ES2742382T3 - Beta-hexosil-transferasas y usos de las mismas - Google Patents

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Abstract

Un ADN aislado que codifica una proteína recombinante ß-hexosiltransferasa (rBHT) que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO. 12, 14 o 20, preferiblemente que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO. 12 o 14.

Description

DESCRIPCIÓN
P-hexosil-transferasas y usos de las mismas
1. Campo de la invención
Esta invención en general se refiere al descubrimiento de nuevas formas recombinantes de p-hexosil-transferasas (BHT) y sus usos para producir galacto-oligosacáridos (GOS).
2. Antecedentes de la invención
2.1. Introducción
La interacción compleja entre la dieta, la microbiota intestinal normal y el bienestar ha fomentado el desarrollo de estrategias para promover la proliferación selectiva de microorganismos beneficiosos en el tracto gastrointestinal de los humanos. Los probióticos son microorganismos que afectan positivamente la salud humana, a los que se les atribuye potentes propiedades antipatógenas y antiinflamatorias (27) (Tabla 1).
Tabla 1. Beneficios para la salud de los probióticos
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Además, años de investigación sobre la probiótica indican que prebióticos selectivos pueden promover una modificación selectiva de la microbiota intestinal y sus actividades bioquímicas asociadas. Osborn DA, Sinn JK. Prebiotics in infants for prevention of allergic disease and food hypersensitivity. Cochrane Database of Systematic Reviews, 2007. Los prebióticos son oligosacáridos no digeribles (NDO) que tienen una doble capacidad. Primero, reducen la eficiencia de la colonización intestinal de las bacterias dañinas y, en segundo lugar, actúan como sustrato selectivo para promover el crecimiento y, por lo tanto, aumentan el número de bacterias probióticas específicas.
Además, un número creciente de estudios demuestran que los probióticos funcionan mejor cuando se combinan con prebióticos. Mayer y otros. 2003 Research for creation of functional foods with Bifidobacteria. Acta Alimentaria 3227-39. Esta forma combinada de suministro se conoce como simbiosis. Gibson GR, Roberfroid MB. 1995 Dietary Modulation of the Human Colonic Microbiota - Introducing the Concept of Prebiotics. Journal of Nutrition 125:1401-12.
Los galacto-oligosacáridos (GOS) se consideran una de las opciones preferidas de los prebióticos y en el tracto gastrointestinal, los GOS son resistentes a las enzimas y al tránsito a través del intestino delgado sin ser digeridos, pero en el intestino grueso los GOS se fermentan y pueden activar el crecimiento de bifidobacterias intestinales como Lactobacillus acidophilus y L. casei, por lo tanto, actúan como un prebiótico (26, 27, 37).
Los GOS son oligosacáridos no digeribles debido a la conformación de su átomo de carbono anomérico (C1 o C2), lo cual permite que sus enlaces glucosídicos evadan la hidrólisis por enzimas digestivas en el estómago o el intestino delgado. Los oligosacáridos libres se encuentran en la leche de todos los mamíferos placentarios, y proporcionan un ejemplo natural de alimentación prebiótica durante la infancia. De acuerdo con la última definición de la Asociación Científica Internacional de Probióticos y Prebióticos (ISAPP) "un prebiótico dietético es un ingrediente selectivamente fermentado que produce cambios específicos en la composición y/o la actividad de la microbiota gastrointestinal, lo que confiere beneficios a la salud del hospedero"(30). La composición de los oligosacáridos de la leche humana (HMO) es muy compleja, lo cual hace que sea poco probable encontrar fuentes alternativas que contengan oligosacáridos de composición análoga. La mejora de la salud del colon entre los lactantes amamantados se atribuye a la presencia de GOS en la leche materna (2). De hecho, la fórmula infantil con GOS agregado replica el efecto bifidogénico de la leche humana con respecto a la actividad metabólica de la microbiota del colon y el número de bacterias (6,21). Entre los oligosacáridos no lácteos, los GOS son de especial interés ya que su estructura se asemeja a las moléculas centrales de los HMO (3). Sin embargo, la concentración y composición de los GOS varía con el método y la enzima utilizada para su generación, lo que a su vez puede influir en sus efectos prebióticos y la proliferación de cepas probióticas del colon (29). Tradicionalmente, los GOS se han producido utilizando p-galactosidasas de microorganismos mesofílicos. Las p-galactosidasas mesofílicas requieren altas concentraciones iniciales de lactosa para alejar la reacción de la hidrólisis de lactosa y dirigirla a la síntesis de GOS. Como la lactosa es más soluble a temperaturas elevadas, se han utilizado p-galactosidasas termoestables que exhiben altas velocidades iniciales y vida media aumentada para alcanzar un equilibrio favorable para la reacción de transgalactosilación (27,37). Sin embargo, la inhibición competitiva por glucosa y/o galactosa es otro obstáculo que queda el cual se puede superar incorporando células en la reacción (16,20,25,27,35).
La levadura basidiomiceto Sporobolomyces singularis (antiguamente denominada Bullera singularis) no puede utilizar galactosa para crecer, pero prolifera en lactosa debido a la actividad de su p-hexosil-transferasa (BHT, EC 3.2.1.21). Los estudios han demostrado que la BHT tiene actividad de transgalactosilación incluso a bajas concentraciones de lactosa e hidrólisis de lactosa muy limitada. Además, la enzima no parece estar inhibida por concentraciones de lactosa superiores al 20% y tiene el potencial de conversión en GOS cercano al máximo teórico del 75% (1,9,10,28). A diferencia de las pgalactosidasas, la BHT de S. singularis lleva a cabo simultáneamente actividades de glicosilhidrolasa y phexosiltransferasa, convirtiendo la lactosa en GOS sin acumulación extracelular de galactosa. Se requieren dos moléculas de lactosa durante el evento de transgalactosilación: una molécula se hidroliza y la segunda actúa como aceptor de galactosa, generando el trisacárido galactosil-lactosa (p-D-Gal(1-4)-p-D-Gal(1-4)-p-D-Glc) y glucosa residual. La galactosil-lactosa también puede actuar como aceptor de una nueva galactosa para generar el tetrasacárido galactosilgalactosil-lactosa (p-D-Gal(1-4)-p-D-Gal(1-4)-p-D-Gal(1-4)-p-D-Glc), y de manera similar para el tetrasacárido y los productos posteriores. Los tri, tetra y pentasacáridos que se acumulan en S. singularisse han designado colectivamente como GOS (9,10).
Para intereses prácticos, una BHT recombinante secretada podría tener varias ventajas sobre la enzima nativa, incluida la mejora de la producción y purificación a gran escala. Actualmente, la purificación de la enzima activa de S. singularis requiere de la lisis celular seguida de múltiples pasos de cromatografía (1,4,16). Los intentos anteriores de expresar la phexosil-transferasa recombinante en E. coli BL21 resultaron en altos niveles de producción, pero la enzima estaba inactiva e insoluble (16).
3. Resumen de la invención
En modalidades particulares no limitantes, la presente invención proporciona un ADN aislado que codifica una proteína recombinante de p-hexosiltransferasa (rBHT) que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEC ID NO. 12, 14 o 20. El ADN aislado que codifica la proteína recombinante p-hexosil-transferasa (rBHT) puede tener la secuencia de ácido nucleico establecida en la SEC ID NO. 11, 13 o 19.
La invención también proporciona una proteína p-hexosil-transferasa recombinante enzimáticamente activa (rBHT) en la que la proteína tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO. 12, 14 o 20. La proteína rBHT puede estar unida a la membrana o ser una enzima soluble.
La rBHT enzimáticamente activa que produce los GOS puede o no ser inhibida por galactosa.
La invención también proporciona un método para producir la proteína p-hexosil-transferasa recombinante enzimáticamente activa (rBHT) en una célula hospedera de levadura, lo cual comprende transformar la célula hospedera de levadura con un plásmido bajo el control de un promotor adecuado, en donde el plásmido contenga un ADN aislado que codifica para una proteína rBHT que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO. 12, 14 o 20.
El ADN aislado está unido a un ADN que codifica un péptido señal. El péptido señal es un péptido señal del factor a de S. cerevisiae y el promotor adecuado pueden ser un promotor de la alcohol oxidasa.
En algunas modalidades, la proteína rBHT enzimáticamente activa tiene una actividad específica de aproximadamente 8 U.mg-1 a 20°C.
La célula hospedera de levadura puede ser la célula de una levadura tal como Pichia pastoris.
La invención también proporciona un método para producir rBHT enzimáticamente activa que comprende además usar dicha rBHT en un método para producir galacto-oligosacáridos (GOS) el cual comprende hacer reaccionar la lactosa con una proteína p-hexosil-transferasa recombinante enzimáticamente activa (rBHT) que tiene la secuencia de aminoácidos establecido en SEQ ID NO. 2, 4, 6 , 8, 10, 12, 14, 16, 18 o 20 en condiciones adecuadas para producir los GOS.
La proteína rBHT enzimáticamente activa puede inmovilizarse sobre un soporte sólido. El soporte sólido puede estar en un reactor de tanque agitado continuo o discontinuo, un reactor de lecho empaquetado o un reactor de membrana de ultrafiltración. Alternativamente, la proteína rBHT enzimáticamente activa puede usarse directamente en un reactor de tanque agitado continuo o discontinuo, un reactor de lecho empaquetado o un reactor de membrana de ultrafiltración. El método puede comprender además un sistema de eliminación de glucosa para evitar la inhibición competitiva de la glucosa tal como un organismo generalmente reconocido como seguro (GRAS). El sistema de eliminación de glucosa puede usarse simultáneamente con la proteína rBHT enzimáticamente activa.
La invención también se dirige a un método para producir la rBHT enzimáticamente activa que comprende además usar dicha rBHT en un alimento o subproducto alimentario modificado que contiene lactosa que comprende una proteína recombinante de p-hexosiltransferasa (rBHT) que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 o 20. El alimento o subproducto alimentario que contiene lactosa puede ser un producto lácteo o un subproducto como el suero. En algunas modalidades, el alimento o subproducto alimentario es un postre para bebés, un jugo para bebés, una merienda para bebés, una bebida de yogur para bebés, una bebida energética, agua para hacer ejercicio o una bebida refrescante, un postre lácteo congelado, una bebida de frutas (vitaminas/minerales fortificados), un relleno de tarta de frutas, una preparación de frutas, una fórmula infantil, una bebida sustitutiva de comidas para bebés, una mermelada o gelatina, una bebida sustitutiva de comidas, una leche, una bebida a base de leche, un sustituto de leche, un saborizante de jarabe para leche, un yogurt o un suero de leche.
4. Breve descripción de las figuras
Figuras 1A-1C. Electroforesis en gel de rBHT purificada expresada en P. pastoris. (1A) SDS-PAGE de rBHT purificada, teñida con plata: Carril 1, 0.5 |jg de rBHT; carril 2, 0.1 |jg de rBHT. (1B) Análisis de la transferencia por Western con antisueros anti-rBHT. El carril M indica que las masas moleculares (kDa) de las proteínas marcadoras se muestran a la derecha del Panel A. (1C) Zimograma de la rBHT. Carril 1, la rBHT-6XHIS purificada expresada en cultivos BLR de E. coli; Carril 2, cultivo de metanol no transformado que induce GS115; Carril 3, cultivo de metanol que induce el recombinante GS115/rBHT. La actividad se visualizó mediante la formación de un precipitado azul resultante de la escisión enzimática de X-GAL.
Figura 2A-2D. Dependencia de la actividad relativa de rBHT del pH (2A). (2B) Temperaturas de 20°C a 80°C. (2C) Concentración de galactosa (círculo sólido) y glucosa (cuadrado sólido). (2D) Estabilidad térmica de 20°C a 50°C. Se extrajeron muestras cada 12 h y se analizó la actividad a 20°C. Los ensayos de actividad enzimática se realizaron en fosfato de sodio 50 mM (pH 5.0) que contenía ONP-Glu 1.3 mM a 20°C, excepto para (A) que usó tampones de fosfato de sodio (pH 5-11) o citrato (pH 2-5). Las actividades enzimáticas se calcularon en relación con el valor tomado en el tiempo cero (100%). La concentración inicial de enzima que se probó fue de 0.2 U.ml-1 ensayado a 20°C (Km=0.37 mM y Vmax=0.09 mM.min'1). Los datos representan las medias de dos experimentos con una fiabilidad de ±5%.
Figura 3. Síntesis de galactosil-lactosa a partir de lactosa (2%) usando rBHT parcialmente purificado (0.5 Ug_1 de lactosa) en 5 mM de tampón de fosfato de sodio a pH 5.0 incubado a 42°C. Las concentraciones de lactosa, glucosa, galactosa y galactosil-lactosa se muestran en g.l-1. Las especies de GOS residuales no cuantificadas se muestran como lecturas de intensidad de señal del detector de índice de refracción. Los datos representan las medias de dos experimentos con una fiabilidad de ±5%.
Figuras 4A-4B. Síntesis de galacto-oligosacáridos a partir de lactosa (20%) usando células en reposo de P. pastoris (que contienen la rBHT unida a la membrana a 0.5 U.g'1 de lactosa) en 5 mM de tampón de fosfato de sodio a pH 5.0 incubado a 42°C (4A) o 30°C (4B). Las concentraciones de lactosa, glucosa, galactosa y galactosil-lactosa se muestran en g.l-1. Las especies de GOS residuales no cuantificadas se muestran como lecturas de intensidad de señal del detector de índice de refracción. Los datos representan las medias de dos experimentos con una fiabilidad de ±5%.
Figura 5. Muestra una comparación de las actividades enzimáticas y los azúcares, incluidos los GOS producidos por la rBHT descrita en este documento (GOS NCSU) y dos enzimas disponibles comercialmente, Vivinal GOS y Oligomate 55NP de Yakalt Pharmaceuticals, Inc. a 30°C. Vea el procedimiento en la Sección 6.3.
Figuras 6A-6B. Gráfico de hidropatía de Kyte y Doolittle para BHT. Se amplificó la secuencia de aminoácidos para la secuencia de señal/anclaje de membrana predicha. El algoritmo de predicción de la región transmembrana (www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html) también pronosticó una región de residuos hidrofóbicos 1-17 en BHT típico para proteínas integrales que abarcan de membrana y el algoritmo SignalP (www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) predijo una posible secuencia de señal para los mismos residuos y el posible sitio de escisión entre los residuos 17 y 18 y entre 22 y 23. La secuencia de señal se retuvo en las construcciones 1, 2, 3, 4 y 7 para servir como un anclaje de membrana natural.
Figuras 7A-7C. Análisis de secuencia de BHT. (7A) Representación esquemática del polipéptido BHT de S. singularis determinado por el programa SMART basado en la web (http://smart.embl-heidelberg.de). El péptido líder representado por un cuadrado negro se determinó por el Programa Signal P. El segmento de baja complejidad de composición representado por un círculo negro se determinó por el programa SEG (http://mendel.imp.ac.at/METHODS/seg.server.html). Los resultados que solo se encuentran por BLAST están indicados por el dominio de glicohidrolasa. Los triángulos negros indican las posiciones de los tres supuestos sitios de N-glicosilación determinados por NetNGlyc 1.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/). (7B) Representación esquemática del péptido líder calculado por el método de predicción transmembrana RHYTHM. Se amplificó la secuencia de aminoácidos para la secuencia de anclaje de membrana predicha. Los aminoácidos de contacto con la membrana están en negrita mayúscula y el aminoácido de contacto de hélice está en mayúscula y subrayado. También se indican las posiciones de las regiones citoplasmáticas y extracelulares predichas. Las flechas indican los posibles sitios de escisión. (7C) Gráfico de hidropatía. El gráfico se generó usando el método Kyte-Doolittle para calcular la hidrofilia en una longitud de pantalla de nueve aminoácidos. El número de aminoácidos se muestra debajo del eje X. El cero en el eje Y separa los aminoácidos hidrofóbicos e hidrofílicos.
Figuras 8A-8D. Concentración de proteína secretada por cada cepa de P. pastoris recombinante. Las representaciones gráficas de cepas recombinantes que contienen rBht y scFv13R4 se muestran a la izquierda (8A) y a la derecha (8D) de los gráficos, respectivamente. (8B) rBHT-SU secretada. (8C) scFv13R4-HIS secretado. Los valores de proteína secretada se normalizaron para una OD600 y representó la media ± SE. Las proteínas secretadas se analizaron a partir de las siguientes cepas recombinantes: (8A y 8B) fila 1, GS115::aMF-rBht((23-594)-H IS; fila 2, GS115::rBht-HIS; fila 3, GS115::rBht(23-594)-HIS; fila 4, GS115::aMF-rBht-HIS. (8C y 8D) fila 1, GS115::aMF-scFv13R4-HIS; fila 2, GS115::rBht0. 110)-scFv13R4-HIS; fila 3, GS115::rBht(23-110)-scFv13R4-HIS; fila 4, GS115::scFv13R4-HIS.
Figuras 9A-9C. La separación por SDS-PAGE (8%) y el Western blot revelaron un antisuero anti-His que mostró la rBHT-HIS secretada, asociada a células o purificada, expresada por diferentes recombinantes de la cepa GS115 de P. pastoris. (9A) Los extractos de proteínas libres de células (proteínas secretadas) generados por todos los recombinantes se concentraron 20 veces. (9B) Las proteínas asociadas a células se obtuvieron de cinco OD600 de células recombinantes disgregadas con perlas de vidrio en el tampón IX Laemmli. Carril 1, GS115::aMF-rBht-HIS; carril 2, GS115::aMF-rBht(23-594)-HIS; carril 3, GS115::rBht-HIS; carril 4, GS115::rBht(23-594)-HIS; y carril 5, control GS115. (9C) Tinción de plata de rBHT-HIS expresada por GS115::aMF-rBht(23-594)-HIS purificado mediante cromatografía de afinidad de níquel y resueltas en SDS-PAGE(8%). M indica carril marcador. Las masas moleculares (kDa) de las proteínas marcadoras se muestran a la izquierda de los paneles.
Figuras 10A-10B. Tiempo de síntesis de galactosil-lactosa usando la rBHT soluble o las células en reposo de P. pastoris que contienen la rBHT unida a la membrana (0.5 U rBHT.g'1 lactosa). (10A) Síntesis por la rBHT-HIS secretada, expresada por GS115::aMF-rBht(23-594)-HIS (línea continua) y la rBHT por GS115::aMF-rBht(23-594) (línea discontinua). (10B) La velocidad de síntesis de galactosil-lactosa por las células en reposo GS115::aMF-rBht(23-594)-HIS (cuadrado negro) y GS115::aMF-rBht(23-594) (cuadrado blanco). Los ensayos contenían 200 g.L'1de lactosa y enzima purificada o células en reposo de P. pastoris en 5 mM de tampón fosfato de sodio a pH 5.0 e incubado a 3ü°C. Las muestras se retiraron periódicamente y se analizaron por HPLc . Las concentraciones de lactosa, glucosa, galactosa y galactosil-lactosa se muestran en g.L-1. Las especies de GOS residuales no cuantificadas se muestran como lecturas de intensidad de señal del detector de índice de refracción. Los datos representan las medias de dos experimentos independientes.
5. Descripción detallada de la invención
Esta invención informa varios métodos para la expresión de la BHTde S. singularis que incluye, entre otros, un método que utiliza un codón optimizado, el gen sintéticorBht (número JF29828 de acceso en GenBank) expresado en Pichia pastoris. Se investigó la cinética de la producción de GOS a partir de la lactosa por la p-hexosil-transferasa recombinante secretada (rBHT) en comparación con células en reposo de P. pastoris que contienen rBHT unido a la membrana.
Las "proteínas rBHT", como se entiende en el presente documento, incluye proteínas rBHT de longitud completa y fragmentos y/o variantes de las mismas, que incluye proteínas codificadas por variantes alélicas naturales del gen rBHT, así como proteínas rBHT producidas de forma recombinante, las cuales pueden contener algunos cambios de secuencia en relación con las proteínas rBHT naturales.
