JPH0937789A - 生澱粉分解酵素遺伝子および生澱粉分解酵素の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】生澱粉分解酵素をコードするDNAを提供する。 【構成】生澱粉分解酵素をコードするDNAを精製・単離
し、その塩基配列を決定することに成功した。更に該遺
伝子を組み込んだ形質転換体を得、該形質転換体を培養
することによって生澱粉分解酵素を製造する方法を完成
した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、生澱粉分解酵素遺伝子
および該遺伝子を組み込んだ形質転換体を培養すること
による生澱粉分解酵素の製造法に関し、該生澱粉分解酵
素は、食品工業、繊維工業、医薬工業などの分野で利用
され、産業上特に重要である。

【０００２】

【従来の技術】従来、本生澱粉分解酵素遺伝子の構造に
ついては、全く未知であり、該遺伝子の単離すらされて
いないのが実情である。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】従来、生澱粉分解酵素
は、該生澱粉分解酵素を産生する菌株を培養して製造さ
れているが、供給量、供給費用などの点で改善すべき点
が多くあった。

【０００４】本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意
研究の結果、生澱粉分解酵素をコードするDNAを精製・
単離し、その塩基配列を決定することに成功した。更に
該遺伝子を組み込んだ形質転換体を得、該形質転換体を
培養することによって生澱粉分解酵素を製造する方法を
完成した。

【０００５】かかる成果に基づいて生澱粉分解酵素の効
率的な大量生産への途を開き、さらには、蛋白質工学に
よる生澱粉分解酵素の特異性の改変への途をも開いた。

【０００６】

【課題を解決するための手段】従って、本発明は、生澱
粉分解酵素遺伝子をコードするDNAに関するものであ
り、更に該遺伝子を組み込んだ形質転換体を培養するこ
とによる生澱粉分解酵素の製造方法に関する。

【０００７】即ち、配列番号：２の配列中のアミノ酸番
号１からアミノ酸番号529で表されるアミノ酸配列をコ
ードする生澱粉分解酵素遺伝子を提供するものである。

【０００８】本発明は更に、配列番号：２の配列中のア
ミノ酸番号−32からアミノ酸番号−１で表されるアミノ
酸配列をコードするシグナルペプチドを５’−末端に有
する生澱粉分解酵素遺伝子をも提供するものである。

【０００９】上記シグナルペプチド及び生澱粉分解酵素
をコードする遺伝子は、遺伝子コドンの縮重により種々
の塩基配列を包含し得るものであり、一具体例として
は、配列番号：２の配列中の塩基番号220から塩基番号2
091で表される塩基配列を有するものが挙げられる。

【００１０】また、その取得方法も化学的合成法も含め
て種々のものが考えられる。例えばPCR（Polymerase Ch
ain Reaction）法により得られたDNA断片をプローブと
して用いて細菌のゲノムDNA等からクローニングするこ
とにより得ることができる。

【００１１】これらの遺伝子は生澱粉分解酵素を生産す
る微生物より以下の実施例に述べる方法により単離でき
る。微生物としては、例えばズーグレア（Zoogloea）属
菌が使用でき、好ましくはズーグレア・ラミゲラ（Zoog
loea ramigera）が使用でき、より好ましくは、ズーグ
レア・ラミゲラ（Zoogloea ramigera) KO-159株が使用
できる。

【００１２】そして単離されたズーグレア・ラミゲラ
（Zoogloea ramigera）KO-159株の染色体中の生澱粉分
解酵素遺伝子とその上流の隣接部にはプロモーター及び
SD配列部位が含まれており、これにより大腸菌を宿主と
した、生澱粉分解酵素の効率的な大量生産が可能であ
る。

【００１３】即ち、本発明により生澱粉分解酵素遺伝子
と該遺伝子の分泌を促進する機能をコードするDNA配列
を含んでなる組換え体DNAを有する微生物を培養するこ
とにより、培養物から生澱粉分解酵素を採取することが
可能となった。

【００１４】以下、実施例を参照しながら本発明を詳細
に説明するが、実施例に使用したプラスミドなどは一例
として挙げたものであり、本発明に使用できるものであ
ればこれらに限定されるものではない。

