JPH11155565A - キチン脱アセチル化酵素遺伝子、該遺伝子を含むベクター及び形質転換体 - Google Patents
キチン脱アセチル化酵素遺伝子、該遺伝子を含むベクター及び形質転換体Info
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- JPH11155565A JPH11155565A JP9345737A JP34573797A JPH11155565A JP H11155565 A JPH11155565 A JP H11155565A JP 9345737 A JP9345737 A JP 9345737A JP 34573797 A JP34573797 A JP 34573797A JP H11155565 A JPH11155565 A JP H11155565A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 不完全菌由来のキチン脱アセチル化酵素の一
層の利用を図るため、該酵素の遺伝子をクローニングす
ることによって、遺伝子の構造を解明し、遺伝子を発現
させて該酵素の工業的生産に寄与すること。 【解決手段】 タンパク質をコードするキチン脱アセチ
ル化酵素遺伝子、該遺伝子を含むプラスミドベクターお
よび該プラスミドベクターで形質転換された形質転換
体。
層の利用を図るため、該酵素の遺伝子をクローニングす
ることによって、遺伝子の構造を解明し、遺伝子を発現
させて該酵素の工業的生産に寄与すること。 【解決手段】 タンパク質をコードするキチン脱アセチ
ル化酵素遺伝子、該遺伝子を含むプラスミドベクターお
よび該プラスミドベクターで形質転換された形質転換
体。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、キチン脱アセチル
化酵素遺伝子、該遺伝子を含むプラスミドベクター及び
形質転換体に関する。キチン脱アセチル化酵素（ＥＣ
３．５．１．４１）は、キチンのＮ−アセチルグルコサ
ミン残基上のＮ−アセチル基を加水分解する酵素であ
り、Ｎ−アセチルグルコサミン残基をグルコサミン残基
と酢酸に分解する。キチンの脱アセチル化反応によっ
て、食品工業、医薬品工業等の分野において有用な素材
であるキトサンが調製される。このことから、本酵素は
廃棄物資源であるキチンの有効利用を図る上で有用なも
のである。さらに、本酵素はキチンオリゴ糖からキトサ
ンオリゴ糖を調製する場合やその他のアミノ糖残基上の
Ｎ−アセチル基を酵素的に脱アセチル化する場合などに
用いることができる。
化酵素遺伝子、該遺伝子を含むプラスミドベクター及び
形質転換体に関する。キチン脱アセチル化酵素（ＥＣ
３．５．１．４１）は、キチンのＮ−アセチルグルコサ
ミン残基上のＮ−アセチル基を加水分解する酵素であ
り、Ｎ−アセチルグルコサミン残基をグルコサミン残基
と酢酸に分解する。キチンの脱アセチル化反応によっ
て、食品工業、医薬品工業等の分野において有用な素材
であるキトサンが調製される。このことから、本酵素は
廃棄物資源であるキチンの有効利用を図る上で有用なも
のである。さらに、本酵素はキチンオリゴ糖からキトサ
ンオリゴ糖を調製する場合やその他のアミノ糖残基上の
Ｎ−アセチル基を酵素的に脱アセチル化する場合などに
用いることができる。
【０００２】
【従来の技術】上記したように、キチン脱アセチル化酵
素は、キチン、キチンオリゴ糖、その他のＮ−アセチル
化アミノ糖残基を含む化合物のＮ−アセチル基を加水分
解する酵素である。キチンの脱アセチル化物であるキト
サンは、前記したように、多方面において有用性が評価
されている。食品分野に限っても、増粘作用、コレステ
ロール低下作用、血圧降下作用、痛風・高尿酸血症の予
防効果、骨粗鬆症予防効果、ビフィズス菌の生育促進、
大腸菌やウェルシュ菌の生育阻害、抗腫瘍活性等を挙げ
ることができる。
素は、キチン、キチンオリゴ糖、その他のＮ−アセチル
化アミノ糖残基を含む化合物のＮ−アセチル基を加水分
解する酵素である。キチンの脱アセチル化物であるキト
サンは、前記したように、多方面において有用性が評価
されている。食品分野に限っても、増粘作用、コレステ
ロール低下作用、血圧降下作用、痛風・高尿酸血症の予
防効果、骨粗鬆症予防効果、ビフィズス菌の生育促進、
大腸菌やウェルシュ菌の生育阻害、抗腫瘍活性等を挙げ
ることができる。
【０００３】従来、糖残基上のＮ−アセチル基の加水分
解は、主にアルカリを用いた化学的加水分解法によって
行われていた。しかし、この方法を行うと、副反応が起
こること、反応の制御が困難なこと及びアルカリ廃液が
生成すること等が問題点として指摘されていた。
解は、主にアルカリを用いた化学的加水分解法によって
行われていた。しかし、この方法を行うと、副反応が起
こること、反応の制御が困難なこと及びアルカリ廃液が
生成すること等が問題点として指摘されていた。
【０００４】この課題を克服する手段として、キチン脱
アセチル化酵素を用い、温和な条件下で酵素的に脱アセ
チル化を行う方法について精力的な研究が行われてい
る。その中でも、不完全菌由来のキチン脱アセチル化酵
素（特開平８−２８９７８５号公報）が注目を浴びてい
る。この不完全菌由来のキチン脱アセチル化酵素は、酵
素反応が反応生成物である酢酸によって阻害されにくい
上に、低級キチンオリゴ糖等に対しても脱アセチル化を
行うことが可能である等の利点があり、工業的な利用に
非常に適している。さらに、該酵素は、キチン質以外に
もＮ−アセチル化アミノ糖残基中のＮ−アセチル基を脱
離する活性を広く持つことから、新規糖鎖を合成する場
合に利用することができる。
アセチル化酵素を用い、温和な条件下で酵素的に脱アセ
チル化を行う方法について精力的な研究が行われてい
る。その中でも、不完全菌由来のキチン脱アセチル化酵
素（特開平８−２８９７８５号公報）が注目を浴びてい
る。この不完全菌由来のキチン脱アセチル化酵素は、酵
素反応が反応生成物である酢酸によって阻害されにくい
上に、低級キチンオリゴ糖等に対しても脱アセチル化を
行うことが可能である等の利点があり、工業的な利用に
非常に適している。さらに、該酵素は、キチン質以外に
もＮ−アセチル化アミノ糖残基中のＮ−アセチル基を脱
離する活性を広く持つことから、新規糖鎖を合成する場
合に利用することができる。
【０００５】キチン脱アセチル化酵素を得るための微生
物として最も研究されている不完全菌は、コレトトリカ
ム・リンデムチアナム（Colletotrichum lindemuthian
um）である。しかしながら、このコレトトリカム・リン
デムチアナムは、植物病原菌であるため、その取扱いが
難しく、安全性の点で問題があった。さらに、菌体培養
液中に該酵素が分泌されるまでに長時間を要する上に、
回収される酵素量が少ないことから、生産性の面でも問
題があった。
物として最も研究されている不完全菌は、コレトトリカ
ム・リンデムチアナム（Colletotrichum lindemuthian
um）である。しかしながら、このコレトトリカム・リン
デムチアナムは、植物病原菌であるため、その取扱いが
難しく、安全性の点で問題があった。さらに、菌体培養
液中に該酵素が分泌されるまでに長時間を要する上に、
回収される酵素量が少ないことから、生産性の面でも問
題があった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上記
課題を解決し、不完全菌由来のキチン脱アセチル化酵素
の一層の利用を図るため、該酵素の遺伝子をクローニン
グすることによって、遺伝子の構造を解明し、遺伝子を
発現させて該酵素の工業的生産に寄与することである。
課題を解決し、不完全菌由来のキチン脱アセチル化酵素
の一層の利用を図るため、該酵素の遺伝子をクローニン
グすることによって、遺伝子の構造を解明し、遺伝子を
発現させて該酵素の工業的生産に寄与することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、キチン脱
アセチル化酵素の構造遺伝子を解明するために研究を重
ねた結果、該酵素の生産能を有するコレトトリカム属微
