KR101747701B1

KR101747701B1 - 재조합 덱스트란슈크라제 발현 벡터 및 이 덱스트란슈크라제를 이용한 파노오스의 제조 방법

Info

Publication number: KR101747701B1
Application number: KR1020160022380A
Authority: KR
Inventors: 유환구; 김준수; 지대민
Original assignee: (주)비씨알엠
Priority date: 2016-02-25
Filing date: 2016-02-25
Publication date: 2017-06-28

Abstract

본 발명은 당 전이 효소의 일종인 덱스트란슈크라제(Dextransucrase)을 생산하고, 덱스트란슈크라제의 효소 반응을 통하여 삼탄당의 일종인 파노오스(Panose)을 합성하는 파노오스 제조 방법에 관한 것으로, 상세하게는 분자생물학 기법을 활용하여 대장균에서 다량 발현이 가능하고 정제 과정이 용이한 덱스트란슈크라제의 발현 벡터를 구축하고, 이를 대장균에서 형질 전환하여 다량의 덱스트란슈크라제를 생산하며, 설탕(Sucrose) 및 맥아당(maltose)을 기질로 재조합 덱스트란슈크라제의 효소 반응을 통하여 삼탄당의 일종인 파노오스를 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

재조합 덱스트란슈크라제 발현 벡터 및 이 덱스트란슈크라제를 이용한 파노오스의 제조 방법{manufacturing method of panose using recombination dextransucrase}

본 발명은 파노오스 제조 방법에 관한 것으로, 상세하게는 당 전이 효소의 일종인 덱스트란슈크라제(Dextransucrase)을 생산하고, 덱스트란슈크라제의 효소 반응을 통하여 삼탄당의 일종인 파노오스(Panose)을 합성하는 파노오스 제조 방법에 관한 것이다.

더욱 상세하게 본 발명은 분자생물학 기법을 활용하여 대장균에서 다량 발현이 가능하고 정제 과정이 용이한 덱스트란슈크라제의 발현 벡터를 구축하고, 이를 대장균에서 형질 전환하여 다량의 덱스트란슈크라제를 생산하며, 설탕(Sucrose) 및 맥아당(maltose)을 기질로 재조합 덱스트란슈크라제의 효소 반응을 통하여 삼탄당의 일종인 파노오스를 생산하는 방법에 관한 것이다.

파노오스는 맥아당(maltose) 및 이소말토오스(isomaltose)에서 포도당 분자가 α-(1,4), α-(1,6) 결합으로 형성된 삼탄당의 일종으로, 플루란(Pululan)의 선구체임과 동시에, 가장 작은 구성 단위체로 인체에 무해한 다당류이며 화장품, 식품 분야로 적용이 가능한 기능성 삼당류의 일종이다.

이러한 파노오스를 이용한 식품 제조에 기술의 예로 특허문헌 1내지 3이 있다.

특허문헌 1은 전분액화액을 제조하여 이 액화액을 130℃로 열처리하여 알파-아밀레이스를 실활한 다음 베타-아밀레이스, 분지효소인 풀루란아제(Pullulanase(E.C.3.2.1.41))를 첨가하여 전분을 말토스, 말토트리오스 등의 올리고당 형태로 전환하고, 이 당화액에 알파-아밀레이스와 트랜스글루코시다제(Transglucosidase)을 병용처리함으로써 트랜스글루코시다제의 생산성을 향상시킬 수 있게 한 분지옹리고당 제조 방법에 관한 것이고,

특허문헌 2는 올리고당 10∼80중량%, 발포제 성분 0.3∼10중량% 및 중화제 성분 0.9∼30중량%을 함유하고, 발포성 츄어블 정 형태를 가지는 것을 특징으로 하는 올리고당 보급 조성물이고,

특허문헌 3은 류코노스톡 시트리움(Leuconostoc citreum) Cares-1(미생물 기탁번호 KACC91931P) 및 이를 포함하는 고추장에 관한 것이다.

이렇게 다양한 음식의 원료로 사용되는 파노오스는 일부 미생물이나 식물에서 극소량만 존재하며, 대부분 풀루란(Pullulan) 중합체를 네오풀루라나아제(Neopullulanase) 등과 같은 당 분해 효소로 절단하여 생산하거나 또는 말토오스 등을 기질로 사용하여 효소 반응으로 합성할 수 있어 제조에 한계가 있다.

즉, 기존 파노오스의 생산 방법은 플루란 등의 다당류를 네오풀루라나아제 등과 같은 당 분해 효소로 가수분해하여 분리하지만 네오풀루라나아제가 목표 생성물인 파노오스 또한 기질로 작용할 수 있어 파노오스를 맥아당 혹은 포도당으로 분해되기 때문에 반응 후 불필요한 부산물이 생성될 뿐만 아니라 파노오스 생산 효율이 극단적으로 낮아지는 단점이 존재한다.

한편, 덱스트란슈크라제(Dextransucrase,EC:2.4.1.5)는 싸이클로덱스트린 당부가효소(cyclomaltodextrin glucanotransferase, CGTase)이나 α-글루코시다아제(α-glucosidase)와 같은 당전이 효소 중 하나로, 포도당 단위가 α-(1,6)으로 연결된 다당인 덱스트란을 합성하는 효소이며, 유래하는 미생물에 따라서 생성되는 덱스트란의 가지 비율 및 길이가 달라진다.

