MX2008012348A

MX2008012348A - Beta-galactosidasa con actividad de transgalactosilacion.

Info

Publication number: MX2008012348A
Application number: MX2008012348A
Authority: MX
Inventors: Georgios Tzortzis; Theodoros Goulas; Athanasios K Goulas
Original assignee: Clasado Inc
Priority date: 2006-03-28
Filing date: 2007-03-27
Publication date: 2008-10-09
Also published as: UA94605C2; CA2645783A1; KR20090003260A; AU2007231221A1; WO2007110619A8; MY144315A; ATE463558T1; DK1999254T3; KR101297615B1; US8168414B2; CN101410512B; US20090117080A1; AU2007231221B2; JP2009531050A; BRPI0710035A2; CN101410512A; WO2007110619A1; CA2645783C; RU2008142530A; GB2449209A

Abstract

La presente invención se relaciona con una nueva ß-galactosidasa con actividad de transgalactosilación aislada de Bifidobacterium bifidum. La ß -galactosidasa es capaz de convertir la lactosa en una mezcla de oligosacáridos con uniones ß e inesperadamente produce el disacárido galactobiosa con uniones a. La mezcla puede ser incorporada en numerosos productos alimenticios o alimentos para animales para incrementar la salud intestinal promoviendo el desarrollo de bifidobacterias en el intestino e impidiendo el desarrollo de la microflora patógena.

Description

-GALACTOSIDASA CON ACTIVIDAD DE TRANSGALACTOSILACION CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con a una nueva ß-galactosidasa con actividad de transgalactosilación capaz de convertir lactosa a una mezcla de galacto-oligosacáridos . En particular se relaciona con a una ß-galactosidasa aislada de una recientemente descubierta cepa de Bifidobacterium bifidum. La invención particularmente se relaciona con secuencias de ADN que codifican para la nueva enzima aislada ß-galactosidasa, para la enzima codificada por una secuencia de ADN y para una célula huésped que comprende la secuencia de ADN o que contiene un vector recombinante que incorpora la secuencia de ADN. La invención también se relaciona con el uso de la enzima codificada por una secuencia de ADN o de la célula huésped que contiene una secuencia de ADN o vector recombinante, para producir galacto-oligosacáridos . ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las bifidobacterias naturalmente colonizan el tracto intestinal inferior, un ambiente en el cual es pobre en monosacáridos y disacáridos ya que tales azúcares son preferentemente consumidos por los huéspedes y microbios presentes en el tracto intestinal superior. Para sobrevivir en el tracto intestinal inferior la bifidobacteria produce varios tipos de exo- y endo-glicosidasas en formas enlazadas superficie y/o extracelulares, por lo cual pueden utilizar diversos carbohidratos. Además de la actividad como hidrolasas, algunas enzimas de las bifidobacterias muestran actividad transferasa. Esta actividad de trasglicosilación de las glucosidasas es ampliamente utilizada para la síntesis enzimática de varios oligosacáridos , los cuales han demostrado actuar como factores promotores del desarrollo de bifidobacterias . Es conocido que los miembros de las bifidobacterias producen enzimas ß-galactosidasas las cuales están involucradas en el metabolismo bacteriano de la lactosa. Moller y cois, en Appl & Environ. Microbial, (2001), 62 , (5) , 2276-2283 describen el aislamiento y caracterización de los genes de tres ß-galactosidasas a partir de una cepa Bifidobacterium bifidum. Ellos encontraron que las tres ß-galactosidasas fueron capaces de catalizar la formación de galacto-oligosacáridos con uniones-beta por transgalactosilación . Dumortier y cois. en Carbohydrate Research 201, (1990), 115-123 describieron la formación de oligosacáridos con uniones-beta por una reacción de transgalactosilación durante la hidrólisis de la lactosa con Bifidobacterium bifidum DSM 20456. Sus análisis para determinar la estructura de la mezcla de oligosacáridos producida demostró que las uniones eran uniones ß-(1?3), ß-(1?6) y ß- ( 1—>4 ) -D-galactosil . Dumortier sugirió que los compuestos producidos por la Bifidobacterium bifidum están involucrados en la adherencia de las bacterias en el intestino grueso. La patente WO 01/90317 describe una nueva ß-galactosidasa de Bifidobacterium bifidum, en particular una versión truncada de la enzima que tiene una alta actividad de transgalactosilación. Se ha encontrado que una cepa de Bifidobacterium bifidum es capaz de producir una enzima galactosidasa activa que convierte la lactosa a una nueva mezcla de galacto-oligosacáridos , la cual inesperadamente contiene arriba del 35 % de disacáridos incluyendo galabiosa (Gal (a 1-6) - Gal) . Este disacárido es conocido (ver Patón, J C and Patón, A W (1988), Clin. Microbiol . Revs , . 11, 450-479; Carlsson, K A (1989), Ann. Reviews Biochem., 58, 309-350) por ser un anti-adhesivo capaz de prevenir la adhesión de toxinas, ejemplo la toxina Shiga y patógenos como E . coli , a la pared del intestino. Esta cepa de B . bifidum fue depositada bajo el numero de adquisición NCIMB 41171 en la National Collection of Industrial & Marine Bacteria, Aberdeen, UK el 31 de marzo de 2003. esto también esta descrito en la patente UK No. 2 412 380. Ahora se ha encontrado que esta cepa de B . bifidum produce varias ß-galactosidasas , incluyendo una nueva ß-galactosidasa . Esta enzima produce un número de diferentes oligosacáridos los cuales son ß-enlazados. SUMARIO DE LA INVENCIÓN De acuerdo a la invención hay provista una secuencia de ADN la cual codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos como se describe en SEQ. ID NO: 2, o hibridíza bajo condiciones rigurosas a la secuencia de ADN la cual codifica esta proteína. La secuencia de ADN esta descrita en SEQ. ID NO: 1, o puede comprender un fragmento o degenerativo del mismo. La frase "degenerativo" se interpreta como una secuencia de ADN la cual es homologa al menos en un 50% a SEQ. ID NO:l, preferentemente de un 50 a un 98% homologa, con mas preferencia desde 75 hasta 95% homologa. Tal secuencia de ADN puede comprender sustituciones, adición o supresión de nucleótidos lo cual resulta en menos del 60%, preferentemente menos del 45%, mayor preferencia menos del 25% de cambio en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ. ID NO: 2. la sustitución de nucleótidos puede resultar en sustituciones conservadoras de aminoácidos.

