CN110946275B

CN110946275B - 小麦静息巯基氧化酶在改善乳剂型特医食品稳定性中的应用

Info

Publication number: CN110946275B
Application number: CN201911220574.9A
Authority: CN
Inventors: 刘光; 张名位; 魏振承; 张雁; 唐小俊; 邓媛元; 王智明; 王佳佳; 廖娜; 李萍
Original assignee: Sericulture and Agri Food Research Institute GAAS
Current assignee: Sericulture and Agri Food Research Institute GAAS
Priority date: 2019-12-03
Filing date: 2019-12-03
Publication date: 2022-12-02
Anticipated expiration: 2039-12-03
Also published as: CN110946275A

Abstract

本发明公开一种小麦静息巯基氧化酶在改善乳剂型特医食品稳定性中的应用，属于基因工程和乳品科学领域。本发明通过原核表达系统，制备了具有巯基氧化活性的重组小麦静息巯基氧化酶，具有表达量高，纯化简便，易于放大，适合工业化应用等特点。本发明首次提供了一种应用重组小麦静息巯基氧化酶改善乳剂型特医食品稳定性的方法，直接添加重组小麦静息巯基氧化酶到乳剂型特医食品中能够显著降低乳剂颗粒粒径和TSI指标，提高乳剂储藏稳定性。因此，重组小麦静息巯基氧化酶可发展成为一种改善乳剂型特医食品稳定性的生物酶制剂，促进我国特医食品加工行业的发展。

Description

小麦静息巯基氧化酶在改善乳剂型特医食品稳定性中的应用

技术领域

本发明属于基因工程和乳品科学领域，具体涉及一种小麦静息巯基氧化酶在改善乳剂型特医食品稳定性中的应用。

背景技术

营养不良是临床病人的常见并发症，严重影响患者的生命安全和治愈周期。营养疗法是改善这类患者营养健康最有效的方法，因此，在国内外临床上被广泛应用。特殊医学用途配方食品(简称特医食品)是专门为了满足肠内营养疗法，针对进食受限、消化吸收障碍、代谢紊乱或特定疾病状态人群加工而成的一类配方食品，其在改善病人营养状况，提高患者免疫力，减少并发症，促进病人快速康复等方面效果显著。

特医食品按照产品的状态划分主要分为粉剂型和乳剂型两大类，乳剂型特医食品由于无需复水操作，便于临床应用，受到了患者和医护人员的青睐。乳剂型特医食品主要由蛋白质、碳水化合物和油脂三大宏量营养素及微量营养素通过乳化、均质和灭菌等工艺制备的O/W乳化体系。对于全营养型乳剂特医食品，由于其营养素组成复杂，矿物离子类型丰富，灭菌后的乳化体系往往更容易发生蛋白质絮凝沉淀、脂肪球颗粒聚集上浮等破乳失稳现象，这也是当前制约我国特医食品行业发展的关键瓶颈。

乳化体系失稳最主要的原因与蛋白质结构有关，对于大部分蛋白质而言，高温灭菌后，蛋白质结构发生去折叠从而变性，导致了蛋白质的乳化性能降低。而且，体系中矿物离子的存在容易破坏蛋白质的水化层，引起蛋白质颗粒之间的互相聚集，从而进一步促进乳液失稳的发生。

强化蛋白质的结构紧凑性是提高蛋白质稳定性的有效办法，利用化学或生物手段促进蛋白质内部二硫键等共价键的交联被广泛应用于提高蛋白质的稳定性，而生物酶催化蛋白质共价交联不仅具有高效性，同时也能够保质食品安全性，符合食品工业追求的“清洁标签”要求。

小麦静息巯基氧化酶(wheat quiescin sulfhydryl oxidase，wQSOX)是含有辅基FAD的巯基氧化酶，能够直接催化二硫键的形成，在辅基FAD的作用下，自身被还原的二硫键可以重新氧化，从而实现巯基氧化活性的持续发挥。而且，QSOX属于巯基氧化酶家族成员，而巯基氧化酶被美国食药局(FDA)认定为GRAS(Generally Recognized as Safe，一般认为安全)，因此，QSOX具有发展成为提高乳剂型特医食品稳定性的生物酶制剂的潜质。目前，国内外有关QSOX的研究集中在酶学活性、反应机理和结构表征等方面，而将QSOX作为一种生物酶制剂应用到乳剂型特医食品稳定性的改善研究尚未见报道。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种小麦静息巯基氧化酶在改善乳剂型特医食品稳定性中的应用。

