FR2771753A1 - Gene de chitine-desacetylase, sequence d'adn hybridable, vecteur plasmidique qui le contient et organisme transforme par ce vecteur plasmidique - Google Patents
Gene de chitine-desacetylase, sequence d'adn hybridable, vecteur plasmidique qui le contient et organisme transforme par ce vecteur plasmidique Download PDFInfo
- Publication number
- FR2771753A1 FR2771753A1 FR9802435A FR9802435A FR2771753A1 FR 2771753 A1 FR2771753 A1 FR 2771753A1 FR 9802435 A FR9802435 A FR 9802435A FR 9802435 A FR9802435 A FR 9802435A FR 2771753 A1 FR2771753 A1 FR 2771753A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- sequence
- gene
- chitin
- deacetylase
- leu
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
- C08B37/0024—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid beta-D-Glucans; (beta-1,3)-D-Glucans, e.g. paramylon, coriolan, sclerotan, pachyman, callose, scleroglucan, schizophyllan, laminaran, lentinan or curdlan; (beta-1,6)-D-Glucans, e.g. pustulan; (beta-1,4)-D-Glucans; (beta-1,3)(beta-1,4)-D-Glucans, e.g. lichenan; Derivatives thereof
- C08B37/0027—2-Acetamido-2-deoxy-beta-glucans; Derivatives thereof
- C08B37/003—Chitin, i.e. 2-acetamido-2-deoxy-(beta-1,4)-D-glucan or N-acetyl-beta-1,4-D-glucosamine; Chitosan, i.e. deacetylated product of chitin or (beta-1,4)-D-glucosamine; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
- C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
- C12Y305/01—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amides (3.5.1)
- C12Y305/01041—Chitin deacetylase (3.5.1.41)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
L'invention concerne un gène de chitine-désacétylase. Le gène de chitine-désacétylase code pour une protéine ayant une séquence d'acides aminés décrite en tant que Séquence Ndegre 1 dans la Liste des Séquences. La chitine-désacétylase produite par expression du gène dans un organisme transformé par un vecteur plasmidique qui le contient est utile pour désacétyler la chitine en chitosane.Application à la production de matières premières pour l'industrie alimentaire et l'industrie pharmaceutique.
Description
La présente invention concerne un gène de chitine-
désacétylase, un vecteur plasmidique contenant ledit gène et
un organisme transformé.
La chitine-désacétylase (EC 3.5.1.41) est une enzyme hydrolysant le groupe N-acétyle du résidu de N-acétyl- glucosamine de la chitine, et possédant la faculté de décomposer le résidu de N-acétylglucosamine en résidu de
glucosamine et acide acétique.
La désacétylation de la chitine donne le chitosane qui est une substance utile dans les domaines de l'industrie alimentaire, l'industrie pharmaceutique, etc. Par conséquent, ladite enzyme est utile pour envisager une exploitation
efficace de la chitine qui est une ressource inutilisée.
De plus, cette enzyme peut être utilisée pour
préparer un oligosaccharide de chitosane à partir d'oligo-
saccharide de chitine, et pour désacétyler par voie enzyma-
tique les groupes N-acétyle présents dans d'autres résidus
de sucres aminés.
Comme décrit ci-dessus, la chitine-désacétylase est une enzyme hydrolysant les groupes N-acétyle de la chitine, d'un oligosaccharide de chitine et d'autres composés contenant des résidus de sucres aminés N- acétylés. Comme indiqué ci-dessus, l'utilité du chitosane, qui est un produit de désacétylation de la chitine, est reconnue
dans des domaines très divers.
Dans le seul domaine alimentaire, son utilité ressort, par exemple, de l'action épaississante, l'action d'abaissement du cholestérol, l'action hypotensive, l'effet prophylactique contre la goutte et l'hyperuricémie, l'effet30 prophylactique contre l'ostéoporose, la stimulation de la croissance des bactéries du genre Bifidus, l'inhibition de la croissance de E. coli et Clostridium perfringens, l'activité antitumorale, etc. Le groupe N-acétyle des résidus de sucres a classiquement été hydrolysé, principalement par hydrolyse chimique avec des alcalis. Il a été remarqué que le procédé est désavantageux en raison de l'apparition de réactions secondaires, de la difficulté rencontrée pour maîtriser la réaction et de la production d'un liquide alcalin résiduaire. En vue de surmonter ces inconvénients, un énergique travail de recherche a été entrepris sur une technique de désacétylation enzymatique dans des conditions douces, par l'utilisation de chitine-désacétylase. En particulier, l'attention s'est portée sur une chitine-désacétylase dérivée de Deuteromycotina (champignons imparfaits) (demande
de brevet japonais Kokai Hei 8-289785).
La chitine-désacétylase dérivée d'un champignon
imparfait est avantageuse du fait que la réaction enzyma-
tique n'est guère inhibée par un produit réactionnel, l'acide acétique, et du fait que des oligosaccharides de chitine ayant un bas poids moléculaire, etc., peuvent également être désacétylés. Par conséquent, la désacétylase convient très bien à l'usage industriel. En outre, l'enzyme offre un large éventail d'activités, par exemple une activité pour éliminer le groupe N-acétyle des résidus de sucres aminés N- acétylés autres que ceux de la chitine, de sorte que l'enzyme peut être appliquée à la synthèse
de nouvelles chaînes de sucres.
Le champignon imparfait qui a fait l'objet de la recherche la plus énergique en tant que bactérie pour l'obtention de chitine-désacétylase est Colletotrichum lindemuthianum. Cependant, étant donne que Colletotrichum
lindemuthianum est un champignon phytopathogène, sa manipu-
lation présente des difficultés très défavorables pour des raisons de sécurité. De plus, en ce qui concerne la produc-
tion de l'enzyme, ce microorganisme est désavantageux du fait qu'un temlpsplus long est necessaire pour que l'enzyme soit sécrétée dans un bouillon de culture, et35 l'enzyme à recueillir est peu abondante.
