DE69533386T2

DE69533386T2 - DNS, die für ein rekombinantes Enzym zur Umwandlung von Maltose in Trehalose kodiert

Info

Publication number: DE69533386T2
Application number: DE69533386T
Authority: DE
Inventors: Michio Okayama-shi Kubota; Keiji Kurashiki-shi Tsusaki; Toshiyuki Okayama-shi Sugimoto
Original assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK; Hayashibara Biochemical Laboratories Co Ltd
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 1994-06-16
Filing date: 1995-06-08
Publication date: 2005-09-01
Anticipated expiration: 2015-06-09
Also published as: KR100387302B1; TW432114B; JP3650632B2; DE69533386D1; IL113856A; EP0695804A2; EP0695804B1; ATE274063T1; EP0695804A3; IL113856A0; JPH08263A; KR960001125A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine DNA kodierend ein rekombinantes Enzym, welches Maltose zu Trehalose konvertiert, sowie auf eine replizierbare rekombinante DNA, Transformant, Verfahren zum Herstellen des rekombinanten Enzyms und ein enzymatisches Umsetzungsverfahren für Maltose.
Trehalose ist ein Disaccharid, welches aus zwei miteinander über deren reduzierende Gruppen verbundenen Glucosemolekülen besteht und natürlich in Bakterien, Pilzen, Algen, Insekten etc. in einer extrem kleinen Menge vorliegt. Trehalose, welches keinen reduzierenden Rest innerhalb des Moleküls aufweist, verursacht keine unbefriedigende Bräunungsreaktion, selbst wenn in der Gegenwart von Aminosäuren oder dgl. erhitzt, und deshalb kann sich vorteilhaft Lebensmittelprodukte süßen, ohne Gefahr, unbefriedigende Verfärbung und Zersetzung zu verursachen. Allerdings ist Trehalose weit davon entfernt, durch herkömmliche Verfahren leicht in einer gewünschten Menge hergestellt zu werden, und tatsächlich ist diese bisher kaum zum Süßen von Lebensmittelprodukten eingesetzt worden.
Konventionelle Verfahren werden grob in zwei Gruppen eingeteilt, d. h. die eine unter Verwendung von Mikroorganismuszellen und die andere unter Anwendung eines multi-enzymatischen Systems, bei dem Enzymen erlaubt wird, auf Saccharide einzuwirken. Das erstgenannte ist, wie in der JP-A-154,485/75 offenbart, ein Verfahren, welches das Erlauben des Wachstums von Mikroorganismen, wie bspw. Bakterien und Hefen, in einem Nährkulturmedium sowie Sammeln der Trehalose aus der resultierenden Kultur umfasst. Das letztgenannte ist, wie in der JP-A-216,695/83 offenbart, ein Verfahren, welches Bereitstellen von Maltose als ein Substrat, Erlauben eines multi-enzymatischen Systems unter Verwendung von Maltose- und Trehalose-Phosphorylasen, auf Maltose einzuwirken, sowie Isolieren der gebildeten Trehalose aus dem Reaktionssystem umfasst. Obwohl das erstgenannte das Wachstum von Mikroorganismen ohne besondere Schwierigkeiten erleichtert, weist es den Nachteil auf, dass die resultierende Kultur höchstens 15 Gew.-% Trehalose, auf einer trockenen Feststoffbasis (d. s. b.), enthält. Während das letztgenannte die Abtrennung der Trehalose mit einer relativen Einfachheit ermöglicht, ist es aber theoretisch schwierig, die Trehaloseausbeute durch Erlauben der Enzyme, auf Substrate bei einer beträchtlich hohen Konzentration einzuwirken, zu erhöhen, weil die enzymatische Reaktion per se eine Gleichgewichtsreaktion von zwei unterschiedlichen Arten an Enzymen ist und der Gleichgewichtspunkt konstant auf die Seite des gebildeten Glucosephosphats tendiert.
Im Hinblick auf das Vorstehende haben die vorliegenden Erfinder energisch Enzyme untersucht, welche direkt Maltose zu Trehalose konvertieren, und haben herausgefunden, dass Mikroorganismen einschließlich Pimelobacter sp. R48, wie in der EP-A-0 636 639 und in der JP-A-170,977/95 offenbart, ein absolut neues Enzym herstellen, welches Trehalose bildet, wenn auf Maltose einwirkend. Das bedeutet, dass Trehalose aus Maltose als ein Material, welches leicht in großen Mengen und unter geringen Kosten erhältlich ist, hergestellt werden kann und dadurch alle der oben genannten Ziele vollständig bewältigt werden. Die Enzymproduktivität dieser Mikroorganismen ist allerdings nicht ausreichend und dies erfordert eine Kultivierung in beträchtlich hohem Maßstab, um eine Trehaloseproduktion in industriellem Maßstab zu erreichen.
Rekombinante DNA-Technologie hat in den letzten Jahren bemerkenswerte Fortschritte gemacht. Zur Zeit kann selbst ein Enzym, dessen gesamte Aminosäuresequenz nicht gezeigt wurde, leicht in einer gewünschten Menge hergestellt werden, wenn ein das Enzym kodierendes Gen einmal isoliert und dessen Basensequenz dekodiert wurde, durch Herstellen einer rekombinanten DNA enthaltend eine DNA, welche das Enzym kodiert, Einführen der rekombinanten DNA in Mikroorganismen oder Zellen von Pflanzen oder Tieren sowie Kultivieren der resultierenden Transformanten. Unter diesen Umständen wird das Auffinden eines Genes dringend benötigt, welches ein zur Bildung von Trehalose aus Maltose fähiges Enzym kodiert, sowie die Erläuterung der Basensequenz.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine DNA kodierend ein rekombinantes Enzym, welches Trehalose bildet, wenn auf Maltose einwirkend, bereitzustellen.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, eine replizierbare rekombinante DNA enthaltend die DNA bereitzustellen.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, einen Transformanten, in welchen die rekombinante DNA eingeführt worden ist, bereitzustellen.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Herstellen des rekombinanten Enzyms durch Verwendung des Transformanten bereitzustellen.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Umsetzen von Maltose zu Trehalose durch das durch Verwenden des Transformanten hergestellte rekombinante Enzym bereitzustellen.
Die vorliegende Erfindung stellt eine isolierte DNA, welche ein rekombinantes Enzym mit den nachfolgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften kodiert, bereit:

(1) Wirkung Trehalose bildend, wenn auf Maltose einwirkend, sowie umgekehrt;
(2) Molekulargewicht 57.000–67.000 Daltons, wenn auf Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid, Gelelektrophorese (SDS-PAGE) untersucht; sowie
(3) Isoelektrischer Punkt (pI) 4,1–5,1, nach Analyse durch Isoelektrophorese;

Die vorliegende Erfindung stellt ferner eine replizierbare rekombinante DNA, welche die DNA sowie einen selbst-replizierbaren Vektor enthält, bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner einen durch Einführen der replizierbaren rekombinanten DNA in einen geeigneten Wirt erhaltenen Transformanten bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren umfassend Kultivieren des Transformanten in einem Nährkulturmedium, um das rekombinante Enzym zu bilden, sowie Sammeln des gebildeten rekombinanten Enzyms aus der resultierenden Kultur bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein enzymatische Umsetzungsverfahren von Maltose bereit, welches einen Schritt des Erlaubens des rekombinanten, unter Verwendung des Transformanten hergestellten Enzyms, auf Maltose einzuwirken, um Trehalose zu bilden, umfasst.
Die vorliegende Erfindung wird nun, lediglich exemplarisch, unter Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen, beschrieben, in welchen:
1 die optimale Temperatur eines durch Pimelobacter sp. R48 hergestellten Enzyms zeigt.
2 den optimalen pH eines durch Pimelobacter sp. R48 hergestellten Enzyms zeigt.
3 die thermische Stabilität eines durch Pimelobacter sp. R48 hergestellten Enzyms zeigt.
4 die pH-Stabilität eines durch Pimelobacter sp. R48 hergestellten Enzyms zeigt.
5 die Struktur der rekombinanten DNA pBRM8 gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt.
Das rekombinante Enzym gemäß der vorliegenden Erfindung bildet Trehalose, wenn auf Maltose einwirkend.
Die DNA gemäß der vorliegenden Erfindung ermöglicht die Bildung des vorliegenden rekombinanten Enzyms durch Einführen der DNA in einen geeigneten selbst-replizierbaren Vektor, um eine replizierbare rekombinante DNA zu erhalten, welche dann in einen geeigneten, inhärent zur Bildung des rekombinanten Enzyms unfähigen, aber leicht wucherbaren Wirt eingeführt wird, um einen Transformanten zu bilden.
Die rekombinante DNA gemäß der vorliegenden Erfindung ermöglicht die Herstellung des rekombinanten Enzyms durch Einführen der DNA in einen geeigneten Wirt, welcher inhärent unfähig zur Bildung des rekombinanten Enzyms, aber leicht wucherbar ist, um einen Transformanten zu bilden, sowie Kultivieren des Transformanten in einem Nährkulturmedium.
Der Transformant gemäß der vorliegenden Erfindung bildet das rekombinante Enzym, wenn kultiviert.
Das rekombinante Enzym gemäß der vorliegenden Erfindung kann in einer gewünschten Menge und mit einer relativen Einfachheit durch das in der vorliegenden Beschreibung offenbarte Verfahren gebildet werden.