De acuerdo a un segundo aspecto de la invención se proporciona una enzima codificada por una secuencia de ADN como se define arriba. Tal enzima puede comprender la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ. ID NO: 2 o un fragmento de la misma. De acuerdo a un tercer aspecto de la invención siempre hay un vector recombinante , preferentemente un vector de expresión, que comprende una secuencia de ADN como se definió arriba. Tal vector puede ser incorporado dentro de una célula huésped como células bacterianas, de levadura o fúngicas . Alternativamente, la secuencia de ADN puede ser incorporada en tal célula huésped. Una célula huésped adecuada puede ser seleccionada del grupo que comprende a Bifidobacterium, Lactococus, Lactobacillus , Bacillus, por ejemplo Bacilus subtilus o Bacillus circulans, Escherichia y Aspergillus, por ejemplo Aspergillus niger. Utilizando la lactosa como un sustrato, la enzima codificada por la secuencia de ADN como se define arriba produce una mezcla de oligosacáridos , que comprende disacáridos, como Gal (ß1-3) Glc, Gal (ß1-3) Gal, Gal (ß?-6) Gal y Gal (al-6) Gal, tri-sacáridos y tetra- sacáridos como Gal (ß1-6) Gal (ß1-4) Glc, Gal(pi-3) Gal (ß1-4) Glc y Gal( l-6) Gal (ß1-6) Gal (ß1-4) Glc. La enzima o la célula huésped como se describe arriba puede ser usada para producir una mezcla de galacto-oligosacáridos los cuales pueden formar parte de un producto para incrementar la salud intestinal. Tal producto puede ser seleccionado del grupo que consiste de productos lácteos (por ejemplo leche líquida, leche en polvo como leche entera en polvo, leche descremada en polvo, leche reconstituida con grasa no láctea en polvo, suero en polvo, leches para bebe, formula para bebe, helado, yogur, queso, productos lácteos fermentados) bebidas como el jugo de fruta, alimentos infantiles, cereales, pan, panecillos, confitería, pasteles, suplementos alimenticios, suplementos dietéticos, alimentos para animales, alimentos avícolas o indudablemente cualquier otro alimento o bebida. La presencia de galacto-oligosacáridos en tales productos tiene la ventaja de elevar el desarrollo de Bifidobacterium, promotora de la salud, en el producto o en la flora intestinal del consumidor después de la ingesta del producto o ambos. De manera alternativa, los oligosacáridos así producidos pueden ser utilizados para la preparación de un medicamento, por ejemplo en forma de tableta o cápsula, para prevenir la adhesión de patógenos o toxinas producidas por los patógenos a la pared intestinal. El medicamento puede ser administrado al paciente, por ejemplo siguiendo un tratamiento con antibióticos, que a menudo altera o a veces destruye la flora saludable normal del intestino.