덱스트란슈크라제는 1,016개의 아미노산으로 구성되어 있고, 110,344 kDa이며, 대장균에서 발현 시 수용성 단백질 형태로 발현되어 재접합 과정이 필요없다.

이렇게 재접합 과정이 필요없는 덱스트란슈크라제를 이용한 파노오스 제조 방법이 개발되지 않았다.

1. 대한민국 등록특허 제10-0144642호(판노스를 주성분으로하는 분지올리고당의 제조방법) 2. 대한민국 등록특허 제10-0615507호(올리고당 보급 조성물) 3. 대한민국 공개특허 제10-2015-0124649호(난분해성 올리고당이 생성되는 고추장 제조방법)

본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하고자 개발된 것으로, 파노오스의 제조 효율을 높인 덱스트란슈크라제를 이용한 파노오스의 제조 방법를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 단일 물질로 정제한 덱스트란슈크라제를 파노오스 효소 합성의 촉매제로 이용하여 파노오스를 제조하는 덱스트란슈크라제를 이용한 파노오스의 제조 방법를 제공하는 것을 목적으로 한다.

이러한 목적을 이루기 위한 본 발명에 따른 재조합 덱스트란슈크라제 발현 벡터는 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 유래의 덱스트란슈크라제 유전자 및 분비 신호 펩타이드(secretion signal peptide)-코딩 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 분비 신호 펩타이드-코딩 염기서열은 첨부된 염기서열목록의 서열번호 1의 염기서열로 표시될 수 있고, 상기 덱스트란 슈크라제 유전자의 N-말단에 연결된다.

다른 일 양상에 따른 재조합 덱스트란슈크라제 발현 벡터는 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 유래의 덱스트란슈크라제 유전자 및 주변세포질 발현(periplasmic expression)이 가능한 신호 펩타이드 에코틴(Ecotin)-코딩 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 에코틴-코딩 염기서열은 첨부된 염기서열목록의 서열번호 2의 에코틴-코딩 염기서열의 3'-말단에 덱스트란슈크라제 유전자가 결합한 염기서열로 표시되고, 상기 덱스트란 슈크라제 유전자의 N-말단에 연결된다.

본 발명의 다른 일 양상에 따른 덱스트란슈크라제를 이용한 파노오스의 제조 방법은 덱스트란슈크라제 발현 벡터를 숙주미생물에 형질전환시킨 형질전환체를 이용한 파노오스 제조 방법에 관한 것으로, 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides)의 gDNA를 주형 DNA로 사용하는 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction)을 실행하여 덱스트란슈크라제 유전자(dsrS)를 획득하는 유전자 획득 단계; pRSET_A(invitrogen 사, USA) 벡터의 N-말단에 신호펩티드 에코틴이 결합된 벡터인 pESET_A를 제한효소로 처리하고, DNA 단편 정제 키트로 정제한 후 절단된 pESET_A 벡터와 삽입 DNA를 1 : 1 비율로 혼합하고, T4 DNA 리가아제 반응을 통하여 pRSET_A를 구하고, 이 pRSET_A와 덱스트란슈크라제 유전자(dsrS)가 봉합된 재조합 벡터(pEDss)를 구축하는 단계; 재조합 벡터 구축 단계에서 반응 완료된 반응물을 대장균인 DH5α에 형질전환(transformation)시키는 단계; 형질전환체를 항생제인 엠피실린(ampicillin)이 포함된 SOB고체배지에 배양 하는 배양단계; 배양된 형질전환체의 콜로니를 취하여 엠피실린이 포함된 TB배지(TB broth, 1% 트립톤, 2% 효모추출물, 0.4% 글리세롤(glycerol))에 접종하고, 30~40℃에서 13~20시간 동안 배양한 후, 배양이 완료된 균주는 다시 덱스트란슈크라제 전용 발현 배지에 1 : 40~60 비율로 본 배양하며, 400~600nm에서 흡광도가 0.5~0.7이 될 때까지 배양하며, 최종농도가 0.1~0.3mM이 되도록 IPTG (isopropyl 1-thio-β-D-galactoside)를 첨가하고 19~25℃에서 15~20시간 동안 발현시키는 발현단계; 발현이 완료된 형질전환체를 4,500~6,500 rpm에서 10~20분 동안 원심분리하여 분비 단백질이 포함된 배양액은 따로 보관하고 균주만을 수획하였으며, 삽투압 충격법을 통해 주변세포질 발현(periplasmic expression)된 재조합 덱스트란슈크라제를 추출하는 단계; Ni-NTA를 이용한 친화성 크로마토그래피를 실시하여 N-말단에 6개의 히스티딘(Histidine)이 융합된 덱스트란슈크라제 단백질을 단일물질로 정제하는 정제단계; 정제된 재조합 덱스트란슈크라제를 혼합한 촉매제를 이용하여 파노오스 효소 합성를 합성하는 합성단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 SOB고체배지는 2% 트립톤(tryptone), 0.5% 효모추출물(yeast extract), 0.05% 염화나트륨(NaCl), 1.5% 한천(agar), 2.5mM 염화칼륨(KCl), 20mM 황산마그네슘(MgSO4)로 이루어지고, 상기 제한요소는 Xho I과 Kpn I이며, 상기 배양액은 1% 트립톤, 2% 효모추출물, 0.4% 글리세롤(glycerol)로 이루어지며, 덱스트란슈크라제 전용 발현 배지는 1% 트립톤, 2.5% 효모추출물, 1% 글리세롤(glycerol), 0.4% 설탕(sucrose)으로 이루어질 수 있다.