Una proteína "recombinante" es resultante del proceso de ingeniería genética. El término "ingeniería genética" se refiere a un método de ADN recombinante o ácido nucleico utilizado para crear una célula que expresa un gen a niveles elevados o bajos, o que expresa una forma mutante del gen. En otras palabras, la célula se transfecta, se transforma o se transduce con una molécula de polinucleótido recombinante, y por lo tanto se altera para hacer que la célula modifique la expresión de un polipéptido deseado.
El "galacto-oligosacárido" o "GOS" es un polisacárido que contiene galactosa con dos o más unidades de azúcar como Gal-Gal o [Gal]n-Glc (1 < n < 8), incluyendo p-D-Gal(1^4)-p-D-Gal(1^4)-p-D-Glc, p-D-Gal(1^4)- p-D-Gal (1^4)-p-D-Gal(1^4)-p-D-Glc, y p-D-Gal(1^4)-p-D-Gal(1^4) -p-D-Gal(1^4)-p-D-Gal(1^4)-p-D-Glc.
5.1 Secuencias señales:
Las proteínas secretadas solubles y las proteínas expresadas en la superficie celular a menudo contienen una "secuencia señal" N-terminal, la cual es una secuencia hidrofóbica que media la inserción de la proteína a través de la membrana al unir el retículo endoplásmico (ER) en una célula eucariota. Las proteínas transmembrana de tipo 1 también comprenden secuencias señales. Las "secuencias señales", como se entiende en el presente documento, son secuencias hidrófobas aminoterminales que por lo general se eliminan enzimáticamente después de la inserción de una parte o toda la proteína a través de la membrana del ER en el lumen de este. Por lo tanto, se sabe en la técnica que una secuencia señal puede estar presente como parte de la forma precursora de una proteína transmembrana o secretada, pero generalmente estará ausente de la forma madura de la proteína. Cuando se dice que una proteína comprende una secuencia señal, debe entenderse que, aunque una forma precursora de la proteína contiene la secuencia señal, una forma madura de la proteína probablemente no contendrá la secuencia señal. Las secuencias señales pueden contener un residuo inmediatamente anterior al sitio de escisión (posición -1) y otro residuo en la posición -3, los cuales son importantes para esta escisión enzimática. Nielsen y otros. 1997 Protein Eng 10 (1) 1-6; von Heijne 1983 Eur J Biochem 133 (1) 7-21; von Heijne 1985 J Mol Biol 18499-105, los cuales describen secuencias señales y cómo identificarlas. Las secuencias de señales se pueden identificar como describe Nielsen y otros. (supra). Los ejemplos de péptidos señales o secuencias que son funcionales en células hospederas de mamífero incluyen los siguientes: la secuencia señal del factor de apareamiento pre-pro-alfa de Saccharomyces cerevisiae, la secuencia señal de la interleucina-7 (IL-7) descrita en la Patente de E.U 4,965,195 : la secuencia señal del receptor de la interleucina-2 descrita en Cosman y otros. 1984 Nature 312768-771); el péptido señal del receptor de la interleucina-4 descrito en la Patente de EP 0367566 ; la secuencia señal del receptor de la interleucina-1 tipo 1 descrita en la Patente de E.U 4,968,607 ; el péptido señal del receptor de interleucina-1 tipo II descrito en la Patente de EP 0460846. Muchas otras secuencias señales se conocen en la técnica.
5.2. Proteína rBHT
La presente invención incluye versiones secretadas y solubles de rBHT, así como versiones que comprenden un dominio transmembrana que puede expresarse en una superficie celular. Estas proteínas pueden aislarse, es decir, ser parte de una preparación de proteína purificada en la que la proteína rBHT constituye al menos el 80% o el 90% de la proteína presente en la preparación. La invención incluye además proteínas rBHT codificadas por los ácidos nucleicos de rBHT descritos a continuación. Una proteína rBHT, como se entiende en el presente documento, incluye una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 12, 14 o 20. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 12, 14 o 20 incluyen una secuencia señal.
5.3. Sustituciones conservadoras
En algunos aspectos, las sustituciones pueden ser sustituciones conservadoras de aminoácidos. Los ejemplos de sustituciones conservadoras de aminoácidos, que probablemente no afecten la actividad biológica, incluyen los siguientes: alanina por serina, valina por isoleucina, aspartato por glutamato, treonina por serina, alanina por glicina, alanina por treonina, serina por asparagina, alanina por valina, serina por glicina, tirosina por fenilalanina, alanina por prolina, lisina por arginina, aspartato por asparagina, leucina por isoleucina, leucina por valina, alanina por glutamato, aspartato por glicina y estos cambios al revés. Ver por ejemplo Neurath y otros., The Proteins, Academic Press, Nueva York (1979) Además, un intercambio de un aminoácido por otro dentro del mismo grupo es una sustitución conservadora, donde los grupos son los siguientes: (1) alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, norleucina y fenilalanina: (2) histidina, arginina, lisina, glutamina y asparagina; (3) aspartato y glutamato; (4) serina, treonina, alanina, tirosina, fenilalanina, triptófano y cisteína; y (5) glicina, prolina y alanina.
5.4 Glicosilación
Las proteínas rBHT pueden estar glicosiladas en diversos grados o no glicosiladas. Como ilustración, una proteína rBHT de la invención puede comprender uno o más sitios de glicosilación de unión a N u O además de los que ya se encuentran en una proteína que comprende la SEQ ID NO. 12, 14 o 20. Un experto en la técnica es consciente de que los residuos de asparagina que forman parte de la secuencia Asn Xxx Ser/Thr (donde Xxx es cualquier aminoácido excepto prolina) pueden servir como sitios de adición para los N-glucanos. Además, hay muchos residuos de serina y treonina que pueden servir como sitios de glicosilación de unión a O. La glicosilación puede aumentar la vida media in vivo o alterar la actividad biológica. Las variantes de las proteínas rBHT también incluyen proteínas que comprenden uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez más sitios de glicosilación de unión a N y/u O que los presentes en la SEQ ID NO. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 o 20 siempre que la proteína resultante pueda actuar como una glicosil hidrolasa y una p-hexosiltransferasa. Las variantes de proteínas rBHT también incluyen aquellas que tienen uno, dos, tres, cuatro o cinco menos sitios de glicosilación de unión a N y/u O que los que están presentes en la SEQ ID NO. 12, 14 o 20 siempre que puedan actuar como una glicosil hidrolasa y una p-hexosil-transferasa.
Las proteínas rBHT, como se describe en el presente documento, pueden ser proteínas de fusión que comprenden al menos un polipéptido rBHT, que puede contener una secuencia de aminoácidos que sea una variante y/o un fragmento de la SEQ ID NO. 12, 14 o 20 (como se explicó anteriormente), y al menos otra porción. La otra porción también puede ser una porción no proteica tal como, por ejemplo, una porción de polietilenglicol (PEG) o una porción citotóxica, citostática, luminiscente y/o radiactiva. Se ha demostrado que la fijación de PEG aumenta la vida media in vivo de al menos algunas proteínas. Además, las porciones citotóxicas, citostáticas, luminiscentes y/o radiactivas se han fusionado con anticuerpos con fines de diagnóstico o terapéuticos.
Se puede fusionar una variedad de polipéptidos distintos de rBHT a un polipéptido rBHT para una variedad de propósitos tales como, por ejemplo, aumentar la vida media in vivo de la proteína, facilitar la identificación, el aislamiento y/o la purificación de la proteína, aumentar su actividad y promover su oligomerización.
Muchos polipéptidos pueden facilitar la identificación y/o purificación de la proteína de fusión recombinante de la cual forman parte. Los ejemplos incluyen poliarginina, polihistidina o HAT™ (Clontech), la cual es una secuencia natural de residuos de histidina no adyacentes que poseen una alta afinidad por los iones metálicos inmovilizados. Las proteínas rBHT que comprenden estos polipéptidos pueden purificarse mediante, por ejemplo, cromatografía de afinidad usando níquel inmovilizado o resina TALON ™ (Clontech), lo cual comprende toneladas de cobalto inmovilizado. Ver por ejemplo Knol y otros. 1996 J Biol Chem 27(26) 15358-15366. Los polipéptidos que comprenden poliarginina permiten una purificación efectiva por cromatografía de intercambio iónico. Otros polipéptidos útiles incluyen, por ejemplo, los péptidos de identificación antigénica descritos en laPatente de E.U 5,011,912 y en Hopp y otros. 1988 BiolTechnology 61204. Uno de estos péptidos es el péptido FLAG™, el cual es altamente antigénico y proporciona un epítopo unido reversiblemente por un anticuerpo monoclonal específico, lo que permite un análisis rápido y una purificación fácil de la proteína de fusión recombinante expresada. Un hibridoma murino designado 4E11 produce un anticuerpo monoclonal que se une al péptido FLAG en presencia de ciertos cationes metálicos divalentes, como se describe en la Patente de E.U 5,011,912. La línea celular de hibridoma 4E11 se identificó en American Type Culture Collection con el número de acceso HB 9259. Los anticuerpos monoclonales que se unen al péptido FLAG se pueden usar como reactivos de afinidad para recuperar un reactivo de purificación de polipéptidos que comprende el péptido FLAG. Otros marcadores de proteínas y reactivos de afinidad adecuados son: 1) los descritos en el sistema GST-Bind™ (Novagen), que utiliza la afinidad de las proteínas de fusión glutatión-S-transferasa por el glutatión inmovilizado; 2) los descritos en el kit de purificación de afinidad T7-TAG®, que utiliza la afinidad de los 11 aminoácidos aminoterminales de la proteína 10 del gen T7 por un anticuerpo monoclonal; o 3) los descritos en el sistema STREP-TAG® (Novagen), que utiliza la afinidad de una forma de estreptavidina diseñada por una proteína marcada. Algunas de las proteínas marcadas mencionadas anteriormente, así como otras, se describen en Sassenfeld 1990 TIBTECH 8: 88-93, Brewer y otros, en Purification and Analysis of Recombinant Proteins, págs. 239­ 266, Seetharam and Sharma (eds.), Marcel Dekker, Inc. (1991) y Brewer y Sassenfeld, en Protein Purification Applications, págs. 91 - 111, Harris y Angal (eds.), Press, Inc., Oxford Inglaterra (1990). Además, las fusiones de dos marcadores o más descritos anteriormente, tales como, por ejemplo, un marcador de fusión de una FLAG y un marcador de polihistidina, pueden fusionarse a una proteína rBHT de la invención.
5.5. Los ácidos nucleicos de rBHT
La invención abarca ácidos nucleicos aislados, que incluyen, por ejemplo, ADN y ARN, que codifican las proteínas rBHT descritas en el presente documento, que incluyen proteínas que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 12, 14 o 20. Preferentemente la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 12 o 14. Estos ácidos nucleicos son útiles para, entre otros, producir proteínas recombinantes que tengan glicosil hidrolasa y una actividad de p-hexosil-transferasa. Estos ácidos nucleicos pueden ser ADN genómico modificado o ADNc. Preferentemente, los ácidos nucleicos pueden comprender un marco de lectura abierto ininterrumpido que codifica una proteína rBHT. Las moléculas de ácido nucleico como se describen incluyen ADN y ARN tanto en forma monocatenaria como bicatenaria, así como las secuencias complementarias correspondientes. Un "ácido nucleico aislado" es, en el caso de los ácidos nucleicos aislados de fuentes naturales, uno que se ha separado de las secuencias genéticas adyacentes presentes en el genoma del organismo del que se aisló este ácido; en el caso de los ácidos nucleicos sintetizados químicamente, como los oligonucleótidos, o enzimáticamente a partir de una plantilla, como los productos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o los ADNc, se entiende que los ácidos nucleicos resultantes de tales procesos son aislados. Una molécula de ácido nucleico aislada se refiere a una molécula en forma de un fragmento separado o como un componente de una construcción de ácido nucleico más grande.
La presente invención también incluye ácidos nucleicos que comprenden la secuencia de SEQ ID NO. 11, 13, 19, o ácidos nucleicos que hibridan en condiciones moderadamente estrictas, y opcionalmente en condiciones altamente estrictas, a ácidos nucleicos que comprenden la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO 11, 13, 19, que es la secuencia del ADNc de rBHT de longitud completa, en donde el ácido nucleico codifica una proteína que puede actuar como una glicosil hidrolasa y una p-hexosil-transferasa. Las técnicas de hibridación son bien conocidas en la técnica y se describen mediante Sambrook, J., EF Fritsch y T. Maniatis (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, capítulos 9 y 11, 1989) y Current Protocols in Molecular Biology (FM Ausubel y otros., eds., John Wileyular (FM Ausubel et al., Eds., John Wiley & Sons, Inc., secciones 2.10 y 6.3-6.4 1995) Las condiciones moderadamente estrictas para las hibridaciones de filtro incluyen la hibridación en aproximadamente 50% de formamida, 6 x SSC a una temperatura de aproximadamente 42°C a 55° y el lavado a aproximadamente 60°C en 0.5 x SSC, 0.1% de SDS. Las condiciones altamente estrictas se definen como las condiciones de hibridación que se indicaron anteriormente, pero con lavado a aproximadamente 68°C en 0.2 x SSC, 0.1% de SDS. SSPE (1xSSPE es 0.15 M NaCI, 10 mM NaH2P04, y EDTA 1.26 mM, pH 7.4) se puede sustituir por SSC (1 xSSC es 0.15 M de NaCl y 15 mM de citrato de sodio) en los tampones de hibridación y lavado; los lavados, opcionalmente al menos dos lavados, se realizan durante 15 minutos después de que se completa la hibridación.
Debe entenderse que la temperatura y la concentración de sales del lavado pueden ajustarse de acuerdo con sea necesario para lograr un grado de rigurosidad deseado al aplicar los principios básicos que rigen las reacciones de hibridación y la estabilidad de los híbridos, como se conoce por los expertos en la técnica y se describe adicionalmente más abajo (ver, por ejemplo, Sambrook y otros., supra). Cuando los ácidos nucleicos de secuencia conocida se hibridan, la longitud del híbrido se puede determinar alineando las secuencias de los ácidos nucleicos (por ejemplo, usando GAP) e identificando la región o regiones complementarias de secuencia óptima. La temperatura de hibridación para los híbridos que se prevé que tenga menos de 50 pares de bases de longitud debe ser de 5°C a 10°C menor que la temperatura de fusión (Tm) del híbrido, donde la Tm se determina de acuerdo con las siguientes ecuaciones. Para híbridos de menos de 18 pares de bases de longitud, Tm (grados C) = 2(# de bases A T) 4 (# de bases G C). Para híbridos de más de 18 pares de bases de longitud, Tm (grados C) = 81.5 16.6(log1ü[Na+]) 0.41 (%G C) - (600 N), en donde N es el número de bases en el híbrido, y [Na+] es la concentración de iones de sodio en el tampón de hibridación. Cada uno de estos ácidos nucleicos hibridantes tiene una longitud que es de al menos 15 nucleótidos (o al menos 18, 20, 25, 30, 40, 50, o 100 nucleóticos). Sambrook y otros., supra.
Los ácidos nucleicos de rBHT incluyen ácidos nucleicos que comprenden los siguientes polinucleótidos: (1) toda o un fragmento de la SEQ ID NO. 11, 13, 19, en donde el fragmento codifica una proteína rBHT que puede actuar como una glicosil hidrolasa y una p-hexosil-transferasa; (2) un polinucleótido que incluye secuencias de nucleótidos al menos 97%, 98%, 99%, 99.5% o 99.7% idénticas a la SEQ ID n O. 11, 13, 19 en donde la secuencia codifica una proteína rBHT que puede actuar como una glicosil hidrolasa y una p-hexosil-transferasa; (3) un polinucleótido que comprende no más de 1, 2, 3, 4, 6 , 8, 10, 15, 20, 25 o 30 alteraciones de un solo nucleótido en relación con la SEQ ID NO. 11, 13, 19, en donde una alteración puede ser una inserción, deleción o sustitución de un solo nucleótido, y en donde el polinucleótido codifica una proteína rBHT que puede actuar como una glicosil hidrolasa y una p-hexosil-transferasa; y (4) un polinucleótido que codifica una proteína rBHT como se describe en el presente documento. En una modalidad preferida, la proteína rBHT se produce reemplazando la secuencia líder con un péptido señal de secreción heterólogo.
5.6. Métodos de síntesis de proteínas rBHT
Las proteínas rBHT pueden prepararse como sigue. Un ácido nucleico que codifica una proteína rBHT, como se describe en el presente documento, se puede introducir en un vector, que se puede introducir en una célula hospedera. La invención abarca los vectores y las células hospedera que comprenden ácidos nucleicos que codifican una proteína rBHT. La célula hospedera que contiene los ácidos nucleicos que codifican una proteína rBHT puede cultivarse en condiciones tales que la proteína rBHT pueda expresarse. La proteína rBHT expresada luego puede obtenerse del medio en el que se cultivan las células o de las células y purificarse por cualquiera de los numerosos métodos apropiados conocidos en la técnica. Además, los métodos de ingeniería genética para la producción de proteínas rBHT incluyen la expresión de las moléculas de polinucleótidos en sistemas de expresión libres de células, en hospedadores celulares, en tejidos y en modelos animales, de acuerdo con los métodos conocidos.
El vector puede incluir un marcador selectivo y un origen de replicación, para la propagación en un hospedero. El vector puede incluir además secuencias reguladoras transcripcionales o traduccionales adecuadas, tales como las derivadas de genes de mamíferos, microbianos, virales o de insectos, operativamente unidos al ácido nucleico que codifica la proteína rBHT. Los ejemplos de tales secuencias reguladoras incluyen promotores, operadores o potenciadores de la transcripción, sitios de unión a ARNm ribosómico y secuencias apropiadas que controlan la transcripción y la traducción. Las secuencias de nucleótidos se unen operativamente cuando la secuencia reguladora se relaciona funcionalmente con el ADN que codifica la proteína diana. Por lo tanto, una secuencia de nucleótidos del promotor se une operativamente a una secuencia nucleica de rBHT si la secuencia del promotor dirige la transcripción de la secuencia que codifica la proteína rBHT. Si la proteína rBHT es una proteína de fusión, una secuencia de ácido nucleico que codifica una porción de la proteína de fusión, por ejemplo, una secuencia señal, puede ser parte de un vector, y un ácido nucleico que codifica una proteína rBHT puede insertarse en el vector de manera que una proteína que comprende la secuencia señal añadida más la proteína rBHT está codificada por el vector.
Las células hospedera descritas para la expresión de proteínas rBHT incluyen células procariotas, de levadura, vegetales, de insectos y células eucariotas superiores. Las secuencias reguladoras en el vector se elegirán de manera que sean operables en la célula hospedera. Las células hospederas procariotas que se describen incluyen bacterias de los géneros Escherichia, Bacillus y Salmonella, así como miembros de los géneros Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus. Para la expresión en células procariotas, por ejemplo, en E. coli la molécula polinucleotídica que codifica una proteína rBHT incluye preferiblemente un residuo de metionina N-terminal para facilitar la expresión del polipéptido recombinante. La metionina N-terminal puede separarse opcionalmente del polipéptido expresado. Las células hospederas de levaduras adecuadas incluyen células de los géneros Saccharomyces, Pichia y Kluveromyces. Los hospederos de levadura que se prefieren son S. cerevisiae y P. pastoris. Un sistema adecuado para la expresión en una célula hospedera de insecto se describe, por ejemplo, en la revisión de Luckow y Summers (1988 BioTechnology 6 47-55) Las células hospederas de mamíferos descritas incluyen la línea celular de riñón de mono COS-7 (Gluzman y otros. 1981 Celda 23 175-182), células de riñón de hámster bebé (BHK), células de ovario de hámster chino (CHO) (Puck y otros. 1958 PNAS USA 60 1275­ 1281), CV-1 (Fischer y otros. 1970 Int J Cáncer 521-27), células de riñón humano 293 (American Type Culture Collection (ATCC®) catálogo no. CRL-10852 ™) y células de carcinoma cervical humano (HELA) (ATCC® c Cl 2).
