JP2024500025A - Ｄｆｌ産生株 - Google Patents

Abstract

本発明は、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ及びα－１，３－フコシルトランスフェラーゼ及び主要促進体スーパーファミリー（ＭＦＳ）の輸送体タンパク質を発現する遺伝子改変細胞、並びに前記遺伝子改変細胞を用いたヒト乳オリゴ糖（ＨＭＯ）の組換え生産方法に関する。より詳しくは、本発明は、３－フコシルラクトース（３ＦＬ）及び／又は２’－フコシルラクトース（２’ＦＬ）の含量が比較的少なく、最も豊富なＨＭＯとしてジフコシルラクトース（ＤＦＬ）を生産することができる組換え生産方法及び遺伝子改変細胞を提供する。【選択図】図１

Description

発明の詳細な説明

［発明の分野］
本発明は、宿主細胞における生物学的分子の組換え産生の分野に関する。特に、本発明は、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ及びα－１，３－フコシルトランスフェラーゼ、並びに、任意選択で主要促進体スーパーファミリー（ＭＦＳ）のタンパク質を発現する遺伝子改変細胞を使用して、ヒト乳オリゴ糖（ＨＭＯ）を組換え生産する方法に関する。より詳しくは、本発明は、３－フコシルラクトース（３ＦＬ）及び２’－フコシルラクトース（２’ＦＬ）の含量が比較的少なく、主にジフコシルラクトース（ＤＦＬ）を生産することができる組換え生産方法及び遺伝子改変細胞を提供する。

［発明の背景］
ヒト乳は、炭水化物、脂肪、タンパク質、ビタミン、ミネラル及び微量元素の複合混合物を表す。最も主要な画分は、炭水化物によって表され、炭水化物はさらに、ラクトース及びより複合したオリゴ糖（ヒト乳オリゴ糖、ＨＭＯ）にさらに分けることができる。ラクトースはエネルギー源として使用されるが、複合オリゴ糖は乳児によって代謝されない。複合オリゴ糖の画分は、炭水化物画分全体の最大１／１０を占め、おそらく１５０種を超える異なるオリゴ糖で構成されている。これらの複合オリゴ糖の発生及び濃度は、ヒトに特有であり、家畜化された乳畜などの他の哺乳類の乳に大量に存在することはない。

最も顕著なオリゴ糖は２’－フコシルラクトース及び３－フコシルラクトースであり、これらは合わせると全ＨＭＯ画分の最大１／３に寄与し得る。ヒト乳中に存在するさらなる顕著なＨＭＯは、ラクト－Ｎ－テトラオース、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース及びラクト－Ｎ－フコペンタオースＩである。これらの中性オリゴ糖の他に、例えば３’－シアリルラクトース、６’－シアリルラクトース及び３－フコシル－３’シアリルラクトース、ジシアリル－ラクト－Ｎ－テトラオースなどの酸性ＨＭＯもヒト乳中に見出すことができる。これらのフコシル構造及びシアリル構造は上皮細胞表面複合糖質のエピトープ、すなわち、癌病因の特徴と考えられるルイスｘ（ＬｅＸ）などのルイス組織血液型抗原と密接に関連している。上皮エピトープに対するＨＭＯの構造的相同性は、細菌性病原体に対するそれらの防御特性を説明する。

ヒト乳中に複合オリゴ糖が存在することは古くから知られており、これらのオリゴ糖の生理学的機能は何十年もの間、医学的研究に供されてきた。豊富に含まれるヒト乳オリゴ糖のいくつかについては、特定の機能が既に特定されている。

腸管における局所作用に加えて、ＨＭＯは、全身循環に入ることによって乳児において全身作用を誘発することが示されている。また、タンパク質－炭水化物相互作用、例えば、セレクチン－白血球結合に対するＨＭＯの影響は、免疫反応を調節し、炎症反応を減少させることができる。さらに、ＨＭＯが乳児の微生物叢の発達にとって重要な基質であることがますます認識されるようになっている。

ヒト乳オリゴ糖（ＨＭＯ）は、ヒト母乳中の三番目に大きい固体成分を構成し、酵素による加水分解に対して非常に耐性がある。結果として、ＨＭＯの実質的な画分は、ほとんど消化も吸収されずに残り、それらの結腸への通過を可能にする。結腸内では、ＨＭＯは、特異的糖分解細菌の増殖を選択的に刺激することにより、腸内エコシステムを形作る基質として機能し得る。この選択性は、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種の菌株が消化管の健康にプラスの効果を有すると考えられるため、乳児及び成人の両方にとって有益であると見なされている（Ｃｈｉｃｈｌｏｗｓｋｉ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｎｕｔｒ．５：２５１－２５８；Ｅｌｉｓｏｎ Ｅ．ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｂｒｉｔ Ｊ．Ｎｕｔｒ，１１６：１３５６－１３６８）。

それらのプレバイオティクス特性の他に、ＨＭＯは、それらの適用分野を拡大する追加のプラスの効果と結び付けられている（Ｋｕｎｚ Ｃ．ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｆｏｏｄ Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ，１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐ５－２０，Ｅｄｓ．Ｍｏｒｅｎｏ Ｊ．ａｎｄ Ｌｕｚ Ｓａｎｚ Ｍ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ）。

ＨＭＯの明白な健康上の利点は、例えば、乳児用調製粉乳及び乳児食などの食品における使用並びに消費者用健康食品のためのそれらの承認を可能にした。

プレバイオティクスオリゴ糖、特にＨＭＯの有益な特性はよく研究されており、その入手が困難であることから、効果的な商業的生産、すなわち大規模生産が非常に望まれている。

ＨＭＯの生物工学的生産は、費用効率良く且つ大規模でＨＭＯを製造するための有益な方法であるその方法は、所望のオリゴ糖を合成するために必要とされるグリコシルトランスフェラーゼを発現するように構築された遺伝子組換え細菌を使用するもので、ＨＭＯ前駆体として細菌に固有のヌクレオチド糖のプールを利用する。

ＨＭＯの生物工学的生産における最近の発展により、細菌発現系の所定の固有の限界を克服することが可能になった。例えば、国際公開第２０１２／１１２７７７号パンフレットには、ＨＭＯ産生細菌細胞を遺伝的に改変して、アルファ－１，２フコシルトランスフェラーゼ及びアルファ－１，３フコシルトランスフェラーゼ活性の両方を潜在的に有することによってフコシル化オリゴ糖を産生させ、細菌中のヌクレオチド糖の限られた細胞内プールを増加させ得ることが記載されている。細胞は２’ＦＬ、３ＦＬ及びＤＦＬの混合物を産生するが、ＤＦＬの量は少ない。国際公開第２０１６／０４０５３１号パンフレットには、フコシル化ＨＭＯの産生活性が改善された特定のアルファ－１，３フコシルトランスフェラーゼが開示されている。国際公開第２０１０／１４２３０５号パンフレット及び国際公開第２０１７／０４２３８２号パンフレットには、合成されたＨＭＯの細胞外培地への分泌を促進するためのエクスポーターの使用が記載されている。さらに、組換え細胞内の目的遺伝子の発現は、例えば、近年、国際公開第２０１９／１２３３２４号パンフレットに記載されているような特定のプロモーター又は他の遺伝子発現調節因子を用いて調節され得る。

国際公開第２０１０／１４２３０５号パンフレット及び国際公開第２０１７／０４２３８２号パンフレットに記載されているアプローチは、例えば、国際公開第２０１２／１１２７７７号パンフレット、国際公開第２０１６／０４０５３１号パンフレット又は国際公開第２０１９／１２３３２４号パンフレットの方法による高レベルの組換え遺伝子発現によって産生細胞に与える代謝負荷を低減することを可能にするという利点を有する。このアプローチは、組換えＨＭＯ産生細胞工学において注目を集めており、例えば、最近、組換えにより産生された２’－フコシルラクトース（２’ＦＬ）の流出を促進することができるいくつかの新しい糖輸送体遺伝子が記載されている（国際公開第２０１８／０７７８９２号パンフレットはｓｅｔＡ及びＹｂｅｒＣを開示し、米国特許出願公開第２０１９／００３２３０５３号明細書及び米国特許出願公開第２０１９／００３２３０５２号明細書は酵母輸送体に関する）。

しかしながら、現在、特定のＨＭＯを効率よく産生することができる組換え方法を提供する必要性が依然として存在する。

［発明の概要］
本発明は、ＨＭＯを産生することができる遺伝子改変細胞に関する。産生されるＨＭＯは主にＤＦＬである。好ましくは、産生される全ＨＭＯの５０％超、例えば６０％に相当する量のＤＦＬが産生される。産生される他のＨＭＯは主に、３ＦＬ及び２’ＦＬ、並びにそれらの組み合わせから選択される。

本発明の一態様は、
ａ．α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ、及び
ｂ．α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ
ｃ．主要促進体スーパーファミリー（ＭＦＳ）から選択される輸送体タンパク質
をコードする異種、組換え及び／又は合成核酸を含む遺伝子改変細胞である。

一実施形態では、本発明による遺伝子改変細胞は、ｆｕｔＣ又はｗｂｇＬ遺伝子であるα－１，２－フコシルトランスフェラーゼをコードする異種、組換え及び／又は合成核酸と、ｆｕｔＡ遺伝子又はｆｕｃＴ遺伝子又はｍｏｕｍｏｕ遺伝子から選択されるα－１，３－フコシルトランスフェラーゼをコードする核酸とを含む。

典型的には、ＭＦＳ輸送体タンパク質を有する遺伝子改変細胞は、ＭＦＳ輸送体タンパク質を有さない同じ細胞と比較して、少なくとも５重量％多くＤＦＬを産生する。典型的には、遺伝子改変細胞は、本明細書に記載の細胞によって産生されるＨＭＯの５０重量％以上、例えば６０重量％、例えば６５重量％以上、又は７０重量％以上がジフコシルラクトース（ＤＦＬ）であり、同細胞において産生されるＨＭＯの総量の多くとも３５重量％が３－フコシルラクトース（３ＦＬ）及び／又は２’－フコシルラクトース（２’ＦＬ）であり、例えば、同細胞において産生されるＨＭＯの総量の最大３０％、例えば最大２０重量％、例えば最大１５重量％、最大１０重量％、最大５重量％、最大２．５重量％又は最大１重量％が３－フコシルラクトースである。さらに、同細胞において産生されるＨＭＯの総量の最大３０重量％、例えば最大２０重量％、例えば最大１５重量％、最大１０重量％、最大５重量％、最大２．５重量％、又は最大１重量％は、２’－フコシルラクトース（２’ＦＬ）である。

現在好ましい実施形態では、遺伝子改変細胞は、主要促進体スーパーファミリー（ＭＦＳ）から選択される輸送体タンパク質をコードする異種、組換え及び／又は合成核酸をさらに含む。輸送体タンパク質は、配列番号１（ｍａｒｃ）、若しくはアミノ酸配列が配列番号１と少なくとも８０％同一、好ましくは少なくとも８５％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一であるその機能的相同体、又は配列番号２（ｎｅｃ）、若しくはアミノ酸配列が配列番号２と少なくとも８０％同一、好ましくは少なくとも８５％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一であるその機能的相同体、又は配列番号３（ｖａｇ）、若しくはアミノ酸配列が配列番号３と少なくとも８０％同一、好ましくは少なくとも８５％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一であるその機能的相同体、又は、又は配列番号４２（ｆｒｅｄ）、若しくはアミノ酸配列が配列番号４２と少なくとも８０％同一、好ましくは少なくとも８５％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一であるその機能的相同体、又は配列番号４３（ｂａｄ）、若しくはアミノ酸配列が配列番号４３と少なくとも８０％同一、好ましくは少なくとも８５％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一であるその機能的相同体からなり得る。

本発明による遺伝子改変細胞は、微生物細胞、好ましくはエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である。前記細胞は、異種、組換え及び／又は合成核酸の発現を調節する核酸配列、例えば、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、若しくはｍｇｌＢプロモーター（ＰｍｇｌＢ）、若しくはｇｌｐプロモーター（ＰｇｌｐＦ）、又はその任意のバリアントなどのプロモーター核配列を含む異種、組換え及び／又は合成調節エレメントをさらに含むことができる。好ましくは、プロモーター核配列は、ＰｇｌｐＦ、ＰｍｇｌＢ、又はそのバリアントである。

本発明はさらに、生産される主要オリゴ糖がジフコシルラクトース（ＤＦＬ）である、１種以上のオリゴ糖を生産する方法であって、
（ｉ）ＨＭＯを産生することができる遺伝子改変細胞を提供する工程であって、前記細胞は、
ａ．α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ、及び
ｂ．α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ、及び
ｃ．主要促進体スーパーファミリー（ＭＦＳ）から選択される輸送体タンパク質
をコードする異種、組換え及び／又は合成核酸を含む遺伝子改変細胞を含む工程；
（ｉｉ）（ｉ）による細胞を好適な細胞培養培地中で培養して、前記ＨＭＯを生成する工程；並びに
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で生成された１種以上のＨＭＯを回収する工程
を含む方法に関する。

典型的には、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼをコードする前記異種、組換え及び／又は合成核酸は、ｆｕｔＣ及び／若しくはｗｂｇＬ遺伝子、又はその機能的相同体であり、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼをコードする前記異種、組換え及び／又は合成核酸は、ｆｕｔＡ遺伝子及び／若しくはｆｕｃＴ遺伝子若しくはｍｏｕｍｏｕ遺伝子、又はｆｕｔＡ遺伝子及び／若しくはｆｕｃＴ遺伝子若しくはｍｏｕｍｏｕ遺伝子の機能的相同体から選択される。

前記遺伝子改変細胞は、以下に限定されないが、ｍａｒｃ、ｎｅｃ、ｖａｇ、ｆｒｅｄ又はｂａｄなどの主要促進体スーパーファミリー（ＭＦＳ）から選択される輸送体タンパク質をコードする異種、組換え及び／又は合成核酸をさらに含むことができる。

本明細書に記載される方法によって生成されるＨＭＯの総量の最大３５重量％、例えば、最大２０重量％、最大１５重量％、最大１０重量％、最大で５重量％、最大２．５重量％又は最大１重量％は、３－フコシルラクトース（３ＦＬ）である。一態様では、本明細書に記載の方法は、３－フコシルラクトース（３ＦＬ）を実質的に生成しないか、又は非常にわずかの３－フコシルラクトース（３ＦＬ）、例えば、生成されるＨＭＯの総量の実質的に０．１～０重量％を生成するだけである。

本明細書に記載される方法によって生産されるＨＭＯの総量の最大３５重量％、例えば、最大２０重量％、最大１５重量％、最大１０重量％、最大で５重量％、最大２．５重量％又は最大１重量％は、２’－フコシルラクトース（２’ＦＬ）である。

一態様では、工程（ｉｉ）における細胞の培養は、低ラクトース条件、例えば、＜５ｇラクトース／ｌ培養培地の条件で行われる。

本発明はさらに、１種以上のＨＭＯを生産するための本発明による遺伝子改変細胞の使用であって、細胞中に生成されるＨＭＯの少なくとも５０重量％、例えば少なくとも６０重量％、例えば少なくとも６５重量％、例えば少なくとも７０重量％は、ジフコシルラクトース（ＤＦＬ）である。

本発明の他の態様及び有利な特徴を、下記の非限定的な実施例で詳細に記載し且つ例示する。

［定義と略語］
細胞生物学及びタンパク質生化学において、異種発現とは、タンパク質が通常はそのタンパク質を作らない細胞に実験的に導入されることを意味する。

組換えＤＮＡ分子は、複数の供給源からの遺伝物質を集め、そうでなければゲノム中に見出されない配列を作り出す、遺伝子組換えの実験室的方法によって形成されるＤＮＡ分子である。

合成プロモーター（これに限定されない）などの合成核酸は、設計され、化学的に合成されたＤＮＡのストレッチである。合成プロモーターは、通常、コアプロモーター領域と、異種上流調節エレメント（シスモチーフ及び／又はＴＦ結合部位）の複数のリピート又は組み合わせとを含む。

用語「組換え細胞」、「組換え細胞株」又は「組換え株」は、本文脈においては、組換えＤＮＡが安定に又は一時的に導入された、すなわち、遺伝子組換えが行われた細胞、細胞株又は株を意味するために使用される。

本文脈において、遺伝子改変細胞は、異種、組換え及び／又は合成ＤＮＡを発現するように遺伝子改変された細胞である。本文脈において、用語「遺伝子改変された」及び「遺伝子操作された」は、互換的に用いられる。組換え細胞、細胞株又は株は、遺伝子改変された細胞、細胞株又は株である。

「遺伝子操作された」及び／又は「遺伝子改変された」という用語は、本明細書で使用される場合、分子生物学的方法を使用する微生物細胞の遺伝子構造の改変を指す。微生物細胞の遺伝子構造の改変には、種の境界内並びに／又は種の境界を越えた遺伝子の移入、ヌクレオチド、トリプレット、遺伝子、オープンリーディングフレーム、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター並びに遺伝子発現を媒介及び／若しくは制御する他のヌクレオチド配列の挿入、欠失、置換並びに／又は改変が含まれ得る。微生物細胞の遺伝子構造の改変は、特定の所望の特性を有する遺伝子改変生物を生成することを目的とする。

遺伝子操作された微生物細胞は、細胞の天然の（遺伝子操作されていない）形態には存在しない１つ以上の遺伝子を含有し得る。細胞の遺伝情報のヌクレオチド配列を挿入、欠失又は変更するために、細胞の遺伝情報に外因性核酸分子を導入し且つ／又は外因性核酸分子（組換え、異種）を挿入する技術は、当業者に知られている。

遺伝子操作された微生物細胞は、細胞の天然形態に存在する１つ以上の遺伝子を含むことができ、前記遺伝子は、人工的手段によって改変され、微生物細胞に再導入される。「遺伝子操作された」という用語はまた、細胞に対して内因性であって、細胞から除去することなく改変された核酸分子を含有する微生物細胞を包含する。このような改変には、遺伝子置換、部位特異的変異、及び関連技術によって得られるものが含まれる。

「組換え核酸配列」、「組換え遺伝子／核酸／ＤＮＡ」という用語は互換的に使用され、人工核酸配列（すなわち、核酸配列を作製するための標準的な実験室方法を使用してインビトロで作製される）を指す。組換え核酸はまた、非コーディングプロモーター又は他の調節エレメントであり得る。

「異種核酸配列／組換え遺伝子／核酸／ＤＮＡコーディング」又は「コーディング核酸配列」という用語は、適切な制御配列、すなわちプロモーターの制御下に置かれた場合、ｍＲＮＡ内に転写されポリペプチドに翻訳される一連の連続的非重複トリプレット（コドン）を含む、人工的（すなわち、核酸配列を作成するために標準的な実験室方法を用いてインビトロで産生される）核酸配列を意味する。コーディング配列の境界は、一般に、ｍＲＮＡの５’末端にあるオープンリーディングフレームのすぐ上流に位置するリボソーム結合部位、翻訳開始コドン（ＡＵＧ、ＧＵＧ又はＵＵＧ）及び翻訳終止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡ又はＵＡＧ）によって決定される。コーディング配列としては、ゲノムＤＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列、合成配列、並びに異種、組換え及び／又は合成配列が挙げられ得るが、これらに限定されない。用語「核酸」には、ＲＮＡ、ＤＮＡ及びｃＤＮＡ分子が含まれる。遺伝コードの縮重の結果として、所与のタンパク質をコードする複数のヌクレオチド配列が産生され得ると理解されている。用語「核酸」は、用語「ポリヌクレオチド」と互換的に使用される。「オリゴヌクレオチド」は、短鎖核酸分子である。