Das enzymatische Umsetzungsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung konvertiert Maltose mit einer relativen Einfachheit zu Trehalose.
Versuche zum Aufzeigen der physikalisch-chemischen Eigenschaften des eines durch Pimelobacter sp. R48 hergestellten Enzyms sind folgende:
Versuch 1
Aufreinigung des Enzyms
Versuch 1-1
Herstellung des Enzyms
In 500-ml-Erlenmeyer-Flaschen wurden 100 ml Teilmengen eines flüssigen Kulturmediums (pH 7,2) enthaltend 2,0 Gew.-% Glucose, 0,5 Gew.-% Polypepton, 0,1 Gew.-% Hefeextrakt, 0,1 Gew.-% Dinatriumhydrogenphosphat, 0,06 Gew.-% Kaliumdihydrogenphosphat, 0,05 Gew.-% Magnesiumsulfatheptahydrat, 0,5 Gew.-% Calciumcarbonat sowie Wasser platziert und die Flaschen wurden bei 115°C für 30 Min. autoklaviert, um Sterilisation zu bewirken. Nach Abkühlung der Flaschen wurde in jede Flasche eine Impfkultur von Pimelobacter sp. R48 inokuliert, gefolgt von der Inkubation für 24 Stunden bei 27°C unter rotierenden, schüttelnden Bedingungen bei 200 Upm (rpm). Zwanzig l Teilmengen einer frischen Präparation desselben flüssigen Kulturmediums wurden in einen 30 l-Fermenter gegeben und sterilisiert, gefolgt vom Inokulieren eines Vol.-% der oben erhaltenen Kultur in jedes flüssige Kulturmedium sowie Inkubieren der Resultante bei einem pH von 6,0–8,0 und 27°C für ungefähr 40 Stunden unter Bewegungs-Schüttel-Bedingungen.
Daran anschließend wurde die enzymatische Aktivität der resultierenden Kultur untersucht, um zu zeigen, dass diese ungefähr 0,55 Einheiten/ml des Enzyms enthielt. Ein Teil der Kultur wurde zentrifugiert und der Überstand wurde untersucht, um zu zeigen, dass dieser ungefähr 0,05 Einheiten/ml des Enzyms enthielt. Während die abgetrennten Zellen in 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert wurden, um das anfängliche Volumen des Teils zu ergeben, gefolgt vom Untersuchen der Suspension, um zu zeigen, dass diese ungefähr 0,5 Einheiten/ml des Enzyms enthielt.
Durch die Beschreibung hindurch wird die Enzymaktivität durch den gemäß der folgenden Untersuchung gemessenen Wert ausgedrückt: platziere ein ml 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) enthaltend 20 Gew.-% Maltose in einem Teströhrchen, füge ein ml einer angemessen verdünnten Enzymlösung in das Röhrchen und inkubiere die Lösung in dem Röhrchen für 60 Min. bei 25°C, um eine enzymatische Reaktion zu bewirken, gefolgt von weiterer Inkubation bei 100°C für 10 Min., um die enzymatische Reaktion auszusetzen. Daran anschließend wurde ein Teil der Reaktionsmischung 11-fach mit 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,5) verdünnt und 0,4 ml davon wurden in einem Teströhrchen platziert, mit 0,1 ml Lösung enthaltend eine Einheit/ml Trehalase vermischt, gefolgt vom Inkubieren der resultierenden Mischung bei 45°C für 120 Min. und Quantifizieren des Glucosegehaltes mit dem Glucose-Oxidase-Verfahren. Als eine Kontrolle wird ein System, umfassend eine Trehalaselösung und eine Enzymlösung, welche durch Erhitzen auf 100°C für 10 Min. inaktiviert wurde, bereitgestellt und gleichermaßen wie oben behandelt. Der Gehalt der gebildeten Trehalose kann basierend auf dem wie zuvor quantifizierten Glucosegehalt abgeschätzt werden. Eine Einheit der enzymatischen Aktivität ist als die Menge definiert, welche ein μmol Trehalose pro Min. unter den obigen Bedingungen bildet.
Versuch 1-2
Aufreinigung des Enzyms
Die in Versuch 1-1 erhaltene Kultur wurde zentrifugiert, um Zellen abzutrennen, und ungefähr 0,5 kg der so erhaltenen nassen Zellen wurden in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert, in gewöhnlicher Weise zertrüm mert und zentrifugiert, um ungefähr 4,5 l einer Rohenzymlösung zu erhalten. Zu der Lösung wurde Ammoniumsulfat hinzugegeben, um eine Sättigung von 30 Gew.-% zu ergeben, diese durch Stehen lassen bei 4°C für 4 Stunden ausgesalzt und zentrifugiert, um einen Überstand zu erhalten. Zu dem Überstand wurde Ammoniumsulfat zugefügt, um eine Sättigung von 80 Gew.-% zu erhalten, und diesem erlaubt, bei 4°C über Nacht stehen zu bleiben. Das resultierende Sediment wurde durch Zentrifugation gesammelt, in einer kleinen Menge 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) gelöst und gegen 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) für 24 Stunden dialysiert. Die dialysierte innere Lösung wurde zentrifugiert, um einen Überstand zu erhalten, welcher dann auf eine mit "DEAE-TOYOPEARL^®" gepackte Säule, eine von Tosoh Corporation, Tokio, Japan kommerziell vertriebene Säule für Ionenaustauschchromatographie, welche zuvor mit 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) äquilibriert wurde, aufgebracht wurde, gefolgt vom Aufgeben eines linearen Gradientenpuffers aus Natriumchlorid im Bereich von 0 M bis 0,4 M in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) auf die Säule. Aus dem Eluat wurden Fraktionen mit der Zielenzymaktivität gesammelt, vereinigt, gegen 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) enthaltend 1 M Ammoniumsulfat für 10 Stunden dialysiert und zentrifugiert, um einen Überstand zu erhalten. Der so erhaltene Überstand wurde auf eine mit "BUTYL-TOYOPEARL^®" gepackte Säule, eine von Tosoh Corporation, Tokio, Japan kommerziell vertriebene Säule für hydrophobe Chromatographie, welche zuvor mit 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) enthaltend 1 M Ammoniumsulfat äquilibriert wurde, aufgegeben, gefolgt vom Zuführen eines linearen Puffergradienten von Ammoniumsulfat im Bereich von 1 M bis 0 M in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) auf die Säule. Aus dem Eluat wurden Fraktionen der Zielenzymaktivität gesammelt, vereinigt und auf eine mit "MONO Q HR5/5" gepackte Säule, eine von Pharmacia LKB Biotechology AB Uppsala, Schweden kommerziell vertriebene Säule für Ionenaustauschchromatographie, welche zuvor mit 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) äquilibriert wurde, aufgegeben, gefolgt von der Zugabe eines linearen Gradientenpuffers von Natriumchlorid im Bereich von 0 M bis 0,5 M auf die Säule und Sammeln der Frak tionen mit der Enzymaktivität aus dem Eluat. Das resultierende aufgereinigte Enzym hatte eine spezifische Aktivität von ungefähr 17 Einheiten/mg Protein und die Ausbeute betrug ungefähr 46 Einheiten pro l der Kultur.
Das aufgereinigte Enzym wurde auf einem 7,5 gew.-%-igen Polyacrylamidgel elektrophoriert, um eine einzelne Proteinbande mit einem aktiven Enzym zu ergeben, und dies bedeutete, dass es beträchtlich hoch an Reinheit war.
Versuch 2
Physikalisch-chemische Eigenschaften des Enzyms
Versuch 2-1
Wirkung
Zu einer wässrigen Lösung enthaltend 5 Gew.-% Maltose oder Trehalose als ein Substrat wurden 2 Einheiten/g Substrat des in Versuch 1-2 erhaltenen, aufgereinigten Enzyms gegeben und die Mischung wurde bei 20°C und pH 7,0 für 24 Stunden inkubiert. Um die Saccharidzusammensetzung der Reaktionsmischung zu analysieren, wurde diese im Vakuum getrocknet, in Pyridin gelöst und in gewöhnlicher Weise trimethylsilyliert (trimethylsylated) und die Resultierende wurde einer Gaschromatographie unterworfen. Die in dieser Analyse eingesetzten Ausrüstungen und Bedingungen waren wie folgt: "GC-16A", kommerziell vertrieben von Shimadzu Seisakusho, Ltd., Tokio, Japan als ein Gaschromatograph; eine Säule aus rostfreiem Stahl mit einem inneren Durchmesser von 3 mm und einer Länge von 2 m, gepackt mit 2% "SILICONE OV-17/CHROMOSOLB W", kommerziell vertrieben von GL Sciences Inc., Tokio, Japan als eine Säule; ein Modell einer Wasserstoff-Flammenionisation als ein Detektor; Stickstoffgas als ein Trägergas (Flussrate von 40 ml/Min.); sowie eine Säulentemperatur von 160–320°C bei einer programmierten Temperaturrate von 7,5°C/Min. Die Saccharidzusammensetzungen der Reaktionsmischungen wurden in Tabelle 1 tabellarisch zusammengefasst:
Tabelle 1
Wie in der Tabelle 1 gezeigt, bildete das aufgereinigte Enzym ungefähr 73 Gew.-% Trehalose und ungefähr 5 Gew.-% Maltose, wenn auf Maltose als ein Substrat eingewirkt, während es ungefähr 17 Gew.-% Maltose und ungefähr 3 Gew.-% Glucose bildete, wenn auf Trehalose als ein Substrat eingewirkt. Diese Fakten indizieren, dass das aufgereinigte Enzym Aktivitäten zum Umsetzen von Maltose in Trehalose und zum Umsetzen von Trehalose in Maltose sowie zum Hydrolysieren der α-1,4-Verknüpfung in Maltosemolekülen und α,α-1,1-Verknüpfung in Trehalosemolekülen aufweist. Es gab bisher keine Berichte über solch ein Enzym und dies führte zu einer Einschätzung, einen neuen enzymatischen Weg zu haben.