通过构建最佳表达体系，获得了具有巯基氧化活性的重组小麦静息巯基氧化酶。乳剂稳定性研究结果表明，重组小麦静息巯基氧化酶能够显著降低乳剂颗粒粒径和动力学稳定性指数(TSI)指标，提高乳剂体系储藏稳定性。

本发明的另一目的在于提供一种应用小麦静息巯基氧化酶改善乳剂型特医食品稳定性的方法。该方法为我国乳剂型特医食品的开发提供了一个新思路。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明提供一种小麦静息巯基氧化酶在改善乳剂型特医食品稳定性中的应用，特别是单独添加以小麦静息巯基氧化酶为主的酶制剂在改善乳剂型特医食品稳定性中的应用。

具体的，小麦静息巯基氧化酶在改善全营养乳剂型特医食品稳定性中的应用；

仅在乳剂型特医食品(尤其全营养乳剂型特医食品)中添加小麦静息巯基氧化酶即能达到稳定乳剂的目的。

所述的小麦静息巯基氧化酶在乳剂型特医食品中的添加水平为0.01％～0.5％(w/w，蛋白质基)，进一步为0.1％～0.5％(w/w)，更进一步为0.5％(w/w)；重组酶的添加可以降低乳剂颗粒粒径和TSI值，提高乳剂储藏稳定性。

所述的小麦静息巯基氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，或者，如SEQ IDNO：2的第28-480位氨基酸所示；其基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，或者，如SEQ IDNO：1的第82-1440位碱基所示。

一种应用重组小麦静息巯基氧化酶改善乳剂型特医食品稳定性的方法，将重组小麦静息巯基氧化酶、蛋白质、碳水化合物、油脂、复合维生素、复合矿物质和水混合，经匀浆、均质、灭菌得到乳剂型特医食品；

具体的，将蛋白质、碳水化合物、复合维生素、复合矿物质与水混合，缓慢倒入油脂，使用高速匀浆机充分混匀，制成乳液；乳液经重组小麦静息巯基氧化酶催化交联后，再经高压均质、灭菌后得到乳剂型特医食品。其中，所述各组分添加量为：蛋白质1.0～10.0％(w/w)，碳水化合物5.0～20.0％(w/w)，油脂2.0～12.0％(w/w)，复合维生素0.1～1.0％(w/w)，复合矿物质0.5～2.0％(w/w)，水余量(需去除重组小麦静息巯基氧化酶的用量)。

优选的，所述各组分添加量为：蛋白质4.0～6.0％(w/w)，碳水化合物10.0～15.0％(w/w)，油脂5.0～8.0％(w/w)，复合维生素0.1％(w/w)，复合矿物质1.0％(w/w)，水余量(需去除重组小麦静息巯基氧化酶的用量)。

所述的重组小麦静息巯基氧化酶在乳剂中的添加水平为0.01％～0.50％(w/w，蛋白质基)，进一步为0.1％～0.5％(w/w，蛋白质基)，更进一步为0.5％(w/w，蛋白质基)；

所述的蛋白质的类型包括酪蛋白、乳清蛋白等动物源蛋白质，或大豆蛋白、豌豆蛋白、大米蛋白等植物源蛋白质，或这些蛋白质的水解产物多肽、氨基酸等不同类型蛋白质中的一种或多种。

优选的，所述的蛋白质为乳清蛋白粉、酪蛋白粉或大豆蛋白粉中的至少一种。

所述的碳水化合物包括葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糊精、淀粉、果胶、低聚糖、膳食纤维等原料中的一种或多种。

所述的油脂包括大豆油、花生油、菜籽油、葵花籽油、米糠油、橄榄油、玉米油、芝麻油、火麻油、山茶油和中链甘油三酯(MCT)等原料中的一种或多种。

所述复合维生素包含：维生素A、β-胡萝卜素、维生素D、天然维生素E、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、维生素C、维生素K1、叶酸、泛酸钙、烟酰胺、生物素等原料中的两种以上；优选为6种以上。

