에 첨가하였다. 배양 중에 수행했던 조치들은 화살표로 표시 및 설명하였다. 그래프 중 기호는 다음과 같다. ●: 건조세포중량 (DCW), ■: 글루코오스 (Glucose), ▲: 락토오스 (Lactose), ◆: 2'-푸코실락토오스 (2'-FL), ▼: 락테이트 (Lactate), X: 프럭토오스 (Fructose).

pfkA가 녹아웃되고 수송체가 도입된 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 (△P harboring pVBCLE and pEGWTT(CO))을 이용한 유가식 배양 결과

	최대 건조 세포 중량 (g/L)	최대 2'-푸코실락토오스 농도^* (g/L)	수율^# ^% (mole 2'-푸코실락토오스 /mole 락토오스)	생산성^# (g/L/h)
회분식 배양	43.2	21.5	1.41	0.119

^#수율과 생산성은 전체 배양시간을 기반으로 계산한 값임.

^% 수율 (mole 2'-푸코실락토오스/mole 락토오스)이 1.0을 초과하는 것으로 계산됨.

한편, 코리네박테리움 글루타미쿰은 내건성(Osmotic stress)이 존재할 때, 트레할로스 (Trehalose)를 생성함이 알려졌다. 배양이 진행될수록 내건성이 커지고 이에 생성되는 트레할로스 (Trehalose)의 양이 점차 증가한다. 본 실험에서는 락토오스를 정량하는 방법으로 HPLC를 이용하였는데, 이 락토오스의 피크가 트레할로스의 피크와 겹쳐서 락토오스를 정확하게 측정하기 어려운 문제가 있었다 (도 9). 도 9는 도 8의 배양에서 84시간 때의 HPLC 피크 프로파일(peak profile)이다. 화살표로 표시한 것이 트레할로스 (Trehalose) 피크로 락토오스의 피크와 겹쳐져 있음을 확인할 수 있다.

<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> Enhanced production of 2'-fucosyllactose in Corynebacterium Glutamicum through introduction of fucosyllactose transporter and opimization of GDP-L-fucose biosynthetic pathway <130> YP-19-099 <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1377 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 1 atgcgtaccc gtgaatctgt cacggctgta attaaggcgt atgacgtccg tggtgttgtt 60 ggtgtcgata ttgatgctga tttcatttct gagactggcg ctgcctttgg tcggctcatg 120 cgtagtgagg gtgaaaccac cgttgctatt ggccatgaca tgcgtgattc ctcccctgaa 180 ttggccaagg cgtttgccga tggcgtgact gcacagggtt tggatgttgt tcatttggga 240 ctgacttcta ctgatgagct gtactttgcg tccggaacct tgaagtgtgc tggtgcgatg 300 tttactgcgt cgcataaccc cgctgagtac aacggcatca agttgtgtcg tgcgggtgct 360 cgtccggtcg gtcaggattc tggtttggcc aacatcattg atgatctggt tgagggtgtt 420 ccagcgtttg atggtgagtc aggttcggtt tctgagcagg atttgctgag cgcatatgcc 480 gagtacctca atgagcttgt tgatctgaag aacatccgcc cgttgaaggt tgctgtggat 540 gcggcaaacg gcatgggtgg gttcactgtc cctgaggtat tcaagggtct gccacttgat 600 gttgcgccac tgtattttga gcttgacggc aatttcccca accatgaggc caatcctctg 660 gagcctgcca acctggttga tttgcagaag tttaccgtag agaccggatc tgatatcggt 720 ttggcgttcg acggcgatgc ggatcgttgc ttcgtggtcg atgagaaggg ccagccagtc 780 agcccttcgg cgatctgtgc gatcgtagcg gagcgttact tggagaagct tccgggttcc 840 accatcatcc acaacctgat tacctctaag gctgtgcctg aggtgattgc tgaaaacggt 900 ggcactgcgg tgcgtactcg cgtgggtcac tccttcatca aggcgaagat ggcagagacc 960 ggtgcggcct ttggtggcga gcactctgcg cactactact tcactgagtt cttcaatgcg 1020 gactccggca ttttggctgc gatgcacgtg ctggctgcgc tgggaagcca ggaccagcca 1080 ctcagtgaga tgatggctag gtataaccgg tacgttgctt caggcgagtt gaactcccgt 1140 ttggctaatg cagaggcgca gcaagagcgc acccaggctg tgctcgatgc gttcgctgat 1200 cgcaccgagt ccgtggacac ccttgacggc gtgactgtgg aactcaagga cacctccgcg 1260 tggttcaacg tgcgtgcgtc caacaccgag ccgctgcttc gcctcaatgt