Un but de la présente invention est de surmonter les problèmes décrits ci-dessus et d'apporter une contribution à la production industrielle d'une chitine-désacétylase dérivée de champignon imparfait, en clonant un gène de ladite enzyme pour déterminer la structure du gène et
exprimer le gène afin d'utiliser l'enzyme plus efficacement.
Les présents inventeurs ont conduit des recherches
pour mettre en évidence le gène de structure de la chitine-
désacétylase. Les inventeurs ont réussi à cloner le gène de
chitine-désacétylase à partir d'un micro-organisme apparte-
nant au genre Colletotrichum ayant la faculté de produire
cette enzyme. La présente invention a ainsi été réalisée.
Le premier aspect de l'invention est le gène de chitine-désacétylase codant pour la protéine ayant la séquence d'acides aminés représentée par la Séquence N 1
de la Liste des Séquences.
Le deuxième aspect de l'invention est une séquence nucléotidique d'ADN hybridable à la séquence nucléotidique du gène selon le premier aspect de l'invention et codant pour une protéine ayant une activité de désacétylase sur le groupe N-acétyle des résidus de sucres aminés N- acétylés. Le troisième aspect de l'invention est un vecteur plasmidique contenant le gène de chitine-désacétylase selon
le premier aspect de l'invention.
Le quatrième aspect de l'invention est un organisme transformé produit par transformation au moyen du vecteur
plasmidique selon le troisième aspect de l'invention.
Les inventeurs ont purifié à un haut degré la chitine-désacétylase retirée d'un bouillon de culture d'un champignon imparfait appartenant au genre Colletotrichum ayant la faculté de produire de la chitine- désacétylase, et
ils ont déterminé sa séquence d'acides aminés N-terminale.
De plus, en décomposant la chitine-désacétylase avec une
protéase, des fragments peptidiques ont été préparés pour déterminer leurs séquencesd'acides aminés.
Ensuite, les inventeurs ont prépare une amorce d'après la séquence nucléotidique déduite de ces séquences d'acides aminés. Des produits amplifiés ont été recueillis par la réaction d'amplification en chaîne par polymérase (PCR) en utilisant l'amorce et de l'ADN génomique extrait du microorganisme appartenant au genre Colletotrichum. Les produits de-FR recueillis ont été clones pour leur analyse avec un séquenceur d'ADN, afin de déterminer la séquence d'ADN. La séquence d'ADN a été traduite en acides aminés, qui correspondaient aux séquences d'acides aminés des fragments peptidiques initialement préparés, ce qui a incité à penser que ces fragments peptidiques correspondaient à des
parties du gène de chitine-désacétylase.
Surlbase de la séquence d'ADN déterminée, une amorce à ensuite été construite de nouveau, avec une prise en compte suffisante de la stringence des codons, pour cloner le gène de chitine-désacétylase, en utilisant comme matrice un ADNc préparé à partir d'ARN par utilisation de transcriptase
inverse.
Premièrement, une PCR a été effectuée sur la base de l'ADNc en utilisant une amorce contenant une séquence oligo-dT et l'amorce mentionnée ci-dessus pour analyser la séquence 3' en aval de la séquence connue du gène et déterminer la séquence nucléotidique de l'ADN jusqu'au codon de terminaison, si bien que la séquence d'acides aminés de
la région C-terminale a été déterminée.
Ensuite, une séquence d'adaptateur a été adaptée à l'amont de l'ADNc en utilisant un kit d'amplification rapide d'extrémités d'ADNc (5'- RACE) disponible dans le commerce, pour effectuer une PCR en utilisant une amorce codée par une partie de la séquence d'adaptateur et une amorce préparée à partir d'un segment de la séquence connue du gène, afin de déterminer la séquence nucléotidique d'ADN 5' en amont du segment de la séquence connue du gène jusqu'en amont du codon d'initiation. En ce qui concerne la région du gène de structure, la séquence d'acides aminés
correspondante a été déterminée.
De plus, on a préparé une amorce comprenant le codon d'initiation et une partie correspondant à plusieurs acides aminés au niveau d'une région déduite comme étant une séquence signal au voisinage du codon d'initiation, ainsi qu'une amorce incluant une partie correspondant à plusieurs acides aminés de la partie C-terminale, et, en effectuant unePCR en utilisant ces amorces, on a recueilli un fragment
amplifié contenant le gène de structure de chitine-désacéty-
lase complet. Le fragment a été ligaturé à un vecteur plasmidique qui a ensuite été utilisé pour transformer E. coli par une technique usuelle afin de récupérer la
bactérie transformée.
L'invention sera décrite en détail ci-dessous.
Comme décrit ci-dessus, la chitine-désacétylase de
la présente invention provient d'un microorganisme apparte-
nant au genre Colletotrichum, ayant la faculté de produire
la chitine-désacétylase.
Les champignons imparfaits appartenant au genre
Colletotrichum, ayant la faculté de produire la chitine-
désacétylase, comprennent par exemple Colletotrichum lindemuthianum ATCC 56676, etc. La chitine-désacétylase peut être retirée du bouillon de culture du microorganisme ci-dessus. Plus particulièrement, le microorganisme peut être cultivé dans un milieu nutritif par une méthode de routine afin de recueillir le bouillon de culture microbienne qui est ensuite purifié par des techniques de purification telles30 que la chromatographie sur colonne, la chromatographie rapide de protéines en phase liquide (FPLC) et la chrmtographie en phase liquide à haute performance (HPC), po=urerailir la chitine-désacétylase hautement purifiée. Ensuite, il faut déterminer la séquence d'acides aminés de la partie N-terminale de la chitine-désacétylase purifiée. Pour le séquençage, on peut faire usage d'un séquenceur de protéines du type HPG 1005A (fabriqué par Hewlett Packard Co.). La séquence de la partie N-terminale a été déterminée et elle est présentée en tant que Séquence
N 2 dans la Liste des Séquences.
