WO2024053959A1 - 콜라닉산으로부터 퓨코실화 올리고당의 생산 방법 - Google Patents

콜라닉산으로부터 퓨코실화 올리고당의 생산 방법 Download PDF

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WO2024053959A1
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acid
galactose
colanic
fucosylated
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PCT/KR2023/013152
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김경헌
유소라
한나리
윤은주
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고려대학교 산학협력단
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds

Definitions

  • the present invention relates to a method for optimizing the acid hydrolysis conditions of colanic acid and producing fucosylated oligosaccharides using colanic acid hydrolyzate as a substrate.
  • Fucose is a 6-deoxyhexose monosaccharide, a rare sugar commonly found in living organisms, including bacteria, plants, and humans. Fucose has numerous physiological properties, including anti-aging, anti-inflammatory, and immune-promoting. Additionally, fucose can be used as a biosynthetic substrate for fucosylated oligosaccharides (FOS), which are attracting attention for their prebiotic effects. FOS, such as 2'-fucosyllactose (2'-FL), has been produced in engineered yeast and E. coli using fucose as a substrate via the salvage pathway.
  • FOS such as 2'-fucosyllactose (2'-FL)
  • This fucose is also a component of extracellular polysaccharides (EPS) such as colanic acid produced by Escherichia coli, fucogel produced by Klebsiella pneumoniae I-1507, and clavan produced by Clavibacter michiganensis. . Therefore, fucose-rich EPS can be used as a source for producing fucose.
  • EPS extracellular polysaccharides
  • colanic acid produced by E. coli is composed of repeating units of fucose, galactose, glucose, and glucuronic acid in a molar ratio of 2:2:1:1. Therefore, since the proportion of fucose in colanic acid is high at about 31%, it has great potential as a substrate for producing fucose.
  • the present inventors optimized acid hydrolysis conditions to efficiently obtain functional sugars such as fucose from colanic acid, and obtained 2'-fucosyllactose (2'-FL) from recombinant yeast using the obtained colanic acid decomposition product as a substrate. ) and 2'-fucosylgalactose (2'-FG), thereby completing the present invention.
  • the purpose of the present invention is to provide a method for acid hydrolysis of colanic acid to obtain fucose, a substrate of fucosylated oligosaccharides, in high yield.
  • Another object of the present invention is to provide an enzymatic or biological method for producing fucosylated oligosaccharides using colanic acid hydrolyzate as a substrate.
  • the present invention provides a method for producing fucosylated oligosaccharides using colanic acid hydrolyzate as a substrate.
  • step (2) may include producing fucosylated oligosaccharides using the fucose produced in step (1) as a substrate.
  • the type and yield of the hydrolyzate may be determined depending on the type of acid and hydrolysis conditions, and the acid may be a strong acid or a weak acid, but a weak acid may be used. It is preferable to use, and more preferably, when phosphoric acid is used to hydrolyze colanic acid, fucose and galactose can each be obtained in high yield.
  • the acid hydrolysis of step (1) may be performed using a 1 to 8 (%, w/v) weak acid at 50 to 150°C for 10 to 100 minutes, preferably 1 to 8 (%, w/v). It can be carried out using 6 (%, w/v) phosphoric acid at 100°C to 130°C for 15 to 90 minutes. Outside the above conditions, little hydrolysis of colanic acid occurs or excessive decomposition occurs, making it impossible to obtain the desired hydrolyzate of the monosaccharide.
  • fucosylated oligosaccharide refers to an oligosaccharide formed by combining fucose and other saccharides.
  • the saccharides that can produce fucosylated oligosaccharides together with fucose are monosaccharides, preferably lactose and galactose. , but is not limited to this.
  • the production step of fucosylated oligosaccharides in step (2) uses the fucose produced in step (1) as a substrate together with lactose and produces fucosylated lactose by using the following enzyme.
  • Enzymatic methods can be:
  • the production step of fucosylated oligosaccharides in step (2) may be a biological method in which the fucose produced in step (1) is used as a substrate along with lactose and fucosylated lactose is produced from microorganisms expressing the enzyme. .
  • the microorganism may be Saccharomyces cerevisiae
  • Saccharomyces cerevisiae may be L-fucokinase/5'-diphosphate-fucose (GDP-fucose) phosphorylase and It may be a recombinant Saccharomyces cerevisiae into which a gene encoding ⁇ -1,2-fucosyltransferase and a gene encoding a hexose transporter for absorbing lactose, a substrate, have been introduced.
  • the production step of fucosylated oligosaccharides in step (2) uses the fucose and galactose produced in step (1) as substrates and uses the following enzyme to produce fucosylated lactose.
  • Enzymatic methods can be:
  • the production step of fucosylated oligosaccharides in step (2) may be a biological method that uses the fucose and galactose produced in step (1) as substrates and produces fucosylated galactose from microorganisms expressing the enzyme.
  • the microorganism may be Saccharomyces cerevisiae
  • Saccharomyces cerevisiae may be L-fucokinase/5'-diphosphate-fucose (GDP-fucose) phosphorylase and It may be a recombinant Saccharomyces cerevisiae in which a gene encoding ⁇ -1,2-fucosyltransferase has been introduced and the GAL1 gene, which can metabolize galactose, has been deleted.
  • the L-fucokinase/5'-diphosphate-fucose (GDP-fucose) phosphorylase is an enzyme that converts fucose, a substrate, into GDP-fucose, and is used in Bacteroide furagillis 9343. It may be derived from , but is not limited thereto.
  • L-fucokinase/5'-diphosphate-fucose (GDP-fucose) phosphorylase used in the present invention may consist of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and the enzyme encoding the enzyme The gene may consist of the base sequence indicated by SEQ ID NO: 2.
  • ⁇ -1,2-fucosyltransferase is an enzyme used to bind futose to a monosaccharide such as lactose or galactose, and may be derived from Helicobacter pylori, but is not limited thereto.
  • the ⁇ -1,2-fucosyltransferase used in the present invention may consist of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, and the gene encoding the enzyme may consist of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4. .
  • Saccharomyces cerevisiae used in a specific embodiment of the present invention does not absorb lactose, so a transporter for lactose intake is required, and the transporter may be a hexose transporter from Pichia stipitis. , but is not limited to this.
  • the hexose transporter used in the present invention may consist of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, and the gene encoding the transporter may consist of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6.
  • Enzymes used in the production of the fucosylated oligosaccharides produce polypeptides containing intervening sequences between individual coding segments as well as regions before and after the coding regions of the enzymes, through DNA segments, i.e. coding genes. Can be transcribed and translated.
  • the enzymes may be transcribed and translated from the nucleic acid sequence encoding them, but are not particularly limited thereto.
  • proteins having the activity of the above enzymes as mutant proteins resulting from one or more substitutions, deletions, translocations, additions, etc. of the above enzymes are also included within the scope of the enzyme of the present invention, and are preferably represented by any one of SEQ ID NOs. 1 to 5. Includes an amino acid sequence having a sequence identity of at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, and at least 99%. .
  • the enzyme and transporter can be obtained from E. coli or a culture thereof transformed with a recombinant vector containing a base sequence encoding the enzyme and transporter.
  • protein and “polypeptide” are used interchangeably herein.