所述复合矿物质包含以氯化盐、硫酸盐或磷酸盐等形式存在的钠、钾、铜、镁、铁、锌、锰、钙、磷、碘、氯、硒等原料中的两种以上；优选为5种以上。

所述的应用重组小麦静息巯基氧化酶改善乳剂型特医食品稳定性的方法，包括如下具体步骤：

(1)称量：蛋白质1.0～10.0％(w/w)，碳水化合物5.0～20.0％(w/w)，油脂2.0～12.0％(w/w)，复合维生素0.1～1.0％(w/w)，复合矿物质0.5～2.0％(w/w)，重组小麦静息巯基氧化酶为0.01％～0.50％(w/w，蛋白质基)，水余量；

(2)匀浆：去除重组小麦静息巯基氧化酶和油脂后，将上述其余材料混合，使用匀浆机以8000～12000r/min的速度搅拌混合，搅拌过程中缓慢加入油脂，继续匀浆5～10min，得到充分乳化的乳液；

(3)催化：将重组小麦静息巯基氧化酶添加到乳液中催化蛋白质交联，反应温度为30～50℃，摇床转速为100～200r/min；

(4)均质：将酶处理后的乳液进行高压均质，均质条件为10～50MPa，循环次数2～5次；

(5)杀菌：将均质后的乳液置于110～130℃，杀菌10～30分钟，得到乳剂型特医食品。

优选的，步骤(1)中，所述各组分添加量为：蛋白质4.0～6.0％(w/w)，碳水化合物10.0～15.0％(w/w)，油脂5.0～8.0％(w/w)，复合维生素0.1％(w/w)，复合矿物质1.0％(w/w)，重组小麦静息巯基氧化酶为0.1％～0.5％(w/w，蛋白质基)，水余量。

优选的，步骤(2)中，以10000r/min的速度搅拌混合。

优选的，步骤(3)中，反应温度为40～50℃，摇床转速为150～200r/min。

优选的，步骤(4)中，均质条件为30～50MPa，循环次数2～3次。

优选的，步骤(5)中，置于110～120℃，杀菌20～30分钟。

所述的重组小麦静息巯基氧化酶的制备方法，采用大肠杆菌表达体系表达，并采用柱层析方法纯化重组wQSOX蛋白；按照wQSOX：FAD＝1：1～5的摩尔比添加FAD到纯化的重组wQSOX蛋白溶液中，获得具有巯基氧化活性的重组小麦静息巯基氧化酶。

所述的大肠杆菌表达体系中采用的出发表达载体为pMAL-c5x，出发表达菌株为大肠杆菌Rosetta-gami B(DE3)。

包括如下步骤：

(1)利用全基因合成技术，合成了小麦静息巯基氧化酶的全基因序列(SEQ ID NO：1)，通过PCR扩增，得到82-1440位碱基片段，使用的扩增引物分别为引物F和引物P；将纯化得到的目的基因片段连接至载体质粒pMAL-c5x上，酶切位点为NdeI和BamHI，构建出了小麦静息巯基氧化酶重组表达质粒pMAL-c5x-wQSOX；

引物F：5′-GGCCCATATGCTCCGGTCGCTCGGCGTCG-3′，其中，下划线部分为NdeI限制性酶切位点；

引物P：5′-CCCCTAGGTCTTGCAGCATGTGAGGAG-3′；其中，下划线部分为BamHI限制性酶切位点；

(2)将重组表达质粒pMAL-c5x-wQSOX转入到大肠杆菌Rosetta-gami B(DE3)感受态细胞中，得到重组表达菌；将重组表达菌接种到LB液体培养基培养至OD₆₀₀达到0.6～0.8，在16～37℃条件下添加0.1～1.0mM IPTG诱导重组蛋白表达4～20小时后收集菌体；

(3)收集的菌体经冰浴超声破碎后，离心收集上清液，利用Ni-NTA纯化重组小麦静息巯基氧化酶蛋白；

(4)按照wQSOX：FAD＝1：1～5的摩尔比添加FAD到纯化的重组小麦静息巯基氧化酶蛋白溶液中，低温孵育过夜，经透析脱盐处理去除多余的FAD，获得具有巯基氧化活性的重组小麦静息巯基氧化酶。重组蛋白浓缩处理后，冻藏于-20℃备用。