Los vectores de expresión para uso en hospedadores celulares generalmente comprenden uno o más genes selectivos de marcadores fenotípicos. Estos genes codifican, por ejemplo, una proteína que confiere resistencia a los antibióticos o que suministra un requerimiento auxotrófico. Se dispone fácilmente de una amplia variedad de estos vectores de fuentes comerciales. Los ejemplos incluyen los vectores pGEM (Promega), los vectores pSPORT y pPROEX (InVitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA), los vectores Bluescript (Stratagene) y los vectores pQE (Qiagen). Los vectores de levadura a menudo contienen una secuencia de origen de replicación de un plásmido de levadura, una secuencia de replicación autónoma (ARS), una región promotora, secuencias de poliadenilación, secuencias de terminación de la transcripción y un gen marcador selectivo. También se pueden usar vectores replicables en levadura y en E. coli (denominados vectores lanzadera). Además de las características mencionadas anteriormente de los vectores de levadura, un vector lanzadera también incluye secuencias para la replicación y selección en E. coli. La secreción directa de los polipéptidos diana expresados en hospederos de levadura se logra mediante la inclusión de la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia líder del factor a de levadura en el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica la rBHT. Brake 1989 Biotechnology 13269-280.
Los ejemplos de vectores de expresión adecuados para usar en células hospederas de mamífero incluyen pcD A3.1 / Hygro (Invitrogen), pDC409 (McMahan y otros. 1991 EMBO J 10: 2821 -2832) y pSVL (Pharmacia Biotech). Los vectores de expresión para usar en células hospederas de mamífero pueden incluir secuencias de control transcripcional y traduccional derivadas de genomas virales.
Las secuencias promotoras y potenciadoras que se usan comúnmente para expresar el ARN de rBHT incluyen, entre otros, aquellas derivadas de citomegalovirus humano (CMV). Adenovirus 2, poliomavirus y virus del simio 40 (SV40). Los métodos para la construcción de vectores de expresión en mamíferos se describen, por ejemplo, en Okayama y Berg (1982 Mol Cell Biol 2: 161-170)), Cosman y otros. (1986 Mol Immunol 23: 935-941), Cosman y otros. (1984 Nature 312: 768-771), EP-A-0367566y WO 91/18982.
5.7. Marcadores de purificación
Además del marcador 6XHIS descrito en el presente documento, se pueden usar una variedad de métodos de purificación tales como marcadores de afinidad, marcadores antigénicos (por ejemplo, FLAG (Sigma-Aldrich, Hopp y otros. 1988 Nat Biotech 6: 1204-1210), hemaglutanina (HA) (Wilson y otros., 1984 Cell 37:767), Sistemas de expresión de fusión Intein (New England Biolabs, USA) Chong y otros. 1997 Gene 192 (2), 271-281o proteína de unión a maltosa (MBP), glutatión S transferasa (GST)/glutatión, poli His/Ni o Co (Gentz y otros., 1989 PNAS USA 86:821-824) ,. Las proteínas de fusión que contienen los marcadores GST en el extremo N de la proteína también se describen en U.S Pat. No. 5,654,176 (Smith). También se pueden usar técnicas de separación magnética tales como Strepavidin-DynaBeads® (Life Technologies, USA). Alternativamente, se pueden usar enlaces foto-escindibles, por ejemplo, U.S. Pat. No 7.595.198 (Olejnik & Rothchild) Muchos otros sistemas se conocen en la técnica y son adecuados para su uso con la presente invención.
5.8. Métodos de síntesis de galacto-oligosacáridos (GOS)
En una modalidad de la invención, los galacto-oligosacáridos (GOS) se producen incubando la célula que expresa la rBHT en un medio que contiene un sustrato disacárido tal como, por ejemplo, lactosa o celobiosa. En una modalidad, los GOS se produce a partir de lactosa simultáneamente con un sistema de eliminación de glucosa. El sistema de eliminación de glucosa puede ser un organismo generalmente reconocido como seguro (GRAS).
5.9. Formulaciones
Otro aspecto de la invención se refiere al uso de la proteína rBHT o de células que expresan la rBHT para producir un alimento o un suplemento dietético que contiene galacto-oligosacáridos (GOS). El alimento puede ser de consumo diario como el yogurt, el queso o los productos lácteos fermentados. La rBHT o la célula que expresa la rBHT puede agregarse en parte al alimento o a los suplementos dietéticos. La rBHT puede secarse usando Spray Dry; Un método rápido y suave para obtener incluso las cantidades más pequeñas de sustancias sensibles a la temperatura en forma de polvo. La rBHT seca también puede encapsularse usando la capacidad del secador por aerosol para recubrir partículas, inmovilizar material sólido en una matriz y fabricar microcápsulas (www.buchi.com/Mini_ Spray_Dryer_B-290.179.0.html). Se pueden usar otras aplicaciones de administración de fármacos que utilizan agentes y tecnologías encapsulantes GRAS funcionales. La tableta de rBHT seca y las formas en polvo pueden analizarse para determinar la tasa de actividad de la rBHT una vez rehidratada en un tampón que contiene lactosa y en productos lácteos.
Los ejemplos de los alimentos incluyen, entre otros, fórmula infantil, productos lácteos, bebidas y suplementos dietéticos. Ver la Tabla 2 a continuación.
Tabla 2.
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Cualquiera de las proteínas rBHT descritas anteriormente puede administrarse en forma de una composición, es decir, con uno o más componentes adicionales tales como un portador, excipiente o diluyente fisiológicamente aceptable. Por ejemplo, una composición puede comprender una proteína rBHT soluble como se describe en el presente documento más un tampón, un antioxidante como el ácido ascórbico, un polipéptido de bajo peso molecular (como los que tienen menos de 10 aminoácidos), una proteína, aminoácidos, carbohidratos tales como glucosa, sacarosa o dextrina, agentes quelantes como EDTA, glutatión y/u otros estabilizantes, excipientes y/o conservantes. La composición puede formularse como un líquido o un polvo liofilizado. Otros ejemplos de componentes que pueden emplearse en formulaciones farmacéuticas se presentan en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., (1980).
Las composiciones que comprenden las moléculas terapéuticas descritas anteriormente se pueden administrar por cualquier método apropiado que incluye, entre otros, la administración parenteral, tópica, oral, nasal, vaginal, rectal o pulmonar (por inhalación). Si se inyecta, la(s) composición(es) pueden administrarse por vía intraarticular, intravenosa, intraarterial, intramuscular, intraperitoneal o subcutánea mediante inyección en bolo o infusión continua. Se contempla la administración localizada, es decir, en el sitio de la enfermedad, así como el suministro transdérmico y la liberación sostenida por implantes, parches cutáneos o supositorios. La administración por inhalación incluye, por ejemplo, la inhalación nasal u oral, el uso de un nebulizador, la inhalación en forma de aerosol y similares. La administración a través de un supositorio insertado en una cavidad corporal se puede lograr, por ejemplo, insertando una forma sólida de la composición en una cavidad corporal elegida y permitiendo que se disuelva. Otras alternativas incluyen gotas para los ojos, preparaciones orales como pastillas, comprimidos, jarabes y goma de mascar, y preparaciones tópicas como lociones, geles, aerosoles y ungüentos. En la mayoría de los casos, las moléculas terapéuticas que son polipéptidos se pueden administrar por vía tópica o por inyección o inhalación.
Las moléculas terapéuticas descritas anteriormente se pueden administrar a cualquier dosis, frecuencia y duración que puedan ser efectivas para tratar la afección presente. La dosificación depende de la naturaleza molecular de la molécula terapéutica y de la naturaleza de la enfermedad que se está tratando. El tratamiento puede continuar por un periodo tan largo como sea necesario hasta lograr los resultados esperados. La periodicidad del tratamiento puede o no ser constante a lo largo de la duración del tratamiento. Por ejemplo, el tratamiento puede realizarse inicialmente a intervalos semanales y luego cada dos semanas. La invención abarca los tratamientos que tienen una duración de días, semanas, meses o años. El tratamiento puede suspenderse y luego reiniciarse.
Se pueden administrar dosis de mantenimiento después de un tratamiento inicial. La dosis puede medirse como miligramos por kilogramo de peso corporal (mg/kg) o como miligramos por metro cuadrado de superficie de la piel (mg/m2) o como una dosis fija, independientemente de la altura o el peso. Estas son unidades de dosificación estándar en la técnica. El área de la superficie de la piel de una persona se calcula a partir de su altura y peso utilizando una fórmula estándar. Por ejemplo, una proteína rBHT terapéutica puede administrarse a una dosis de aproximadamente 0.05 mg kg a aproximadamente 10 mg/kg, o de aproximadamente 0.1 mg/kg a aproximadamente 1.0 mg kg. Alternativamente, se puede administrar una dosis de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 500 mg. O una dosis de aproximadamente 5 mg, 10 mg. 15 mg 20 mg, 25 mg, 30 mg. 35 mg, 40, mg, 45, mg, 50 mg, 55 mg, 60 mg, 100 mg, 200 mg o 300 mg se pueden administrar.
Los artículos “un” y “una” se usan en la presente descripción para referirse a uno o más de uno (es decir, para al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A manera de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.
A través de esta descripción la palabra "comprender", o variaciones tales como "comprende" o "que comprende", se entiende que implica la inclusión de un elemento declarado, entero o por etapas, o un grupo de elementos, enteros o por etapas, pero no la exclusión de ningún otro elemento, entero o por etapa, o grupo de elementos, enteros o por etapas. La presente invención puede adecuadamente "comprender", "consistir en', o "consistir esencialmente en', los pasos, elementos y/o reactivos descritos en las reivindicaciones.
Los siguientes ejemplos son solamente para ilustrar adicionalmente la invención y no pretenden limitar el alcance de la invención que se define por las reivindicaciones.
6. EJEMPLOS
6.1. Materiales y Métodos
Diseño de un gen de codon p-hexosil-transferasa optimizado. La secuencia de codificación de ADN para el gen de la ¡3-hexosil-transferasa de S. singularis (16) (número de acceso de GenBank AB126324; 1.782 pb) se ensambló uniendo exones usando el software Clone Manager (Cary, NC). La secuencia de codificación se rediseñó en función de los codones preferidos deP. pastoris y E. coli, optimizados para la energía libre mínima (-619.9), los sitios de restricción específicos (5 'Ncol y 3' Notl) y el contenido de GC (48.89%). Esta versión rediseñada del gen se rotuló comorBht (Número de acceso de GenBank JF29828), se sintetizó y se insertó en pGS21a y pUC57 para generar pJB100 y pJB107, respectivamente (Tabla 1). La secuencia de ADN de rBhtfue confirmada (GenScript, Piscataway, NJ).
Construcción de plásmidos que contienen rBht para expresarse en E. coli. Los procedimientos de clonación se llevaron a cabo como se describió previamente (32). Las cepas de E. coli utilizadas para la clonación y la expresión de rBHT se enumeran en la Tabla 3. Las endonucleasas de restricción y la ADN ligasa T4 se obtuvieron de New England Biolabs (Beverly, MA). Los plásmidos pJB100 y pJB107 se digirieron con Ncol y Notl, y el fragmento que contenía el gen de la rBht se insertó en los plásmidos Novagen para generar los plásmidos de expresión pJB101, pJB103, pJB104, pJB105 y pJB106 (consulte la Tabla 3 para obtener una descripción de las construcciones).
Expresión de construcciones de fusión de rBHT en BLR deE. coli. La expresión se llevó a cabo como se describe en el manual del sistema pET TB0558th Edición 02/99 (Novagen). Brevemente, los plásmidos de expresión se transformaron en BLR de E. coli y después de la inducción de IPTG seleccionaron la actividad de rBHT. La actividad de rBHT se evaluó in vivoincubando células BLR inducidas por IPTG en tampón de fosfato de sodio 50 mM a pH 4 y pH 6, y 50 pg.ml'1 sustrato cromogénico penetrante celular X-GAL (Tabla 4). Los cultivos se incubaron durante la noche a 37°C para visualizar la apariencia del color. Las células BL21 que contienen actividad endógena de p-galactosidasa se usaron como control positivo.
Producción de anti-rBHT. El antisuero anti-rBHT se produjo usando rBHT-6XHIS expresado y purificado en células BLR de E. coli que contienen pJB101. La purificación de rBHT-6XHIS presente en la fracción de extracto libre de células se realizó mediante cromatografía en gel de níquel agarosa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (QIAGEN, Alemania) y luego se purificó adicionalmente por electro-elución de geles de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Bio-Rad, Richmond, CA). La proteína pura se usó para la inmunización de conejos (Cocalico Biologics Reamstown, PA). Los anticuerpos adicionales utilizados en el estudio se enumeran en la Tabla 4.
Electroforesis e inmunotransferencia. La electroforesis en gel de poliacrilamina de dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE-4-12%) se llevó a cabo rutinariamente en el sistema Laemmli (23). Las proteínas se visualizaron por azul Coomassie (Bio-Rad, Richmond, CA) o tinción de plata (Bio-Rad, Richmond, CA). Se usó SeeBlue plus (Invitrogen, Carlsbad, CA) como marcador de masa molecular. El análisis de inmunotransferencia en geles PAGE duplicados se llevó a cabo como se describió anteriormente (7), excepto que la detección se realizó utilizando anticuerpos anti-conejo o cabra conjugados con fosfatasa alcalina (Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA) y se visualizó usando NBT (tetrazolio nitro-azul cloruro) y BCIP (5-bromo-4-cloro-3'-indolifosfato sal p-toluidina) solución premezclada (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).
Construcción de una cepa recombinante deP. pastoris. El gen rBht se amplificó por PCR a partir de pJB107 usando los cebadores JBB1 y JBB2 para agregar los sitios de restricción Xhol y Notl en el marco con la secuencia de señal del factor de apareamiento pre-pro-alfa de Saccharomyces cerevisiae contenida en pPIC9, seguida de un marcador 6XHIS y un sitio de escisión de proteasa de TEV modificado (Tabla 2). El producto de PCR se ligó a los sitios de restricción de pPIC9 Xhol y Notl para generar pJB108 (Tabla 3). La ligazón correcta dentro del marco se confirmó mediante secuenciación (Sequatech, Mountain View, CA) utilizando los cebadores 5 'AOX1 y 3' AOX1 (Tabla 4).
La cepa GS115 de P. pastoris (Tabla 1) se electro-transformó con pJB108 linealizado con Sacl (lnvitrogen's Pichiamanual del kit de expresión, versión M) utilizando un generador de impulsos Bio-Rad (Bio-Rad, Richmond, CA). Los recombinantes se seleccionaron en Dextrosa de Regeneración deficiente en histidina (placas de agar RDB) a 30°C. Se seleccionó al azar colonias His+, y la integración genómica del casete de expresión se verificó por PCR utilizando los cebadores 5 'AOX1, 3' AOX1 y Factor-a (Tabla 4). La utilización de metanol (mut+) del fenotipo de GS115/rBht recombinante se determinó de acuerdo con el procedimiento descrito en lnvitrogen's Pichia manual del kit de expresión, versión M.
Producción de rBHT en P. pastoris. Para seleccionar un productor de alto nivel de la rBHT recombinante, seis aislamientos His+ se cultivaron en medio de extracto de levadura peptona dextrosa (YPD) a 30°C y 250 rpm durante 12 h y luego se usaron para inocular 100 ml de medio complejo de glicerol tamponado (BMGY) en una OD 600 inicial= 0.1. Cuando el cultivo excedió una OD600= 10, se agregó metanol a una concentración final de 0.5% a intervalos de 24 h hasta que el cultivo excedió una OD6oo= 50 después de lo cual se añadió metanol cada 12 h. Las muestras de los medios se analizaron para detectar la presencia de la actividad BHT y mediante Western blot usando un anti-rBHT de conejo cada 24 h para determinar el tiempo óptimo de producción. El recombinante GS115/rBht seleccionado se cultivó diariamente en 0.5 L de BMGY y se indujo con metanol durante 6 días.
Purificación de la rBHT secretada. Los sobrenadantes del cultivo (500 ml) se fraccionaron con sulfato de amonio. Los precipitados entre 60%-80% de sulfato de amonio se resuspendieron en 50 mM de tampón de fosfato de sodio (pH 6). Después de eliminar la sal y concentrar con una membrana Amicon MWCO 15 (Amicon Inc., Beverly, MA), la solución se aplicó a una columna preequilibrada Mono Q 1/30 (5 ml) (amino etil cuaternario) (Amersham Biosciences). Luego se lavó la columna con 50 ml de tampón y se eluyó con 3 volúmenes de columna de un gradiente lineal de cloruro de sodio de 0 a 0.2 M en 50 mM de tampón de fosfato de sodio (pH 6.0) a una velocidad de flujo de 1 ml.min-1. El eluato se recogió en porciones de 1 ml. Las fracciones activas se agruparon, se concentraron y se resuspendieron en 10 mM de fosfato de sodio (pH 6.8), luego se aplicaron a una columna de hidroxiapatita Bio-Gel HT (Bio-Rad, Richmond, CA) (1/102 ml) pre­ equilibrada con el mismo tampón, se lavaron con 10 mM de fosfato de sodio (pH 6.8) y se eluyeron con 50 mM de fosfato de sodio (pH 6.8). Las fracciones con mayor actividad específica contenían rBHT puro con actividad específica de 8.2 U.mg-1. La actividad enzimática se ensayó (se describe a continuación) en todas las fracciones de cromatografía y los pasos de purificación se realizaron a 25°C.
Determinación de la masa molecular. Se aplicó un medio de cultivo concentrado 20 veces por ultrafiltración (0.5 ml) a una columna de exclusión por tamaño Superdex 200 (Amersham Biosciences) 1/30 (18 ml) preequilibrada con 50 mM de tampón de fosfato de sodio, pH 6.0, NaCl 0.1 M . Se colectaron fracciones de 0.5 ml a una velocidad de flujo de 0,5 ml.min-1 y se analizó la actividad de rBHT usando ONP-Glu como sustrato y mediante zimograma como se describe a continuación. La elución de rBHT y los patrones de masa molecular se monitorearon a 280 nm. La columna se calibró utilizando las siguientes moléculas: Tiroglobulina, 669 kDa; Ferritina, 440 kDa; Catalasa, 232 kDa; Lactato deshidrogenasa, 140 kDa; Albúmina de suero bovino; 67 kDa (GE, Salud). La masa molecular de rBHT se extrapoló de un gráfico de calibración de masa molecular logarítmica (eje Y) versus volumen de elución (eje X). Todos los pasos cromatográficos se realizaron a 25°C.
Ensayos de actividad enzimática. La velocidad de reacción inicial de rBHT se midió mediante una modificación del método de Kuby (13,22) en las condiciones establecidas. Brevemente, las reacciones se realizaron en un volumen de 250 j l que contenía 1.3 mM de ONP-Glu y 50 mM de tampón de fosfato de sodio (pH 5). Los ensayos se realizaron durante 10 minutos en las condiciones establecidas y se detuvieron agregando 1 volumen de 0.25 M de Na2CO3. La mezcla de reacción que contenía la rBHT hervida y el sustrato sirvió como control negativo. Los ensayos siempre se realizaron por duplicado con una confiabilidad de ±5%. Se obtuvieron muestras de cultivo libre de células y concentrados de proteínas como se describió anteriormente. Las células en reposo (que contienen la rBHT unida a la membrana) previamente lavadas con 50 mM de tampón de fosfato de sodio (pH 5.0) se analizaron, bajo condiciones establecidas. Cuando X-GAL fue el sustrato de la reacción, la concentración fue de 50 jg.mMen 50 mM de tampón de fosfato de sodio (pH 4).
