FR2771752A1 - Gene d'enzyme de lyse de paroi cellulaire, plasmide le contenant et bacterie transformee par ce plasmide - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne le gène d'un précurseur d'une enzyme de lyse de paroi cellulaire dérivée d'un microorganisme du genre Streptomyces, un plasmide contenant ce gène et une bactérie E. coli transformée par ce plasmide; ainsi que le gène d'une enzyme de lyse de paroi cellulaire dérivée d'un microorganisme du genre Streptomyces, un plasmide contenant ce gène et une bactérie E. coli transformée par ce plasmide.
Description
La présente invention concerne un gène d'une enzyme de lyse de paroi
cellulaire, un vecteur plasmidique conte-
nant ce gène et une bactérie transformée par ce vecteur.
Une enzyme de lyse de paroi cellulaire est une enzyme qui dégrade la paroi cellulaire de bactéries, y compris des actinomycètes. Sous l'action de l'enzyme,
la paroi cellulaire bactérienne est décomposée, ce qui entraîne la mort de la bactérie.
La couche extérieure des bactéries est recouverte
d'une paroi cellulaire, et le principal constituant struc- tural de la paroi cellulaire est un peptidoglycane compre-
nant des chaînes de sucre et des peptides. L'enzyme de lyse de paroi cellulaire agit sur le peptidoglycane.
Lorsque l'enzyme agit sur le peptidoglycane, l'enzyme réagit avec la chaîne de sucre du peptidoglycane en produisant de l'acide Nacétylmuramique à partir du sucre
au niveau de l'extrémité soumise à la réduction. Par consé- quent, l'enzyme est classée comme une N-acétylmuramidase.
Les principales enzymes entrant dans la classe des N-acétylmuramidases comprennent le lysozyme dérivé du blanc d'oeuf de poule. Cependant, l'enzyme de lyse de paroi cellulaire diffère de ces enzymes au regard des propriétés chimiques et enzymatiques et des microorganismes sujets à la décomposition [K. Hayashi et coll. Agric. Biol. Chem.25 (Édition Européenne du Journal Japonais d'Agriculture, Biochimie et Chimie), Vol. 45, pages 2289-2300, 1981] et du
fait que l'enzyme possède des caractéristiques originales.
Comme décrit ci-dessus, l'enzyme de lyse de paroi cellulaire décompose la paroi cellulaire bactérienne et, en tirant parti de cette propriété, l'enzyme est utilisée pour extraire les enzymes et l'ADN présents à l'intérieur des bactéries. Étant donné que certaines bactéries peuvent être tuées par l'action de la présente enzyme, l'enzyme peut en outre être utilisée comme conservateur alimentaire [K. Hayashi et coll. Agric. Biol. Chem. (Édition Européenne du Journal Japonais d'Agriculture, Biochimie et Chimie),
Vol. 53, pages 3173-3177, 1989].
Les procédés classiques pour produire l'enzyme de lyse de paroi cellulaire comprennent un procédé consistant à cultiver des microorganismes, tels que des actinomycètes appartenant au genre Streptomyces et des bactéries appar- tenant aux genres Achromobacter, Aeromonas, Bacillus,10 Clostridium, Flavobacterium, Myxobacter, Myxococcus, Pseudomonas, Staphylococcus et Streptococcus, et à
recueillir l'enzyme recherchée à partir du filtrat de culture ou des bactéries cultivées. Lorsque l'enzyme de lyse de paroi cellulaire est le lysozyme dérivé de blanc d'oeuf,15 on emploie un procédé consistant à préparer l'enzyme en utilisant la précipitation isoélectrique ou autre.
L'enzyme produite par ces procédés est disponible dans le commerce sous forme d'enzyme brute ou d'enzyme purifiée. Cependant, ces procédés ne sont pas satisfaisants20 en tant que procédés permettant de produire l'enzyme d'une
manière stable.
Afin de promouvoir l'utilisation des enzymes de lyse de paroi cellulaire, la présente invention a pour objet d'apporter une contribution à la production industrielle des25 enzymes de lyse de paroi cellulaire, et par le clonage du gène de ces enzymes permettant d'élucider la structure du
gène, et l'expression de ce gène.
La Demanderesse a conduit des recherches en vue de résoudre les problèmes décrits ci-dessus. La Demanderesse a ensuite élaboré une technique de clonage du gène d'une
enzyme de lyse de paroi cellulaire provenant d'un micro-
organisme appartenant au genre Streptomyces. La Demanderesse a réussi à cloner le gène et la présente invention a ainsi
été mise au point.