Versuch 2-2
Molekulargewicht
Das aufgereinigte Enzym wurde im Einklang mit dem von U. K. Laemmli in Nature, Bd. 277, S. 680–685 (1970) beschriebenen Verfahren mit Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) elektrophoriert, um eine einzige Proteinbande bei einer ungefähr 57.000–67.000 Daltons entsprechenden Position zu zeigen. Die in diesem Versuch eingesetzten Markerproteine waren Myosin (M_w = 200.000 Daltons), β-Galactosidase (M_w = 116.250 Daltons), Phosphorylase B (M_w = 97.400 Daltons), Serumalbumin (M_w= 66.200 Daltons) und Ovalbumin (M_w = 45.000 Daltons).
Versuch 2-3
Isoelektrischer Punkt
Das aufgereinigte Enzym ergab einen isoelektrischen Punkt von ungefähr 4,1–5,1, wenn mit Isoelektrophorese vermessen.
Versuch 2-4
Optimale Temperatur
Die optimale Temperatur des aufgereinigten Enzyms betrug, wie in 1 gezeigt, ungefähr 20°C, wenn in gewöhnlicher Weise in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) für 60 Min. inkubiert.
Versuch 2-5
Optimaler pH
Der optimale pH des aufgereinigten Enzyms betrug, wie in 2 gezeigt, ungefähr 7,0–8,0, wenn in gewöhnlicher Weise durch Inkubieren desselben bei 25°C für 60 Min. in 10 mM Acetatpuffer, Phosphatpuffer oder Natriumcarbonat-Natriumhydrogencarbonat-Puffer mit unterschiedlichen pH's experimentiert.
Versuch 2-6
Thermische Stabilität
Das aufgereinigte Enzym war, wie in 3 gezeigt, bis zu einer Temperatur von ungefähr 30°C stabil, wenn in gewöhnlicher Weise durch Inkubieren desselben in 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) für 60 Min. experimentiert.
Versuch 2-7
pH-Stabilität
Das aufgereinigte Enzym war, wie in 4 gezeigt, bis zu einem pH von ungefähr 6,0–9,0 stabil, wenn in gewöhnlicher Weise durch Inkubieren desselben bei 20°C für 60 Min. in 50 mM Acetatpuffer, Phosphatpuffer oder Natriumcarbonat-Natriumhydrogencarbonat-Puffer mit unterschiedlichen pH's experimentiert.
Versuch 2-8
Aminosäuresequenz enthaltend den N-Terminus
Die Aminosäuresequenz enthaltend den N-Terminus des aufgereinigten Enzyms wurde auf "MODEL 470A", einem von Perkin-Eimer Corp., Norwalk, USA kommerziell vertriebenen Gasphasenproteinsequenzer, analysiert, um zu zeigen, dass es eine Aminosäuresequenz enthaltend den N-Terminus wie in SEQ ID NO: 3 gezeigt, aufwies.
Versuch 2-9
Partielle Aminosäuresequenz
Eine angemessene Menge des aufgereinigten, in Versuch 1 hergestellten Enzyms wurde gewogen, gegen 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 9,0) bei 4°C für 18 Stunden dialysiert und mit 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 9,0) vermischt, um eine Lösung enthaltend ungefähr ein mg/ml des Enzyms zu erhalten. Ungefähr ein ml der Lösung wurde in einem Teströhrchen platziert, mit 10 μg Lysylendopeptidase vermischt und bei 30°C für 22 Stunden inkubiert, um das Enzym partiell zu hydrolysieren. Das resultierende Hydrolysat wurde auf "μBONDAPAK C18", eine von Japan Millipore Ltd., Tokio, Japan kommerziell vertriebene Säule für Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, welche zuvor mit 0,1 Vol.-% Trifluoracetat enthaltend 16 Vol.-% wässriges Acetonitril äquilibriert wurde, aufgegeben, gefolgt von Zugabe von 0,1 Vol.-% Trifluoracetat enthaltend Acetonitril bei einer Flussrate von 0,9 ml/Min. unter Erhöhen der Konzentration des Acetonitrils von 16 Vol.-% auf 44 Vol.-% auf die Säule und getrenntem Sammeln von Fraktionen enthaltend ein ungefähr 46 Min. nach dem Beginn der Aufgabe eluiertes Peptidfragment. Fraktionen enthaltend das Peptidfragment wurden vereinigt, im Vakuum getrocknet und in 0,1 Vol.-% Trifluoracetat enthal tend 50 Vol.-% wässriges Acetonitril gelöst. Gleichermaßen wie in Versuch 2-8 wurde das Peptidfragment analysiert und gezeigt, eine Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 4 dargestellt, aufzuweisen.
Bisher war kein Enzym mit diesen physikalisch-chemischen Eigenschaften bekannt und dies führt zu der Schlussfolgerung, dass es eine neue Substanz ist. Bezugnehmend auf Pimelobacter sp. R48 ist dieser ein Mikroorganismus, welcher aus einem Boden in Okayama-Stadt, Okayama, Japan isoliert wurde, am 3. Juni 1993 beim National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology, Tsukuba, Ibaraki, Japan hinterlegt wurde und unter der Zugangsnummer FERM BP-4315 akzeptiert wurde und dieser wurde durch das Institut aufrecht erhalten. Die bakteriologischen Charakteristika dieses Mikroorganismus sind im Detail in der JP-A-170,977/95, angemeldet durch den vorliegenden Anmelder, offenbart.
Die vorliegenden Erfinder haben die chromosomale DNA von Pimelobacter sp. R48 durch Verwenden eines Oligonukleotids als eine Probe, welches basierend auf der Aminosäuresequenz enthaltend die in den Versuchen 2-8 und 2-9 gezeigte N-terminale und partielle Aminosäuresequenz chemisch synthetisiert wurde, untersucht und haben ein DNA-Fragment erhalten, welches aus ungefähr 1.700 Basenpaaren mit der in der nachfolgenden SEQ ID NO: 2, welche vom 5'-Terminus anfängt, gezeigten Basensequenz besteht. Die Dekodierung der Basensequenz zeigte, dass diese aus 568 Aminosäuren besteht und eine vom N-Terminus beginnende Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 1 gezeigt, aufweist.
Die sequenziellen Versuchsschritte, eingesetzt, um die Basensequenz und Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NOs: 1 und 2 gezeigt, zu bestimmen, sind nachfolgend zusammengefasst:

(1) Das Enzym wurde aus einer Kultur eines Spendermikroorganismus isoliert, hoch aufgereinigt und dessen Aminosäuresequenz enthaltend den N-Terminus bestimmt. Das aufgereinigte Enzym wurde mit Protease partiell hydrolysiert und daraus wurde ein Peptidfragment isoliert und bezüglich dessen Aminosäuresequenz untersucht;
(2) davon getrennt wurde eine chromosomale DNA aus einer Spendermikroorganismuszelle isoliert, aufgereinigt und mit einem Restriktionsenzym partiell verdaut, um ein DNA-Fragment bestehend aus ungefähr 2.000–6.000 Basenpaaren zu erhalten. Das DNA-Fragment wurde mit einer DNA-Ligase mit einem Plasmidvektor ligiert, welcher zuvor mit einem Restriktionsenzym geschnitten wurde, um eine rekombinante DNA zu erhalten;
(3) die rekombinante DNA wurde in einen Mikroorganismus der Art Escherichia coli eingeführt, um Transformanten zu erhalten, und aus diesen wurde ein Zieltransformant enthaltend eine das Enzym kodierende DNA durch das Koloniehybridisierungsverfahren unter Verwendung eines Oligonukleotids als eine Sonde, welche basierend auf der vorgenannten partiellen Aminosäuresequenz chemisch synthetisiert wurde, ausgewählt; und
(4) die rekombinante DNA wurde aus dem ausgewählten Transformanten erhalten und mit einem Primer angelagert (annealed), gefolgt vom Erlauben einer DNA-Polymerase, auf die Resultante einzuwirken, um den Primer zu verlängern, und die Basensequenz der resultierenden komplementären DNA-Kette durch das Didesoxykettenterminationsverfahren bestimmt. Der Vergleich einer Aminosäuresequenz, welche aus der bestimmten Basensequenz abschätzbar ist, mit der vorgenannten Aminosäuresequenz endete in der Schlussfolgerung, dass diese das Enzym kodiert.

Die nachfolgenden Versuche 3 und 4 illustrieren die obigen Schritte (2) bis (4) konkret und die in diesen Versuchen eingesetzten Techniken waren die in diesem Gebiet herkömmlichen, bspw. solche beschrieben durch J. Sumbruck et al. in "Molecular Cloning A Laboraory Manual", 2. Ausgabe, veröffentlicht von Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).