优选地，重组小麦静息巯基氧化酶按0.5％(w/w，蛋白质基)比例添加至乳液中，经稳定性试验发现，经重组小麦静息巯基氧化酶处理后的乳液稳定性高于对照组。

本发明的机理是：本发明通过原核表达系统，制备了具有巯基氧化活性的重组小麦静息巯基氧化酶。直接添加重组小麦静息巯基氧化酶到乳剂型特医食品中能够显著降低乳液颗粒粒径和TSI指标，提高乳剂储藏稳定性。因此，重组小麦静息巯基氧化酶可发展成为一种改善乳剂型特医食品稳定性的生物酶制剂，促进我国特医食品加工行业的发展。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明首次提供了一种应用重组小麦静息巯基氧化酶改善乳剂型特医食品稳定性的方法。该重组酶能有效降低乳液颗粒粒径和TSI指标，提高乳剂储藏稳定性，其可发展成为一种改善乳剂型特医食品稳定性的生物酶制剂，用于我国特医食品加工行业。

(2)本发明提供了一种采用原核表达制备具有巯基氧化活性的重组小麦静息巯基氧化酶，具有表达量高，纯化简便，易于放大，适合工业化应用等特点。

附图说明

图1是重组质粒的双酶切鉴定；其中，泳道M：DNA Marker D10000；泳道1：重组质粒酶切电泳产物。

图2是重组wQSOX的表达及可溶性分析；其中，泳道M：分子量Marker；泳道1：未诱导菌液；泳道2：诱导后菌液；泳道3：细胞破碎液上清。

图3是亲和层析后重组wQSOX的SDS-PAGE分析；其中，泳道M：分子量Marker；泳道1：细胞破碎上清液；泳道2：Ni-NTA亲和层析后目的蛋白。

图4是应用氧电极检测重组wQSOX的巯基氧化活性。

图5是实施例4中重组wQSOX对乳剂型特医食品外观特性影响。

图6是实施例5中重组wQSOX对乳剂型特医食品体系颗粒粒径影响。

图7是实施例5中重组wQSOX对乳剂型特医食品稳定性影响。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。本发明的实施例中使用的乳清蛋白粉、酪蛋白粉、大豆蛋白粉、橄榄油、玉米油、麦芽糊精购于市场；限制性内切酶NdeI和BamHI购于Thermo Fisher Scientific公司；pMAL-c5x质粒购于美国纽英伦生物技术；大肠杆菌DH5α和Rosetta-gami B(DE3)感受态细胞购于Novagen公司；全基因序列合成由广州英赞生物科技有限公司完成。

实施例1重组小麦静息巯基氧化酶表达载体构建

小麦静息巯基氧化酶全基因序列(SEQ ID NO：1)合成于广州英赞生物科技有限公司，并连接至克隆载体pGSI上。由于N-端带有信号肽序列，C-端带有跨膜序列，为了不影响蛋白的可溶表达，选择28-480位氨基酸进行表达，对应的碱基序列为82-1440位，长度为1359bp，序列扩展的上下游引物分别为引物F和引物P。取1ng重组克隆质粒，加入上下游引物和2×PfuMix进行PCR反应，扩增结束后，对PCR产物进行电泳分析和回收纯化处理。

用NdeI和BamHI限制性内切酶对回收得到的扩展片段进行双酶切，酶切反应(37℃，30min)结束后，纯化回收带有粘性末端的小麦静息巯基氧化酶基因片段。将20μg基因片段与5μg经相同限制酶酶切的质粒pMAL-c5x混合，在T4 DNA连接酶作用下于20℃连接1h。连接后产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于含卡那霉素的LB固体培养基上培养12～16h。挑取形态饱满的单克隆菌落进行培养，37℃培养过夜后提取质粒，并对质粒进行双酶切电泳验证，结果如图1所示，重组质粒经NdeI和BamHI双酶切后得到了两条条带，分子量大小分别约为1400bp和5500bp，这与目的基因(1359bp)和酶切后pMAL-c5x质粒(5660bp)理论碱基大小接近。因此，该结果表明pMAL-c5x-wQSOX重组表达载体被成功构建。