En effectuant ensuite une dégradation enzymatique de la chitinedésacétylase, on prépare des fragments peptidiques pour déterminer leur séquences d'acides aminés (voir les
Séquences N 3 à 5 de la Liste des Séquences).
En terminant les séquences nucléotidiques des séquences d'acides aminés analysées et en utilisant une amorce préparée d'après les séquences déduites, on effectue une PCR avec une matrice d'ADN extraite du champignon imparfait appartenant au qenre Colletotrichum. Les bandes resultantes (produits de PCR sont clonées pour effectuer leur analyse par un séquenceur d'ADN du type ABI PRISM 371 ou 310 (fabriqué par Perkin Elmer Applied Biosystems Co.)
afin de déterminer la séquence nucléotidique d'ADN.
La séquence nucléotidique d'ADN résultante est représentée
en tant que Séquence N 6 dans la Liste des Séquences.
La traduction de la séquence nucléotidique d'ADN en acides aminés révèle la présence d'une séquence d'acides aminés correspondant à une partie des fragments peptidiques initialement recueillis (voir les Séquences N 3 à 5 de la Liste des Séquences). Il est alors confirmé que ces fragments peptidiques correspondent à des parties du gène
de chitine-désacétylase.
Une amorce est ensuite reconstruite d'après la
séquence d'ADN résultante, avec une prise en compte suffi-
sante de la stringence des codons, pour le clonage de la chitinedésacétylase en utilisant comme matrice un ADNc préparé à partir d'ARN en utilisant une transcriptase inverse.
Premièrement, on effectue unePCR basée sur l'ADNc ayant été préparé à partir d'ARN en utilisant une trans-
criptase inverse, en utilisant une autre amorce incluant une séquence oligo-dT et l'amorce susmentionnée, pour analyser la séquence 3' en aval de la séquence connue du gène, puis déterminer la séquence nucléotidique d'ADN jusqu'au codon de terminaison, si bien que la séquence d'acides aminés est déterminée. Ensuite, une séquence d'adaptateur est adaptée à l'amont de l'ADNc en utilisant un nécessaire de 5'-RACE disponible dans le commerce (Marathon cDNA Amplification Kit, fabriqué par Clone Tech Co.), et une PCR est effectuée en utilisant une amorce codée par une partie de la séquence d'adaptateur et une amorce préparée à partir d'un segment de la séquence connue du gène, pour déterminer la séquence nucléotidique d'ADN 5' en amont du segment de la séquence
connue du gène jusqu'en amont du codon d'initiation.
Les séquences d'acides aminés correspondantes ont été déterminées pour la région déduite comme étant une séquence signal partant du codon d'initiation et la région du gène
de structure de la protéine mature.
De plus, on prepare une amorce comprenant le codon d'initiation et une partie correspondant à plusieurs acides aminés au niveau d'une partie déduite comme étant une séquence signal au voisinage du codon d'initiation, ainsi qu'une amorce comprenant une partie correspondant à plusieurs acides aminés de la partie C-terminale, et, en utilisant ces amorces pour une PCR, on a recueilli un fragment amplifié contenant le gène de structure complet de la chitine-désacétylase. Le fragment contient la séquence
d'ADN correspondant à la séquence d'acides aminés repré-
sentée dans la Séquence N 1 de la Liste des Séquences, après la région déduite comme étant une séquence signal en partant du codon d'initiation et, ainsi, le fragment contient le gène d'enzyme complet de la chitine-désacétylase
selon le premier aspect de l'invention.
Le gène de chitine-désacétylase selon le premier aspect l'invention contient la séquence nucléotidique décrite en tant que Séquence N 1 dans la Liste des Séquences ou possède une fonction sensiblement identique à celle de cette séquence. L'expression "fonction sensiblement identique" signifie ici qu'un gène codant pour les mêmes résidus d'acides aminés est considéré comme sensiblement identique, compte tenu de la stringence des codons, même si sa séquence est tout à fait différente de celle du gène décrit en tant
que Séquence N 1.
Sous son deuxième aspect, la présente invention concerne une séquence nucléotidique hybridable à la séquence nucléotidique du gène selon le pruer objetdel'invtionetqui code pour une protéine ayant une activité de désacétylase sur le
groupe N-acétyle des résidus de sucres aminés N-acétylés.
Lorsque l'homologie globale est d'environ 85 % ou plus, un gène presque homologue à celui du premier aspect de l'invention peut être facilement clone, en référence à la séquence de ladite Séquence N 1, en utilisant des
techniques connues du génie génétique telles que l'hybri-
dation d'ADN et l'amplification de gènes.
Sous son troisième aspect, la présente invention conoerte un vecteur plasmidique contenant ledit gène; et sous son quatrième aspect, la présente inventionpropose un organisme transformé produit par transformation avec ledit vecteur plasmidique. Plus particulièrement, un fragment d'ADN contenant la séquence nucléotidique du gène selon le premier aspect peut être inséré par ligature dans un vecteur plasmidique tel qu'un vecteur plasmidique pCR2.1 (fabriqué par In Vitro Gen Co.), pour transformer E. coli en y
introduisant le vecteur selon une méthode de routine.