生物からキチン脱アセチル化酵素遺伝子のクローニング
に成功し、これに基づいて本発明を完成した。
アセチル化酵素の構造遺伝子を解明するために研究を重
ねた結果、該酵素の生産能を有するコレトトリカム属微
生物からキチン脱アセチル化酵素遺伝子のクローニング
に成功し、これに基づいて本発明を完成した。
【０００８】請求項１記載の本発明は、配列表の配列番
号１記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードす
るキチン脱アセチル化酵素遺伝子である。請求項２記載
の本発明は、請求項１記載の遺伝子の塩基配列にハイブ
リッドする塩基配列であり、かつＮ−アセチル化アミノ
糖残基中のＮ−アセチル基の脱アセチル化酵素活性を有
するタンパク質をコードするＤＮＡ塩基配列である。請
求項３記載の本発明は、請求項１記載のキチン脱アセチ
ル化酵素遺伝子を含むプラスミドベクターである。請求
項４記載の本発明は、請求項３記載のプラスミドベクタ
ーで形質転換された形質転換体である。
号１記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードす
るキチン脱アセチル化酵素遺伝子である。請求項２記載
の本発明は、請求項１記載の遺伝子の塩基配列にハイブ
リッドする塩基配列であり、かつＮ−アセチル化アミノ
糖残基中のＮ−アセチル基の脱アセチル化酵素活性を有
するタンパク質をコードするＤＮＡ塩基配列である。請
求項３記載の本発明は、請求項１記載のキチン脱アセチ
ル化酵素遺伝子を含むプラスミドベクターである。請求
項４記載の本発明は、請求項３記載のプラスミドベクタ
ーで形質転換された形質転換体である。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明者らは、キチン脱アセチル
化酵素生産能を有するコレトトリカム属不完全菌の培養
液から回収したキチン脱アセチル化酵素を高度に精製
し、そのＮ末端のアミノ酸配列を決定した。さらに、こ
のキチン脱アセチル化酵素をタンパク質加水分解酵素に
よって分解することによってペプチドフラグメントを調
製し、それらのアミノ酸配列を決定した。
化酵素生産能を有するコレトトリカム属不完全菌の培養
液から回収したキチン脱アセチル化酵素を高度に精製
し、そのＮ末端のアミノ酸配列を決定した。さらに、こ
のキチン脱アセチル化酵素をタンパク質加水分解酵素に
よって分解することによってペプチドフラグメントを調
製し、それらのアミノ酸配列を決定した。
【００１０】次いで、それらのアミノ酸配列から推定し
た塩基配列を基にしてプライマーを作成した。これを用
いて、コレトトリカム属菌株から抽出したゲノムＤＮＡ
として行ったポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）によ
り、増幅産物を得た。得られたＰＣＲ産物をクローニン
グし、ＤＮＡシーケンサーで分析してＤＮＡ配列を解読
した。このＤＮＡ産物をアミノ酸に翻訳したところ、先
に得られたペプチドフラグメントに相当するアミノ酸配
列が認められたことから、これらのペプチドフラグメン
トが、キチン脱アセチル化酵素遺伝子の一部であること
が判明した。
た塩基配列を基にしてプライマーを作成した。これを用
いて、コレトトリカム属菌株から抽出したゲノムＤＮＡ
として行ったポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）によ
り、増幅産物を得た。得られたＰＣＲ産物をクローニン
グし、ＤＮＡシーケンサーで分析してＤＮＡ配列を解読
した。このＤＮＡ産物をアミノ酸に翻訳したところ、先
に得られたペプチドフラグメントに相当するアミノ酸配
列が認められたことから、これらのペプチドフラグメン
トが、キチン脱アセチル化酵素遺伝子の一部であること
が判明した。
【００１１】そこで、得られたＤＮＡ配列をもとに、コ
ドンの縮重を十分に考慮したプライマーを再構築し、Ｒ
ＮＡから逆転写酵素を用いて作製したｃＤＮＡを鋳型と
したキチン脱アセチル化酵素のクローニングを行った。
まず、ｃＤＮＡから、オリゴｄＴ配列を含むプライマー
及び前記したプライマーを用いてＰＣＲを行い、既知の
遺伝子配列から外へ３’側の配列を解読し、終止コドン
に至るＤＮＡ塩基配列の決定を経てＣ末端部分のアミノ
酸配列を決定した。続いて、市販の５’−ＲＡＣＥキッ
トを用いてｃＤＮＡの上流部分にアダプター配列をとり
つけ、アダプター部分の配列の一部分をコードしたプラ
イマーと既知遺伝子配列部分から作製したプライマーを
用いてＰＣＲを行い、既知遺伝子配列部分から５’側
へ、開始コドンの上流に至るまでのＤＮＡ塩基配列を決
定し、構造遺伝子部分については、対応するアミノ酸配
列を決定した。
ドンの縮重を十分に考慮したプライマーを再構築し、Ｒ
ＮＡから逆転写酵素を用いて作製したｃＤＮＡを鋳型と
したキチン脱アセチル化酵素のクローニングを行った。
まず、ｃＤＮＡから、オリゴｄＴ配列を含むプライマー
及び前記したプライマーを用いてＰＣＲを行い、既知の
遺伝子配列から外へ３’側の配列を解読し、終止コドン
に至るＤＮＡ塩基配列の決定を経てＣ末端部分のアミノ
酸配列を決定した。続いて、市販の５’−ＲＡＣＥキッ
トを用いてｃＤＮＡの上流部分にアダプター配列をとり
つけ、アダプター部分の配列の一部分をコードしたプラ
イマーと既知遺伝子配列部分から作製したプライマーを
用いてＰＣＲを行い、既知遺伝子配列部分から５’側
へ、開始コドンの上流に至るまでのＤＮＡ塩基配列を決
定し、構造遺伝子部分については、対応するアミノ酸配
列を決定した。
【００１２】さらに、開始コドンとその付近の、シグナ
ル配列と推定される部分の数個のアミノ酸に対応する部
分を含むプライマー及びＣ末端の数個のアミノ酸に対応
する部分を含むプライマーを作製し、これを用いてＰＣ
Ｒを行うことによって、キチン脱アセチル化酵素の全構
造遺伝子を含む増幅断片を獲得した。これをプラスミド
ベクターにライゲーションし、常法により大腸菌に形質
転換し、形質転換体を得た。
ル配列と推定される部分の数個のアミノ酸に対応する部
分を含むプライマー及びＣ末端の数個のアミノ酸に対応
する部分を含むプライマーを作製し、これを用いてＰＣ
Ｒを行うことによって、キチン脱アセチル化酵素の全構
造遺伝子を含む増幅断片を獲得した。これをプラスミド
ベクターにライゲーションし、常法により大腸菌に形質
転換し、形質転換体を得た。
【００１３】以下に、本発明を詳しく説明する。前記し
たように、本発明のキチン脱アセチル化酵素遺伝子は、
キチン脱アセチル化酵素生産能を有するコレトトリカム
属微生物に由来するものである。このようなキチン脱ア
セチル化酵素生産能を有するコレトトリカム属不完全菌
としては、コレトトリカム・リンデムチアナムＡＴＣＣ
５６６７６等がある。
たように、本発明のキチン脱アセチル化酵素遺伝子は、
キチン脱アセチル化酵素生産能を有するコレトトリカム
属微生物に由来するものである。このようなキチン脱ア
セチル化酵素生産能を有するコレトトリカム属不完全菌
としては、コレトトリカム・リンデムチアナムＡＴＣＣ
５６６７６等がある。
【００１４】キチン脱アセチル化酵素は、上記微生物菌
体培養液から得ることができる。具体的には、上記の菌
体を常法に従い栄養培地で培養後、菌体培養液を回収
し、該培養液をカラムクロマトグラフィ−、ＦＰＬＣ、
ＨＰＬＣ等の精製手段を用いて処理し、高度に精製した
キチン脱アセチル化酵素を得ることができる。
体培養液から得ることができる。具体的には、上記の菌
体を常法に従い栄養培地で培養後、菌体培養液を回収
し、該培養液をカラムクロマトグラフィ−、ＦＰＬＣ、
ＨＰＬＣ等の精製手段を用いて処理し、高度に精製した
キチン脱アセチル化酵素を得ることができる。
【００１５】次に、この精製したキチン脱アセチル化酵
素のＮ末端のアミノ酸配列を決定する。配列の決定に
は、プロテインシ−ケンサ−ＨＰＧ１００５Ａ（ＨＥＷ
ＬＥＴＴＰＡＣＫＡＲＤ社製）を用いることができる。
決定したＮ末端のアミノ酸配列は配列表の配列番号２に
示す通りである。さらに、このキチン脱アセチル化酵素
を酵素分解して、ペプチドフラグメントを調製し、それ