实施例2重组小麦静息巯基氧化酶(wQSOX)的诱导表达及纯化

1、诱导表达

将构建好的重组质粒pMAL-c5x-wQSOX转化至Rosetta-gami B(DE3)中，挑取3颗单克隆菌落到含50μg/mL卡那霉素和100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，200r/min条件下培养至OD₆₀₀到0.6～0.8左右，加入0.1～1.0mM IPTG诱导表达4～20h，诱导温度范围在16～37℃之间。经SDS-PAGE分析(图2)，重组wQSOX能够大量表达(泳道2)，且破碎上清液中有目的蛋白(泳道3)，说明获得了可溶表达。

2、亲和纯化

收集表达后的菌体，加入缓冲液重悬，利用探头式超声仪破碎菌体细胞，超声条件为350w，占空比0.4:0.6，超声15min。超声完全后，8000r/m离心20min后收集上清液。

上清液缓慢注入Ni-NTA亲和层析柱中，利用线性洗脱方式纯化目的蛋白，收集各流出峰组分，并利用SDS-PAGE检测重组蛋白纯度(图3)。

合并目的蛋白溶液，按wQSOX：FAD＝1：1～5的摩尔比加入FAD，4℃处理过夜，再经脱盐、浓缩后冻藏于-20℃备用。

以上结果表明，重组wQSOX获得可溶表达，经一步亲和层析获得高纯度目的蛋白。

实施例3重组wQSOX的巯基氧化活性

wQSOX的巯基氧化活性可用多种方法测定，本研究使用液相氧电极测定重组蛋白的巯基氧化活性。其原理为wQSOX催化二硫键形成过程中，其自身催化活性位点二硫键被还原，在其辅基FAD的作用下，被还原的活性位点二硫键将重新氧化，形成二硫键，此过程中伴随溶液氧的消耗，因此，通过测定溶液氧变化可以表征wQSOX巯基氧化活性。

酶活测定反应体系如下：10μmol/L wQSOX加入到50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)缓冲溶液中，加入10mmol/L DTT(二硫苏糖醇)启动反应，使用液相氧电极检测氧浓度变化。

结果如图4所示，单独添加DTT或者wQSOX对溶液氧影响较小，但同时添加DTT和wQSOX后，溶液氧浓度明显降低，表明wQSOX具有显著的巯基氧化活性。

实施例4重组wQSOX对乳剂型特医食品外观品质影响

一种乳剂型特医食品，其原料组成为：乳清蛋白粉2.0％，酪蛋白粉2.0％；橄榄油8.0％；麦芽糊精15.0％；重组wQSOX 0.1％；复合维生素0.1％；复合矿物质1.0％；余量为水。所述复合维生素和复合矿物质的组成参照《特殊医学用途配方食品通则》(GB29922-2013)指南要求。

上述乳剂型特医食品的制备方法如下：

(1)匀浆：去除重组wQSOX和橄榄油后，将上述其余材料混合，使用匀浆机以10000r/min的速度搅拌混合，搅拌过程中缓慢加入橄榄油，继续匀浆5min，保证乳剂充分乳化；

(2)催化：将重组wQSOX添加到乳剂中催化蛋白质交联，反应温度为50℃，摇床转速为150r/min；对照组无此步操作；

(3)均质：将酶处理后的乳剂进行高压均质，均质条件为30MPa，循环次数3次；

(4)杀菌：将均质后的乳剂置于110℃，杀菌30分钟，得到乳剂型特医食品。

灭菌完成后，取出乳剂冷却至室温，对产品进行感官评定。观察对照组样品可得(图5)，样品出现明显的分层破乳现象，说明乳剂体系不稳定。相比于对照组，添加重组wQSOX的处理组样品体系均一，无破乳失稳现象，表明乳剂稳定性得到了提高。进一步将不同组样品置于常温条件下储藏6个月后，由图5可见，对照组乳剂出现明显分层和蛋白絮凝现象，而经过酶处理的乳剂样品仅有轻微破乳，无严重乳液失稳，因此，该结果表明，经过wQSOX处理的乳剂其储藏稳定性得到了显著提高。

实施例5重组wQSOX对乳剂型特医食品稳定性影响

一种乳剂型特医食品，其原料组成为：乳清蛋白粉3.0％，大豆蛋白粉3.0％；玉米油5.0％；麦芽糊精10.0％；重组wQSOX 0.5％；复合维生素0.1％；复合矿物质1.0％；余量为水。所述复合维生素和复合矿物质的组成参照《特殊医学用途配方食品通则》(GB29922-2013)指南要求。