또한 상기 파노오스 합성단계에서 사용되는 촉매제는 중량비율로 100~120의 50mM 초산나트륨버퍼(Sodium acetate buffer)와 1 mM 염화칼슘(CaCl₂) 혼합액, 2~7의 맥아당, 1~3의 설탕을 혼합하여 만들어지고, 촉매제에 재조합 덱스트란슈크라제를 10 Unit 첨가하여 25~29℃에서 3~5시간 동안 반응시킨 후, 반응물에 추가로 설탕을 1~3 첨가한 후 다시 25~29℃에서 3~6시간 동안 반응시킬 수 있다.

또한 덱스트란슈크라제 발현 벡터는 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 유래의 덱스트란슈크라제 유전자 및 분비 신호 펩타이드(secretion signal peptide)-코딩 염기서열을 포함하거나, 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 유래의 덱스트란슈크라제 유전자 및 주변세포질 발현(periplasmic expression)이 가능한 신호 펩타이드 에코틴(Ecotin)-코딩 염기서열을 포함한다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 재조합 덱스트란슈크라제 발현 벡터와 이를 이용하여 파노오스를 제조하는 방법은 종래의 파노오스 제조 방법보다 합성 수율을 높일 수 있는 효과가 있다.

즉, 본 발명은 종래의 플루란을 네오풀루라나아제의 효소 반응으로 가수분해하여 파노오스를 획득하는 공정과 비교할 때 파노오스의 합성 수율이 월등하게 높아질 뿐만 아니라 포도당 부산물의 생성 가능성이 없어 고순도의 파노오스를 획득할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Recation) 과정을 통한 덱스트란슈크라제 유전자 증폭의 아가로스 겔 전기영동의 분석 결과 영상
도 2는 재조합 덱스트란슈크라제의 발현 확인을 위한 SDS-PAGE 분석 결과 영상
도 3은 재조합 덱스트란슈크라제의 효소 반응을 통한 파노오스 합성의 박층크로마토그래피 분석 결과 영상
도 5은 에코틴이 N말단에 포함된 덱스트란슈크라제의 재조합 발현벡터 모식도

본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

각 도면을 설명하면서 유사한 참조부호를 유사한 구성요소에 대해 사용하였다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

이하 본 발명의 바람직한 실시 예에 대하여, 첨부도면을 참조하여 상세하게 설명한다.

본 발명은 대장균에서 형질 전환하여 다량의 덱스트란슈크라제를 생산하며, 설탕 및 맥아당을 기질로 재조합 덱스트란슈크라제의 효소 반응을 통하여 파노오스를 보다 쉽고, 높은 수율로 제작할 수 있다.

이러한 본 발명에 따른 덱스트란슈크라제를 이용한 파노오스의 제조 방법은 상기한 바와 같이, 덱스트란슈크라제를 이용하고 있고, 이 덱스트란슈크라제 발현 벡터에 대하여 먼저 설명한다.

본 발명에 따른 재조합 덱스트란슈크라제 발현 벡터는 코딩 염기서열에 따라 두 가지로 분류될 수 있고, 그 하나는 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 유래의 덱스트란슈크라제 유전자 및 분비 신호 펩타이드(secretion signal peptide)-코딩 염기서열을 포함한다.

상기 분비 신호 펩타이드-코딩 염기서열은 첨부된 염기서열목록의 서열번호 1의 염기서열로 표시될 수 있다. 상기 분비 신호 펩타이드-코딩 염기서열은 상기 덱스트란 슈크라제 유전자의 N-말단에 연결된다.

이러한 본 발명의 재조합 덱스트란슈크라제 발현 벡터에 포함되는 염기서열은 종래의 염기서열과 동일한 것을 이에 대한 상세한 설명은 생략한다.

다른 하나의 재조합 덱스트란슈크라제 발현 벡터는 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 유래의 덱스트란슈크라제 유전자 및 주변세포질 발현(periplasmic expression)이 가능한 신호 펩타이드 에코틴(Ecotin)-코딩 염기서열을 포함하며, 상기 에코틴-코딩 염기서열은 첨부된 염기서열목록의 서열번호 2의 에코틴-코딩 염기서열의 3'-말단에 덱스트란슈크라제 유전자가 결합한 염기서열로 표시된다.

상기 에코틴-코딩 염기서열은 상기 덱스트란 슈크라제 유전자의 N-말단에 연결된다.

상기와 같은 덱스트란슈크라제 발현 벡터는 형질전환하여 사용되고, 재조합 덱스트란슈크라제 발현 벡터의 형질전환체는 숙주미생물에 형질전환시켜 만들어진다.

상기 숙주미생물은 대장균 BL21(DE3)을 사용할 수 있다.

상기와 같은 재조합 덱스트란슈크라제 발현 벡터 및 이를 형전전환한 형질전환체를 이용하여 덱스트란슈크라제를 이용한 파노오스의 제조 방법은 다음과 같다.