Una unidad (U) de actividad enzimática equivale a 1 jm ol de o-nitrofenol liberado por minuto en las condiciones del ensayo. La actividad específica se define como Unidades/mg de proteína. Los coeficientes de extinción molar de onitrofenol fueron: £=0.033 mM'1cirr1pH 4; £=0.036 mM'1cirr1pH 5; £=0.038 mM'1cirr1, pH 6. La cantidad de o-nitrofenol liberado se extrapoló de un gráfico de calibración de la absorbancia deo-nitrofenol a 405 nm (eje Y) versus la concentración de o-nitrofenol (eje X).
Las actividades enzimáticas también se visualizaron mediante zimogramas. El PAGE nativo se realizó usando una modificación del protocolo descrito por Gallagher (8). Las proteínas de E. coli lisadas o los sobrenadantes de P. pastoris se solubilizaron en sacarosa al 5% (p/v)/10 jg .m l-1 de azul de bromofenol y se separaron en geles de poliacrilamida nativos al 6%, usando como tampón de corrida 50 mM de tampón de fosfato de sodio (pH 6). El gel se mantuvo frío en un aparato de electroforesis Mighty Small Hoefer donde se recirculó agua fría durante la electroforesis a 60 mA durante 5 h. Después de la electroforesis, el gel se enjuagó dos veces en tampón de lavado (50 mM de tampón de fosfato de sodio, pH 4.0) durante 10 min. Los zimogramas se desarrollaron durante 24 h colocando papel de filtro empapado en tampón de lavado que contenía 50 jg .m l.'1 X-GAL a 20°C. Un precipitado azul definió la ubicación de la enzima.
Cinética de las enzimas. Se analizó una serie de diluciones enzimáticas que iban de 0 a 1.2 U.ml-1 en 50 mM de fosfato de sodio (pH 5) a 42 ° C. El ensayo de actividad enzimática se inició mediante la adición de 1,3 mM de ONP-Glu y se monitoreó la absorbancia a 405 nm durante intervalos de 1 min en un total de 20 minutos. Los valores experimentales de absorbancia se representaron en función del tiempo mostrando una proporcionalidad lineal de hasta 0.6 U.ml-1 durante al menos 20 min, mientras que a concentraciones de enzimas superiores a 1.0 U.ml-1 los valores de absorbancia se estabilizaron antes de 5 min.
Las constantes de Michaelis-Menten (kmetro y Vmax) de 0.2 U.ml-1de rBHT (a 42°C) se determinaron variando la ONP-Glu de 0 a 10.4 mM en 50 mM de fosfato de sodio (pH 5) y midiendo la velocidad de reacción inicial a 20°C, 30°C, 40°C y 50°C. Las constantes cinéticas a cada temperatura se determinaron con OriginPro 7.5 usando una regresión no lineal de la ecuación de Hill con un coeficiente de Hill de 1. Los valores obtenidos en las condiciones establecidas fueron los siguientes (T, km, Vmax): (20°C, 0.37 mM, 0.09 mM.min-1), (30°C, 0.48 mM, 0.12 mM.min-1), (40°C, 0.71 mM, 0.23 mM.min1) and (50°C, 1.3 mM, 0.42 mM.min-1). Los coeficientes de regresión adecuados (R2) fueron 0.9869, 0.99065, 0.99115 y 0.98996 a 20°C, 30°C, 40°C y 50°C, respectivamente.
Caracterización de la rBHT. Los ensayos de actividad enzimática se realizaron en las condiciones establecidas descritas anteriormente. La influencia del pH en la actividad enzimática se probó en soluciones tampón que incluyeron 50 mM de fosfato de sodio (pH 5.0 a 11.0), 50 mM de citrato (pH 2.0 a 5.0) y 50 mM de fosfato-citrato (pH 2 a 11) (Fig. 2A). La inhibición competitiva de los monosacáridos (glucosa y galactosa) se examinó variando sus concentraciones en la mezcla de la reacción (Fig. 2C). La temperatura y la termoestabilidad se determinaron midiendo la actividad residual a 20, 30, 40, 50, 60, 70 u 80°C (Figs. 2B y 2D). De manera similar, se usaron ensayos de actividad enzimática para evaluar aditivos como inhibidores/activadores potenciales. Se probaron los siguientes aditivos de hasta 10 mM: agente quelante (EDTA), agentes reductores (ditiotreitol (DTT), 2-mercaptoetanol (2-ME) y cobre (Cu2+)) e iones (cationes monovalentes; NH4+, Cs+, K+, Na+, Li+, and Rb+; cationes divalentes; Ba2+, Ca2+, Co2+, Fe2+, Mg2+, Mn2+, Ni2+, and Se probaron los metales pesados (Co2+Fe2+y Zn2+) en 50 mM de tampón de citrato (pH 5.0) para evitar la precipitación.
Además, los tensoactivos añadidos a la mezcla de reacción al 1% (v/v) fueron: TritonX-100, Tween 20, Tween 80 y Dodecil Sulfato de Sodio (SDS). Los solventes probados al 10% v/v incluyeron: etanol, metanol, acetona, acetonitrilo, PEG400 y glicerol.
Producción y análisis de los GOS. Las reacciones de transgalactosilación estándares, utilizando la rBHT purificada o las células en reposo de P. pastoris (que contienen la enzima unida a la membrana) se iniciaron agregando cantidades estandarizadas de enzima (0.5 Ug-1 de lactosa) en 5 mM de tampón fosfato de sodio (pH 5.0) que contiene lactosa (22 gL-1 o 200 gL-1) a 30°C o 42°C.
Los productos y sustratos de las reacciones se analizaron por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japón) en condiciones isocráticas a 65°C y a una velocidad de flujo de 0,4 ml.min-1. La fase móvil fue 5 mM de ácido sulfúrico (H2SO4) usando una columna de ácidos orgánicos Alltech IOA-1000 (300 mm por 7.8 mm) (Alltech, IL) acoplada a un detector de índice de refracción. La columna se calibró usando; galactosil-lactosa (Carbosynth (Berkshire, Reino Unido)), lactosa, glucosa y galactosa (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Las especies residuales de GOS no cuantificadas (tetrasacárido y pentasacárido) se informaron como lecturas de intensidad de señal del detector de índice de refracción.
6.2. Resultados
Expresión de una p-hexosil-transferasa recombinante (rBHT) en£. coli. La cepa BL21 de E. coli es el hospedero más utilizado para la producción de proteínas heterólogas. Desafortunadamente, esta cepa hospedera contiene una pgalactosidasa endógena activa que interfiere con la evaluación de la p-hexosil-transferasa, designada como rBHT (ver materiales y métodos). Después de seleccionar diferentes cepas deE. coli apropiadas para sistemas de expresión basados en pET, incluidos BL21, BLR, NovaBlue, Origami y Rosetta (Tabla 3), la BLR de E. coli se confirmó que carecía de actividad p-galactosidasa endógena. Se usó la cepa CC118 (AlacZ) de E. coli como control (36).
El gen derBht se insertó en plásmidos de expresión pET que contenían un 6XHIS C-terminal o uno de los cuatro asociados de coexpresión que aumentan la solubilidad (glutatión-S-transferasa (GST), tiorredoxina (Trx), el líder de PelB y DsbA) dando como resultado pJB101, pJB103, pJB104, pJB105 y pJB106 (Tabla 3). La transformación en la cepa BLR de E. coli y la inducción con IPTG dieron como resultado la expresión de rBHT inactiva en células enteras o en extractos libres de células. El análisis por inmunotransferencia de las proteínas de fusión con antisueros rBHT detectó todas las proteínas de fusión de rBHT y sus masas moleculares predichas, con la mayor reactividad observada en las fracciones insolubles.
Para descartar la posible insolubilidad de la proteína dependiente del hospedero, se analizó la expresión de rBHT en la cepa CC118 de E. coli que contenía pJB102 (pJB101 con su promotor T7 reemplazado por un promotor inducible por tetraciclina (TET)), pero también demostró no tener éxito (datos no mostrados).
Expresión y purificación de rBHT de P. pastoris. P. pastoris es capaz de introducir modificaciones postraduccionales y se conoce por su capacidad para producir una serie de proteínas recombinantes activas (aspecto del que E. coli carece) (14). Por lo tanto, se insertó el codón optimizado del gen de rBht en pPIC9 bajo el control del promotor alcohol oxidasa (AOX1), en el marco con la señal del factor a deS. cerevisiae (secuencia para la secreción de proteínas) y un 6XHIS N-terminal seguido de un sitio de escisión de proteasa TEV (pJB108, Tabla 3). La cepa GS115 de P. pastoris se transformó con pJB108 (GS115/rBht) y la actividad de rBHT se evaluó en seis recombinantes GS115 /rBht. La cepa recombinante que secretó la mayor concentración de proteína bioactiva se estudió con mayor profundidad. Los zimogramas confirmaron la presencia de una rBHT activa: sólo GS115/rBht dio una señal positiva, mientras que los extractos celulares de la cepa BLR deE. coli que contenían pJB101 y los sobrenadantes de cultivo de GS115 no transformado fueron negativos (Fig. 1C). Como se esperaba, las regiones transmembrana de proteínas en BHT también resultaron en células GS115/rBht que mostraron actividad de rBHT asociada a la superficie celular, emulando la ubicación de BHT nativo en S. singularis (15,16).
Se intentó la purificación de rBHT usando la cromatografía de afinidad del níquel, pero el marcador HIS no estaba presente, ni se detectó la proteína mediante Inmunotranferencia de proteínas usando antisueros anti-HIS, lo que indica un posible procesamiento de la secuencia de señal N-terminal en los sitios de escisión predichos (16). Posteriormente, se purificó la enzima rBHT (actividad específica de 8.2 U.mg'1 a 20°C) usando Mono Q y cromatografía de hidroxiapatita (Tabla 5).
6.3. Caracterización de la rBHT expresada en P. pastoris.
1. Masa molecular aparente de rBHT. La masa molecular estimada para una rBHT completamente procesada no glicosilada que incluía el marcador de sitio de proteasa 6XHIS y TEV fue de 68 kDa. La enzima se purificó previamente como un dímero y como un monómero, con una masa molecular aparente que varía de 53 a 146 kDa, datos que reflejan variaciones en la glicosilación de proteínas (Tabla 5) (1,16). Aquí, la actividad enzimática eluyó como un pico monomérico con una masa molecular experimental aparente de 110 kDa. Nosotros suponemos que la forma dimérica podría predominar dentro del intervalo ácido del pH óptimo de la enzima nativa (3.7 a 6) (Tabla 5). Sin embargo, las fracciones de la columna Superdex 200 a pH 4.0 describieron el mismo perfil, confirmando la forma monomérica estable de la enzima recombinante. No se detectaron agregados de mayor masa molecular mediante el ensayo de actividad enzimática, el zimograma o el Western blot La purificación de las fracciones de la columna y el análisis de inmunotransferencia usando anti-rBHT verificaron que la enzima migró como una banda única con una masa molecular aparente de 110 kDa (Figs. 1A y 1 B).
2. Especificidad de sustrato. El ONP-Gal se usa tradicionalmente como sustrato para p-galactosidasas y los sustratos
ONP-Gal, PNP-Gal y PNP-Glu se usan en estudios previos para la detección de la actividad de BHT nativa (Tabla 5). Las actividades enzimáticas de rBHT (0.2 U.ml-1) se compararon entre los sustratos anteriores en las mismas condiciones experimentales. La enzima recombinante fue igualmente activa en respuesta a ONP-Glu y PNP-Glu. Los sustratos con una galactosa en la porción glicón se hidrolizaron a una velocidad de aproximadamente 41% (ONP-Gal) y 23% (PNP-Gal) de esta para ONP-Glu. Estos resultados indican que la rBHT tiene una especificidad limitada con respecto al azúcar y más flexibilidad hacia la configuración de la posición de enlace de carbono en C2 y C4 cuando se usan derivados de azúcar de glucosa como sustratos.
3. PH óptimo, temperatura y termoestabilidad de rBHT.La rBHT estuvo activa dentro de un amplio intervalo de pH (de pH
3.5 a 6) mostrando los valores más altos a pH 4.0 (Fig. 2A). El perfil de actividad enzimática mostró un fuerte descenso a menos del 50% de la actividad enzimática máxima a valores de pH superiores a 7 o inferiores a 3.5. Estos resultados fueron consistentes con el pH óptimo informado (1) (ver referencias de la Tabla 5); lo que sugiere que las condiciones alcalinas pueden tener un efecto perjudicial sobre la actividad enzimática y la estabilidad.
La velocidad de reacción inicial medida a diferentes temperaturas que iban de 20°C a 80°C indicó que la enzima estaba activa en un intervalo de temperatura de 20°C a 50°C, con un intervalo óptimo entre 40°C y 50°C (Fig. 2B). A temperaturas inferiores a 30°C se observa una reducción del 50% en la velocidad de reacción inicial y las temperaturas superiores a
50°C inactivan de forma rápida e irreversible la enzima. La temperatura óptima al maximizar la velocidad de reacción enzimática también se puede obtener del valor más alto de Vmax/ Km (33). La Vmax aumentó a una velocidad más rápida que Km a temperaturas entre 20°C y 40°C, en consecuencia los valores de Vmax/ Km (0.242 min'1, 20°C; 0.255 min'1, 30°C;
0,324 min_1, 40°C; 0.322 min_1, 50°C) aumentaron en este intervalo y fueron constantes a temperaturas entre 40°C y 50°C.
Por lo tanto, la temperatura óptima determinada por Vmax/ Km estaba dentro de 40°C-50°C, lo que confirmó los valores óptimos establecidos usando los valores de la velocidad de reacción inicial a cada temperatura.
Como se muestra en la Fig. 2D, la termoestabilidad de la rBHT se evaluó de 20°C a 50°C. A 20°C y 30°C, la enzima conservó al menos el 90% de la actividad original durante 6 días, lo que confirmó los resultados informados previamente para la enzima nativa (4). Cinco lotes independientes de rBHT almacenados durante 6 meses a 4°C conservaron el 95%
de la actividad inicial (datos no mostrados). Aunque la temperatura óptima se encontró en el intervalo de 40°C a 50°C, la incubación a temperaturas superiores a 40°C fue perjudicial para rBHT. A 40°C, la enzima conservó el 70% de la actividad inicial a las 12 h y este nivel de actividad solo persistió durante 36 h adicionales. En contraste, la actividad enzimática disminuyó bruscamente a 50°C dentro de las primeras 12 h de incubación.
4. Efecto de metales, sales, tensoactivos y solventes sobre la actividad de rBHT. La inhibición/activación enzimática se probó dentro de un amplio intervalo de aditivos. La rBHT no exhibió un requerimiento para ninguno de los iones probados
(NH4+, Ba2+, Ca2+, Cs+Co2+, Cu2+, Li+, Rb+, Mg2+, Ni2+, Na+ y Zn2+) a pesar de que el magnesio aumen la actividad enzimática de algunas p-galactosidasas (26). Además, la enzima recombinante era completamente activa en presencia de 1 y 5 mM del agente quelante de iones EDTA, lo que confirma los hallazgos anteriores y un informe anterior
(1). Además, los compuestos probados para romper puentes disulfuro, como Cu2+ y los agentes reductores ditiotreitol
(DTT) y 2-mercaptoetanol (2Me ) (1,18,19), no tuvieron consecuencias negativas sobre la actividad. Los solventes metanol, etanol, acetona y acetonitrilo solo inhiben parcialmente la enzima (conservando una actividad relativa del 66%-81%). En contraste, la adición de 10% de glicerol o 1% de SDS (un tensoactivo no iónico) inhibió casi por completo la enzima.
Síntesis de GOS utilizando la rBHT purificada. Una vez que se caracterizó la enzima, se analizó la rBHT secretada para determinar la biotransformación de lactosa al 2% en los GOS. Las condiciones de la reacción fueron 0.5 U rBHT.g’1 de lactosa a 42°C en 5 mM tampón de fosfato de sodio (pH 5.0). La Figura 3 muestra el consumo de lactosa y la acumulación de los GOS a lo largo del tiempo. La mayor velocidad de producción se observó durante las primeras 12 h y la galactosillactosa y la glucosa fueron los principales productos. No se detectó galactosa, lo que indica que se estaba incorporando completamente en la reacción de transgalactosilación para formar los GOS. Después de 30 h, 4.2 gL’1 de glucosa se había acumulado y la utilización de lactosa (54%) estaba en su máximo. Además, en este momento, 7.8 gL_1 del trisacárido
se había acumulado alcanzando un promedio de conversión del 67% de la lactosa utilizada. A medida que avanzaba la reacción, la galactosa comenzó a liberarse de la reacción enzimática y a acumularse en concentraciones traza. Dado que la inhibición competitiva de la enzima podría reducir la eficiencia de la biotransformación de la lactosa, examinamos el efecto de concentraciones variables de glucosa o galactosa en la actividad enzimática en la mezcla de reacción. La presencia de 5 g.L-1 de glucosa redujo la actividad de rBHT hasta en un 90%, mientras que la actividad enzimática no se vio afectada por hasta 70 g.L-1 de galactosa, en las condiciones establecidas (Fig. 2C).
Síntesis de los GOS por células en reposo deP. pastoris (que contienen la rBHT unida a la membrana). Para evitar la inhibición competitiva y confirmar que la conversión de lactosa en los GOS podría mejorarse si la glucosa se elimina simultáneamente de la mezcla de reacción, evaluamos la biotransformación del 20% e l lactosa por las células en reposo del recombinante GS115/rBht deP. pastoris. Los GS115/rBht de P. pastoris que contenía la rBHT unida a membrana se normalizaron a una densidad celular que contenía 0.5 U rBHT.g-1 de lactosa en 5 mM de tampón fosfato de sodio (pH 5). Las reacciones se realizaron durante 10 días a 30°C, la temperatura óptima para el crecimiento de P. pastoris, y a 42°C, la temperatura para la cual la velocidad de reacción inicial es máxima para la rBHT secretada. Como se esperaba, el 90% de la lactosa inicial se convirtió en GOS sin productos secundarios a 30°C, en comparación con el 51% de utilización de lactosa a 42°C. Los resultados indicaron que las células en reposo eran fisiológicamente activas y capaces de consumir el subproducto de glucosa de la reacción, evitando así la inhibición competitiva. Sin embargo, la velocidad de reacción inicial de la formación de los GOS a 42°C fue el doble de la velocidad a 30°C durante las primeras 48 h. Se alcanzó una concentración final de 80 g.L-1 de galactosil-lactosa, que corresponde a una productividad de 1.6 g.L-1.h-1 a 42°C (Fig. 4A). A 30°C cuando la utilización de lactosa fue del 63%, la concentración de galactosil-lactosa fue de 100 g.L-1 y se alcanzó una productividad de 0.8 g.L'1.h'1 después de 5 días (Fig. 4B).
6.4. Discusión
En este estudio, optimizamos la secuencia de ADN del gen de la p-hexosil-transferasa de S. singularis (número de acc. AB126324) para la expresión en E. coli y P. pastoris. El gen de la rBht resultante se generó sintéticamente (número de acc. JF29828) y se expresó en E. coli. Sin embargo, este hospedero bacteriano carece de la capacidad de incorporar modificaciones postraduccionales esenciales para producir una rBHT soluble y activa como se observó anteriormente (16). Posteriormente, el gen de rBht bajo el control delpromotor AOX1 se integró con éxito en el cromosoma deP. pastoris, lo que resultó en la expresión de una enzima completamente activa que se detectó en el caldo de cultivo y se asoció con la superficie celular. La secreción de rBHT por la cepa GS115 de P. pastoris nos permitió evitar los procesos complejos de purificación que se requieren para obtener BHT puro de S. singularis. Además, ya que P. pastoris secreta naturalmente solo niveles muy bajos de proteínas nativas, la recuperación de la rBHT extracelular fue tan simple como la eliminación de células enteras del medio por centrifugación o filtración (5).