Versuch 3
Herstellung von rekombinanter DNA enthaltend DNA abgeleitet aus Pimelobacter sp. R48 und Herstellung des Transformanten
Versuch 3-1
Herstellung von chromosomaler DNA
Eine Impfkultur von Pimelobacter sp. R48 wurde in ein bakterielles Nährkulturmedium (pH 7,0) inokuliert und bei 27°C für 24 Stunden mit einem Rotationsschüttler kultiviert. Die Zellen wurden aus der resultierenden Kultur durch Zentrifugation abgetrennt, in TES-Puffer (pH 8,0) suspendiert, mit 0,05 Gew.-% Lysozym vermischt und bei 37°C für 30 Min. inkubiert. Die Resultierende wurde bei –80°C für eine Stunde eingefroren, mit TSS-Puffer (pH 9,0) vermischt, auf 60°C erhitzt und mit einer Lösungsmischung aus TES-Puffer und Phenol vermischt und die resultierende Lösung wurde auf Eis abgekühlt, gefolgt von Zentrifugation, um einen Überstand zu erhalten. Zu dem Überstand wurde ein zweifaches Volumen von kaltem Ethanol zugegeben und die präzipierte rohe chromosomale DNA wurde gesammelt, in SSC-Puffer (pH 7,1) suspendiert, mit 7,5 μg Ribonuklease und 125 μg Protease vermischt und für eine Stunde bei 37°C inkubiert. Daran anschließend wurde eine Lösungsmischung aus Chloroform und Isoamylalkohol zu der Reaktionsmischung zugegeben, um die chro mosomale Ziel-DNA zu extrahieren, und das Extrakt wurde mit kaltem Ethanol vermischt, gefolgt vom Sammeln des gebildeten Sediments enthaltend die chromosomale DNA. Die resultierende aufgereinigte chromosomale DNA wurde in SSC-Puffer (pH 7,1) gelöst, um eine Konzentration von ungefähr einem mg/ml zu erhalten, und die resultierende Lösung wurde bei –80°C eingefroren.
Versuch 3-2
Herstellung von rekombinanter DNA pBRM8 und Transformant BRM8
Ungefähr ein ml der in Versuch 3-1 erhaltenen, aufgereinigten chromosomalen DNA wurde in einem Teströhrchen platziert, mit ungefähr 35 Einheiten Sau 3AI, einem Restriktionsenzym, vermischt und für ungefähr 20 Min. bei 37°C enzymatisch reagiert, um die chromosomale DNA partiell zu verdauen, gefolgt vom Wiedergewinnen eines DNA-Fragments bestehend aus ungefähr 2.000–6.000 Basenpaaren mittels Sucrose-Dichte-Gradienten-Ultrazentrifugation. Ein μg Bluescript II SK(+), ein Plasmidvektor, wurde in einem Teströhrchen platziert, der Wirkung von BamHI, einem Restriktionsenzym, ausgesetzt, um den Plasmidvektor komplett zu verdauen, mit 10 μg des DNA-Fragments und 2 Einheiten T4-DNA-Ligase vermischt und erlaubt, über Nacht bei 4°C stehen zu bleiben, um das DNA-Fragment mit dem Plasmidvektorfragment zu ligieren. Zu der resultierenden rekombinanten DNA wurden 30 μl "Epicurian Coli^® XLI-Blue", eine von Toyobo Co., Ltd., Tokio, Japan kommerziell vertriebenen kompetente Zelle, zugegeben, dieser erlaubt, unter eiskühlenden Bedingungen für 30 Min. stehen zu bleiben, auf 42°C erwärmt, mit SOC-Broth vermischt und bei 37°C für eine Stunde inkubiert, um die rekombinante DNA in Escherichia coli einzuführen.
Der resultierende Transformant wurde auf eine Agar-Platte (pH 7,0) enthaltend 50 μg/ml 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-galactosid inokuliert und bei 37°C für 18 Stunden kultiviert, gefolgt vom Platzieren eines Nylon-Films auf die Agar-Platte, um darauf ungefähr 6.000 auf der Agar-Platte gebildete Kolonien zu fixieren. Basierend auf der an den Positionen 6 bis 11 lokalisierten Aminosäuresequenz, d. h. Glu-Glu-Pro-Glu-Trp-Phe, wurde die Basensequenz von Sonde 1 wie in SEQ ID NO: 6 gezeigt, chemisch synthetisiert, mit ³²P markiert und mit den auf dem Nylonfilm fixierten Kolonien der Transformanten hybridisiert, gefolgt vom Auswählen von 5 Transformanten, welche mit der Sonde 1 stark hybridisierten.
Die rekombinante Ziel-DNA wurde in gewöhnlicher Weise aus den 5 Transformanten ausgewählt und im Einklang mit dem von E. M. Southern in Journal of Molecular Biology, Bd. 98, S. 503–517 (1975) beschriebenen Verfahren wurde die rekombinante DNA mit Sonde 2 mit der wie in SEQ ID: NO 7 gezeigten Basensequenz, welche basierend auf der Aminosäuresequenz lokalisiert an den Positionen 5 bis 10, d. h. Met-Leu-Glu-Ala-Met-Ala, chemisch synthetisiert wurde, hybridisiert, gefolgt vom Auswählen einer rekombinanten DNA, welche mit der Probe 2 stark hybridisierte. Die rekombinante DNA und der so ausgewählte Transformant wurden "pBRM8" bzw. "BRM8" benannt.
Der Transformant BRM8 wurde in L-Broth (pH 7,0) enthaltend 100 μg/ml Ampicillin inokuliert und bei 37°C für 24 Stunden auf einem Rotationsschüttler kultiviert. Nach Komplettierung der Kultur wurden die resultierenden Zellen durch Zentrifugation aus der Kultur gesammelt und im Allgemeinen mit der alkalischen Methode behandelt, um extrazellulär eine rekombinante DNA zu extrahieren. Das Extrakt wurde in gewöhnlicher Weise aufgereinigt und analysiert, um zu zeigen, dass die rekombinante DNA pBRM8 aus ungefähr 7.600 Basenpaaren besteht, und, dass, wie in 5 gezeigt, die DNA, welche aus ungefähr 1.700 Basenpaaren besteht und das Enzym kodiert, stromabwärts nahe der Verdauungsstelle von SmaI, einem Restriktionsenzym, positioniert ist.
Versuch 3-3
Herstellung des rekombinanten Enzyms durch Transformant BRM8
100 ml-Teilmengen eines flüssigen Nährkulturmediums bestehend aus 2,0 Gew.-% Glucose, 0,5 Gew.-% Pepton, 0,1 Gew.-% Hefeextrakt, 0,1 Gew.-% Dikaliumhydrogenphosphat, 0,06 Gew.-% Natriumdihydrogenphosphat, 0,05 Gew.-% Magnesiumsulfatheptahydrat, 0,5 Gew.-% Calciumcarbonat und Wasser wurden in 500 ml-Flaschen platziert und jede Flasche wurde durch Erhitzen auf 115°C für 30 Min. sterilisiert, abgekühlt, mit 50 μg/ml Ampicillin vermischt und mit dem in Versuch 3-2 erhaltenen Transformanten BRM8 inokuliert, gefolgt vom Kultivieren des Transformanten bei 37°C für 24 Stunden auf einem Rotationsschüttler. Die resultierende Kultur wurde mit einem Ultraschall-Desintegrator behandelt, um Zellen aufzuschließen, und die resultierende Suspension wurde zentrifugiert, um unlösliche Verbindungen zu entfernen. Der so erhaltene Überstand wurde bezüglich dessen Enzymaktivität untersucht, um zu zeigen, dass ein l der Kultur ungefähr 850 Einheiten des Enzyms enthielt.
Als eine Kontrolle wurde eine Impfkultur von Escherichia coli XLI-Blue oder Pimelobacter sp. R48 in einer frischen Präparation desselben flüssigen Nährkulturmediums, aber frei an Ampicillin inokuliert und in dem Fall der Kultivierung von Pimelobacter sp. R48 wurde diese gleichermaßen wie zuvor ausgenommen, dass die Kultivierungstemperatur auf 27°C eingestellt wurde, kultiviert und behandelt. Die resultierende Aktivität untersuchend enthielt ein l der Kultur von Pimelobacter sp. R48 ungefähr 410 Einheiten des Enzyms und die Ausbeute war signifikant geringer als diejenige des Transformanten BRM8. Als ein Wirt eingesetzte Escherichia coli XLI-Blue bildete das Enzym nicht.
Danach wurde das durch den Transformanten BRM8 hergestellte Enzym gleichermaßen wie in Versuch 1-2 aufgereinigt und bezüglich dessen physikalisch-chemischen Eigenschaften und Charakteristika untersucht. Als ein Ergebnis wurde gezeigt, dass es im Wesentlichen dieselben physikalisch-chemischen Eigenschaften wie das Enzym von Pimelobacter sp. R48 hatte, d. h. es weist ein Molekulargewicht von ungefähr 57.000–67.000 Daltons auf SDS-PAGE und einen isoelektrischen Punkt von 4,1–5,1 nach Isoelektrophorese auf. Die Ergebnisse indizieren, dass das vorliegende Enzym durch die rekombinante DNA-Technologie hergestellt werden kann, und die Ausbeute kann dadurch beträchtlich gesteigert werden.