본 발명의 덱스트란슈크라제를 이용한 파노오스의 제조 방법은 덱스트란슈크라제 발현 벡터를 숙주미생물에 형질전환시킨 형질전환체를 이용한 파노오스 제조 방법에 관한 것으로, 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides)의 gDNA를 주형 DNA로 사용하는 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction)을 실행하여 덱스트란슈크라제 유전자(dsrS)를 획득하는 유전자 획득 단계; pRSET_A(invitrogen 사, USA) 벡터의 N-말단에 신호펩티드 에코틴이 결합된 벡터인 pESET를 제한효소로 처리하고, DNA 단편 정제 키트로 정제한 후 절단된 pESET 벡터와 삽입 DNA를 1 : 1 비율로 혼합하고, T4 DNA 리가아제 반응을 통하여 pRSET_A를 구하고, 이 pRSET_A와 덱스트란슈크라제 유전자(dsrS)가 봉합된 재조합 벡터(pEDss)를 구축하는 단계; 재조합 벡터 구축 단계에서 반응 완료된 반응물을 대장균인 DH5α에 형질전환(transformation)시키는 단계; 형질전환체를 항생제인 엠피실린(ampicillin)이 포함된 SOB고체배지에 배양 하는 배양단계; 배양된 형질전환체의 콜로니를 취하여 엠피실린이 포함된 TB배지(TB broth, 1% 트립톤, 2% 효모추출물, 0.4% 글리세롤(glycerol))에 접종하고, 30~40℃에서 13~20시간 동안 배양한 후, 배양이 완료된 균주는 다시 덱스트란슈크라제 전용 발현 배지에 1 : 40~60 비율로 본 배양하며, 400~600nm에서 흡광도가 0.5~0.7이 될 때까지 배양하며, 최종농도가 0.1~0.3mM이 되도록 IPTG (isopropyl 1-thio-β-D-galactoside)를 첨가하고 19~25℃에서 15~20시간 동안 발현시키는 발현단계; 발현이 완료된 형질전환체를 4,500~6,500 rpm에서 10~20분 동안 원심분리하여 분비 단백질이 포함된 배양액은 따로 보관하고 균주만을 수획하였으며, 삽투압 충격법을 통해 주변세포질 발현(periplasmic expression)된 재조합 덱스트란슈크라제를 추출하는 단계; Ni-NTA를 이용한 친화성 크로마토그래피를 실시하여 N-말단에 6개의 히스티딘(Histidine)이 융합된 덱스트란슈크라제 단백질을 단일물질로 정제하는 정제단계; 정제된 재조합 덱스트란슈크라제를 혼합한 촉매제를 이용하여 파노오스 효소 합성를 합성하는 합성단계를 포함한다.

상기와 같이 이루어지는 덱스트란슈크라제를 이용한 파노오스의 제조 방법에서 상기 SOB고체배지는 2% 트립톤(tryptone), 0.5% 효모추출물(yeast extract), 0.05% 염화나트륨(NaCl), 1.5% 한천(agar), 2.5mM 염화칼륨(KCl), 20mM 황산마그네슘(MgSO4)로 이루어지고, 상기 제한요소는 Xho I과 Kpn I이며, 상기 배양액은 1% 트립톤, 2% 효모추출물, 0.4% 글리세롤(glycerol)로 이루어지며, 덱스트란슈크라제 전용 발현 배지는 1% 트립톤, 2.5% 효모추출물, 1% 글리세롤(glycerol), 0.4% 설탕(sucrose)으로 이루어질 수 있다.

또한, 상기 파노오스 합성단계에서 사용되는 촉매제는 중량비율로 100~120의 50mM 초산나트륨버퍼(Sodium acetate buffer)와 1 mM 염화칼슘(CaCl₂) 혼합액, 2~7의 맥아당, 1~3의 설탕을 혼합하여 만들어지고, 촉매제에 재조합 덱스트란슈크라제를 10 Unit 첨가하여 25~29℃에서 3~5시간 동안 반응시킨 후, 반응물에 추가로 설탕을 1~3 첨가한 후 다시 25~29℃에서 3~6시간 동안 반응시켜 합성단계가 이루어질 수 있다.

상기 덱스트란슈크라제 발현 벡터는 전술한 바와 같이, 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 유래의 덱스트란슈크라제 유전자 및 분비 신호 펩타이드(secretion signal peptide)-코딩 염기서열을 포함하거나, 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 유래의 덱스트란슈크라제 유전자 및 주변세포질 발현(periplasmic expression)이 가능한 신호 펩타이드 에코틴(Ecotin)-코딩 염기서열을 포함한다.

이하, 본 발명에 따른 덱스트란슈크라제를 이용한 파노오스의 제조 방법 및 이에 사용되는 덱스트란슈크라제 발형 벡터의 일예에 대하여 상세하게 설명한다.

하기의 설명에서 용어는 출원인이 실험하는 과정에서 붙인 약칭으로 설명될 수 있다.

<실시예1>중합효소 연쇄 반응(PCR)을 통한 덱스트란슈크라제 유전자의 획득

류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides)의 gDNA를 주형 DNA로 사용하는 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction)을 실행하여 덱스트란슈크라제 유전자(dsrS)를 획득하였다.

류코노스톡 메센테로이데스를 0.3% 고기추출물(Beef Extract), 0.5% 펩톤(Peptone)으로 이루어진 뉴트리언트배지(Nutrient Broth)에 접종하고, 27℃에서 48 시간 배양하였으며, 배양된 류코노스톡 메센테로이데스을 스핀다운(spin down)하여 균주만을 획득하고, TE버퍼(TE buffer)으로 희석하여 특별한 용균(lysis) 과정 없이 시편DNA(Template DNA)로 사용하였다.