上述乳剂型特医食品的制备方法如下：

(1)匀浆：去除重组wQSOX和玉米油后，将上述其余材料混合，使用匀浆机以10000r/min的速度搅拌混合，搅拌过程中缓慢加入玉米油，继续匀浆10min，得到充分乳化的乳液；

(2)催化：将重组wQSOX添加到乳液中催化蛋白质交联，反应温度为40℃，摇床转速为200r/min；对照组无此步操作。

(3)均质：将酶处理后的乳液进行高压均质，均质条件为50MPa，循环次数2次；

(4)杀菌：将均质后的乳液置于120℃，杀菌20分钟，得到乳剂型特医食品。

灭菌完成后，取出乳液冷却至室温，对产品进行颗粒粒度和动力学稳定性指数(TSI)测定。由图6可得，对照组样品颗粒粒径明显大于wQSOX处理组，乳剂颗粒粒径越大，意味着体系越容易发生沉淀失稳，稳定性越差。

进一步采用TSI值评价乳剂稳定性，TSI值越大表明乳液越不稳定。由图7可得，相比于对照组，经wQSOX处理的乳液样品，其TSI值远远小于对照组，测量30min后，对照组样品TSI值大小是wQSOX处理组样品的近3倍。因此，该结果进一步表明，wQSOX处理组乳剂具有更好的稳定性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所

<120> 小麦静息巯基氧化酶在改善乳剂型特医食品稳定性中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1554