らのアミノ酸配列を決定した（配列表の配列番号３〜５
参照）。
素のＮ末端のアミノ酸配列を決定する。配列の決定に
は、プロテインシ−ケンサ−ＨＰＧ１００５Ａ（ＨＥＷ
ＬＥＴＴＰＡＣＫＡＲＤ社製）を用いることができる。
決定したＮ末端のアミノ酸配列は配列表の配列番号２に
示す通りである。さらに、このキチン脱アセチル化酵素
を酵素分解して、ペプチドフラグメントを調製し、それ
らのアミノ酸配列を決定した（配列表の配列番号３〜５
参照）。
【００１６】解読できたアミノ酸配列から塩基配列を解
読し、これをもとに作製したプライマーを用いて、コレ
トトリカム属不完全菌から抽出したＤＮＡを鋳型として
ＰＣＲを行った。得られたバンド（ＰＣＲ産物）をクロ
ーニングし、ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ ＰＲＩＳＭ
３７７あるいは３１０（株式会社パーキンエルマーアプ
ライドバイオシステムズ）で分析してＤＮＡ塩基配列を
解読した。得られたＤＮＡ塩基配列を配列表の配列番号
６に示す。
読し、これをもとに作製したプライマーを用いて、コレ
トトリカム属不完全菌から抽出したＤＮＡを鋳型として
ＰＣＲを行った。得られたバンド（ＰＣＲ産物）をクロ
ーニングし、ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ ＰＲＩＳＭ
３７７あるいは３１０（株式会社パーキンエルマーアプ
ライドバイオシステムズ）で分析してＤＮＡ塩基配列を
解読した。得られたＤＮＡ塩基配列を配列表の配列番号
６に示す。
【００１７】このＤＮＡ塩基配列をアミノ酸に翻訳した
ところ、先に得られたペプチドフラグメント（配列表の
配列番号３〜５参照）の一部分に相当するアミノ酸配列
が認められたことから、これらのペプチドフラグメント
がキチン脱アセチル化酵素遺伝子の一部であることを確
認することができた。
ところ、先に得られたペプチドフラグメント（配列表の
配列番号３〜５参照）の一部分に相当するアミノ酸配列
が認められたことから、これらのペプチドフラグメント
がキチン脱アセチル化酵素遺伝子の一部であることを確
認することができた。
【００１８】そこで、得られたＤＮＡ配列をもとに、コ
ドンの縮重を十分に考慮したプライマーを再構築し、Ｒ
ＮＡから逆転写酵素を用いて作製したｃＤＮＡを鋳型と
したキチン脱アセチル化酵素のクローニングを行った。
まず、逆転写酵素によってＲＮＡからオリゴｄＴ配列を
含むプライマーを用いて作製したｃＤＮＡから、オリゴ
ｄＴ配列を含むプライマー及び前記したプライマーを用
いてＰＣＲを行い、既知遺伝子配列から外へ３’側の配
列を解読し、終止コドンに至るＤＮＡ塩基配列の決定を
経てアミノ酸配列を決定した。
ドンの縮重を十分に考慮したプライマーを再構築し、Ｒ
ＮＡから逆転写酵素を用いて作製したｃＤＮＡを鋳型と
したキチン脱アセチル化酵素のクローニングを行った。
まず、逆転写酵素によってＲＮＡからオリゴｄＴ配列を
含むプライマーを用いて作製したｃＤＮＡから、オリゴ
ｄＴ配列を含むプライマー及び前記したプライマーを用
いてＰＣＲを行い、既知遺伝子配列から外へ３’側の配
列を解読し、終止コドンに至るＤＮＡ塩基配列の決定を
経てアミノ酸配列を決定した。
【００１９】続いて、５’−ＲＡＣＥ用キット（Marath
on cDNA Amplification Kit,クローンテック社）を用い
てｃＤＮＡの上流部分にアダプター配列をとりつけ、ア
ダプター部分の配列の一部分をコードしたプライマーと
既知遺伝子配列部分から作製したプライマーを用いてＰ
ＣＲを行い、既知の遺伝子配列部分から５’側へ、開始
コドンの上流に至るまでのＤＮＡ塩基配列を決定し、開
始コドンより始まるシグナル配列と推定される領域及び
成熟タンパクの構造遺伝子部分については、対応するア
ミノ酸配列を決定した。
on cDNA Amplification Kit,クローンテック社）を用い
てｃＤＮＡの上流部分にアダプター配列をとりつけ、ア
ダプター部分の配列の一部分をコードしたプライマーと
既知遺伝子配列部分から作製したプライマーを用いてＰ
ＣＲを行い、既知の遺伝子配列部分から５’側へ、開始
コドンの上流に至るまでのＤＮＡ塩基配列を決定し、開
始コドンより始まるシグナル配列と推定される領域及び
成熟タンパクの構造遺伝子部分については、対応するア
ミノ酸配列を決定した。
【００２０】さらに、開始コドンとその付近の、シグナ
ル配列と推定される部分の数個のアミノ酸に対応する部
分を含むプライマー及びＣ末端の数個のアミノ酸に対応
する部分を含むプライマーを作製し、これを用いてＰＣ
Ｒを行うことによって、キチン脱アセチル化酵素の全構
造遺伝子を含む増幅断片を獲得した。この断片は、開始
コドンから始まるシグナル配列と推定される領域の後
に、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列に対応する
ＤＮＡ配列を含んでおり、請求項１記載の脱アセチル化
酵素の全酵素遺伝子を含むものである。
ル配列と推定される部分の数個のアミノ酸に対応する部
分を含むプライマー及びＣ末端の数個のアミノ酸に対応
する部分を含むプライマーを作製し、これを用いてＰＣ
Ｒを行うことによって、キチン脱アセチル化酵素の全構
造遺伝子を含む増幅断片を獲得した。この断片は、開始
コドンから始まるシグナル配列と推定される領域の後
に、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列に対応する
ＤＮＡ配列を含んでおり、請求項１記載の脱アセチル化
酵素の全酵素遺伝子を含むものである。
【００２１】請求項１記載の本発明のキチン脱アセチル
化酵素遺伝子は、配列番号１記載の塩基配列またはそれ
と実質的に同一の機能を有するものである。ここで、実
質的に同一の機能を有するとは、コドンの縮重という事
実により、同じアミノ酸残基をコードする遺伝子であれ
ば、その配列が全体にわたって配列番号１記載の遺伝子
と異なっている場合でも、実質的に同一であることを意
味する。
化酵素遺伝子は、配列番号１記載の塩基配列またはそれ
と実質的に同一の機能を有するものである。ここで、実
質的に同一の機能を有するとは、コドンの縮重という事
実により、同じアミノ酸残基をコードする遺伝子であれ
ば、その配列が全体にわたって配列番号１記載の遺伝子
と異なっている場合でも、実質的に同一であることを意
味する。
【００２２】請求項２記載の本発明は、上記請求項１記
載の遺伝子の塩基配列にハイブリッドする塩基配列から
なり、かつＮ−アセチル化アミノ糖残基中のＮ−アセチ
ル基の脱アセチル化酵素活性を有するタンパク質をコー
ドするＤＮＡ配列である。全体の相同性が約８５％以上
の場合、上記の配列番号１の配列を参考にして、ＤＮＡ
ハイブリダイゼーションや遺伝子増幅法等の公知の遺伝
子工学的手法を用いて、容易に請求項１記載の本発明と
ほぼ相同の遺伝子をクローニングすることが可能であ
る。
載の遺伝子の塩基配列にハイブリッドする塩基配列から
なり、かつＮ−アセチル化アミノ糖残基中のＮ−アセチ
ル基の脱アセチル化酵素活性を有するタンパク質をコー
ドするＤＮＡ配列である。全体の相同性が約８５％以上
の場合、上記の配列番号１の配列を参考にして、ＤＮＡ
ハイブリダイゼーションや遺伝子増幅法等の公知の遺伝
子工学的手法を用いて、容易に請求項１記載の本発明と
ほぼ相同の遺伝子をクローニングすることが可能であ
る。
【００２３】請求項３記載の本発明は、上記の遺伝子を
含むプラスミドベクターであり、請求項４記載の本発明
は、該プラスミドベクターで形質転換された形質転換体
である。具体的には、請求項１記載の遺伝子の塩基配列
を含むＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＣＲ２．１
（インビトロジェン社）等のプラスミドベクターにライ
ゲーションし、常法により大腸菌に形質転換することに
より得ることができる。プラスミドベクターｐＣＲ２．
１（インビトロジェン社）を用いて形質転換された大腸
菌は、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されて