  • a polypeptide having a certain percentage (e.g., 80%, 85%, 90%, 95%, or 99%) of sequence identity to another sequence means that when the two sequences are aligned, the sequence When comparing, it means that the amino acid residues in the above ratio are the same.
  • the alignment and percent homology or identity can be performed using any suitable software program known in the art, such as those described in CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel et al. (eds) 1987 Supplement 30 section 7.7.18). You can use it to decide.
  • Preferred programs include the GCG Pileup program, FASTA (Pearson et al. 1988 Proc. Natl Acad.
  • BLAST BLAST Manual, Altschul et al., Natl. Cent. Biotechnol. Inf., Natl Lib. Med. (NCIB NLM NIH), Bethesda, MD, and Altschul et al. 1997 NAR 25:3389-3402).
  • Another preferred alignment program is ALIGN Plus (Scientific and Educational Software, PA), preferably using default parameters.
  • TFASTA Data Searching Program available in Sequence Software Package Version 6.0 (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI).
  • the term "recombinant" when used in relation to a cell, nucleic acid, protein or vector means that the cell, nucleic acid, protein or vector has been modified by introduction of a heterologous nucleic acid or protein or alteration of the native nucleic acid or protein, or Indicates that the cell is derived from a cell so modified. That is, for example, a recombinant cell may express a gene that is not found in the native (non-recombinant) form of the cell, or, alternatively, may express a native gene that is abnormally expressed or not expressed at all when expressed. It manifests.
  • nucleic acid encompasses single-stranded or double-stranded DNA, RNA, and chemical variants thereof. “Nucleic acid” and “polynucleotide” may be used interchangeably herein. Because the genetic code is degenerate, more than one codon can be used to encode a particular amino acid, and the present invention encompasses polynucleotides that encode a particular amino acid sequence.
  • introduction to insert a nucleic acid sequence into a cell means “transfection” or “transformation” or “transduction” and refers to the integration of a nucleic acid sequence into a eukaryotic or prokaryotic cell. Reference is included wherein the nucleic acid sequence is integrated into the genome of the cell (e.g., chromosome, plasmid, plastid, or mitochondrial DNA), converted into an autonomous replicon, or transiently expressed.
  • the genome of the cell e.g., chromosome, plasmid, plastid, or mitochondrial DNA
  • step (1) may be performed simultaneously as a single process or may be performed sequentially while being spatially separated.
  • step (1) may further include the step of separating and purifying the hydrolyzate to be used as a substrate in step (2).
  • the present invention not only suggests the possibility that colanic acid can be used as a source of fucose, but also provides an optimal acid hydrolysis method for obtaining fucose from colanic acid in high yield, using it to produce fucosylated lactose and fucosylated galactose. It can be used for mass production of functional fucosylated oligosaccharides such as.
  • Figure 1 is a schematic diagram of the production process of fucosylated oligosaccharides using fucose from colanic acid.
  • Figure 2 shows the results of confirming the effect of various hydrolysis conditions on the acid hydrolysis of colanic acid.
  • Figure 3 shows the results of confirming the effect of colanic acid hydrolysis according to the type of weak acid.
  • Figure 4 shows the results confirming the production of fucosylated lactose by yeast using colanic acid hydrolyzate.
  • Figure 5 shows the fermentation profile of Saccharomyces cerevisiae D452-2_2'-FL.
  • Figure 6 shows the results confirming the production of fucosylated galactose by recombinant E. coli using colanic acid hydrolyzate.
  • Figure 7 shows the GC/TOF-MS chromatogram and mass spectrum results of fucosylated galactose produced using recombinant E. coli.
  • Figure 8 shows the results confirming the production of fucosylated galactose by recombinant yeast using the standard sugars fucose and galactose.
  • Figure 9 shows the results confirming the production of fucosylated galactose by the recombinant yeast of the present invention using colanic acid hydrolyzate.
  • Cholanic acid was quantified using a previously reported method (Han et al., 2021). The cell culture was boiled at 95°C for 10 minutes, cooled, and centrifuged at 10,000 Asboe-Hansen, 1973). The precipitate was collected by centrifugation at 10,000 The colanic acid obtained in this way was dissolved in distilled water, freeze-dried, and stored at -20°C. The concentration of cholanic acid (mg cholanic acid/culture volume L) and yield (mg cholanic acid/g dry weight [DCW]) were calculated based on the molar content of glucuronic acid in cholanic acid.
  • glucuronic acid concentration 1 mL of aqueous cholanic acid was mixed with 5 mL of 12.5 mM sodium tetraborate dissolved in 95% sulfuric acid and boiled at 100°C for 5 minutes. After cooling on ice, 100 ⁇ L of 1.5 g/L hydroxydiphenyl was added to 0.5% (w/v) sodium hydroxide solution, and the absorbance (OD 526 ) was measured at 526 nm.
  • concentration and yield of CA a standard curve was prepared between the absorbance at 600 nm (OD 600 ) and dry weight of recombinant E. coli, and a standard curve showing the linear correlation between OD 526 and various concentrations of glucuronic acid was prepared. .
  • Freeze-dried cholanic acid was prepared by pulverizing it and dissolving it in distilled water for component analysis. Cholanic acid hydrolysates, including fucose, galactose, glucose, and glucuronic acid, were analyzed using HPLC analysis according to the laboratory analytical procedures of the National Renewable Energy Laboratory (NREL; Golden, CO, USA) (Sluiter et al. , 2006; Sluiter et al., 2008). HPLC (Agilent 1100, Agilent Technologies, Santa Clara, USA) used a refractive index (RI) detector (Agilent Technologies) and an Aminex HPX-87H column (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).
  • RI refractive index
  • colanic acid was treated with various phosphoric acid concentrations (1% to 6% [w/v]) using a microwave digester (Milestone, Shelton, CT, USA) hydrolysis was performed. Mixtures of cholanic acid and various phosphoric acid concentrations were treated at temperatures ranging from 100°C to 130°C for times ranging from 15 to 90 minutes. The hydrolyzate was cooled on ice and neutralized to pH 6 using 5M sodium hydroxide before further analysis.
  • fucose had the highest yield of 62.5% (theoretical maximum) at 110°C, so the acid hydrolysis temperature was fixed at 110°C.
  • the hydrolysis yield of fucose at various phosphoric acid concentrations it was 92.8% (theoretical maximum) at 6% (w/v), followed by 88.5% at 4% (w/v), but fucose The yield at 6% (w/v) was not significantly higher than at 4% (w/v).
  • Saccharomyces cerevisiae D452-2_2'-FL strain a strain producing 2'-FL, was produced by introducing three genes.
  • fkp encoding L-fucokinase/5'-diphosphate-fucose (GDP-fucose) phosphorylase from Bacteroide furragillis 9343 (MJ Coyne, B. Reinap, MM Lee, LE Comstock)
  • Human symbionts use a host-like pathway for surface fucosylation, Science 307(5716) (2005) 1778-1781), and ⁇ -1,2-fucosyl transfer in Helicobacter pylori for fucosylation of lactose and GDP-fucose.
  • fucT2 encoding the enzyme (G. Wang, PG Boulton, NWC Chan, MM Palcic, DE Taylor, Novel Helicobacter pylori ⁇ 1,2-fucosyltransferase, a key enzyme in the synthesis of Lewis antigens, Microbiology 145(11) (1999) 3245 -3253.) and the mutation HXT2.4 (A291D), which encodes the hexose transporter of Pichia stipitis for lactose uptake, was introduced.