덱스트란슈크라제의 증폭을 위한 중합효소 연쇄 반응 과정은 태크 폴리머레이즈(Taq polymearse)를 이용하였고, 폴리머레이즈(polymerase) 0.5㎕ polymerase, 10x PCR buffer 5㎕, 2.5 mM dNTP 혼합물 5㎕, 10 nM/ul 정방향 프라이머(forward primer) 및 10 nM/ul 역방향 프라이머(revese primer)를 각각 1㎕, 주형은 2㎕를 넣은 PCR 반응용액이 50㎕가 되도록 증류수를 넣어 준 후 PCR을 수행하였다.

이때 정방향 프라이머로 pF프라이머를 사용하고, 역방향 프라이머로 pR프라이머를 사용하였고, PCR 반응 조건은 94℃에서 10분간 전변성(predenaturation)시키고, 94℃에서 30초, 52℃에서 30초, 72℃에서 3분 40초 조건으로 30회간 반복 반응하고 72℃에서 7분간 연장 반응을 유도하였다.

결과물은 아가로오스 젤(Agarose gel) 전기영동을 통하여 크기 및 농도를 분석하였으며, 그 결과 도 1에 도시한 바와 같이, 3,897bp의 류코노스톡 메센테로이데스 유래 덱스트란슈크라제 유전자가 증폭되었음을 확인할 수 있었다.

반응물 결과물은 추후 효소 반응을 위하여 DNA 단편 정제 키트로 정제하였다.

<실시예2>덱스트란슈크라제 유전자(dsrS)가 삽입된 재조합 발현 벡터의 구축

덱스트란슈크라제의 발현벡터 구축은 발현 양상에 맞춰 크게 3가지로 나누어 진행하였다.

1. 신호 펩티드가 존재하지 않는 덱스트란슈크라제 발현 벡터(cytoplasmic expression),

2. 분비 신호 펩티드가 덱스트란슈크라제의 N단말(N-terminal)에 부착된 덱스트란슈크라제 발현 벡터(secreted exression),

3. 에코틴(Ecotin)(세린계단백질가수분해효소억제제, serine protease inhibitor)가 덱스트란슈크라제의 N단말(N-terminal)에 부착된 덱스트란슈크라제 발현 벡터(periplasmic expression).

중합효소 연쇄 반응을 통해 증폭된 덱스트란슈크라제 유전자(dsrS)와 pRSET_A(invitrogen 사, USA) 벡터의 N-말단에 신호펩티드 에코틴이 결합된 벡터인 pESET를 제한효소인 Xho I과 Kpn I으로 처리하고, DNA 단편 정제 키트로 정제한 후 절단된 벡터와 삽입 DNA를 1 : 1 비율로 혼합하고, T4 DNA 리가아제(intron, korea) 반응을 통하여 pRSET_A와 덱스트란슈크라제 유전자(dsrS)가 봉합된 재조합 벡터를 구축하였다.

반응이 완료된 후 반응물을 대장균 DH5α에 형질전환하고, 항생제 엠피실린 (100 μg/ml)이 포함된 LB 고체배지에 배양하였다.

DNA 시퀸싱 분석을 통해 재조합 발현 벡터(pRDss)를 선별한 후 다시 대장균 BL21(DE3)에 형질전환하였다.

<실시예3> 재조합 덱스트란슈크라제 발현 벡터의 형질전환

구축한 재조합 덱스트란슈크라제 발현 벡터를 대장균인 DH5α에 형질전환(transformation)시킨 후, 항생제로 엠피실린(ampicillin)이 포함된 SOB 고체배지(2% tryptone, 0.5% yeast extract, 0.05% NaCl, 1.5% agar, 2.5mM KCl, 20mM MgSO4)에 배양하였다.

대장균 DH5α에 형질전환시킨 후 얻은 콜로니(colony)들로부터 재조합 덱스트란슈크라제 발현 벡터를 추출하여 클리닝 여부 확인 및 DNA 염기서열을 분석하였다.

재조합 덱스트란슈크라제 발현 벡터의 클로닝 여부 확인을 위해서 콜로니에서 분리한 재조합 덱스트란슈크라제 발현 벡터에 XhoⅠ과 Kpn Ⅰ 제한 효소를 처리한 후 전기 영동하여 덱스트란슈크라제와 pRSET_A 플라스미드 DNA가 분리되어 2개의 DNA 밴드가 나타나는 지를 확인하였다.

콜로니 스크리닝을 통해 올바르게 구축된 재조합 덱스트란슈크라제 발현 벡터(pRDss)를 선별하여 다시 대장균인 BL21(DE3)에 형질전환 시켜 형질전환체를 확보하였다.

비교예1 : 대장균으로부터 신호 펩티드가 부착되지 않은 재조합 덱스트란슈크라제의 발현

재조합 발현 벡터(pRDss)가 형질전환된 BL21(DE3)의 콜로니를 취하여 엠피실린이 포함된 TB 배지(1% tryptone, 2% yeast extract, 0.4% glycerol)에 접종하고, 37℃에서 16시간 동안 배양하였다.