おり、その受託番号はＦＥＲＭ ＢＰ−６１９１であ
る。
含むプラスミドベクターであり、請求項４記載の本発明
は、該プラスミドベクターで形質転換された形質転換体
である。具体的には、請求項１記載の遺伝子の塩基配列
を含むＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＣＲ２．１
（インビトロジェン社）等のプラスミドベクターにライ
ゲーションし、常法により大腸菌に形質転換することに
より得ることができる。プラスミドベクターｐＣＲ２．
１（インビトロジェン社）を用いて形質転換された大腸
菌は、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されて
おり、その受託番号はＦＥＲＭ ＢＰ−６１９１であ
る。
【００２４】なお、当業者に明らかなように、本発明に
係るＤＮＡ配列を用いて、原核生物もしくは真核生物の
いずれかの宿主細胞内でこのキチン脱アセチル化酵素を
大量に発現させることができる。すなわち、下記のよう
な常法に従って発現させることができる。例えば、本発
明に係る遺伝子を、適切な調節シグナルと共に原核生物
もしくは真核生物のいずれかの発現ベクターに挿入し、
そしてこれを細胞の形質転換に用いる。調節シグナル及
び発現ベクターには既に様々なものが開発、市販されて
おり、当業者によく知られたものを使用することができ
る。さらに、ベクタ−を用いた一連の操作及び形質転換
の方法についても、既に一般的なものであり、当業者で
あれば実施可能である。例えば、J. Sambrook, E.F. Fr
itsch, T. Maniatis (ed.), "Molecular Cloning: A La
boratory Manual, 2nd edition", Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1989等に詳細に説明されている方法
により実施することができる。
係るＤＮＡ配列を用いて、原核生物もしくは真核生物の
いずれかの宿主細胞内でこのキチン脱アセチル化酵素を
大量に発現させることができる。すなわち、下記のよう
な常法に従って発現させることができる。例えば、本発
明に係る遺伝子を、適切な調節シグナルと共に原核生物
もしくは真核生物のいずれかの発現ベクターに挿入し、
そしてこれを細胞の形質転換に用いる。調節シグナル及
び発現ベクターには既に様々なものが開発、市販されて
おり、当業者によく知られたものを使用することができ
る。さらに、ベクタ−を用いた一連の操作及び形質転換
の方法についても、既に一般的なものであり、当業者で
あれば実施可能である。例えば、J. Sambrook, E.F. Fr
itsch, T. Maniatis (ed.), "Molecular Cloning: A La
boratory Manual, 2nd edition", Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1989等に詳細に説明されている方法
により実施することができる。
【００２５】
【実施例】次に、実施例によって本発明を説明するが、
本発明はこれらによって制限されるものではない。 実施例１ スラント培地で継代培養している不完全菌コレトトリカ
ム・リンデムチアナム（Colletotrichum lindemuthian
um）ＡＴＣＣ５６６７６株を液体栄養培地に接種し、２
２℃で暗所にて１８日間培養を行った。菌体を濾別する
ことによって菌体培養液を回収した後、硫安沈殿法、疎
水クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィ
ー、ゲル濾過クロマトグラフィー等を活用し、高度に精
製されたキチン脱アセチル化酵素を得た。
本発明はこれらによって制限されるものではない。 実施例１ スラント培地で継代培養している不完全菌コレトトリカ
ム・リンデムチアナム（Colletotrichum lindemuthian
um）ＡＴＣＣ５６６７６株を液体栄養培地に接種し、２
２℃で暗所にて１８日間培養を行った。菌体を濾別する
ことによって菌体培養液を回収した後、硫安沈殿法、疎
水クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィ
ー、ゲル濾過クロマトグラフィー等を活用し、高度に精
製されたキチン脱アセチル化酵素を得た。
【００２６】次に、この精製したキチン脱アセチル化酵
素のＮ末端のアミノ酸配列を決定した。配列の決定には
プロテインシ−ケンサ−ＨＰＧ１００５Ａ（ＨＥＷＬＥ
ＴＴＰＡＣＫＡＲＤ社製）を用いた。決定したＮ末端の
アミノ酸配列は、配列表の配列番号２に示す通りであ
る。
素のＮ末端のアミノ酸配列を決定した。配列の決定には
プロテインシ−ケンサ−ＨＰＧ１００５Ａ（ＨＥＷＬＥ
ＴＴＰＡＣＫＡＲＤ社製）を用いた。決定したＮ末端の
アミノ酸配列は、配列表の配列番号２に示す通りであ
る。
【００２７】トリフルオロ酢酸を含む溶媒を用いて逆相
クロマトグラフィーによって酵素タンパク質を精製した
際には、Ｎ末端部分がピログルタミル化を受け、配列を
読むことができなかったが、ピログルタメート・アミノ
ペプチダーゼ（ベーリンガーマンハイム社）を作用させ
てシークエンス反応を行うことにより、Ｎ末端から２残
基目のペプチド配列から順番に配列を解読することがで
きた。
クロマトグラフィーによって酵素タンパク質を精製した
際には、Ｎ末端部分がピログルタミル化を受け、配列を
読むことができなかったが、ピログルタメート・アミノ
ペプチダーゼ（ベーリンガーマンハイム社）を作用させ
てシークエンス反応を行うことにより、Ｎ末端から２残
基目のペプチド配列から順番に配列を解読することがで
きた。
【００２８】さらに、このキチン脱アセチル化酵素をエ
ンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ（ベーリンガーマンハイ
ム社）及びエンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ（ベーリン
ガーマンハイム社）によって限定分解して、ペプチドフ
ラグメントを調製し、それらのアミノ酸配列を決定した
（配列表の配列番号３〜５参照）。
ンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ（ベーリンガーマンハイ
ム社）及びエンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ（ベーリン
ガーマンハイム社）によって限定分解して、ペプチドフ
ラグメントを調製し、それらのアミノ酸配列を決定した
（配列表の配列番号３〜５参照）。
【００２９】解読できたアミノ酸配列からコドン縮重の
少ない領域を選び、これをもとに作製したプライマーを
用いて、コレトトリカム属不完全菌から抽出したＤＮＡ
を鋳型としてＰＣＲを行った。得られたバンド（ＰＣＲ
産物）をクローニングし、ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ
ＰＲＩＳＭ３７７（株式会社パーキンエルマーアプラ
イドバイオシステムズ）で分析してＤＮＡ塩基配列を解
読した結果、配列表の配列番号６に示す４４４ｂｐの塩
基配列を決定することができた。
少ない領域を選び、これをもとに作製したプライマーを
用いて、コレトトリカム属不完全菌から抽出したＤＮＡ
を鋳型としてＰＣＲを行った。得られたバンド（ＰＣＲ
産物）をクローニングし、ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ
ＰＲＩＳＭ３７７（株式会社パーキンエルマーアプラ
イドバイオシステムズ）で分析してＤＮＡ塩基配列を解
読した結果、配列表の配列番号６に示す４４４ｂｐの塩
基配列を決定することができた。
【００３０】このＤＮＡ塩基配列をアミノ酸に翻訳した
ところ、先に得られたペプチドフラグメント（配列番号
表の配列番号３〜５参照）の一部分に相当するアミノ酸
配列が認められたことから、これらのペプチドフラグメ