Un premier aspect de l'invention est le gène d'un précurseur d'une enzyme de lyse de paroi cellulaire
ayant la séquence nucléotidique représentée par la Séquence N 1 de la Liste des Séquences.
Un deuxième aspect de l'invention est un plasmide contenant le gène du précurseur de l'enzyme de lyse de paroi
cellulaire selon le premier aspect.
Un troisième aspect de l'invention est une bactérie E. coli (FERM BP6166) transformée par le plasmide selon le
deuxième aspect.
Un quatrième aspect de l'invention est le gène d'une enzyme de lyse de paroi cellulaire ayant la séquence nucléotidique représentée par la Séquence N 2 de la Liste
des Séquences.
Un cinquième aspect de l'invention est un plasmide contenant le gène de l'enzyme de lyse de paroi cellulaire
selon le quatrième aspect.
Un sixième aspect de l'invention est une bactérie E. coli transformée par le plasmide selon le cinquième
aspect.
La Demanderesse a extrait une enzyme de lyse de paroi cellulaire à partir d'une bactérie, appartenant au genre Streptomyces, qui possède la faculté de produire une enzyme de lyse de paroi cellulaire, purifié l'enzyme à un haut degré de pureté et déterminé la séquence d'acides aminés de la partie N-terminale (voir la Séquence N 3 de la Liste des Séquences). De plus, d'après la séquence d'acides aminés déterminée, une paire d'amorces a été préparée (voir les Séquences N 4 et 5 de la Liste des Séquences). Par une réaction d'amplification en chaîne par polymérase (PCR) conduite en utilisant les amorces susmentionnées avec l'ADN génomique extrait d'une bactérie appartenant au genre Streptomyces comme matrice, une bande fortement visible à
pb a été recueillie.
En clonant la bande résultante (produit de PCR) et en analysant la bande avec un séquenceur d'ADN, sa séquence nucléotidique d'ADN (voir la Séquence N 6 de la Liste des Séquences) a été déterminée. La séquence nucléotidique d'ADN a ensuite été traduite en acides aminés. On a observé une séquence correspondant à la séquence d'acides aminés initialement obtenue au niveau de la partie N-terminale (voir la Séquence N 3 de la Liste des Séquences), ce qui
a indiqué que ledit produitdePCR faisait partie du gène de l'enzyme de lyse de paroi cellulaire.
Ensuite, le gène de l'enzyme de lyse de paroi cellulaire a été clone en premier lieu en utilisant le
produit de PCR comme sonde.
En variante, l'ADN génomique extrait de la bactérie appartenant au genre Streptomyces a été dégradé par action enzymatique afin de soumettre les fragments d'ADN résultants à une hybridation de Southern. En conséquence, il a été confirmé que le gène recherché de l'enzyme de lyse de paroi
cellulaire était présent dans le fragment d'ADN de 2,8 kpb.
En sous-clonant le fragment contenant le gène de l'enzyme de lyse de paroi cellulaire, un plasmide a été
préparé. Le plasmide a été utilisé pour transformer E. coli afin de recueillir une bactérie transformée.
La présente invention sera maintenant décrite en
détail dans ce qui suit.
Comme décrit ci-dessus, le gène d'une enzyme de lyse de paroi cellulaire selon la présente invention est
dérivé d'un microorganisme ayant la faculté de produire une30 enzyme de lyse de paroi cellulaire.
Les microorganismes ayant la faculté de produire l'enzyme de lyse de paroi cellulaire comprennent, par exemple, des actinomycètes du genre Streptomyces et des bactéries appartenant aux genres Achromobacter, Aeromonas, Bacillus, Clostridium, Flavobacterium, Myxobacter, Myxococcus, Pseudomonas, Staphylococcus, Streptococcus, etc. Parmi ceux-ci, on fait de préférence usage de bactéries appartenant au genre Streptomyces. Les souches bactériennes appartenant au genre Streptomyces comprennent, par exemple, Streptomyces rutgersensis H-46, etc.
L'enzyme de lyse de paroi cellulaire peut être extraite des microorganismes susmentionnés. Plus particu-
lièrement, les souches bactériennes susmentionnées sont cultivées par des méthodes de routine. Le milieu de culture est de préférence un milieu contenant de l'extrait de soja dégraissé, mais n'y est pas limité. La culture peut être effectuée, par exemple, suivant la méthode de K. Hayashi et15 coll., J. Ferment. Technol. (Édition Européenne du Journal Japonais de l'Association de Technogénie des Fermentations),
Vol. 59, pages 319-323, 1981.