La masa molecular de la enzima recombinante correspondía a un único polipéptido catalíticamente activo de 110 kDa y no se detectaron polipéptidos más pequeños o agregados de la rBHT. Las modificaciones postraduccionales juegan un papel crítico en el plegamiento de proteínas, la estabilidad estructural, la formación de oligómeros y el reconocimiento del sustrato (17,24), por lo que no fue sorprendente que la masa molecular fuera mayor que la proteína de 68 kDa expresada en E. coli y predicha por la secuencia de aminoácidos. La glicosilación postraduccional de la BHT nativa por S. singularis se ha informado previamente, y se observó un cambio en la masa molecular de la proteína purificada de 73.9 a 66.3 kDa después del tratamiento con quitinasa y EndoHf (16). La futura mutagénesis de los sitios de glicosilación predichos debería ayudar a determinar si la glicosilación es también la causa del cambio en la masa molecular de la rBHT.
Los datos informados aquí son parte de un estudio más amplio que comparó la utilización de la rBHT con datos documentados para la b Ht nativa de S. singularis (Tabla 5). Nuestro estudio confirmó que la enzima recombinante no requiere cofactores o agentes reductores con frecuencia esenciales para los p-galactósidos. La enzima mostró una mejor termoestabilidad a temperaturas más bajas (por debajo de 40°C) y actividades óptimas a temperaturas de 40°C a 50°C y un pH de 3.5 a 6. Además, la enzima se controló mediante la inhibición de la glucosa, aunque la rBHT no era sensible a la galactosa o al Ag3+ como se informó anteriormente para la BHT nativo (4,16,25,35).
La utilización de lactosa y su concentración inicial son dos factores claves que contribuyen a maximizar la acumulación final de GOS. Aquí demostramos un proceso con una utilización mejorada de lactosa (90%) que emplea células en reposo fisiológicamente activas de GS115/rBhtde P. pastoris. En estas condiciones, las células consumen glucosa residual a 30°C, evitando la inhibición de la glucosa y asegurando una mejora significativa del proceso y un mayor grado final de pureza prebiótica (Fig. 4B). Por el contrario, se informó que las temperaturas superiores a 25°C impiden el consumo de glucosa residual por las células en reposo de S. singularis que contienen BHT nativa unida a la membrana, lo que a su vez limita la concentración final de g Os y la pureza (revisado por Gosling y otros (11)).
Las células en reposo deGS115/rBht incubadas a 42°C solo convirtieron el 51% de la lactosa inicial en galactosil-lactosa y glucosa residual (Fig. 4A). Estos datos tenían semejanza con la formación de galactosil-lactosa por la rBHT secretada en las mismas condiciones (Fig. 3). Además, los valores de conversión y utilización se compararon con los procesos informados previamente por S. singularis (Tabla 5). Se han informado valores de utilización de lactosa típicos entre el 30% y el 40% de la lactosa inicial (11), y un estudio informó la utilización de lactosa al 50% utilizando 10.8 veces más enzima por gramo de lactosa en comparación con la rBHT secretada (Tabla 5) (4).
El descubrimiento de la síntesis de GOS por S. singularis a mediados del siglo20 ha alentado la exploración de pgalactosidasas superiores que producen GOS más eficientemente (9,10,37). Sin embargo, las enzimas estudiadas mostraron valores de utilización de lactosa más bajos y concentraciones finales más altas de subproductos no deseados en comparación con la BHT de S. singularis (1,4,12,16,27,34,35). Sin embargo, los avances en la utilización industrial de la BHT deS. singularis ha sido más lento de lo deseado debido a los procesos desafiantes de purificación de varios pasos necesarios para obtener BHT nativa pura (1,4,16). La rBHT bioactiva secretada o como enzima unida a la membrana de P. pastoris significa una clara ventaja del proceso para producir GOS. Los estudios futuros explorarán estrategias de modificación de proteínas para mejorar el rendimiento de expresión de proteínas, la estabilidad y la actividad enzimática.
La Tabla 6 a continuación resume las construcciones que se prepararon en relación con esta invención. Todas las construcciones se prepararon en pPIC9 pero subsisten como integrantes cromosómicos en P. pastoris.
6.5. Galacto-oligosacáridos del suero rico en lactosa
El mercado mundial de productos lácteos fue de $299.7B en 2009, y se espera que crezca a $370.9B en 2014, un aumento del 23.8%. Global. Perfil de la industria láctea: Global. Perfil de la industria láctea: Global [serial online]. Octubre 2010:1. Disponible de: Business Source Complete, Ipswich, MA. Consultado el 24 de febrero de 2012. Global (2012) La leche y el queso representaron el 35.2% y el 28.3% del mercado, respectivamente. Se espera que el consumo mundial de queso alcance los 21 millones de toneladas en 2015. Lenoir-Wijnkoop I. & van Aalderen w M, B.G.K.D.S.A.N.MJ. Modelo de rentabilidad para una mezcla específica de prebióticos en los Países Bajos. Eur J Health Econ (2010)) El crecimiento del mercado de productos lácteos genera grandes problemas de tratamiento de residuos industriales dado el alto contenido de lactosa de la leche y los subproductos producidos durante el procesamiento de los productos lácteos. Los líquidos residuales con alto contenido de lactosa tienen una demanda biológica de oxígeno (DBO) excepcionalmente alta, lo que significa que la cantidad de oxígeno requerido para descomponer la lactosa es lo suficientemente alta como para privar a otros organismos del oxígeno necesario para la supervivencia. Por lo tanto, muchos países han promulgado leyes de protección ambiental que restringen la eliminación de fluidos que contienen lactosa directamente en cuerpos de agua. Ganzle,M.G., Haase,G. & Jelen,P. Lactose: Crystallization, hydrolysis and value-added derivatives. International Dairy Journal 18, 685-694 (2008). La carga adicional para los procesos de tratamiento de aguas municipales puede ser especialmente costosa y problemática para los países y estados que dependen de una economía láctea (4-6). Affertsholt-Allen T. Market developments and industry challenges for lactose and lactose derivatives. IDF Symposium "Lactose and its Derivatives." Moscú. (lactosa. ru/present/1Tage_Affertsholt-Allen. pdf. Consultado el 30 de septiembre de 2009) (2007); Markets and Markets U.S. Digestive Health Ingredients Market Worth $495.3 million in 2015. (www. marketsandmarkets. com/PressReleases/us-digestive-health-ingredients-market. asp) (2010); UBIC consulting. THE WORLD GALACTO-OLIGOSACCHARIDE MARKET. (www. ubic-consulting. com/template/fs/documents / Dairy-Ingredients/Galacto-Oligosaccharide-Ingredient-Market. pdf) (2010) Por ejemplo, la fabricación de queso genera dos productos: queso y suero. Porcada libra de queso hecha, se generan nueve libras de suero, creando un excedente creciente de suero (186 millones de toneladas en 2008), que contiene -5% de lactosa. Esta fracción de lactosa tiene una DBO que es aproximadamente 175 veces mayor que el efluente de aguas residuales típico, por lo tanto, los desechos no tratados no pueden eliminarse directamente en cuerpos de agua. Smithers, G.W. Whey and whey proteins. "From Glitter to Gold". International Dairy Journal 18, 695-704 (2008). La solución tradicional a este problema ha sido biorremediar los efluentes ricos en lactosa mediante la aplicación de procesos costosos para extraer la lactosa, que luego puede venderse como un producto básico a un valor máximo de $ 1.50/kg. Solo el 50% del suero de queso que se produce anualmente se recicla en productos útiles, como ingredientes alimenticios y alimentos para animales. El resto se considera desperdicio, ya sea porque no se alcanzan volúmenes críticos para permitir el reciclado económico o por el alto grado de dificultad técnica involucrado en la biotransformación. Por lo tanto, existe una necesidad estratégica de convertir la lactosa en productos comercialmente viables y de alto valor para reducir el costo total del proceso y mejorar la economía de la industria láctea de los E.U.
Aquí proponemos la biotransformación/biorremediación simultánea del producto químico lactosa mediante la aplicación de un nuevo proceso de desarrollo de productos alimenticios como la solución ideal para este problema industrial. Nosotros mejoramos un método por el cual la lactosa puede convertirse en derivados de galactosil-lactosa llamados galacto-oligosacáridos (GOS) a través de una reacción enzimática. Los GOS se clasifican como prebióticos, que estimulan el crecimiento y la actividad de las bacterias beneficiosas en el sistema digestivo, y se usan ampliamente en productos alimenticios como fórmulas infantiles, suplementos nutricionales, yogures, productos horneados y alimentos para animales. A diferencia del producto básico de lactosa, los GOS son ingredientes alimenticios altamente valorados, y el valor económico de esta transformación se demuestra fácilmente al comparar el precio actual de mercado de la lactosa a $ 1.50/kg con el precio de mercado de los GOS de $5.20-8.50/kg. Los GOS son parte de una tendencia en ingredientes de alimentos para la salud digestiva valorados en $265.9 millones en 2010 con una velocidad de crecimiento anual de 18.3% y se espera que crezca a una velocidad de crecimiento anual compuesta de 13.2% de 2010 a 2015.
Nuestro método de conversión de lactosa a GOS es muy superior a los procesos existentes porque podemos reducir el volumen total de reacción en 50 veces mediante la utilización de un hospedero eficiente para producir la enzima, aumentar el volumen y la pureza de los GOS producidos y potencialmente generar productos sin lactosa. Euromonitor. Lactose-free Foods Maintain Their Global Appeal, 1ro de Marzo de 2011. Euromonitor (2011) El mercado global de productos sin lactosa fue de $3.4B en 2009, y se espera que crezca a medida que los consumidores continúen centrándose en alimentos funcionales para la salud y el bienestar. Mientras que otros productos lácteos son extremadamente sensibles a los precios, los alimentos funcionales como los productos sin lactosa se pueden vender a un precio superior.
Al utilizar el proceso mejorado que se describe en este documento, la industria láctea y los fabricantes de suplementos alimenticios a nivel mundial y estadounidense pueden beneficiarse claramente de tres maneras: 1) creación de grandes volúmenes de GOS de calidad, un ingrediente alimentario/suplemento dietético que promueve la salud con un alto valor de mercado, 2) generación potencial simultánea de valiosos productos lácteos o leche sin lactosa, y 3) reducción efectiva del impacto ambiental a través del reciclaje de suero y los derivados de la leche.
Tabla 3. Cepas y plásmidos utilizados en este estudio.
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Tabla 4. Cebadores, anticuerpos y sustratos utilizados en este estudio (SEQ ID NOS: 21-27)
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Tabla 5. Informes que evalúan la BHT de Sporobolomyces singularis para la producción de galactooligosacáridos (GOS)
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Tabla 6 Proteínas rBH Tde Pichia pastoris
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6.6. La secreción de p-hexositransferasa se mejora al reemplazar el dominio señal
6.6.1. Resumen
La p-hexosiltransferasa (BHT) de Sporobolomyces singularisse conoce por su capacidad para catalizar reacciones de transgalactosilación y sintetizar galacto-oligosacáridos (GOS). Anteriormente nosotros informamos la expresión heteróloga de un polipéptido bioactivo de longitud completa (rBHT) por una cepa recombinante de Pichia pastoris (GS115::aMF-HIS-TEV-rBht) Esta cepa recombinante contiene toda la longitud del gen Bht precedido por la señal pre prodel factor de acoplamiento a de Saccharomyces cerevisiae (aMF), un marcador de histidina y un sitio de escisión de TEV. Después de la inducción de metanol, la rBHT generada por GS115::aMF-HIS-TEV-rBht se secretó solo parcialmente y la mayor parte de la proteína permaneció asociada a la membrana celular. Para aumentar la cantidad de rBHT secretada, este trabajo examina la región aminoterminal de BHT no caracterizada (aminoácidos 1-110) que contiene dos supuestos dominios estructurales endógenos. La región aminoteminal incluye un dominio (aminoácidos 1-22) que puede servir como una señal líder de secreción clásica, mientras que los 23-110 aminoácidos restantes contienen una supuesta señal de secreción no clásica. Por lo tanto, nosotros evaluamos funcionalmente estos dominios generando cepas GS115 recombinantes de P. pastoris que expresan rBHT-HIS. Los resultados muestran la interferencia de la señal que afecta la secreción de proteínas cuando aMF se siguió por la señal líder clásica derBhtfi-22) (aminoácidos 1-22), mientras que la sustitución de la señal líder (aminoácidos 1-22) con el aMF (aMF-rBht(23-594)) mejoró la producción de enzimas secretadas y unidas a la membrana de P. pastoris hasta 50 y 14 veces, respectivamente. Para validar el papel de los dominios aminoterminales de BHT como promotor de la secreción de proteínas, nosotros probamos los dominios con una proteína alternativa no secretada, el fragmento scFv13R4 de anticuerpo variable de cadena sencilla anti-p-galactosidasa. Cepas recombinantes de P. pastoris que expresaba combinaciones de los dominios aMF y aminoterminales de rBHT, seguidas por el anticuerpo scFv13R4 generaron resultados que se correlacionan con la fuerte secreción obtenida por los recombinantes que expresan rBHT-HIS. Finalmente, las proteínas rBHT-HIS y rBHT activas obtenidas de los recombinantes más eficientes (GS115::aMF-rBht(23-594)-HlS y GS115::aMF-rBht(23-594)) se purificaron hasta la homogeneidad y se evaluaron las posibles alteraciones en la actividad enzimática. La actividad enzimática de las enzimas secretadas marcadas con 6XHIS y sin marcar se compararon, como lo demuestran las velocidades de generación de GOS.
6.6.2. Introducción
Existe un interés creciente en el uso de enzimas para la producción de alimentos funcionales, especialmente en el campo de la producción de prebióticos a partir de lactosa para obtener derivados de lactosa. Sporobolomyces singularis pueden asimilar la lactosa y la glucosa pero no la galactosa, lo que indica que solo son capaces de metabolizar la porción de glucosa de la lactosa. Además, el monómero de galactosa no utilizado solo se puede encontrar en el cultivo como componente de los galacto-oligosacáridos (GOS). Esta característica fisiológica condujo al descubrimiento de la phexosiltransferasa (BHT) (Blakely y Mackenzi 1021-25; Phaff y Carmo-Sousa 193-207; Spencer, de Spencer y Laluce 147-56; Gorin, Phaff y Spencer 1341-44; Gorin, Spencer y Phaff 2307-17). Los prebióticos como GOS sintetizados por BHT a partir de S. singularis se reconocen como GRAS y se utilizan ampliamente como aditivos alimentarios funcionales (Tzortzis y Vulevic 207-44).
Además de la síntesis de GOS a partir de la lactosa, la BHT también cataliza la hidrólisis de enlaces p-glucosídicos como ONP-Glu y PNP-Glu (Blakely y Mackenzi 1021-25). Las capacidades enzimáticas de BHT son particularmente atractivas con respecto a tecnologías competidoras, ya que es una de las pocas enzimas capaces de catalizar la producción de GOS con ventajas industriales que incluyen; la ocurrencia de la catálisis en ausencia de iones y cofactores adicionales, así como su capacidad para realizar reacciones de transgalactosilación independientemente de la concentración inicial de lactosa (Goslingy otros 307-18; Blakely y Mackenzi 1021-25).
En S. singularis, el gen Bht es un gen inducible que se reprime por glucosa y cuando está en presencia de un inductor como la lactosa, la enzima generada (BHT) se encuentra principalmente asociada a la membrana celular. Debido a la ubicación celular, la purificación de BHT requiere múltiples pasos de cromatografía y se ha recuperado de S. singularis con rendimientos muy bajos que van del 14% al 16% (Blakely y Mackenzi 1021-25; Cho, Shin y Bucke 2107-11; Ishikawa y otros 331-39). Como los protocolos convencionales de purificación de proteínas limitan la recuperación de enzimas y, por lo tanto, su aplicación tecnológica, se han evaluado estrategias alternativas. El primer enfoque consistió en exponer S. singularis a la selección a través de mutagénesis. Aplicando esta metodología, se seleccionó una nueva cepa sin represión de glucosa y capaz de generar un aumento de 10 veces de la BHT unida a la membrana; sin embargo, no se informó un aumento en la producción de enzimas secretadas (Ishikawa y otros331-39). Alternativamente, con fecha reciente describimos que la cepa GS115 deP pastoris es capaz de secretar un polipéptido rBHT recombinante biológicamente activo cuando se precede por la señal de secreción prepro de aMF que consiste en una secuencia de señal de 19 aminoácidos (secuencia previa) seguida de una secuencia de 66 aminoácidos y un sitio de procesamiento de endopeptidasa Kex2 dibásico (Kurjan y Herskowitz 933-43). En este estudio, el análisis del extracto libre de células y la actividad asociada a la membrana mostró que la mayoría de la enzima permaneció asociada a la membrana celular. Por lo tanto se muestra que la cepa GS115 deP. pastoris es un hospedero adecuado para la producción y secreción de la rBHT bioactiva que facilitará el procesamiento posterior y demostrará la viabilidad de la producción de la rBHT bioactiva secretada y asociada a la membrana (Dagher y otros, 2013).
Una mirada adicional a la secuencia de la proteína BHT nativa mostró que contiene características estructurales endógenas en el extremo aminoterminal, incluidos los dominios aminoterminales que pueden servir como señales de secreción clásicas y no clásicas adecuadas. Apoyando estos roles como señales líderes, se demostró que después del tratamiento de S. singularis con las enzimas líticas de la pared celular, la mayor parte de la BHT liberada carecía de la señal líder clásica del terminal amino (Ishikawa y otros, 331-39). Dado que la eficiencia de la expresión génica y la secreción de proteínas puede afectarse por los elementos estructurales de la proteína que participan en la asociación y secreción celular, las mismas funciones también pueden extenderse a la localización celular de la proteína cuando se expresa por la cepa GS115 de P. pastoris.
En este estudio, nosotros probamos el papel fisiológico de los dominios aminoterminales de BHT y su relación con la secreción de proteínas por la cepa GS115 deP. pastoris. Además, las funciones secretoras de los dominios aminoterminales de rBHT se validaron usando recombinantes quiméricos que contienen como carboxilo terminal el anticuerpo scFv13R4 anti-p-galactosidasa de cadena sencilla. El anticuerpo scFv13R4 es un ejemplo de una proteína de cadena única hiperestable no secretada que es independiente de la formación del puente disulfuro para la actividad de unión (Martineau, Jones y Winter 117-27). Como tal, scFv13R4 se ha expresado heterólogamente en Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, y células de ovario de hámster chino (CHO) (Visintin y otros, 11723-28; Grage y Rehm 254­ 62; Bach y otros, 79-93).