tgaagctgca 1320 tcgaaggaag aagtcgatgc gttggtagcg gagattctag ggattatccg cgcataa 1377 <210> 2 <211> 1089 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 2 atgactttaa ctgacaacag caaaaacgtt gatgctgtca tcttggtcgg tggcaaaggt 60 acccgactgc gccccctgac cgtcaatact ccaaagccaa tgctgccaac tgctggccac 120 ccattcttga cccacctttt ggcccgcatc aaggccgcag gcatcacaca cgtcgtgctg 180 ggaacgtcat tcaaagctga agtcttcgag gaatacttcg gagatggctc cgaaatgggc 240 ttggaaattg aatatgtcgt cgaggatcag cctttgggca ctggtggtgg catccgaaac 300 gtctacgaca agctgcgtca cgatactgcg attgtgttca acggcgatgt gctctccggt 360 gcggatctca acagcattct ggacacccac cgcgaaaagg acgcagatct gaccatgcat 420 ctcgtgcgcg tagctaaccc tcgtgcgttt ggttgcgtcc ccaccgatga ggatggtcgc 480 gtcagcgaat tccttgaaaa gaccgaagat ccaccaaccg atcagatcaa cgccggctgc 540 tacgtgttca agaaggaact catcgagcag atcccggcag gccgagcagt ttccgtcgag 600 cgcgaaacct tccctcagct gttggaagaa ggcaagcgag tcttcggcca cgtcgacgct 660 tcctactggc gcgacatggg caccccaagc gacttcgtcc gcggctcggc tgacctggtc 720 cgcggcattg cgtactcccc attgctcgaa ggcaaaacag gagagtcgct tgtcgacgcc 780 tccgccggcg ttcgcgacgg cgtcctgctg ctcggcggaa ccgtagtcgg ccgcggcact 840 gagatcggtg ccggctgccg cgttgacaac actgttattt tcgacggcgt caccattgaa 900 ccaggtgcgg tcattgaaaa ttccatcatt tcctcgggag cacgcatcgg tgctaatgcg 960 cacatctccg gttgcatcat tggcgagggc gcacaggttg gtgctcggtg tgaactcaac 1020 gcagggatgc gcgtcttccc aggcgttgtg atcccagaca gcggaattcg tttttcgtct 1080 gatcagtag 1089 <210> 3 <211> 2090 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 3 atgtcaaaag tcgctctcat caccggtgta accggacaag acggttctta cctggcagag 60 tttctgctgg aaaaaggtta cgaggtgcat ggtattaagc gtcgcgcatc gtcattcaac 120 accgagcgcg tggatcacat ttatcaggat ccgcacacct gcaacccgaa attccatctg 180 cattatggcg acctgagtga tacctctaac ctgacgcgca ttttgcgtga agtacagccg 240 gatgaagtgt acaacctggg cgcaatgagc cacgttgcgg tctcttttga gtcaccagaa 300 tataccgctg acgtcgacgc gatgggtacg ctgcgcctgc tggaggcgat ccgcttcctc 360 ggtctggaaa agaaaactcg tttctatcag gcttccacct ctgaactgta tggtctggtg 420 caggaaattc cgcagaaaga gaccacgccg ttctacccgc gatctccgta tgcggtcgcc 480 aaactgtacg cctactggat caccgttaac taccgtgaat cctacggcat gtacgcctgt 540 aacggaattc tcttcaacca tgaatccccg cgccgcggcg aaaccttcgt tacccgcaaa 600 atcacccgcg caatcgccaa catcgcccag gggctggagt cgtgcctgta cctcggcaat 660 atggattccc tgcgtgactg gggccacgcc aaagactacg taaaaatgca gtggatgatg 720 ctgcagcagg aacagccgga agatttcgtt atcgcgaccg gcgttcagta ctccgtgcgt 780 cagttcgtgg aaatggcggc agcacagctg ggcatcaaac tgcgctttga aggcacgggc 840 gttgaagaga agggcattgt ggtttccgtc accgggcatg acgcgccggg cgttaaaccg 900 ggtgatgtga ttatcgctgt tgacccgcgt tacttccgtc cggctgaagt tgaaacgctg 960 ctcggcgacc cgaccaaagc gcacgaaaaa ctgggctgga aaccggaaat caccctcaga 1020 gagatggtgt ctgaaatggt ggctaatgac ctcgaagcgg cgaaaaaaca ctctctgctg 