  • Each plasmid containing the three genes fkp , fucT2 and mutant HXT2.4 was cloned into Saccharomyces cerevisiae D452 using the lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method (LiAc/SS carrier DNA/PEG method). Transformed at -2 ( Figure 1).
  • Saccharomyces cerevisiae D452-2_2'-FL strain was grown on 20 g/L glucose, 6.7 g/L yeast nitrogen source without amino acids (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA), and 1.4 g/L. Selective pressure was applied using a synthetic yeast medium supplement (Sigma-Aldrich) without histidine, leucine, uracil, or tryptophan and medium containing 0.1 g/L tryptophan (Kanto Chemical Co., INC., Tokyo, Japan). did.
  • Precultured cells were incubated with cholanic acid hydrolyzate containing 20 g/L glucose, 2 g/L lactose, 1.6 g/L fucose, and histidine containing 50 mM potassium phthalate hydrogenated buffer (KHP buffer; pH 5.5); Fermentation was carried out in YSC medium lacking leucine and uracil. The initial OD 600 was adjusted to 0.1, and cultured at 30°C and 200 rpm for 105 hours ( Figure 5).
  • the gene GAL1 which is involved in the first step of galactose metabolism, was deleted using CRISPR-Cas9.
  • the guide RNA plasmid p42K_gGAL1 was constructed through reverse PCR using the pRS42K plasmid with the primer pairs of gRNA_GAL1_F and gRNA_GAL1_R (Tables 2 and 3). Additionally, donor DNA for deleting GAL1 was prepared using the primer pair dDNA_GAL1_F and dDNA_GAL1_R (Table 2).
  • Saccharomyces cerevisiae D452-2 was transformed with 2 ⁇ g of guide RNA p42K_gGAL1, 20 ⁇ g of donor DNA, and 1 ⁇ g of Cas9-NAT plasmid (Table 1). Deletion of GAL1 was confirmed by colony PCR using the primer pair Conf_GAL1_F and Conf_GAL1_R (Table 1), and as a result, the control strain Saccharomyces cerevisiae D452-2 ⁇ GAL1 strain was created.
  • GC/TOF-MS analysis was performed. 1 mL of culture was boiled at 95°C for 5 minutes, and the supernatant was centrifuged at 20,035 It was obtained separately. 20 ⁇ L of the supernatant was vacuum dried and then derivatized, and the derivatized sample was analyzed as described in [Example 4]. The concentrations of fucose, lactose, galactose, glucose, and glucuronic acid were also measured by HPLC or GC/TOF-MS using the same method as described in [Example 3].
  • the D452-2_2'-FG strain was first fermented using standard fucose and galactose as substrates and then confirmed by GC/TOF-MS in the same manner as above ( Figure 8). By confirming the peak at the same retention time as the purified 2'-FG and confirming that the mass spectrum was consistent, it was confirmed that fucosylated galactose was produced when fermentation was performed using fucose and galactose, which are hydrolysates of cholanic acid, as substrates. Confirmed ( Figure 9).
  • E. coli BL21(DE3) pmBCGWF Since 2'-FG does not exist as a standard material, it was produced using E. coli BL21(DE3) pmBCGWF, which was first reported to produce 2'-FG (EJ Yun, J.-J. Liu, JW Lee, S Kwak, S. Yu, KH Kim, Y.-S. Jin, Biosynthetic routes for producing various fucosyl-oligosaccharides, ACS Synth. Biol. 8(2) (2019) 415-424.). E. coli BL21(DE3) pmBCGWF was inoculated into LB medium containing 50 ⁇ g/mL kanamycin in a 1-L flask and cultured at 37°C and 200 rpm.
  • OD 600 reached 1.0
  • 5 g/L glycerol, 2 g/L galactose, and 0.1 mM IPTG were added.
  • the incubation temperature was changed to 25°C after IPTG induction, and 4 g/L glycerol was additionally added when glycerol was depleted.
  • 2'-FG produced in E. coli was first purified using a gel filtration chromatography column (I.D. 6 ⁇ 100 cm) packed with Sephadex G-10 resin (Sigma-Aldrich). The concentrated E. coli culture solution was injected into the column, and the sample was eluted at a flow rate of 1 mL/min using distilled water as the mobile phase. In order to obtain high purity 2'-FG, the first purification sample was collected using HPLC at a specific time when 2'-FG was detected and subjected to second purification (FIGS. 6 and 7).

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Abstract

본 발명은 콜라닉산의 산가수분해 조건을 최적화하고, 콜라닉산 가술분해물을 기질로 사용하여 퓨코실화 올리고당을 생산하는 방법에 대한 것이다. 본 발명은 콜라닉산으로부터 퓨코스를 고수율로 얻을 수 있는 최적의 산가수분해 방법을 제공함으로써 이용하여 퓨코실화락토스 및 퓨코실화갈락토스와 같은 기능성 퓨코실화올리고당의 대량 생산에 이용될 수 있다.

Description

콜라닉산으로부터 퓨코실화 올리고당의 생산 방법
본 발명은 콜라닉산의 산가수분해 조건을 최적화하고, 콜라닉산 가수분해물을 기질로 사용하여 퓨코실화 올리고당을 생산하는 방법에 대한 것이다.
퓨코스는 6-디옥시헥소스 단당류로, 보통 박테리아, 식물, 인간을 포함한 살아있는 유기체에서 발견되는 희귀한 당이다. 퓨코스는 항노화, 항염증, 그리고 면역증진을 포함한 수많은 생리적 특성을 가지고 있다. 또한, 퓨코스는 프리바이오틱 효과로 주목받고 있는 푸코실화 올리고당(FOS)의 생합성 기질로 사용될 수 있다. 2'-퓨코실락토스(2'-FL)와 같은 FOS는 salvage 경로를 통해 퓨코스를 기질로 사용하여 엔지니어링된 효모 및 대장균에서 생산된 바 있다.
이러한 퓨코스는 대장균이 생산하는 콜라닉산, 클렙시엘라 뉴모니에 I-1507이 생산하는 퓨코겔, 그리고 클라비박터 미치가넨시스가 생산하는 클라반과 같은 세포 외 다당류(EPS)의 구성 성분이기도 하다. 따라서, 퓨코스가 풍부한 EPS는 퓨코스를 생산하기 위한 공급원으로 사용될 수 있다. 그 중 대장균에 의해 생산되는 콜라닉산은 퓨코스, 갈락토스, 글루코스, 글루쿠론산이 2:2:1:1의 몰비율로 반복적인 단위로 구성되어 있다. 따라서, 콜라닉산에서 퓨코스의 비율은 약 31%로 높기 때문에 퓨코스를 생산하는 기질로서 큰 잠재력을 가지고 있다.
이에 본 발명자들은 콜라닉산으로부터 퓨코스와 같은 기능성 당을 효율적으로 얻을 수 있는 산가수분해 조건을 최적화하였고, 이때 얻어진 콜라닉산 분해물을 기질로 이용하는 재조합 효모로부터 2'-퓨코실락토스(2'-FL)와 2'-퓨코실갈락토스(2'-FG)를 생산함으로써 본 발명을 완성하였다.