「ヌクレオチド配列コーディング」という用語は一般に、任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを指し、非改変ＲＮＡ若しくはＤＮＡであっても改変ＲＮＡ若しくはＤＮＡであってもよく、一般に、特定のポリペプチド又はタンパク質をコードする遺伝子の部分を表す。この用語には、一本鎖ＤＮＡ及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖領域、又は一本鎖、二本鎖及び三本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ及び二本鎖ＲＮＡ、並びに一本鎖及び二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖領域、より典型的には二本鎖若しくは三本鎖領域、又は一本鎖及び二本鎖領域の混合物であってもよいＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子が含まれるが、これらに限定されない。この用語はまた、ポリペプチドをコードする単一の連続領域又は不連続領域（例えば、組み込まれたファージ又は挿入配列若しくは編集によって中断されている）を、コード配列及び／又は非コード配列も含み得るさらなる領域と共に含むポリヌクレオチドを包含する。

本明細書中で用いられる「異種（の）」は、細胞又は生物と無関係のポリペプチド、アミノ酸配列、核酸配列又はヌクレオチド配列、すなわち前記細胞又は生物内に天然に存在しないポリペプチド、アミノ酸配列、核酸分子又はヌクレオチド配列を指す。「異種配列」又は「異種核酸」又は「異種ポリペプチド」は、本明細書で使用される場合、特定の宿主細胞とは無関係の供給源に由来する（例えば、異なる種に由来する）、又は同じ供給源に由来する場合、その元の形態から改変されているものである。したがって、プロモーターに作動可能に連結された異種核酸は、プロモーターが由来するものとは異なる供給源に由来するか、又は同じ供給源に由来する場合、その元の形態から改変されている。異種配列は、例えば、トランスフェクション、形質転換、コンジュゲーション又は形質導入によって、宿主微生物宿主細胞のゲノムに安定に導入することができ、したがって、遺伝子改変宿主細胞を示す。配列が導入される宿主細胞に応じた技術が適用され得る。様々な技術が当業者に知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａ／，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ． （１９８９）に開示されている。

本明細書で使用される場合、「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖又は二本鎖の形態のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーを指し、他に限定されない限り、天然に存在するヌクレオチドと同様の様式で核酸にハイブリダイズする天然ヌクレオチドの既知の類似体を包含する。別段の指示がない限り、特定の核酸配列には、その相補配列が含まれる。

「機能的遺伝子」という用語は、本明細書で使用される場合、タンパク質又はポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を指し、タンパク質又はポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が前記機能的遺伝子を有する微生物細胞において／によって発現され得るように、前記タンパク質コードヌクレオチド配列に作動可能に連結された調節配列も含む。したがって、機能的遺伝子の発現を許容する条件で培養された場合、前記機能的遺伝子は発現され、前記機能的遺伝子を発現する微生物細胞は、機能的遺伝子のタンパク質コード領域によってコードされるタンパク質又はポリペプチドを通常含む。

用語「作動可能に連結した」は、２個以上の核酸（例えば、ＤＮＡ）断片間の機能的関係を指す。通常、それは、転写調節配列と転写配列との機能的関係を指す。作動可能に連結されるとは、核酸発現制御配列（プロモーター、シグナル配列、又は転写因子結合部位のアレイなど）と第２の核酸配列との間に機能的連結が存在し、発現制御配列が第２の配列に対応する核酸の転写及び／又は翻訳に影響を及ぼすことを意味する。例えば、プロモーター配列は、それが適切な宿主細胞又は他の発現系のコード配列の転写を刺激又は調節する場合、コード配列と作動可能に連結している。一般に、転写配列に作動可能に連結しているプロモーター転写調節配列は、転写配列に物理的に隣接している。すなわち、それらは、シス作用性である。

「過剰発現」又は「過剰発現された」という用語は、本明細書で使用される場合、遺伝子改変されていない宿主細胞と同じ種の野生型細胞において測定されるレベルより高い酵素又はポリペプチドの発現レベルを指す。

本発明に関連して、用語「オリゴ糖」は、複数の単糖単位を含有する糖ポリマーを意味する。用語「オリゴ糖」は、本明細書で使用される場合、３～２０個の単糖残基からなる糖分子を指し、ここで、前記単糖残基の各々は、グリコシド結合によって前記単糖単位の少なくとも１つの他の単糖単位に結合している。オリゴ糖は、単糖残基の直鎖又は単糖残基の分枝鎖であり得る。

いくつかの実施形態では、好ましいオリゴ糖は、３又は４単糖単位からなる糖ポリマー、すなわち三糖又は四糖である。本発明の好ましいオリゴ糖は、ヒト乳オリゴ糖（ＨＭＯ）である。

本文脈において、用語「ヒト乳オリゴ糖」又は「ＨＭＯ」は、ヒト母乳中で見出される複合糖質を意味する（参考のために、Ｕｒａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．：Ｍｉｌｋ Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．Ｎｏｖａ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ（２０１１）；又はＣｈｅｎ，Ａｄｖ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２，１１３（２０１５）を参照されたい）。ＨＭＯは、１つ以上のベータ－Ｎ－アセチル－ラクトサミニル及び／又は１つ以上のベータ－ラクト－Ｎ－ビオシル単位によって伸長され得る還元末端にラクトース単位を含むコア構造を有し、このコア構造は、アルファ－Ｌ－フコピラノシル及び／又はアルファ－Ｎ－アセチル－ノイラミニル（シアリル）部分によって置換され得る。

現在までに、少なくとも１１５個のＨＭＯの構造が決定されており（Ｕｒａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．：Ｍｉｌｋ Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０１１，ＩＳＢＮ： ９７８－１－６１１２２－８３１－１を参照されたい）、及びかなりより多くのものがおそらくヒト母乳中に存在する。

非酸性（又は中性）ＨＭＯは、シアリル残基を欠き、酸性ＨＭＯは、それらの構造内に少なくとも１つのシアリル残基を有する。非酸性（又は中性）ＨＭＯは、フコシル化されていても又はされていなくてもよい。

このような中性の非フコシル化ＨＭＯの例としては、ラクト－Ｎ－トリオース２（ＬＮＴ－２）ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）、ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ＬＮｎＨ）、パラ－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ｐＬＮｎＨ）、パラ－ラクト－Ｎ－ヘキサオース（ｐＬＮＨ）及びラクト－Ｎ－ヘキサオース（ＬＮＨ）が挙げられる。

中性フコシル化ＨＭＯの例としては、２’－フコシルラクトース（２’－ＦＬ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰ－Ｉ）、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩ（ＬＮＤＦＨ－Ｉ）、３－フコシルラクトース（３ＦＬ）、ジフコシルラクトース（ＤＦＬ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩ（ＬＮＦＰ－ＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩＩ（ＬＮＦＰ－ＩＩＩ）、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩＩＩ（ＬＮＤＦＨ－ＩＩＩ）、フコシル－ラクト－Ｎ－ヘキサオースＩＩ（ＦＬＮＨ－ＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＶ（ＬＮＦＰ－Ｖ）、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩＩ（ＬＮＤＦＨ－ＩＩ）、フコシル－ラクト－Ｎ－ヘキサオースＩ（ＦＬＮＨ－Ｉ）、フコシル－パラ－ラクト－Ｎ－ヘキサオースＩ（ＦｐＬＮＨ－Ｉ）、フコシル－パラ－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩＩ（Ｆ－ｐＬＮｎＨ ＩＩ）及びフコシル－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ＦＬＮｎＨ）が挙げられる。

酸性ＨＭＯの例としては、３’－シアリルラクトース（３’－ＳＬ）、６’－シアリルラクトース（６’－ＳＬ）、３－フコシル－３’－シアリルラクトース（ＦＳＬ）、３’－Ｏ－シアリルラクト－Ｎ－テトラオースａ（ＬＳＴ ａ）、フコシル－ＬＳＴ ａ（ＦＬＳＴ ａ）、６’－Ｏ－シアリルラクト－Ｎ－テトラオースｂ（ＬＳＴ ｂ）、フコシル－ＬＳＴ ｂ（ＦＬＳＴ ｂ）、６’－Ｏ－シアリルラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＳＴ ｃ）、フコシル－ＬＳＴ ｃ（ＦＬＳＴ ｃ）、３’－Ｏ－シアリルラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＳＴ ｄ）、フコシル－ＬＳＴ ｄ（ＦＬＳＴ ｄ）、シアリル－ラクト－Ｎ－ヘキサオース（ＳＬＮＨ）、シアリル－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩ（ＳＬＮＨ－Ｉ）、シアリル－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩＩ（ＳＬＮＨ－ＩＩ）及びジシアリル－ラクト－Ｎ－テトラオース（ＤＳＬＮＴ）が挙げられる。

本発明に関連して、ラクトースは、ＨＭＯ種であると見なされない。

本文脈における「培養する（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｎｇ）」（又は「培養する（ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ）」又は「培養」（「発酵」ともいう））という用語は、培地中、所望のオリゴ糖の産生に許容的で且つ好適な条件下で、細菌細胞を増殖させることを意味する。制御されたバイオリアクター中での細菌発現細胞の増殖は、業界で知られた方法である。数種の好適な細菌宿主細胞、並びにそれらを培養する培地及び条件は、当業者であれば、当業者の技術的及び専門的背景に関連して本発明の開示を読めば、容易に入手可能であろう。

本明細書で使用される場合、「回収する」という用語は、宿主微生物によって産生されたオリゴ糖を宿主微生物培養物から単離する、採取する、精製する、収集する、又はさもなければ分離することを意味する。

「酵素活性」という用語は、本明細書で使用される場合、酵素活性を示す任意の分子、特にタンパク質を含み、特定の生化学反応を引き起こすが、その反応によっては変化しない触媒として作用することを意味する。特に、基質を生成物に変換することができる酵素活性を有するタンパク質が、この用語に含まれることを意味する。

酵素反応において、基質と呼ばれるプロセス開始時の分子は、生成物と呼ばれる異なる分子に変換される。生物学的細胞におけるほとんど全ての化学反応は、生涯にわたって十分な速度で起こるために、酵素を必要とする。酵素はその基質に対して選択的であり、多くの可能性の中からわずかな反応のみを加速するので、細胞内で作られる一連の酵素のセットによって、その細胞内でどの代謝経路が発生するかが決まる。

「バリアント」という用語は、本明細書で使用される場合、参照ポリヌクレオチド又は参照ポリペプチドとそれぞれ異なるが、参照ポリヌクレオチド又は参照ポリペプチドの必須の（酵素）特性を保持するポリヌクレオチド又はポリペプチドを指し、機能的バリアントともいう。ポリヌクレオチドの典型的なバリアントは、別の参照ポリヌクレオチドとヌクレオチド配列が異なる。バリアントのヌクレオチド配列の変化は、参照ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変化させても変化させなくてもよい。ヌクレオチドの変化は、後述するように、参照配列によってコードされるポリペプチドにおけるアミノ酸置換、付加、欠失、融合及び切断をもたらし得る。

バリアント及び参照ポリペプチドは、アミノ酸配列が、任意の組み合わせの１つ又は複数の置換、付加、欠失によって異なり得る。一般に、参照ポリペプチドとバリアントの配列は、全体的によく類似し、多くの領域で同一であるように、相違は限られている。置換又は挿入されたアミノ酸残基は、遺伝子コードによってコードされるものであってもなくてもよい。ポリヌクレオチド又はポリペプチドのバリアントは、アレルバリアントなどの天然に存在するものであっても、天然に存在することが知られていないバリアントであってもよい。ポリヌクレオチド及びポリペプチドの天然には存在しないバリアントは、変異誘発技術によって、直接合成によって、及び当業者に知られる他の組換え方法によって作製することができる。

したがって、本明細書に開示される遺伝子／タンパク質のいずれかの「機能的バリアント」は、それぞれの断片が由来する遺伝子又はタンパク質の同じか又はいくらか低い活性を依然として保持する遺伝子／タンパク質の配列バリアントを示すことを意味する。

本発明の範囲内で、野生型核酸／アミノ酸配列に対して、好ましくは少なくとも約２５、５０、１００、２００、５００、１０００又はそれ以上の核酸／アミノ酸の領域にわたって、約６０％を超える核酸／アミノ酸配列同一性、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、好ましくは９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％又はそれ以上の核酸／アミノ酸配列同一性を有する核酸／アミノ酸配列を有する核酸／ポリヌクレオチド及びポリペプチド多型バリアント、アレル、変異体、及び種間相同体もまた、それらの用語に含まれる。

２つ以上の核酸又はアミノ酸配列に関連して、「［所定の］％の配列同一性」という用語は、２つ以上の配列を核酸又はアミノ酸の比較ウィンドウ又は指定された配列にわたって最大一致するように比較及び整列させた場合に、それらが所与の％で共通するヌクレオチド又はアミノ酸残基を有することを意味する（すなわち、配列は、少なくとも９０パーセント（％）の同一性を有する）。核酸配列又はアミノ酸配列の同一性パーセントは、デフォルトパラメーターを用いるＢＬＡＳＴ ２．０配列比較アルゴリズムを使用して、又は手動によるアラインメント及び視覚的検査によって測定することができる（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／を参照されたい）。この定義は、欠失及び／又は付加を有する試験配列の補体及び配列並びに置換を有する補体及び配列にも適用される。同一性パーセント、配列類似性の決定に、またアラインメントに好適なアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴ ２．２．２０＋アルゴリズムであり、これは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５－３３８９（１９９７）に記載されている。ＢＬＡＳＴ ２．２．２０＋は、本発明の核酸及びタンパク質の配列同一性パーセントを決定するために使用される。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウエアは、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して公的に入手可能である。一般的に使用されている配列アラインメントアルゴリズムの例は、
ＣＬＵＳＴＡＬ Ｏｍｅｇａ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｏ／）、
ＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／）、
ＭＡＦＦＴ（ｈｔｔｐ：／／ｍａｆｆｔ．ｃｂｒｃ．ｊｐ／ａｌｉｇｎｍｅｎｔ／ｓｅｒｖｅｒ／）又は
ＭＵＳＣＬＥ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｍｕｓｃｌｅ／）である。

本開示の目的のためには、好ましくは、２つのアミノ酸配列間の配列同一性は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏ／．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３）を用いて決定され、これはＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６－２７７，）、好ましくはバージョン５．０．０以後のＮｅｅｄｌｅプログラム（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ ｎｅｅｄｌｅ／で入手可能）により実行される。用いられるパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップエクステンションペナルティ及びＥＢＬＯＳＵＭ６２（３０ ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識「最長同一性」（－ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）の出力が同一性パーセントとして用いられ、以下のように算出される：（同一の残基×１００）／（アラインメントの長さ－アラインメント内のギャップの総数）。

本開示の目的のためには、好ましくは、２つのヌクレオチド配列間の配列同一性は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０、前掲）を用いて決定され、これはＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６－２７７）、１０好ましくはバージョン５．０．０以後のＮｅｅｄｌｅプログラムにより実行される。用いられるパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップエクステンションペナルティ及びＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識「最長同一性」（－ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）の出力が同一性パーセントとして用いられ、以下のように算出される：（同一のデオキシリボヌクレオチド×１００）／（アラインメントの長さ－アラインメント内のギャップの総数）。

他に規定されない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）は、当業者に、本発明において使用する用語の多くの一般的辞書を提供する。本明細書に記載したものと類似の又は均等な任意の方法及び材料を本発明の実施又は試験において使用できるが、以下で好ましい材料及び方法について記載する。本出願において必要とされるほとんどの命名法及び一般的検査手順は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｖｏｌ．１－３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０１２）；Ｗｉｌｓｏｎ Ｋ．ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ Ｊ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１０），Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；又はＭａｎｉａｔｉｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（２０１２）；又はＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｈｎｓ（２０１０）に見出すことができる。これらの手引書は、以下では、それぞれ対応して「Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．」、「Ｗｉｌｓｏｎ ＆ Ｗａｌｋｅｒ」、「Ｍａｎｉａｔｉｓｅ ｅｔ ａｌ．」、「Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．」と呼ぶ。

特許請求の範囲で使用される「含む」という用語は、その後に列挙される手段に限定されると解釈されるべきではなく、他の要素又は工程を排除しないことに留意されたい。したがって、言及された特徴、整数、工程又は構成要素の存在を特定するものとして解釈されるべきであるが、１つ以上の他の特徴、整数、工程若しくは構成要素、又はそれらの群の存在又は追加を排除するものではない。したがって、「手段Ａ及びＢを含むデバイス」という表現の範囲は、構成要素Ａ及びＢのみからなるデバイスに限定されるべきではない。それは、本発明に関して、デバイスの関連する構成要素がＡ及びＢのみであることを意味する。「～を含む」という用語には、「～からなる」という用語も含まれる。

本明細書を通して「一実施形態」又は「実施形態」への言及は、実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造又は特性が本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体にわたる様々な箇所における「一実施形態では」又は「実施形態では」という語句の出現は、必ずしも全て同じ実施形態を指すわけではなく、しかし同じ実施形態を指す場合もある。さらに、特定の特徴、構造、又は特性は、当業者であれば本開示から明らかなように、１つ又は複数の実施形態において、任意の好適な方法で組み合わせることができる。

本明細書で提供される説明及び図面では、多数の具体的な詳細が記載される。しかし、これらの具体的な詳細がなくとも本発明の実施例を実施し得ることは理解されている。他の例では、この説明の理解を曖昧なものにしないために、よく知られた方法、構造、及び技法は詳細に示されていない。

同様に、本発明の例示的な実施形態の説明では、開示を簡素化し、様々な発明の態様の１つ又は複数の理解を助ける目的で、本発明の様々な特徴が単一の実施形態、図、又はそれらの説明にまとめられることがあることを理解されたい。しかしながら、この開示の方法は、特許請求される発明が各請求項に明示的に列挙されるよりも多くの特徴を必要とするという意図を反映するものとして解釈されるべきではない。むしろ、以下の特許請求の範囲が反映しているように、発明の態様の特徴は、先に開示された単一の実施形態の全ての特徴に満たない。

したがって、詳細な説明に続く特許請求の範囲はこの詳細な説明に明示的に組み込まれ、各請求項はそれ自体が本発明の別個の実施形態である。

［発明の詳細な説明］
本発明は、特異的ＨＭＯを効率的に産生する遺伝子改変細胞、及びＨＭＯを生産する方法における前記遺伝子改変細胞の使用に関する。生産されるＨＭＯは主にＤＦＬであり、ＤＦＬは、生産される全ＨＭＯの５０重量％超、例えば全ＨＭＯの少なくとも７０重量％に相当する量が生産される。生産される他のＨＭＯは主に、３ＦＬ及び２’ＦＬ、並びにそれらの組み合わせから選択される。

［３－フコシルラクトース（３ＦＬ）及び／又は２’－フコシルラクトース（２’ＦＬ）の含量が比較的少ないジフコシルラクトース（ＤＦＬ）を産生することができる遺伝子改変細胞。］
特に、本発明は、オリゴ糖、好ましくは異種オリゴ糖、特にヒト乳オリゴ糖（ＨＭＯ）を合成することを可能にされた遺伝子改変細胞に関する。したがって、本発明の細胞は、例えば、下記に記載するグリコシルトランスフェラーゼ活性を備える１種以上の酵素をコードする遺伝子など、細胞による１種以上のＨＭＯを合成するために必要な、細胞が１種以上のＨＭＯを合成することを可能にする、一連の異種、組換え及び／又は合成を発現するように改変されている。