1080 aaatctcacg gctacgacgt ggcgatcgcg ctggagtcat aagcatgagt aaacaacgag 1140 tttttattgc tggtcatcgc gggatggtcg gttccgccat caggcggcag ctcgaacagc 1200 gcggtgatgt ggaactggta ttacgcaccc gcgacgagct gaacctgctg gacagccgcg 1260 ccgtgcatga tttctttgcc agcgaacgta ttgaccaggt ctatctggcg gcggcgaaag 1320 tgggcggcat tgttgccaac aacacctatc cggcggattt catctaccag aacatgatga 1380 ttgagagcaa catcattcac gccgcgcatc agaacgacgt gaacaaactg ctgtttctcg 1440 gatcgtcctg catctacccg aaactggcaa aacagccgat ggcagaaagc gagttgttgc 1500 agggcacgct ggagccgact aacgagcctt atgctattgc caaaatcgcc gggatcaaac 1560 tgtgcgaatc atacaaccgc cagtacggac gcgattaccg ctcagtcatg ccgaccaacc 1620 tgtacgggcc acacgacaac ttccacccga gtaattcgca tgtgatccca gcattgctgc 1680 gtcgcttcca cgaggcgacg gcacagaatg cgccggacgt ggtggtatgg ggcagcggta 1740 caccgatgcg cgaatttctg cacgtcgatg atatggcggc ggcgagcatt catgtcatgg 1800 agctggcgca tgaagtctgg ctggagaaca cccagccgat gttgtcgcac attaacgtcg 1860 gcacgggcgt tgactgcact atccgcgagc tggcgcaaac catcgccaaa gtggtgggtt 1920 acaaaggccg ggtggttttt gatgccagca aaccggatgg cacgccgcgc aaactgctgg 1980 atgtgacgcg cctgcatcag cttggctggt atcacgaaat ctcactggaa gcggggcttg 2040 ccagcactta ccagtggttc cttgagaatc aagaccgctt tcgggggtaa 2090 <210> 4 <211> 3335 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 4 accatcgaat ggcgcaaaac ctttcgcggt atggcatgat agcgcccgga agagagtcaa 60 ttcagggtgg tgaatgtgaa accagtaacg ttatacgatg tcgcagagta tgccggtgtc 120 tcttatcaga ccgtttcccg cgtggtgaac caggccagcc acgtttctgc gaaaacgcgg 180 gaaaaagtgg aagcggcgat ggcggagctg aattacattc ccaaccgcgt ggcacaacaa 240 ctggcgggca aacagtcgtt gctgattggc gttgccacct ccagtctggc cctgcacgcg 300 ccgtcgcaaa ttgtcgcggc gattaaatct cgcgccgatc aactgggtgc cagcgtggtg 360 gtgtcgatgg tagaacgaag cggcgtcgaa gcctgtaaag cggcggtgca caatcttctc 420 gcgcaacgcg tcagtgggct gatcattaac tatccgctgg atgaccagga tgccattgct 480 gtggaagctg cctgcactaa tgttccggcg ttatttcttg atgtctctga ccagacaccc 540 atcaacagta ttattttctc ccatgaagac ggtacgcgac tgggcgtgga gcatctggtc 600 gcattgggtc accagcaaat cgcgctgtta gcgggcccat taagttctgt ctcggcgcgt 660 ctgcgtctgg ctggctggca taaatatctc actcgcaatc aaattcagcc gatagcggaa 720 cgggaaggcg actggagtgc catgtccggt tttcaacaaa ccatgcaaat gctgaatgag 780 ggcatcgttc ccactgcgat gctggttgcc aacgatcaga tggcgctggg cgcaatgcgc 840 gccattaccg agtccgggct gcgcgttggt gcggatatct cggtagtggg atacgacgat 900 accgaagaca gctcatgtta tatcccgccg ttaaccacca tcaaacagga ttttcgcctg 960 ctggggcaaa ccagcgtgga ccgcttgctg caactctctc agggccaggc ggtgaagggc 1020 aatcagctgt tgcccgtctc actggtgaaa agaaaaacca ccctggcgcc caatacgcaa 1080 accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc tggcacgaca ggtttcccga 1140 ctggaaagcg ggcagtgagc gcaacgcaat taatgtgagt tagctcactc attaggcacc 1200 ccaggcttta cactttatgc ttccggctcg tatgttgtgt ggaattgtga gcggataaca 1260 