De acuerdo a un aspecto aún lejano de la invención se proporciona un proceso para producir una enzima como se definió arriba, el cual comprende el cultivo de una célula huésped como se definió anteriormente en un medio de cultivo apropiado bajo las condiciones que permitan la expresión de la enzima y la recuperación de la enzima resultante o productos enzimáticos del medio de cultivo. La invención también esta dirigida a un proceso para producir la mezcla de galacto-oligosacáridos que implica poner en contacto a la enzima como se definió anteriormente con un material que contenga lactosa bajo condiciones que permitan la formación de la mezcla de galacto-oligosacáridos . El material adecuado que contenga lactosa puede ser seleccionado de lactosa comercialmente disponible, leche entera, leche semi-descremada, leche descremada, suero, leche reconstituida con grasa no láctea y permeado de suero. Tales productos lácteos pueden ser obtenidos de vacas, búfalos, ovejas o cabras. La leche reconstituida con grasa no láctea se define como leche entera que ha sido descremada para remover la grasa láctea, la cual es subsecuentemente reemplazada por la adición de grasa vegetal o aceite.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 es una gráfica que muestra el curso del tiempo de reacción durante la síntesis de galacto-oligosacáridos con ß-galactosidasa y 40% de lactosa (w/w) contenida en una solución buffer de fosfato 0.1M a pH 6.0 como sustrato; y La figura 2 muestra el cromatograma de líquidos de alta resolución de intercambio aniónico de la mezcla de galacto-oligosacáridos sintetizada por la ß-galactosidasa proveniente de B . bifiduw NCIMB 41171 utilizando 40% de lactosa (w/w) en un buffer de fosfatos 0.1M a pH 6.0 como sustrato (Glc = glucosa, Gal = galactosa, Lac = lactosa, a (1-6) = galactobiosa, GP = grado de polimerización) . DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El ADN genómico fue aislado de la cepa de Bifidobacterium bifidu (NCIMB 41171) utilizando el método de Lawson y cois. (1989) Fems Microbiol . Letters, 65 , (1-2) 41-45. El ADN fue degradado con enzimas de restricción y los fragmentos que tenían un tamaño máximo de 15 kbp, fueron ligados con el vector pSP72 el cual había sido degradado con las mismas enzimas de restricción. Las células de E. coli fueron transformadas con un vector que contiene las inserciones que consisten en PstI, Eco RI , Bam HI, Kpnl, Smal o HindIII de AND cromosómico degradado a partir de B . bifidum. Los clones con actividad ß-galactosidasa fueron seleccionados sobre placas de agar Luria Bertani conteniendo ß-D-galactósido de p-nitrofenilo , ?-ß-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolilo y ß-D- tiogalactósido de isopropilo (IPTG) . La unión de las mezclas con ADN cromosómico Pst I produjo trece clones positivos de ß-galactosidasa , uno de los cuales es identificado como pP2.

La secuencia de ADN del fragmento de ADN inserto P2 fue realizada utilizando el método dideoxi de Sanger de terminación de cadena (Russel P., 2002 iGenetics, Pearson Education, Inc., San Francisco, 187-189) utilizando el kit ciclo de secuenciación BigDye Terminator V 3.0 (Applied Biosystems, EUA) . El marco de lectura abierto (ORF) fue localizado utilizando el buscador ORF del NCBI (Centro Nacional de Información Biotecnológica) . La secuencia de nucleótidos del fragmento de ADN P2 fue traducida en los seis posibles marcos de lectura y se identifico un marco de lectura de 738 aminoácidos codificando a una ß-galactosidasa putativa.