【００１５】

【実施例】

(1) 菌体の取得 ズーグレア・ラミゲラKO-159（Zoogloea ramigera）KO-
159（FERM-P 11738）を以下の培養条件で培養した。

【００１６】500mlのペプトン−ブイヨン培地で、30℃
で一晩培養後集菌し、Saline-EDTA（0.15M NaCl-0.1M N
a₂EDTA,pH8.0）50mlで、２〜３回洗浄遠心（6,000rpm）
し、菌体を得た。

【００１７】(2) 染色体DNAの調製 得られた湿菌体6.5ｇをSaline-Tris（0.1M NaCl-10mM N
a₂EDTA-0.1M Tris-HCl,pH9.0）20mlに懸濁し、使用直前
に調製した20mg/mlのリゾチーム溶液500μlを加え、37
℃で10分間ゆっくり振盪しながらTris-SDS〔５％SDSを
含む0.14M NaCl1mM Na₂EDTA 20mM Tris-HCl（pH 9.
0）〕５mlを滴下し、60℃で20分間ゆっくり振盪し、25m
lの80％フェノール〔フェノール液 20mlと50mM Tris-HC
l（pH8.0）５mlを使用直前に混合させて調整〕を加え、
室温でゆっくり30分間振盪した後、溶液を遠心管に移
し、冷却後6,000rpmで室温20分間遠心分離し、上層（水
層）を分取し、２倍容量の冷却エタノール（−20℃）を
ゆっくり加え、沈殿したDNAをガラス棒で静かに巻き取
り、デシケーター中で減圧乾燥した。

【００１８】次にDNAサンプル中のRNAを分解し除去する
ために、DNAのペレットを0.1×ＳＳＣ緩衝液（10mM NaC
l−1.5mM Na₃Citrate）10mlに再懸濁し、DNAが完全に溶
解した後、20×ＳＳＣ緩衝液（1M NaCl−1.5M Na₃Citra
te）500μlを加え、１mg/mlRNase（Sigma社製，R4875）
を600μl加えて37℃で30分処理してRNAを分解した後、
フェノール10mlを加え、よく混合した後6,000rpm、３分
間遠心分離し、水層を分離してエタノール沈殿し、生じ
た沈殿物を遠心により集め、２mgの染色体DNAを得た。

【００１９】(3) 遺伝子ライブラリーの作成 (2)で得られた全DNAをHind IIIで分解し、分解されたDN
Aを子牛の腸由来のアルカリフォスファターゼ（Takara
社製）を用いて脱リン酸し、Fricshaufらの方法〔J. Mo
l. Biol.170巻、827-842頁（1987）〕に従って、 λ DA
SHIIのHind IIIサイトにライゲートした。

【００２０】ライゲーション混合物はインビトロでパッ
ケージし、Escherichia coli LE392にトランスフェクシ
ョンした。その結果、5.2×10⁵のインデペンデントクロ
ーンよりなるライブラリーが作成できた。

【００２１】(4) 生澱粉分解酵素の部分アミノ酸配列
の決定 生澱粉分解酵素遺伝子の部分DNAを増幅するためのPCRに
用いるプライマーをデザインするために、生澱粉分解酵
素の部分アミノ酸配列を以下の方法で決定した。

【００２２】(a) 生澱粉分解酵素の精製 ズーグレア・ラミゲラKO-159（Zoogloea ramigera）KO-
159（FERM-P 11738）を魚肉エキス1.0％、ポリペプトン
1.0％、NaCl0.5％からなるペプトン−ブイヨン培地（pH
6.5）50mlに接種し、温度30℃で24時間振とう培養して
得られた前培養液を、リン酸二水素カリウム0.15％、ポ
リペプトン0.15％、酵母エキス0.2％、無水塩化カルシ
ウム（CaCl₂）2.5mMに、予め殺菌したバレイショ生澱粉
３％を添加した生澱粉培地（pH6.5）500mlに接種し、温
度30℃で３日間培養した。