オリゴ糖を産生する本発明の遺伝子改変細胞は、異種、組換え及び／又は合成核酸配列、好ましくは推定ＭＦＳ（主要促進体スーパーファミリー）輸送体タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むようにさらに改変することができる。

一般に、２’ＦＬの産生には、遺伝子改変細胞が活性α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ酵素を発現することが必要であり、３ＦＬの産生には、遺伝子改変細胞が活性α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ酵素の発現を必要とする。しかしながら、本明細書の実施例からわかるように、活性α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ酵素及び活性α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ酵素の両方を発現する本発明の遺伝子改変細胞によって産生される主要ＨＭＯは、主にＤＦＬである。

実験の項に示されるように、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ、及び場合により主要な促進因子スーパーファミリー（ＭＦＳ）から選択される輸送体タンパク質を発現するＨＭＯ産生組換え細胞の使用は、ＨＭＯの発酵及び精製の両方に関連するＨＭＯ製造プロセスの非常に明確な改善をもたらすことが見出された。本明細書に開示したＨＭＯ生産のための遺伝子改変細胞及び方法はいずれも、生成されるＨＭＯ全体の高い収率、低い副生成物形成又は副生成物対生成物比、発酵あたりの低いバイオマス形成を提供し、発酵ブロスの下流処理中のＨＭＯの簡素化された回収を促進する。

特に、驚くべきことに、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ及びα－１，３－フコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ配列の組み合わせ発現により、３－フコシルラクトース（３ＦＬ）及び／又は２’－フコシルラクトース（２’ＦＬ）の含量が比較的低いジフコシルラクトース（ＤＦＬ）が主に産生されることが、本明細書において示される。特に、ＦｕｔＣ若しくはＷｇｂＬから選択されるα－１，２－フコシルトランスフェラーゼ又はその機能的変異体を、ＦｕｔＡ若しくはＦｕｃＴから選択されるα－１，３－フコシルトランスフェラーゼ又はその機能的変異体と組み合わせることにより、遺伝子改変細胞によって産生される全ＨＭＯの少なくとも５０重量％を構成するＤＦＬが産生される。

発酵条件及び酵素の発現レベルに応じて、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ及びα－１，３－フコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ配列の組み合わせ発現は、２’－フコシルラクトース（２’ＦＬ）の含量が比較的少なく、３－フコシルラクトース（３ＦＬ）は全ＨＭＯの１重量％未満である、ジフコシルラクトース（ＤＦＬ）の産生を主にもたらす。

したがって、本発明の一実施形態では、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ及びα－１，３－フコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ配列の組み合わせ発現は、ＤＦＬ（全ＨＭＯの少なくとも７０重量％）及び２’ＦＬ（全ＨＭＯの３０重量％以下）を産生し、驚くべきことに３ＦＬは実質的に産生しない。

発酵条件及び酵素の発現レベルに応じて、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ及びα－１，３－フコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ配列の組み合わせ発現は、３－フコシルラクトース（３ＦＬ）の含量が比較的少なく、２’－フコシルラクトース（２’ＦＬ）は全ＨＭＯの１重量％未満である、ジフコシルラクトース（ＤＦＬ）の産生を主にもたらす。

したがって、本発明の一実施形態では、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ及びα－１，３－フコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ配列の組み合わせ発現は、ＤＦＬ（全ＨＭＯの少なくとも７０重量％）及び３ＦＬ（全ＨＭＯの３０重量％以下）を産生し、驚くべきことに２’ＦＬは実質的に産生しない。

一実施形態では、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼは、ＦｕｔＣ、又は配列番号３７と少なくとも９０％の同一性、例えば少なくとも９５％の同一性を有する機能的バリアントであり、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼのＦｕｔＡ、又は配列番号３８若しくは配列番号３９と少なくとも９０％の同一性、例えば少なくとも９５％の同一性を有する機能的バリアントと組み合わされる。細胞中のＦｕｔＣ及びＦｕｔＡのフコシルトランスフェアーゼをコードする組換え核酸配列の数が、１：１、例えば１：２、例えば１：３の範囲であると有利である。特に、細胞中の活性フコシルトランスフェラーゼの比率、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ： α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ、例えばＦｕｔＣ：ＦｕｔＡ、又はＦｕｔＣ：ＦｕｃＴ、又はＦｕｔＣ：ｍｏｕｍｏｕの比が、１：１、例えば１：２、例えば１：３、例えば１：４、例えば１：５、例えば２：３、例えば２：５の範囲であると有利である。

加えて、実験の項に記載のように、主要促進体スーパーファミリー（ＭＦＳ）から選択される輸送体タンパク質の発現を含むと、ＤＦＬの選択的産生はさらに増強され、例えば、全ＨＭＯの最大２５重量％、例えば５重量％、１０重量％、１５重量％、２０重量％又は２５重量％増強される。

本発明の態様では、組換え又は異種ＭＦＳ輸送体タンパク質の導入は、ＭＦＳ輸送体タンパク質の存在を除いて同一である細胞（対照細胞／株）と比較して、遺伝子改変細胞により産生されるＤＦＬの量を増加させる。一実施形態では、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ及びα－１，３－フコシルトランスフェラーゼ並びに組換えＭＦＳ輸送体タンパク質を含む遺伝子改変細胞は、ＭＦＳ輸送体タンパク質を含まない同じ遺伝子改変細胞と比較して、少なくとも５％多くＤＦＬを産生する。好ましくは、組換え又は異種ＭＦＳ輸送体タンパク質の導入は、ＭＦＳ輸送体タンパク質を含まない対照細胞と比較して、ＤＦＬ産生を少なくとも８％、１０％、１５％、２０％又は２５％増加させる。

一実施形態では、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ及びα－１，３－フコシルトランスフェラーゼ、並びに主要促進体スーパーファミリー（ＭＦＳ）から選択される輸送体タンパク質をコードするＤＮＡ配列の組み合わせ発現により、ＤＦＬ（全ＨＭＯの少なくとも５５重量％、例えば少なくとも６５重量％）及び２’ＦＬ、３ＦＬ（全ＨＭＯの４５重量％以下）が産生される。

一実施形態では、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ及びα－１，３－フコシルトランスフェラーゼ、並びに主要促進体スーパーファミリー（ＭＦＳ）から選択される輸送体タンパク質をコードするＤＮＡ配列の組み合わせ発現により、ＤＦＬ（全ＨＭＯの少なくとも７０重量％）及び２’ＦＬ、３ＦＬ（全ＨＭＯの３０重量％以下）が産生される。

特に好ましい実施形態では、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ及びα－１，３－フコシルトランスフェラーゼ、並びに主要促進体スーパーファミリー（ＭＦＳ）から選択される輸送体タンパク質をコードするＤＮＡ配列の組み合わせ発現により、ＤＦＬ（全ＨＭＯの少なくとも９０重量％）及び２’ＦＬ、３ＦＬ（全ＨＭＯの１０重量％以下）が産生される。

一態様では、本発明は、１種以上のヒト乳オリゴ糖（ＨＭＯ）を産生することができる遺伝子改変細胞に関し、前記細胞は、
ａ．α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ、及び
ｂ．α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ
をコードする異種、組換え及び／又は合成核酸を含む。
好ましくは、細胞によって産生される主要ＨＭＯはジフコシルラクトース（ＤＦＬ）であり、より好ましくは、産生される全ＨＭＯの５０重量％超、例えば６５重量％超がジフコシルラクトース（ＤＦＬ）である。

「主要ＨＭＯ」という用語は、遺伝子改変細胞によって産生されるＨＭＯの混合物中の最も豊富なＨＭＯとして理解されるべきである。したがって、ＤＦＬに関しては、例えば、２’ＦＬ及び３ＦＬの個々の量よりも多くのＤＦＬが存在することを意味し、例えば、４０％のＤＦＬ及び３０％の２’ＦＬ及び３０％の３ＦＬでは、ＤＦＬが遺伝子改変細胞によって産生される主要ＨＭＯになる。

好ましい態様では、本発明は、１種以上のヒト乳オリゴ糖（ＨＭＯ）を産生することができる遺伝子改変細胞に関し、前記細胞は、
ａ．α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ
ｂ．α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ、及び
ｃ．主要促進体スーパーファミリー（ＭＦＳ）から選択される輸送体タンパク質
をコードする異種、組換え及び／又は合成核酸を含む。
好ましくは、ＭＦＳ輸送体タンパク質を有する遺伝子改変細胞は、ＭＦＳ輸送体タンパク質を含まない遺伝子改変細胞よりもジフコシルラクトース（ＤＦＬ）を少なくとも５重量％多く産生する。

本発明の一態様では、遺伝子改変細胞は、全ＨＭＯの少なくとも４５％、例えば少なくとも５０重量％のＤＦＬ、例えば少なくとも４５～９９％、例えば少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は９９％のＤＦＬを産生する。好ましくは、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は９９％のＤＦＬ。

本発明の一態様では、遺伝子改変細胞は、全ＨＭＯの最大で４５重量％の２’ＦＬ及び／又は３ＦＬ、例えば５～１０％、５～１５％、５～３０％、５～４０％、例えば最大で０．５、１、５、１０、５、２０、２５、３０、３５又は４０％の２’ＦＬ及び／又は３ＦＬを産生する。

本発明の一態様では、遺伝子改変細胞は、全ＨＭＯの最大で５重量％、例えば０～５％、例えば最大で０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５又は５％の２’ＦＬ及び／又は３ＦＬを産生する。

本発明の遺伝子改変細胞は、典型的には、微生物細胞、好ましくは原核細胞である。適した微生物細胞としては、酵母細胞、細菌細胞、古細菌細胞、藻類細胞、及び真菌細胞が挙げられる。

遺伝子組換え微生物細胞は、細菌細胞、好ましくは、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテリコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ビティドバクテリウム属（Ｂｉｔｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スポロイアクトバチルス属（Ｓｐｏｒｏｉａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の菌種、ミクロモモスポラ属（Ｍｉｃｒｏｍｏｍｏｓｐｏｒａ）の菌種ミクロコッカス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種、及びシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）からなる群より選択される細菌細胞であり得る。好適な細菌種は、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・ラテロスポルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・マイコイデス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｙｃｏｉｄｅｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・サークランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）、サイトロバクター・フレウンディイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、クロストリジウム・セルロリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・ユングダリ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ）、クロストリジウム・オートエタノゲナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、エンテロコッカス・ファエシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・サーモフィルス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、エルビニア・ハービコーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）（パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・デルブレッキイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・ジェンセニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｊ ｅｎｓｅｎｉｉ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、パントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａ）、ペクトバクテリウム・カロトヴォルム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ）、プロピオニバクテリウム・フリューデンレイッヒイ（Ｐｒｏｐｒｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）、シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・エルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）及びキサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）である。当業者は、本開示を読めば、さらなる細菌株を認識するであろう。

実験の項において例示するように、現在好ましい遺伝子改変微生物細胞は、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞である。

遺伝子操作細胞は、酵母細胞、好ましくはサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の菌種、特にサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミコプシス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ）の菌種、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）の菌種、特にピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）の菌種、クロベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）の菌種、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の菌種及びシゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の菌種であり得る。

遺伝子操作細胞は、アスパルギルス属（Ａｓｐａｒｇｉｌｌｕｓ）の菌種、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）の菌種又はトリコデルマ属（Ｔｈｒｉｃｏｄｅｒｍａ）の菌種などの糸状菌であってもよく、例示的な種は、Ａ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、Ａ．オリゼー（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、Ｆ．ソラニ（Ｆ．ｓｏｌａｎｉ）、Ｆ．グラミネアラム（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）及びＴ．レーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）である。

遺伝子改変細胞は、内因性又は異種の組換え及び／又は合成配列の制御された過剰発現を可能にする制御配列をさらに含み得る。上で定義したように、本明細書において「核酸発現制御配列」という表現と同義的に使用される「制御配列」という用語は、制御配列に作動可能に連結された核酸配列の転写及び／又は翻訳に影響を及ぼすプロモーター配列、シグナル配列、又は転写因子結合部位のアレイを含む。

核酸配列は、遺伝子の発現を指令するプロモーターである誘導性プロモーターの制御下に置くことができ、この場合、発現レベルは、例えば温度、ｐＨ、嫌気性又は好気性条件、光、転写因子及び化学物質などの環境因子又は発生因子によって変更可能である。このようなプロモーターは、本明細書においては、本発明で使用されるタンパク質の発現のタイミングを制御することを可能にする「誘導性」プロモーターと称される。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び他の細菌宿主細胞については、誘導性プロモーターが当業者に知られている。

本発明において使用される核酸配列は、例えば、宿主微生物細胞に形質転換／トランスフェクト又は他の方法で安定的に導入されるベクターに含まれ得る。

多種多様な発現系を用いて、ポリペプチドを産生することができる。そのようなベクターとしては、なかでも、染色体、エピソーム及びウイルス由来のベクター、例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入エレメント、酵母染色体エレメント、ウイルス由来のベクター、及びそれらの組み合わせに由来するベクター、例えば、プラスミド及びバクテリオファージ遺伝エレメント、例えばコスミド及びファージミドに由来するベクターなどが挙げられる。発現系コンストラクトは、発現を調節し発現を生じさせる制御領域を含み得る。一般に、ポリヌクレオチドを維持、増殖又は発現し、宿主中でポリペプチドを合成するのに適した任意の系又はベクターを、この点での発現のために使用することができる。適切なＤＮＡ配列は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａ／．（前掲）に記載されているものなど、様々なよく知られた日常的な技術のいずれかによって、発現系に挿入することができる。

この技術分野は、選択された宿主生物の形質転換に使用するための遺伝物質の単離、合成、精製及び増幅のための「組換えＤＮＡ」方法論に関する特許及び文献刊行物が豊富にある。したがって、選択された外因性（すなわち、外来又は「異種」）ＤＮＡ配列を含む「ハイブリッド」ウイルス又は環状プラスミドＤＮＡを用いて宿主生物を形質転換することは、一般常識である。当該技術分野で知られている手順は、最初に、環状のウイルス又はプラスミドＤＮＡを酵素により切断して直鎖状ＤＮＡ鎖を形成することにより形質転換ベクターを生成することを含む。所望のタンパク質産物をコードする配列を通常含む選択された外来ＤＮＡ鎖を、同じ／類似の酵素を使用して直鎖状に調製する。直鎖状のウイルス又はプラスミドＤＮＡを、修復プロセスを行うことができるライゲーション酵素の存在下で外来ＤＮＡと共にインキュベートし、ウイルス又は環状ＤＮＡプラスミドの中に「スプライシングされた」選択された外因性ＤＮＡセグメントを含む「ハイブリッド」ベクターを形成する。

［α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ］
本発明の遺伝子改変細胞は、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ及びα－１，３－フコシルトランスフェラーゼの発現を可能にする異種、組換え及び／又は合成核酸を含む。

一般に、及び本開示全体を通して、「グリコシルトランスフェラーゼ活性」又は「グリコシルトランスフェラーゼ」という用語は、二糖、オリゴ糖及び多糖の生合成に関与する酵素の活性を指し、包含する。これらの酵素は、活性化ヌクレオチド単糖／糖（「グリコシルドナー」）からグリコシルアクセプター分子への単糖部分の転移を触媒する。

用語「アルファ－１，２－フコシルトランスフェラーゼ」若しくは「フコシルトランスフェラーゼ」、又は「アルファ－１，２－フコシルトランスフェラーゼ」若しくは「フコシルトランスフェラーゼ」をコードする核酸／ポリヌクレオチドは、ドナー基質、例えば、ＧＤＰ－フコースからアクセプター分子へのフコースのアルファ－１，２－結合での転移を触媒するグリコシルトランスフェラーゼを指す。

用語「アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ」若しくは「フコシルトランスフェラーゼ」、又は「アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ」若しくは「フコシルトランスフェラーゼ」をコードする核酸／ポリヌクレオチドは、ドナー基質、例えば、ＧＤＰ－フコースからアクセプター分子へのフコースのアルファ－１，３－結合での転移を触媒するグリコシルトランスフェラーゼを指す。アクセプター分子は例えば、ラクトース、２’－フコシルラクトース、３－フコシルラクトース、又はより複合化したＨＭＯ構造であり得る。

α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ及びα－１，３－フコシルトランスフェラーゼは、当該技術分野においてよく知られている。表１に、核酸によってコードされ得るα－１，２－フコシルトランスフェラーゼ及びα－１，３－フコシルトランスフェラーゼの非限定的な選択を列挙する。本発明にはまた、表１に列挙されるα－１，２－フコシルトランスフェラーゼ及び／又はα－１，３－フコシルトランスフェラーゼの機能的相同体も含まれ、そのアミノ酸配列は、それぞれのタンパク質配列ＩＤ（ＧｅｎＢａｎｋ）に示される配列と少なくとも８０％同一、好ましくは少なくとも８５％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一、例えば９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である。

本発明による遺伝子改変細胞の現在好ましい実施形態では、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼをコードする異種核酸は、ｆｕｔＣ遺伝子又は上で定義されたその機能的相同体、例えば、配列番号３７のアミノ酸配列、又は配列番号３７と少なくとも９０％の同一性、例えば少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。通常、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を発現する遺伝子改変細胞は、主に２’ＦＬを産生すると予想される。

本発明による遺伝子改変細胞の現在好ましい実施形態では、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼをコードする異種核酸は、ｆｕｔＡ遺伝子、ｆｕｃＴ遺伝子又はｍｏｕｍｏｕ遺伝子、及び上で定義されたその機能的相同体からなる群から選択される。

一実施形態では、発現される異種α１，３－フコシルトランスフェラーゼは、配列番号３８と同一のポリペプチドを含む、又は好ましくはそれからなる。配列番号３８によるタンパク質は、１２８位のＡｌａ（Ａ）がＡｓｎ（Ｎ）によって置換され、１２９位のＨｉｓ（Ｈ）がＧｌｕ（Ｅ）によって置換されているＦｕｔＡの機能的バリアントである（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇｉｎ． １１３，１６６６（２０１６））。ＦｕｔＡのさらなる機能的バリアントは、国際公開第２０２０／１１５６７１号パンフレットに記載されており、１２８位のＡｌａ（Ａ）がＡｓｎ（Ｎ）によって置換され、１２９位のＨｉｓ（Ｈ）がＧｌｕ（Ｅ）によって置換され、１４８位のＡｓｐ（Ｄ）がＧｌｙ（Ｇ）によって置換され、２２１位のＴｙｒ（Ｙ）がＣｙｓ（Ｃ）によって置換されている。国際公開第２０２０／１１５６７１号パンフレットの配列番号７によるタンパク質は、ＦｕｔＡ＿ｍｕｔ２と称される。本発明においては、ＦｕｔＡのさらなる機能的バリアントが同定されており、そのバリアントでは、４６位のＳｅｒ（Ｓ）がＰｈｅ（Ｆ）で置換され、１２８位のＡｌａ（Ａ）がＡｓｎ（Ｎ）で置換され、１２９位のＨｉｓ（Ｈ）がＧｌｕ（Ｅ）で置換され、１３２位のＴｙｒ（Ｙ）がＩｌｅ（Ｉ）で置換され、１４８位のＡｓｐ（Ｄ）がＧｌｙ（Ｇ）で置換され、２２１位のＴｙｒ（Ｙ）がＣｙｓ（Ｃ）で置換されている。