[선행기술문헌]
한국특허등록공보 KR 10-2568773 B1
본 발명의 목적은 퓨코실화 올리고당의 기질인 퓨코스를 고수율로 얻기 위한 콜라닉산의 산가수분해 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 콜라닉산 산가수분해물을 기질로 사용하여 퓨코실화 올리고당을 생산하기 위한 효소적 또는 생물학적 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 콜라닉산 가수분해물을 기질로 사용하여 퓨코실화올리고당을 생산하는방법을 제공한다.
구제적으로, 본 발명은
(1) 콜라닉산을 산가수분해하여 퓨코스를 생산하는 단계; 및
(2) 단계(1)에서 생산된 퓨코스를 기질로 퓨코실화올리고당을 생산하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에서, 단계 (1)의 콜라닉산을 산가수분해하는 단계는 산의 종류 및 가수분해 조건에 따라 가수분해물의 종류 및 수율이 결정될 수 있고, 산은 강산 또는 약산을 사용할 수 있으나, 약산을 사용하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 인산을 사용하여 콜라닉산을 가수분해할 때, 퓨코스 및 갈락토스를 각각 높은 수율로 얻을 수 있다.
구체적인 일실시예에서, 상기 단계 (1)의 산가수분해는 1 내기 8(%, w/v) 약산을 사용하여, 50 내지 150℃에서 10 내지 100분간 수행될 수 있고, 바람직하게는 1 내지 6(%, w/v)인산을 사용하여 100℃ 내지 130℃에서 15분 내지 90분간 수행될 수 있다. 상기 조건을 벗어난 범위에서는 콜라닉산의 가수분해가 거의 일어나지 않거나 과분해가 일어나 원하는 단당류의 가수분해물을 얻을 수 없다.
본 발명에서 "퓨코실화 올리고당"은 퓨코스 및 다른 당류의 결합으로 형성된 올리고당을 의미하며, 구체적으로, 퓨코스와 함께 퓨코실화올리고당을 생성할 수 있는 당류는 단당류이고, 바람직하게는 락토스 및 갈락토스이며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 단계 (2)의 퓨코실화 올리고당의 생산 단계는 단계 (1)에서 생성된 퓨코스를 락토스와 함께 기질로 사용하고 하기 효소를 사용함으로써 퓨코실화락토스를 생산하는 효소적 방법일 수 있다:
(1) L-퓨코카이네이스/5'-다이포스페이트-퓨코스(GDP-퓨코스)포스포릴레이스; 및
(2) α-1,2-퓨코실 전이효소.
또한, 상기 단계 (2)의 퓨코실화 올리고당의 생산 단계는 단계 (1)에서 생성된 퓨코스를 락토스와 함께 기질로 사용하고 상기 효소를 발현하는 미생물로부터 퓨코실화락토스를 생산하는 생물학적 방법일 수 있다. 여기서, 상기 미생물은 사카로마이세스 세레비시아이일 수 있고, 상기 사카로마이세스 세레비시아이는 L-퓨코카이네이스/5'-다이포스페이트-퓨코스(GDP-퓨코스)포스포릴레이스 및 α-1,2-퓨코실 전이효소를 암호화하는 유전자 및 기질인 락토스를 흡수하기 위한 헥소스 수송체를 암호화하는 유전자가 도입된 재조합 사카로마이세스 세레비시아이일 수 있다.
본 발명의 구체적인 다른 일 실시예에 따르면, 단계 (2)의 퓨코실화 올리고당의 생산 단계는 단계 (1)에서 생성된 퓨코스 및 갈락토스를 기질로 사용하고 하기 효소를 사용함으로써 퓨코실화락토스를 생산하는 효소적 방법일 수 있다:
(1) L-퓨코카이네이스/5'-다이포스페이트-퓨코스(GDP-퓨코스)포스포릴레이스; 및
(2) α-1,2-퓨코실 전이효소.
또한, 상기 단계 (2)의 퓨코실화 올리고당의 생산 단계는 단계 (1)에서 생성된 퓨코스 및 갈락토스를 기질로 사용하고 상기 효소를 발현하는 미생물로부터 퓨코실화갈락토스를 생산하는 생물학적 방법일 수 있다. 여기서, 상기 미생물은 사카로마이세스 세레비시아이일 수 있고, 상기 사카로마이세스 세레비시아이는 L-퓨코카이네이스/5'-다이포스페이트-퓨코스(GDP-퓨코스)포스포릴레이스 및 α-1,2-퓨코실 전이효소를 암호화하는 유전자가 도입되고, 갈락토스를 대사할 수 있는 GAL1 유전자가 결실된 재조합 사카로마이세스 세레비시아이일 수 있다.
본 발명에서, 상기 L-퓨코카이네이스/5'-다이포스페이트-퓨코스(GDP-퓨코스)포스포릴레이스는 기질인 퓨코스를 GDP-퓨코스로 전환시키는 효소로, 박테로이드 후라길리스 9343로 유래된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 본 발명에서 사용된 L-퓨코카이네이스/5'-다이포스페이트-퓨코스(GDP-퓨코스)포스포릴레이스는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있고, 상기 효소를 암호화하는 유전자는 서열번호 2로 표시된 염기서열로 이루어질 수 있다.
본 발명에서, α-1,2-퓨코실 전이효소는 락토스 또는 갈락토스와 같은 단당류에 퓨토스를 결합하는데 사용되는 효소로, 헬리코박터 파이로리로부터 유래된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 본 발명에서 사용된 α-1,2-퓨코실 전이효소는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있고, 상기 효소를 암호화하는 유전자는 서열번호 4로 표시된 염기서열로 이루어질 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에 사용되는 사카로마이세스 세레비시아이는 락토스를 흡수하지 못하므로 락토스 섭취를 위한 수송체가 요구되며, 상기 수송체는 피키아 스티피티스 유래의 헥소스 수송체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서 사용된 헥소스 수송체는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있고, 상기 수송체를 암호화하는 유전자는 서열번호 6으로 표시된 염기서열로 이루어질 수 있다.
상기 퓨코실화올리고당의 생성에 이용되는 효소(수송체 포함)들은 효소들의 코딩 영역 전 및 후의 영역뿐만 아니라 개별 코딩 분절 사이의 개재 서열이 포함된 폴리펩타이드를 생산하는데 연관된 DNA 분절, 즉 코딩 유전자를 통해 전사 및 번역될 수 있다. 예컨대, 상기 효소들은 이를 암호화하는 핵산 서열로부터 전사 및 번역될 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 효소의 하나 이상의 치환, 결손, 전위, 첨가 등의 변이 단백질로서 상기 효소들의 활성을 가지는 단백질도 본 발명의 효소의 권리범위에 포함되며, 바람직하게는 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나로 표시된 아미노산 서열과 서열 동일성이 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 및 99% 이상인 아미노산 서열을 포함한다.
상기 효소 및 수송체는 상기 효소 및 수송체를 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 대장균 또는 이의 배양물로부터 수득될 수 있다.
본 명세서에서 "단백질" 및 "폴리펩타이드"는 본원에서 상호 교환 가능하게 사용된다.