Le bouillon de culture est centrifugé pour éliminer le microorganisme. Une enzyme de lyse de paroi cellulaire hautement purifiée peut être retirée du surnageant ainsi obtenu par des techniques de purification courantes, telles que la chromatographie d'échange d'ions, la chromatographie sur colonne, la chromatographie rapide de protéines en phase liquide, la chromatographie en phase liquide à haute25 performance, etc.
Un exemple d'une telle technique de purification comprend le procédé de K. Hayashi et coll. Agric. Biol.
Chem. (Édition Européenne du Journal Japonais d'Agriculture, Biochimie et Chimie), Vol. 45, pages 2289-2300, 1981. Plus30 particulièrement, l'enzyme peut être purifiée en utilisant la chromatographie sur colonne de résine échangeuse de cations. Ensuite, on détermine la séquence d'acides aminés
de la partie N-terminale de l'enzyme de lyse de paroi cellu-
laire purifiée. Pour le séquencage, on peut utiliser un séquenceur de protéine du type G 1005A (fabriqué par Hewlett Packard Co.). La séquence d'acides aminés déterminée de la partie N-terminale est représentée par la Séquence N 3 de la Liste des Séquences. En déduisant la séquence nucléotidique de la séquence d'acides aminés déterminée et en préparant des amorces (voir les Séquences N 4 et 5 de la Liste des Séquences) sur la base de la séquence nucléotidique, 10 on effectue une réaction de PCR en utilisant ces amorces avec l'ADN génomique extrait de la souche bactérienne
appartenant au genre Streptomyces comme matrice. En conséquence, on recueille une prédominante à 140 pb.
Afin d'analyser la séquence nucléotidique d'ADN
de la bande résultante, la bande est clonée pour effectuer l'analyse avec un séquenceur d'ADN. La séquence nucléoti-
dique ainsi déterminée par l'analyse (voir la Séquence N 6 de la Liste des Séquences) est ensuite traduite en acides aminés. En conséquence, on observe une séquence corres-20 pondant à la séquence d'acides aminés initiale de la partie N-terminale (voir la Séquence N 3 de la Liste des Séquences), ce qui indique que le produit recueilli par la PCR est une partie du gène de l'enzyme de lyse de paroi cellulaire. Ensuite, le gène du précurseur, incluant le gène de l'enzyme de lyse de paroi cellulaire mature, est clone
en utilisant le produit de PCR comme sonde.
Tout d'abord, de l'ADN génomique est extrait d'une bactérie appartenant au genre Streptomyces. L'extraction peut être effectuée, par exemple, suivant la méthode de Saito, "Protein, Nucleic Acid and Enzyme", Vol. 11, page 446. Plus particulièrement, la paroi cellulaire de la bactérie est dégradée par action enzymatique, l'ADN extrait est enroulé sur une baguette de verre et l'ADN génomique
est purifié.
La séquence nucléotidique et la séquence d'acides aminés du précurseur de l'enzyme de lyse de paroi cellulaire selon la présente invention sont représentées par la Séquence N 1 de la Liste des Séquences. De plus, d'après la séquence d'acides aminés correspondant au gène du précurseur de l'enzyme de lyse de paroi cellulaire, on construit la séquence d'acides aminés correspondant au gène de l'enzyme10 de lyse de paroi cellulaire sur la base de la séquence d'acides aminés initialement déterminée de la partie N-terminale de l'enzyme de lyse de paroi cellulaire (voir la Séquence N 3 de la Liste des Séquences). La séquence d'acides aminés correspondant audit gène est représentée
avec sa séquence nucléotidique par la Séquence N 2 de la Liste des Séquences.
Le gène de l'enzyme de lyse de paroi cellulaire selon la présente invention exprime une enzyme ayant une
séquence d'acides aminés originale, et l'on n'a trouvé20 aucune protéine ayant 55 % ou plus d'homologie avec l'enzyme.
En sous-clonant le fragment de 2,8 kpb préparé par électrophorèse sur gel d'agarose en utilisant un kit de ligature d'ADN (fabriqué par Takara Brewery Co.) dans un plasmide préalablement déphosphorylé, on prépare un plasmide
pUC 18-SR1.