6.6.3. Resultados
Análisis de la secuencia de proteínas de la ¡5-hexosil transferasa (BHT) in silico. La porción carboxiterminal (aminoácidos 111a 594) del polipéptido BHT (594 aminoácidos) tiene notable homología con las p-glucosidasas. Este dominio de glicohidrolasa I (GHI) contiene el supuesto ácido/base catalítico, el nucleófilo catalítico y tres residuos de asparagina potencialmente necesarios para la N-glicosilación de la proteína (Fig. 7A). Sorprendentemente, el extremo aminoterminal de BHT reveló una región única que abarca los primeros 110 aminoácidos. Esta región comprende un dominio de señal líder clásico aminoterminal (aminoácidos 1 a 22) seguido de una señal predicha de secreción no clásica (NC) de baja complejidad (http://www.cbs.dtu.dk/services/SecretomeP) (aminoácidos 72 a 83) (http://mendel.imp.ac.at/METHODS/seg.server.html) La señal líder del extremo aminoterinal (aminoácidos 1 a 22) se puede dividir en la región N (extremo aminoterminal; aminoácidos 1 a 5), la región H (hidrófoba; aminoácidos 6 a 17) y la región C (extremo carboxiterminal; aminoácidos 18 a 22) (Fig. 7B). Algoritmos alternativos como el programa web Phobius (http://phobius.sbc.su.se/) y el algoritmo SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) también predijeron la supuesta señal líder clásica y los posibles sitios de escisión entre los residuos 17 y 18 y entre 22 y 23. Además, se predijo que la señal líder clásica contenía cinco aminoácidos que tienen contacto con la membrana dentro de la región H (RHYTHM, http://proteinformatics.charite.de/rhythm/) y una distribución de carga que podría facilitar la localización y secreción de proteínas de membrana (Boyd y Beckwith 1031-33). El algoritmo de predicción de la región transmembrana (http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED form.html) también pronosticó una región de residuos hidrofóbicos de 1-17 y 177-199 en BHT, típico para proteínas integrales que abarcan la membrana y la región no citoplasmática (aminoácidos 23-594) como se representa en el diagrama de hidropatía de Kyte y Doolittle (Fig. 7C). Estas características estructurales también pueden indicar que la señal líder clásica aminoterminal puede actuar como un ancla de membrana durante el paso a través de la vía secretora de levadura.
Los dominios aminoterminales participan en la secreción de proteínas. Para investigar las funciones fisiológicas probables de los dos dominios de secreción aminoterminales (señales de secreción clásicas y no clásicas), se probó la expresión del dominio BHT carboxiterminal (aminoácidos 111 a 594) y del anticuerpo anti-p-galactosidasa de cadena única (scFv13R4). Cepas GS115 recombinantes estables de P. pastoris se obtuvieron por integración cromosómica de las combinaciones genéticas modificadas apropiadas precedidas por los dominios amino terminales derBht y/o la fuerte secuencia prepro de aMF de 9.3 kDa. Las combinaciones de genes derBht y scFv13R4 se insertaron posterior al promotor AOX1 y seguidas del marcador 6XHIS carboxiterminal para ayudar a la detección y purificación Fig. 8A y 8D (ver Materiales y Métodos).
El reemplazo de la señal líder (aminoácidos 1 a 22) con la fuerte señal de secreción prepro de aMF (GS115::aMF-rBht(23-594)-HIS) aumentó la secreción de proteínas a más de 19 veces (9.80 pg.ml'1) en comparación con la expresión de la rBHT-HIS de longitud completa precedida por la señal de secreción aMF (GS115::aMF-rBht-HIS) (0.49 pg.ml'1) (Fig. 8B). De la misma manera, en ausencia de la aMF, la señal líder fue capaz de dirigir la proteína heteróloga para la secreción GS115::rBht-HIS) (6.35 pg.ml'1). Además, se detectó la secreción de proteínas en ausencia de las señales aMF y líder (GS115::rBht(23-594)-HIS) (4.65 |jg.ml-1), lo que sugiere que tanto la señale de secreción líder clásica como la no clásica contienen información dirigida a la proteína para la secreción.
Para validar que los dominios aminoterminales, como se describió anteriormente, dirigen las proteínas a la vía secretora, elegimos el anticuerpo scFv13R4, una proteína intracelular sin secuencias de señal. Los diagramas del anticuerpo scFv13R4 quimérico se muestran en la Figura (8C). El scFv13R4-HIS cuando lo expresa GS115 ::scFv13R4-SIS (sin señales de secreción líder) no se pudo detectar en el caldo de cultivo mediante tinción con plata SDS-PAGE o análisis de transferencia Western (datos no mostrados). Secreción de scFv13R4-HIS por GS115::rBht(1-110)-scFv13R4-HIS o GS115::rBht(23-110)-scFv13R4-HIS manifestado cuando cualquier scFv13R4se fusiona con la señal de secreción líder clásicaBht (25.17 jg .m l-1), o cuando se fusiona con la señal no clásicaBht (7.03 jg .m l-1) De la misma manera, como ocurre con BHT-HIS, la secreción dirigida por aMF, (GS115::aMF-scFv13R4-HIS) proporcionó el nivel más alto de proteína secretada (91.02 jg .m l-1)
Actividad enzimática y análisis de Western blot de rBHT-HIS expresado por la cepa GS115de P. pastoris. Para confirmar que la expresión de la proteína se correlaciona con la actividad enzimática, la actividad de las rBHT-HIS secretadas y unidas a la membrana se midieron usando ONP-Glu como sustrato (ver Materiales y Métodos). Todas las cepas recombinantes secretaron rBHT-HIS en cantidades detectables y los valores de actividad reflejaron aumentos en la proteína secretada. La proteína secretada porGS115::aMF-rBht(23-594)-HIS mostró una actividad enzimática de 3.7 mU.OD-1 que fue 6 veces mayor que la actividad medida cuando la secreción la condujo la región aminoterminal completa (aminoácidos 1-110) (GS115::rBht-HIS (0.63 mU.OD-1)). De la misma manera, la actividad enzimática medida de la proteína secretada por GS115::aMF-rBht(23-594)-HIS fue 53 veces mayor que la obtenida del recombinante que contenía las señal aMF y la líder (GS115::aMF-rBht-HIS (0.07 mU.OD-1)). El recombinante GS115::rBht(23-594)-HIS (0.26 mU.OD-1) muestra una cantidad reducida de enzima secretada activa Tabla 8.
También se probó la actividad de la enzima unida a la membrana mostrada por las células en reposo de cada recombinante. Encontramos valores de actividad que se correlacionan con la proteína secretada total, lo cual muestra un aumento en la actividad unida a la membrana de 15 veces para la cepa GS115::aMF-rBht(23-594)- HlS (21.52 mU.OD-1) y un aumento de 1.3 veces para la cepa GS115::rBht-HIS (1.94 mU.OD-1) en comparación con GS115 ::aMF-rBht-HIS (1.48 mU.OD-1) El recombinante GS115::rBht(23-594)-HIS (0.15 mU.OD’1) muestra una cantidad reducida de enzima unida a la membrana, lo cual confirma que este recombinante redirige la proteína a través de la supuesta vía de secreción no clásica. En general, estos resultados muestran que ni aMF ni la señal de secreción líder de BHT podrían completar la secreción de rBHT-HIS, lo cual puede relaionarse con la presencia de una región transmembrana predicha entre los aminoácidos 177 a 199.
El análisis por Western blot de los extractos libres de células usando el anticuerpo anti-HIS confirmó los valores de proteína secretada por GS115::aMF-rBht(23-594)-HIS, GS115::rBht-HIS y GS115::rBht(23-594)-HIS (Fig. 9A). En cada caso, estaba presente la banda prominente rBHT-HIS correspondiente a una masa molecular de aproximadamente 110 kDa. Estos resultados coinciden con los patrones de migración de cromatografía de exclusión por tamaño y SDS-PAGE previamente informados (Dagher, Azcarate-Peril y Bruno-Bárcena). El análisis por Western blot de los extractos celulares obtenidos de GS115::aMF-rBht(23-594)-HIS, GS115::rBht-HIS y GS115::aMF-rBht-HIS también exhibió una masa molecular de aproximadamente 110 kDa, mientras que GS115::rBht(23-594)-HIS mostró bandas prominentes entre 98 y 64 kDa que pueden indicar degradación intracelular o patrones de glicosilación alternativos (Fig. 9B).
Actividad hidrolítica de rBHT. Además, probamos las enzimas secretadas para proteínas marcadas con HIS y sin marcaje de GS115::aMF-rBht(23-594)-HIS y GS115::aMF-rBht(23-594), respectivamente. Las enzimas suministraron resultados comparables y estuvieron activas en un amplio intervalo de temperaturas (10 a 50°C) y con valores de pH (2.8 a 6). Se observó una actividad máxima de pH 3.6 a 5 (91 a 100% de la actividad máxima) seguido de una disminución constante hasta pH 2.6 (43% del máximo) y hasta pH 6.8 (29% del máximo). De la misma manera, la temperatura óptima se encontró en el intervalo de 40 y 45°C (actividad máxima del 97 al 100%) pero disminuyó rápidamente a temperaturas superiores a 50°C e inferiores a 20°C (menos del 25% del máximo) (datos no mostrados) La enzima era estable en 50 mM de tampón de fosfato de sodio a pH 5 a 4°C durante al menos 6 meses, y la actividad no se afectó por el almacenamiento a -80°C. Los valores para las constantes cinéticas para la enzima secretada por GS115::aMF-rBht(23-594)-HIS se obtuvieron de la ecuación de Hill (Km 0.79 mM y Vmax 3.97 mmol.min-1 por mg-1 de enzima a 42°C a pH 4). Esos hallazgos coincidieron con nuestros informes anteriores y los de otros (Blakely y Mackenzi 1021-25; Cho, Shin y Bucke 2107-11; Gorin, Phaff y Spencer 1341-44; Gorin, Spencer y Phaff 2307-17; Ishikawa y otros, 331-39; Sakai y otros, 285-93; Shin, Park y Yang 787-92; Shin y Yang 484-89; Dagher, Azcarate-Peril y Bruno-Bárcena).
Estabilidad de rBHT. Para examinar la estabilidad a largo plazo de la enzima, todas las cepas recombinantes recién inducidas se incubaron en un tampón que contenía glucosa al 2% y se midió la actividad hidrolítica de la rBHT secretada y unida a la membrana con el tiempo. La rBHT-HIS secretada que se obtuvo de todos los recombinantes a través de la vía de secreción clásica o no clásica se mantuvo estable durante el período de prueba de una semana y retuvo más del 95% de la actividad inicial. Se observó la misma estabilidad cuando las células en reposo que contenían la enzima asociada a la membrana se expresó por GS115::aMF-rBht-HIS, GS115::rBht-HIS y GS115::aMF-rBht(23-594)-HIS. Sin embargo, cuando se prueban células en reposo que contienen enzimas asociadas a la membrana expresadas por GS115::rBht(23-594)-HIS, la actividad comenzó a disminuir dentro de las 24 h apuntando a la vía de secreción alternativa no clásica.
Purificación y caracterización de la rBHT-HIS generada por GS115::aMF-rBht(23-594)-HIS. La proteína rBHT expresada por GS115::aMF-rBht(23-594)-HIS se purificó utilizando la cromatografía de afinidad de níquel. La colocación del marcador 6XHIS en el extremo carboxiterminal permitió con éxito la recuperación en un solo paso de más del 73% de la actividad enzimática original y después de SDS-PAGE se observó una única banda de polipéptidos de aproximadamente 110 kDa (Fig. 9C). La purificación de proteínas de 6.54 veces del sobrenadante del cultivo recuperó 7.24 mg de enzima, lo que produjo una actividad específica de 18.45 mU.mg-1 a 42°C y a pH 4 (Tabla 9). Además, siguiendo la misma metodología, nosotros purificamos la rBHT-HIS secretada por los diferentes recombinantes y encontramos actividades específicas comparables que van desde 18.45 a 18.65 mU.mg-1. Una determinación de las secuencias aminoterminales del polipéptido secretado por GS115::aMF-rBht(23-594)-HIS mostró que todo la proteína rBHT(23-594)-HIS estaba presente en el cultivo (residuos VXYPG) además de un producto que contenía dos aminoácidos aminoterminales adicionales (residuos E-A-V-X-Y). La variabilidad en la escisión de los aminoácidos A-E durante la secreción puede afectarse por la secuencia de aminoácidos circundante y la estructura terciaria (Cereghino y Cregg 45-66). La secuencia no clásica restante no introdujo un nuevo sitio de escisión.
Impacto de HIS en el marcador de la actividad transferasa de rBHT. Los recombinantes GS115::aMF-rBht(23-594)- HIS y GS115::aMF-rBht(23-594) se emplearon además para evaluar comparativamente si la presencia del marcador HIS puede afectar la síntesis de GOS a partir de la lactosa. La acumulación de GOS se analizó cuantitativamente por HPLC a partir de mezclas de reacción que contenían 220 gL-1de lactosa inicial, 0.5 U de rBHT g-1 de lactosa se incubó a 30°C.
La Fig. 10A muestra la acumulación comparativa de GOS y el consumo de lactosa a lo largo del tiempo cuando la reacción se catalizó por las enzimas secretadas marcadas o no marcadas con 6XHIS. En ambos casos, la tasa máxima de producción se observó durante las primeras 25 h con galactosil-lactosa como producto principal. Como confirmación de la inhibición enzimática competitiva de glucosa descrita previamente después de 125 h, la acumulación de galactosillactosa (75 gL-1) fue estacionaria, alcanzando un promedio de conversión del 67% del 60% de lactosa inicial utilizada (Dagher, Azcarate-Peril y Bruno-Bárcena).
Cuando se utilizaron células en reposo que expresaban HIS asociado a membrana y rBHT no marcado con HIS, también se confirmó la acumulación comparativa de los GOS y el consumo de lactosa a lo largo del tiempo. (Fig. 10B) muestra que la presencia de HIS en el estremo carboxiterminal no tuvo impacto en la velocidad de reacción inicial de la formación de galactosil-lactosa (1.87 y 1.7 g.L-1.h-1). Como se informó anteriormente, la glucosa se consumió por las células en reposo de P. pastoris mientras que la galactosa se usó para sintetizar los GOS (68% de rendimiento (g/g)) acercándose al rendimiento teórico de 75% (Dagher, Azcarate-Peril y Bruno-Bárcena).
6.6.4. Discusión
Los prebióticos son derivados de carbohidratos comercializados como alimentos funcionales y promovidos activamente para mejorar la salud del consumidor, cuyo objetivo es estimular específicamente el crecimiento de bacterias beneficiosas en el intestino. La fuerza fundamental que impulsa el desarrollo de los prebióticos es la promesa de procesos de producción más eficientes con costos operativos más bajos. Sin embargo, la producción o síntesis de derivados de carbohidratos específicos por los métodos químicos es compleja y requiere pasos de protección y desprotección debido a la presencia de varios grupos hidroxilo de reactividad similar (Sears y Wong 2344-50). Por lo tanto, el desarrollo de enfoques enzimáticos es de interés práctico y la modificación genética se ha utilizado ampliamente para modificar la actividad enzimática, para obtener un conocimiento más profundo de los mecanismos catalíticos y para aumentar la secreción de proteínas. Las proteínas destinadas a la secreción generalmente se preceden de señales líderes aminoterminales de 20-30 aminoácidos y finalmente se procesan por señales peptidasas unidas a la membrana (Von Heijne 17-21). La secreción de proteínas por P. pastorisestá influenciada por la naturaleza de las secuencias de nucleótidos iniciales y, en ocasiones, requiere la optimización del codón, así como la consideración de los patrones de glicosilación, la estructura tridimensional final, las condiciones de cultivo y la composición del medio (Damasceno, Huang y Batt 31-39). Además, la distribución de aminoácidos cargados dentro de los dominios líderes juega un papel importante para facilitar la localización de la membrana y las proteínas secretadas (Boyd y Beckwith 1031-33).
Como se informó anteriormente, P. pastoris ofrece ventajas sobre E. colipara la expresión de la rBHT gracias a su capacidad para incorporar eficientemente las modificaciones postraduccionales que permitieron la producción heteróloga de pequeñas cantidades de rBHT bioactivo. Los análisis in silico de BHT sugirieron que esta enzima contiene dominios transmembrana que debían estudiarse para aumentar la secreción de la enzima por P. pastoris.La única región proteica de BHT (1-110 aminoácidos) contiene dos dominios que funcionan como señal líder clásica (BHT)(1-22)) y dominios de señal de secreción no clásicos (BHT(23-110)) La señal líder clásica también se dirige a la proteína para realizar su función en la membrana celular (de acuerdo con lo predicho por el método RHYTHM y las gráficas de hidropatía, Fig. 1). En particular, la presencia de aminoácidos básicos como la arginina en la posición 17 podría implicarse en la eficacia de la secreción y la orientación de las proteínas en la membrana (Fig. 1).
Los datos que aquí se presentan muestran la interferencia de la secreción de proteínas por GS115::aMF-rBht-HIS debido a la presencia simultánea de la señal aMF y la líder (BHT(1-22)) Los niveles de secreción de proteínas se compararon a los valores informados previamente por GS115::aMF-HIS-TEV-rBht (Dagher, Azcarate-Peril y Bruno-Bárcena). Por otro lado, los recombinantes GS115::rBht-HIS y GS115::aMF-rBht(23-594)-HIS obtuvieron una mayor acumulación de proteína secretada careciendo de aMF o BHT(1-22), respectivamente. Por lo tanto, se demostró que el dominio de señal líder (BHT(1 22)) participa en el mecanismo mediado por péptidos señal (vía secretora clásica) comparable a aMF. Ambas señales líderes fueron capaces individualmente de aumentar la expresión de proteínas de la rBHT asociada a membrana y la secretada en comparación con GS115::aMF-rBht-HIS, que contiene ambas secuencias líderes. Los mejores valores para la proteína rBHT bioactiva secretada (aumento de 50 veces) y unida a la membrana (aumento de 14 veces) se obtuvieron mediante el recombinante GS115::aMF-rBht(23-594)-HIS (tabla 3). La purificación posterior de la proteína bioactiva expresada a partir de GS115::aMF-rBht(23-594)-HIS resultó en una proteína muy pura por SDS-PAGE con una actividad específica de 18.45 U.mg-1 (Tabla 4). La masa molecular de la rBHT (110 kDa) no se desvió entre la rBHT asociada a la membrana celular y la secretada y mostraron una actividad enzimática, termoestabilidad, reutilización y estabilidad de almacenamiento similar en comparación con la rBHT de nuestro estudio anterior (Dagher y otros, 2013).
Esperábamos que la eliminación de ambos dominios líderes (BHTfi-22)) y aMF dificultaría la secreción de enzimas. Sin embargo, la eliminación de aMF y BHTfi-22) todavía mostró bajas cantidades de proteína secretada. Esto también confirma que la región única de 110 aminoácidos contiene una función dual por la cual el dominio líder BHTfi-22) actúa como una señal de secreción eficiente (vía de secreción clásica) y el dominio de la BHT predicha(23-110) funciona como una señal de secreción alternativa (vía de secreción no clásica). Los análisis por Western blot muestran proteólisis que indica una mayor sensibilidad a las proteínas en la célula. La mayoría de la actividad hidrolítica medida se detectó como bandas múltiples por debajo de la masa máxima de 110 kDa, lo que probablemente afecta la cantidad de enzima secretada (Fig. 9A-9C). Nosotros especulamos que las secuencias de señal pueden actuar para proteger la proteína durante la secreción al mantener la proteína alejada de las proteasas dentro de la vía secretora.
Aunque la mayor cantidad de proteínas se secreto por GS115::aMF-rBht(23-594)-HIS, una cantidad significativa permaneció unidas de manera estable a la membrana, posiblemente debido a la movilidad limitada predicha en la membrana por la presencia del dominio transmembrana dentro del dominio carboxiterminal de la proteína (aminoácidos 177-199). Por lo tanto, para confirmar la función fisiológica de estos dominios como señales secretoras, generamos nuevas proteínas quiméricas reemplazando el dominio de la rBHT(23-594) con la proteína anticuerpo scFv13R4. El líder clásico (1-110) de la BHT seguido por un supuesto líder no clásico de la b HT(23-110) y el dominio aMF se colocaron en el marco en la posición aminoterminal con scFv13R4. Los análisis de estos nuevos recombinantes corroboraron la función secretora líder al dirigir el anticuerpo a la secreción. Nuestros resultados confirman que la elección de las secuencias de señal tiene un fuerte impacto en los niveles de producción y secreción de proteínas, incluidos la BHT recombinante y el scFv13R4. Es notable el hecho de que la nueva señal líder más pequeña (22 aminoácidos) tiene una ventaja de tamaño en comparación con aMF (66 aminoácidos) y se demostró aquí que es una nueva secuencia única capaz de dirigir la secreción de proteínas heterólogas. Este dominio de señal líder agrega una nueva característica que puede incorporarse a las enzimas intracelulares que, de lo contrario, deben extraerse por interrupción utilizando medios mecánicos o la permeabilización con tratamientos químicos (Panesar y otros, 530-43).