本発明の一実施形態は、配列番号３８と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％同一であり、以下の置換、Ｓ４６Ｆ、Ａ１２８Ｎ、Ｈ１２９Ｅ、Ｙ１３２Ｉ、Ｄ１４８Ｇ及びＹ２２１Ｃを含むか又はそれらからなるアミノ酸配列を有する１，３－フスコシルトランスフェラーゼに関する。特に、ＦｕｔＡ＿ｍｕｔ４と称され、配列番号３２のヌクレオチド配列によってコードされる、配列番号３９を含むか又はそれからなるタンパク質に関する。本発明はさらに、ＤＦＬ又は３ＦＬを生成するためのＦｕｔＡ＿ｍｕｔ４の使用に関する。

一実施形態では、１，３－フスコシルトランスフェラーゼｆｕｔＡ遺伝子は、配列番号３８若しくは配列番号３９のアミノ酸配列、又は配列番号３８若しくは配列番号３９と少なくとも９０％の同一性、例えば少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列、例えば国際公開第２０２０／１１５６７１号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）の配列番号７のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるアミノ酸配列をコードする。

別の実施形態では、１，３－フスコシルトランスフェラーゼｆｕｃＴ遺伝子は、配列番号４０のアミノ酸配列、又は配列番号４０と少なくとも９０％の同一性、例えば少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるアミノ酸配列をコードする。

別の実施形態では、１，３－フスコシルトランスフェラーゼｍｏｕｍｏｕ遺伝子は、配列番号５４のアミノ酸配列、又は配列番号５４と少なくとも９０％の同一性、例えば少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるアミノ酸配列をコードする。

通常、α－１，３フコシルトランスフェラーゼをコードする異種、組換え及び／又は合成を含む遺伝子改変細胞は、主に３ＦＬを産生すると予想される。

したがって、本発明の遺伝子改変細胞によって最も多く産生されるＨＭＯがＤＦＬであることは驚くべきことである。単一のＨＭＯの大部分がＤＦＬ成分であることが理解される。

［輸送体タンパク質］
本発明は、ヒト乳オリゴ糖（ＨＭＯ）を産生することができる組換え細胞であって、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ、及び推定ＭＦＳ（主要促進体スーパーファミリー）輸送体タンパク質をコードする異種遺伝子を発現する細胞を提供する。前記輸送体遺伝子は、典型的には、細菌セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、細菌ローゼンベルギエラ・ネクタレア（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｉｅｌｌａ ｎｅｃｔａｒｅａ）、又は細菌パントエア・バガンス（Ｐａｎｔｏｅａ ｖａｇａｎｓ）、又は細菌エルシニア・フレデリクセニ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｅｎｉｉ）、又は細菌ロウシエラ・バデンシス（Ｒｏｕｘｉｅｌｌａ ｂａｄｅｎｓｉｓ）に由来する。

主要促進体スーパーファミリー（ＭＦＳ）輸送体タンパク質は、ｍａｒｃ、ｎｅｃ、ｖａｇ、ｆｒｅｄ又はｂａｄから選択され得るが、これらに限定されない。特定の実施形態では、ＭＦＳ輸送体は、ｓｅｔＡでもＹｂｅｒＣでもない。

より具体的には、本発明は、オリゴ糖、特にＨＭＯの産生のために最適化された遺伝子改変細胞であって、異種、組換え及び／又は合成核酸は、配列番号１（ＭＡＲＣ）、又は配列番号２（ＮＥＣ）又は配列番号３（ＶＡＧ）、又は配列番号４２（ＦＲＥＤ）又は配列番号４３（ＢＡＤ）のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも９０％、例えば９５％の配列同一性を有する輸送体タンパク質をコードする細胞に関する。

本明細書において配列番号１として特定されたアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＩＤ ＷＰ＿０６０４４８１６９．１を有するアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列である。配列番号１のアミノ酸配列を有するＭＦＳ輸送体タンパク質は、本明細書では、「Ｍａｒｃタンパク質」、又は「Ｍａｒｃ輸送体」、又は「ｍａｒｃ」と互換的に特定され、ｍａｒｃタンパク質をコードする核酸配列は、本明細書では、「Ｍａｒｃコーディング核酸／ＤＮＡ」、又は「ｍａｒｃ遺伝子」、又は「ｍａｒｃ」と特定される。

本明細書で配列番号２と特定されたアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＩＤ ＷＰ＿０９２６７２０８１．１（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／ＷＰ＿０９２６７２０８１．１）を有するアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列である。配列番号２のアミノ酸配列を有するＭＦＳ輸送体タンパク質は、本明細書では、「Ｎｅｃタンパク質」、又は「Ｎｅｃ輸送体」、又は「Ｎｅｃ」と互換的に特定され、Ｎｅｃタンパク質をコードする核酸配列は、本明細書では、「ｎｅｃコーディング核酸／ＤＮＡ」、又は「ｎｅｃ遺伝子」、又は「ｎｅｃ」と特定される。

本明細書で配列番号３と特定されたアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＩＤ ＷＰ＿０４８７８５１３９．１（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／ＷＰ＿０４８７８５１３９．１）を有するアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列である。配列番号３のアミノ酸配列を有するＭＦＳ輸送体タンパク質は、本明細書では、「Ｖａｇタンパク質」、又は「Ｖａｇ輸送体」、又は「Ｖａｇ」と互換的に特定され、Ｖａｇタンパク質をコードする核酸配列は、本明細書では、「ｖａｇコーディング核酸／ＤＮＡ」、又は「ｖａｇ遺伝子」、又は「ｖａｇ」と特定される。

本明細書で配列番号４２と特定されたアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＩＤ ＷＰ＿０８７８１７５５６．１（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／ＷＰ＿０８７８１７５５６．１）を有するアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列である。配列番号４２のアミノ酸配列を有するＭＦＳ輸送体タンパク質は、本明細書では、「Ｆｒｅｄタンパク質」、又は「Ｆｒｅｄ輸送体」、又は「Ｆｒｅｄ」と互換的に特定され、Ｆｒｅｄタンパク質をコードする核酸配列は、本明細書では、「ｆｒｅｄコーディング核酸／ＤＮＡ」、又は「ｆｒｅｄ遺伝子」、又は「ｆｒｅｄ」と特定される。

本明細書で配列番号４３と特定されたアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＩＤ ＷＰ＿０１７４８９９１４．１（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／ＷＰ＿０１７４８９９１４．１）を有するアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列である。配列番号４３のアミノ酸配列を有するＭＦＳ輸送体タンパク質は、本明細書では、「Ｂａｄタンパク質」、又は「Ｂａｄ輸送体」、又は「Ｂａｄ」と互換的に特定され、Ｂａｄタンパク質をコードする核酸配列は、本明細書では、「ｂａｄコーディング核酸／ＤＮＡ」、又は「ｂａｄ遺伝子」、又は「ｂａｄ」と特定される。

本発明は、１種以上の特定のオリゴ糖、特に１種以上の特定のＨＭＯ、例えばフコシル化ＨＭＯ、例えば２’ＦＬ、３ＦＬ、ＤＦＬ又はこれらの混合物を生産するために最適化された遺伝子改変細胞であって、配列番号１（ＭＡＲＣ）又は配列番号２（ＮＥＣ）又は配列番号３（ＶＡＧ）又は配列番号４２（ＦＲＥＤ）又は配列番号４３（ＢＡＤ）のアミノ酸配列と、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、又は１００％の配列同一性を有するタンパク質をコードする、異種、組換え及び／又は合成核酸を含む細胞に関する。

本発明の遺伝子改変細胞において発現される推定ＭＦＳ（主要促進体スーパーファミリー）輸送体タンパク質は、好ましくは、トリ－ＨＭＯ及びテトラ－ＨＭＯ、例えば、２’ＦＬ、３ＦＬなどの三糖類及びＤＦＬなどの四糖類を輸送する。

本明細書に記載のＨＭＯ産生細胞におけるＭａｒｃ、Ｎｅｃ、Ｖａｇ、Ｆｒｅｄ又はＢａｄタンパク質などの推定ＭＦＳ（主要促進体スーパーファミリー）輸送体タンパク質をコードするＤＮＡ配列の発現は、ＨＭＯの総産生量の増加に関連することがわかり、細胞によって産生されるそのうちの５０重量％以上、例えば６５重量％以上はジフコシルラクトース（ＤＦＬ）である。

さらに、非常に意外であったことに、本明細書に記載のＨＭＯ産生細胞におけるＭａｒｃタンパク質、Ｎｅｃ又はＶａｇ又はＦｒｅｄ又はＢａｄタンパク質などの推定ＭＦＳ（主要促進体スーパーファミリー）輸送体タンパク質の発現は、発酵中のバイオマスの形成の減少をもたらし、発酵の終わりにおける死細胞の数の減少によって反映される健康な細胞培養をもたらし、これにより、産生するバイオマス単位あたりの産物の量が増すため、製造プロセスはより効率的なものになる。

用語「主要促進体スーパーファミリー（ＭＦＳ）」は、糖、薬物、疎水性分子、ペプチド、有機イオンなどの広範囲の様々な物質を輸送することを担っている第２の活性輸送体クラスの大きく且つ並外れて広汎なファミリーを意味する。糖輸送体タンパク質の特異性は、全く予測不能であり、例えばオリゴ糖に対する特異性を備える新規な輸送体タンパク質の同定には、極めて負担の大きい研究室での実験を必要とする（詳細については、Ｒｅｄｄｙ Ｖ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，（２０１２），ＦＥＢＳ Ｊ．２７９（１１）：２０２２－２０３５によるレビューを参照されたい）。

用語「ＭＦＳ輸送体」は、本文脈においては、オリゴ糖、好ましくはＨＭＯの、細胞膜を通した輸送、好ましくは宿主細胞により合成されたＨＭＯ／オリゴ糖、好ましくは３又は４糖単位を含むＨＭＯ／オリゴ糖、特に２’ＦＬ及び／又は３ＦＬ及び／又はＤＦＬの細胞サイトゾルから細胞培地への輸送を意味する。さらに又は代わりに、ＭＦＳ輸送体は、ラクトース、グルコース、細胞代謝産物又は毒素など、本発明によるＨＭＯ又はオリゴ糖と見なされない分子の排出も促進し得る。

［宿主細胞の遺伝子改変］
１種以上のＨＭＯを合成することができるように、本発明の遺伝子改変宿主細胞は、表１に示すリストから選択され得るα－１，２－フコシルトランスフェラーゼ及びα－１，３－フコシルトランスフェラーゼを含む、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有する機能的酵素をコードする少なくとも１つの異種、組換え及び／又は合成核酸を含む。好ましくは、グリコシルトランスフェラーゼは、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ及びα－１，３－フコシルトランスフェラーゼをコードする少なくとも２つの異種、組換え及び／又は合成核酸が改変宿主細胞中に存在するように、個別の異種、組換え及び／又は合成核酸によってコードされる。

グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、宿主細胞のゲノム内に（染色体への組み込みによって）統合されるか、又はプラスミドＤＮＡ内に含まれ、プラスミド性として発現され得る。グリコシルトランスフェラーゼ活性を有する異なる酵素をコードする２つ以上の異種、組換え及び／又は合成核酸は、ゲノムに組み込まれても、且つ／又はプラスミドから発現されてもよく、例えばα－１，２－フコシルトランスフェラーゼ（第１のグリコシルトランスフェラーゼをコードする第１の異種、組換え及び／又は合成核酸）をα－１，３－フコシルトランスフェラーゼ（第２のグリコシルトランスフェラーゼをコードする第２の異種、組換え及び／又は合成核酸）と組み合わせて発現されてもよく、ここで、第１及び第２の異種、組換え及び／又は合成核酸は互いに独立して染色体に組み込まれてもプラスミドに組み込まれてもよい。好ましい一実施形態では、第１及び第２の異種、組換え及び／又は合成核酸はいずれも、産生細胞の染色体に安定に組み込まれ、別の実施形態では、第１及び第２のグリコシルトランスフェラーゼの少なくとも一方は、プラスミド媒介性である。

さらに、推定ＭＦＳ（主要促進体スーパーファミリー）輸送体タンパク質遺伝子は宿主細胞の（染色体組み込みによる）ゲノムに組み込まれてもよく、或いはプラスミドＤＮＡに含まれ、プラスミド媒介性として発現されてもよい。第１及び第２及びさらなる異種、組換え及び／又は合成核酸は、互いに独立して、染色体又はプラスミドに組み込まれ得る。好ましい一実施形態では、第１、第２及びさらなる異種、組換え及び／又は合成核酸は、産生細胞の染色体に安定に組み込まれ、別の実施形態では、第１、第２及びさらなる異種、組換え及び／又は合成核酸の少なくとも１つは、プラスミド媒介性である。

本発明の異種、組換え及び／又は合成核酸配列は、コーディングＤＮＡ配列、例えば遺伝子、又は非コーディングＤＮＡ配列、例えばプロモーター配列等の調節ＤＮＡであり得る。本発明の一態様は、組換え細胞であって、１種以上のＨＭＯの産生のために必要な酵素をコードする組換えＤＮＡ配列及び糖輸送体タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む組換え細胞を提供することに関する。したがって、一実施形態では、本発明は、核酸コンストラクトであって、コーディング核酸配列、すなわち目的の遺伝子の異種、組換え及び／又は合成ＤＮＡ配列、例えばグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子又はＭＦＳ遺伝子、並びに非コーディングＤＮＡ配列、例えばプロモーターＤＮＡ配列、例えばｌａｃオペロン、ｍｇｌＢオペロン若しくはｇｌｐオペロンのプロモーターに由来する組換えプロモーター配列、又は別のゲノムプロモーターＤＮＡ配列に由来するプロモーター配列、又は合成プロモーター配列を含む核酸コンストラクト（ここで、コーディング配列とプロモーター配列は作動可能に連結している）に関する。

一実施形態では、本発明の核酸コンストラクトは、ベクターＤＮＡの一部であり得、別の実施形態では、コンストラクトは、宿主細胞のゲノムに組み込まれた発現カセット／カートリッジである。したがって、用語「核酸コンストラクト」は、ゲノムの遺伝子の発現を改変するか、又はコンストラクト中に含まれ得る遺伝子／コーディングＤＮＡ配列を発現させるために標的細胞、例えば細菌細胞中に「移植」することが意図される、核酸の人工的に構築された断片、特にＤＮＡ断片を意味する。本発明に関連して、核酸コンストラクトは、２つ以上の組換えＤＮＡ配列、すなわち本質的に、プロモーターＤＮＡ配列を含む非コーディングＤＮＡ配列、並びに目的の遺伝子、例えば糖輸送体タンパク質、グリコシルトランスフェラーゼ及び／又は宿主細胞におけるＨＭＯ産生に有用な別の遺伝子をコードするコーディングＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ配列を含有する。

好ましくは、コンストラクトは、コンストラクトのコーディングＤＮＡの転写又は翻訳を調節する非コーディングＤＮＡ配列、例えば転写産物へのリボソーム結合を促進するＤＮＡ配列、転写産物を安定化するリーディングＤＮＡ配列をさらに含む。

コンストラクト（発現カセット）内に含まれる目的の組換え遺伝子の細菌ゲノム内への組み込みは、従来方法により、例えばａｔｔＴｎ７部位について記載されているように、染色体上の特異的部位に相同なフランキング配列を含有する直鎖状カートリッジを用いることにより（Ｗａｄｄｅｌｌ Ｃ．Ｓ． ａｎｄ Ｃｒａｉｇ Ｎ．Ｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．（１９８８）Ｆｅｂ；２（２）：１３７－４９．）；組換えがファージλのＲｅｄリコンビナーゼ機能又はＲａｃプロファージのＲｅｃＥ／ＲｅｃＴリコンビナーゼ機能によって媒介される核酸配列のゲノム組み込み方法により（Ｍｕｒｐｈｙ，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９８）；１８０（８）：２０６３－７；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９８）２０：１２３－１２８Ｍｕｙｒｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｒｅｐ．（２０００）１（３）：２３９－２４３）；Ｒｅｄ／ＥＴ組換えに基づく方法により（Ｗｅｎｚｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．（２００５），１２（３）：３４９－５６．；Ｖｅｔｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００５）；７１（４）：１８２９－３５）；又は陽性クローン、すなわち例えばマーカー遺伝子又は遺伝子機能の損失若しくは獲得によって選択され得る発現カセットを運ぶクローンにより達成され得る。

目的遺伝子を含む発現カセットの単一コピーは、本発明による所望のＨＭＯの確実な産生及び所望の作用を達成するために十分であり得る。したがって、いくつかの好ましい実施形態では、本発明は、細胞のゲノムＤＮＡ組み込まれた目的遺伝子の１つ、２つ又は３つのコピーを含む組換えＨＭＯ産生細胞に関する。いくつかの実施形態では、遺伝子の単一コピーが好ましい。

好ましい一実施形態では、本発明の核酸コンストラクトの組換えコーディング核酸配列は、プロモーターに関して異種であり、これは、起源の種のゲノム内の同等の天然コーディング配列が別のプロモーター配列（すなわち、コンストラクトのプロモーター配列ではない）の制御下で転写されることを意味する。さらに、宿主細胞に関して、コーディングＤＮＡは、例えば、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）宿主細胞内で発現した糖輸送体タンパク質をコードするＤＮＡ配列などの異種（すなわち、別の生物学的種若しくは属に由来する）、又は、例えば、本明細書において配列番号３０としても開示されているコロン酸オペロンの遺伝子、例えばｇｍｄ、ｗｃａＧ、ｍａｎＣ、ｍａｎＢ遺伝子などの相同（すなわち、宿主細胞に由来する）であり得る。

「調節エレメント」又は「プロモーター」又は「プロモーター領域」又は「プロモーターエレメント」という用語は、転写の開始中にＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって認識、結合され、ｍＲＮＡへの転写の開始部位を提供する核酸配列である。プロモーターは他の転写及び翻訳調節核酸配列（「制御配列」とも呼ばれる）と共に、転写阻害を含む転写開始の頻度（又は速度）を決定するタンパク質を結合することによって、所与の遺伝子又は遺伝子群（オペロン）を発現させるために必要である。プロモーターエレメント及びほとんどの調節エレメントは通常、転写される遺伝子の「上流」（すなわち、その前）にある。コード遺伝子の下流にあるＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡへの転写の終結のためのシグナルを提供することができ、転写「ターミネーター」配列と呼ばれる。一般に、転写及び翻訳調節配列としては、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始及び終止配列、翻訳開始及び終止配列、並びにエンハンサー又はアクチベーター配列が挙げられるが、これらに限定されない。「転写開始部位」は、転写される第１ヌクレオチドを意味し、＋１と指定される。開始部位の下流のヌクレオチドは、＋２、＋３、＋４などとナンバリングされ、５’逆（上流）方向にあるヌクレオチドは、－１、－２、－３などとナンバリングされる。コンストラクトのプロモーターＤＮＡ配列は、選択された種のゲノムの任意の遺伝子のプロモーター領域、好ましくはＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ．）のゲノムＤＮＡのプロモーター領域に由来し得る。したがって、ＲＮＡポリメラーゼに結合して転写を開始することができる任意のプロモーター領域ＤＮＡ配列は、本発明の実施に好適である。原則として、コンストラクトの目的の異種、組換え及び／又は合成遺伝子の転写を制御するために、任意のプロモーターＤＮＡ配列を使用することができ、宿主細胞のゲノム内又は発現ベクターＤＮＡに組み込まれた目的の異なる遺伝子の転写を駆動するために、異なる又は同一のプロモーター配列を使用することができる。コンストラクト中に含まれる異種、組換え及び／又は合成遺伝子を最適に発現させるために、コンストラクトは、さらなる調節配列、例えばリボソーム結合のための配列であるＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｇｌｐ遺伝子の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）に由来するＤＮＡ配列などの、例えばリーディングＤＮＡ配列を含み得る。後者の配列の例は、国際公開第２０１９／１２３３２４号パンフレット及び国際公開第２０２０／２５５０５４号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。