【００２３】得られた本培養液をろ過した液（2000ml，
比活性0.83）に20分間蒸気滅菌したコーンスターチ５％
（w/v）を加えて一夜攪拌し、酵素を澱粉に吸着させ
た。次いでデカンテーションによって上澄液を除去し、
沈降した澱粉を冷水で洗浄・ろ過してろ取した。この澱
粉を更に冷水で洗浄・ろ過後50℃に保持した0.01M 酢酸
ナトリウム緩衝液（pH 6.0）中に分散させ、２時間攪拌
して吸着した酵素を溶出させた。溶出後、ろ過して澱粉
を除去し溶出液を得た。

【００２４】あらかじめ0.01M酢酸ナトリウム緩衝液（p
H6.0）で平衡化させたCM−セファデックスC-50カラム
（2.8×21cm）に酵素を吸着させ、0-1M NaCl濃度勾配溶
出法で溶出した。溶出してきた酵素画分を分取し、PM-1
0 限外ろ過膜（アミコン社製）で濃縮した。こうして得
られた酵素溶液（比活性83.70，収量30.6％）は、SDS−
ポリアクリルアミド電気泳動法により単一にまで精製さ
れた。

【００２５】尚、生澱粉分解活性は下記の方法により測
定した。２％トウモロコシ生澱粉懸濁液〔0.1M酢酸ナト
リウム（pH6.0）に懸濁〕1.0mlに、酵素液1.0mlを加
え、37℃、４時間反応を行い、反応終了後、15,000rp
m、10分間遠心分離した。その上澄中の可溶性全糖をフ
ェノール−硫酸法で測定した。

【００２６】酵素活性は37℃、１時間に生澱粉を分解し
て１mgの可溶性糖を精製する酵素量を１単位とした。

【００２７】(a)で得られた精製した生澱粉分解酵素350
μl（5.7mg/ml）と酵素の300倍mol量のBrCNを含む70％
ギ酸2.5ml中で室温で24時間反応させ、反応終了後、蒸
留水４mlを加えて減圧乾燥し、余剰のシアン化物を除く
ところのBrCN分解及び(a)で得られた精製した生澱粉分
解酵素350μl（5.7mg/ml）に、1M Tris-HCl緩衝液（pH
7.5）70μl，11.5mMCaCl₂ 20 μlと2.0mg/mlを加え、よ
く混合し、37℃で１時間反応させるところのプロテアー
ゼ分解をそれぞれ行うことによって７種類の異なったペ
プチド断片が得られた。

【００２８】これらのペプチドのアミノ酸配列を気相プ
ロテインシークエンサー（AppliedBiosystem 492 mode
l）を用いて同定した結果、以下に示されるアミノ酸配
列のものが得られた。

【００２９】未消化酵素 N 末端（M.W. 63,000） Leu-Asn-Pro-Asn-Ser-Thr-Ser-Val-Gln-Met-Phe-Glu-Tr
p-Ala-Trp-Pro-Asp-Ile-Ala-Thr BrCN 分解 1)BrCN-1（M.W. 10,000） Ala-Asp-Gly-Ser-Gly-Thr-Ala-Thr 2)BrCN-2（M.W. 10,000以下） Val-Gly-Phe-Arg-Asn-Ala-Ser-Ile-Gly 3)BrCN-22（M.W. 45,000） Ala-Asp-Gly-Ser-Gly-Thr-Ala-Thr-Asp-Gly 4)BrCN-23（M.W. 35,000） Gly-Thr-Pro-Ala-Asn- X -Gly 5)BrCN-24（M.W. 28,000） Lew-Ala-Gln-Gly-Tyr-Ala-Glu-Ala-Glu-Lew-Tyr-Ser-Gl
y-Phe-Lys-Phe-Ser-Asn-Thr-Asp プロテアーゼ分解 1)トリプシン（M.W. 13,000） Val-Thr-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Thr-Gly-Thy- x -Al
a-Val-Thr-Phe-Thr-Ile-Ala-Asn