본 발명에서 폴리펩타이드가 또 다른 서열에 대하여 특정 비율(예컨대, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%)의 서열 동일성을 가진다는 것은, 상기 두 서열을 정렬시킬 때, 상기 서열들의 비교시 상기 비율의 아미노산 잔기가 동일함을 의미한다. 상기 정렬 및 백분율 상동성 또는 동일성은, 당업계에 공지된 임의의 적당한 소프트웨어 프로그램, 예를 들어 문헌[CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel 등 (eds) 1987 Supplement 30 section 7.7.18)]에 기재된 것들을 사용하여 결정할 수 있다. 바람직한 프로그램으로는, GCG Pileup 프로그램, FASTA(Pearson 등 1988 Proc. Natl Acad. Sci USA 85:2444-2448), 및 BLAST(BLAST Manual, Altschul 등, Natl. Cent. Biotechnol. Inf., Natl Lib. Med.(NCIB NLM NIH), Bethesda, MD, 및 Altschul 등 1997 NAR 25:3389-3402)이 있다. 또 다른 바람직한 정렬 프로그램은 ALIGN Plus(Scientific and Educational Software, PA)로서, 바람직하게는 기본 매개변수를 사용하는 것이다. 사용 가능한 또 다른 서열 소프트웨어 프로그램은 Sequence Software Package Version 6.0(Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI)에서 이용 가능한 TFASTA Data Searching Program 이다.
본 발명에서 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터와 관련하여 사용될 때 용어 "재조합"은, 상기 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터가 이종 핵산 또는 단백질의 도입 또는 본래적 핵산 또는 단백질의 변경에 의해 변형되었거나, 또는 상기 세포가 이렇게 변형된 세포로부터 유래한 것을 가리킨다. 즉, 예를 들어, 재조합 세포는 상기 세포의 본래적 (비(非)재조합) 형태 내에서는 발견되지 않는 유전자를 발현하거나 또는, 다르게는 발현 시 비정상적으로 발현되거나 또는 전혀 발현되지 않는 본래적 유전자를 발현한다.
본 명세서에서 "핵산"은 단일가닥 또는 이중가닥의 DNA, RNA, 및 이들의 화학적 변형체를 포괄한다. "핵산" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 본원에서 상호교환 가능하게 사용될 수 있다. 유전 암호가 축퇴되어 있기 때문에, 특정 아미노산을 인코딩하기 위해서 하나 이상의 코돈을 사용할 수 있으며, 본 발명은 특정 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포괄한다.
핵산 서열을 세포 내로 삽입하는 용어 "도입"은 "트랜스펙션(transfection)", 또는 "형질전환" 또는 "형질도입(transduction)"을 의미하며, 핵산 서열의 진핵 또는 원핵 세포 내로의 통합에 대한 언급이 포함되고, 이때 상기 핵산 서열은 세포의 게놈 (예컨대, 염색체, 플라스미드, 색소체, 또는 미토콘드리아 DNA) 내로 통합되어, 자율 레플리콘으로 전환되거나, 또는 일시적으로 발현된다.
본 발명의 방법에서, 단계 (1)의 콜라닉산의 산가수분해 단계와 단계 (2) 퓨코실화올리고당을 생산하는 단계는 단일 공정으로 동시에 수행되거나, 공간적으로 분리되어 순차적으로 수행될 수 있다. 구체적으로, 단계 (1)에서, 단계 (2)에서 기질로 사용될 가수분해물을 분리, 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 콜라닉산이 퓨코스 공급원으로 이용될 수 있다는 가능성을 제시했을 뿐만 아니라 콜라닉산으로부터 퓨코스를 고수율로 얻을 수 있는 최적의 산가수분해 방법을 제공함으로써 이용하여 퓨코실화락토스 및 퓨코실화갈락토스와 같은 기능성 퓨코실화올리고당의 대량 생산에 이용될 수 있다.
도 1은 콜라닉산의 퓨코스를 이용한 퓨코실화 올리고당 생산 과정의 도식도이다.
도 2는 다양한 가수분해 조건이 콜라닉산의 산가수분해에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 3은 약산의 종류에 따른 콜라닉산 가수분해 효과를 확인한 결과이다.
도 4는 콜라닉산 가수분해물을 이용한 효모의 퓨코실화락토스 생산을 확인한 결과이다.
이다.
도 5는 사카로미세스 세레비시아이 D452-2_2'-FL의 발효 프로파일을 나타낸 것이다.
도 6은 콜라닉산 가수분해물을 이용한 재조합 대장균의 퓨코실화갈락토스 생산을 확인한 결과이다.
도 7은 재조합 대장균을 이용하여 생산된 퓨코실화갈락토스의 GC/TOF-MS 크로마토그램 및 질량 스펙트럼 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 표준당 퓨코스와 갈락토스를 이용한 재조합 효모의 퓨코실화갈락토스의 생산을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 콜라닉산 가수분해물을 이용한 본 발명의 재조합 효모의 퓨코실화갈락토스의 생산을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명에 따르는 실시예 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
[실시예 1] 콜라닉산의 대량생산
콜라닉산의 대량생산을 위해, 이전에 보고된 재조합 대장균 JM109(DE3) △waaF + rcsF 발효 방법이 사용되었다(Yun et al., 2021). 20 g/L 글루코스, 10.62 g/L 제이인산나트륨, 3 g/L 인산칼륨, 0.5 g/L 염화나트륨, 2.63 g/L 트립톤, 0.24 g/L 황산마그네슘, 0.011 g/L 염화칼슘을 포함한 최적화 배지 300 mL에서 발효기를 이용하여 발효를 진행하였고, pH 7을 유지하면서 25°C, 200 rpm에서 48시간 동안 배양하였다.
[실시예 2] 콜라닉산의 정량
이전에 보고된 방법을 사용하여 콜라닉산을 정량하였다(Han et al., 2021). 세포 배양액을 95°C에서 10분간 끓이고 냉각 후, 10,000 X g에서 30분간 원심분리한 후, 콜라닉산이 함유된 상등액을 3배 부피의 에탄올과 혼합하여 4°C에서 하룻밤 동안 보관하였다(Bluenkrantz & Asboe-Hansen, 1973). 침전물은 10,000 X g에서 30분간 원심분리하여 채취한 후 얼음 위에서 에탄올을 완전히 건조하였다. 이렇게 얻은 콜라닉산을 증류수에 용해한 후 동결건조하여 -20°C에서 보관하였다. 콜라닉산의 농도(콜라닉산 mg/배양부피 L) 및 수율(콜라닉산 mg /건중량 [DCW] g)는 콜라닉산 내 글루쿠론산의 몰 함량을 기준으로 계산하였다. 글루쿠론산 농도를 측정하기 위해, 수용액 상태의 콜라닉산 1 mL를 95% 황산에 녹인 12.5 mM 소듐 테트라보레이트 5 mL와 혼합하고, 100°C에서 5분 동안 끓였다. 얼음 위에서 냉각한 후, 0.5 %(w/v) 수산화나트륨 용액에 1.5 g/L 하이드록시다이페닐 100 μL를 첨가한 후, 526nm에서 흡광도(OD526)를 측정하였다. CA의 농도와 수율을 계산하기 위해 재조합 대장균의 600nm에서 흡광도(OD600)와 건중량 사이의 표준 곡선을 준비하고, OD526과 다양한 농도의 글루쿠론산 사이의 선형 상관관계를 나타내는 표준 곡선을 준비하였다.