La presente invención será descrita más adelante en el modo de referencia para el siguiente ejemplo. Ejemplo 1 Materiales y Métodos Todas las preparaciones de medios y reactivos químicos usadas a lo largo de este estudio fueron obtenidas de Sigma (Dorset, UK) , Invitrogen (Paisley, UK, Oxoid (Basingstoke , UK) , Qiagen (West Sussex, UK) y Promega (Southampton, UK) . Cepas Bacterianas La cepa de Bif idobacterium bifidum (NCIMB 41171) se mantuvieron sobre cuentas criogénicas en tubos Microbank a -70°C. Para los experimentos posteriores, la cepa fue reactivada sobre agar ilkinson Chalgren (WC) (Oxoid, UK) y medio TPY (medio de extracto de levadura tripticasa fitona) y en condiciones anaerobias (C02 y N2 composición 80% y 20% respectivamente) a 37°C por 48 horas. La morfología de la colonia y la ausencia de contaminación fueron comprobadas por tinción de gram. Cepas de E.coli En este estudio se utilizo la cepa de E.coli DH5a que fue incubada comúnmente bajo condiciones aerobias a 37 °C en agar o caldo Luria Bertani (Sambrook J. and Russell W.D. (2001) . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) y cuando fue necesario se complemento con antibióticos (100 µg/mL de ampicilina y/o 15 g/mL de cloramfenicol) y 40 µL de ?-ß-Gal al 2%, 7 µL de IPTG (ß-D- tiogalactósido de isopropilo) al 20% los cuales fueron aplicados sobre la superficie de una placa de agar de 90 mm prefabricada. La cepa de E. coli DH5a (Invitrogen, Paisley, UK) (genotipo: F" cp80lacZAM ? ( lacZYA-argF) U169 recAl endAl hsdR17(rk", mk~ ) phoA supE44 t i-1 gyrA96 eIAl?") es una cepa positiva para a-galactosidasa y fue utilizada en experimentos de expresión y para otras manipulaciones genéticas . Extracción de ADN Genomico de Bifidobacteriiun bifidum El ADN genomico fue aislado de la cepa de Bifidobacteriuw bifidum (NCIMB 41171) usando el siguiente método en el cual el ADN cromosomal fue preparado a partir de un pellet celular cultivado de 100 mL de caldo anaerobio WC. Las células fueron suspendidas en 10 mL de buffer TES (10 mM de Tris-HCl, lOmM de EDTA, 10 mM de NaCl, pH 8) y tratadas con 200 µL de una mezcla de lisozima/mutanolisina (4:1, lisozima lOmg/mL mutanolisina lmg/mL) por 30 minutos a 37°C. Las células fueron después tratadas con 200 µL de prote nasa K (a 20 mg/mL) y 200 µL de RNasa (ambas 10 mg/mL) e incubadas por una hora a 65 °C. Finalmente las células fueron tratadas con 2 mL de SDS al 10% e incubadas por 15 minutos a 65°C. Se adicionaron 12 mL de fenol/cloroformo y la extracción se repitió hasta que la fase acuosa se pudo separar fácilmente de la interfase. El ADN genomico fue precipitado con isopropanol y resuspendido en Tris-HCl (10 mM) -EDTA (1 mM) (pH 8) . El ADN genomico fue después degradado con enzimas de restricción, ligado a pSP72 degradado con las mismas enzimas y tratado con fosfatasa alcalina. La degradación del ADN genómico de B.bifidum fue realizada utilizando Ncori, PstI, Ba HI, Smal y Kpnl . Las mezclas de las reacciones de ligadura fueron utilizadas para transformar E. coli DH5a y se identificaron clones positivos de ß-galactosidasa como colonias azules sobre las placas que contenían X-Gal. Preparación del ADN Vector El vector usado para la clonación y expresión durante este estudio fue el pSP72 (Promega, UK) (Krieg, P.A and Melton, D.A. (1987) . In Vitro RNA síntesis with SP6 RNA polymerase . Methods in Enzymology. 