atttcacaca ggaaacagct atgtactatt taaaaaacac aaacttttgg atgttcggtt 1320 tattcttttt cttttacttt tttatcatgg gagcctactt cccgtttttc ccgatttggc 1380 tacatgacat caaccatatc agcaaaagtg atacgggtat tatttttgcc gctatttctc 1440 tgttctcgct attattccaa ccgctgtttg gtctgctttc tgacaaactc gggctgcgca 1500 aatacctgct gtggattatt accggcatgt tagtgatgtt tgcgccgttc tttattttta 1560 tcttcgggcc actgttacaa tacaacattt tagtaggatc gattgttggt ggtatttatc 1620 taggcttttg ttttaacgcc ggtgcgccag cagtagaggc atttattgag aaagtcagcc 1680 gtcgcagtaa tttcgaattt ggtcgcgcgc ggatgtttgg ctgtgttggc tgggcgctgt 1740 gtgcctcgat tgtcggcatc atgttcacca tcaataatca gtttgttttc tggctgggct 1800 ctggctgtgc actcatcctc gccgttttac tctttttcgc caaaacggat gcgccctctt 1860 ctgccacggt tgccaatgcg gtaggtgcca accattcggc atttagcctt aagctggcac 1920 tggaactgtt cagacagcca aaactgtggt ttttgtcact gtatgttatt ggcgtttcct 1980 gcacctacga tgtttttgac caacagtttg ctaatttctt tacttcgttc tttgctaccg 2040 gtgaacaggg tacgcgggta tttggctacg taacgacaat gggcgaatta cttaacgcct 2100 cgattatgtt ctttgcgcca ctgatcatta atcgcatcgg tgggaaaaac gccctgctgc 2160 tggctggcac tattatgtct gtacgtatta ttggctcatc gttcgccacc tcagcgctgg 2220 aagtggttat tctgaaaacg ctgcatatgt ttgaagtacc gttcctgctg gtgggctgct 2280 ttaaatatat taccagccag tttgaagtgc gtttttcagc gacgatttat ctggtctgtt 2340 tctgcttctt taagcaactg gcgatgattt ttatgtctgt actggcgggc aatatgtatg 2400 aaagcatcgg tttccagggc gcttatctgg tgctgggtct ggtggcgctg ggcttcacct 2460 taatttccgt gttcacgctt agcggccccg gcccgctttc cctgctgcgt cgtcaggtga 2520 atgaagtcgc ttaagcaatc aatgtcggat gcggcgcgag cgccttatcc gaccaacata 2580 tcataacgga gtgatcgcat tgaacatgcc aatgaccgaa agaataagag caggcaagct 2640 atttaccgat atgtgcgaag gcttaccgga aaaaagactt cgtgggaaaa cgttaatgta 2700 tgagtttaat cactcgcatc catcagaagt tgaaaaaaga gaaagcctga ttaaagaaat 2760 gtttgccacg gtaggggaaa acgcctgggt agaaccgcct gtctatttct cttacggttc 2820 caacatccat ataggccgca atttttatgc aaatttcaat ttaaccattg tcgatgacta 2880 cacggtaaca atcggtgata acgtactgat tgcacccaac gttactcttt ccgttacggg 2940 acaccctgta caccatgaat tgagaaaaaa cggcgagatg tactcttttc cgataacgat 3000 tggcaataac gtctggatcg gaagtcatgt ggttattaat ccaggcgtca ccatcgggga 3060 taattctgtt attggcgcgg gtagtatcgt cacaaaagac attccaccaa acgtcgtggc 3120 ggctggcgtt ccttgtcggg ttattcgcga aataaacgac cgggataagc actattattt 3180 caaagattat aaagttgaat cgtcagttta aattataaaa attgcctgat acgctgcgct 3240 tatcaggcct acaagttcag cgatctacat tagccgcatc cggcatgaac aaagcgcagg 3300 aacaagcgtc gcatcatgcc tctttgaccc acagc 3335 <210> 5 <211> 903 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COfucT2 <400> 5 atggcgttta aagtggtgca aatttgcgga ggcttgggta accaaatgtt tcagtacgcc 60 ttcgctaaaa gtttgcaaaa gcattccaac acgccggtgc tgctcgatat cactagcttt 120 gattggtctg atcgcaaaat gcaactggaa ctttttccga ttgacttgcc atacgcctcg 180 gcgaaagaga