Versuch 4
Herstellung komplementärer DNA-Kette und Bestimmung dessen Basensequenz und Aminosäuresequenz
Zwei μg der in Versuch 3-2 erhaltenen rekombinanten DNA pBRM8 wurden in einem Teströhrchen platziert, mit 2 M wässriger Natriumhydroxidlösung vermischt, um Degeneration zu bewirken, und mit einer angemessenen Menge kaltem Ethanol vermischt, gefolgt vom Sammeln des gebildeten Sediments enthaltend eine Matrizen-DNA und Trocknen des Sediments im Vakuum. Zu der Matrizen-DNA (template DNA) wurden 50 pmol/ml eines durch die nachfolgende SEQ ID NO: 8 repräsentierten, chemisch synthetisierten Primers 1, 10 μl 40 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) enthaltend 20 mM Magnesiumchlorid und 20 mM Natriumchlorid zugefügt und die Mischung wurde bei 65°C für 2 Min. inkubiert, um Anlagern zu bewirken, und mit 2 μl einer wässrigen Lösung enthaltend dATP, dGTP und dTTP in jeweiligen Mengen von 7,5 μM, 0,5 μl [α-³²P]dCTP (2 mCi/ml), ein μl 0,1 M Dithiothreitol sowie 2 μl T7 DNA-Polymerase mit 1,5 Einheiten/ml vermischt, gefolgt vom Inkubieren der resultierenden Mischung bei 25°C für 5 Min., um den Primer 1 von dem 5'-Terminus aus zu dem 3'-Terminus zu verlängern. So wurde eine komplementäre DNA-Kette gebildet.
Das die komplementäre DNA-Kette enthaltende Reaktionsprodukt wurde in vier gleiche Teile aufgeteilt, zu jedem von diesen 2,5 μl einer 50 mM wässrigen Natriumchloridlösung enthaltend 80 μM dNTP und 8 μM ddATP, ddCTP, ddGTP oder ddTTP zugegeben und die resultierende Mischung wurde bei 37°C für 5 Minuten inkubiert, gefolgt vom Aussetzen der Reaktion durch die Zugabe von 4 μl einer 98 vol.-%-igen wässrigen Formamidlösung enthaltend 20 mM EDTA, 0,05 Gew.-% Bromphenolblau und 0,05 Gew.-% Xylencyanol. Die Reaktionsmischung wurde in einem kochenden Wasserbad für 3 Minuten erhitzt und eine kleine Teilmenge davon wurde auf einem 6 gew.-%-igen Polyacrylamidgel platziert und mit einer konstanten Spannung von ungefähr 2.000 Volt elektrophoriert, um DNA-Fragmente aufzutrennen, gefolgt vom Fixieren des Gels in gewöhnlicher Weise, Trocknen desselben und Unterwerten der Resultante einer Autoradiographie.
Analysen der auf dem Radiogramm aufgetrennten DNA-Fragmente zeigten, dass die komplementäre DNA-Kette die in SEQ ID NO: 5 gezeigte, aus ungefähr 1.700 Basenpaaren bestehende Basensequenz enthält. Eine aus der Basensequenz abgeschätzte Aminosäuresequenz wurde parallel in SEQ ID NO: 5 gezeigt und mit der Aminosäuresequenz enthaltend den N-Terminus oder die partielle Aminosäuresequenz, welche in den Versuchen 2-8 und 2-9 gezeigt wurde, verglichen, um zu zeigen, dass die Aminosäuresequenz enthaltend den N-Terminus, wie in Versuch 2-8 gezeigt, zu der Aminosäuresequenz lokalisiert an den Positionen 1 bis 20 in SEQ ID NO: 5 und, dass die in Versuch 2-9 gezeigte partielle Aminosäuresequenz zu der Aminosäuresequenz lokalisiert an den Positionen 183 bis 193 korrespondiert. Diese Ergebnisse indizieren, dass das vorliegende Enzym die in SEQ ID NO: 1 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist und das Enzym von Pimelobacter sp. R48 wird durch die DNA mit der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Basensequenz kodiert.
Wie oben beschrieben, haben die vorliegenden Erfinder als ein Ergebnis langer Forschung das Enzym gefunden, welches Maltose zu Trehalose und umgekehrt umsetzt, und dieses hat dieses von herkömmlichen Enzymen unterscheidende spezifische physikalisch-chemische Eigenschaften. Die vorliegende Erfindung zielt darauf ab, ein rekombinantes Enzym mittels der rekombinanten DNA-Technologie herzustellen. Mit Bezug zu den Beispielen wurde das Verfahren zum Herstellen solch eines rekombinanten Enzyms und dessen Verwendungen im Detail beschrieben.
Das in der vorliegenden Erfindung in Bezug genommene rekombinante Enzym schließt solche ein, welche durch die rekombinante DNA-Technologie hergestellt werden und zum Umsetzen von Maltose zu Trehalose und umgekehrt fähig sind. Üblicherweise hat die vorliegende rekombinante DNA eine gezeigte Aminosäuresequenz, bspw. die in SEQ ID NO: 1 gezeigte Aminosäuresequenz, oder eine zu dieser Aminosäuresequenz komplementäre Aminosäuresequenz. Varianten enthaltend Aminosäuresequenzen, welche zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 homolog sind, können durch Ersetzen einer oder mehrerer Aminosäuren in denen von SEQ ID NO: 1 mit anderen Aminosäuren ohne Ändern der inhärenten Aktivität des Enzyms hergestellt werden. Obwohl, selbst wenn dieselbe DNA eingesetzt wird und es auch von den Wirten, in welche die DNA eingeführt wird, abhängt, sowie von den Bestandteilen und Komponenten der zum Kultivieren der Transformanten eingesetzten Nährkulturmedien und deren Kultivierungstemperatur und -pH, können modifizierte Enzyme hergestellt werden, welche eine zu dem durch die DNA kodiertem Enzym inhärente enzymatische Aktivität aufweisen, aber in einer oder mehreren in der Nähe des N-Terminus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 lokalisierten Aminosäuren defekt sind oder eine oder mehrere zu dem N-Terminus durch die Modifikation der intrazellulären Enzyme des Wirts nach der DNA-Expression neu zugefügte Aminosäuren aufweisen. Solche Varianten können in das vorliegende rekombinante Enzym eingefügt werden, solange diese Maltose zu Trehalose und umgekehrt konvertieren.
Das rekombinante Enzym gemäß der vorliegenden Erfindung kann aus Kulturen von Transformanten enthaltend die spezifische DNA erhalten werden. In der vorliegenden Erfindung einsetzbare Transformanten können durch Einführen der Basensequenz enthaltend den 5'-Terminus wie in SEQ ID NO: 2 gezeigt, zu diesen Basensequenzen homologen Basensequenzen oder komplementären Basensequenzen erhalten werden. Eine oder mehrere Basen in den oben genannten Basensequenzen können durch andere Basen mittels Degeneration des genetischen Kodes ohne Änderung der Aminosäuresequenz, welche diese kodieren, ersetzt werden. Unnötig zu sagen, dass eine oder mehrere Basen in der Basensequenz, welche das Enzym oder deren Varianten kodieren, leicht durch andere Basen ersetzt werden können, um der DNA zu erlauben, tatsächlich die Enzymproduktion in den Wirten zu exprimieren.
In der vorliegenden Erfindung können alle aus natürlichen Quellen abgeleitete DNA's und solche künstlich synthetisierte eingesetzt werden, solange diese die zuvor genannten Basensequenzen aufweisen. Die natürlichen Quellen der DNA gemäß der vorliegenden Erfindung sind bspw. Mikroorganismen der Gattung Pimelobacter, d. h. Pimelobacter sp. R48, aus denen Gene enthaltend die vorliegende DNA erhalten werden können. Diese Mikroorganismen können in Nährkulturmedien inokuliert werden und für ungefähr 1–3 Tage unter aeroben Bedingungen kultiviert werden und die resultierenden Zellen werden aus den Kulturen gesammelt und einer Ultraschallbehandlung unterworfen oder mit einem zellwandlysierendem Enzym, wie bspw. Lysozym oder β-Glucanase, behandelt, um Gene enthaltend die vorliegende DNA zu extrahieren. In diesem Fall kann ein proteolytisches Enzym, wie bspw. Protease, in Kombination mit dem zellwandlysierenden Enzym eingesetzt werden und, in dem Fall des Behandelns der Zellen mit Ultraschallbehandlung können diese in der Gegenwart eines Tensids, wie bspw. Natriumdodecylsulfat (SDS), behandelt oder mit Einfrier- und Auftauverfahren behandelt werden. Die Ziel-DNA ist durch Behandeln der Resultierenden mit Phenolextraktion, Alkoholsedimentation, Zentrifugation, Proteasebehandlung und/oder Ribonukleasebehandlung, wie im Allgemeinen in diesem Gebiet eingesetzt, erhältlich. Um die DNA gemäß der vorliegenden Erfindung künstlich zu synthetisieren, kann diese durch Verwenden der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Basensequenz chemisch synthetisiert werden oder kann in Plasmid-Form durch Einfügen einer DNA, welche die in SEQ ID NO: 1 gezeigte Aminosäuresequenz kodiert, in einen geeigneten, selbstreplizierbaren Vektor, um eine rekombinante DNA zu erhalten, Einführen der rekombinanten DNA in einen geeigneten Wirt, um einen Transformanten zu erhalten, Kultivieren des Transformanten, Abtrennen der gewucherten Zellen aus der resultierenden Kultur und Sammeln des Plasmids enthaltend die rekombinante DNA aus den Zellen erhalten werden.