ントがキチン脱アセチル化酵素遺伝子の一部であること
を確認することができた。そこで、得られたＤＮＡ配列
をもとに、コドンの縮重を十分に考慮したプライマーを
再構築し、ＲＮＡから逆転写酵素（ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋ
ｉｔ (AMV) Ver.2.1、宝酒造株式会社）を用いて作製し
たｃＤＮＡを鋳型としたキチン脱アセチル化酵素のクロ
ーニングを行った。
ところ、先に得られたペプチドフラグメント（配列番号
表の配列番号３〜５参照）の一部分に相当するアミノ酸
配列が認められたことから、これらのペプチドフラグメ
ントがキチン脱アセチル化酵素遺伝子の一部であること
を確認することができた。そこで、得られたＤＮＡ配列
をもとに、コドンの縮重を十分に考慮したプライマーを
再構築し、ＲＮＡから逆転写酵素（ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋ
ｉｔ (AMV) Ver.2.1、宝酒造株式会社）を用いて作製し
たｃＤＮＡを鋳型としたキチン脱アセチル化酵素のクロ
ーニングを行った。
【００３１】まず、ＲＮＡを鋳型として逆転写酵素を用
いてオリゴｄＴ配列を含むプライマーと反応させて作製
したｃＤＮＡから、オリゴｄＴ配列を含むプライマー及
び前記したプライマーを用いてＰＣＲを行い、既知の遺
伝子配列から外へ３’側の配列を解読し、終止コドンに
至るＤＮＡ塩基配列の決定を経てアミノ酸配列を決定し
た。
いてオリゴｄＴ配列を含むプライマーと反応させて作製
したｃＤＮＡから、オリゴｄＴ配列を含むプライマー及
び前記したプライマーを用いてＰＣＲを行い、既知の遺
伝子配列から外へ３’側の配列を解読し、終止コドンに
至るＤＮＡ塩基配列の決定を経てアミノ酸配列を決定し
た。
【００３２】続いて、５’−ＲＡＣＥ用キット（Marath
on cDNA Amplification Kit,クローンテック社）を用い
てｃＤＮＡの上流部分にアダプター配列をとりつけ、ア
ダプター部分の配列の一部分をコードしたプライマーと
既知遺伝子配列部分から作製したプライマーを用いてＰ
ＣＲを行い、既知遺伝子配列部分から５’側へ、開始コ
ドンの上流に至るまでのＤＮＡ塩基配列をＤＮＡシーク
エンサーＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３１０（株式会社パーキン
エルマーアプライドバイオシステムズ）で分析して決定
した。構造遺伝子部分については、対応するアミノ酸配
列を決定した。
on cDNA Amplification Kit,クローンテック社）を用い
てｃＤＮＡの上流部分にアダプター配列をとりつけ、ア
ダプター部分の配列の一部分をコードしたプライマーと
既知遺伝子配列部分から作製したプライマーを用いてＰ
ＣＲを行い、既知遺伝子配列部分から５’側へ、開始コ
ドンの上流に至るまでのＤＮＡ塩基配列をＤＮＡシーク
エンサーＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３１０（株式会社パーキン
エルマーアプライドバイオシステムズ）で分析して決定
した。構造遺伝子部分については、対応するアミノ酸配
列を決定した。
【００３３】さらに、開始コドンとその付近の、シグナ
ル配列と推定される部分の数個のアミノ酸に対応する部
分を含むプライマー及びＣ末端の数個のアミノ酸に対応
する部分を含むプライマーを作製し、これを用いてＰＣ
Ｒを行うことによって、キチン脱アセチル化酵素の全構
造遺伝子を含む増幅断片を獲得した。この断片をプラス
ミドベクターｐＣＲ２．１（インビトロジェン社）にラ
イゲーションし、常法により大腸菌に形質転換した。こ
れをアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）及びメシチリン
（８０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天培地上にまき、３７
℃で一晩培養することによって形質転換体（ＦＥＲＭ
ＢＰ−６１９１）を選抜し、導入されたプラスミドを回
収して該酵素遺伝子の塩基配列を解読した（配列表の配
列番号７参照）。その結果、この挿入断片は、開始コド
ンから始まりシグナルと推定される配列の後に、配列表
の配列番号１に示す塩基配列を含んでおり、請求項１記
載の脱アセチル化酵素の全酵素遺伝子を含むものである
ことが明らかとなった。
ル配列と推定される部分の数個のアミノ酸に対応する部
分を含むプライマー及びＣ末端の数個のアミノ酸に対応
する部分を含むプライマーを作製し、これを用いてＰＣ
Ｒを行うことによって、キチン脱アセチル化酵素の全構
造遺伝子を含む増幅断片を獲得した。この断片をプラス
ミドベクターｐＣＲ２．１（インビトロジェン社）にラ
イゲーションし、常法により大腸菌に形質転換した。こ
れをアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）及びメシチリン
（８０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天培地上にまき、３７
℃で一晩培養することによって形質転換体（ＦＥＲＭ
ＢＰ−６１９１）を選抜し、導入されたプラスミドを回
収して該酵素遺伝子の塩基配列を解読した（配列表の配
列番号７参照）。その結果、この挿入断片は、開始コド
ンから始まりシグナルと推定される配列の後に、配列表
の配列番号１に示す塩基配列を含んでおり、請求項１記
載の脱アセチル化酵素の全酵素遺伝子を含むものである
ことが明らかとなった。
【００３４】
【発明の効果】本発明の請求項１記載のキチン脱アセチ
ル化酵素遺伝子を発現させて得られる酵素は、キチン、
キチンオリゴ糖、その他のＮ−アセチル化アミノ糖残基
上のＮ−アセチル基を脱アセチル化する反応を進行さ
せ、食品加工及び医薬品工業等の分野において有用な素
材であるキトサン、キトサンオリゴ糖あるいはその他の
Ｎ−脱アセチル化糖を効率的に調製することができる。
ル化酵素遺伝子を発現させて得られる酵素は、キチン、
キチンオリゴ糖、その他のＮ−アセチル化アミノ糖残基
上のＮ−アセチル基を脱アセチル化する反応を進行さ
せ、食品加工及び医薬品工業等の分野において有用な素
材であるキトサン、キトサンオリゴ糖あるいはその他の
Ｎ−脱アセチル化糖を効率的に調製することができる。
【００３５】従来、コレトトリカム属等の植物病原菌か
らキチン脱アセチル化酵素を得るためには、病原菌を取
扱うための安全上及び管理上の問題があり、また培養に
多くの日数を要する上に、酵素の収量も満足すべきもの
ではなかった。しかしながら、本発明の請求項３記載の
キチン脱アセチル化酵素遺伝子を含むプラスミドを用い
て、適切な原核生物あるいは真核生物中で該遺伝子を発
現させることにより、上記の諸問題に煩わされることな
く、該酵素を安全、迅速、かつ大量に獲得することが可
能となる。したがって、本発明により、キチン脱アセチ
ル化酵素を活用した素材生産産業の振興に拍車がかかる
ものと期待される。
らキチン脱アセチル化酵素を得るためには、病原菌を取
扱うための安全上及び管理上の問題があり、また培養に
多くの日数を要する上に、酵素の収量も満足すべきもの
ではなかった。しかしながら、本発明の請求項３記載の
キチン脱アセチル化酵素遺伝子を含むプラスミドを用い
て、適切な原核生物あるいは真核生物中で該遺伝子を発
現させることにより、上記の諸問題に煩わされることな
く、該酵素を安全、迅速、かつ大量に獲得することが可
能となる。したがって、本発明により、キチン脱アセチ
ル化酵素を活用した素材生産産業の振興に拍車がかかる
ものと期待される。
【００３６】
配列番号：１ 配列の長さ：６６３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ構造遺伝子部分 起源 生物名：コレトトリカム・リンデムチアナム（Colletot