いくつかの好ましい実施形態では、本発明のコンストラクト中に含まれる組換え遺伝子の発現を調節するための調節エレメントは、ｇｌｐＦＫＸオペロンプロモーター、ＰｇｌｐＦであり、他の好ましい実施形態では、プロモーターは、ｌａｃオペロンプロモーター、Ｐｌａｃである。しかしながら、宿主細胞内の１種以上のＨＭＯの最適レベルの生合成産生を達成するために必要又は有益である１種以上のタンパク質、例えば、ＨＭＯ若しくはＨＭＯ前駆体の膜貫通輸送、ＨＭＯ産生の副産物の分解に関与するタンパク質、遺伝子発現調節タンパク質などをコードする１種以上の異種、組換え及び／又は合成核酸（又は１種以上の調節核酸）の転写及び／又は転写レベルの調節を可能にし、且つ本発明による所望の作用を達成することを可能にするプロモーターは、本発明の実施に好適である。

本発明によるフコシルトランスフェラーゼ遺伝子及び／又は糖輸送体遺伝子はまた、ＰｇｌｐＦプロモーターエレメントに作動可能に連結され、対応するゲノムに組み込まれたカセットから発現され得、それは、ｇｌｐプロモーター、ｍｇｌＢプロモーターの制御下で、又は発現系に適した任意の他のプロモーター、例えばＰｌａｃの制御下で発現され得る。

現在好ましい態様では、本発明によるフコシルトランスフェラーゼ遺伝子及び／又はＭＦＳ輸送体遺伝子は、ＰｍｇｌＢプロモーターに作動可能に連結され、対応するゲノムに組み込まれたカセットから発現される。特に、前記プロモーターは、配列番号４に示されるＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ４であり得る。

好ましくは、宿主細胞中で発現する、ＨＭＯの生合成産生に関連する遺伝子、プロモーターＤＮＡ配列、及びリボソーム結合部位配列（例えば、シャイン・ダルガノ配列）などの他の調節配列を含む本発明のコンストラクトは、宿主細胞の懸濁液を含む１リットルの発酵培地の少なくとも０，０３ｇ／ＯＤ（光学密度）のレベル、例えばおよそ０．０５ｇ／ｌ／ＯＤ～０，１ｇ／ｌ／ＯＤのレベルでのＨＭＯの産生を可能にする。本発明の目的のために、ＨＭＯ産生の後者のレベルは、「十分である」と見なされ、このレベルの所望のＨＭＯを産生することができる宿主細胞は、「好適な宿主細胞」と見なされる。すなわち、細胞は、ＨＭＯ産生のために有利である本明細書に記載した少なくとも１つの作用を達成するために、ＭＦＳ輸送体タンパク質、例えばＭａｒｃ又はＮｅｃ又はＶａｇ又はＦｒｅｄ又はＢａｄを発現するようにさらに改変することができる。

本発明の遺伝子改変細胞は、当該技術分野における標準的な方法、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｗｉｌｓｏｎ ＆ Ｗａｌｋｅｒ，“Ｍａｎｉａｔｉｓｅ ｅｔ ａｌ．，ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．によるマニュアルに記載された方法によって提供され得る。

ＨＭＯの産生に好適な宿主細胞、例えばＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、内因性β－ガラクトシダーゼ遺伝子又は外因性β－ガラクトシダーゼ遺伝子を含み得、例えば、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、内因性ｌａｃＺ遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｖ００２９６（ＧＩ：４１９０１））を含む。本発明の目的のために、ＨＭＯ産生細胞は、不活性化される遺伝子を含むように遺伝子操作される。ｌａｃＺ遺伝子は細菌ゲノム由来の対応する核酸配列の完全若しくは部分欠失によって不活性化され得るか、又は遺伝子配列はそれが転写される方法で変異されるか、又は転写されると、転写産物は翻訳されないか、又はタンパク質（すなわち、β－ガラクトシダーゼ）に翻訳されると、そのタンパク質は対応する酵素活性を有していない。このように、ＨＭＯ産生細菌は、ＨＭＯの産生に有益な細胞内ラクトースプールの蓄積を増加させる。

［１種以上のＨＭＯの生産方法］
本発明のさらなる態様は、細胞において産生されるＨＭＯの４５％、例えば５０重量％、例えば６５重量％、又はそれ以上がジフコシルラクトース（ＤＦＬ）である、１種以上のオリゴ糖を生産する方法であって、
（ｉ）ＨＭＯを産生することができる遺伝子改変細胞を提供する工程であって、前記細胞は、
ａ．α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ、及び
ｂ．α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ
をコードする異種、組換え及び／又は合成核酸を含む遺伝子改変細胞を含む工程；
（ｉｉ）（ｉ）による細胞を好適な細胞培養培地で培養して、前記ＨＭＯを生成する工程；並びに
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において生成された１種以上のＨＭＯを回収する工程
を含む方法に関する。

現在好ましい実施形態では、前記遺伝子改変細胞は、主要促進体スーパーファミリー（ＭＦＳ）から選択される輸送体タンパク質をさらにコードする異種、組換え及び／又は合成核酸をさらに含む。

好ましくは、組換えＭＦＳ輸送体タンパク質を含む遺伝子改変細胞を用いる方法は、遺伝子改変細胞が組換えＭＦＳ輸送体タンパク質を発現していない同じ方法と比較して、少なくとも５重量％多くＤＦＬを生産する。

特に、本発明による方法は、３－フコシルラクトース（３ＦＬ）、２’－フコシルラクトース（２’ＦＬ）及び／又はラクトースが細胞で産生されるＨＭＯの総量の多くとも４５重量％まで、例えば細胞で産生されるＨＭＯの総量の多くとも３０重量％までとするのを容易にする。

本発明の方法により、３－フコシルラクトース（３ＦＬ）及び／又は２’－フコシルラクトース（２’ＦＬ）の含量が比較的低いジフコシルラクトース（ＤＦＬ）が主に生成されることが本明細書において示される。

本発明の方法は、発酵条件及び酵素の発現レベルに応じて、２’－フコシルラクトース（２’ＦＬ）の含量が比較的少なく、３－フコシルラクトース（３ＦＬ）は全ＨＭＯの１重量％未満である、ジフコシルラクトース（ＤＦＬ）の生成を主にもたらす。

したがって、本発明の一態様では、本発明の方法は、ＤＦＬ（全ＨＭＯの少なくとも６０重量％、例えば少なくとも６５重量％、例えば少なくとも７０重量％）、及び２’ＦＬ（全ＨＭＯの３５重量％以下、例えば３０重量％未満）を生成し、驚くべきことに３ＦＬは実質的に生成しない。

本発明の方法は、発酵条件及び酵素の発現レベルに応じて、３－フコシルラクトース（３ＦＬ）の含量が比較的少なく、２’－フコシルラクトース（２’ＦＬ）は全ＨＭＯの１重量％未満である、ジフコシルラクトース（ＤＦＬ）の生成を主にもたらす。

したがって、本発明の一態様では、本発明の方法は、ＤＦＬ（全ＨＭＯの少なくとも６０重量％、例えば少なくとも６５重量％、例えば少なくとも７０重量％）、及び３ＦＬ（全ＨＭＯの３５重量％以下、例えば３０重量％未満）を生成し、驚くべきことに２’ＦＬは実質的に生成しない。

加えて、実験の項に記載のように、主要促進体スーパーファミリー（ＭＦＳ）から選択される輸送体タンパク質の発現を含む本発明の方法は、ＤＦＬの選択的生成をさらに増強し、例えば、全ＨＭＯの最大２５重量％、例えば５重量％、１０重量％、１５重量％、２０重量％又は２５重量％増強する。

したがって、一態様では、本発明の方法は、ＤＦＬ（全ＨＭＯの少なくとも５５重量％、例えば少なくとも６０重量％、例えば少なくとも６５重量％）、及び２’ＦＬ、３ＦＬ（全ＨＭＯの４５重量％以下、例えば３５重量％以下）を生成する。

したがって、一態様では、本発明の方法は、ＤＦＬ（全ＨＭＯの少なくとも６５重量％）、及び２’ＦＬ、３ＦＬ（全ＨＭＯの３５重量％以下）を生成する。

したがって、一態様では、本発明の方法は、ＤＦＬ（全ＨＭＯの少なくとも７０重量％）、及び２’ＦＬ、３ＦＬ（全ＨＭＯの３０重量％以下）を生成する。

特に好ましい態様においては、一態様において、本発明の方法は、ＤＦＬ（全ＨＭＯの少なくとも９０重量％）、及び２’ＦＬ、３ＦＬ（全ＨＭＯの１０重量％以下）を生成する。

したがって、本発明は、細胞によって産生されるＨＭＯの５０重量％、例えば６５重量％以上がジフコシルラクトース（ＤＦＬ）である、１種以上のヒト乳オリゴ糖（ＨＭＯ）を生産する方法に関する。

現在好ましい態様では、本発明は、細胞によって産生されるＨＭＯの５５重量％以上がジフコシルラクトース（ＤＦＬ）である方法に関する。

本発明の一態様では、本発明の方法は、全ＨＭＯの少なくとも５０重量％、例えば５０～９９％、例えば少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は９９％のＤＦＬを生産する。好ましくは、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は９９％のＤＦＬ。

本発明の一態様では、本発明の方法は、全ＨＭＯの最大で４５重量％、例えば、５～１０、５～１５、５～３０、１０～３０％、例えば最大で０．５、１、５、１０、５、２０、２５、３０、３５％の２’ＦＬ及び／又は３ＦＬを生産する。

本発明の一態様では、本発明の方法は、全ＨＭＯの最大で５重量％、例えば０～５％、例えば最大で０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５又は５％の２’ＦＬ及び／又は３ＦＬを産生する。

本発明による方法は、ラクトースを含む。発酵におけるラクトースの量は、発酵条件及び発現レベル、並びに酵素及び発現される任意選択の糖輸送体タンパク質の選択に依存する。生成される２’ＦＬ、３ＦＬとラクトースの合計量は、本明細書に記載の細胞及び／又は方法によって生成される全オリゴ糖の４９重量％以下、例えば４５重量％、例えば３５重量％未満である。

現在開示されている方法は、（ｉ）ＨＭＯを産生することができる遺伝子改変細胞を提供する工程であって、前記細胞は、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ及びα－１，３－フコシルトランスフェラーゼ、並びに任意選択により必要に応じて主要促進体スーパーファミリー（ＭＦＳ）から選択される輸送体タンパク質、例えば、以下に限定されないが、配列番号１若しくは２若しくは３若しくは４２若しくは４３のタンパク質、又はアミノ酸配列が配列番号１若しくは２若しくは３若しくは４２若しくは４３と少なくとも８０％同一、好ましくは少なくとも８５％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一であるその機能的相同体をコードする異種、組換え及び／又は合成核酸を含む工程と、（ｉｉ）（ｉ）の細胞を好適な細胞培養培地で培養する工程と、（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において生成されたＨＭＯを回収する工程とを含む。

１種以上のＨＭＯを産生させるために、本明細書に記載のＨＭＯ産生細菌は、好適な炭素源の存在下、当該技術分野で知られた手順に従って培養される。典型的には、炭素源は、グリセロール、グルコース、スクロース及びこれらの混合物からなる群から選択される。代替の炭素源は、糖蜜、コーンシロップ、ガラクトース、コハク酸塩、リンゴ酸塩、ピルビン酸塩、乳酸塩、エタノール、メタノール、クエン酸塩及びラフィノースから選択することができる。産生されたＨＭＯは、培養培地から回収され、微生物バイオマスが培養プロセス中に形成される。その後、ＨＭＯは、当該技術分野において知られている手順、例えば国際公開第２０１５／１８８８３４号パンフレット、国際公開第２０１７／１８２９６５号パンフレット又は国際公開第２０１７／１５２９１８号パンフレットなどに記載されている手順に従って精製され、精製されたＨＭＯは、栄養補助食品、医薬品として、又は任意の他の目的に、例えば研究用に使用される。

ＨＭＯの製造は、典型的には、大量で培養することによって実施される。本発明の意味における「製造」及び「製造規模」という用語は、最小体積１００Ｌ、例えば１０００Ｌ、例えば１０，０００Ｌ、例えば１００，０００Ｌ、例えば２００，０００Ｌの媒養ブロスによる発酵を定義する。通常、「製造規模」のプロセスは、大量の目的ＨＭＯ調製物を処理し、毒性試験、臨床試験及び市場供給の要求を満たす量の目的ＨＭＯを回収することが可能であることによって定義される。大量であることに加えて、製造規模の方法は、振盪フラスコによる培養のような簡単な実験室規模の方法とは対照的に、撹拌、通気、栄養素供給、プロセスパラメーター（ｐＨ、温度、溶存酸素圧、背圧など）のモニタリング及び制御のための機器を装備しているバイオリアクター（発酵槽）の技術システムの使用を特徴とする。大体において、本開示の実施例に記載される振盪フラスコ、卓上バイオリアクター又はディープウエルフォーマットなどの実験室規模の方法における発現系の挙動により、バイオリアクターの複雑な環境における発現系の挙動を予測することは可能である。

発酵プロセスに用いられる好適な培地に関して制限はない。培養培地は、半規定、すなわち複合培地化合物（例えば、酵母抽出物、大豆ペプトン、カザミノ酸など）を含有するものであっても、複合化合物を含まない化学的に規定されたものであってもよい。

一態様では、本明細書に記載の方法は、低ラクトース条件で行われる工程（ｉｉ）における細胞の培養を含む。本文脈において、低ラクトース条件は、典型的には、培養培地１ｌ当たりラクトース５ｇ未満、例えば、培養培地１ｌ当たりラクトース４ｇ未満、培養培地１ｌ当たりラクトース３ｇ未満、培養培地１ｌ当たりラクトース２ｇ未満、培養培地１ｌ当たりラクトース２ｇ未満、培養培地１ｌ当たりラクトース１ｇ未満である条件と考えられる。特定の一態様では、工程（ｉｉ）における細胞の培養は、ラクトースを実質的に含まない条件、又は少なくとも、遺伝子改変細胞自体によって産生されるもの以外のラクトースを培養培地に添加しない条件で行われる。

本発明に関連して、用語「回収する」は、発酵の終了に続いて、産生したＨＭＯを収集することに関する。異なる実施形態では、それには、バイオマス（すなわち、宿主細胞の内部）及び培養培地（上清／発酵ブロス）の両方に含まれる、すなわちバイオマスから発酵ブロスを分離する前に／分離せずに、ＨＭＯを収集することが含まれ得る。他の実施形態では、産生したＨＭＯは、バイオマス及び発酵ブロスから個別に、すなわち培養培地（すなわち発酵ブロス）からバイオマスを分離した後に／分離に続いて収集され得る。培地からの細胞の分離は、当業者によく知られた方法のいずれか、例えば好適な任意のタイプの遠心分離又は濾過により実行することができる。培地からの細胞の分離は、発酵ブロスの収集直後に続けるか、又は適切な条件で発酵ブロスを貯蔵した後の段階で実行することができる。残留しているバイオマス（又は全発酵）からの産生したＨＭＯの回収には、バイオマス（すなわち産生細胞）からの抽出が含まれる。これは、当該技術分野の任意の好適な方法により、例えば音波処理、沸騰、均質化、リゾチームを用いる酵素的溶解、又は凍結及び破砕により実施することができる。

発酵から回収した後、ＨＭＯは、さらなる処理及び精製に利用可能である。

本発明の組換え細胞によって産生されたＨＭＯは、例えば、図７に示すように、又は国際公開第２０１６／０９５９２４号パンフレット、国際公開第２０１５／１８８８３４号パンフレット、国際公開第２０１７／１５２９１８号パンフレット、国際公開第２０１７／１８２９６５号パンフレット、国際公開第２０１７／１５２９１８号パンフレット、若しくは米国特許出願公開第２０１９／０１１９３１４号明細書（全て参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、当該技術分野で利用可能な好適な手順を用いて精製され得る。

本明細書に記載されるＨＭＯを生産するための細胞及び方法は、所定のＨＭＯプロファイルを有するＨＭＯ産物の制御された生産を可能にし、例えば、生産されたＨＭＯ混合物において、ＤＦＬは、他のＨＭＯ、すなわち混合物の３ＦＬ及び２’ＦＬ（副生成物）と比較して支配的なＨＭＯ（生成物）である。したがって、ＤＦＬは、他の副生成物ＨＭＯ（３ＦＬ及び／又は２’ＦＬ）よりも実質的に多い量で生成される。本発明の遺伝子改変細胞では、ＤＦＬ生成物中の３ＦＬ及び２’ＦＬのレベルを、有意に減少させることができる。

有利には、本発明は、副生成物対生成物の比の減少、すなわち２’ＦＬ／３ＦＬ／ＤＦＬの比の減少、及び全ＨＭＯ（及び／又はＨＭＯの合計）の全体的な収量の増加の両方を提供する。生成物の形成に関連した副生成物形成の減少は、生成物形成の増加を促進し、生成及び生成物回収プロセスの両方の効率を高め、ＨＭＯの、特にＤＦＬ生成のための優れた製造手順を提供する。

好ましい一実施形態では、生成物はＤＦＬであり、副生成物は３ＦＬである。別の好ましい実施形態では、生成物はＤＦＬであり、副生成物は２’ＦＬである。別の好ましい実施形態では、生成物はＤＦＬであり、副生成物は３ＦＬ及び２’ＦＬである。

以下の非限定的な実施例及び実施形態によって本発明をさらに説明する。

２’ＦＬ、３ＦＬ又はＤＦＬをそれぞれ産生する改変されたＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株における２’ＦＬ、３ＦＬ及びＤＦＬの相対的産生。改変Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＦＬ株は、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子ｆｕｔＣ及びα－１，３－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子ｆｕｔＡを過剰発現する。ＨＭＯレベルは、株１によって産生される２’ＦＬに対し相対的に示す。データは、ディープウェルフェドバッチアッセイから得る。 株４における相同糖排出輸送体Ａ遺伝子（ｓｅｔＡ）、又は株５～７における異種ＭＦＳ輸送体遺伝子ｍａｒｃ、ｎｅｃ又はｖａｇをそれぞれ過剰発現する改変Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＦＬ産生株における全ＨＭＯの相対的産生。ＨＭＯレベルは、株３で産生された全ＨＭＯに対し相対的に示す。データは、ディープウェルフェドバッチアッセイから得る。 株４における相同糖排出輸送体Ａ遺伝子（ｓｅｔＡ）、又は株５～７における異種ＭＦＳ輸送体遺伝子ｍａｒｃ、ｎｅｃ又はｖａｇをそれぞれ過剰発現する改変Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＦＬ産生株における２’ＦＬ及びＤＦＬの相対分布。ＤＦＬ及び２’ＦＬの相対比率は、各株によって産生されるＨＭＯの総量に対し相対的に示す。データは、ディープウェルフェドバッチアッセイから得る。 ＤＦＬ産生株８を用いて、高ラクトース（プロセス１、実線）又は低ラクトース（プロセス、点線）の条件で行った２回の試験を通した、発酵ブロス中のラクトース一水和物濃度の時間プロファイル。 株８を用いて、高ラクトース条件（プロセス１、実線）又は低ラクトース条件（プロセス２、点線）で行った２回の試験を通した、発酵ブロス中の質量％での比ＤＦＬ／（２’ＦＬ＋ＤＦＬ）の時間プロファイル。３ＦＬは、全ての場合において、ＨＭＯの合計の１％未満であり、したがって無視できる。 菌株８を用いて、高ラクトース条件（工程１、実線）又は低ラクトース条件（プロセス２、点線）で行った２回の試験を通した、発酵ブロス中のＤＦＬ力価の相対的形成の時間プロファイル。ＤＦＬ力価は、菌株８のプロセス２（低ラクトースレベル）の終点時測定と比較して示す。 結晶性ＤＦＬを得るための発酵ブロスの精製工程。限外濾過（ＵＦ）を用いて、バイオマスをブロスから分離し、ナノ濾過（ＮＦ）を用いてブロスを濃縮し、イオン交換樹脂（ＩＥＸ）を用いて塩を除去し、活性炭（ＡＣ）を用いて色を除去する。最終工程としての選択的ＤＦＬ結晶化により、非常に高純度のＤＦＬが提供される。