[실시예 3] 콜라닉산의 성분분석
동결 건조된 콜라닉산은 성분분석을 위해 분말화 한 후 증류수에 용해시켜 준비하였다. 퓨코스, 갈락토스, 글루코스 및 글루쿠론산을 포함하는 콜라닉산 가수분해물은 HPLC 분석을 사용하여 미국 국립 재생 에너지 연구소(NREL; Golden, CO, USA)의 실험실 분석 절차에 따라 분석하였다(Sluiter et al., 2006; Sluiter et al., 2008). HPLC(Agilent 1100, Agilent Technologies, Santa Clara, USA)는 굴절률(RI) 검출기(Agilent Technologies)와 Aminex HPX-87H 컬럼(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용하였다.
[실시예 4] 퓨코스가 함유된 가수분해물을 생산하기 위한 콜라닉산의 산가수분해
퓨코즈 생산을 위한 온도, 인산 농도, 처리 시간 등 콜라닉산의 전처리 조건을 최적화하기 위해 콜라닉산에 다양한 인산 농도(1%~6%[w/v])를 처리하여 마이크로파 분해기(Milestone, Shelton, CT, USA)에서 가수분해를 진행하였다. 콜라닉산과 다양한 인산 농도의 혼합물을 100°C에서 130°C의 온도에서 15분 내지 90분 범위의 시간 동안 처리하였다. 가수분해물은 얼음 위에서 냉각하고 5M 수산화나트륨을 사용하여 pH 6으로 중화시킨 후 추가 분석하였다.
콜라닉산 가수분해물의 성분 중 퓨코스, 갈락토스, 글루코스는 HPLC로 분석하였고, 글루쿠론산 분석에는 Agilent 7890 B GC(Agilent Technologies)와 페가수스 HT-TOF-MS(LECO, St. Joseph, MI, USA)를 사용하였다. GC/TOF-MS 분석을 위해 가수분해물은 두 단계로 유도체화 하였다. 먼저, 가수분해물에 40 mg/mL의 메톡시아민 염산염-피리딘(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 용액을 10μL 첨가하고 30°C에서 90분간 인큐베이션한 후, N-메틸-N-트리메틸-실릴-트리플루오로아세트아미드(Sigma-Aldrich) 45μL를 첨가하고 37°C에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 유도체화된 시료(1μL)를 GC에 주입하고 RTX-5Sil MS 컬럼(길이 30-m, 내경 0.25-mm, 막두께 0.25-μm; Restek, Bellefonte, PA, USA)으로 분리하였다.
그 결과, 도 2 및 표 1에 나타나는 바와 같이, 퓨코스는 110°C에서 62.5%(이론적 최대치)로 수율이 가장 높았으므로, 산가수분해 온도는 110°C로 고정되었다. 다음으로 다양한 인산 농도에서 퓨코스의 가수분해 수율을 비교한 결과, 6%(w/v)에서 92.8%(이론적 최대치)였으며, 그 다음으로 4%(w/v)에서 88.5%이었지만, 퓨코스의 수율은 6%(w/v)에서 4%(w/v)에 비해 유의하게 높지는 않았다. 산가수분해에서 고농도의 산을 사용하면 강산과 같이 단당류를 HMF로 과분해 시킬 수 있기 때문에(Roman-Leshkov et al., 2006) 인산 농도는 4%(w/v)로 고정하였다. 마지막으로, 다양한 처리 시간 중, 퓨코스의 가수분해 수율이 가장 높은 것은 60분일 때 88.5%(이론적 최대치)였으며, 가수분해 시간이 60분으로 늘어날 때까지 증가했지만, 처리시간을 60분에서 90분으로 늘렸을 때는 퓨코스의 수율이 증가하지 않았는데, 이는 60분이면 콜라닉산을 퓨코스로 가수분해할 수 있을 정도로 충분하다는 것을 의미한다. 또한, 산업의 경제적인 공정과 생산성을 고려할 때 짧은 가수분해 시간이 적합하다(Horn & Eijsink, 2010). 따라서, 콜라닉산의 산가수분해는 110°C, 4%(w/v) 인산 및 60분의 가수분해 조건을 선택하였다.
콜라닉산 가수분해물의 종류 및 다양한 가수분해 조건에서의 수율
Hydrolysis condition bHydrolysis yield (% of theoretical max.)
H3PO4
(%, w/v)		 Temp. (°C) Time (min) Fucose Galactose Glucose Glucuronic acid
1.0 110 60 36.4 ± 6.3 57.6 ± 3.6 44.9 ± 3.7 22.0 ± 19.1
110 90 44.3 ± 0.8 60.9 ± 0.2 47.6 ± 1.6 10.3 ± 1.4
120 60 22.3 ± 1.8 38.6 ± 0.3 24.9 ± 2.9 11.9 ± 2.2
130 60 12.3 ± 1.0 45.2 ± 0.5 35.4 ± 0.2 5.0 ± 0.1
2.0 100 60 32.3 ± 5.5 41.0 ± 6.9 54.6 ± 1.6 5.8 ± 0.7
110 60 65.2 ± 3.5 57.8 ± 1.6 47.9 ± 0.9 7.9 ± 1.1
110 90 74.6 ± 4.8 67.1 ± 0.5 22.4 ± 5.4 11.2 ± 0.5
120 60 43.7 ± 6.0 50.2 ± 2.2 42.4 ± 2.0 8.2 ± 4.1
130 60 13.9 ± 2.2 50.6 ± 1.0 38.5 ± 0.4 5.2 ± 0.0
4.0 100 60 59.7 ± 4.6 56.5 ± 3.8 56.4 ± 15.2 6.0 ± 0.5
110 15 58.5 ± 6.7 55.4 ± 3.0 50.1 ± 13.9 5.5 ± 0.1
110 30 74.6 ± 4.8 66.7 ± 3.0 81.0 ± 16.2 11.8 ± 3.3
110 60 88.5 ± 1.3 62.2 ± 0.9 65.8 ± 4.0 7.4 ± 0.6
110 90 87.2 ± 1.4 68.3 ± 0.3 74.0 ± 10.1 14.9 ± 11.2
120 60 70.8 ± 9.2 64.2 ± 2.9 44.0 ± 2.1 18.5 ± 10.4
130 60 15.9 ± 2.0 36.1 ± 1.4 39.2 ± 0.5 NDc
6.0 110 60 92.8 ± 1.0 69.3 ± 1.2 75.2 ± 10.3 42.8 ± 11.5
[실시예 5] 산 종류에 따른 콜라닉산 가수분해 효과
콜라닉산의 산 가수분해시, 강산을 이용하는 경우 과분해에 의해서 원하는 수율로 퓨코스 등을 얻을 수 없으므로, 약산을 이용하였다. 추가로, 약산 중에서도 콜라닉산의 가수분해에 최적인 약산을 선택하기 위하여, 아세트산, 인산 및 포름산을 사용하여 실시예 4에서 결정된 최적 조건과 동일한 조건에서 콜라닉산의 산가수분해 반응을 수행하였다.
그 결과, 도 3에 나타나는 바와 같이, 인산을 사용한 경우에 가수분해물 내 퓨코스 및 갈락토스 함량이 가장 높음을 확인하였고, 가수분해에 사용될 산을 인산으로 결정하였다.