richum lindemuthianum) 株名：ATCC 56676 配列の特徴 特徴を示す記号：ＣＤＡ 存在位置：１．．６６３ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 CAG GTT CCC GTG GGC ACA CCC ATC CTC CAG TGC ACC CAG CCT GGT TTG 48 Gln Val Pro Val Gly Thr Pro Ile Leu Gln Cys Thr Gln Pro Gly Leu 1 5 10 15 GTT GCT CTG ACC TAC GAC GAC GGT CCT TTC ACC TTC ACC GCT CAG CTC 96 Val Ala Leu Thr Tyr Asp Asp Gly Pro Phe Thr Phe Thr Ala Gln Leu 20 25 30 CTC GAC ATC TTG AAG CAG AAC GAC GTC AAG GCG ACC TTC TTC GTC AAC 144 Leu Asp Ile Leu Lys Gln Asn Asp Val Lys Ala Thr Phe Phe Val Asn 35 40 45 GGC AAC AAC TGG GCC AAC ATC GAG GCC GGA TCC AAC CCC GAC ACG ATC 192 Gly Asn Asn Trp Ala Asn Ile Glu Ala Gly Ser Asn Pro Asp Thr Ile 50 55 60 CGC CGC ATG CGC GCC GAC GGC CAC CTC GTC GGC TCT CAC ACG TAC GCT 240 Arg Arg Met Arg Ala Asp Gly His Leu Val Gly Ser His Thr Tyr Ala 65 70 75 80 CAC CCG GAC CTC AAC ACG CTC TCC TCC GCG GAC CGC ATC TCC CAG ATG 288 His Pro Asp Leu Asn Thr Leu Ser Ser Ala Asp Arg Ile Ser Gln Met 85 90 95 CGG CAG CTC GAG GAG GCC ACC CGC CGC ATC GAC GGC TTC GCG CCC AAG 336 Arg Gln Leu Glu Glu Ala Thr Arg Arg Ile Asp Gly Phe Ala Pro Lys 100 105 110 TAC ATG CGC GCG CCG TAC CTG TCG TGC GAC GCG GGC TGC CAG GGC GAC 384 Tyr Met Arg Ala Pro Tyr Leu Ser Cys Asp Ala Gly Cys Gln Gly Asp 115 120 125 CTC GGC GGC CTC GGA TAC CAC ATC ATC GAC ACC AAC CTC GAC ACC AAG 432 Leu Gly Gly Leu Gly Tyr His Ile Ile Asp Thr Asn Leu Asp Thr Lys 130 135 140 GAC TAC GAG AAC AAC AAG CCC GAG ACC ACC CAC CTC TCG GCC GAG AAG 480 Asp Tyr Glu Asn Asn Lys Pro Glu Thr Thr His Leu Ser Ala Glu Lys 145 150 155 160 TTC GAC AAC GAG CTG AGC GGC GAC GTC GGC GCC AAC AGC TAC ATT GTC 528 Phe Asp Asn Glu Leu Ser Gly Asp Val Gly Ala Asn Ser Tyr Ile Val 165 170 175 CTC TCG CAC GAC GTC CAC GAG CAG ACG GTC GTC TCC CTC ACG CAG AGG 576 Leu Ser His Asp Val His Glu Gln Thr Val Val Ser Leu Thr Gln Arg 180 185 190 CTG ATT GAC ACG CTC AAG AGC AAG GGC TAC CGC GCC GTC ACC GTC GGC 624 Leu Ile Asp Thr Leu Lys Ser Lys Gly Tyr Arg Ala Val Thr Val Gly 195 200 205 GAG TGC CTC GGC GAC GCC CCG GAG AAC TGG TAC AAG GCG 663 Glu Cys Leu Gly Asp Ala Pro Glu Asn Trp Tyr Lys Ala 210 215 220
richum lindemuthianum) 株名：ATCC 56676 配列の特徴 特徴を示す記号：ＣＤＡ 存在位置：１．．６６３ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 CAG GTT CCC GTG GGC ACA CCC ATC CTC CAG TGC ACC CAG CCT GGT TTG 48 Gln Val Pro Val Gly Thr Pro Ile Leu Gln Cys Thr Gln Pro Gly Leu 1 5 10 15 GTT GCT CTG ACC TAC GAC GAC GGT CCT TTC ACC TTC ACC GCT CAG CTC 96 Val Ala Leu Thr Tyr Asp Asp Gly Pro Phe Thr Phe Thr Ala Gln Leu 20 25 30 CTC GAC ATC TTG AAG CAG AAC GAC GTC AAG GCG ACC TTC TTC GTC AAC 144 Leu Asp Ile Leu Lys Gln Asn Asp Val Lys Ala Thr Phe Phe Val Asn 35 40 45 GGC AAC AAC TGG GCC AAC ATC GAG GCC GGA TCC AAC CCC GAC ACG ATC 192 Gly Asn Asn Trp Ala Asn Ile Glu Ala Gly Ser Asn Pro Asp Thr Ile 50 55 60 CGC CGC ATG CGC GCC GAC GGC CAC CTC GTC GGC TCT CAC ACG TAC GCT 240 Arg Arg Met Arg Ala Asp Gly His Leu Val Gly Ser His Thr Tyr Ala 65 70 75 80 CAC CCG GAC CTC AAC ACG CTC TCC TCC GCG GAC CGC ATC TCC CAG ATG 288 His Pro Asp Leu Asn Thr Leu Ser Ser Ala Asp Arg Ile Ser Gln Met 85 90 95 CGG CAG CTC GAG GAG GCC ACC CGC CGC ATC GAC GGC TTC GCG CCC AAG 336 Arg Gln Leu Glu Glu Ala Thr Arg Arg Ile Asp Gly Phe Ala Pro Lys 100 105 110 TAC ATG CGC GCG CCG TAC CTG TCG TGC GAC GCG GGC TGC CAG GGC GAC 384 Tyr Met Arg Ala Pro Tyr Leu Ser Cys Asp Ala Gly Cys Gln Gly Asp 115 120 125 CTC GGC GGC CTC GGA TAC CAC ATC ATC GAC ACC AAC CTC GAC ACC AAG 432 Leu Gly Gly Leu Gly Tyr His Ile Ile Asp Thr Asn Leu Asp Thr Lys 130 135 140 GAC TAC GAG AAC AAC AAG CCC GAG ACC ACC CAC CTC TCG GCC GAG AAG 480 Asp Tyr Glu Asn Asn Lys Pro Glu Thr Thr His Leu Ser Ala Glu Lys 145 150 155 160 TTC GAC AAC GAG CTG AGC GGC GAC GTC GGC GCC AAC AGC TAC ATT GTC 528 Phe Asp Asn Glu Leu Ser Gly Asp Val Gly Ala Asn Ser Tyr Ile Val 165 170 175 CTC TCG CAC GAC GTC CAC GAG CAG ACG GTC GTC TCC CTC ACG CAG AGG 576 Leu Ser His Asp Val His Glu Gln Thr Val Val Ser Leu Thr Gln Arg 180 185 190 CTG ATT GAC ACG CTC AAG AGC AAG GGC TAC CGC GCC GTC ACC GTC GGC 624 Leu Ile Asp Thr Leu Lys Ser Lys Gly Tyr Arg Ala Val Thr Val Gly 195 200 205 GAG TGC CTC GGC GAC GCC CCG GAG AAC TGG TAC AAG GCG 663 Glu Cys Leu Gly Asp Ala Pro Glu Asn Trp Tyr Lys Ala 210 215 220