［項目］
１．１種以上のヒト乳オリゴ糖（ＨＭＯ）を産生することができる遺伝子改変細胞であって、
ａ．α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ、及び
ｂ．α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ
をコードする異種、組換え及び／又は合成核酸を含み、
細胞によって産生されるＨＭＯの５０重量％以上、例えば６０％超がジフコシルラクトース（ＤＦＬ）である、遺伝子改変細胞。
２．ｃ．主要促進体スーパーファミリー（ＭＦＳ）から選択される輸送体タンパク質をコードする異種、組換え及び／又は合成核酸をさらに含む、項目１に記載の遺伝子改変細胞。
３．ＭＦＳ輸送体タンパク質は、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、ローゼンベルギエラ・ネクタレア（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｉｅｌｌａ ｎｅｃｔａｒｅａ）、パントエア・バガンス（Ｐａｎｔｏｅａ ｖａｇａｎｓ）、エルシニア・フレデリクセニ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｅｎｉｉ）、及びロウシエラ・バデンシス（Ｒｏｕｘｉｅｌｌａ ｂａｄｅｎｓｉｓ）からなる群から選択される細菌に由来する、項目１又は２に記載の遺伝子改変細胞。
４．前記輸送体タンパク質は、配列番号１（Ｍａｒｃ）、配列番号２（Ｎｅｃ）、配列番号３（Ｖａｇ）、配列番号４２（ｆｒｅｄ）及び配列番号４３（ｂａｄ）からなる群から選択されるか、又はアミノ酸配列が配列番号１（Ｍａｒｃ）、配列番号２（Ｎｅｃ）、配列番号３（Ｖａｇ）、配列番号４２（ｆｒｅｄ）若しくは配列番号４３（ｂａｄ）と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％若しくは少なくとも９０％同一であるその機能的相同体である、項目１～３のいずれか一つに記載の遺伝子改変細胞。
５．ＭＦＳ輸送体タンパク質を有する遺伝子改変細胞は、ＭＦＳ輸送体タンパク質を有さない同じ細胞と比較して、少なくとも５重量％多くＤＦＬを産生する、項目１～４のいずれか一つに記載の遺伝子改変細胞。
６．細胞が産生するＨＭＯの６５％、例えば７０重量％以上がジフコシルラクトース（ＤＦＬ）である、項目１～５のいずれか一つに記載の遺伝子改変細胞。
７．α－１，２－フコシルトランスフェラーゼをコードする前記異種、組換え及び／又は合成核酸は、ｆｕｔＣ遺伝子若しくはｗｂｇＬ Ａ遺伝子、又はその機能的相同体である、項目１～６のいずれか一つに記載の遺伝子改変細胞。
８．ｆｕｔＣ遺伝子は、配列番号３７のアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなるアミノ酸配列、又は配列番号３７のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるその機能的相同体をコードし、ｗｂｇＬ遺伝子は、ＮＣＢＩアクセッションｎｒ ＡＤＮ４３８４７のアミノ酸配列、又はＮＣＢＩアクセッションｎｒ ＡＤＮ４３８４７のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるその機能的相同体を含むか又はそれからなる、項目７に記載の遺伝子改変細胞。
９．α－１，３－フコシルトランスフェラーゼをコードする前記異種、組換え及び／又は合成核酸は、ｆｕｔＡ遺伝子若しくはｆｕｃＴ遺伝子若しくはｍｏｕｍｏｕ遺伝子、又はその機能的相同体である、項目１～８のいずれか一つに記載の遺伝子改変細胞。
１０．ｆｕｔＡ遺伝子は、配列番号３８若しくは配列番号３９のアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなるアミノ酸配列、又は配列番号３８若しくは配列番号３９のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるその機能的相同体をコードし、ｆｕｃＴ遺伝子は、配列番号４０のアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなるアミノ酸配列、又は配列番号４０のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるその機能的相同体をコードし、ｍｏｕｍｏｕ遺伝子は、配列番号５４のアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなるアミノ酸配列、又は配列番号５４のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるその機能的相同体をコードする、項目９に記載の遺伝子改変細胞。
１１．α－１，３－フコシルトランスフェラーゼをコードする異種、組換え及び／又は合成核酸は、配列番号４０のアミノ酸配列、又は配列番号４０のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるその機能的相同体をコードするｆｕｃＴ遺伝子である、項目１～１０のいずれか一つに記載の遺伝子改変細胞。
１２．α－１，３－フコシルトランスフェラーゼをコードする異種、組換え及び／又は合成核酸は、配列番号３８若しくは配列番号３９のアミノ酸配列、又は、配列番号３８若しくは配列番号３９のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるその機能的相同体をコードするｆｕｔＡ遺伝子である、項目１～１１のいずれか一つに記載の遺伝子改変細胞。
１３．活性フコシルトランスフェラーゼのα－１，２－フコシルトランスフェラーゼ対α－１，３－フコシルトランスフェラーゼの比は、１：１～２：５の範囲、例えば１：１、１：２、１：３；１：４、１：５、２：３又は２：５である、項目１～１２のいずれか一つに記載の遺伝子改変細胞。
１４．ＦｕｔＣ：ＦｕｔＡの比は１：３又は２：３である、項目１３に記載の遺伝子改変細胞。
１５．α－１，２－フコシルトランスフェラーゼＦｕｔＣをコードする異種、組換え及び／又は合成核酸、並びに項目４から選択されるＭＦＳ輸送体又はその機能的相同体をコードする異種、組換え及び／又は合成核酸をさらに含む、項目１２に記載の遺伝子改変細胞。
１６．α－１，２－フコシルトランスフェラーゼＦｕｔＣをコードする異種、組換え及び／又は合成核酸、並びに項目４からのｎｅｃ若しくはｍａｒｃＭＦＳ輸送体又はその機能的相同体をコードする異種、組換え及び／又は合成核酸をさらに含む、項目１１に記載の遺伝子改変細胞。
１７．細胞において産生されるＨＭＯの総量の最大で４５重量％、例えば最大で３５重量％が、３－フコシルラクトース（３ＦＬ）、又は２’－フコシルラクトース（２’ＦＬ）である、項目１～１６のいずれか一つに記載の遺伝子改変細胞。
１８．細胞において産生されるＨＭＯの総量の最大で３０重量％、例えば最大２０重量％、最大１５重量％、最大１０重量％、最大５重量％、最大２．５重量％、又は最大１重量％が、３－フコシルラクトース（３ＦＬ）である、項目１～１７のいずれか一つに記載の遺伝子改変細胞。
１９．細胞において産生されるＨＭＯの総量の最大で３０重量％、例えば最大２０重量％、最大１５重量％、最大１０重量％、最大５重量％、最大２．５重量％、又は最大１重量％が、２’－フコシルラクトース（２’ＦＬ）である、項目１～１８のいずれか一つに記載の遺伝子改変細胞。
２０．微生物細胞である、項目１～１９のいずれか一つに記載の遺伝子改変細胞。
２１．エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、項目１～２０のいずれか一つに記載の遺伝子改変細胞。
２２．異種、組換え及び／又は合成核酸の発現を調節するための核酸配列を含む異種、組換え及び／又は合成調節エレメントをさらに含む、項目１～２１のいずれか一つに記載の遺伝子改変細胞。
２３．異種、組換え及び／又は合成核酸の発現を調節するための調節エレメントは、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、若しくはｍｇｌＢプロモーター（ＰｍｇｌＢ）、若しくはｇｌｐプロモーター（ＰｇｌｐＦ）、又はその任意のバリアントなどのプロモーター核配列を含む、項目２２に記載の遺伝子改変細胞。
２４．異種、組換え及び／又は合成核酸におけるα－１，２－フコシルトランスフェラーゼの発現を調節するための調節エレメントは、ＰｇｌｐＦ又はそのバリアントであるプロモーター核配列を含む、項目２３に記載の遺伝子改変細胞。
２５．ＰｇｌｐＦプロモーターは、配列番号２９の核酸配列、又は配列番号２９と少なくとも９０％、例えば９５％同一である核酸配列を含むか、又はそれからなる、項目２４に記載の遺伝子改変細胞。
２６．異種、組換え及び／又は合成核酸におけるα－１，３－フコシルトランスフェラーゼの発現を調節するための調節エレメントは、ＰｍｇｌＢ又はそのバリアントであるプロモーター核配列を含む、項目２２又は２３に記載の遺伝子改変細胞。
２７．ＰｍｇｌＢプロモーターは、配列番号４の核酸配列、又は配列番号４と少なくとも９０％、例えば９５％同一である核酸配列を含むか、又はそれからなるバリアントである、項目２６に記載の遺伝子改変細胞。
２８．細胞において産生されるＨＭＯの５０重量％、例えば７０重量％以上がジフコシルラクトース（ＤＦＬ）である、１種以上のオリゴ糖を生産する方法であって、
（ｉ）ＨＭＯを産生することができる遺伝子改変細胞を提供する工程であって、前記細胞は、
ａ．α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ、及び
ｂ．α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ
をコードする異種、組換え及び／又は合成核酸を含む遺伝子改変細胞を含む工程；
（ｉｉ）（ｉ）による細胞を好適な細胞培養培地で培養して、前記ＨＭＯを生成する工程；並びに
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において生成された１種以上のＨＭＯを回収する工程
を含む方法。
２９．前記細胞は、主要促進体スーパーファミリー（ＭＦＳ）から選択される輸送体タンパク質をコードする異種、組換え及び／又は合成核酸をさらに含む、項目２８に記載の方法。
３０．ＭＦＳ輸送体タンパク質をコードする異種、組換え及び／又は合成核酸を有する遺伝子改変された細胞は、ＭＦＳ輸送体タンパク質を含まない同じ細胞と比較して、ＤＦＬを少なくとも５重量％多く産生する、項目２９に記載の方法。
３１．細胞によって産生されるＨＭＯの６５重量％、例えば７０重量％以上がジフコシルラクトース（ＤＦＬ）である、項目２８～３０に記載の方法。
３２．α－１，２－フコシルトランスフェラーゼをコードする前記異種、組換え及び／又は合成核酸は、ｆｕｔＣ遺伝子若しくはｗｂｇＬ遺伝子、又はその機能的相同体である、項目２８～３１に記載の方法。
３３．ｆｕｔＣ遺伝子は、配列番号３７のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるアミノ酸配列、又は配列番号３７のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるその機能的相同体をコードし、ｗｂｇＬ遺伝子は、ＮＣＢＩアクセッションｎｒ ＡＤＮ４３８４７のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるアミノ酸配列、又はＮＣＢＩアクセッションｎｒ ＡＤＮ４３８４７のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるその機能的相同体をコードする、項目３２に記載の方法。
３４．α－１，３－フコシルトランスフェラーゼをコードする前記異種、組換え及び／又は合成核酸は、ｆｕｔＡ遺伝子若しくはｆｕｃＴ遺伝子若しくはｍｏｕｍｏｕ遺伝子、又はその機能的相同体である、項目２８～３３に記載の方法。
３５．ｆｕｔＡ遺伝子は、配列番号３８若しくは配列番号３９のアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなるアミノ酸配列、又は配列番号３８若しくは配列番号３９のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるその機能的相同体をコードし、ｆｕｃＴ遺伝子は、配列番号４０のアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなるアミノ酸配列、又は配列番号４０のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるその機能的相同体をコードし、ｍｏｕｍｏｕ遺伝子は、配列番号５４のアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなるアミノ酸配列、又は配列番号５４のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるその機能的相同体をコードする、項目３４に記載の遺伝子改変細胞。
３６．細胞において産生されるＨＭＯの総量の最大で３０重量％が、３－フコシルラクトース（３ＦＬ）又は２’－フコシルラクトース（２’ＦＬ）である、項目２８～３５のいずれか一つに記載の方法。
３７．細胞において産生されるＨＭＯの総量の最大で３０％、例えば最大２０重量％、最大１５重量％、最大１０重量％、最大５重量％、最大２。５重量％、又は最大１重量％が、３－フコシルラクトース（３ＦＬ）である、項目２８～３６のいずれか一つに記載の方法。
３８．細胞において産生されるＨＭＯの総量の最大で３０％、例えば最大２０重量％、最大１５重量％、最大１０重量％、最大５重量％、最大２。５重量％、又は最大１重量％が、２’－フコシルラクトース（２’ＦＬ）である、項目２８～３７のいずれか一つに記載の方法。
３９．工程（ｉｉ）における細胞の培養は、低ラクトース条件で行われる、項目２８～３８のいずれか一つに記載の方法。
４０．工程（ｉｉ）における細胞の培養は、＜５ｇラクトース／ｌ培養培地を有する条件で行われる、項目３９に記載の方法。
４１．１種以上のＨＭＯを生産するための、項目１～２７のいずれか１つに記載の遺伝子改変細胞の使用であって、細胞において産生されるＨＭＯの少なくとも６５重量％、例えば７０重量％以上がジフコシルラクトース（ＤＦＬ）である使用。
４２．配列番号３８と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％同一であり、以下の置換、Ｓ４６Ｆ、Ａ１２８Ｎ、Ｈ１２９Ｅ、Ｙ１３２Ｉ、Ｄ１４８Ｇ及びＹ２２１Ｃを含むか又はそれらからなるアミノ酸配列を有する１，３－フスコシルトランスフェラーゼ。
４３．アミノ酸配列は、配列番号３９を含むか又はそれからなる、項目４２に記載の１，３－フスコシルトランスフェラーゼ。
４４．配列番号３２のヌクレオチド配列によってコードされる、項目４２又は４３に記載の１，３－フスコシルトランスフェラーゼ。

［実施例］
［材料及び方法］
他に明記しない限り、分子生物学の分野において知られている標準的な技術、ベクター、制御配列エレメント及び他の発現系エレメントが、核酸の操作、形質転換及び発現のために使用される。そのような標準的な技術、ベクター及びエレメントは、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５）（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，＆Ｍａｎｉａｔｉｓ（ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８９）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）；Ｂｅｒｇｅｒ ＆ Ｋｉｍｍｅｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５２：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８７）（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）；Ｂｕｋｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ＤＮＡ Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ，Ｐｌａｓｍｉｄｓ ａｎｄ Ｅｐｉｓｏｍｅｓ（１９７７）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９７２．）（Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）に見出すことができる。

以下に記載する実施形態は、本発明を例示するために選択されたものであり、決して本発明を限定するものではない。

［培地］
ルリアブロス（ＬＢ）培地は、ＬＢブロス粉末、Ｍｉｌｌｅｒｓ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて作成し、ＬＢ寒天プレートは、ＬＢ寒天粉末、Ｍｉｌｌｅｒｓ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて作成した。適切な場合、アンピシリン（（１００μｇ／ｍＬ）若しくは任意の適切な抗生物質）及び／又はクロラムフェニコール（２０μｇ／ｍｌ）を添加した。

基礎最少培地は、以下の組成を有した：ＮａＯＨ（１ｇ／Ｌ）、ＫＯＨ（２．５ｇ／Ｌ）、ＫＨ_２ＰＯ_４（７ｇ／Ｌ）、ＮＨ_４Ｈ_２ＰＯ_４（７ｇ／Ｌ）、クエン酸（０．５ｇ／ｌ）、微量ミネラル溶液（５ｍＬ／Ｌ）。微量ミネラルストック液は、ＺｎＳＯ_４＊７Ｈ_２Ｏ ０．８２ｇ／Ｌ、クエン酸 ２０ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ_４＊Ｈ_２Ｏ ０．９８ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ_４＊７Ｈ_２Ｏ ３．９２５ｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ_４＊５Ｈ_２Ｏ ０．２ｇ／Ｌを含有した。基礎最少培地のｐＨを、５ＮのＮａＯＨを用いて７．０に調整し、オートクレーブにかけた。接種の前に、基礎最小培地に、１ｍＭのＭｇＳＯ_４、４μｇ／ｍＬのチアミン、０．５％の所与の炭素源（グルコース又はグリセロール（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ））を供給した。チアミン及び抗生物質は濾過により滅菌した。全てのパーセンテージでの濃度は、グリセロールについては体積／体積として、グルコースについては重量／体積として表示した。

２－デオキシ－ガラクトースを含有するＭ９プレートは、以下の組成を有した：１５ｇ／Ｌの寒天（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２．２６ｇ／Ｌの５×Ｍ９最小塩（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、２ｍＭのＭｇＳＯ４、４μｇ／ｍＬのチアミン、０．２％のグリセロール及び０．２％の２－デオキシ－Ｄ－ガラクトース（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ）。ＭａｃＣｏｎｋｅｙインジケータープレートは、以下の組成を有した：４０ｇ／ＬのＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天ベース（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ^ＴＭ）及び最終濃度１％の炭素源。

［培養］
他に明記しない限り、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）菌株は、０．２％のグルコースを含有する３７℃のルリア・ベルターニ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）（ＬＢ）培地中で撹拌しながら増殖させた。寒天プレートは、３７℃で一晩インキュベートした。

［化学的コンピテント細胞及び形質転換］
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）を、ＬＢプレートから、ＯＤ６００が約０．４になるまで３７℃で振盪しながら、０．２％のグルコースを含有する５ｍＬのＬＢ内に接種した。１３，０００ｇで２５秒間にわたる遠心分離により、２ｍＬの培養物を回収した。上清を除去し、細胞ペレットを６００μＬの低温ＴＢ溶液（１０ｍＭのＰＩＰＥＳ、１５ｍＭのＣａＣｌ_２、２５０ｍＭのＫＣｌ）に再懸濁させた。細胞を氷上で２０分間インキュベートし、その後、１３，０００ｇで１５秒間、ペレット化した。上清を除去し、細胞ペレットを１００μＬの低温ＴＢ溶液に再懸濁させた。プラスミドの形質転換を、１００μＬのコンピテント細胞及び１～１０ｎｇのプラスミドＤＮＡを用いて実施した。細胞及びＤＮＡを、氷上で２０分間インキュベートし、その後、４２℃で４５秒間、熱ショックを与えた。氷上での２分間のインキュベーション後、４００μＬのＳＯＣ（２０ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、０．５ｇ／ＬのＮａＣｌ、０．１８６ｇ／ＬのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、１０ｍＭのＭｇＳＯ_４及び２０ｍＭのグルコース）を添加し、細胞培養物を１時間にわたり振盪しながら３７℃でインキュベートし、その後、選択プレート上にプレーティングした。

プラスミドを、供給業者（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が推奨する条件で、ＴＯＰ１０化学的コンピテント細胞に形質転換させた。