【００３０】(b)PCR増幅断片のダイデオキシターミネー
ター法による生澱粉分解酵素遺伝子の部分DNA配列の決
定 上記のＮ末端とBrCN-24のアミノ酸の部分配列の結果を
もとに、できるだけ遺伝子コードの縮重の少ないアミノ
酸を選んで次の４種のプライマーを調製した。

【００３１】1)N 末端側 YAN-N21 :5' GTG GTC GAC ACN TCN GTN CAR ATG TTY GA YAN-N22 :5' GTG GTC GAC ACN AGY GTN CAR ATG TTY GA 2)C 末端側 YAN-C21 :5' GTG GAA TTC GCR TAN CCY TGN GCY AAC AT YAN-C22 :5' GTG GAA TTC GCR TAN CCY TGN GCY AGC AT

【００３２】上述のプライマーを用い、YAN-N21,YAN-N2
2とYAN-C21,YAN-C22の４種類の組み合わせで、ズーグレ
ア・ラミゲラ （Zoogloea ramigera）KO-159株の染色体
DNAをテンプレートにしてPCRを行った。反応は、パーキ
ンエルマージャパン社のDNAThermal Cyclerにより行
い、反応溶液の組成及び反応条件は、以下の通りであ
る。

【００３３】 反応組成 テンプレートDNA 12.5μl(500ng)又は0.5μl(20ng) プライマーYAN-N ＆YAN-C 4 μl(4 pmol) [10×] Reaction buffer 10 μl dNTP Mix 25mM 8 μl H₂O 60.5μl 又は 61.0μl 100mM MgCl₂ 0.5μl 又は none Ampi Taq^TM DNA polymerase 0.5μl 計 100 μl （アニーリング温度：テンプレートDNA500 ngは60℃，20 ngは50℃）

【００３４】 反応条件 1st.(1 cycle) Target Temp. Segment Time Seg#1 94℃ 0 min 0 sec Seg#2 94℃ 10 min 0 sec Seg#3 0℃ 0 min 0 sec 2nd.(30 cycle) Target Temp. Segment Time Seg#1 94℃ 0 min 1 sec Seg#2 94℃ 0 min 30 sec Seg#3 55℃ 0 min 1 sec Seg#4 55℃ 2 min 0 sec Seg#5 72℃ 0 min 1 sec Seg#6 72℃ 3 min 0 sec Seg#7 0℃ 0 min 0 sec 3rd. Soak Temperature 4 ℃

【００３５】上記のDNAの増幅を行った結果、YAN-N21と
YAN-C21及びYAN-N21とYAN-C22の組み合わせで約1,000bp
のDNA断片が得られた。

【００３６】そして、SalIとEcoRIで消化し、アルカリ
性フォスファターゼ（BAP,Takara 社製）処理したpUC19
にSalIとEcoRIで処理した1,000 bpのPCR産物DNA断片を
挿入し、Escherichia coli JM 109を形質転換した。こ
の組換え体よりプラスミドを抽出した結果、1000bp、75
0bp及び250bpのDNA断片が挿入されたプラスミドが得ら
れた。これらをそれぞれpUKY-1，pUKY-2，pUKY-3とし
た。

【００３７】そしてpUKY-1，pUKY-2，pUKY-3をテンプレ
ートとして、これらのプラスミドの挿入断片のDNA塩基
配列をダイデオキシターミネーター法で決定した結果、
本酵素をコードすると予想されるDNA塩基配列の約50％
が明らかになった。このDNA塩基配列をアミノ酸配列に
変換した結果、N 末端アミノ酸配列及びBrCN1,BrCN22,B
rCN23,BrCN24の配列が確認された。本シークエンス反応
に用いたプライマーの塩基配列を以下に示す。

【００３８】 F〔M13(-21)〕: 5'TGT AAA ACG ACG GCC ATG R (M13RP1) : 5'CAG GAA ACT GCT ATG ACC

【００３９】上記分析結果から、pUKY-1のインサート1,
000bpの内、上流側の250bpとpUKY-3のインサート250bp
の配列とが完全に一致し又、下流側の750bpとpUKY-2の
インサート750bpの配列も完全に一致した。その生澱粉
分解酵素のDNA部分塩基配列及び部分アミノ酸配列は配
列番号：１に示される。