Solch eine rekombinante DNA wird normalerweise in der Form einer rekombinanten DNA in Wirte eingeführt. Im Allgemeinen enthält die rekombinante DNA die vorgenannte DNA und einen selbst-replizierbaren Vektor und diese kann durch herkömmliche Verfahren mit einer relativen Einfachheit hergestellt werden, wenn das DNA-Material vorliegt. Beispiele für solch einen Vektor sind Plasmidvektoren, wie bspw. pBR322, pUC18, Bluescript II SK(+), pUB110, pTZ4, pC194, pHV14, TRp7, TEp7, pBS7 etc.; und Phagenvektoren, wie bspw. λgt·λC, λgt·λB, ρ11, ϕ1, ϕ105 etc. Unter diesen Plasmid- und Phagenvektoren werden pBR322, pUC18, Bluescript II SK(+), λgt·λC und λgt·λB befriedigend in dem Fall eingesetzt, dass die vorliegende DNA in Escherichia coli exprimiert werden soll, während pUB110, pTZ4, pC194, ρ11, ϕ1 und ϕ105 befriedigend eingesetzt werden, um die DNA in Mikroorganismen der Gattung Bacillus zu exprimieren. Die Plasmidvektoren pHV14, TRp7, Tep7 und pBS7 werden befriedigend eingesetzt, wenn der rekombinanten DNA erlaubt wird, in zwei oder mehr Wirten zu wachsen.
Die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, welche eingesetzt werden, um die vorliegende DNA in solche Vektoren einzuführen, können die allgemein in diesem Gebiet eingesetzten herkömmlichen sein. Ein Gen enthaltend die vorliegende DNA und ein selbst-replizierbarer Vektor werden erst durch ein Restriktionsenzym und/oder Ultraschall-Desintegrator verdaut, dann die resultierenden DNA-Fragmente und Vektorfragmente ligiert. Um DNA-Fragmente und -vektoren zu ligieren, können diese ggf. zunächst angelagert (annealed) werden, dann in vivo oder in vitro der Wirkung einer DNA-Ligase unterworfen werden. Die so erhaltene rekombinante DNA ist ohne substantielle Beschränkung durch Einführen in einen geeigneten Wirt und Kultivieren des resultierenden Transformanten replizierbar.
Die rekombinante DNA gemäß der vorliegenden Erfindung kann in geeignete Mikroorganismuswirte einschließlich Escherichia coli und solche der Gattung Bacillus sowie Actinomyces und Hefen eingeführt werden. In dem Fall des Einsatzes von Escherichia coli als Wirt kann diese in der Gegenwart der rekombinanten DNA und Calciumionen kultiviert werden, während in dem Fall der Verwendung des Mikroorganismus der Gattung Bacillus das kompetente Zellenverfahren und das Koloniehybridisierungsverfahren eingesetzt werden können. Gewünschte Transformanten können durch das Koloniehybridisierungsverfahren oder durch Kultivierung einer Vielzahl von Transformanten in Nährkulturmedien enthaltend entweder Maltose oder Trehalose und Auswählen von Transformanten, welche Trehalose oder Maltose bilden, geklont werden.
Die so erhaltenen Transformanten stellen das Zielenzym extrazellulär her, wenn in den Kulturmedien kultiviert. Im Allgemeinen können flüssige Medien ergänzt mit Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und/oder Mineralien sowie ggf. weiter ergänzt mit einer geringen Menge an Aminosäuren und/oder Vitaminen als Nährkulturmedien eingesetzt werden. Beispiele für Kohlenstoffquellen sind Saccharide, wie bspw. Stärke, Stärkehydrolysat, Glucose, Fructose und Sucrose. Beispiele für Stickstoffquellen sind organische und anorganische Substanzen enthaltend Stickstoff, wie bspw. Ammoniak, Ammoniumsalze, Harnstoff, Nitrat, Pepton, Hefeextrakt, entfettete Sojabohnen, Maiseinweichflüssigkeit und Rinderextrakt. Kulturen enthaltend das Zielenzym können durch Inokulieren der Transformanten in Nährkulturmedien und Inkubieren derselben bei einer Temperatur von 20–50°C und einem pH von 2–9 für ungefähr 1–6 Tage unter aeroben Belüftungs-Bewegungs-Bedingungen erhalten werden. Solche Kulturen können intakt oder als eine Rohenzympräparation eingesetzt werden und normalerweise können die Zellen in den Kulturen mit Ultraschall-Desintegrator und/oder zellwandlysierenden Enzymen vor der Verwendung aufgeschlossen werden, gefolgt vom Abtrennen des Enzyms aus den intakten Zellen und Zelltrümmern durch Filtration und/oder Zentrifugation sowie Aufreinigen des Enzyms. Die zum Aufreinigen des Enzyms verwendeten Verfahren gemäß der Erfindung schließen herkömmliche Verfahren im Allgemeinen ein. Intakte Zellen und Zelltrümmer werden aus den Kulturen entfernt und einer oder mehreren Verfahren, wie bspw. Konzentration, Aussalzen, Dialyse, abtrennender Sedimentation, Gelfiltrationschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, hydrophobe Chromatographie, Affinitätschromatographie, Gelelektrophorese und isoelektrische Punktelektrophorese unterworfen.
Wie oben beschrieben weist das vorliegende rekombinante Enzym eine ausgeprägte Aktivität der Bildung von Trehalose oder Maltose aus Maltose bzw. Trehalose auf und eine solche Aktivität wurde bis jetzt in herkömmlichen Enzymen nicht gefunden. Trehalose hat eine milde und hochqualitative Süßheit und sie hat den großen Vorteil, zum Süßen von Lebensmittelprodukten geeignet zu sein ohne Gefahr, unbefriedigende Verfärbung und Zersetzung zu verursachen, weil sie keinen reduzierenden Rest innerhalb des Moleküls aufweist. Durch Verwenden der Eigenschaften des vorliegenden rekombinanten Enzyms kann Maltose, welche in einigen Gebieten aufgrund ihrer Reduzierbarkeit nicht eingesetzt werden konnte, in nützliche Trehalose mit einer befriedigenden Handhabbarkeit und einer substantiellen Nicht-Reduzierbarkeit konvertiert werden.
Um Trehalose effektiv in einem industriellen Maßstab herzustellen, können Saccharidzusammensetzungen mit einem relativ hohen Maltosegehalt, d. h. üblicherweise ungefähr 70 Gew.-% oder mehr, vorzugsweise ungefähr 80 Gew.-% oder mehr, willkürlich eingesetzt werden. Solche Saccharidzusammensetzungen können durch herkömmliche, in diesem Gebiet generell eingesetzte Verfahren, bspw. den in der JP-B-11,437/81 und der JP-B-17,078/81 offenbarten Verfahren, wobei β-Amylase erlaubt wird, auf gelatinisierte oder verflüssigte Stärke einzuwirken und Abtrennen der gebildeten Maltose durch abtrennende Sedimentationsverfahren oder Dialyseverfahren, oder solche in der JP-B-13,089/72 und der JP-B-3,938/79 offenbarte Verfahren, wobei β-Amylase erlaubt wird, auf gelatinisierte oder verflüssigte Stärke zusammen mit einem stärkeentzweigenden Enzym, wie bspw. Isoamylase oder Pullulanase, einzuwirken, hergestellt werden.
In der enzymatischen Umwandlungsmethode gemäß der vorliegenden Erfindung wird einer effektiven Menge des vorliegenden rekombinanten Enzyms erlaubt, in einem wässrigen Medium enthaltend Maltose zu koexistieren, gefolgt vom Halten der resultierenden Mischung bei einer vorgeschriebenen Temperatur und pH, um enzymatisch zu reagieren, bis die gewünschte Menge an Trehalose gebildet ist. Obgleich sich die enzymatische Reaktion selbst bei einer relativ geringen Konzentration von ungefähr 0,1 Gew.-%, d. s. b., fortsetzt, kann die Konzentration auf ungefähr 2 Gew.-% oder mehr, d. s. b., vorzugsweise ungefähr 5–50 Gew.-%, d. s. b., eingestellt werden, um die enzymatische Umwandlungsmethode in einem industriellen Maßstab fortzusetzen. Die Reaktionstemperatur und -pH werden innerhalb des Bereiches, welcher effektiv Maltose bildet, ohne das rekombinante Enzym zu inaktivieren, d. h. einer Temperatur von ungefähr 30°C, vorzugsweise ungefähr 4–30°C, und einem pH von ungefähr 6–9, vorzugsweise ungefähr 7–8, eingestellt. Die Menge des rekombinanten Enzyms und die Reaktionszeit werden abhängig von den Bedingungen der enzymatischen Reaktion angemessen eingestellt. Das vorliegende enzymatische Umwandlungsverfahren wandelt Maltose effektiv in Trehalose um und die Umwandlungsrate erreicht bis zu ungefähr 80% oder in manchen Fällen mehr.