배양이 완료된 균주는 다시 덱스트란슈크라제 전용 발현 배지(1% trypone, 2.5% yeast extract. 1% glycerol, 0.4% sucrose)에 1 : 50 비율로 본 배양하고, 600 nm에서 흡광도가 0.7이 될 때 까지 배양하였다.

최종농도가 0.2 mM이 되도록 IPTG (isopropyl 1-thio-β-D-galactoside)를 첨가하고 20℃에서 18시간 동안 발현을 시도하였다.

발현이 완료된 BL21(DE3)는 6,000 rpm에서 15분 동안 원심분리하여 균주를 수획하고, PBS(137 mM NaCl, 27 mM KCl, 10 mM NaHPO₄, 1.8 mM KH₂PO₄)로 균주를 세척한 후, 용균버퍼(lysis buffer)(50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, 2 % lysozyme, pH 8.0)로 현탁시키고, 믹서(Sonic dismembrator)을 사용하여 균주를 완전히 파쇄하였다.

파쇄된 균주는 다시 16,000rpm에서 30분 동안 원심 분리하여 수용성 단백질과 불용성 단백질을 분리한 후, 각각 SDS-PAGE 분석에 실시하였으며, 그 결과 도 2에 도시한 바와 같이, 덱스트란슈크라제의 발현 양상을 확인하였다.

분석하고자 하는 단백질 중 40ul을 취하여 5x SDS-PAGE 표본버퍼(sample buffer)(60 mM Tris-HCl(pH 6.8), 25% glycerol, 2% SDS, 14.4 mM 2-mercaptoethanol, 0.1% bromophenol blue)40㎕를 혼합하고, 끓는 물에 5분 동안 반응시켰으며, 이를 8% 아크릴아미드(Acrylamide) 겔에 전기 영동하여 덱스트란슈크라제의 발현을 확인하였다.

분석결과 수용성 단백질 샘플로부터 140 kDa에서 발현 단백질 밴드가 관찰되었으며 이를 통해 재조합 덱스트란슈크라제가 수용성 단백질 형태로 발현되었음을 알 수 있었다.

비교예2 : 대장균으로부터 재조합 덱스트란슈크라제의 세포 외 분비 발현

재조합 발현 벡터(pRDss)가 형질전환된 BL21(DE3)의 콜로니를 취하여 엠피실린이 포함된 TB배지(1% tryptone, 2% yeast extract, 0.4% glycerol)에 접종하고 37℃에서 16시간 동안 배양하였다.

이 후 최종농도가 0.2 mM이 되도록 IPTG(isopropyl 1-thio-β-D-galactoside)를 첨가하고 20℃에서 18시간 동안 발현을 시도하였다.

발현이 완료된 BL21(DE3)는 6,000 rpm에서 15분 동안 원심분리하여 분비 단백질이 포함된 배양액은 따로 보관하고, 균주만을 수획하여 용균버퍼(lysis buffer)(50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, 2 % lysozyme, pH 8.0)으로 현탁시키고, 믹서(Sonic dismembrator)을 사용하여 균주를 완전히 파쇄하였다.

이 후 파쇄된 균주와 미리 분주한 배양액을 40ul 취하여 5x SDS-PAGE 표본버퍼(sample buffer)(60 mM Tris-HCl(pH 6.8), 25% glycerol, 2% SDS, 14.4 mM 2-mercaptoethanol, 0.1% bromophenol blue) 10㎕를 혼합하고, 끓는 물에 5분 동안 반응시켰으며, 이를 8% 아크릴아미드(Acrylamide) 겔에 전기 영동하여 덱스트란슈크라제의 발현을 확인하였다.

발현 배양액으로부터 140 kDa 부근의 밴드(band)가 관찰된 것으로 볼 때 덱스트란슈크라제의 세포외 발현이 이루어 졌음을 알 수 있었으며, 또한 세포용해물(Cell lysate)에서도 동일한 크기의 단백질 크기가 관찰되었기에 100% 완전한 세포 외 분비 발현이 이루어 지지는 않은 것으로 확인되었다.

<실시예4> 대장균으로부터 재조합 덱스트란슈크라제의 세포질(Periplasmic) 발현

배양이 완료된 균주는 다시 덱스트란슈크라제 전용 발현 배지(1% trypone, 2.5% yeast extract. 1% glycerol, 0.4% sucrose)에 1 : 50 비율로 본 배양하고, 600nm에서 흡광도가 0.7이 될 때 까지 배양하였다.

이 후 최종농도가 0.2 mM이 되도록 IPTG (isopropyl 1-thio-β-D-galactoside)를 첨가하고 20℃에서 18시간 동안 발현을 시도하였다.

발현이 완료된 BL21(DE3)는 6,000 rpm에서 15분 동안 원심분리하여 분비 단백질이 포함된 배양액은 따로 보관하고 균주만을 수확하였으며, 삽투압 충격법을 통해 주변세포질 발현(periplasmic expression)된 재조합 덱스트란슈크라제를 추출하였다.

추출 과정은 획득한 균주를 설탕버퍼(Sucrose buffer)(50 mM Tris pH 7.4, 1 mM EDTA, 20% sucrose w/v)로 세척하고, 얼음에 10분 동안 교반(shaking)한 후, 다시 5 mM MgCl₂로 현탁시키고, 얼음에 10분 동안 교반시켜 저온 충격(cold shock) 방식으로 주변세포질 발현(periplasmic expression)된 재조합 덱스트란슈크라제를 방출시켰다.