【００３７】配列番号：２ 配列の長さ：５１ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 起源 生物名：コレトトリカム・リンデムチアナム（Colletot
richum lindemuthianum) 株名：ATCC 56676 直接の起源 キチン脱アセチル化酵素 配列 Gln Val Pro Val Gly Thr Pro Ile Leu Gln Cys Thr Gln Pro Gly Leu 1 5 10 15 Val Ala Leu Thr Tyr Asp Asp Gly Pro Phe Thr Phe Thr Ala Gln Leu 20 25 30 Leu Asp Ile Leu Lys Gln Asn Asp Val Lys Ala Thr Phe Phe Val Asn 35 40 45 Gly Asn Asn 50
richum lindemuthianum) 株名：ATCC 56676 直接の起源 キチン脱アセチル化酵素 配列 Gln Val Pro Val Gly Thr Pro Ile Leu Gln Cys Thr Gln Pro Gly Leu 1 5 10 15 Val Ala Leu Thr Tyr Asp Asp Gly Pro Phe Thr Phe Thr Ala Gln Leu 20 25 30 Leu Asp Ile Leu Lys Gln Asn Asp Val Lys Ala Thr Phe Phe Val Asn 35 40 45 Gly Asn Asn 50
【００３８】配列番号：３ 配列の長さ：５０ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 起源 生物名：コレトトリカム・リンデムチアナム（Colletot
richum lindemuthianum) 株名：ATCC 56676 直接の起源 キチン脱アセチル化酵素の分解物 配列 Ala Thr Phe Phe Val Asn Gly Asn Asn Trp Ala Asn Ile Glu Ala Gly 1 5 10 15 Ser Asn Pro Asp Thr Ile Arg Arg Met Arg Ala Asp Gly His Leu Val 20 25 30 Gly Ser His Thr Tyr Ala His Pro Asp Leu Asn Thr Leu Ser Ser Ala 35 40 45 Asp Arg 50
richum lindemuthianum) 株名：ATCC 56676 直接の起源 キチン脱アセチル化酵素の分解物 配列 Ala Thr Phe Phe Val Asn Gly Asn Asn Trp Ala Asn Ile Glu Ala Gly 1 5 10 15 Ser Asn Pro Asp Thr Ile Arg Arg Met Arg Ala Asp Gly His Leu Val 20 25 30 Gly Ser His Thr Tyr Ala His Pro Asp Leu Asn Thr Leu Ser Ser Ala 35 40 45 Asp Arg 50
【００３９】配列番号：４ 配列の長さ：８４ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 起源 生物名：コレトトリカム・リンデムチアナム（Colletot
richum lindemuthianum) 株名：ATCC 56676 直接の起源 キチン脱アセチル化酵素の分解物 配列 Tyr Met Arg Ala Pro Tyr Leu Ser Xaa Asp Ala Gly Xaa Gln Gly Asp 1 5 10 15 Leu Gly Gly Leu Gly Tyr His Ile Ile Asp Thr Asn Leu Asp Xaa Lys 20 25 30 Asp Tyr Glu Asn Asn Lys Xaa Glu Thr Thr His Leu Ser Ala Glu Lys 35 40 45 Phe Asp Asn Glu Leu Ser Gly Asp Val Gly Ala Asn Ser Tyr Ile Val 50 55 60 Leu Ser His Asp Val His Glu Gln Thr Val Val Ser Leu Thr Gln Arg 65 70 75 80 Leu Ile Asp Thr 84
richum lindemuthianum) 株名：ATCC 56676 直接の起源 キチン脱アセチル化酵素の分解物 配列 Tyr Met Arg Ala Pro Tyr Leu Ser Xaa Asp Ala Gly Xaa Gln Gly Asp 1 5 10 15 Leu Gly Gly Leu Gly Tyr His Ile Ile Asp Thr Asn Leu Asp Xaa Lys 20 25 30 Asp Tyr Glu Asn Asn Lys Xaa Glu Thr Thr His Leu Ser Ala Glu Lys 35 40 45 Phe Asp Asn Glu Leu Ser Gly Asp Val Gly Ala Asn Ser Tyr Ile Val 50 55 60 Leu Ser His Asp Val His Glu Gln Thr Val Val Ser Leu Thr Gln Arg 65 70 75 80 Leu Ile Asp Thr 84
【００４０】配列番号：５ 配列の長さ：２７ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 起源 生物名：コレトトリカム・リンデムチアナム（Colletot
richum lindemuthianum) 株名：ATCC 56676 直接の起源 キチン脱アセチル化酵素の分解物 配列 Leu Ile Asp Thr Xaa Lys Ser Lys Gly Tyr Arg Ala Val Thr Val Gly 1 5 10 15 Glu Xaa Leu Gly Asp Ala Pro Glu Asn Trp Tyr 20 25 27
richum lindemuthianum) 株名：ATCC 56676 直接の起源 キチン脱アセチル化酵素の分解物 配列 Leu Ile Asp Thr Xaa Lys Ser Lys Gly Tyr Arg Ala Val Thr Val Gly 1 5 10 15 Glu Xaa Leu Gly Asp Ala Pro Glu Asn Trp Tyr 20 25 27
【００４１】配列番号：６ 配列の長さ：４４４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 起源 生物名：コレトトリカム・リンデムチアナム（Colletot