155: 397-415) . Se escogió este vector debido a la carencia de actividad complementaria del fragmento-a de la ß-galactosidasa el cual no es codificado en pSP72. Este vector no transporta el segmento pequeño de ADN de E. coli que contiene la secuencia regulatoria y la información de codificación para los primeros 146 aminoácidos de ß-galactosidasa la cual en combinación con las cepas de E.coli (e . DH5a) expresan la porción terminal carboxi- de esta ß-galactosidasa que esta dando una ß-galactosidasa activa (complementación a) . Este vector fue degradado con laS siguientes enzimas de restricción: PstI, BamHI, Hindi , Smal, Kpnl y EcoRI de acuerdo a las instrucciones del fabricante utilizando un exceso de diez veces la enzima sobre el ADN (unidades enzimáticas : µg de ADN igual a 10 unidades de enzima por un ig de ADN plásmido o diez unidades enzimáticas por 0.5 pmol de ADN plásmido) . Después de la inactivación de la enzima con calor (20 min. a 65°C) los patrones de restricción se analizaron por electroforesis en gel horizontal. La presencia de un fragmento único en el gel indico la degradación completa del vector y la degradación única de restricción de este. La digestión suficiente del vector fue probada también por transformación de moléculas no ligadas en células competentes de E. coli DH5a. El numero de colonias formadas, sobre las placas de agar LB complementadas con ampicilina (100 µg/mL) , fue un indicador de las moléculas degradadas y el fondo esperado durante los experimentos subsecuentes . Los vectores fueron posteriormente de-fosforilados con fosfatasa alcalina del intestino de ternera, CIAP (Promega, Southampton, UK) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La eficacia del tratamiento fue probada ligándolo (con la ADN ligasa del Bacteriófago T4 de acuerdo a las instrucciones del fabricante) seguido de la transformación en células DH5a. El numero de colonias formadas demostró el numero de moléculas recircularizadas (vector no clonado) y una sustracción del antedicho con las colonias formadas sin tratamiento del vector CIAP demostró el numero de vectores no de-fosforilados . Construcción de la Librería de ADN genómico El ADN genómico fue parcialmente degradado con seis enzimas de restricción que reconocen frecuentemente secuencias hexa-nucleótidas presentes dentro de ADN procariota. Ncori, BamHI, PstI, Kpnl, Smal y HindIII son endonucleasas de restricción tipo II que reconocen específicamente las secuencias 5'G/AATTC'3, 5 'G/GATCC'3 , 5'CTGCA/G'3, 5'GGTAC/C3', 5'CCC/GGG3' y 5 'A/AGCTT3 ' respectivamente, y ocasionan la ruptura de doble hebras entre estas secuencias generando 5 'salientes de cuatro nucleótidos, AATT, GATC, AGCT para NcoRI, BamHI y HindIII respectivamente y 3 'salientes, ACGT, GTAC para PstI y Kpnl respectivamente y terminaciones romas para Smal. Todas estas enzimas son activas y capaces de romper ADN solo en la presencia de iones magnesio divalente . Estos iones fueron el único co- factor requerido. Degradación Restringida de ADN Todas las degradaciones restringidas de las muestras de ADN genómico fueron incubadas por 2 horas a 37°C y finalmente inactivadas con calor a 65 °C por 20 minutos. Las reacciones fueron enfriadas a temperatura ambiente y se adiciono la cantidad apropiada máxima de buffer, seguido de un mezclado suave con un capilar de vidrio sellado.