tcgcgatcgc taaaatgcag cacctcccga agctagtccg cgatgcactg 240 aagtgcatgg gcttcgaccg cgtgtctcaa gaaatcgttt tcgaatacga gccgaagctt 300 ctcaagccaa gccgcctcac ttatttcttc ggctacttcc aggacccacg atactttgat 360 gctatctccc ctttaatcaa gcaaaccttc accctgccac ccccccccga aaacaacaag 420 aataataata agaaagagga agagtatcag tgcaagcttt cactcatcct cgccgctaag 480 aatagcgtgt ttgttcacat ccgtcgcggt gactatgtcg gcattggctg tcagctgggt 540 attgattacc agaagaaggc tcttgagtac atggcaaagc gcgtgccaaa catggaactt 600 ttcgtgtttt gcgaagatct ggaattcaca cagaaccttg accttggata ccctttcatg 660 gatatgacca cccgtgacaa ggaggaagaa gcgtactggg acatgctgct catgcagtct 720 tgccagcacg ccattatcgc aaactccacc tattcgtggt gggcagcgta cttgatcgag 780 aacccagaaa agattattat tggccctaaa cactggttgt tcgggcacga aaacatcctg 840 tgtaaagagt gggtgaaaat cgaatcccat ttcgaggtca aatcccagaa gtataacgca 900 taa 903 <210> 6 <211> 1890 <212> DNA <213> Bifidobacterium infantis <400> 6 atgagtgaag caatcgcaag accgcgttcc aagtcgctgc agcgcagaga cgccaaactg 60 gcgctcaagg caagcaagca ttacaagcgc atgcagcagc gtgagccggc tccgaagctg 120 accggcaagc agcgtgtgct caactggctg ctgcacatca ttatggctgt gatggtcatc 180 tactgcctcg tgccgctgct gtgggtcgtc ttctcttcca caaagaccag tgagggcatc 240 ttcagctctt tcggcctgtg gttcgatgac aagaatgtgt tctggcagaa cgtgcaggat 300 acgtttgctt atcagcatgg tgtctacact cgttggctgt tcaatacgat catgtacgca 360 gtggtagcag gtgttggtgc aaccatcatt gccactttcg ctgggtatgc catcgccacc 420 atgcgattcc ctggacgtaa cgccctgctg gccgtcactc tggcattcat gtcaattcct 480 tctacggtga tcaccgtgcc gctgttcctc atgtattcga agatcgggct ggtcggcact 540 ccgtgggccg tgattattcc gcagcttgcc acgccgttcg gcctgtatct gatgatcatc 600 tatgcgcaga cctcgattcc ggtctcgctg atcgaagccg cgaaactgga cggtgcaaac 660 acttggacca tcttctggaa ggtcggtttc ccgctgctgt ctccaggttt cgtcaccgta 720 ctgctgttca cgctggtcgg tgtttggaac aactacttcc tgccgctgat catgcttacg 780 aataccaacg actacccgtt gacggtcggt ctgaacatgt ggctgaagat gggtgcccag 840 ggaacttcag acggtcaggt tccgaacaac ctcatcatca cgggctcgct tatcgcagtt 900 gttccgttga tcatcgcatt catgttcctg caaaagtact ggcagtctgg cctcgcggcc 960 ggctctgtca agcagtgaat gacaaatgca acggcgcaac cggatacttc cgtgatgcgc 1020 aagccgaagc gccaatacat aggcatattg tattgtcttc catacgtggt ggtcttcctg 1080 ttcggcatga tcgtcccgat gttctacgcg ctttatctca gcttcttcaa gcagtccctt 1140 ctcggtggca ccacattcgc gggcttcgac aacttcatcc gagcgttcaa ggatgaggct 1200 ttgtggggcg gctttaggaa cgtgctgatt tacgcggcga tccagattcc gatgaatctg 1260 attctgtccc tcgtggcggc gctcgtcttg gactcccaga ggatccgcca tatcgcggtg 1320 ccgcgaatcc tgctgttcct gccttatgcc gtcccaggcg tcatcgcggc gctgatgtgg 1380 ggatacattt acggcgataa gtatggtctt tttggacaaa tcgccggtat gtttggcgta 1440 gcggctccta atatgttgtc gaagcagctc atgttgttcg ccatcgcgaa catctgcact 1500 tggtgcttcc ttggctataa catgctgatt tattattctg cactgatcgg cattccgaac 1560 gacctgtacg aatctgcccg tattgacggc