Le plasmide est ensuite utilisé pour transformer E. coli par une méthode de routine. La souche E. coli transformée a été déposée sous le numéro de référence30 FERM BP-6166 à l'Institut National de Science Biologique et de Technologie Humaine, Agence de la Science et de la
Technologie Industrielles (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba- shi, Ibarakiken, Japon). De plus, le plasmide pUC 18-SR1 contient le gène de l'enzyme de lyse de paroi cellulaire.
L'expression du gène de l'enzyme de lyse de paroi cellulaire peut être confirmée en cultivant E. coli trans-
formé ainsi obtenu et en titrant ledit E. coli et l'enzyme de lyse de paroi cellulaire dans le surnageant.
On peut produire l'enzyme de lyse de paroi cellu- laire en cultivant la bactérie transformée dans un milieu nutritif entre 20 et 370C pendant 3 à 48 heures, en faisant éclater la souche microbienne résultante et en purifiant le surnageant recueilli en séparant le liquide du solide selon
une technique courante.
Le gène de l'enzyme agissant pour décomposer la paroi cellulaire bactérienne est obtenu selon la présente
invention. L'enzyme produite par l'expression du gène est utile dans le domaine de l'industrie alimentaire.
La présente invention sera maintenant illustrée dans le détail en considérant l'exemple suivant.
EXEMPLE
Le microorganisme Streptomyces rutgersensis H-46 est cultivé dans un milieu de culture contenant 0,5 % de
glucose et 2 % d'extrait à l'eau chaude de soja dégraissé suivant la méthode de K. Hayashi et coll., J. Ferment.
Technol. (Édition Européenne du Journal Japonais de l'Association de Technogénie des Fermentations), Vol. 59, pages 319- 323, 1981.
A partir du surnageant recueilli en éliminant la souche microbienne du bouillon de culture, on retire une enzyme de lyse de paroi cellulaire hautement purifiée en utilisant la chromatographie d'échange d'ions par la méthode de K. Hayashi et coll. Agric. Biol. Chem. (Édition Euro-30 péenne du Journal Japonais d'Agriculture, Biochimie et
Chimie), Vol. 45, pages 2289-2300, 1981.
En utilisant l'enzyme purifiée, on détermine la séquence d'acides aminés de la partie N-terminale au moyen d'un séquenceur de protéine Type G 1005A (fabriqué par Hewlett Packard Co.). La séquence déterminée est représentée
par la Séquence N 3 de la Liste des Séquences.
Dans la séquence d'acides aminés déterminée, on choisit deux régions ayant une moindre stringence des codons, pour synthétiser chimiquement une amorce directe (représentée par la Séquence N 4 de la Liste des Séquences) et une amorce inverse (représentée par la Séquence N 5 de
la Liste des Séquences).
En utilisant ces amorces, on effectue une amplifi- cation par PCR avec l'ADN génomique de la souche H-46 de
Streptomyces rutgersensis comme matrice. En conséquence, on recueille une bande prédominante à 140 pb.
En clonant la bande résultante et en analysant la bande avec un séquenceur d'ADN, on détermine que sa séquence nucléotidique d'ADN est telle que représentée par la Séquence N 6 de la Liste des Séquences. La séquence nucléotidique d'ADN est ensuite traduite en acides aminés. On observe une séquence correspondant à la séquence d'acides20 aminés initialement obtenue de la partie N-terminale telle que représentée par la Séquence N 3 de la Liste des Séquences. Il est ainsi indiqué que le produit de PCR est une
partie du gène de l'enzyme de lyse de paroi cellulaire.
Ensuite, le produit de PCR est marqué avec le Système de Détection d'Acide Nucléique par Chimiluminescence
Gene Images (fabriqué par Amersham Co.) et, en utilisant le produit marqué comme sonde, on clone le gène du précurseur de l'enzyme de lyse de paroi cellulaire.
En variante, l'ADN génomique est extrait de Streptomyces rutgersensis H-46 par la méthode de Saito, "Protein, Nucleic Acid and Enzyme", Vol. 11, page 446. L'ADN génomique est ensuite complètement décomposé par l'enzyme de restriction SacI. Les fragments de restriction résultants sont séparés par électrophorèse sur gel d'aga- rose, puis soumis à une hybridation de Southern ("Cloning and Sequence", Watanabe Eds. Noson Bunka-sha, 1989, page 5 157). En conséquence, il est confirmé que le gène recherché de l'enzyme de lyse de paroi cellulaire est présent dans le
fragment d'ADN de 2,8 kpb.