재조합 덱스트란슈크라제의 세포내 발현을 알아보기 위하여 삼투압 처리가 끝난 균주를 용균버퍼(lysis buffer)(50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, 2 % lysozyme, pH 8.0)으로 현탁시키고 믹서(Sonic dismembrator)을 사용하여 균주를 완전히 파쇄하였다.

이 후 삽투압 충격을 통해 얻어낸 결과물과 파쇄된 균주를 40ul을 취하여 5x SDS-PAGE 표본버퍼(sample buffer)(60 mM Tris-HCl(pH 6.8), 25% glycerol, 2% SDS, 14.4 mM 2-mercaptoethanol, 0.1% bromophenol blue) 10㎕를 혼합하고 끓는 물에 5분 동안 반응시켰으며, 이를 8% 아크릴아미드(Acrylamide) 겔에 전기 영동하여 덱스트란슈크라제의 발현을 확인하였다. 세포질(Periplasmic) 처리물로부터 140 kDa 부근의 밴드(band)가 관찰되어 재조합 덱스트란슈크라제의 세포질 방현(Periplasmic expression)이 올바르게 이루어졌음을 알 수 있었다.

<실시예5> 친화성 크로마토그래피를 통한 재조합 덱스트란슈크라제 단백질의 정제

N-말단에 6개의 히스티딘(Histidine)이 융합된 덱스트란슈크라제 단백질을 단일물질로 정제하기 위하여 Ni-NTA를 이용한 친화성 크로마토그래피를 실시하였다.

Ni-NTA 수지가 충전된 컬럼에 10 배의 바인딩버퍼(binding buffer)(50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0)를 흘려보내 평형화하였고, 덱스트란슈크라제가 포함된 단백질 샘플을 로딩하였으며, 10배의 세척버퍼(washing buffer)(50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole, pH 8.0)를 통해 불순물을 완전히 제거하였다.

8배의 용출버퍼(elution buffer)(50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0)를 이용하여 목표 단백질을 용출하였으며, 피크가 나타나는 분획물을 회수하여 SDS-PAGE 분석을 실시하였다.

280 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 유속은 0.5 mL/min으로 하였다.

<실시예6> 재조합 덱스트란슈크라제를 이용한 파노오스의 합성

단일 물질로 정제한 덱스트란슈크라제를 파노오스 효소 합성의 촉매제로 사용하였다. 100 mL의 50 mM 초산나트륨버퍼(Sodium acetate buffer)(pH 5.2)와 1 mM CaCl_2,5 g의 맥아당, 2 g의 설탕을 혼합하고 재조합 덱스트란슈크라제를 10 Unit 첨가하여 27℃에서 반응하였다. 반응을 4시간 동안 진행 시킨 후 반응물에 추가로 설탕을 2 g 첨가한 후 다시 27℃에서 5시간 동안 반응하였다.

반응이 완료된 샘플은 각각 TLC(Thin Layer Chromatography)와 IR 분석을 실시하였다.

TLC분석은 고정상으로 C₁₈ 실리카겔을 사용하였으며, 75%의 아세토나이트릴(Acetonitrile)을 이동상으로 사용하였고, 전개가 완료된 플레이트(plate)는 5%의 황산이 포함된 메탄올 용액에 살짝 담구고, 121℃에서 5분 동안 반응시켜 점(spot)을 검출하였으며, 이를 통해 도 3에 도시한 바와 같이, 파노오스의 합성을 확인하였다.

HPLC(High Performance Liquid Chromatography) 분석은 이동상으로 80% 아세토나이트릴(Acetonitrile), 컬럼은 Kromasil NH₂, 검출기로는 RI detector를 사용하였다.

파노오스 표준품으로 머무름 시간을 비교 분석하여 정성 분석을 실시하고, 검량선을 작성하여 파노오스의 정량 분석 및 효소 반응의 수득률을 분석하였다.

분석 결과, 각각 5%의 맥아당 및 설탕을 효소 반응의 기질로 사용하여 약 4.2%의 파노오스 수득률을 나타내었다.

<110> BCRM <120> manufacturing method of panose using recombination dextransucrase} <130> J05757 <140> 10-2016-0022380 <141> 2016-02-25 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 3897 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 1 acacaacaag ttagcggcaa gtacgttgaa aaagacggta gttggtatta ttattttgat 60 gatggcaaaa atgctaaagg tttatcaacg atagacaaca atattcaata tttttacgag 120 agtggtaaac aagccaaagg acagtatgtc acaattgata atcaaacata ttattttgat 180 aagggctcag gtgatgagtt aactggtctg caaagcattg atgggaacat agttgctttt 240 aacgatgaag ggcaacaaat ttttaatcaa tattaccaat ctgaaaatgg tacaacatac 300 tactttgatg ataaaggaca cgctgctacc ggtattaaga atatcgaggg caaaaattat 360 tattttgata atcttgggca actaaaaaaa ggcttctctg gtgtgattga tggtcaaata 420 atgacatttg atcaggaaac agggcaagaa gtttctaaca caacttctga aataaaagaa 480 ggtttgacga ctcaaaacac ggattatagc gaacataatg cagcccacgg tacggatgct 540 gaggactttg aaaatattga cggctattta acagctagtt catggtatcg tccaacaggt 600 attttacgta acggaacaga ctgggaacct 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Claims