La souche E. col! transformée en utilisant le vecteur plasmidique pCR2.1 (fabriqué par In Vitro Gen Co.) a été déposée sous le numéro de référence FERM BP-6191 à l'Institut National de Science Biologique et de Technologie Humaine, Agence de la Science et de la Technologie Industrielles
(1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japon).
En outre, comme cela doit être évident pour une
personne normalement avisée en ce domaine, la chitine-
désacétylase peut être exprimée en grande quantité dans des cellules hâtes d'organismes procaryotes ou eucaryotes,
en utilisant la séquence d'ADN selon la présente invention.
En d'autres termes, l'enzyme peut être exprimee par la
méthode de routine suivante.
Par exemple, le gène de la présente invention est inséré dans un vecteur d'expression pour un organisme procaryote ou eucaryote, avec un signal de modification
approprié, et le vecteur est ensuite utilisé pour trans-
former une cellule. Il a été développé une grande diversité de tels signaux de modification et vecteurs d'expression qui sont disponibles dans le commerce, et l'on fait donc
usage de ceux qui sont bien connus de l'homme de l'art.
Une série de manipulations pour l'utilisation des vecteurs et la méthode de transformation sont déjà bien
connues et peuvent être exécutées par l'homme de l'art.
Par exemple, on peut employer la méthode décrite par J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis (éd.), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ème édition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989) pour exécuter les opérations
décrites ci-dessus.
Selon la présente invention, l'enzyme recueillie par l'expression du gène de chitine-désacétylase selon le premier aspect de l'invention active la désacétylation de la chitine, d'un oligosaccharide de chitine et des groupes N-acétyle d'autres résidus de sucres aminés N-acétylés, en permettant de préparer efficacement le chitosane, un oligosaccharide de chitosane ou d'autres sucres N-désacétylés qui sont utiles comme matières premières dans l'industrie de transformation alimentaire
et l'industrie pharmaceutique.
L'extraction de chitine-désacétylase à partir de bactéries phytopathogènes telles que des microorganismes appartenant au genre Colletotrichum a classiquement impliqué des problèmes de sécurité et d'organisation occasionnés par
la manipulation de ces bactéries pathogènes, et la culture du microorganisme nécessite une longue période de temps.
De plus, le rendement en enzyme n'était pas satisfaisant.
En faisant s'exprimer le gène de chitine-désacéty-
lase dans un organisme procaryote ou eucaryote par utilisa-
tion du plasmide contenant le gène de chitine-désacétylase selon le troisième aspect de la présente invention, on peut obtenir cette enzyme en grande quantité d'une manière sûre et rapide, sans avoir à s'inquiéter des problèmes susmentionnés. Par conséquent, selon la présente invention, l'utilisation de la chitine-désacétylase sera encore plus profitable et utile aux industries de production de matières premières. La présente invention va maintenant être décrite par
un exemple qui n'est cependant pas destiné à la limiter.
Exemple
Un champignon imparfait, Colletotrichum linde- muthianum ATCC 56676, sous-cultivé dans un milieu incliné, est inoculé dans un milieu de culture liquide pour effectuer une culture pendant 18 jours dans l'obscurité à 22 C. Le bouillon de culture microbienne est recueilli en séparant20 le microorganisme par filtration, et il est ensuite purifié en utilisant la précipitation par le sulfate d'ammonium, la chromatographie hydrophobe, la chromatographie par échange d'ions, la chromatographie par filtration sur gel, etc.,
pour recueillir une chitine-désacétylase hautement purifiée.
On détermine ensuite la séquence d'acides aminés de
la partie N-terminale de la chitine-désacétylase purifiée.
Pour ce séquençage, on utilise un séquenceur de protéines
du type HPG 1005A (fabriqué par Hewlett Packard Co.).
La séquence d'acides aminés déterminée de la partie N-terminale est représentée en tant que Séquence N 2 dans
la Liste des Séquences.
Lorsqu'une protéine enzymatique est purifiée par chromatographie en phase inversée en utilisant un solvant contenant de l'acide trifluoracétique, la partie N-terminale35 est pyroglutaminée. Par conséquent, la séquence ne peut jamais être lue. Cependant, par séquençage après traitement par la pyroglutamate-aminopeptidase (fabriquée par Boehringer Mannheim Co.), la séquence peptidique commençant au second résidu à partir de l'extrémité N-terminale peut être
analysée et déterminée séquentiellement.
Des fragments peptidiques sont préparés par dégra-
dation ménagée de la chitine-désacétylase avec l'endoprotéi-
nase Lys-C (Boehringer Mannheim Co.) et l'endoprotéinase Arg-C (Boehringer Mannheim Co.), puis leuxséquenced'acides aminés sont déterminéeS (voir les Séquences N 3 à 5 de la
Liste des Séquences).
A partir des séquences d'acides aminés déterminées on choisit des régions ayant une moindre stringence des codons et, en utilisant une amorce produite d'après ces régions, on effectue une PCR en utilisant comme matrice de l'ADN extrait i15 du champignon imparfait appartenant au genre Colletotrichum: Les bandes résultantes (produits de PCR) sont clonées pour leur analyse par un séquenceur d'ADN du type ABI PRISM 377 (fabriqué par Perkin Elmer Applied Biosystems Co.) pour déterminer la séquence nucléotidique d'ADN. La séquence nucléotidique de 444 pb résultante, telle que déterminée par séquençage, est représentée en tant que Séquence N 6 dans
la Liste des Séquences.
La séquence nucléotidique d'ADN est traduite en acides aminés et l'on observe une séquence d'acides aminés correspondant à une partie des fragments peptidiques recueillis initialement (voir les Séquences N 3 à 5 de la Liste des Séquences). Il est alors confirmé que ces fragments peptidiques correspondent à des parties du gène
de chitine-désacétylase.