Le fragment de 2,8 kpb est préparé par électro- phorèse sur gel d'agarose selon la méthode décrite par J. Sambrook, E.F. Fritsch et T. Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ème édition, Section 6.3,
Vol. 1 (1989).
En variante, le plasmide pUS-18 est clivé par l'enzyme de restriction SacI, puis déphosphorylé par la phosphatase alcaline. Le fragment de 2, 8 kpb est sous-cloné dans le plasmide déphosphorylé au moyen d'un kit de ligature
d'ADN (fabriqué par Takara Brewery Co.) suivant la méthode décrite dans "Cloning and Sequence", Watanabe Eds. Noson Bunka-sha, 1989, page 157, pour préparer un plasmide pUC 18-20 SR1.
Le plasmide est utilisé pour transformer E. coli selon la méthode décrite par J. Sambrook, E.F. Fritsch et
T. Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ème édition, Section 1.74, Vol. 1 (1989).
La souche E. coli transformée a été déposée à l'Institut National de Science Biologique et de Technologie Humaine, Agence de la Science et de la Technologie Indus- trielles et son numéro de référence est FERM BP-6166. De plus, le plasmide pUC 18-SR1 contient le gène de l'enzyme30 de lyse de paroi cellulaire. La bactérie transformée selon le sixième aspect de l'invention peut également être obtenue
par la même méthode.
Un plus grand volume du plasmide pUS 18-SR1 est préparé à partir de la bactérie transformée pour analyse
avec un kit de Séquençage Cyclique avec Terminateur à la d-
Rhodamine (fabriqué par Perkin Elmer Co.).
En réunissant les informations sur les séquences nucléotidiques déterminées, on construit le gène du précur-
seur de l'enzyme de lyse de paroi cellulaire. La séquence nucléotidique et la séquence d'acides aminés correspondante
dudit gène du précurseur sont représentées par la Séquence N 1 de la Liste des Séquences.
La séquence d'acides aminés correspondant au gène du précurseur de l'enzyme de lyse de paroi cellulaire, telle que représentée par la Séquence N 1 de la Liste des Séquences, est comparée à la séquence d'acides aminés obtenue initialement de la partie N-terminale de l'enzyme de lyse de paroi cellulaire (voir la Séquence N 3 de la Liste
des Séquences).
En conséquence, la séquence d'acides aminés de la partie N-terminale de l'enzyme de lyse de paroi cellulaire (voir la Séquence N 3 de la Liste des Séquences) concorde avec la séquence allant du 2lème résidu au 100ème résidu de la séquence d'acides aminés représentée par la Séquence N 1. Il est ainsi indiqué que le gène de l'enzyme de lyse de paroi cellulaire peut se trouver en aval du 24lème résidu de la séquence nucléotidique du gène de précurseur. Le gène de l'enzyme de lyse de paroi cellulaire active est construit d'après le gène du précurseur de l'enzyme de lyse de paroi cellulaire sur la base de la séquence d'acides aminés de la partie N-terminale de l'enzyme de lyse de paroi cellulaire, comme représenté par la Séquence N 2 de la Liste des Séquences. Le poids moléculaire de l'enzyme de lyse de paroi cellulaire active est déterminé par un système d'ionisation à laser Type TOF-MS KOMPACT MALDI III, fabriqué par Shimadzu Co., Ltd. Le poids moléculaire est de 23 000 daltons, ce qui concorde bien avec le poids moléculaire de la protéine codée
par le présent gène, à savoir 23 056 daltons.