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류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 유래의 덱스트란슈크라제 유전자 및 주변세포질 발현(periplasmic expression)이 가능한 신호 펩타이드 에코틴(Ecotin)-코딩 염기서열을 포함하고,
상기 에코틴-코딩 염기서열의 3'-말단에 상기 덱스트란슈크라제 유전자가 결합한 염기서열은 염기서열목록의 서열번호 2로 표시되며,
에코틴이 상기 덱스트란 슈크라제의 N-말단에 위치하여 에코틴-덱스트란슈크라제의 융합 단백질의 발현을 유도하는 것을 특징으로 하는 재조합 덱스트란슈크라제 발현 벡터.
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제4항의 덱스트란슈크라제 발현 벡터를 숙주미생물에 형질전환시키고, 상기 숙주미생물은 대장균 BL21(DE3)인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
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류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 유래의 덱스트란슈크라제 유전자 및 주변세포질 발현(periplasmic expression)이 가능한 신호 펩타이드 에코틴(Ecotin)-코딩 염기서열을 포함하는 덱스트란슈크라제 발현 벡터를 숙주미생물에 형질전환시킨 형질전환체를 이용한 파노오스 제조 방법에 관한 것으로,
류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides)의 gDNA를 주형 DNA로 사용하는 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction)을 실행하여 덱스트란슈크라제 유전자(dsrS)를 획득하는 유전자 획득 단계;
pRSET_A(invitrogen 사, USA) 벡터의 멀티 콜로닝 사이트(multiple cloning site)에 신호펩티드 에코틴이 결합된 벡터인 pESET를 제한효소로 처리하고, DNA 단편 정제 키트로 정제한 후 절단된 pESET 벡터와 PCR을 통해 증폭한 덱스트란수크라제 유전자를 1 : 1(v/v) 비율로 혼합하고, T4 DNA 리가아제 반응을 통하여 pRSET_A벡터의 멀티 콜로닝 사이트에 덱스트란슈크라제 유전자(dsrS)와 에코틴 유전자(덱스트란수크라제 유전자의 5'에 위치)가 봉합된 재조합 벡터를 구축하는 단계 ;
재조합 벡터 구축 단계에서 반응 완료된 반응물을 대장균인 DH5α에 형질전환(transformation)시키는 단계;
형질전환체를 항생제인 엠피실린(ampicillin)이 포함된 SOB고체배지에 배양 하는 배양단계;
배양된 형질전환체의 콜로니를 취하여 엠피실린이 포함된 배양액에 접종하고, 37℃에서 16시간 동안 배양한 후, 배양이 완료된 균주는 다시 덱스트란슈크라제 전용 발현 배지에 본 배양하되 배양이 완료된 균주와 덱스트란슈크라제 전용 발현 배지의 비율이 1 : 50(v/v) 비율로 본 배양하며, 600nm에서 흡광도가 0.6이 될 때까지 배양하며, 최종농도가 0.1mM이 되도록 IPTG(isopropyl 1-thio-β-D-galactoside)를 첨가하고 25℃에서 18시간 동안 발현시키는 발현단계;
발현이 완료된 형질전환체를 4,500~6,500 rpm에서 10~20분 동안 원심분리하여 분비 단백질이 포함된 배양액은 따로 보관하고 균주만을 수획하였으며, 삽투압 충격법을 통해 주변세포질 발현(periplasmic expression)된 재조합 덱스트란슈크라제를 추출하는 단계;
Ni-NTA를 이용한 친화성 크로마토그래피를 실시하여 N-말단에 6개의 히스티딘(Histidine)이 융합된 덱스트란슈크라제 단백질을 단일물질로 정제하는 정제단계;
정제된 재조합 덱스트란슈크라제를 혼합한 촉매제를 이용하여 파노오스 효소를 합성하는 합성단계를 포함하며,
상기 SOB고체배지는 2% 트립톤(tryptone), 0.5% 효모추출물(yeast extract), 0.05% 염화나트륨(NaCl), 1.5% 한천(agar), 2.5mM 염화칼륨(KCl), 20mM 황산마그네슘(MgSO4)로 이루어지고, 상기 제한효소는 Xho I과 Kpn I이며, 상기 배양액은 1% 트립톤, 2% 효모추출물, 0.4% 글리세롤(glycerol)로 이루어지며, 덱스트란슈크라제 전용 발현 배지는 1% 트립톤, 2.5% 효모추출물, 1% 글리세롤(glycerol), 0.4% 설탕(sucrose)으로 이루어지고,
상기 파노오스 효소를 합성하는 합성단계에서 사용되는 촉매제는 중량비율로 100~120의 50mM 초산나트륨버퍼(Sodium acetate buffer)와 1 mM 염화칼슘(CaCl₂) 혼합액, 2~7의 맥아당, 1~3의 설탕을 혼합하여 만들어지고,
촉매제에 재조합 덱스트란슈크라제를 10 Unit 첨가하여 25~29℃에서 3~5시간 동안 반응시킨 후, 반응물에 추가로 설탕을 1~3 첨가한 후 다시 25~29℃에서 3~6시간 동안 반응시키는 것을 특징으로 하는 덱스트란슈크라제를 이용한 파노오스의 제조 방법.
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