Ensuite, sur la base de la séquence d'ADN résul-
tante, on reconstruit une amorce, avec une prise en compte suffisante de la stringence des codons, et le clonage de la chitine-désacétylase est effectué en utilisant comme matrice un ADNc ayant été préparé à partir d'ARN en utilisant une transcriptase inverse (RNA PCR kit (AMV) Ver. 2. 1, fabriqué
par Takara Brewery Co.).
Premièrement, sur la base de l'ADNc préparé par la réaction d'une amorce contenant une séquence oligo-dT avec de l'ARN comme matrice en utilisant une transcriptase inverse, on effectue une PCR en utilisant à la fois une amorce contenant une séquence oligo-dT et l'amorce sus- mentionnée, pour analyser la séquence 3' en aval de la
sequence connue du gène et déterminer la séquence nucléoti-
dique d'ADN jusqu'au codon de terminaison, si bien que
la séquence d'acides aminés est déterminée.
Ensuite, une séquence d'adaptateur est adaptée à l'amont de l'ADNc en utilisant un nécessaire de 5'-RACE (Marathon cDNA Amplification Kit, fabriqué par Clone Tech Co.) et une PCR est effectuée en utilisant à la fois une amorce codée par une partie de la séquence d'adaptateur et une amorce préparée à partir d'un segment de la séquence connue du gène, pour déterminer la séquence nucléotidique d'ADN 5' en amont du segment de la séquence connue du gène jusqu'en amont du codon d'initiation, en utilisant un séquenceur d'ADN ABI PRISM 310 (fabriqué par Perkin Elmer
Applied Biosystems Co.). La séquence d'acides aminés corres-
pondante est déterminée pour la région du gène de structure.
De plus, on prépare une amorce contenant le codon d'initiation et une partie correspondant à plusieurs acides aminés au niveau d'une partie déduite comme étant une séquence signal au voisinage du codon d'initiation, ainsi qu'une amorce incluant une partie correspondant à plusieurs acides aminés de la partie C-terminale, et, en utilisant ces amorces dans une PCR, on recueille un fragment amplifie
contenant le gène de structure complet de la chitine-
désacétylase.
Le fragment est inséré par ligature dans un vecteur plasmidique pCR2.1 (In Vitro Gen Co.), qui est ensuite
utilisé pour transformer E. col! par une méthode de routine.
Le produit résultant est inoculé sur un milieu de gélose LB contenant de l'ampicilline (50 kg/ml) et de la méticilline (80 ig/ml) et la culture est conduite pendant une nuit à 37 C afin de sélectionner la bactérie transformée (FERM BP-6191) et récupérer le plasmide introduit pour déterminer la séquence nucléotidique dudit gène d'enzyme (voir la
Séquence N 7 de la Liste des Séquences).
En conséquence, le fragment inséré contient la séquence nucléotidique représentée par la Séquence N 1 de la Liste des Séquences, suivie d'une séquence déduite comme étant un signal d'initiation partant du codon d'initiation, et il est clairement démontré que le fragment contient le gène d'enzyme complet de la désacétylase selon le premier
aspect de l'invention.
L'exposé de la demande de brevet japonais N 9-345737 déposée le 2 décembre 1997 est incorporé ici par référence
dans son intégralité.
LISTE DES SÉQUENCES
Séquence N 1 Longueur de Séquence: 663 Type de Séquence: acide nucléique Nombre de brins: deux Topologie: linéaire Type Moléculaire de la Séquence: ADNc, partie de gène de structure Origine Nom de l'Organisme: Colletotrichum lindemuthianum Nom de la Souche: ATCC 56676 Caractéristiques de la Séquence: Symbole Représentant les Caractéristiques: CDA Situation: 1...663 Méthode de Détermination des Caractéristiques: E Séquence:
CAG GTT CCC GTG GGC ACA CCC ATC CTC CAG TGC ACC CAG CCT GGT TTG 48
Gln Val Pro Val Gly Thr Pro Ile Leu Gln Cys Thr Gln Pro Gly Leu
1 5 10 15
GTT GCT CTG ACC TAC GAC GAC GGT CCT TTC ACC TTC ACC GCT CAG CTC 96
Val Ala Leu Thr Tyr Asp Asp Gly Pro Phe Thr Phe Thr Ala Gin Leu
25 30
CTC CAC ATC TTG AAG CAG AAC GAC GTC AAG GCG ACC TTC TTC GTC AAC 144
Leu Asp Ile Leu Lys Gin Asn Asp Val Lys Ala Thr Phe Phe Val Asn
40 45
GGC AAC AAC TGG GCC AAC ATC GAG GCC GGA TCC AAC CCC GAC ACG ATC 192
Gly Asn Asn Trp Ala Asn Ile Glu Ala Gly Ser Asn Pro Asp Thr ile
55 60
CGC CGC ATG CGC GCC GAC GGC CAC CTC GTC GGC TCT CAC ACG TAC GCT 240
Arg Arg Met Arg Ala Asp Gly His Leu Val Gly Ser His Thr Tyr Ala
70 75 80
CAC CCG GAC CTC AAC ACG CTC TCC TCC GCG GAC CGC ATC TCC CAG ATG 288