gcttcggagc tgcgcatcgc ttggtccgtg 1620 aagatccccc agattaagag caccatcgtg atgacggtcc tcttctctgt gatcggcacg 1680 ctccagctgt tcaacgaacc gaacatcttg cgtacttccg ccccggacgt gatcaacagc 1740 agctatacgc cgaacatcta cacctacaac ctcgcattca atggccagaa cgtcaactat 1800 gccgctgccg tctctctggt catcggcatc atcgtcatgg ccttggtcgc cgtcgttaag 1860 atcatcggca acaagtggga gaacaagtga 1890 <210> 7 <211> 1041 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 7 atggaagaca tgcgaattgc tactctcacg tcaggcggcg actgccccgg actaaacgcc 60 gtcatccgag gaatcgtccg cacagccagc aatgaatttg gctccaccgt cgttggttat 120 caagacggtt gggaaggact gttaggcgat cgtcgcgtac agctgtatga cgatgaagat 180 attgaccgaa tcctccttcg aggcggcacc attttgggca ctggtcgcct ccatccggac 240 aagtttaagg ccggaattga tcagattaag gccaacttag aagacgccgg catcgatgcc 300 cttatcccaa tcggtggcga aggaaccctg aagggtgcca agtggctgtc tgataacggt 360 atccctgttg tcggtgtccc aaagaccatt gacaatgacg tgaatggcac tgacttcacc 420 ttcggtttcg atactgctgt ggcagtggct accgacgctg ttgaccgcct gcacaccacc 480 gctgaatctc acaaccgtgt gatgatcgtg gaggtcatgg gccgccacgt gggttggatt 540 gctctgcacg caggtatggc cggcggtgct cactacaccg ttattccaga agtacctttc 600 gatattgcag agatctgcaa ggcgatggaa cgtcgcttcc agatgggcga gaagtacggc 660 attatcgtcg ttgcggaagg tgcgttgcca cgcgaaggca ccatggagct tcgtgaaggc 720 cacattgacc agttcggtca caagaccttc acgggaattg gacagcagat cgctgatgag 780 atccacgtgc gcctcggcca cgatgttcgt acgaccgttc ttggccacat tcaacgtggt 840 ggaaccccaa ctgctttcga ccgtgttctg gccactcgtt atggtgttcg tgcagctcgt 900 gcgtgccatg agggaagctt tgacaaggtt gttgctttga agggtgagag cattgagatg 960 atcacctttg aagaagcagt cggaaccttg aaggaagttc cattcgaacg ctgggttact 1020 gcccaggcaa tgtttggata g 1041 <210> 8 <211> 693 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> the sequence for knocking-out pfkA <400> 8 atggaagaca tgcgaattgc tactctcacg tcaggcggcg actgccccgg actaaacgcc 60 gtcatccgag gaatcgtccg cacagccagc aatgaatttg gctccaccgt cgttggttat 120 caagacggtt gggaaggact gttaggcgat cgtcgcgtac agctgtatga cgatgaagat 180 attgaccgaa tcctccttcg aggcggcacc attttgggca ctggtcgcct ccatccggac 240 aagtttaagg ccggaattga tcagattaag gccaacttag aagacgccgg catcgatgcc 300 cttatcccaa tcattatcgt cgttgcggaa ggtgcgttgc cacgcgaagg caccatggag 360 cttcgtgaag gccacattga ccagttcggt cacaagacct tcacgggaat tggacagcag 420 atcgctgatg agatccacgt gcgcctcggc cacgatgttc gtacgaccgt tcttggccac 480 attcaacgtg gtggaacccc aactgctttc gaccgtgttc tggccactcg ttatggtgtt 540 cgtgcagctc gtgcgtgcca tgagggaagc tttgacaagg ttgttgcttt gaagggtgag 600 agcattgaga tgatcacctt tgaagaagca gtcggaacct tgaaggaagt tccattcgaa 660 cgctgggtta ctgcccaggc aatgtttgga tag 693 <210> 9 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F_inf_SpeI_RBS_Exp <400> 9 tcgtctgatc agtagactag taaggagata tacaatgaca aatgcaacgg cgc 53 <210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R_inf_SpeI_Exp <400> 10 cggggatccg gactagttca ctgcttgaca gagccg 36 <210> 11 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F1_BamHI_pfkA_dis <400> 11 cgggatccat ggaagacatg cgaattgcta ct 32 <210> 12 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R1_pfkA_dis.ovl <400> 12 ccgcaacgac gataatgatt gggataaggg catcgatgc 39 <210> 13 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F2_pfkA_dis.ovl <400> 13 gatgccctta tcccaatcat tatcgtcgtt gcggaagg 38 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R2_EcoRI_pfkA_dis <400> 14 cggaattcct atccaaacat tgcctgggc 29

Claims

α-1,2-푸코오스 전이효소 (α-1,2- fucosyltransferase)가 발현되도록 형질전환되며,
GDP-D-만노오스-4,6-데하이드라타아제 (GDP-D-mannose-4,6-dehydratase)가 발현되도록 형질전환되고,
GDP-L-푸코오스 신타아제 (GDP-L-fucose synthase)가 발현되도록 형질전환되며,
락토오즈 퍼미아제 (lactose permease)가 발현되도록 형질전환되고,
ABC 트랜스포터 퍼미아제(transporter permease)가 발현되도록 형질전환되며,
포스포만노뮤타아제 (Phosphomannomutase) 및 GTP-만노오스-1-포스페이트 구아닐릴트랜스퍼라아제 (GTPmannose-1-phosphate guanylyltransferase)를 보유하고 있는 것을 특징으로 하는 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum).
α-1,2-푸코오스 전이효소 (α-1,2- fucosyltransferase)가 발현되도록 형질전환되며,
GDP-D-만노오스-4,6-데하이드라타아제 (GDP-D-mannose-4,6-dehydratase)가 발현되도록 형질전환되고,
GDP-L-푸코오스 신타아제 (GDP-L-fucose synthase)가 발현되도록 형질전환되며,
락토오즈 퍼미아제 (lactose permease)가 발현되도록 형질전환되고,
포스포프럭토키나아제 A (Phosphofructokinase A, PfkA) 유전자가 제거되거나 부분 파쇄되어 그 기능이 소실되도록 형질전환되며,
포스포만노뮤타아제 (Phosphomannomutase) 및 GTP-만노오스-1-포스페이트 구아닐릴트랜스퍼라아제 (GTPmannose-1-phosphate guanylyltransferase)를 보유하고 있는 것을 특징으로 하는 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum).
제2항에 있어서,
상기 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰은,
ABC 트랜스포터 퍼미아제(transporter permease)가 발현되도록 추가로 형질전환된 것을 특징으로 하는 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum).
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 α-1,2-푸코오스 전이효소 (α-1,2-fucosyltransferase)는,
서열번호 5에 기재된 핵산서열로 암호화된 것을 특징으로 하는 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum).
제1항 또는 제3항에 있어서,
상기 ABC 트랜스포터 퍼미아제(transporter permease)는,
서열번호 6에 기재된 핵산서열로 암호화된 것을 특징으로 하는 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum).
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰은,
포스포만노뮤타아제 (Phosphomannomutase)가 과발현되도록 형질전환되고,
GTP-만노오스-1-포스페이트 구아닐릴트랜스퍼라아제 (GTP-mannose-1-phosphate guanylyltransferase)가 과발현되도록 형질전환된 것을 특징으로 하는 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum).
락토오스(lactose) 및 글루코오스(glucose)가 첨가된 배지에, 제1항의 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)을 배양하는 것을 특징으로 하는 2'-푸코실락토오스의 생산방법.
락토오스(lactose), 글루코오스(glucose) 및 프럭토오스(fructose)가 첨가된 배지에, 제2항의 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)을 배양하는 것을 특징으로 하는 2'-푸코실락토오스의 생산방법.
제7항 또는 제8항에 있어서,
상기 푸코실락토오스의 생산방법은,
프럭토오스 또는 글루코오스 또는 락토오스를 추가로 공급하는 유가식 배양인 것을 특징으로 하는 2'-푸코실락토오스의 생산방법.