Posteriormente las soluciones fueron cargadas en pozos de un gel de agarosa al 0.8% (suministro eléctrico 4-5 volts/cm por 14-16 horas) y el tamaño del ADN degradado se estimo con estándares de ADN de 1 kbp (Promega, UK) (Sambrook J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2002) ) . Purificación de los fragmentos generados después de la degradación restringida. La purificación del fragmento a partir de las mezclas de reacción y los geles de agarosa se hizo utilizando el kit de extracción en gel QIAEX de Quiagen (West Sussex, UK) . Los protocolos son descritos detalladamente en el manual del fabricante . Ligadura y Transformación de ADN. Después de la purificación de los fragmentos de ADN con el kit de extracción en gel Qiaex, estos fueron ligados con el vector pSP27 tratado con CIAP . Para ligarlos, las cantidades apropiadas de ADN fueron transferidas a tubos de microcentrífuga estériles de 0.5 mL como se muestra en la Tabla 1.

Tabla 1: Mezclas de la reacción de ligadura. El tubo A muestra el numero de vector de ADN autoligado el cual debe ser sustraído del numero total de transformados después de la transformación. El tubo B muestra al vector ligado con los fragmentos de ADN y el tubo C muestra el control en orden para que la eficiencia de la transformación sea calculada . Antes de cada reacción de ligadura los fragmentos de ADN fueron calentados a 45°C por 5 minutos para fundir cualquier terminación cohesiva recocida durante la preparación del fragmento. Se escogió una relación molar vector: ADN inserto 1:1 para todas las reacciones de ligadura y la reacción de ensamble se hizo de acuerdo a las instrucciones de Promega. Para los tubos A y B se adiciono 1.0 µ?_ de buffer lOx para la reacción de ligadura y 0.5 unidades Weiss de T4 ADN ligasa (Promega, UK) y el volumen de la reacción de ligadura se ajusto a 10 µ?- con agua grado biología molecular. Para los tubos C se añadieron 10 µ??? de buffer lQx para la reacción de ligadura y el volumen para la reacción de ligadura fue ajustado a 10 µ?* con agua grado biología molecular. Los fragmentos de ADN fueron añadidos junto con el agua y se calentaron a 45 °C por 5 minutos para fundir cualquier terminación cohesiva recocida durante la preparación. El A N fue enfriado a 0°C antes que el resto de los reactivos de la reacción de ligadura fueran añadidos y las mezclas de reacción fueran incubadas toda la noche a 16°C ( Sambrook and Russell, 2001) Después de la precipitación con etanol y purificación de los fragmentos ligados (en orden para remover la mezcla de la reacción de ligadura lo cual causa una reducción de la eficiencia de la transformación) las transformaciones se llevaron a cabo de acuerdo a las instrucciones de Hanahan. -50 ng de ADN ligado en 5 µ?. de solución fueron añadidos a 100 i de células competentes DH5a. Después del tratamiento con calor y expresión del gen de resistencia a la ampicilina, las células fueron extendidas sobre la superficie de las placas LB que contenían ampicilina (100 µg/mL) ?-ß-Gal (40 µ?, de ?-ß-Gal al 2%) e IPTG (7µ?? de IPTG al 20%) . Se midió el numero de transformados proveniente de cada reacción de ligadura. El numero de transformados comúnmente obtenidos del tubo C fue 2xl05 - 2xl06 cfu/^g mientras que del tubo A fue 500 - 600 cfu^g. El numero de transformados en el tubo A fue un indicativo del tratamiento eficiente del ADN vector. El numero de transformados en el tubo B estuvo en un intervalo de 2 - 4 xlO4 cfu^g.