［ＤＮＡ技術］
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のプラスミドＤＮＡを、ＱＩＡｐｒｅｐスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離した。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の染色体ＤＮＡを、ＱＩＡｍｐ ＤＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離した。ＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。ＤｒｅａｍＴａｑ ＰＣＲマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＵホットスタートＰＣＲマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）、ＵＳＥＲ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ）は、供給業者の推奨どおりに使用した。プライマーは、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｇｅｒｍａｎｙによって供給された。ＰＣＲ断片及びプラスミドは、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓによってシーケンシングされた。コロニーＰＣＲは、Ｔ１００^ＴＭサーマルサイクラー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）内のＤｒｅａｍＴａｑ ＰＣＲマスターミックスを用いて実施した。

代替のアルファ１，２－フコシルトランスフェラーゼは、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１２６由来のｗｂｇＬ（ＮＣＢＩアクセッションｎｒ ＡＤＮ４３８４７、国際公開第２０１６／１２０４４８号パンフレットに開示（参照により本明細書に組み込まれる））、又はヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）由来のｆｕｃＴ２（ＮＣＢＩ ｒｅｆＡＡＣ９９７６４、参照により本明細書に組み込まれる）である。

［プラスミドの構築］
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノム内への相同組換えに適切な２個のＤＮＡ断片によって分離された２つのＩ－ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼ部位及びＴ１転写ターミネーター配列を含有するプラスミドバックボーンを合成した。例えば、１本のプラスミドバックボーンでは、ｇａｌオペロン（ｇａｌＫにおける相同組換えに必要とされる）及びＴ１転写ターミネーター配列（ｐＵＣ５７：：ｇａｌ）を合成した（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ）。ｇａｌオペロン内の相同組換えに使用されるＤＮＡ配列は、配列のエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＭＧ１５５完全ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ：ＩＤ：ＣＰ０１４２２５．１）内の塩基対３，６２８，６２１～３，６２８，７２０及び３，６２７，５７２～３，６２７，６７１をカバーした。相同組換えによる挿入は、ｇａｌＫ及びｇａｌＫ－表現型の９４９塩基対の欠失を生じさせるであろう。同様の方法で、ｐＵＣ５７（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ）に基づくバックボーン、又はＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノム内への相同組換えに適切な２個のＤＮＡ断片によって分離された２つのＩ－ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼ部位及びＴ１転写ターミネーター配列を含有する任意の他の適切なベクターを合成することができるであろう。エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＤＨ１染色体ＤＮＡの特定のＤＮＡ配列のプライマーの設計及び増幅のために、分子生物学の分野においてよく知られる標準的な技術を使用した。

Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＤＨ１から得られた染色体ＤＮＡを使用し、オリゴＯ２６１及びＯ２６２（表２）を用いて、プロモーターＰｇｌｐＦを含有する３００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した（国際公開第２０１９／１２３３２４号パンフレットに記載）。

ｍｇｌＢプロモーターとＰｇｌｐＦ＿ＳＤ４の７０ＵＴＲ＿ＳＤ４配列との融合によって合成プロモーターエレメントを構築し、２０３ｂｐのプロモーターエレメント、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ４を得た（表３、ＰＣＴ／ＩＢ２０２０／０５５７７３号明細書に記載）。このプロモーターエレメントを、オリゴＯ３６４及びＯ４５９を用いて増幅した（表２）。

Ｅ．コリＫ－１２ ＤＨ１から得られた染色体ＤＮＡを使用し、オリゴＯ３４２及びＯ１２６（表２）を用いて、コロン酸遺伝子ｇｍｄ－ｗｃａＧ－ｗｃａＨ－ｗｃａＩ－ｍａｎＣ－ｍａｎＢを含有する６，７０６ｂｐのＤＮＡ断片（表３）を増幅した。

ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）２６６９５に由来するｆｕｔＣ遺伝子のコドン最適化バージョンを含有する９０９ｂｐのＤＮＡ断片は、ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔにより合成された（表４）。ｆｕｔＣ遺伝子を、オリゴＯ１２３及びＯ１２４（表２）を用いてＰＣＲにより増幅した。

８つの改変された塩基対を含むｆｕｔＡ遺伝子のコドン最適化バージョンを含有する１，２７８ｂｐのＤＮＡ断片は、ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔにより合成された（表４）。ｆｕｔＡ＿ｍｕｔ４を、オリゴＫＡＢＹ５２８及びＫＡＢＹ５６８（表２）を用いてＰＣＲにより増幅した。ｆｕｔＡ遺伝子は、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）２６６９５に由来する。

エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＤＨ１に由来するｓｅｔＡを含有する１，１７９ｂｐのＤＮＡ断片（表４）を、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＤＨ１由来の染色体ＤＮＡ並びにオリゴＯ４９９及びＯ４５０（表２）を用いてＰＣＲにより増幅した。

セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）に由来するｍａｒｃ遺伝子のコドン最適化バージョンを含有する１，１９７ｂｐのＤＮＡ断片は、ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔにより合成された（表４）。ｍａｒｃ遺伝子を、オリゴＯ７３７及びＯ７３８（表２）を用いてＰＣＲにより増幅した。

ローゼンベルギエラ・ネクタレア（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｉｅｌｌａ ｎｅｃｔａｒｅａ）に由来するｎｅｃ遺伝子のコドン最適化バージョンを含有する１，１８５ｂｐのＤＮＡ断片は、ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔにより合成された（表４）。ｎｅｃ遺伝子を、オリゴＯ７４１及びＯ７４２（表２）を用いてＰＣＲにより増幅した。

パントエア・バガンス（Ｐａｎｔｏｅａ ｖａｇａｎｓ）に由来するｖａｇ遺伝子のコドン最適化バージョンを含有する１，１７９ｂｐのＤＮＡ断片は、ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔにより合成された（表４）。ｖａｇ遺伝子を、オリゴＫＡＢＹ７４５及びＫＡＢＹ７４６（表２）を用いてＰＣＲにより増幅した。

エルシニア・フレデリクセニ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｅｎｉｉ）に由来するｆｒｅｄ遺伝子のコドン最適化バージョンを含有する１．１８２ｂｐのＤＮＡ断片は、ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔにより合成された（表４）。ｆｒｅｄ遺伝子を、オリゴＫＡＢＹ７３３及びＫＡＢＹ７３４（表２）を用いて増幅した。

ロウシエラ・バデンシス（Ｒｏｕｘｉｅｌｌａ ｂａｄｅｎｓｉｓ）に由来するｂａｄ遺伝子のコドン最適化バージョンを含有する１．１８２ｂｐのＤＮＡ断片は、ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔにより合成された（表４）。ｂａｄ遺伝子を、オリゴＫＡＢＹ７２９及びＫＡＢＹ７３０（表２）を用いて増幅した。

エルニシア・ベルコビエリ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｂｅｒｃｏｖｉｅｒｉ）に由来するｙｂｅｒＣ遺伝子のコドン最適化バージョンを含有する１，１８５ｂｐのＤＮＡ断片は、ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔにより合成された（表４）。ｙｂｅｒＣ遺伝子を、オリゴＫＡＢＹ７２１及びＫＡＢＹ７２２（表２）を用いてＰＣＲにより増幅した。

全てのＰＣＲ断片（プラスミドバックボーン、プロモーターエレメント及び目的遺伝子を精製し、プラスミドバックボーン、プロモーターエレメント及び目的の遺伝子を組み立てた。プラスミドを、標準ＵＳＥＲクローニングによってクローン化した。任意の適切なプラスミドにおけるクローニングは、任意の標準的なＤＮＡクローニング技術を用いて実施することができるであろう。プラスミドを、ＴＯＰ１０細胞内に形質転換させ、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（又は任意の適切な抗生物質）及び０．２％のグルコースを含有するＬＢプレートで選択した。構築したプラスミドを精製し、プロモーター配列及び目的遺伝子の５’末端をＤＮＡシーケンシングによって検証した（ＭＷＧ Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）。このようにして、目的遺伝子に融合した目的プロモーターを含む遺伝子カセットを構築し、相同組換えによる染色体への組み込みに使用した。

［菌株の構築］
使用した細菌株のＭＤＯは、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＤＨ１から構築した。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＤＨ１の遺伝子型は、Ｆ^－、λ^－、ｇｙｒＡ９６、ｒｅｃＡ１、ｒｅｌＡ１、ｅｎｄＡ１、ｔｈｉ－１、ｈｓｄＲ１７、ｓｕｐＥ４４である。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＤＨ１遺伝子型に加えて、ＭＤＯは、以下の改変を有する：ｌａｃＺ：１．５ｋｂｐの欠失、ｌａｃＡ：０．５ｋｂｐの欠失、ｎａｎＫＥＴＡ：３．３ｋｂｐの欠失、ｍｅｌＡ：０．９ｋｂｐの欠失、ｗｃａＪ：０．５ｋｂｐの欠失、ｍｄｏＨ：０．５ｋｂｐの欠失、及びｇｍｄ遺伝子の上流へのＰｌａｃプロモーターの挿入。本実施例で用いた菌種の構築について以下に説明する。菌株の概要を表５に示す。

発現カセットを含有するプラスミド、ＰｇｌｐＦ－ｇｍｄ－ｗｃａＧ－ｗｃａＨ－ｗｃａＩ－ｍａｎＣ－ｍａｎＢ、ＰｇｌｐＦ－ｆｕｔＣ、ＰｇｌｐＦ－ｆｕｔＡ＿ｍｕｔ４、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ４－ｆｕｔＣ、ＰｇｌｐＦ－ｓｅｔＡ、ＰｇｌｐＦ－ｍａｒｃ、ＰｇｌｐＦ－ｎｅｃ、又はＰｇｌｐＦ－ｖａｇを、国際公開第２０１９／１２３３２４号パンフレットに記載のように、相同リコンビニアリングにより染色体ＤＮＡに組み込んだ。簡潔に記載すると、染色体ＤＮＡへの組み込みのために、ヘルパープラスミドのｐＡＣＢＳＲ、及び発現カセットを含むドナープラスミド（上記の通り）をＭＤＯに同時形質転換し、０．２％のグルコース、アンピシリン（１００ｐｇ／ｍｌ）又はカナマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ）、及びクロラムフェニコール（２０ｐｇ／ｍｌ）を含むＬＢプレートで選択した。単一コロニーを、クロラムフェニコール（２０ｐｇ／ｍＬ）及び１０μＬの２０％Ｌ－アラビノースを含有する１ｍｌのＬＢ中に接種し、７～８時間にわたり振盪しながら３７℃でインキュベートした。ｇａｌＫ遺伝子座への挿入の選択は、Ｍ９－ＤＯＧプレート上にプレーティングすることによって行い、３７℃で４８時間インキュベートした。ＭＭ－ＤＯＧプレート上に形成された単一コロニーを、０．２％グルコースを含有するＬＢプレート上に再度画線し、３７℃で２４時間インキュベートした。ＭａｃＣｏｎｋｅｙ－ガラクトース寒天プレート上で白く見え、アンピシリン及びクロラムフェニコールの両方に感受性を示したコロニーはドナー及びヘルパープラスミドを失い、ｇａｌＫ遺伝子座への挿入を含むと予想された。ｇａｌＫ部位への挿入は、ｇａｌＫ遺伝子座の外側に位置するプライマー０４８及び０４９を使用するコロニーＰＣＲによって確認した。染色体ＤＮＡを精製し、プライマー０４８及び０４９を用いてｇａｌＫ遺伝子座を増幅し、挿入されたＤＮＡをシーケンシングにより検証した（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。目的の組み込み部位の上流及び下流に位置する相同ＤＮＡを用いて、いくつかの遺伝子カセットを染色体ＤＮＡ中のいくつかの特定の遺伝子座に組み込んだ。

株１は、コロン酸オペロンｇｍｄ－ｗｃａＧ－ｗｃａＨ－ｗｃａＩ－ｍａｎＣ－ｍａｎＢに融合したＰｇｌｐＦを含む１つの遺伝子発現カセットを挿入し、ＭＤＯ株の染色体ＤＮＡにｆｕｔＣに融合したＰｇｌｐＦを含む２つの遺伝子発現カセットを挿入することによって構築した。ｌａｃＩ遺伝子を、相同リコンビニアリングによりマーカー遺伝子で置換した。ｌａｃＩにおけるマーカー遺伝子を、相同組換えによって再び除去し、これによりｌａｃＩ遺伝子は痕跡を残さずに除去された。

株２は、ｇｍｄの上流に位置するＰｌａｃをＰｇｌｐＦに置き換えることによって構築した。まず、Ｐｌａｃエレメントを相同リコンビニアリングによりマーカー遺伝子を置換し、次に、このマーカー遺伝子を、ＰｇｌｐＦを含むＤＮＡ断片上でオリゴＯＬ－０５５０及びＯＬ－０５１１を用いてＰＣＲにより構築したｄｓＤＮＡ断片を用いて相同リコンビニアリングによりＰｇｌｐＦに置換した。さらに、ｆｕｔＡ＿ｍｕｔ４に融合したＰｇｌｐＦを含む３つの遺伝子発現カセット、及びｍａｒｃに融合したＰｇｌｐＦを含む１つの遺伝子発現カセットを、ＭＤＯ株の染色体ＤＮＡの特定の遺伝子座に挿入した。ｌａｃＩ遺伝子を、相同リコンビニアリングによりマーカー遺伝子で置換した。ｌａｃＩにおけるマーカー遺伝子を、相同組換えによって再び除去し、これによりｌａｃＩ遺伝子は痕跡を残さずに除去された。

株３は、ｆｕｔＣに融合したＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ４をＰｇｌｐＦ－ｍａｒｃに代えて株ＭＤＯの染色体ＤＮＡに挿入したことを除いて、株２のように構築した。

株４は、ｓｅｔＡに融合したＰｇｌｐＦを含有する１つの遺伝子発現カセットを、株３の染色体に挿入することによって構築した。

株５は、ｍａｒｃに融合したＰｇｌｐＦを含有する１つの遺伝子発現カセットを、株３の染色体に挿入することによって構築した。

株６は、ｎｅｃに融合したＰｇｌｐＦを含有する１つの遺伝子発現カセットを、株３の染色体に挿入することによって構築した。

株７は、ｖａｇに融合したＰｇｌｐＦを含有する１つの遺伝子発現カセットを、株３の染色体に挿入することによって構築した。

株８は、ｆｕｔＣに融合したＰｇｌｐＦを含有する１つの遺伝子発現カセットを、株２の染色体に挿入することによって構築した。

株９は、ｆｒｅｄに融合したＰｇｌｐＦを含有する１つの遺伝子発現カセットを、株３の染色体に挿入することによって構築した。

株１０は、ｂａｄに融合したＰｇｌｐＦを含有する１つの遺伝子発現カセットを、株３の染色体に挿入することによって構築した。

株１１は、ＹｂｅｒＣに融合したＰｇｌｐＦを含有する１つの遺伝子発現カセットを、株３の染色体に挿入することによって構築した。

株１２は、ＰｇｌｐＦプロモーター及び転写ターミネーターの制御下で、１，３－フコシルトランスフェラーゼのｆｕｔＡを含むカナマイシン耐性ｐＴＯＰＯプラスミドコンストラクト（ｐｌ－ｆｕｔＡ－ｍｕｔ４）を、株１Ａ（ｎｅｃ輸送体を有する２’－ＦＬ株）に形質転換することによって構築した。

株１３は、ＰｇｌｐＦプロモーター及び転写ターミネーターの制御下で、１，３－フコシルトランスフェラーゼのｆｕｃＴを含むカナマイシン耐性ｐＴＯＰＯプラスミドコンストラクト（ｐｌ－ｆｕｃＴ）を、株１Ａ（ｎｅｃ輸送体を有する２’－ＦＬ株）に形質転換することによって構築した。

株１４は、ＰｇｌｐＦプロモーター及び転写ターミネーターの制御下で、１，３－フコシルトランスフェラーゼのｍｏｕｍｏｕ（表１）を含むカナマイシン耐性ｐＴＯＰＯプラスミドコンストラクト（ｐｌ－ｍｏｕｍｏｕ）を、株１Ａ（ｎｅｃ輸送体を有する２’－ＦＬ株）に形質転換することによって構築した。

株１５は、ＰｇｌｐＦプロモーター及び転写ターミネーターの制御下で、１，３－フコシルトランスフェラーゼのｆｕｃＴを含むカナマイシン耐性ｐＴＯＰＯプラスミドコンストラクト（ｐｌ－ｆｕｃＴ）を、株１Ｂ（ｍａｒｃ輸送体を有する２’－ＦＬ株）に形質転換することによって構築した。

［ディープウェルアッセイ（ＤＷＡ）］
ＤＷＡは、最初にＬｖ ｅｔ ａｌ（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｓｙｓｔ Ｅｎｇ（２０１６）３９：１７３７－１７４７）に記載され、本発明の目的に合わせて最適化して実施した。

より詳細には、実施例に開示した菌株を、４日間プロトコルを用いて２４ディープウェルプレート内でスクリーニングした。最初の２４時間中に細胞を高密度に増殖させ、次の４８時間では、細胞を遺伝子発現の誘導及び生成物形成を許容する培地に移した。詳細には、１日目に、硫酸マグネシウム、チアミン及びグルコースが補充された基礎最少培地を用いて新鮮な接種材料を調製した。７００ｒｐｍで振盪しながら３４℃で調製した培養物を２４時間インキュベートした後、硫酸マグネシウム及びチアミンを補充した新しい基礎最小培地（２ｍｌ）に細胞を移し、これに２０％グルコース溶液（１μｌ）及び１０％ラクトース溶液（０．１ｍｌ）の初期ボーラスを添加し、次いで、炭素源として５０％スクロース溶液を細胞に供給し、スクロース加水分解酵素（インベルターゼ、０．１ｇ／Ｌ溶液４μｌ）を添加して、グルコースがインベルターゼによるスクロースの切断による増殖のためにゆっくりとした速度で供給されるようにした。新規培地の接種後、細胞を、４８時間にわたり２８℃、７００ｒｐｍで振盪した。変性及びその後の遠心分離後、上清をＨＰＬＣによって分析した。

［発酵］
発酵は、２００ｍＬのＤａｓＢｏｘバイオリアクター（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）又は２ＬのＢｉｏｓｔａｔ Ｂバイオリアクター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中で行った。開始体積は、それぞれ１００ｍＬ又は１Ｌとした。培地は、２５ｇ／ｋｇの炭素源（グルコース）、ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、ＫＯＨ、ＮａＯＨ、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、微量元素溶液、クエン酸、消泡剤及びチアミンからなる既定の最小培地とした。微量金属溶液（ＴＭＳ）には、Ｍｎ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｚｎが硫酸塩及びクエン酸として含まれた。規定の最小培地中で増殖させた２％（ｖ／ｖ）の前培養物を接種することによって発酵を開始した。バッチ培地中に含まれる炭素源を枯渇させた後、グルコース、ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、ＴＭＳ、Ｈ３ＰＯ４、消泡剤及びラクトースを含有する滅菌供給溶液を、所定の線形プロファイルを用いて、グルコース制限方式で連続的に供給した。供給溶液中のラクトース濃度は、発酵中に高又は低ラクトース濃度を得るために、１２０ｇ／ｋｇ（プロセス ＤＦＬ１）又は６０ｇ／ｋｇ（プロセス ＤＦＬ２）とした。したがって、低ラクトース条件は発酵の大部分を通して＜５ｇ／ｌを有すると定義され、高ラクトース条件は発酵の大部分を通して１０～２５ｇ／Ｌを有すると定義された。図４は、ＨＰＬＣを用いて発酵ブロスにおいて測定された、生成ラクトース濃度を示す。

ＮＨ４ＯＨ溶液で滴定することにより、発酵中のｐＨを６．８に制御した。通気は空気を用いて１ｖｖｍに制御し、溶存酸素は撹拌速度によって制御し、空気飽和の２０％以上に維持した。グルコースの供給開始から３時間後に、発酵温度設定値を３３℃から３０℃に下げた。この温度降下は、瞬時に、又は１時間の直線ランプを用いて行った。