His Pro Asp Leu Asn Thr Leu Ser Ser Ala Asp Arg Ile Ser Gin Met
90 95
CGG CAG CTC GAG GAG GCC ACC CGC CGC ATC GAC GGC TTC GCG CCC AAG 336
Arg Gin Leu Glu Glu Ala Thr Arg Arg Ile Asp Gly Phe Ala Pro Lys
105 110
TAC ATG CGC GCG CCG TAC CTG TCG TGC GAC GCG GGC TGC CAG GGC GAC 384
Tyr Met Arg Ala Pro Tyr Leu Ser Cys Asp Ala Gly Cys Gin Gly Asp
120 125
CTC GGC GGC CTC GGA TAC CAC ATC ATC GAC ACC AAC CTC GAC ACC AAG 432
Leu Gly Gly Leu Gly Tyr His Ile le Asp Thr Asn Leu Asp Thr Lys
135 140
GAC TAC GAG AAC AAC AAG CCC GAG ACC ACC CAC CTC TCG GCC GAG AAG 480
Asp Tyr Glu Asn Asn Lys Pro Glu Thr Thr His Leu Ser Ala Glu Lys
150 155 160
TTC GAC AAC GAG CTG AGC GGC GAC GTC GGC GCC AAC AGC TAC ATT GTC 528
Phe Asp Asn Glu Leu Ser Gly Asp Val Gly Ala Asn Ser Tyr Ile Val
170 175
CTC TCG CAC GAC GTC CAC GAG CAG ACG GTC GTC TCC CTC ACG CAG AGG 576
Leu Ser His Asp Val His Glu Gin Thr Val Val Ser Leu Thr Gin Arg
185 190
CTG ATT GAC ACG CTC AAG AGC AAG GGC TAC CGC GCC GTC ACC GTC GGC 624
Leu Ile Asp Thr Leu Lys Ser Lys Gly Tyr Arg Ala Val Thr Val Gly
200 205
GAG TGC CTC GGC GAC GCC CCG GAG AAC TGG TAC AAG GCG 663
Glu Cys Leu Gly Asp Ala Pro Glu Asn Trp Tyr Lys Ala
210 215 220
Séquence N 2 Longueur de Séquence: 51 Type de Séquence: acide aminé Nombre de brins: un Topologie: linéaire Type Moléculaire de la Séquence: peptide Type de Fragment: fragment N-terminal Origine Nom de l'Organisme: Colletotrichum lindemuthianum Nom de la Souche: ATCC 56676 OrigineDirecte: chitine-désacétylase Séquence: Gin Val Pro Val Gly Thr Pro lie Leu Gin Cys Thr Gin Pro Gly Leu
1 5 10 15
Val Ala Leu Thr Tyr Asp Asp Gly Pro Phe Thr Phe Thr Ala Gin Leu
25 30
Leu Asp le Leu Lys Gln Asn Asp Val Lys Ala Thr Phe Phe Val Asn
40 45
Gly Asn Asn Séquence N 3 Longueur de Séquence: 50 Type de Séquence: acide aminé Nombre de brins: un Topologie: linéaire Type Moléculaire de la Séquence: peptide Type de Fragment: fragment de partie intermédiaire Origine Nom de l'Organisme: Colletotrichum lindemuthianum Nom de la Souche: ATCC 56676
Origine Directe: Produits de dégradation de chitine-
désacétylase Séquence: Ala Thr Phe Phe Val Asn Gly Asn Asn Trp Ala Asn le Glu Ala Gly
1 5 10 15
Ser Asn Pro Asp Thr le Arg Arg Met Arg Ala Asp Gly His Leu Val
25 30
Gly Ser His Thr Tyr Ala His Pro Asp Leu Asn Thr Leu Ser Ser Ala
40 45
Asp Arg Séquence N 4 Longueur de Séquence: 84 Type de Séquence: acide aminé Nombre de brins: un Topologie: linéaire Type Moléculaire de la Séquence: peptide Type de Fragment: fragment de partie intermédiaire Origine Nom de l'Organisme: Colletotrichum lindemuthianum Nom de la Souche: ATCC 56676
Origine Directe: Produits de dégradation de chitine-
désacétylase Séquence: Tyr Met Arg Ala Pro Tyr Leu Ser Xaa Asp Ala Gly Xaa Gin Gly Asp
1 5 10 15
Leu Gly Gly Leu Gly Tyr His lie lie Asp Thr Asn Leu Asp Xaa Lys
25 30
Asp Tyr Glu Asn Asn Lys Xaa Glu Thr Thr His Leu Ser Ala Glu Lys
40 45
Phe Asp Asn Glu Leu Ser Gly Asp Val Gly Ala Asn Ser Tyr Ile Val
55 60
Leu Ser His Asp Val His Glu Gln Thr Val Val Ser Leu Thr Gin Arg
70 75 80
Leu Ile Asp Thr Séquence N 5 Longueur de Séquence: 27 Type de Séquence: acide aminé Nombre de brins: un Topologie: linéaire Type Moléculaire de la Séquence: peptide Type de Fragment: fragment de partie intermédiaire Origine Nom de l'Organisme: Colletotrichum lindemuthianum Nom de la Souche: ATCC 56676
Origine Directe: Produits de dégradation de chitine-
désacétylase Séquence: Leu lie Asp Thr Xaa Lys Ser Lys Gly Tyr Arg Ala Val Thr Val Gly
1 5 10 15
Glu Xaa Leu Gly Asp Ala Pro Glu Asn Trp Tyr
25 27
Séquence N 6 Longueur de Séquence: 444 Type de Séquence: acide nucléique Nombre de brins: un Topologie: linéaire Type Moléculaire de la Séquence: autre acide nucléique Origine Nom de l'Organisme: Colletotrichum lindemuthianum Nom de la Souche: ATCC 56676 Origine Directe: Produits de réaction d'ACP Séquence:
AACATCGAGG CCGGGTCCAA CCCCGACACG ATCCGCCGCA TGCGCGCCGA CGGCCACCTC 60
GTCGGCTCTC ACACGTACGC TCACCCGGAC CTCAACACGC TCTCCTCCGC GGACCGCATC 120
TCCCAGATGC GGCAGCTCGA GGAGGCCACC CGCCGCATCG ACGGCTTCGC GCCCAAGTAC 180
ATGCGCGCGC CGTACCTGTC GTGCGACGCG GGCTGCCAGG GCGACCTCGG CGGCCTCGGA 240
TACCACATCA TCGACACCAA CCTCGACACC AAGGACTACG AGAACAACAA GCCCGAGACC 300
ACCCACCTCT CGGCCGAGAA GTTCGACAAC GAGCTGAGCG GCGACGTCGG CGCCAACAGC 360