Numero de Transformados Las mezclas de ligadura con PstI AND cromosomal ocasiono 13 clones positivos de ß-galactosidasa afuera de los ~ 2500 transformados proyectados, mientras que con BamHI ocasiono 7 clones positivos (~ 1500 ser. Transformados) , EcoKI provoco 3 clones positivos (~ 1300 ser. Transformados) , Kpnl produjo 7 clones positivos (~ 2000 ser. Transformados) , Smal ocasiono 3 clones positivos (~ 1600 ser. transformados) y HindlII ocasiono 2 clones positivos (~ 1200 ser. Transformados) . Degradación de un Clon Positivo En orden para identificar los diferentes genes de ß- galactosidasa, los plásmidos aislados a partir de los clones positivos fueron degradados de acuerdo a la siguiente tabla: El análisis de electroforesis en gel de los fragmentos generados después de la degradación mostró que cada uno los plásmidos PB1, pPl, pP2 , y pPll tiene un inserto el cual codifica una ß-galactosidasa diferente. Los clones que contienen P2 fueron usados para un análisis posterior. Secuenciación de ADN La secuenciación de ADN se llevo a cabo con el método dideoxi de terminación de cadena de Sanger usando el kit ciclo de secuenciación BigDye Terminator V 3.0 (Applied Biosystems, EUA) y analizado con el ABI Prism 3100, un sistema de análisis de ADN basado en la fluorescencia que incorpora electroforesis capilar. Las terminaciones 5' y 3' de los fragmentos de ADN inserto fueron secuenciadas con vectores primers específicos. Los insertos fueron secuenciados mas adelante con el sistema Genome Priming (GPS-I) (New England Biolabs, UK) . El GPS-I es un sistema in Vitro TN7 basado en transposones el cual utiliza TnsABC Transposasa para insertar Transposones aleatoriamente dentro del ADN objetivo. Se utilizo la relación de masa donador: ADN objetivo, 1:4, de acuerdo a las instrucciones del fabricante. El número de plásmidos aislados para la secuenciación después de la inserción del Transprimer dentro del plásmido objetivo fue 25. Este número fue calculado de acuerdo a las instrucciones del fabricante y supone una profundidad de 5 dobleces de cobertura. Debido a la larga secuencia de nucleótidos del plásmido pP2 en el cual la proteína P2 fue codificada, solamente la parte la cual contenía el gen de la ß-galactosidasa fue escogida para ser secuenciada. La enzima desactivada después de la inserción del inserto transposasa en una posición relativa de 172 bp del fragmento secuenciado indico que el codón iniciador fue río arriba de esta posición. Similarmente , la inserción del inserto en la posición 2882 bp elimino completamente la actividad enzimática indicando que el codón stop existió río debajo de esta posición. Además, la actividad enzimática fue eliminada completamente con la inserción del inserto en las posiciones 262bp, 331bp, 375bp, 621bp, 866bp, 1348bp, 1358bp, 1394bp, 1513bp, 1704bp, 2128bp, 2519bp respecto a el primer nucleótido que ha sido secuenciado. El análisis del dominio N-terminal con el software SignalIP y PSORT, no mostró ninguna señal peptídica, indicando que P2 no es secretado extracelularmente . La mezcla de la reacción de secuenciación contenía aproximadamente 400-500 ng de ADN plasmídico, 3.2 pmol de solución del primer y 4µL de la solución BigDye Terminator.

Identificación de un Marco Abierto de Lectura El marco abierto de lectura (ORF) de P2 fue localizado inutilizando el buscador ORF de la dirección web del NCBI (htt : //www. ncbi . nlm . ni . gov/gorf/gorf . html) . Se utilizo el código genético bacteriano y la longitud del marco se determino sería 100 bp . La secuencia de nucleótidos fue traducida en los seis marcos posibles y se identifico un marco abierto de lectura de 738 aminoácidos codificando una ß-galactosidasa putativa. Ejemplo 2 Síntesis con la enzima clonada ß-galactosidasa de Bifidobacterium bifídum NCIMB 41171 en el huésped E.coli (cepa DH5a) La siguiente síntesis descrita, a menos que si no halla sido establecido, se llevo a cabo con la células del huésped E. coli completas después del tratamiento de la biomasa de E. coli (recolectada por centrifugación a 10000 g) con tolueno a una concentración de 2000 ppm en orden para incrementar la permeabilidad celular y también para desactivar las células no viables por destrucción de su membrana citoplasmática . La biomasa de E. coli fue preparada como se describió en el Ejemplo | debajo de "cepas de E. coli" .

Síntesis con enzima clonada La síntesis con la ß-galactosidasa fue realizada con una concentración de sustrato del 40% (w/w) concentración inicial de lactosa. La solución para la síntesis fue preparada en buffer de fosfato 0.1 a pH 6.0 que contenía Tween 80 adicional (monooleato sorbitan de polioxietileno (20)) . La síntesis se realizo a 40°C en un baño de agua con agitación a 150 rpm. El pH óptimo para la enzima específica se eligió con base en las mediciones de la actividad (utilizando ß-D-galactopiranósido de o-nitro fenilo como sustrato) de una preparación enzimática específica variando los valores de pH . Para la síntesis del galacto-oligosacárido se utilizaron 2 mL de sobrenadante de las células lisadas (después de lisar -desbaratar- las células de E. coli con una prensa francesa) con 8 g de lactosa al 50% (w/w) en orden para obtener una concentración final de sustrato del 40% (w/w) . Esta preparación enzimática tuvo una actividad de 735 U/mL. Los cromatogramas de la cromatografía de alta resolución de intercambio aniónico acoplada a detección amperométrica pulsada (HPAEC-PAD) de las mezclas sintetizadas de galacto-oligosacáridos por la ß-galactosidasa clonada a partir de B.bifidum NCIMB 41171 se muestran en la Figura 2. La concentración de azúcares en la mezcla de galacto-oligosacáridos en el tiempo óptimo síntesis se muestra en la tabla 1. Tabla 1. Composición de carbohidratos de la síntesis galacto-oligosacáridos a una concentración inicial lactosa del 40% en el momento que se observo concentración máxima de oligosacáridos. 40 8.82 16.25 39.4 20.76 14.85 Lac: Lactosa, Glc: Glucosa, Gal: Galactosa, GP : Grado de polimerización .