LISTE DES SÉQUENCES
Séquence N 1 Longueur de Séquence: 1088 Type de Séquence: acide nucléique Nombre de brins: double Topologie: linéaire Type Moléculaire de la Séquence: ADN génomique Origine: Nom de l'Organisme: Streptomyces rutgersensis Nom de la Souche: H-46 Origine Directe: Nom du Plasmide: pUC 18-SR1 Caractéristiques de la Séquence: Symbole Représentant les Caractéristiques: CDS Situation: 181...870 Méthode de Détermination des Caractéristiques: P Séquence:
TCAGGCACCC CCCGTCACGC TCGCCCACCG CCTTCGGAGG CCCCCATGCG CGTACCCAGA 60
TCCGGAGCCC GCCCCTCTCG CCGCACCGCG GCCGGAGTTC TCCTCGCCGC CCTCTCCCTG 120
CTCTTCACCC TGCCCTCGGG GGCGCACGCC GCCGACCGTC CCGAGCGGGG CGAGGCCCAC 180
ATG GGC ATG GGC GTC GTG GAG CAC GAC GGC CGG AGC GGG GCG CCC GGT 228
Met Gly Met Gly Val Val Glu His Asp Gly Arg Ser Gly Ala Pro Gly
10 15
ATC TCG CCG CGC GCC GTG CAG ACG GAG GGC GTG GAC GTC TCC AGC CAT 276
Ile Ser Pro Arg Ala Val Gln Thr Glu Gly Val Asp Val Ser Ser His
25 30
CAG GGG AAC GTC GAC TGG GCC GCG CTG TGG AAC AGC GGC GTC AAG TGG 324
Gln Gly Asn Val Asp Trp Ala Ala Leu Trp Asn Ser Gly Val Lys Trp
40 45
TCG TAC GTG AAG GCC ACC GAG GGC ACG TAC TAC AAG AAC CCG TAC TTC 372
Ser Tyr Val Lys Ala Thr Glu Gly Thr Tyr Tyr Lys Asn Pro Tyr Phe
55 60
GCG CAG CAG TAC AAC GGC AGT TAC AAC GTG GGG ATG ATC CGC GGC GCC 420
Ala Gin Gin Tyr Asn Gly Ser Tyr Asn Val Gly Met Ile Arg Gly Ala
70 75 80
TAC CAC TTC GCG ACG CCC AAC ACG ACG AGC GGC GCC GCC CAG GCC AAC 468
Tyr His Phe Ala Thr Pro Asn Thr Thr Ser Gly Ala Ala Gin Ala Asn
90 95
TAC TTC GTG GAC AAC GGC GGC GGC TGG TCC CGC GAC GGC AAG ACC CTG 516
Tyr Phe Val Asp Asn Gly Gly Gly Trp Ser Arg Asp Gly Lys Thr Leu
105 110
CCG GGT GTC CTG GAC ATC GAG TGG AAC CCG TAC CGC GAC CAG TGC TAC 564
Pro Gly Val Leu Asp le Glu Trp Asn Pro Tyr Gly Asp Gin Cys Tyr
120 125
GGC CTG AGC CAG TCC GCG ATG GTC AAC TGG ATC CGC GAC TTC ACC AAC 612
Gly Leu Ser Gin Ser Ala Met Val Asn Trp Ile Arg Asp Phe Thr Asn
135 140
ACC TAC AAG GCC CGC ACC GGC CGG GA GGCG GTC ATC TAC ACC GCG ACC 660
Thr Tyr Lys Ala Arg Thr GIy Arg Asp Ala Val le Tyr Thr Ala Thr
150 155 160
AGC TGG TGG ACC TCC TGC ACC GGC AAC TAC GCG GGC TTC GGC ACC ACC 708
Ser Trp Trp Thr Ser Cys Thr Gly Asn Tyr Ala Gly Phe Gly Thr Thr
170 175
AAC CCG CTC TGG GTC GCC CGG TAC GCC GCC TCG GTG GGC GAA CTC CCG 756
Asn Pro Leu Trp Val Ala Arg Tyr Ala Ala Ser Val Gly Glu Leu Pro
185 190
GCC GGC TGG GGC TTC TAC ACG ATG TGG CAG TAC ACC TCC ACC GGC CCG 804
Ala Gly Trp Gly Phe Tyr Thr Met Trp Gln Tyr Thr Ser Thr Gly Pro
200 205
ATC GTC GGC GAC CAC AAC CGC TTC AAC GGC GCG TAC GAC CGG CTC CAG 852
le Val Gly Asp His Asn Arg Phe Asn Gly Ala Tyr Asp Arg Leu Gin
210 215 220
GCG CTC GCC AAC GGC TGAGCCCGAG CCGTCGGACG CCCCGGCGAC CGCGCACGCC 907
Ala Leu Ala Asn Gly
GAAGAGGCCC GGTGACCTGT TCACCGGGCC TTTTCCGGGT CCGGAGCGGG GTGCGGAAAT 967
CCTTCCGGGG GCGGGGCAAC CGTTCGACTA TCCACTCCAT CTATACACGG CGTGAACACT 1027
CTGACGCACG CCGAGCCCCG CACCCGCCGC CGCCCGCACC GCATCCGCCG TACAGCCGTC 1087
G 1088
Séquence N 2 Longueur de Séquence: 630 Type de Séquence: acide nucléique Nombre de brins: deux Topologie: linéaire Type Moléculaire de la Séquence: ADN génomique Origine: Nom de l'Organisme: Streptomyces rutgersensis Nom de la Souche: H-46 Origine Directe: Nom du Plasmide: pUC 18-SR1 Caractéristiques de la Séquence: Symbole Représentant les Caractéristiques: peptide mat Situation: 1...630 Méthode de Détermination des Caractéristiques: P Séquence:
GCC GTG CAG ACG GAG GGC GTG GAC GTC TCC AGC CAT CAG GGG AAC GTC 48
Ala Val Gln Thr Glu Gly Val Asp Val Ser Ser His Gln Gly Asn Val
10 15
GAC TGG GCC GCG CTG TGG AAC AGC GGC GTC AAG TGG TCG TAC GTG AAG 96
Asp Trp Ala Ala Leu Trp Asn Ser Gly Val Lys Trp Ser Tyr Val Lys
25 30
GCC ACC GAG GGC ACG TAC TAC AAG AAC CCG TAC TTC GCG CAG CAG TAC 144
Ala Thr Glu Gly Thr Tyr Tyr Lys Asn Pro Tyr Phe Ala Gin Gln Tyr
40 45
AAC GGC AGT TAC AAC GTG GGG ATG ATC CGC GGC GCC TAC CAC TTC GCG 192
Asn Gly Ser Tyr Asn Val Gly Met Ile Arg Gly Ala Tyr His Phe Ala
55 60
ACG CCC AAC ACG ACG AGC GGC CCC GCC CAG GCC AAC TAC TTC GTG GAC 240
Thr Pro Asn Thr Thr Ser Gly Ala Ala Gin Ala Asn Tyr Phe Val Asp
70 75 80
AAC GGC GGC GGC TGG TCC CGC GAC GGC AAG ACC CTG CCG GGT GTC CTG 288
Asn Gly Gly Gily Trp Ser Arg Asp Gly Lys Thr Leu Pro Gly Val Leu
90 95
GAC ATC GAG TGG AAC CCG TAC GGC GAC CAG TGC TAC GGC CTG AGC CAG 336
Asp le Glu Trp Asn Pro Tyr Gly Asp Gln Cys Tyr Gly Leu Ser Gln
105 110
TCC GCG ATG GTC AAC TGG ATC CGC GAC TTC ACC AAC ACC TAC AAG GCC 384
Ser Ala Met Val Asn Trp Ile Arg Asp Phe Thr Asn Thr Tyr Lys Ala
120 125
CGC ACC GGC CGG GAC GCG GTC ATC TAC ACC GCG ACC AGC TGG TGG ACC 432
Arg Thr Gly Arg Asp Ala Val lie Tyr Thr Ala Thr Ser Trp Trp Thr
135 140
TCC TGC ACC GGC MAAC TAC GCG GGC TTC GGC ACC ACC AAC CCC CTC TGG 480
Ser Cys Thr Gly Asn Tyr Ala Gly Phe Gly Thr Thr Asn Pro Leu Trp
150 155 160
GTC GCC CGG TAC GCC GCC TCG GTG GGC GAA CTC CCG GCC GGC TGG GGC 528
Val Ala Arg Tyr Ala Ala Ser Val Gly Glu Leu Pro Ala Gly Trp Gly
170 175
17 2771752
TTC TAC ACG ATG TGG CAG TAC ACC TCC ACC GGC CCG ATC GTC GGC GAC 576
Phe Tyr Thr Met Trp Gln Tyr Thr Ser Thr GIy Pro Ile Val Gly Asp
185 190
CAC AAC CGC TTC AAC GGC GCG TAC GAC CGG CTC CAG GCG CTC GCC AAC 624
His Asn Arg Phe Asn Gly Ala Tyr Asp Arg Leu Gin Ala Leu Ala Asn
200 205
GGC TGA 630
Gly
209
Séquence N 3 Longueur de Séquence: 80 Type de Séquence: acide aminé Topologie: linéaire Type Moléculaire de la Séquence: peptide Type de Fragment: fragment N-terminal Origine: Nom de l'Organisme: Streptomyces rutgersensis Nom de la Souche: H-46 Origine Directe: Enzyme produite par Streptomyces rutgersensis Séquence: Ala Val Gin Thr Glu Gly Val Asp Val Ser Ser His Gin Gly Asn Val
1 5 10 15
Asp Trp Ala Ala Leu Trp Asn Ser Gly Val Lys Trp Ser Tyr Val Lys
25 30
Ala Thr Glu Gly Thr Tyr Tyr Lys Asn Pro Tyr Phe Ala Gin Gin Tyr
40 45
Asn Gly Ser Tyr Asn Val Gly Met lle Arg Gly Ala Tyr His Phe Ala
55 60
Thr Pro Asn Thr Thr Ser Gly Ala Ala Gin Ala Asn Tyr Phe Val Asp
70 75 80
Séquence N 4 Longueur de Séquence: 20 Type de Séquence: acide nucléique Nombre de brins: un Topologie: linéaire Type Moléculaire de la Séquence: autres acides nucléiques (préparé à partir de séquence d'acides aminés) Origine: Nom de l'Organisme: Streptomyces rutgersensis Nom de la Souche: H-46 Origine Directe: Enzyme produite par Streptomyces rutgersensis Séquence:
CARGGSAAYG TSGAYTGGGC 20