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 小麦静息巯基氧化酶的核苷酸序列

<400> 1

atggcccccg cggcggcccg ggtcctcgtc ctcgtcctcg ccctcgccgc cgcctcctcc 60

ctcgcggggc gcgcggacgc cctccggtcg ctcggcgtcg gcgacggggc ggaggccgcc 120

gcgcaggggg actacgccgt ggacctcaac gccaccagct tcgacgcctt cctcacggcc 180

tcgcgggagc agttcgccgt cgtcgagttc ttcgcccact ggtgtccagc ttgcagaaac 240

tacaagcctc attatgagaa ggttgcgaaa cttttcaatg gtccagatgc tgcgcatcct 300

ggcagaatac tgatggctag ggttgattgc gcatcaaagg tgaatgtaga tctttgcagt 360

agattttctg ttgaccatta tcctttccta ctttggggcc ccccaccaaa atttgctaac 420

actaagtggg accggaagca agagaaaagc gaaataaaat tgattgatga tggaagaaca 480

gcagagcgct tacttaagtg gataaataag caactggaaa gctcgttcac tttggatgac 540

agaaaatatg agaatgaaaa catgcttcca aacaatgctt cagatcctaa acaggttgtt 600

caagcaattt acgatgttga ggaagcaaca gctcatgcgt tacagataat tttggacaac 660

aagatgatca agccagacac tcgtgactct cttataaggt ttttacaaat tttggtggct 720

catcatccat ccaagaggtg tcgaagagga tctgctgatc tacttattaa ctttgatgat 780

cactggcctt cgaacctctc tttaagttca caagacagtt ctaaattgtt ggaaagtgtt 840

gcagcagata accacaagat ctgtggaaag gaggtgcctc gcggttactg gatcttctgc 900

cgtggaagta aaagtgaaac aagaggattt agctgtggtc tatgggtttt gctgcattca 960

cttactgtcc aaattgggga tggtgaaagc caatcaacct ttacgtcaat atgtgatttc 1020

atacacaatt tcttcatctg tgaggaatgc cgcaaacact tctatgatat gtgttcaagt 1080

gtgtcagttc ccttcaagtc agcccgtgat ctcagcctct ggctatggag cacgcataac 1140

aaagttaatg agaggttgat gaaagaagaa aaggatatgg gaactggcga tccatcattc 1200

cctaaggcta tctggcctcc aaaggcactc tgcccatctt gctatcgttc ttcaagcagg 1260

acaagtgatg ggaccttgca ggttgactgg aatgaggacg aagtatttcc attcttggtt 1320

aactactatg ggaagacgct cgtatcatcc tataaagaaa cctacatgga gtctcttcaa 1380

gggaggacgc aagtaggggc ggcacttgct gacgatgcct cctcctcaca tgctgcaaga 1440

gtcccaattg gagctgccct gggtgttgca gctgccagct gtacatttgg ggcactagct 1500

tgcttctgga gaactcagca gaagaacaga aagcaaagaa agaactggaa ctga 1554

<210> 2

<211> 517

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 小麦静息巯基氧化酶的氨基酸序列

<400> 2

Met Ala Pro Ala Ala Ala Arg Val Leu Val Leu Val Leu Ala Leu Ala

1 5 10 15

Ala Ala Ser Ser Leu Ala Gly Arg Ala Asp Ala Leu Arg Ser Leu Gly

20 25 30

Val Gly Asp Gly Ala Glu Ala Ala Ala Gln Gly Asp Tyr Ala Val Asp

35 40 45

Leu Asn Ala Thr Ser Phe Asp Ala Phe Leu Thr Ala Ser Arg Glu Gln

50 55 60

Phe Ala Val Val Glu Phe Phe Ala His Trp Cys Pro Ala Cys Arg Asn

65 70 75 80

Tyr Lys Pro His Tyr Glu Lys Val Ala Lys Leu Phe Asn Gly Pro Asp

85 90 95

Ala Ala His Pro Gly Arg Ile Leu Met Ala Arg Val Asp Cys Ala Ser

100 105 110

Lys Val Asn Val Asp Leu Cys Ser Arg Phe Ser Val Asp His Tyr Pro

115 120 125

Phe Leu Leu Trp Gly Pro Pro Pro Lys Phe Ala Asn Thr Lys Trp Asp

130 135 140

Arg Lys Gln Glu Lys Ser Glu Ile Lys Leu Ile Asp Asp Gly Arg Thr

145 150 155 160

Ala Glu Arg Leu Leu Lys Trp Ile Asn Lys Gln Leu Glu Ser Ser Phe

165 170 175

Thr Leu Asp Asp Arg Lys Tyr Glu Asn Glu Asn Met Leu Pro Asn Asn

180 185 190

Ala Ser Asp Pro Lys Gln Val Val Gln Ala Ile Tyr Asp Val Glu Glu

195 200 205

Ala Thr Ala His Ala Leu Gln Ile Ile Leu Asp Asn Lys Met Ile Lys

210 215 220

Pro Asp Thr Arg Asp Ser Leu Ile Arg Phe Leu Gln Ile Leu Val Ala

225 230 235 240

His His Pro Ser Lys Arg Cys Arg Arg Gly Ser Ala Asp Leu Leu Ile