TACATTGTCC TCTCGCACGA CGTCCACGAG CAGACGGTCG TCTCCCTCAC GCAGAGGCTG 420
ATTGACACGC TCAAGAGCAA GGGC 444
Séquence N 7 Longueur de Séquence: 756 Type de Séquence: acide nucléique Nombre de brins: un Topologie: lineaire Type Moléculaire de la Séquence: autre acide nucléique Origine Nom de l'Organisme: Colletotrichum lindemuthianum Nom de la Souche: ATCC 56676 Origine Directe: Produits de réaction d'ACP Séquence:
GTCGACATGC ACTTCTCGAC CCTTCTTGGC GCCGCGGCTA CTGCTGCTCT CGCTGGCAGC 60
* ACGAACGCAA GCCCTCTCGC CCGTCGCCAG GTTCCCGTGG GCACACCCAT CCTCCAGTGC 120
ACCCAGCCTG GTCTGGTTGC TCTGACCTAC GACGACGGTC CTTTCACCTT CACCGCTCAG 180
CTCCTCGACA TCTTGAAGCA GAACGACGTC AAGGCGACCT TCTTCGTCAA CGGCAACAAC 240
TGGGCCAACA TCGAGGCCGG ATCCAACCCC GACACGATCC GCCGCATGCG CGCCGACGGC 300
CACCTCGTCG GCTCTCACAC GTACGCTCAC CCGGACCTCA ACACGCTCTC CTCCGCGGAC 360
CGCATCTCCC AGATGCGGCA GCTCGAGGAG GCCACCCGCC GCATCGACGG CTTCGCGCCC 420
AAGTACATGC GCGCGCCGTA CCTGTCGTGC GACGCGGGCT GCCAGGGCGA CCTCGGCGGC 480
CTCGGATACC ACATCATCGA CACCAACCTC GACACCAAGG ACTACGAGAA CAACAAGCCC 540
GAGACCACCC ACCTCTCGGC CGAGAAGTTC GACAACGAGC TGAGCGGCGA CGTCGGCGCC 600
AACAGCTACA TTGTCCTCTC GCACGACGTC CACGAGCAGA CGGTCGTCTC CCTCACGCAG 660
AGGCTGATTG ACACGCTCAA GAGCAAGGGC TACCGCGCCG TCACCGTCGG CGAGTGCCTC 720
GGCGACGCCC CGGAGAACTG GTACAAGGCG AGATCT 756
Claims (5)
1. Gène de chitine-désacétylase, caractérisé en ce qu'il code pour une protéine ayant une séquence d'acides
aminés telle que décrite en Séquence N 1.
2. Séquence nucléotidique d'ADN, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique hybridable à la séquence nucléotidique telle que décrite en Squence N et codant pour une protéine ayant une activité de désacétylase sur le groupe N-acétyle des résidus de sucres aminés N-acétylés.
3. Vecteur plasmidique, caractérisé en ce qu'il
contient le gène de chitine-désacétylase selon la revendi-
cation 1.
4. Organisme transformé, caractérisé en ce qu'il a
été transformé par le vecteur plasmidique selon la revendi-.
cation 3.
5. Organisme transformé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ledit organisme transformé est E. coli
(FERM BP-6191).
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9345737A JP3030431B2 (ja) | 1997-12-02 | 1997-12-02 | キチン脱アセチル化酵素遺伝子、該遺伝子を含むベクター及び形質転換体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2771753A1 true FR2771753A1 (fr) | 1999-06-04 |
| FR2771753B1 FR2771753B1 (fr) | 2003-10-24 |
Family
ID=18378634
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR9802435A Expired - Fee Related FR2771753B1 (fr) | 1997-12-02 | 1998-02-27 | Gene de chitine-desacetylase, sequence d'adn hybridable, vecteur plasmidique qui le contient et organisme transforme par ce vecteur plasmidique |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6057144A (fr) |
| JP (1) | JP3030431B2 (fr) |
| DE (1) | DE19810349B4 (fr) |
| FR (1) | FR2771753B1 (fr) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10111083B4 (de) * | 2001-03-08 | 2006-06-22 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Chitindeacetylase und Verfahren zu seiner Herstellung |
| US6998397B2 (en) * | 2004-07-23 | 2006-02-14 | Drebsk Comptech, Inc. | Method for decreasing cholesterol level in blood |
| WO2006054319A2 (fr) * | 2004-11-19 | 2006-05-26 | Genis Ehf. | Utilisation de formulations a base de chito-oligomeres pour modifier l'activite anormale des proteines de type chitinase |
| NZ593692A (en) | 2007-03-29 | 2012-08-31 | Yissum Res Dev Co | Transgenic plants containing soluble cell wall polysaccharides |
| DE102007024085A1 (de) * | 2007-05-22 | 2008-11-27 | Westfälische Wilhelms-Universität Münster | Nukleinsäuremoleküle codierend für ein Protein mit Deacetylase-Aktivität, besagtes Protein, sowie Verfahren zur Herstellung von Chitosan |
| WO2010056896A1 (fr) * | 2008-11-12 | 2010-05-20 | Synedgen, Inc. | Dérivés de chitosan pour traiter des animaux ou optimiser la santé animale |
| CN111979218B (zh) * | 2020-07-28 | 2023-01-20 | 江苏海洋大学 | 一种Arthrobacter sp. AW19M34-1几丁质脱乙酰酶突变体 |
| CN111876403A (zh) * | 2020-08-07 | 2020-11-03 | 中科荣信（苏州）生物科技有限公司 | 一种禾柄锈菌几丁质脱乙酰酶及其制备方法和应用 |
| CN112501150B (zh) * | 2020-12-09 | 2023-04-11 | 吉林中粮生化有限公司 | 几丁质脱乙酰酶及其编码基因、重组载体、重组菌株、发酵剂和酶制剂以及它们的应用 |
| CN112921019B (zh) * | 2021-04-19 | 2022-06-03 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 几丁质脱乙酰基酶蛋白晶体 |