El desarrollo molecular continuo de la BHT ayudará a abordar los problemas de las industrias alimentarias para enzimas con propiedades novedosas como la termoactividad, la estabilidad al frío y la síntesis de oligosacáridos específicos. Los presentes hallazgos motivan un análisis estructural adicional para dilucidar las características que contribuyen a la actividad de transglicosilación y la especificidad del sustrato. La mutagénesis de los sitios catalíticos y la mutagénesis racional basada en la estructura 3D allanarán el camino para alteraciones en la especificidad del sustrato para la producción de nuevos GOS como candidatos prebióticos.
Tabla 7. Cepas y plásmidos utilizados en este estudio.
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Tabla 8. Actividad enzimática de la rBHT-HIS secretada y la unida a la membrana por diferentes recombinantes de P.
pastoris
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6.7. Referencias para la Sección 6.6
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37. Torres, D. P. M., M. D. F. Gongalves, J. A. Teixeira, y L. R. Rodrigues. 2010. Galacto-oligosaccharides: Production, properties, applications, and significance as prebiotics. Compr. Rev. Food Sci. Food Saf. 9:438-454.
Se entiende que, aunque la invención se ha descrito en conjunto con la descripción detallada de ésta, la descripción anterior pretende ilustrar y no limitar el alcance de la invención, la cual se define por el alcance de las reivindicaciones anexas.
8. Listado de secuencias
SEQ ID NO. 1
>gi|345649663|gb|JF298281.1| Construcción sintética del gen de la beta-hexosil transferasa (bglA), cds parciales
ATGAXGCTGCATGCTGCACTGCTAGTAGCGCTGCCATGXGTTGTXTTGGCGCGCCCGGCCGGAGCGGXTA
CTTATCCGGGAGCCATTCCTCTGTCCCTGACGAGCAATTACGAAACCCCAAGTCCGACAGCAATCCCGCT
GGAGCCAACACCGACGGCTACCGGTACAGCAGAATTAGATGCGCTGTGGAACTTAGTCGAAGCTCAGrAC
CCAGTTCAAACTGCTGCAGTGACAACTTTGGTGACAGTGCCCGATGATTATAAGTXTGAGGCAGATCCAC
CGAGXTAXGCATXAGCAGGGTAXGAAACAAGCGAGAXIGCCGGACTGAAGXTICCAAAGGGGTITAAGTX
TGGTGTXGCGGGGGCAGCCATTCAAGTTGAAGGXGCAGCAAAAGCCGAAGGGCGGGGCCCAAGXACCXGG
GATTATCTGTGTCATCACTATGCCAGCACGCAGTGTAACAATIATGATCCCGATATTACAACCAACCATT
ACTACCTGTACCCATTGGACTTTGCGCGCCTGCAACACCTAGGCATTAACACTTACTCGTTTTCAATTTC
ATGGACGCGTATTTATCCATTGGGCGCAGGCTATGTTAATGAAGCAGGGTTAGCCCACTATGATGCCGTA
ATCCATAGTGCCAAGAAGTATGGTCTGGAACCAGrGGGCACCGTTTTTCACTGGGATACGCCACTGTCTC
TGATGCTGAAATACGGTGCCTGGCAAGATACTGGTGACCAAAITGTTAAGGACTTTGTTACCTATGCCAC
AACTGTGTTTAAGCGTTATGGTAATGAAGTCAAGACGTGGTTTACTTTCAATGAACCACGGGTTTTCTGT
TCACAAAAIAGTGGICTGCCAIACAATCTGACGXAICCAGAAGGXAXIAACAGCACCTCCGCTGIATXIC
GTTGCACCTACAATGTTCTGAAAGCTCATGGTCArGCTGTTAAAGTGTATCGGGATCTAGTTGCCTCCGG
GACCATXGCGGCAGGTGAAATCGGCTTTAAATCCGATGATAACTACCCAATCCCGGCCCGTCCAGGGAAC
GCCGATGACGAGGAATCAGCCAAGCGTCACGAGGCTTTTCGCATTGGGATTTTTGCGCAACCGGTTTATG
GTAATGGCGATTATCCAGArGTTGTTAAAGAAACTGTTGGAGATATGCTGCCGGCCCTGACGGATGAAGA
TAAAGGATACATTAAAGGTAGCGGAGATATTTTTGCGATTGACGGGTATCGTACCGATATTTCCCATGCG
GCTCXGAACGGGATCGCGAATTGXATTCGCAACCAAAGXGACCCGAATTGGCCAGTGTGXGAAGAAGGGT
CAGAXCCTXTTGCTCATGTXTACCCATCCGGGTTXGCTATTGGTCAATCAGCCGAXCCACTGTCTTCATG
GTTAGTCAACTCAGCCCCGrTXAXCCGCGATCAACXGAAGTTTCXGACACAAACCXACCCTGCXAAGGGX
GGTAXTXAXTTCTCGGAAXXTGGXXGGGCTGAAGACGCCGAATAXGATCGTCAACXGCXGXATCAAAXTA
CCTGGGATGGTCTGCGTACGCAATACCTGACGGACTATCTGAGCCAGCXGCTGTXGGCTGTGCACAAAGA
CGGGATXAATCTGCGAGGCGCGCXGACGTGGAGXXXTGXCGATAATTGGGAGTGGGGTTXAGGGATGCAA
CAGAAATTCGGATTTCAGTrTGTTAATCAATCAGATCCCGATCTGACACGCACGTTTAAACTGAGCGCTC
ACGCTTACGCCCAATTTGGGCGTAATCATCTG
SEQ ID NO. 2
>gi|345649664|gb|AE014215.1| beta-hexosil transferasa [construcción sintética]
MMLHAALLVALPCWLARPAGAVTYPGAIPL5 LTSNYETPS P TAIPLEPTPTATGXAE LDALWNLVEAQY
PVQTAAVTT LVTVP DDYKFEADPPSYALAG YETSEIAGLKF P KGFKFGVAGAAIQVEGAAKAEGRGP STW DYLCHHYASTQCNNYDPDITTNHYYLYPLDFARLQHLGINTYSFSISWTRIYPLGAGYVNEAGLAHYDAV IHSAKKYGLEPVGTVFHWDTPLSLMLKYGAWQDTGDQIVKDFVTYATTVFKRYGNEVKTWFTFNEPRVFC SQNSGLPYMLTYPEGINST3AVFRCTYHVLKAHGHAVKVYRDLVASGTIAAGEIGFKGDDHYPIPARPGN
ADDEESAKRHEA F R IG IFAQPVYGHGD YPDW KE XVGDMLPALT DEDKGYI KGSGDI F A I DGYRTDI SHA ALNGIANCIRNQSDPHHPVCEEGSDPFAHVYPSGFAIGCSADPLSSWLVNSAPFIRDQLKFLTQTYPAKG GIYFSEFGWAEDAEYDRQLLYQirWDGLRTQYLTDYLSQLLLAVHKDGIMLRGALTHSFVDNWEWGLGMQ QKFGFQFVNQSDPDLTRIFKLSAKAYAQFGRNHL
SEQ ID NO. 3
FP#1 aMF-6XHIS-TEV(QyMFrBHT (Xhol-Noth
ATGAGAT T TC C T TCAAT T T TTAC TG C AG T I T TA T TC GCAG C A T C r; TC C GCAT TAGC TC-C T CCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGT TACTCAGATTTAGAAGGGG ATTT C G A T G T IC C T G TT TT G C C A TT TT C C A A C A G IA C A A A T
:'iACG GGT TA T TG T T TATAAATAC TAC TA T TGC CAG CATTG C T GC TAAAGAAGAAGGGG TA TC TC TCGAGAAAAGAGAGGCT GAAG C T CACC ACCAC CAC C AC CAC G AAAACC 7 G C A T IT T CACATUAI fJC IC C A IC C TC CAC IC C I A C I ACC CC I C C C A I I C I I C 11 CT CCT TC CC T CC GC CG GA GC GG TTAC TT A TC CG GG AGC C A T TCC T í: TG TC C í: TG Ai: GAG í: AA TTA C GAA ACC CC AAGTCC GA C AC-CAAI CC CG C T GGÁG C C A AC AC CG AC C-G C I AC C GG T AÜÁGC AG AAT TA GATG CG i T GT GGAA CTT AG TC GA AG TTCA CTA CC f A G TTC A A Ai: TGC T GC AG T GAGA Ai: T T TG G TG Ai: AG TGC CCGA TG AT TA TA AG TTTGA GGCA GATí: CA C i: GAG T TA TGC A T 7A GCA G G G TA TG A A A CA A G CG A G A TTG C CG G A CTG A A G TTTÍi:A A A G G G G TTTA A G TT"G G TG TT GC GG GG GC AG C CAT T í: A AG TT GA AG GT GC AGC AA AA GC CGAA GG GCG G GG C CC AAG T ACC IC CC AT TATC TC I C I C L TC AC TATC C CAC C AC CC AC TC 7AA.C A A TTA T CA IC C T G A TA T T ACAACCjIV C C A T IA IT A C C T C T A IC T A T T G C A C T T T C C C C G C IT G C A A C A C C T A C Ü C A T I A A C A C T T A C T C G IT IT C A A T T T C A IG G A C ^C G T A T T T A IC C A T IG G C C G C A G G irA T G T T AAT C AA CC AG C-G I T A.CC CC AC T AZÜ AT C-C C G IA A T C C A T A C IG C C AAG AA GZA TG G IC TC CAAC CACT CC C C A C IC T T T TTC A C TC C CATAC CC CAC TG TC TC T CAT C CTG A A A TAC CC I GC C T GG CA AG ATAG TGG TG AC C A AA TT G T T AA GG AC T TTG T T AC C TA T GG C AC A AG T G TG ITT A A G CGZTATC-GTAATGAAG T CAAGAC C-TGG T T TAC T T TC AATGAACCACGGGZ T T TC TC T T C A C A A A A ZA C IC G TC TC CCA TACAATC T CACG TATCCAG-AACG TA T IA_AC AGCACC TC CG CTG T AT TTC G T TG CA CC TA CAAT G T TG T GA AA GC T í: A T GG TCA T GC TG T T A AA G TG TATC GGGATC TAGTTGC CTCC G G G A C CA TIG C GGCAGGTGAAATCGGC TT TAAATCCGAT GATA ACTA CC C AAT C CC GG CC CG TC C A GG GA.A CGCC GATG AC GA GGA A TC AGC G A AG G G T CA CGAGGCTT TTC GG A T TGGGA T T T T T GC GCA AC CGG T T T A T GGTAA T GG GGA" I A T C CA G A T G T T G T T A A A G A A A T T G T T G G A G A T A T G C T G T C G G T IT rG jL C r^A T oA A ^A T A A A ^G A TAGATTjlAAÜ^TAGIGGAGATATTTTTG'TGAT T G r 'T G '^ T A T I G T A 'T C o A r A T i r iC I A l CC GC CT T T CAACC C GAT CG CC AAT T C IA I IC C CAAC CAAAG I GAT CC C A A IZ C GC C AG TG IG T G A A G A A G G G IC Á G A lC C T Z IZ G C T C A rG IZ IA C Ü C A IC C G G G T IZ G C IA IZ G G IT A A IC AG C C CAZC T AC T GTC T IC AT G C I I A C IC AAC T CAC C C C C G TTTA TC C C C G.-.7C AAT TG AAG T TT C T GA G AC AAAG C T AC GC TG C TAAC-GG TGG TA TT TA T 7 T C TC G GAAT T TC-G T TGG GC TG AA GA CGCC GA A T A TG AT CG TC AA G T GC T G T A T CAAA T T Ai: C TG G GA TGG TC TG G G T AC GC AA TACC TGAC C-G AC T AT C T GAGC C AGC T GC TG T T C-G C T G T GCAC AAAGAC GGGA T T AATC TG GG AG GCG C Gí: T GA CG TG GA GT T T TG T CGA T AAT T GG GA GTG G GG TT T AGGG A TG i: A Ai: AG AA AT TCGG AT T T í: AG T T TG TT AA T ÍA A T CA GATí: CC GA TC T G AC ACGC ACG T T T AAAC TGAGCGCTCACGC T TAC GC CCAAT ITG G G C G T AATC A I C TGTAA
SEQ ID NO. 4
FP#1 aMF-6XHIS-TEVfQ/M)-rBHT
MR F P S IF T A V L F A A 53 A L AAPVT: TT T Z n Z T A Q IP A E A V IG Y S D LEC D F D V A V L F F SN5 TN rJ G L L F IM T T IA S IA A K E E G V S L E K R E A E ñ H H H H HI-IKK T. Y h 'Q M tí: I-IA A :. T. V A T A C W T. A R A A G AV T YP G A T ? T.0 T .T 0 M í Z T ? C P TA 7 P T Z P TP T A T G TA F. T .DA T .GT 1 TV F.A 'jY PV Q T A A V T T . V IV U- D Z Y X Z Z A D F P !-¡ YA. L A i i Y E T I-i E 7 A i i L K FP K i i Z K F i PC A i .AA 7 ^ V ECIAAKA Z : i RC ÍP X WD ? LC HH YAS rQCNÜYD FDITTH PíVYL^ f F LDFARLQH LGIHTY5 FSlSWTRI^fF LGAGYV 7]Z A ; LAH Y CAV I H :■! A K X T G L Z F \ri ÍT VFXW DTP L ^ L t ]L K Yt i A 'i:Q =:T; iDQ IV K T T V T T A T T ' f >:r v g i:f v z t ^ f t f :]f ? z v f g G'Qk g c : .p v t ; t.t y p z g i ' t:g t g a v t z g t y i:v t .k a x g h a v k v y r □ l v a :■; ( : a a ( : e i ( ; ? :■; x m i m y p i p a r ?t it: a z z z z s a k r h e a f p : : í i f a q p v y : í i :z v p DWKETVGDMLF A LTDE D KGTf IKGS GDIFAIDGYFIDISR AALMGIAWCIRMQ5 DFWWP V t: z z ; i x dp f a :-: v y e s e r a : : ;q x a d ü l : ax h l v i : i : a p z i r pg l k f l z " z y ü k g ( :: y f s e f t ; AE DAE YDRQLLYQITWDG LRTQ Y LTDYLSQ LLLAV H KDQ1H LRGA.LTMSFVDHMBHGLGM QQ X b 'i; t •<':;£ V n q e d i z l z z I F X L a AH a y a q f c k m h 1
SEQ ID NO. 5
FP#2 aMF-6XHIS-TEVfQ/MHBHT-GXHIS fXhOl-Notl}
A7 y ACJAT T IC C r TCflAT 7 T T TAC TGC rtGTT TTA 77 C GCAGCñT C C 7 CCGC.ATT A GC TGC 7 C C AGTC AAC AC TAC AAC AG AAGflTGAAACGGCAC AAñTTCCGGC T<? AíiGCTGTCftTCGGT TAC ICAG AT T TkQPJiG Q Q QP T T TCGAT Q T TGCT 0. T 11 TGC CAT T T T CCAACAG CACAAAT AAO GGGT T AT TG T TT ATAAA TAC TAC TA T TGCCAG CA T TGC TGC T AAAGAAGAA GGGC-7 A TC TCTCGAGAAAAGAGAQGCTGAAGCT CACCACCACCACCACCACGAAAACCTQTA TTTT C AGA TGAT G C TGCAT G C G C A C TGC TA G TA.GCGC 7 G CCAT G TGT t G IT TTGGC G CGCC C G GCCGGAGCGGT T A C IT A CCCGGGAGCCATTCCTCCG TCCCTGACGAGCAATTACCAAA.CC C 7 AAG TC G G A CAGCAAC 7 CCGC TGC-AG 7 r.ppCPC C GACGC-C TAC C 3 3 TACAC 7 A GAA1T A G A T 3CGC T G T GG A A C IT A G TC GAAGCI CAGTACCCAGT T CAAACT G C TGCAGT GACAA.CT I 7 G G TGAC A G TGCCC GA 3 GA T TA TAAG 7 T TGAG G GA GA TC CAC C GA G T TAT GG A T TAGCA GCC TATC-AAA GAAGCC-A CATTGCCGGA G TGAAGTTT CCAAAGG G G T T TAAG G G T 3G TG G G GC G GGGC-C A G GC A TT C A A G T TG A AC-GT 57 AGCA a A A GCCC-AAC-C-G C GGGGC C C A AG TA C C TGG G A TTA IC TGTGTCñ TCflC TATGCCAGCACGCñG TGTAAC.A.A77 A TC A TCCCGATATI a c a ac :c ya a c ; i a r t ac: t a ; i ; i t c t actc: ci a t re x ¡ ac: r 7 t ; x :c ¡c: cxtci t ;; c a ac: ac: c r a ; x x yat r AA CAC TT AC IC G T I T T CAA T I TC AT GGA CGCGT AT I TA TC CAT T üG GCGCAGÜ C TA TGT T AATGAAC-CA3GGTTAGCCCACTATC-A7GCCGTAA7CCATAGTC-CCAAGAAC-7ATGGTC7G ÜAACCAGTCCCCACCÜTTTTTCACTCÜCATACGCCACTCTCTCTCATCCTGAAATACGÜT
t x i ; i r c c ;( : a a c a r a c t t : t ; r c a cc : a a A7 r c r r a a c í r a ; i r r tc 7T r a í i c r a tc ;c:t ga; i a ac : r t r7 7 7 TAjTGC G 77 A l'GG'T AA 3 GAAGTCAAGA GG 1GG 77 TAC TT TCAA7 GAACCAC G G G T TT' 7 G 3 c i re :ac : a a a a tac ít ( : (; 3 ; : tc x :c : a t ac :a a re :tc ya: :; 7 t a t c c:ac : a a c c t a t t a a ; :ac íc :ac : (: 3 £ C GC r e T A 7 r I CCT 3 G CACO I ACAA3 GI' TC i CJAAAGC I GA I G G 7 GA TGCT G 7 T AAAGTG 7' A T GGGG A 3 G TAG TT G G G TCCGGGAC CA T T'GCG G TIA GG TGAAA7 G G GC T "1"T AA A l'CCG A3 GATATlC'TAGGGAATGCGGGCCCGTCGAGGGAAGGCGGATGACGAGGAATCAGGGA/lGGG3 C A C GAGC-C T T T TCGC AT T GGGA T TT T - G CGCAAC C G 3 T TTA TGGT AA TGGC GATIA TC CA GA TG TTG T7AAAGAAAG3 G TTG GAG A3ATGCi G G G G GCCG i GAG G GATGAAGA 7 AAAGG A T ACATTAAAGG TAGC GGA GATAT TT T . G CGATTGA C GGGTATC GTA CCGATAT T TCCCAT C-C G GG: TC T CAA CGGC-AT C GCGAA TT C- TA T TCGC AA C CAAAG TC-AC C CGÁÁT T G G CCAC-C G TGT GAAC-A A s GG TCA C-A ~ CC T r T TC-C 7 c A TG T T 7 P. c CC A T CCGGG 7 T TGCT A T T GG r e A A 7CaCCCGA7CC A C TG 7C 7TC A TG G T7A C TC ;A A C 7C A :;C C C C G T77A TC C G C G A TC A A C 7C AA G T T TC T GA CACAAACCTACCC TC-C TAAGGGTGG TA T TTA TT T C C CGGAATT T GG TT GG C-C T 3ÁÁC-AC G C CGÁÁT A C GA TCG TC AA C TGC: TC-C A T CÁÁÁT TAC C C 3GGÁT C-G T C TGC C-T A C G C A AT A c C TC ACC-C-A C T A TC TGA GC C AGC T GC 7 G T TGGC T C-7 G c AC AAA C-A C GGG-A 77 AAICTGCGA GGCG CGCICACG TGG.AGITTTGTCGfl TAATTGGGAGiGGGGTTIflGGG.ATG g a a ; cac ;a a a t tc :c ;c ;a t t t ; :ac 7 t t tc 77 t a a tc :a a t : :a ; ta tc: ere: i : A7 c tc yac : a í : c ; :ac :c ;t t : AAACTGAGCGCTGACGC7TACGCCCAA7TTGGGCGTAATCATC7GCACCACCACCACCAC GACTAA
SEQ ID NO. 6
FP#2 aMF-6XH IS-TEVfQ/MVrBHT-GXHIS
MRFP S1FTA VLF Añ S SA LAAP VNTT T E DE T AQ1 i: AEAV1G Y S D LLG DFDVAVLP FS N S I 11
MGL L F IN T T IA S IAAKE EG VS LE KREAEA RR HR RRKELY FQl-TCGH AALL VA 3 PC 'JVLAKP AC AVTY FG A I F L 5 L T 5 N YE TF 5 F T A I F LE F T P 7ATG TAZ 3 DALÍ71CLVEAQ TFVQ TAAV T T LVTVFD CY 711 A n F Y h AG V E C C IIA G '. K r P K.G F K F C-VAGAAIQ VE GPhYJZ G?G ?GT WDY L CH HYAG TCC WWY D PD IT THHYlf L YP L DFAFLQHLGIT1TYGFGISWT R I Y ? LGAfiYV me a c l a :-:ytiA V : i i3 a i :l-: y c l e f v g t v e ' hv.-t t f l j l x l k z CA w g l¡ t ü l¡ q : v k g e ' v t y a t t v F KRYGH EVKTAT TFtCEF RVrC 0QM5GL FYMLTYF EG I NT I GAVF RCTYTIYLKAHGHAVKV YRDLVASGTIAAC- E IGFKSDDN Y P IPARPGMADDEE SAKRHEAFRIGIFAQPVYGHGDYP CVV KET\:G ZiM LPA L T DE DKGYIKGEG D I F A I D G Y R TD IC HAAL11C-1 AG C I AHQD DPI IVCPV C:FEC " DPF AHYYP.7GFA TGQ.7 A7 P I .C r;l-?:.Y71f;APF T FPQCVFT.TQT YP AFGG TYFlYEZGV: AE DAEY 3 RC L LYQI T '^C G 3 PT QYLTPYLSQL3 LAYE K PC-1 N 3 PC AL I líT FV JI i l E : CC LC7-1 QQK F GF C F 'G1Q3 C D D L T R T PE L D A H A Y AQZ G RM H L H H H H H H