Die durch das vorliegende enzymatische Umwandlungsverfahren erhältlichen Reaktionsmischungen könne intakt eingesetzt werden und üblicherweise können diese vor der Verwendung aufgereinigt werden. Zum Beispiel werden die Reaktionsmischungen filtriert und zentrifugiert, um unlösliche Verbindungen abzutrennen, und die resultierenden Lösungen werden mit einer Aktivkohle entfärbt, entsalzt und mit einem Ionenaustauscherharz aufgereinigt und zu sirupartigen Produkten konzentriert. Abhängig von der Verwendung können die sirupartigen Produkte im Vakuum getrocknet und zu festen Produkten sprühgetrocknet werden. Um im Wesentlichen aus Trehalose bestehende Produkte zu erhalten, werden die sirupartigen Produkte einem oder mehreren Chromatographieverfahren unter Verwendung von Ionenaustauschern, Aktivkohlen oder Silicagelen, Fermentation unter Verwendung von Hefen sowie Entfernung durch Zersetzung reduzierenden Saccharide mit Alkalien unterworfen. Um eine relativ große Menge Reaktionsmischungen zu behandeln, werden Ionenaustauschchromatographien, wie bspw. Festbett-, Wanderbett- und Pseudowanderbettverfahren, wie in der JP-A-23,799/83 und der JP-A-72,598/88 offenbart, in der Erfindung willkürlich eingesetzt und diese ermöglichen eine Produktion von Produkten mit hohem Trehalosegehalt in einem industriellen Maßstab, welche bisher schwer in großen Mengen und in einer beträchtlichen Ausbeute erhältlich waren. Die so erhaltenen Trehalose- und Saccharidzusammensetzungen enthaltend Trehalose können in einer Vielzahl von Produkten, welche von der Reduzierbarkeit von Saccharid-Süßmitteln freigehalten werden sollen, eingesetzt werden, und daher können diese willkürlich in Lebensmittel produkten im Allgemeinen, Kosmetika und Pharmazeutika als ein Süßmittel, geschmacksverbesserndes Agenz, qualitätsverbesserndes Agenz, Stabilisierungsmittel, Füllstoff, Adjuvanz oder Hilfsstoff eingesetzt werden.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Herstellung des rekombinanten Enzyms und das enzymatische Umwandlungsverfahren von Maltose gemäß der vorliegenden Erfindung:
Beispiel A-1
Herstellung des rekombinanten Enzyms
100-Teilmengen eines Nährkulturmediums bestehend aus 2,0 Gew.-% Glucose, 0,5 Gew.-% Pepton, 0,1 Gew.-% Hefeextrakt, 0,1 Gew.-% Dikaliumhydrogenphosphat, 0,06 Gew.-% Natriumdihydrogenphosphat, 0,05 Gew.-% Magnesiumsulfatheptahydrat, 0,5 Gew.-% Calciumcarbonat und Wasser wurden zu 500 ml-Erlenmeyer-Flaschen zugefügt und jede Flasche wurde durch Erhitzen derselben auf 115°C für 30 Min. sterilisiert, abgekühlt, mit 50 μg/ml Ampicillin vermischt und mit dem in Versuch 3-2 erhaltenen Transformanten BRM8 inokuliert, gefolgt von der Inkubation bei 37°C für 24 Stunden unter Rotation-Schüttel-Bedingungen, um eine Impfkultur zu erhalten. Zu 30 l Gefäßfermentern wurden 18 l Teilmengen einer frischen Präparation desselben Nährkulturmediums zugefügt, gleichermaßen wie zuvor sterilisiert, mit 50 μg/ml Ampicillin vermischt und mit 1 Vol.-% der Impfkultur inokuliert, gefolgt von der Inkubation bei 37°C und einem pH von 6–8 für 24 Stunden unter Bewegungs-Schüttel-Bedingungen. Die resultierenden Kulturen wurden vereinigt, mit Ultraschall behandelt, um Zellen aufzuschließen, zentrifugiert, um unlösliche Verbindungen zu entfernen, gefolgt vom Untersuchen der enzymatischen Aktivität des resultierenden Überstandes. Als ein Ergebnis enthielt ein l der Kultur ungefähr 880 Einheiten des rekombinanten Enzyms. Die gemäß dem Verfahren in Versuch 1-2 durchgeführte Untersuchung des Überstandes zeigte, dass in dieser Kultur eine ungefähr 5 ml wässrige Lösung enthaltend ungefähr 160 Einheiten/ml eines rekombinanten Enzyms mit einer spezifischen Aktivität von ungefähr 34 Einheiten/mg Protein erhalten wurde.
Beispiel B-1
Herstellung von Trehalose-Sirup durch rekombinantes Enzym
Kartoffelstärkepulver wurde in Wasser suspendiert, um eine Konzentration von 10 Gew.-% zu ergeben, und die Suspension wurde auf einen pH von 5,5 eingestellt, mit 2 Einheiten/g Stärke "SPITASE HS", einer von Nagase Biochemicals, Ltd., Kyoto, Japan kommerziell erhältlichen α-Amylaseprobe, vermischt und auf 95°C erhitzt, um Gelatinisierung und Verflüssigung zu bewirken. Daraufhin wurde die resultierende verflüssigte Lösung bei 120°C für 20 Min. autoklaviert, um das verbliebene Enzym zu inaktivieren, sofort auf 50°C abgekühlt, auf pH 5,0 eingestellt, mit 500 Einheiten/g Stärke einer von Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japan kommerziell erhältlichen Isoamylase-Probe und mit 20 Einheiten/g Stärke einer β-Amylase-Probe, kommerziell vertrieben von Nagase Biochemicals Ltd., Kyoto, Japan, vermischt und bei 50°C für 24 Stunden einer enzymatischen Reaktion unterworfen, um eine Saccharidlösung enthaltend 92 Gew.-% Maltose, d. s. b., zu erhalten. Die Saccharidlösung wurde für 20 Min. auf 100°C erhitzt, um das verbliebene Enzym zu inaktivieren, auf 10°C abgekühlt, auf pH 7,0 eingestellt, mit einer Einheit/g Stärke des in Beispiel A-1 erhaltenen rekombinanten Enzyms vermischt und für 96 Stunden einer enzymatischen Reaktion unterworfen. Die Reaktionsmischung wurde für 10 Minuten auf 95°C erhitzt, um das verbliebene Enzym zu inaktivieren, abgekühlt, filtriert und in gewöhnlicher Weise mit Aktivkohle entfärbt, entsalzt und mit einem Anionenaustauscherharz deionisiert sowie konzentriert, um einen 70 gew.-%-igen Sirup in einer Ausbeute von ungefähr 95% zu dem Startmaterial, d. s. b., zu erhalten.
Das Produkt enthält ungefähr 69 Gew.-% Trehalose, d. s. b., und hat aufgrund dessen DE (Dextroseäquivalent) von 18,2 eine relativ geringe Reduzierbarkeit sowie eine geringe Süßheit, moderate Viskosität und feuchtigkeitsrückhaltende Fähigkeit und diese machen es in einer Vielzahl von Zusammensetzungen, wie bspw. Lebensmittelprodukten, Kosmetika und Pharmazeutika, als ein Süßstoff, geschmacksverbesserndes Agenz, Stabilisierungsmittel, Füllstoff, Hilfsstoff oder Adjuvanz willkürlich einsetzbar.
Beispiel B-2
Herstellung von Trehalosepulver durch rekombinante DNA
Die in Beispiel B-1 erhaltene Reaktionsmischung wurde auf pH 5,0 eingestellt, mit 10 Einheiten/g Stärke "GLUCOZYME", eine von Nagase Biochemicals Ltd., Kyoto, Japan kommerziell vertriebene Glucoamylaseprobe, vermischt und bei 50°C für 24 Stunden einer enzymatischen Reaktion unterworfen. Die so erhaltene Reaktionsmischung wurde erhitzt, um das verbliebene Enzym zu inaktivieren, und in gewöhnlicher Weise entfärbt, entsalzt, aufgereinigt und einer Ionenaustauschsäulenchromatographie unter Verwendung von "XT-1016 (Polymerisationsgrad von 4%)", einem von Tokyo Organic Chemical Industries., Ltd., Tokio, Japan kommerziell vertriebenen Kationenaustauscherharz in Na⁺-Form, unterworfen, um den Trehalosegehalt zu erhöhen. Insbesondere wurde das zuvor in Wasser suspendierte Ionenaustauscherharz in vier ummantelte Säulen aus rostfreiem Stahl mit einem inneren Durchmesser von 5,4 cm gepackt und die Säulen wurden in Reihe kaskadiert, um eine gesamte Gelbetttiefe von 20 m zu ergeben. Ungefähr 5 Vol.-% der Reaktionsmischung wurden auf die Säulen unter Halten der inneren Säulentemperatur bei 60°C aufgegeben sowie durch Zuführen von 60°C heißem Wasser bei einer SV (Raumgeschwindigkeit) von 0,15 fraktioniert, gefolgt vom Sammeln von Fraktionen mit hohem Trehalosegehalt. Die Fraktionen wurden vereinigt und in gewöhnlicher Weise konzentriert, im Vakuum getrocknet und pulverisiert, um ein Trehalosepulver in einer Ausbeute von ungefähr 55% zu dem Material, d. s. b., zu ergeben.
Das Produkt enthielt ungefähr 97 Gew.-% Trehalose, d. s. b., und hat aufgrund dessen DE (Dextroseäquivalent) von 18,2 eine relative geringe reduzierende Kraft sowie eine milde Süßheit, moderate Viskosität und feuchtigkeitszurückhaltende Fähigkeit, und diese machen es willkürlich geeignet für eine Vielzahl von Zusammensetzungen, wie bspw. Lebensmittelprodukte, Kosmetika und Pharmazeutika als ein Süßmittel, geschmacksverbesserndes Agenz, Stabilisierungsmittel, Füllstoff, Adjuvanz oder Hilfsmittel.