245 250 255

Asn Phe Asp Asp His Trp Pro Ser Asn Leu Ser Leu Ser Ser Gln Asp

260 265 270

Ser Ser Lys Leu Leu Glu Ser Val Ala Ala Asp Asn His Lys Ile Cys

275 280 285

Gly Lys Glu Val Pro Arg Gly Tyr Trp Ile Phe Cys Arg Gly Ser Lys

290 295 300

Ser Glu Thr Arg Gly Phe Ser Cys Gly Leu Trp Val Leu Leu His Ser

305 310 315 320

Leu Thr Val Gln Ile Gly Asp Gly Glu Ser Gln Ser Thr Phe Thr Ser

325 330 335

Ile Cys Asp Phe Ile His Asn Phe Phe Ile Cys Glu Glu Cys Arg Lys

340 345 350

His Phe Tyr Asp Met Cys Ser Ser Val Ser Val Pro Phe Lys Ser Ala

355 360 365

Arg Asp Leu Ser Leu Trp Leu Trp Ser Thr His Asn Lys Val Asn Glu

370 375 380

Arg Leu Met Lys Glu Glu Lys Asp Met Gly Thr Gly Asp Pro Ser Phe

385 390 395 400

Pro Lys Ala Ile Trp Pro Pro Lys Ala Leu Cys Pro Ser Cys Tyr Arg

405 410 415

Ser Ser Ser Arg Thr Ser Asp Gly Thr Leu Gln Val Asp Trp Asn Glu

420 425 430

Asp Glu Val Phe Pro Phe Leu Val Asn Tyr Tyr Gly Lys Thr Leu Val

435 440 445

Ser Ser Tyr Lys Glu Thr Tyr Met Glu Ser Leu Gln Gly Arg Thr Gln

450 455 460

Val Gly Ala Ala Leu Ala Asp Asp Ala Ser Ser Ser His Ala Ala Arg

465 470 475 480

Val Pro Ile Gly Ala Ala Leu Gly Val Ala Ala Ala Ser Cys Thr Phe

485 490 495

Gly Ala Leu Ala Cys Phe Trp Arg Thr Gln Gln Lys Asn Arg Lys Gln

500 505 510

Arg Lys Asn Trp Asn

515

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物F

<400> 3

ggcccatatg ctccggtcgc tcggcgtcg 29

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物P

<400> 4

cccctaggtc ttgcagcatg tgaggag 27

Claims

1.一种应用重组小麦静息巯基氧化酶改善乳剂型特医食品稳定性的方法，其特征在于：将重组小麦静息巯基氧化酶、蛋白质、碳水化合物、油脂、复合维生素、复合矿物质和水混合，经匀浆、催化、均质、灭菌得到乳剂型特医食品；所述的小麦静息巯基氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；

所述的重组小麦静息巯基氧化酶的添加水平为蛋白质基的0.01%～0.5%w/w；

各组分添加量为：蛋白质1.0～10.0%w/w，碳水化合物5.0～20.0%w/w，油脂2.0～12.0%w/w，复合维生素0.1～1.0%w/w，复合矿物质0.5～2.0%w/w，余量为去除重组小麦静息巯基氧化酶的用量后的水。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于

所述的小麦静息巯基氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的第28-480位氨基酸所示。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：包括如下具体步骤：

（1）称量：蛋白质1.0～10.0%w/w，碳水化合物5.0～20.0%w/w，油脂2.0～12.0%w/w，复合维生素0.1～1.0%w/w，复合矿物质0.5～2.0%w/w，重组小麦静息巯基氧化酶为蛋白质基的0.01%～0.5%w/w，水余量；

（2）匀浆：去除重组小麦静息巯基氧化酶和油脂后，将上述其余材料混合，使用匀浆机以8000～12000r/min的速度搅拌混合，搅拌过程中缓慢加入油脂，继续匀浆5～10min，得到充分乳化的乳液；

（3）催化：将重组小麦静息巯基氧化酶添加到乳液中催化蛋白质交联，反应温度为30～50℃，摇床转速为100～200r/min；

（4）均质：将酶处理后的乳液进行高压均质，均质条件为10～50MPa，循环次数2～5次；

（5）杀菌：将均质后的乳液置于110～130℃，杀菌10～30分钟，得到乳剂型特医食品。

4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于：

所述的重组小麦静息巯基氧化酶的制备方法，采用大肠杆菌表达体系表达，并采用柱层析方法纯化重组wQSOX蛋白；按照wQSOX：FAD=1：1～5的摩尔比添加FAD到纯化的重组wQSOX蛋白溶液中，获得具有巯基氧化活性的重组小麦静息巯基氧化酶。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：

所述的重组小麦静息巯基氧化酶的制备方法，包括如下步骤：

（1）利用全基因合成技术，合成了小麦静息巯基氧化酶的全基因序列，利用引物F和引物P进行PCR扩增；将纯化得到的目的基因片段连接至载体质粒pMAL-c5x上，酶切位点为NdeI和BamHI，构建出了小麦静息巯基氧化酶重组表达质粒pMAL-c5x-wQSOX；

引物F：5′-GGCCCATATGCTCCGGTCGCTCGGCGTCG-3′，其中，下划线部分为NdeI限制性酶切位点；

引物P：5′-CCCCTAGGTCTTGCAGCATGTGAGGAG-3′；其中，下划线部分为BamHI限制性酶切位点；

（2）将重组表达质粒pMAL-c5x-wQSOX转入到大肠杆菌Rosetta-gami B(DE3)感受态细胞中，得到重组表达菌；将重组表达菌接种到LB液体培养基培养至OD₆₀₀达到0.6～0.8，在16～37℃条件下添加0.1～1.0 mM IPTG诱导重组蛋白表达4～20小时后收集菌体；

（3）收集的菌体经冰浴超声破碎后，离心收集上清液，利用Ni-NTA纯化重组小麦静息巯基氧化酶蛋白；

（4）按照wQSOX：FAD=1：1～5的摩尔比添加FAD到纯化的重组小麦静息巯基氧化酶蛋白溶液中，低温孵育过夜，经透析脱盐处理去除多余的FAD，获得具有巯基氧化活性的重组小麦静息巯基氧化酶。