[실시예 6] 2'-FL(퓨코실화락토스) 생산균주의 제작
2'-FL을 생산하는 균주인 사카로미세스 세레비시아이 D452-2_2'-FL 균주는 3가지 유전자를 도입하여 제작하였다. 먼저, 박테로이드 후라길리스 9343의 L-퓨코카이네이스/5'-다이포스페이트-퓨코스(GDP-퓨코스) 포스포릴레이스를 코딩하는 fkp(M.J. Coyne, B. Reinap, M.M. Lee, L.E. Comstock, Human symbionts use a host-like pathway for surface fucosylation, Science 307(5716) (2005) 1778-1781)와, 락토스와 GDP-퓨코스의 퓨코실화를 위한 헬리코박터 파이로리의 α-1,2-퓨코실 전이효소를 코딩하는 fucT2(G. Wang, P.G. Boulton, N.W.C. Chan, M.M. Palcic, D.E. Taylor, Novel Helicobacter pylori α1,2-fucosyltransferase, a key enzyme in the synthesis of Lewis antigens, Microbiology 145(11) (1999) 3245-3253.)와, 락토스 섭취를 위한 피키아 스티피티스의 헥소스 수송체를 코딩하는 돌연변이 HXT2.4(A291D)를 도입하였다. fkp, fucT2 및 돌연변이 HXT2.4(A291D) 세가지 유전자를 포함하는 각 플라스미드는 리튬 아세테이트/단일가닥 캐리어 DNA/폴리에틸렌 글리콜 방법(LiAc/SS carrier DNA/PEG method)을 사용하여 사카로미세스 세레비시아이 D452-2에 형질전환하였다 (도 1).
[실시예 7] 콜라닉산 가수분해물을 이용한 2'-FL의 생산
사카로미세스 세레비시아이 D452-2_2'-FL 균주는 20 g/L 글루코스, 6.7 g/L 아미노산을 포함하지 않는 효모 질소원(Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA), 1.4 g/L 히스티딘, 류신, 유라실, 트립토판을 포함하지 않는 합성 효모 배지 첨가물(Sigma-Aldrich) 및 0.1 g/L 트립토판(Kanto Chemical Co., INC., Tokyo, Japan)을 포함한 배지를 사용하여 선택적 압력을 가하였다. 사전배양된 세포는 20 g/L 글루코스, 2 g/L 락토스, 1.6 g/L 퓨코스를 함유한 콜라닉산 가수분해물, 그리고 50 mM 수소화 칼륨 프탈산 버퍼(KHP 버퍼; pH 5.5)를 함유한 히스티딘, 류신, 유라실이 빠진 YSC 배지에서 발효를 진행하였다. 초기 OD600은 0.1로 조절하였으며, 30°C, 200 rpm에서 105시간 동안 배양하였다(도 5).
[실시예 8] 2'-FG(퓨코실화갈락토스) 생산균주의 제작
사카로미세스 세레비시아이에서 2'-FG 합성에 필요한 기질인 갈락토스를 이용하지 못하도록 하기 위해 갈락토스 대사의 첫 번째 단계에 관여하는 유전자 GAL1을 CRISPR-Cas9를 이용하여 삭제하였다. 가이드 RNA 플라스미드 p42K_gGAL1은 gRNA_GAL1_F 및 gRNA_GAL1_R의 프라이머 쌍(표 2, 3)과 함께 pRS42K 플라스미드를 사용하여 리버스 PCR을 통해 제작하였다. 또한 GAL1을 삭제하기 위한 공여 DNA는 프라이머 쌍 dDNA_GAL1_F와 dDNA_GAL1_R을 사용하여 제작하였다(표 2). 사카로미세스 세레비시아이 D452-2는 가이드 RNA인 p42K_gGAL1 2 μg과 20 μg의 공여 DNA 및 1 μg의 Cas9-NAT 플라스미드로 형질전환시켰다(표 1). GAL1의 삭제는 프라이머 쌍 Conf_GAL1_F 및 Conf_GAL1_R(표 1)를 사용하여 콜로니 PCR로 확인하였고, 결과적으로 컨트롤 균주인 사카로미세스 세레비시아이 D452-2 △GAL1 균주를 제작하였다. 효모에서 2'-FG 생산을 위해, D452-2 △GAL1 균주에 fkp와 fucT2를 각각 포함하는 플라스미드를 LiAc/SS 운반체 DNA/PEG법을 이용하여 넣어주었고, 최종적으로 사카로미세스 세레비시아이 D452-2_2'-FG 균주를 제작하였다 (도 1).
[실시예 9] 콜라닉산 가수분해물을 이용한 2'-FG의 생산
표준당을 사용하여 효모 사카로미세스 세레비시아이 D452-2_2'-FG에서 2'-FG를 생산하기 위해, 성장을 위한 탄소 공급원으로 20 g/L 글루코스를, 그리고 2'-FG 생산 기질로 2 g/L 퓨코스와 갈락토스를 넣은 YSC 배지에서 발효를 진행하였다. 이 때 발효 조건은 30°C, 200rpm이었다.
그 다음으로, 퓨코스와 갈락토스의 공급원으로 콜라닉산 가수분해물을 사용하여 D452-2_2'-FG 균주에서 2'-FG를 생산하기 위해, 20 g/L 글루코스, 2.8 g/L 퓨코스와 2.3 g/L 갈락토스를 함유한 콜라닉산 가수분해물을 넣은 YSC 배지를 이용하여 30°C, 200rpm 조건에서 66시간 동안 발효를 진행하였다. 발효 시 UV 가시 분광 광도계(Bio-Rad)를 사용하여 OD600을 측정해 세포 성장을 모니터링하였다.
[실시예 10] 가스 크로마토그래피/비행시간-질량분광법을 이용한 퓨코실화 올리고당 생산 분석
2'-FL 및 2'-FG의 생산을 확인하기 위하여 GC/TOF-MS 분석을 실시하였으며, 배양액 1 mL를 95°C에서 5분간 끓이고, 상등액을 20,035 X g, 4°C에서 5분간 원심분리하여 얻었다. 상등액 20 μL를 진공 건조시킨 후 유도체화하였으며, 유도체화된 시료는 [실시예 4]에서 설명한 바와 같이 분석하였다. 퓨코스, 락토스, 갈락토스, 포도당 및 글루쿠론산의 농도 또한 [실시예 3]에 설명된 것과 동일한 방법을 사용하여 HPLC 또는 GC/TOF-MS로 측정하였다.
그 결과, 사카로미세스 세레비시아이 D452-2_2'-FL 균주를 발효하여 2'-FL이 생산되는 것을 GC/TOF-MS로 확인하였다. 표준 2'-FL과 같은 머무름 시간에 생성된 피크와, 그 때 나타난 피크의 질량 스펙트럼 또한 표준 2'-FL의 질량 스펙트럼과 일치하였다. 이를 통해, 콜라닉산 분해물인 락토스 및 퓨코스를 기질로 사용하여 효모에서의 퓨코실화락토스가 생성됨을 확인하였다(도 4).
또한, D452-2_2'-FG 균주를 먼저 표준 퓨코스와 갈락토스를 기질로 이용하여 발효한 후 위와 동일하게 GC/TOF-MS로 확인하였다(도 8). 정제된 2'-FG와 같은 머무름 시간에서 피크를 확인하고, 질량 스펙트럼이 일치하는 것을 확인하여 콜라닉산 가수분해물인 퓨코스 및 갈락토스를 기질로 이용하여 발효를 진행했을 때 퓨코실화갈락토스를 생산하는 것을 확인하였다(도 9).