Beispiel B-3
Herstellung von kristallinem Trehalosepulver durch rekombinantes Enzym
Eine durch das Verfahren in Beispiel B-2 erhaltene Fraktion mit hohem Trehalosegehalt wurde in gewöhnlicher Weise mit Aktivkohle entfärbt, mit einem Ionenaustauscher entsalzt und zu einer ungefähr 70 gew.-%-igen Lösung konzentriert. Das Konzentrat wurde in einen Kristallisierer platziert und unter Rühren graduell abgekühlt, um eine Füllmasse mit einem Kristallisationsprozentsatz von ungefähr 45% zu erhalten. Die Füllmasse wurde bei einem Druck von ungefähr 150 kg/cm² aus einer an dem Kopfende eines Trockenturms angeordneten Düse, während ungefähr 85°C heiße Luft von dem Kopfteil des Trockenturms nach unten geblasen wurde, ungefähr 45°C heiße Luft unter einem Drahtgeflechtförderer geblasen wurde, welcher in dem Fundament des Trockenturms angeordnet war, zu einem in dem Förderer gesammelten kristalli nen Pulver versprüht und das Pulver wurde graduell aus dem Trockenturm gefördert. Daraufhin wurde das kristalline Pulver zu einem Alterungsturm transferriert und für 10 Stunden in dem Strom heißer Luft gealtert, um die Kristallisation und das Trocknen zu komplettieren. So wurde ein wässriges kristallines Trehalosepulver in einer Ausbeute von ungefähr 90% zu dem Material, d. s. b., erhalten.
Das Produkt ist im Wesentlichen frei von Hygroskopizität und leicht handhabbar und es kann willkürlich in einer Vielzahl von Zusammensetzungen, wie bspw. Lebensmittelprodukten, Kosmetika und Pharmazeutika als ein Süßmittel, geschmacksverbesserndes Agenz, qualitätsverbesserndes Agenz, Stabilisierungsmittel, Füllstoff, Adjuvanz oder Hilfsmittel, eingesetzt werden.
Beispiel B-4
Herstellung von wasserfreiem kristallinem Trehalosepulver durch rekombinantes Enzym
Eine durch das Verfahren in Beispiel B-2 erhaltene Fraktion mit hohem Trehalosegehalt wurde gleichermaßen wie in Beispiel B-3 aufgereinigt und die resultierende Lösung wurde zu einem Behälter transferriert und unter reduziertem Druck gekocht, um einen Sirup mit einem Feuchtigkeitsgehalt von ungefähr 3 Gew.-% zu erhalten. Der Sirup wurde in einen Kristallisierer platziert, mit ungefähr einem Gew.-% wasserfreier, kristalliner Trehalose als Impfkristall vermischt, bei 120°C unter Rühren kristallisiert und zu einem einfachen Aluminiumgefäß transferriert, gefolgt vom Altern desselben bei 100°C für 6 Stunden, um einen Block zu bilden. Der so erhaltene Block wurde mit einer Schneideinrichtung pulverisiert, durch Wirbelbetttrocknung getrocknet, um ein wasserfreies, kristallines Trehalosepulver mit einem Feuchtigkeitsgehalt von ungefähr 0,3 Gew.-% in einer Ausbeute von ungefähr 85% zu dem Material, d. s. b., zu erhalten.
Das Produkt mit einer starken dehydrierenden Aktivität kann willkürlich als ein Trockenmittel für Lebensmittelprodukte, Kosmetika und Pharmazeutika sowie deren Materialien und Zwischenprodukte und ebenfalls als ein weißes pulverförmiges Süßmittel mit einer milden Süßheit in Lebensmittelprodukten, Kosmetika und Pharmazeutika eingesetzt werden.
Wie zuvor beschrieben basiert die vorliegende Erfindung auf dem Auffinden eines neuen Enzyms, welches Trehalose oder Maltose bildet, wenn auf Maltose oder Trehalose einwirkend, und sie zielt darauf ab, einen Weg zum Herstellen solch eines Enzyms in einem industriellen Maßstab und in einer beträchtlich hohen Ausbeute durch die rekombinante DNA-Technologie herzustellen. Die enzymatische Umwandlungsmethode gemäß der vorliegenden Erfindung erreicht die Umwandlung von Maltose zu einer Saccharidzusammensetzung enthaltend Trehalose, Glucose und/oder Maltose in einer beträchtlich hohen Ausbeute. Trehalose hat eine milde und hochqualitative Süßheit und hat keinen reduzierenden Rest innerhalb des Moleküls und aufgrund dessen kann es leicht Lebensmittel im Allgemeinen süßen ohne Gefahr, unbefriedigende Verfärbungen und Zersetzung zu verursachen. Das rekombinante Enzym mit der gezeigten Aminosäuresequenz kann mit einer großen Sicherheit für die Herstellung von Trehalose, welche dazu verheißen ist, in Lebensmittelprodukten eingesetzt zu werden, eingesetzt werden.
Daher ist die vorliegende Erfindung eine nützliche Erfindung, welche die zuvor genannte beträchtliche Wirkung aufweist und einen großen Beitrag zu diesem Gebiet liefert sowie bewirkt.
SEQUENZLISTEN

Claims

Isolierte DNA, welche ein rekombinantes Enzym mit den folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften kodiert: (1) Wirkung Bildung von Trehalose beim Einwirken auf Maltose und umgekehrt; (2) Molekulargewicht 57.000–67.000 Daltons nach Analyse durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE); und (3) Isoelektrischer Punkt (pI) 4,1–5,1 nach Analyse durch Isoelektrophorese; und, wobei die Basensequenz der DNA (i) die Basensequenz von SEQ ID NO: 2, (ii) eine komplementäre Basensequenz hierzu oder (iii) eine Variante der Basensequenz von SEQ ID NO: 2, bei der eine oder mehrere Basen in SEQ ID NO: 2 durch andere Basen mittels der Entartung des genetischen Kodes ersetzt sind oder eine oder mehrere Basen von SEQ ID NO: 2 durch andere Basen ohne Änderung der inhärenten Aktivität des rekombinanten Enzyms ersetzt sind, ist.
DNA nach Anspruch 1, welche sich aus einem Mikroorganismus der Gattung Pimelobacter ableitet.
Replizierbare rekombinante DNA, welche einen selbst-replizierbaren Vektor und eine wie in Anspruch 1 oder Anspruch 2 definierte DNA enthält.
Replizierbare rekombinante DNA nach Anspruch 3, wobei der selbstreplizierbare Vektor der Plasmidvektor Blueskript II SK(+) ist.
Transformant, welcher durch Einführen der replizierbaren rekombinanten, in Anspruch 3 oder Anspruch 4 definierten DNA in einen Wirt präpariert ist.
Transformant nach Anspruch 5, wobei der Wirt ein Mikroorganismus der Art Escherichia coli ist.
Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Enzyms mit den folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften: (1) Wirkung Bildung von Trehalose beim Einwirken auf Maltose und umgekehrt; (2) Molekulargewicht 57.000–67.000 Daltons nach Analyse durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE); und (3) Isoelektrischer Punkt (pI) 4,1–5,1 nach Analyse durch Isoelektrophorese; und, wobei die Aminosäuresequenz des Enzyms entweder die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 oder einer Variante von SEQ ID NO: 1, in der ohne Änderung der inhärenten Aktivität des rekombinanten Enzyms (i) eine oder mehrere Aminosäuren in SEQ ID NO: 1 durch andere Aminosäuren ersetzt, (ii) eine oder mehrere Aminosäuren in SEQ ID NO: 1 deletiert oder (iii) eine oder mehrere Aminosäuren zu SEQ ID NO: 1 hinzugefügt sind, enthält, wobei das Verfahren umfasst: (a) Kultivieren des Transformanten gemäß Anspruch 5 oder Anspruch 6 in einem Nährkulturmedium zwecks Bildung des rekombinanten Enzyms; und (b) Sammeln des gebildeten rekombinanten Enzyms aus der resultierenden Kultur.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Sammeltechnik in dem Schritt (b) ein oder mehrere Mitglieder ausgewählt aus der aus Zentrifugation, Filtration, Konzentration, Aussalzen, Dialyse, abtrennender Sedimentation, Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltrationschromatographie, hydrophober Chromatographie, Affinitätschromatographie, Gelektrophorese und Isoelektrophorese bestehenden Gruppe sind.
Verfahren zur Präparation von Trehalose, welches einen Schritt der Herstellung eines rekombinanten Enzyms durch das in Anspruch 7 oder Anspruch 8 definierte Verfahren und einen Schritt des Erlaubens des rekombinanten Enzyms, auf Maltose einzuwirken, um Trehalose zu bilden, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das rekombinante Enzym auf in einer Saccharidzusammensetzung enthaltende Maltose einwirkt.
Verfahren nach Anspruch 9 oder Anspruch 10, wobei einer effektiven Menge an rekombinanten Enzym erlaubt wird, in einem bis zu 50 Gew.-% Maltose enthaltenden wässrigen Medium zu koexistieren, um eine enzymatische Reaktion bei einer Temperatur von 4–45°C und einem pH von 5,5–9,0 zu bewirken.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, welches eine Zusammensetzung enthaltend bis zu 80 Gew.-% Trehalose, bezogen auf die trockene Feststoffbasis, bildet.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Gehalt an Maltose in der Saccharidzusammensetzung 70 Gew.-% oder mehr, bezogen auf die trockene Feststoffbasis, ist.