| CN114317568B (zh) * | 2021-12-31 | 2023-12-26 | 山西大学 | 蟋蟀CDA1和CDA2基因的dsRNA合成方法及其应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994013815A1 (fr) * | 1992-12-07 | 1994-06-23 | Institute For Molecular Biology And Biotechnology/Forth | Adn codant la chitine deacetylase |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5219749A (en) * | 1991-10-09 | 1993-06-15 | Institute For Molecular Biology & Biotechnology/Forth | Process for isolating and preparing purified chitin deacetylase |
-
1997
- 1997-12-02 JP JP9345737A patent/JP3030431B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-01-26 US US09/013,067 patent/US6057144A/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-02-27 FR FR9802435A patent/FR2771753B1/fr not_active Expired - Fee Related
- 1998-03-10 DE DE19810349A patent/DE19810349B4/de not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994013815A1 (fr) * | 1992-12-07 | 1994-06-23 | Institute For Molecular Biology And Biotechnology/Forth | Adn codant la chitine deacetylase |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| TSIGOS IASON ET AL: "Purification and characterization of chitin deacetylase from Colletotrichum lindemuthianum.", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 270, no. 44, 1995, pages 26286 - 26291, XP002220138, ISSN: 0021-9258 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE19810349A1 (de) | 1999-06-10 |
| FR2771753B1 (fr) | 2003-10-24 |
| DE19810349B4 (de) | 2006-05-18 |
| JPH11155565A (ja) | 1999-06-15 |
| US6057144A (en) | 2000-05-02 |
| JP3030431B2 (ja) | 2000-04-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1124835B1 (fr) | Application de fuco-oligosaccharides sulfates a la protection des plantes | |
| JP2651288B2 (ja) | セファロスポリン・アセチルハイドロラーゼ遺伝子および該遺伝子にコードされるタンパク質 | |
| CN106884025B (zh) | 一种酶法水解定向制备褐藻胶寡糖的方法 | |
| CA2342124A1 (fr) | Molecules d'acide nucleique codant une amylosucrase | |
| DE69637011T2 (de) | Herstellung enzymatisch aktiver, rekombinanter carboxypeptidase b | |
| FR2771753A1 (fr) | Gene de chitine-desacetylase, sequence d'adn hybridable, vecteur plasmidique qui le contient et organisme transforme par ce vecteur plasmidique | |
| JP2000228987A (ja) | コエンザイムｑ１０の製造法 | |
| EP2456866B1 (fr) | Porphyranases et leur utilisation pour hydrolyser des polysaccharides | |
| FR2793259A1 (fr) | Epoxyde hyrolases d'origine fongique et derivees, leurs procedes d'obtention, et leurs utilisations, notamment pour la preparation de molecules enantiomeriquement pures | |
| WO1998049275A2 (fr) | INTEINE D'ARCHAEBACTERIE DE L'ESPECE $i(THERMOCOCCUS FUMICOLANS) | |
| EP2582810B1 (fr) | Ulvane lyase, procede de fabrication et utilisations | |
| WO1999054475A2 (fr) | Identification de genes de bacteries lactiques dans la biosynthese des exopolysaccharides | |
| EP0644264A1 (fr) | Enzyme recombiné destiné à la fragmentation du N-acétylhéparosane, gène codant pour l'enzyme et son utilisation | |
| FR2771752A1 (fr) | Gene d'enzyme de lyse de paroi cellulaire, plasmide le contenant et bacterie transformee par ce plasmide | |
| JP3107977B2 (ja) | 新規セルラーゼおよびその遺伝子 | |
| JPH0824573B2 (ja) | キチナーゼ、キチナーゼ遺伝子及びキチナーゼの製法 | |
| FR2786500A1 (fr) | Gene codant pour une alpha-agarase et son utilisation pour la production d'enzymes de biodegradation des agars | |
| FR2779736A1 (fr) | Genes codant pour des beta-agarases et leur utilisation pour la production d'enzymes de biodegradation des agars | |
| JP2984143B2 (ja) | 新規なウリカーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及びウリカーゼの製造法 | |
| WO2006008379A1 (fr) | Endofucanase recombinante | |
| EP0957170A1 (fr) | Identification de gènes de Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus Lfi5 impliqués dans la biosynthèse d'exopolysaccharides | |
| JP3062595B2 (ja) | マルトペンタオース高生産性α−アミラーゼ遺伝子、該遺伝子を含むベクターおよび形質転換体 | |
| EP0957168A1 (fr) | Identification de gènes de Streptococcus thermophilus Sfi39 impliqués dans la biosynthèse d'exopolysaccharides | |
| WO2006018512A1 (fr) | GENE ISOLE CODANT POUR LA λ-CARRAGHENASE ET LA λ-CARRAGHENASE RECOMBINANTE OBTENUE A L'AIDE DE CE GENE | |
| WO2013079828A1 (fr) | 3s-rhamnose-glucuronyl hydrolase, procédé de fabrication et utilisations |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| ST | Notification of lapse |
Effective date: 20081031 |