[실시예 11] 겔여과 크로마토그래피 및 고성능 액체 크로마토그래피를 통한 2'-FG의 생산 및 정제
2'-FG는 표준물질이 존재하지 않기 때문에, 최초로 2'-FG를 생산하는 것으로 보고된 대장균 BL21(DE3) pmBCGWF를 이용하여 생산하였다(E.J. Yun, J.-J. Liu, J.W. Lee, S. Kwak, S. Yu, K.H. Kim, Y.-S. Jin, Biosynthetic routes for producing various fucosyl-oligosaccharides, ACS Synth. Biol. 8(2) (2019) 415-424.). 대장균 BL21(DE3) pmBCGWF는 1-L 플라스크에 50 μg/mL의 카나마이신이 함유된 LB 배지에 접종하고 37°C, 200 rpm에서 배양하였다. OD600이 1.0에 도달하면 5 g/L 글리세롤, 2 g/L 갈락토스, 그리고 0.1 mM IPTG를 첨가하였다. 인큐베이션 온도는 IPTG 유도 후 25°C로 변경하고, 글리세롤이 고갈되면 4 g/L 글리세롤을 추가로 첨가하였다.
대장균에서 생산된 2'-FG는 겔 여과 크로마토그래피인 Sephadex G-10 수지(Sigma-Aldrich)로 패킹된 컬럼(I.D. 6 Х 100 cm)을 이용하여 1차로 정제하였다. 농축시킨 대장균 배양액을 컬럼에 주입하고 증류수를 이동상으로 하여 1 mL/min의 유량으로 용출되는 샘플을 받았다. 고순도 2'-FG를 얻기 위해 1차 정제 샘플을 HPLC를 이용하여 2'-FG가 검출되는 특정 시간에 샘플을 수집하여 2차 정제를 실시하였다(도 6 및 도 7).
Name Sequence (5’ > 3’, restriction sites are underlined)
Primer
gRNA_GAL1_F (서열번호 7) GGTGATGTACCAACTGGCAGGTTTTAGAAGCTAGAAATAGCAAG
gRNA_GAL1_R (서열번호 8) CTGCCAGTTGGTACATCACC CGATCTTTATCTTTCACTGCG
dDNA_GAL1_F (서열번호 9) TCA AAT GTC ATA AAA GTA TCA ACA AAA AAT TGT TAA TAT ACC TCT ATA CTT TAA CGT CAA GGA GAA AAA ACT ATA GTA TAC TTC TTT TTT
dDNA_GAL1_R (서열번호 10) TAT TTT GTG ATG CTA AAG TTA TGA GTA GAA AAA AAT GAG AAG TTG TTC TGA ACA AAG TAA AAA AAA GAA GTA TAC TAT AGT TTT TTC TCC
Conf_GAL1_F (서열번호 11) TGGAACTTTCAGTAATACGC
Conf_GAL1_R (서열번호 12) GTCATTTCTTTTCCTCCTCG
Name Description
Plasmid
pRS423GPD HIS3, GPD promoter, CYC1 terminator, 2 μ origin, and Ampr
pRS425GPD LEU2, GPD promoter, CYC1 terminator, 2 μ origin, and Ampr
pRS426GPD URA3, GPD promoter, CYC1 terminator, 2 μ origin, and Ampr
pRS423GPD_fucT2 pRS423GPD harboring fucT2 from H. pylori
pRS425GPD_fkp pRS423GPD harboring fkp from B. fragilis 9343
pRS426GPD_HXT2.4M pRS426GPD harboring mutant HXT2.4(A291D) from S. stipitis
pmBCGWF Derived from pCOLAduet-1, PT7-manB, manC-PT7-gmd, wcaG-PT7-fucT2-TT7, KanR
pRS42K 2 μ origin, KanMX
p42K_gGAL1 pRS42K, gRNA cassette targeting GAL1
Cas9-NAT p414-TEF1p-Cas9-CYC1t-NAT1
Strain
S. cerevisiae D452-2 S. cerevisiae, MATα, leu2, his3, ura3, and can1
D452-2_2'-FL S. cerevisiae D452-2 harboring pRS423GPD_ fucT2, pRS425GPD_fkp, and pRS426GPD_HXT2.4M
D452-2 △GAL1 Deletion of GAL1 in S. cerevisiae D452-2
D452-2_2'-FG S. cerevisiae D452-2 △GAL1 harboring pRS423GPD_fucT2, pRS425GPD_fkp, pRS426GPD
E. coli JM109(DE3) △waaF + rcsF deletion of waaF and overexpression of rcsF in E. coli JM109(DE3)
E. coli BL21(DE3) F-, dcm, ompT, hsdSB (rB- mB-), gal, dcm (DE3)
E. coli BL21(DE3) pmBCGWF BL21(DE3) harboring pmBCGWF plasmid

Claims (9)

  1. (1) 콜라닉산을 산가수분해하여 퓨코스를 생산하는 단계; 및
    (2) 단계(1)에서 생산된 퓨코스를 락토스와 함께 기질로 이용하여 퓨코실화락토스를 생산하는 단계를 포함하는 콜라닉산으로부터 퓨코실화 올리고당 생산 방법.
  2. (1) 콜라닉산을 산가수분해하여 퓨코스 및 갈락토스를 생산하는 단계; 및
    (2) 단계(1)에서 생산된 퓨코스 및 갈락토스를 기질로 퓨코실화갈락토스를 생산하는 단계를 포함하는 콜라닉산으로부터 퓨코실화 올리고당 생산 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 단계 (1)의 산가수분해는 1 내기 8(%, w/v) 약산을 사용하여, 50 내지 150℃에서 10 내지 100분간 수행되는 것인 방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 단계　(2)는 하기 효소, 또는 하기 효소를 코딩하는 유전자가 도입된 재조합 미생물에 의해 수행되는 방법:
    (1) L-퓨코카이네이스/5'-다이포스페이트-퓨코스(GDP-퓨코스)포스포릴레이스;
    (2) α-1,2-퓨코실 전이효소; 및
    (3) 헥소스 수송체.
  5. 제 4항에 있어서,
    L-퓨코카이네이스/5'-다이포스페이트-퓨코스(GDP-퓨코스)포스포릴레이스는 서열번호 1로 표시되고, α-1,2-퓨코실 전이효소는 서열번호 3으로 표시되며, 헥소스 수송체는 서열변호 5로 표시되는 방법.
  6. 제 4항에 있어서,
    제 4항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 사카로마이세스 세레비시아이인 방법.
  7. 제 2항에 있어서,
    상기 단계　(2)는 하기 효소, 또는 하기 효소를 코딩하는 유전자가 도입된 재조합 미생물에 의해 수행되는 방법:
    (1) L-퓨코카이네이스/5'-다이포스페이트-퓨코스(GDP-퓨코스)포스포릴레이스; 및
    (2) α-1,2-퓨코실 전이효소.
  8. 제 7항에 있어서,
    L-퓨코카이네이스/5'-다이포스페이트-퓨코스(GDP-퓨코스)포스포릴레이스는 서열번호 1로 표시되고, α-1,2-퓨코실 전이효소는 서열번호 3으로 표시되는 방법.
  9. 제 7항에 있어서,
    상기 재조합 미생물은 GAL1 유전자가 결실된 사카로마이세스 세레비시아이인 방법.
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