SEQ ID NO. 7
FP#3 aMF-rBHT-GXHIS fXhOl-Notn
ATGAGAXT TCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGC ATTAGC TGCT CCAGTCAACACTAC^CAGAACÍATSAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTeTgXTCGGT TAC TCAGATTXAjGAAG&GGATTTC GATGTTGC TGTTT TL-CCATT ICC CAACAGC ACAAAT AACGGGTTATTGTTT ATAAATACTAC TATTGCC AGC ATTGC TGCIAAAGAAGAAGGGGTA
T fT G T C G ASUUUUSAGAG(GCTGAñGTT >■ TGATGCTGCATGCTGCAC TGCTACTAGCGTTG r-CATG-L-TTC-T riVGGCÜVGCCVGGVVGGAGCGG TT A W l ATCCGL-GAGCCA TT TC TC TG TC C T TGATGAGC AAT TACGAAACC C VA-AL-TC C GAC AG T AATCC CGC T G GAGCC AAV.-.C VL-ACGCCT ACCGCTACACCACAATTAGATGCCCTCTCCAACTTAGTCGAACCTCACTACCCA G TTTAAAT TGC TGC A GTGAC ALT TTTGGTGAC AG TGTCG G A TG A TT A T A AGT TT G7-.GG VA GATTCAC CGAGTTAT GC AT TAG TAC-GGT-ATGAAACAA GCGAGATTGCC GGAT TG AAGT TT CCAAACCCCTTTAACTCTCCTCTTCCCGCCOCAGCCATTCAACTTGAACGTCCACCAAAA GC CGAjAG GGC GGC-C-C TC AAGTA CCTGG GAIT A IC TG T GI'CA TC AC TA T TC CAGC ACGCAG IGTAAC AA TT A TGA.T TC CG.-.TAT TACA-AC CAA.CC .-.I IA C IA C C I'G T A T TC AT TG GAC T TT CCCCCCC TGCAAC AC GIAGCCAT TAACAC T TAC TGC T TT TC AAT T TCATC-G.-.CC TC T A T I TATCCATTGGGCSCAG&CTATGTTAATGAAGCAGg&TTAGCCCACTftTGATGCCGTAATC TA CAGTL-TCAAGAAG TAT GGTC TC-L-AAC CAGT GGGCATC G T TC T TCAT TL-GGAT ACAL TA CTGTCTCTGATCCTGAAATACGGTGCCTGGCAAGArACTGGTGACCAAATTGTTAAGGAC T TTG TIA C C TA TC-C TAC A A C IG T G IT TAAGCGT TAT G S IA A TGAAGT CAAGACG T'GGT TT AC CT TC AA. TGAAC CATGGG TXT TC TG T'CCAGAAAAT AG'CGG TC TGC CATACAAT T TGATG TATCCAGAAC-GTATTAACAGCACC1-CCC-CTGTATTTCGTTGCACCTACAATGTTCTGAAA GC T-C ATG G TG A TGC T GTTAAAG TGTA TC G G Gr. TC TA G TTGC C TGC GG G T'.C GA TT GC GG VA GGTG AA ATCGGCTTTAAATCC GA TC-A TAAT TACCCAA TC CCGGCCC G T TC AGGG AACG TC G A TG AC GACGAA TCAGC CAAGCG TCACC-ACCC TTTTCGCATTGGGATT TTTCC'G CAAC GG G rTTATGrTIT.ATGGGGATTA CCCAGATG C I G T TAAAGA/.ACT(TI TGGAGATATGGTGCTG GC C T TL-AIGl-A TC-AA G.ATAFAlGCAATA C.ATTAARGGiT A GC GG AC- AT.AT T TTTGC G AT TG AC GGGT---TCG TACCC-ATAIT TCC CA TG CGC-C TCT GAAC G GGATCG CC AAT TOTA TT CCCAAC CAAAGTSACC CGAAT TGGCCAG T5TGTSAAGAAGGG TCAGATC G ITTTG C TC A T G T TTAC TC A TCC C-GGT T TC-C TAXI GGXCA-A - TAC-C TGATC CAT TC-TT TTC.-.TG G TVAG TCAAC'T TA GCC TCGTT TATCC i-T GATCAAC TC-AAGTTTCT G ACAC AA ACO? ACC T T GC TAAG GG TG TV ~TT~TT~C TC CCA .- TT~G C— GGGCTTAT T C C C G ' T G ■ K G ~ " '-A G -G -T C T A T CAA A TT; ■ TCTGGGA T GG TC TG CtG Ti. TGC A A TA Ct~ TG A GG G ACTA TC T G AGGC AG G TGC TG T TGGCTC-TGCACAAA GACGGG-AT TAA TC TGCG AGGC G TGC TG ACGTG GAC-TT TT G TCGAT AATTGGGACT GGC-GTTIACGGATGCAAGAGAAAITC G G A IT TCAGTT TGTTAAT CAATCA GA'TTCC GA TC TGAC A TC CAV C T T 'J'AAAC TTAC TGC T TAC GC TTAC GC T TAAT TT GTGC G'C AAIGATCTGCAGCAG CACCAC CAC CACIA A
SEO ID NO. a
FP#3 aM F-rBHT-6XHIS
ÜftF L1T : TAVLFAA3 SALAArv I I TXT G Oí TAC ü'AL AVIGT GDLEGD F DVAV LFFTHG TM IIC LLF IM TTIA 31AAKEEGV3LEKREAEA Mt'LKAALLVAGFC Vv LARFAGAVTYFC.AIFL G LTS11VIT P.'J ? TA IP L E ? TFT ATG?A. E L DAUVtl L V I A ? VQT AATT T LVXV P2 X Y K? EA GPPGTALl-.-G'. ITGE I AG LEFF: GF]:FGVAGAAIG'CIGAAI'AEGRGPGTT<DVLG-HHTAGTQ
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SEO ID NO. 9
FP#4 aM F-rBH TíXhol-Notn
ATGAG A TT TC C T T C A A T T T T T A C TG CA G TT TT A TT C GC A G C A 7C C 7C C GC ATTAGC TG CT CC AG TC AAC i. C TACAAC AGAA GA TG A AAC GGC ACAAAT- CCGG G TG A A GC TG TG R TC G GT TAC T CAGA TT TA jGAA GC-GGATT TC L-A TGTTGC TG T T T TG C C A TT TTC CAACAGC ACAAAT A A C G G G 7T A T TG T TTA T A A A T A C T A C TA TTG C CA G C A TTG C TGC TAAAGAAGAAGGGGTA TC TC TC GAGAAAAGAGAGGCTGAASCT A TGATGC T Ü CATGCTGC AC T GC TAGT AGC ü CTG GC A T G T G T T G T T T T G GC GCGGCCGGCCGGAGCGG TT A CTTA TCCGGGAGC CATT GC TG TG TCC C TGACGAGGAAT TA 'l GAAACC C CAAC IC C C A C A C CAATCC CGC T G CA.GCGAACA1. CC-ACSGCTACCGG TA CA G CA G A A TTA G ATG CG CTG TSG A A CTTA STCG 1A A G CTCA & TA CCCA G T TCAAACTGC TGCAG l'GACAAC TT TGGTGACAG TÜL'CCÜATGAT TATAAGT O GA'TGCA GACCCA1. TG AGTTATGC AT TAG-CAGGGTATGAAACAR GC GAGAT TGC C GC-A-C TG AAGT TT cca-Ra g g g g t t t a a g t : tgo tcttg cg c-g g c c r c c c r t t c a a g t t g r a g g t g c r c <gara.a GC G G A A G GGG GGCrGG GG A AGTAC C TGGGÍ. T TA TC TG T GTC A TG AC T A T GG G AGC AC GG A G TG TA A CA i. IT A TGAT TCCGAT A IJA T A A C TAATC AT TAC 1 ACC 1G I ACTC AT TG G A C I TT CCGCCC C TCCAAC AC CTAGCCAT TAA.CAC T T A C T C C T TT TC A A T T TCATGGACGCG TA TT T A T G CA T TG G G ~GC AGGC TATG T TAA TGAAGCACCGT T A G ~ ~C ACT A T GATGCC GTAA TC C7-.TAGTGC~AAGA.AG TA.TGCTC TGGA AC C AGT GGGC A GC G T TT T TC A G TGGG7-.T ACGG G.A C TG TC T CT G ATG CTG A AA TA CG G TGCCTG G CA AG A TA CTG GTG A CCA A A TTG TTA A G CAC T T C G T T A C C 7A T G C C .A C A A C 7C T C 7T TAAGCCTTATGGTAATCAAGTCAACA<CGT<G<GTTT AC l'T TC AA T'CAA-C CATG ÜG TTT TC TG T I C AC AAAATAGTGG TC TGC CATACAAT C TCÁCL-T A T C C AGAAGG TA TTA A C A G C A G C TC CG C TG TA T TT C G T TG C A CC T A C A A TG T T C TGAAA C CT C A T G G TC A TG C TC TT A A A C TG T A T C G C G A TC TA C TT C CC TC C G G CA C C A T TG C G CC A GGTGAAATCC- GC T T T A A A lC C CA TC A TAAC TÁCC C AA TCC'CGC- CC C G T CC AGGG AAC C GC GATGAC GAGGAA.C C A GC CAAGCG J C í.CGAGGC I T TT TGC AT IG G G A l T TTT GC G TAAC TG G T T T A 7G GTAATGGG GA T T A 7C C 7. GA TG TTG TTA A A G AAAC TG T TGG A GA 7 A TG G TG C GG G C C T IG A TG G A 1T-AAGAIA.AAGGATACTATTAAAGG1 A G C G G A G A rA IX T T T G C G AT TGAC G G üTA TC G TACC G A TA ':"1 TCCCA IC-C-GC-CICl G A A C G G Ü A IC Ü C G A A IIG T A TT TGCAÍ.C GAAA.G7GACGGGAATTGC<G<GACTG7GTGAA.CAÁCCCTGAGATCCT7TTGG7<GATGTTTAG CC ATCG GG'GTT TGG T ATTGGTC7-.7lT ~7-.GC GGA TC C A G TG TC TTGATG G TT.AG TC AAC T G.A GCC T C G 7 T TATCC GC GA.ICAAT TC-AÍ.GTTTCT GACACAAAGCTAGC C T CC TAAÚ GG TG GT A T 7 T A T 7 T C 7 C G G A A T7TG G 7TG G G C TGAAGACGCC GAATA TG A T C G T CAAC TG GTCT AT G A AA T -A -C 7GGGA T GG TC TG GG Ti. CGG A A TA CC TG A GG G AC 7 A TG T G AGGCAG G TGG TG T TGGCTG I CC AC AAA GACGGC AT TAA. TC GGC G AÜÜC G TG C TGACGT'G GÍ.L-TT l'T G TC GAT A A7TCGGA.C7 CGC-C-T TTACCC-ATGCAACACAAAT TC G GAT T T C A G T T T G 77A A T CAATCA GATGCC G A TG T GA G A GG G AC G T T TAA AG “ G AG GGC T G AG GC T 7 AC GG G CAA T TT GGiGC GT AATTAT'G TGT'AA
SEQ ID NO . 10
FP#4 a M F -rBHT
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SEO ID NO. 11
FP#5 a M F -rBHTfA1-22V6XHIS fXhol-Notl^
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7 XL-7 AL CACL ACC A 77 ACC.-.C X AA
SEO ID NO . 12
FP#5 a M F -rBHT1A1-22V6XHIS
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SEO ID NO . 13
FP#6 a M F -r B H m i-22 ) (Xhol-Noth
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SEQ ID NO. 14
FP#6 aMF-xBHIÍM-22)
M R FPÍH FX A V LTA A SSA LA A PV N rrTED ETA iO IPM A V U SY ÍD LEG D FD V A V LPFSM STN MGLLF : m t t [A;; [AAT E EGUSLEKREAEA v'TVPGA i i-'C£: ;i :;r:Y E T P$PT A i ET,EP rPTA 7C-TAEL CA LTÍtTIVEACT PY^TAAYTT LYTYFT S i KF EA □ F PC VA LAC Y 11 C I C AC L V, F F Y, C-7 KF GV ACAA I QYEGAAKAEG KGF5TWDYL G H HYAJ5 TCCI11TYTFD17 T NH Y'YLYP L DFAR i . ( j i ; i .G :n T r : ; -T i i jíw t ií i y f i .g a g v v Mk ^.g i .^.jiv d a v i i ig a k ?: : g i .i.:f v g t v : . : iw i)t f :.:; LMI .V Y CAVI QP TG 7Q T V K □ FVTjjATTY F E 7 Y GT17 V FCTH FTFtJEPR V FC G Qt IE G í ,PY H [. T Y F E C- C 777 G A YF ?-C TT ’ IT L FA HG H A Vi: V i F 71 YAC G-11A AG EIC-F ]'G P DI 1Y F 17 AFFGl 1A C D e z ai :f h e a f ?. i g i f :-.c f7 • y g tg d yf tv c e i t tg pl i t fa l t pe l f.gy i y g g g t : 7; •. 1 pg y k t d : g il a a : : ig i a m c i FN c;:;::'P r^FY C K r:Lc;:jFV A i;Y Y F:T ;i. A :GQ;;AL:Fi g j ü g .v Ng a p F IR E Q L K F L T Q TY PA KGG IY 7 C 7 FG!v A E T A I Y U 7Q LLY Q I TC’E G .. RTQY L TDYLSQ IL L A VHKDGIML RGALTW5FYDMWEWGLGMQQKF GFQFVT1QEDPDLTRTFK ESAHAYApFGKtffl L
Seq. ID No. 15
FF#7 rBHT-GXHIS fBamHI-NotIV-
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SEQ ID NO. 16
FP#7 rBHT-6XHIS
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SEQ ID NO. 17
FP#8 rBHTÍ ¿1-221-6XHIS ÍBamHI-Noth
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SEO ID NO. 18
FP#8 rBHT(A1 -22)-&XHIS
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SEO ID NO. 19
FP#9 3MF-rB H m i-110 l-6X H IS (EcoRI-N&tlI
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Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un ADN aislado que codifica una proteína recombinante p-hexosiltransferasa (rBHT) que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO. 12, 14 o 20, preferiblemente que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO. 12 o 14.
2. El ADN aislado de la reivindicación 1, en donde el ADN tiene al menos un 97% de identidad con la secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ ID NO. 11, 13 o 19, preferentemente con la secuencia de ácido nucleico establecida en la SEC ID NO NO. 11 o 13.
3. El ADN aislado de la reivindicación 2, en donde el ADN tiene la secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ ID NO. 11, 13 o 19, preferentemente con la secuencia de ácido nucleico establecida en la SEC ID NO. 11 o 13.
4. Una proteína recombinante p-hexosil-transferasa enzimáticamente activa (rBHT) en donde la proteína tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO. 12, 14 o 20.
5. La proteína rBHT enzimáticamente activa de la reivindicación 4, en donde la proteína está unida a la membrana o una enzima soluble.
6. Un método para producir la proteína recombinante p-hexosil-transferasa enzimáticamente activa (rBHT) en una célula hospedera de levadura el cual comprende transformar la célula hospedera con un plásmido bajo el control de un promotor adecuado en donde el plásmido contiene un ADN aislado que codifica una proteína rBHT de acuerdo con la reivindicación 1, 2 o 3.
7. El método de la reivindicación 6, en donde el promotor adecuado es un promotor de alcohol oxidasa.
8. El método de las reivindicaciones 6 o 7, en donde la proteína rBHT enzimáticamente activa tiene una actividad específica de aproximadamente 8 U.mg'1 a 20°C.
9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 6-8, en donde la célula hospedera de levadura es de Pichia pastoris.
10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 6-9, que comprende además el uso de la proteína recombinante p-hexosiltransferasa enzimáticamente activa (rBHT) producida en condiciones adecuadas para convertir la lactosa en galacto-oligosacáridos (GOS).
11. El método de la reivindicación 10, en donde la proteína rBHT enzimáticamente activa se inmoviliza sobre un soporte sólido.
12. El método de la reivindicación 10 u 11, en el que las condiciones adecuadas son un reactor de tanque agitado continuo o discontinuo, un reactor de lecho empaquetado o un reactor de membrana de ultrafiltración.
13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 10-12, que comprende además un organismo generalmente reconocido como seguro (GRAS) como un sistema de eliminación de la glucosa para evitar la inhibición competitiva de la glucosa, preferentemente el sistema de eliminación de la glucosa se usa simultáneamente con la proteína rBHT enzimáticamente activa.
14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 6-9, que comprende además usar la proteína recombinante p-hexosiltransferasa (rBHT) producida en un producto o subproducto alimentario que contiene lactosa modificada, preferentemente en donde el producto alimentario es un producto lácteo o subproducto.
15. El método de la reivindicación 14, en el que el producto o subproducto alimentario es un postre para bebés, un jugo para bebés, una merienda para bebés, una bebida de yogurt para bebés, una bebida energética, un agua para hacer ejercicio o un calmante de sed, un postre lácteo congelado, una bebida de frutas (enriquecido con vitaminas/minerales), un relleno de tarta de frutas, una preparación de frutas, una fórmula infantil, una bebida sustitutiva de comidas para bebés, una gelatia mermelada, una bebida sustitutiva de comidas, una leche, una bebida a base de leche, un sustituto de leche, un saborizante de jarabe para leche, yogur o suero de leche.
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