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION Habiendo descrito el presente invento se considera como novedad y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES 1. Una secuencia de ADN la cual a) codifica a una proteina con una secuencia de aminoácidos como la descrita en SEQ. ID NO: 2, o b) hibridiza bajo condiciones estrictas de hibridación para la secuencia de a) , o c) es una secuencia degenerativa de a) o b) . 2. La secuencia de ADN de conformidad con la reivindicación 1, en donde la secuencia o un fragmento de la misma se describe en SEQ. ID NO :
2.
3. La secuencia de ADN de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, en donde dicha secuencia comprende las sustituciones, adiciones o supresiones de nucleótidos que resulten en menos del 60%, preferentemente menos del 45%, mayor preferencia menos del 25% de cambio en la secuencia de aminoácidos o un fragmento de la misma de acuerdo con SEQ. ID. NO: 2.
4. Una secuencia de ADN de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, en donde dicha secuencia comprende la sustitución de nucleótidos lo cual resulta en sustituciones de aminoácidos conservativa.
5. Una enzima codificada por una secuencia de ADN de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. Una enzima que comprende una secuencia de aminoácidos o un fragmento de los mismos de acuerdo con SEQ. ID. NO: 2.
7. una ß-galactosidasa que tiene la secuencia definida en SEQ. ID. NO: 2.
8. Un vector recombinante que comprende una secuencia de ADN de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
9. El vector que de conformidad con la reivindicación 8, en donde dicho vector es un vector de expresión .
10. Una célula huésped que comprende una secuencia de ADN de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
11. Una célula huésped que comprende el vector de las reivindicaciones 8 ó 9.
12. La célula huésped de conformidad con las reivindicaciones 10 ó 11, en donde dicha célula es una célula bacteriana, una célula de levadura o una célula fúngica .
13. La célula huésped que de conformidad con la reivindicación 12, en donde dicha célula es seleccionada del grupo que consiste de Bifidobacterium, Lactococcus, Lactobacillus , Escherichia, Bacillus y Aspergillus.
14. La célula huésped que de conformidad con la reivindicación 13, en donde dicha célula es seleccionada del grupo que consiste de Bifidobacterium bifidum, Bacillus subtilis, Bacillus circulans y Aspergillus niger.
15. El uso de una enzima de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, o una célula de cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, para producir una mezcla de oligosacáridos .
16. El uso de una enzima de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, o una célula de cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, para producir una mezcla de oligosacáridos que sea parte de un producto seleccionado del grupo que sean parte de productos lácteos, tales como leche líquida, leche en polvo, leches para bebe, formula para bebe, helado, yogur, queso, productos lácteos fermentados, bebidas como jugo de frutas, alimentos infantiles, cereales, pan, galletas, confitería, pasteles, suplementos alimenticios, suplementos dietéticos, productos comestibles probióticos, productos comestibles prebióticos, alimentos para animales, alimentos avícolas y medicamentos.
17. El uso de una célula huésped de cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, para producir un producto seleccionado del grupo que consiste de productos lácteos, tales como leche líquida, leche en polvo, leches para bebe, formula para bebe, helado, yogur, queso, productos lácteos fermentados, bebidas como jugo de frutas, alimentos infantiles, cereales, pan, galletas, confitería, pasteles, suplementos alimenticios, suplementos dietéticos, productos comestibles probióticos, productos comestibles prebióticos, alimentos para animales, alimentos avícolas y medicamentos.
18. Un proceso para producir una enzima de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 que comprende el cultivo de una célula huésped de cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14 en una medio de cultivo apropiado bajo condiciones que permitan la expresión de dicha enzima y que recupere la enzima resultante del cultivo.