richum lindemuthianum) 株名：ATCC 56676 直接の起源 ＰＣＲ反応物 配列 AACATCGAGG CCGGGTCCAA CCCCGACACG ATCCGCCGCA TGCGCGCCGA CGGCCACCTC 60 GTCGGCTCTC ACACGTACGC TCACCCGGAC CTCAACACGC TCTCCTCCGC GGACCGCATC 120 TCCCAGATGC GGCAGCTCGA GGAGGCCACC CGCCGCATCG ACGGCTTCGC GCCCAAGTAC 180 ATGCGCGCGC CGTACCTGTC GTGCGACGCG GGCTGCCAGG GCGACCTCGG CGGCCTCGGA 240 TACCACATCA TCGACACCAA CCTCGACACC AAGGACTACG AGAACAACAA GCCCGAGACC 300 ACCCACCTCT CGGCCGAGAA GTTCGACAAC GAGCTGAGCG GCGACGTCGG CGCCAACAGC 360 TACATTGTCC TCTCGCACGA CGTCCACGAG CAGACGGTCG TCTCCCTCAC GCAGAGGCTG 420 ATTGACACGC TCAAGAGCAA GGGC 444
richum lindemuthianum) 株名：ATCC 56676 直接の起源 ＰＣＲ反応物 配列 AACATCGAGG CCGGGTCCAA CCCCGACACG ATCCGCCGCA TGCGCGCCGA CGGCCACCTC 60 GTCGGCTCTC ACACGTACGC TCACCCGGAC CTCAACACGC TCTCCTCCGC GGACCGCATC 120 TCCCAGATGC GGCAGCTCGA GGAGGCCACC CGCCGCATCG ACGGCTTCGC GCCCAAGTAC 180 ATGCGCGCGC CGTACCTGTC GTGCGACGCG GGCTGCCAGG GCGACCTCGG CGGCCTCGGA 240 TACCACATCA TCGACACCAA CCTCGACACC AAGGACTACG AGAACAACAA GCCCGAGACC 300 ACCCACCTCT CGGCCGAGAA GTTCGACAAC GAGCTGAGCG GCGACGTCGG CGCCAACAGC 360 TACATTGTCC TCTCGCACGA CGTCCACGAG CAGACGGTCG TCTCCCTCAC GCAGAGGCTG 420 ATTGACACGC TCAAGAGCAA GGGC 444
【００４２】配列番号：７ 配列の長さ：７５６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 起源 生物名：コレトトリカム・リンデムチアナム（Colletot
richum lindemuthianum) 株名：ATCC 56676 直接の起源 ＰＣＲ反応物 配列 GTCGACATGC ACTTCTCGAC CCTTCTTGGC GCCGCGGCTA CTGCTGCTCT CGCTGGCAGC 60 ACGAACGCAA GCCCTCTCGC CCGTCGCCAG GTTCCCGTGG GCACACCCAT CCTCCAGTGC 120 ACCCAGCCTG GTCTGGTTGC TCTGACCTAC GACGACGGTC CTTTCACCTT CACCGCTCAG 180 CTCCTCGACA TCTTGAAGCA GAACGACGTC AAGGCGACCT TCTTCGTCAA CGGCAACAAC 240 TGGGCCAACA TCGAGGCCGG ATCCAACCCC GACACGATCC GCCGCATGCG CGCCGACGGC 300 CACCTCGTCG GCTCTCACAC GTACGCTCAC CCGGACCTCA ACACGCTCTC CTCCGCGGAC 360 CGCATCTCCC AGATGCGGCA GCTCGAGGAG GCCACCCGCC GCATCGACGG CTTCGCGCCC 420 AAGTACATGC GCGCGCCGTA CCTGTCGTGC GACGCGGGCT GCCAGGGCGA CCTCGGCGGC 480 CTCGGATACC ACATCATCGA CACCAACCTC GACACCAAGG ACTACGAGAA CAACAAGCCC 540 GAGACCACCC ACCTCTCGGC CGAGAAGTTC GACAACGAGC TGAGCGGCGA CGTCGGCGCC 600 AACAGCTACA TTGTCCTCTC GCACGACGTC CACGAGCAGA CGGTCGTCTC CCTCACGCAG 660 AGGCTGATTG ACACGCTCAA GAGCAAGGGC TACCGCGCCG TCACCGTCGG CGAGTGCCTC 720 GGCGACGCCC CGGAGAACTG GTACAAGGCG AGATCT 756
richum lindemuthianum) 株名：ATCC 56676 直接の起源 ＰＣＲ反応物 配列 GTCGACATGC ACTTCTCGAC CCTTCTTGGC GCCGCGGCTA CTGCTGCTCT CGCTGGCAGC 60 ACGAACGCAA GCCCTCTCGC CCGTCGCCAG GTTCCCGTGG GCACACCCAT CCTCCAGTGC 120 ACCCAGCCTG GTCTGGTTGC TCTGACCTAC GACGACGGTC CTTTCACCTT CACCGCTCAG 180 CTCCTCGACA TCTTGAAGCA GAACGACGTC AAGGCGACCT TCTTCGTCAA CGGCAACAAC 240 TGGGCCAACA TCGAGGCCGG ATCCAACCCC GACACGATCC GCCGCATGCG CGCCGACGGC 300 CACCTCGTCG GCTCTCACAC GTACGCTCAC CCGGACCTCA ACACGCTCTC CTCCGCGGAC 360 CGCATCTCCC AGATGCGGCA GCTCGAGGAG GCCACCCGCC GCATCGACGG CTTCGCGCCC 420 AAGTACATGC GCGCGCCGTA CCTGTCGTGC GACGCGGGCT GCCAGGGCGA CCTCGGCGGC 480 CTCGGATACC ACATCATCGA CACCAACCTC GACACCAAGG ACTACGAGAA CAACAAGCCC 540 GAGACCACCC ACCTCTCGGC CGAGAAGTTC GACAACGAGC TGAGCGGCGA CGTCGGCGCC 600 AACAGCTACA TTGTCCTCTC GCACGACGTC CACGAGCAGA CGGTCGTCTC CCTCACGCAG 660 AGGCTGATTG ACACGCTCAA GAGCAAGGGC TACCGCGCCG TCACCGTCGG CGAGTGCCTC 720 GGCGACGCCC CGGAGAACTG GTACAAGGCG AGATCT 756
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:00） (Ｃ１２Ｐ 19/26 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 林 清 茨城県土浦市乙戸南１丁目５−３
Claims (4)
- 【請求項１】 配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列
からなるタンパク質をコードするキチン脱アセチル化酵
素遺伝子。 - 【請求項２】 配列表の配列番号１記載の塩基配列にハ
イブリッドする塩基配列からなり、かつＮ−アセチル化
アミノ糖残基中のＮ−アセチル基の脱アセチル化酵素活
性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ塩基配列。 - 【請求項３】 請求項１記載のキチン脱アセチル化酵素
遺伝子を含むプラスミドベクター。 - 【請求項４】 請求項３記載のプラスミドベクターで形
質転換された形質転換体。
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