発酵を通して、ＨＰＬＣを用いて２’ＦＬ、３ＦＬ、ＤＦＬ、ラクトース及び他の副生成物の濃度を決定するために試料を採取した。全ブロス試料を脱イオン水で３倍に希釈し、２０分間煮沸した。これに続いて、１７０００ｇで３分間遠心分離を行い、その後、得られた上清をＨＰＬＣで分析した。

［実施例１．α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ及びα－１，３－フコシルトランスフェラーゼの過剰発現によるＨＭＯ産生のためのエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の操作。］
２’ＦＬ、３ＦＬ又はＤＦＬを主生成物として産生する３株を構築した。２’ＦＬ産生株である株１は、コロン酸遺伝子（ｇｍｄ－ｗｃａＧ－ｗｃａＨ－ｗｃａＩ－ｍａｎＣ－ｍａｎＢ）及びα－１，２－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子のｆｕｔＣを過剰発現する。３ＦＬ産生株である株２は、コロン酸遺伝子（ｇｍｄ－ｗｃａＧ－ｗｃａＨ－ｗｃａＩ－ｍａｎＣ－ｍａｎＢ）、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子のｆｕｔＡ＿ｍｕｔ４、及びＭＦＳ遺伝子のｍａｒｃを過剰発現する。ＤＦＬ産生株である株３は、コロン酸遺伝子（ｇｍｄ－ｗｃａＧ－ｗｃａＨ－ｗｃａＩ－ｍａｎＣ－ｍａｎＢ）、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子のｆｕｔＡ＿ｍｕｔ４、及びα－１，２－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子のｆｕｔＣを過剰発現する。

材料及び方法の項に記載のディープウェルアッセイを用いてこれらの株を培養し、ＨＰＬＣを用いて２’ＦＬ、３ＦＬ及びＤＦＬの含量を測定した。結果を図１に示す。

驚くべきことに、３ＦＬ産生株においてα－１，２－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子のｆｕｔＣを過剰発現すると、３ＦＬがＤＦＬに変換される。株３によって産生される全ＨＭＯの７０％超がＤＦＬであり、３ＦＬの産生はほとんど排除される。

図１からわかるように、株３によって産生される全ＨＭＯの７０％超がＤＦＬであり、３ＦＬの産生はほとんど排除されている。

［実施例２．異種ＭＦＳタンパク質の過剰発現によるＤＦＬ産生のためのエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の操作。］
株３によって産生される主なＨＭＯはＤＦＬである。株３は、コロン酸遺伝子（ｇｍｄ－ｗｃａＧ－ｗｃａＨ－ｗｃａＩ－ｍａｎＣ－ｍａｎＢ）、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子のｆｕｔＣ、及びα－１，３－フコシルトランスフェラーゼのｆｕｔＡ＿ｍｕｔ４を過剰発現する。

本実施例では、相同糖排出輸送体タンパク質のＳｅｔＡ（株４）、又は３つの異種ＭＦＳ輸送体タンパク質のうちの１つ、すなわちＭａｒｃ（株５）、Ｎｅｃ（株６）若しくはＶａｇ（株７）、エクスポータータンパク質の過剰発現が、株３と比較して、全ＨＭＯの発現及びＤＦＬ／２’ＦＬ比に影響を及ぼすかどうかを調べた。

材料及び方法の項に記載のディープウェルアッセイを用いてこれらの株を培養し、ＨＰＬＣを用いて２’ＦＬ、３ＦＬ及びＤＦＬの含量を測定した。結果を図２及び３に示す。

ｓｅｔＡ遺伝子の過剰発現（株４）は、産生されるＨＭＯの総量を増加させなかった（図２）。ｍａｒｃ遺伝子の過剰発現（株５）は、産生されるＨＭＯの総量を２５％増加させた（図２）。ｎｅｃ又はｖａｇ遺伝子（それぞれ株６又は７）の過剰発現は、産生されるＨＭＯの総量を８０％増加させた（図２）。さらに、ｍａｒｃ、ｎｅｃ又はｖａｇの過剰発現は、ＨＭＯの総量に対するＤＦＬの比率を２５％増加させ（図３）、ＨＭＯの総量に対する２’ＦＬの比率を３０％超減少させた（図３）。α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子のｆｕｔＣ、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼのｆｕｔＡ＿ｍｕｔ４を過剰発現し、ｍａｒｃ、ｎｅｃ又はｖａｇの過剰発現と組み合わされた株において、産生されたＨＭＯの７０％超がＤＦＬである。

［実施例３．発酵により得られるＤＦＬ：２’ＦＬの高い比率。］
ラクトースは、ＤＦＬ形成に関与するアルファ－１，２－フコシルトランスフェラーゼ及びアルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼによって行われるフコシル化のための基質である。本実施例では、発酵している間の供給物中のラクトース濃度がＤＦＬ形成に影響を及ぼすかどうかを調べた。

ＤＦＬ産生株（株８）は２’ＦＬとＤＦＬとの混合物を産生することができ、ＤＦＬは主要なＨＭＯであり、２’ＦＬは一般に、以下に記載されるように、発酵条件に応じて、全ＨＭＯの３０％以下を構成する。驚くべきことに、アルファ－１，３フコシルトランスフェラーゼ遺伝子のｆｕｔＡ＿ｍｕｔ４が発現されたにもかかわらず、これらの株を用いた発酵では３ＦＬはほとんど検出されない。異なる供給量のラクトースを用いた２回の発酵を、材料及び方法の項に記載されているように並行して行った。２つの発酵プロセスは、培地組成、グルコース供給プロファイル、並びに温度、ｐＨ及び溶存酸素などの発酵プロセスパラメーターに関して同一であった。ＨＰＬＣにより測定し得られた発酵ブロス中のラクトース濃度は、発酵中のほとんどの時間、プロセスＤＦＬ１では１５ｇ／Ｌを超え、プロセスＤＦＬ２では５ｇ／Ｌ未満であった（図４）。低ラクトースプロセスでは、ＤＦＬ／（２’ＦＬ＋ＤＦＬ）の最高比率が＞８０％に達し、この比率は発酵の終わりまで安定している（図５）。高ラクトースプロセス（ＤＦＬ１）では、ＤＦＬ／（２’ＦＬ＋ＤＦＬ）の比率はやや低いが、それでも＞７０％であり、これは全ての場合において、ＤＦＬが生産される最も豊富なＨＭＯであることを意味する（図６）。驚くべきことに、３ＦＬは、全ての場合において、ＨＭＯの総和の＜１％であると決定され、したがって、最終生成物品質では無視できる（表６）。

［実施例４．発酵ブロスからのＤＦＬの精製及び結晶化］
発酵後、細胞及びタンパク質を限外濾過によって除去し、得られた溶液をナノ濾過によって濃縮した。溶液を強陽イオン交換樹脂（Ｈ^＋型）及び弱陰イオン交換樹脂（遊離塩基型）を通して溶出し、脱塩した。次いで、溶液を木炭で処理して、脱色した。続いて、溶液を減圧下で濃縮し、結晶化工程に必要な濃度にした。ＤＦＬの結晶化のために、エタノール（約１．３体積）を濃縮溶液に加えた。溶液に種晶を加え、室温で１８時間撹拌した。続いて、エタノール（約１．３体積）を室温で３時間かけて連続的に添加した。結晶を濾別し、エタノール（約０．４体積）で洗浄した。一定重量になるまで空気中で結晶を乾燥させた。ＤＦＬ含量（無水）＞９０重量％％。

図７は、結晶性ＤＦＬを得るための発酵ブロスの精製工程を示す。

限外濾過（ＵＦ）を用いて、バイオマスをブロスから分離し、ナノ濾過（ＮＦ）を用いてブロスを濃縮し、イオン吸収工程により塩を除去し、活性炭（ＡＣ）を用いて色を除去する。最終工程としての選択的ＤＦＬ結晶化により、非常に高純度のＤＦＬが提供される。

［実施例５－異なる異種輸送体タンパク質の比較研究。］
実施例２では、３つのＭＦＳ輸送体タンパク質のＭａｒｃ、Ｎｅｃ又はＶａｇ、及び糖排出輸送体タンパク質のＳｅｔＡを株３に挿入した場合のＤＦＬ発現を増加させる能力について試験した。本実施例では、３つのさらなるＭＦＳ輸送体Ｆｒｅｄ、Ｂａｄ及びＹｂｅｒＣをＤＦＬ産生株（株３）において過剰発現させ、それぞれ株９～１１を得た。

材料及び方法の項に記載のディープウェルアッセイを用いてこれらの株を培養し、ＨＰＬＣを用いて２’ＦＬ、３ＦＬ及びＤＦＬの含量を測定した。

生成されたＨＭＯの総量のＤＦＬ、２ＦＬ及び３ＦＬの割合を表７に示す。

実施例２で観察されたように、ｓｅｔＡ遺伝子（株４）の過剰発現は産生されるＤＦＬの量を増加させず、これは新たなエクスポーターＹｂｅｒＣ（株１１）にも当てはまる。実施例２と同様に、ｍａｒｃ、ｎｅｃ、又はｖａｇ（株５～７）の過剰発現は、ＨＭＯの総量に対するＤＦＬの比率を７～１２％増加させた。同じことが、ｆｒｅｄ及びｂａｄ（株９及び１０）の新しい輸送体で観察された。α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子のｆｕｔＣ、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼのｆｕｔＡ＿ｍｕｔ４を過剰発現するｍａｒｃ、ｎｅｃ、ｖａｇ ｆｒｅｄ又はｂａｄ輸送体タンパク質株を有する株において産生されたＨＭＯの６５％超がＤＦＬである。

［実施例６－ＤＦＬ形成のための代替α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ。］
α－１，３－フコシルトランスフェラーゼは、ラクトース基質のグルコース部分へのフコシルの付加に関与する。以下の実施例において、ＭＦＳ輸送体ｎｅｃと組み合わせた代替α－１，３－フコシルトランスフェラーゼの添加を試験した。

簡潔に記載すると、染色体上にＦｕｔＣ α－１，２－フコシルトランスフェラーゼを含有する２’－ＦＬ産生株（株１）を、ｎｅｃ ＭＦＳ輸送体タンパク質産生株１Ａを過剰発現させることによって改変した。この２’ＦＬ発現株を異なるＤＦＬ発現株に変換するために、細胞を、異なるα－１，３－フコシルトランスフェラーゼを含有するプラスミドでトランスフェクトした。

材料及び方法の項に記載のディープウェルアッセイを用いてこれらの株を培養し、ＨＰＬＣを用いて２’ＦＬ、３ＦＬ及びＤＦＬの含量を測定した。結果を表８に示す。

これから、３つの異なるα－１，３－フコシルトランスフェラーゼは、ｎｅｃ ＭＦＳ輸送体と組み合わせた場合に、細胞によって産生されるＨＭＯ混合物中で最も豊富なＨＭＯとしてＤＦＬを産生することができることがわかる。ｍｏｕｍｏｕ α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ（株１４）は、ほぼ同量のＤＦＬ及び３ＦＬを産生し、この比は、ｍｏｕｍｏｕ α－１，３－フコシルトランスフェラーゼとα－１，２－フコシルトランスフェラーゼのＦｕｔＣとの比を調整することにより、ｍｏｕｍｏｕトランスフェラーゼは高発現プラスミドから発現され、ＦｕｔＣはゲノム上の２コピーから発現されるので、ｍｏｕｍｏｕトランスフェラーゼのコピー数を減少させることにより、ＨＭＯ産生がＤＦＬがより多く３ＦＬがより少なくなる方向にシフトすると予想されるため、おそらくＤＦＬの方向に変化し得る。ＦｕｔＡ＿ｍｕｔ４ α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ（株１２）では、２コピーのＦｕｔＣを含む株における高コピー数プラスミドからのＦｕｔＡ＿ｍｕｔ４の高過剰発現が、全ＨＭＯの６１％のＤＦＬをもたらす。しかしながら、ＦｕｔＡ＿ｍｕｔ４の３コピー及びｆｕｔＣの１コピーのみが株中に存在した実施例５の株６と比較すると、株１２では、３ＦＬの産生が増加し、ＤＦＬの産生が減少する。これは、フコシルトランスフェラーゼ比の最適化が培養物中のＤＦＬの量を増加させるのに有益であり得ることを示している。

［実施例７－ＤＦＬ形成のためのｆｕｃＴ α－１，３－フコシルトランスフェラーゼとｍａｒｃ ＭＦＳ輸送体との組み合わせ。］
以下の実施例では、実施例６の最も良好な性能を示したα－１，３－フコシルトランスフェラーゼ、ＦｕｃＴを、ｍａｒｃ ＭＦＳ輸送体と組み合わせて試験した。

簡潔に記載すると、染色体上にＦｕｔＣ α－１，２－フコシルトランスフェラーゼを含有する２’－ＦＬ産生株（株１）を、ｍａｒｃ ＭＦＳ輸送体タンパク質産生株１Ｂを過剰発現させることによって改変した。この２’ＦＬ発現株をＤＦＬ発現株に変換するために、ＦｕｃＴ α－１，３－フコシルトランスフェラーゼを含有するプラスミドで株をトランスフェクトした。

材料及び方法の項に記載のディープウェルアッセイを用いてこれらの株を培養し、ＨＰＬＣを用いて２’ＦＬ、３ＦＬ及びＤＦＬの含量を測定した。結果を表９に示す。

これらのデータから、ＦｕｃＴ α－１，３－フコシルトランスフェラーゼは、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼのＦｕｔＣ及びｍａｒｃ ＭＦＳ輸送体と組み合わせた場合、ＤＦＬの産生において非常に効率的であることがわかる。この細胞によって産生されたＨＭＯ混合物の７６％をＤＦＬが構成し、一方、ＦｕｃＴ及びｎｅｃ ＭＦＳ輸送体の使用で、６４％のＤＦＬが産生された（表９に含まれる表８からのデータ）。

Claims (20)

1. １種以上のヒト乳オリゴ糖（ＨＭＯ）を産生することができる遺伝子改変細胞であって、
   ａ．α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ、及び
   ｂ．α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ、及び
   ｃ．主要促進体スーパーファミリー（ＭＦＳ）から選択される組換え輸送体タンパク質
   をコードする異種、組換え及び／又は合成核酸を含む遺伝子改変細胞。
2. 前記ＭＦＳ輸送体タンパク質を有する前記遺伝子改変細胞は、前記ＭＦＳ輸送体タンパク質を有さない同じ細胞と比較して、少なくとも５重量％多くＤＦＬを産生する、請求項１に記載の遺伝子改変細胞。
3. 前記遺伝子改変細胞により産生される最も豊富なＨＭＯは、ジフコシルラクトース（ＤＦＬ）である、請求項１又は２に記載の遺伝子改変細胞。
4. 前記細胞によって産生される前記ＨＭＯの６０重量％超は、ジフコシルラクトース（ＤＦＬ）である、請求項１～３のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
5. α－１，２－フコシルトランスフェラーゼをコードする前記異種、組換え及び／又は合成核酸は、ｆｕｔＣ遺伝子若しくはｗｂｇＬ Ａ遺伝子、又はその機能的相同体である、請求項１～４のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
6. α－１，３－フコシルトランスフェラーゼをコードする前記異種、組換え及び／又は合成核酸は、ｆｕｔＡ遺伝子若しくはｆｕｃＴ遺伝子若しくはｍｏｕｍｏｕ遺伝子、又はその機能的相同体である、請求項１～５のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
7. 前記細胞において産生される前記ＨＭＯの総量の最大で３５重量％が、３－フコシルラクトース（３ＦＬ）、又は２’－フコシルラクトース（２’ＦＬ）である、請求項１～６のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
8. 前記ＭＦＳ輸送体タンパク質は、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、ローゼンベルギエラ・ネクタレア（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｉｅｌｌａ ｎｅｃｔａｒｅａ）、パントエア・バガンス（Ｐａｎｔｏｅａ ｖａｇａｎｓ）、エルシニア・フレデリクセニ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｅｎｉｉ）、及びロウシエラ・バデンシス（Ｒｏｕｘｉｅｌｌａ ｂａｄｅｎｓｉｓ）からなる群から選択される細菌に由来する、請求項１～７のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
9. 前記輸送体タンパク質は、配列番号１（Ｍａｒｃ）、配列番号２（Ｎｅｃ）、配列番号３（Ｖａｇ）、配列番号３７（ｆｒｅｄ）及び配列番号３８（ｂａｄ）からなる群から選択されるか、又はアミノ酸配列が配列番号１（Ｍａｒｃ）、配列番号２（Ｎｅｃ）、配列番号３（Ｖａｇ）、配列番号４２（ｆｒｅｄ）若しくは配列番号４３（ｂａｄ）と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％若しくは少なくとも９０％同一であるその機能的相同体である、請求項１～８のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
10. 微生物細胞、例えばエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、請求項１～９のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
11. Ｐｌａｃプロモーター、ＰｍｇｌＢプロモーター及びＰｇｌｐプロモーター、例えばＰｇｌｐＦ、又はこれらの任意のバリアントからなるプロモーター核配列の群から選択される異種、組換え及び／又は合成調節エレメントをさらに含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
12. 前記α－１，２－フコシルトランスフェラーゼの発現の調節のための調節エレメントは、ＰｇｌｐＦ又はそのバリアントであるプロモーター核配列を含む、請求項１１に記載の遺伝子改変細胞。
13. 前記α－１，３－フコシルトランスフェラーゼの発現の調節のための調節エレメントは、ＰｍｇｌＢ又はそのバリアントであるプロモーター核配列を含む、請求項１１又は１２に記載の遺伝子改変細胞。
14. １種以上のＨＭＯを生産する方法であって、生産される前記ＨＭＯは主にジフコシルラクトース（ＤＦＬ）であり、前記方法は、
    （ｉ）請求項１～１３のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞を提供する工程；
    （ｉｉ）（ｉ）による前記細胞を好適な細胞培養培地で培養して、前記ＨＭＯを生成する工程；及び
    （ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において生成された１種以上のＨＭＯを回収する工程
    を含む方法。
15. 前記遺伝子改変細胞が前記組換えＭＦＳ輸送体タンパク質を発現しないことによって工程（ｉ）の前記細胞と異なる同じ方法と比較して、少なくとも５重量％多くＤＦＬを生産する、請求項１４に記載の方法。
16. 前記細胞において産生されるＨＭＯの総量の最大４５％、例えば最大３０重量％は、３－フコシルラクトース（３ＦＬ）及び／又は２’－フコシルラクトース（２’ＦＬ）である、請求項１４又は１５に記載の方法。
17. 工程（ｉｉ）における前記細胞の培養は、低ラクトース条件、例えば、培養培地１ｌ当たりラクトース５ｇ未満の条件で行われる、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の方法。
18. １種以上のＨＭＯを生産するための、請求項１～１７のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞の使用であって、生産される前記ＨＭＯは主にジフコシルラクトース（ＤＦＬ）である使用。
19. 配列番号３８と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％同一であり、以下の置換、Ｓ４６Ｆ、Ａ１２８Ｎ、Ｈ１２９Ｅ、Ｙ１３２Ｉ、Ｄ１４８Ｇ及びＹ２２１Ｃを含むか又はそれらからなるアミノ酸配列を有する１，３－フスコシルトランスフェラーゼ。
20. 前記アミノ酸配列は、配列番号３９を含むか又はそれからなる、請求項１９に記載の１，３－フスコシルトランスフェラーゼ。

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