Séquence N 5 Longueur de Séquence: 20 Type de Séquence: acide nucléique Nombre de brins: un Topologie: linéaire Type Moléculaire de la Séquence: autres acides nucléiques (préparé à partir de séquence d'acides aminés) Origine: Nom de l'organisme: Streptomyces rutgersensis Nom de la Souche: H-46 Origine Directe: Enzyme produite par Streptomyces rutgersensis Séquence:
CGGATCATSC CSACRTTRTA 20
Séquence N 6 Longueur de Séquence: 137 Type de Séquence: acide nucléique Nombre de brins: un Topologie: linéaire Type Moléculaire de la Séquence: autres acides nucléiques Origine: Nom de l'Organisme: Streptomyces rutgersensis Nom de la Souche: H-46 Origine Directe: produits d'ACP Séquence:
CAG GGG AAC GTC GAC TGG GCC GCG CTG TGG AAC AGC GGC GTC AAG TGG 48
GIln Gly Asn Val Asp Trp Ala Ala Leu Trp Asn Ser Gly Val Lys Trp i 5 10 15 TCG TAC GTG AAG GCC ACC GAG GGC ACG TAC TAC AAG AAC CCG TAC TTC 96
Ser Tyr Val Lys Ala Thr Glu Gly Thr Tyr Tyr Lys Asn Pro Tyr Phe
25 30
GCG CAG CAG TAC AAC GGC AGT TAC AAC GTG GGG ATG ATC CG 137
Ala Gin Gin Tyr Asn Gly Ser Tyr Asn Val Gly Met Ile
40 45
Claims (10)
1. Gène codant pour un précurseur d'une enzyme de lyse de paroi cellulaire dérivée d'un microorganisme, ledit gène possédant la séquence nucléotidique représentée par la Séquence N 1 de la liste des séquences.
2. Gène selon la revendication 1, ledit microorganisme étant choisi parmi les actinomycètes du genre Streptomyces et les bactéries appartenant aux genres Achromobacter, Aeromonas, Bacillus, Clostridium,
Flavobacterium, Myxobacter, Myxococcus, Pseudomonas, Staphylococcus et Streptococcus.
3. Gène selon l'une quelconque des revendications
ou 2, ledit microorganisme étant Streptomyces rutgersensis H-46.
4. Plasmide caractérisé en ce qu'il contient le gène du précurseur de l'enzyme de lyse de paroi cellulaire
selon l'une quelconque des revendications 1 à 3.
5. E. coli (FERM BP-6166) transformé par le
plasmide selon à la revendication 4.
6. Gène codant pour une enzyme de lyse de paroi cellulaire dérivée d'un microorganisme ledit gène possédant la séquence nucléotidique représentée par la Séquence N 2
de la liste des séquences.
7. Gène selon la revendication 6, ledit microorganisme étant choisi parmi les actinomycètes du genre Streptomyces et les bactéries appartenant aux genres
Achromobacter, Aeromonas, Bacillus, Clostridium, Flavobacterium, Myxobacter, Myxococcus, Pseudomonas, Staphylococcus et Streptococcus.
8. Gène selon l'une quelconque des revendications 6
ou 7, ledit microorganisme étant Streptomyces rutgersensis H-46.
9. Plasmide caractérisé en ce qu'il contient le gène de l'enzyme de lyse de paroi cellulaire selon l'une
quelconque des revendications 6 à 8.
10. E. coli (FERM BP-6166) transformé par le plasmide selon à la revendication 9.
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Non-Patent Citations (3)
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| K. HAYASHI ET AL.,: "Purification and characterization of the lytic enzyme produced by Streptomyces rutgersensis H-46", AGRICULTURAL AND BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 45, no. 10, 1981, pages 2289 - 2300, XP002092256 * |
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