【００４０】(5) 生澱粉分解酵素遺伝子の全DNA配列の
決定 次に、本発明者らは、生澱粉分解酵素の全DNAを決定す
るために配列番号：１で示されたDNA塩基配列の５’及
び３’側からGC 含量が約50％で内部にステムループを
作らない配列を選び、各２種類のプライマーを調製し、
BamHI,BclI,BglIIの各々で消化したゲノムDNAをテンプ
レートとしてカセット＆カセット法を用いてPCR法によ
るDNAの増殖を行った。プライマーは以下のものを用い
た。

【００４１】1)１回目のPCR ５’側 YAN-N23 :5' TCA AGT TGG CGT ATG TCA CC ３’側 YAN-C23 :5' CAA CAG CCT CTC CAG CAT TC 2)２回目のPCR ５’側 YAN-N24 :5' GTC GAA TTC ATT GGC ATT CTT
GGA GGC G ３’側 YAN-C24 :5' GTG GTC GAC CTG AAC ATC AAC
AAT GCG GC なお、PCRの反応条件は、94℃,30sec、65℃,２min、72
℃,３min、30cycleであった。

【００４２】DNAのシーケンスの結果、上流側の約500bp
のDNA断片は完全に決定できたが、下流の約1,050bpのDN
A断片の中間の約250bpの領域が決定できなかった。そこ
で、ここで決定された領域から新たなプライマーを調製
し、内部の配列をダイレクトシークエンス法により決定
した。新たに調製したプライマーを以下に示す。

【００４３】 YAN-C26 : 5' TTC GCA ATG CCA GCA TCG GG YAN-C27 : 5' CAT ATC TGT ACT GGA TCG CC

【００４４】同様にDNAのシーケンスを行った結果、カ
セット＆カセット法で増幅した500bpと1,050bpのDNA断
片の配列が全て明らかになった。解析することができた
DNA塩基配列はそれぞれ420bpと958bpであった。

【００４５】このように決定されたDNA塩基配列のう
ち、500 pの下流側78bpの配列は、pUKY-1のインサートD
NA（927bp）の上流側78bpと完全に一致した。又、1050b
pの断片の上流側30bpの配列も同様に、pUKY-1のインサ
ートのDNAの下流側30bpと完全に一致した。そして決定
された全DNA及び全アミノ酸配列は、配列番号：２に示
される。

【００４６】配列番号：２で示された生澱粉分解酵素の
塩基配列から明らかなように、BrCN分解及びプロテアー
ゼ分解より得られたペプチドのアミノ酸配列の全てが、
DNA塩基配列から推定されるアミノ酸配列中に認められ
た。そして決定されたDNA塩基配列の316番目のCTCから
始まる塩基配列から推定されるアミノ酸配列が本酵素の
N末端アミノ酸配列と一致した。

【００４７】そしてこのLeuのコドンからフレームを一
致させて上流を検索したところ、106番目の塩基から始
まるコドンが停止コドンOpaであり、この停止コドンか
らN末端のLeuのコドンまでの間に開始コドンと考えられ
る配列のATGは、220番目の塩基から始まるコドンただ１
つであるので、220番目の塩基から始まるコドンが翻訳
開始コドンで、このMet からN末端のLeu迄のアミノ酸配
列がシグナルペプチドと考えられる。本酵素の遺伝子か
ら推定される総アミノ酸残基数は、N末端のLeuから592
残基であり、これから計算される分子量62,334は精製酵
素のSDS-PAGEによって求められた分子量63,000とほぼ一
致した。又、本酵素のアミノ酸組成も塩基配列から推定
されるアミノ酸組成にほぼ一致した。

【００４８】さらに、プロモーター部位と考えられる配
列が配列番号：２の配列中の塩基番号96〜101及び塩基
番号110〜115のところ（開始コドンATGの上流-124bp〜-
119bp及び-110bp〜-105bpのところ）に見られ且つ又、S
D配列部位も配列番号：２の配列中の塩基番号211〜塩基
番号215のところ（開始コドンATGの上流-９bp〜-５bpの
ところ）にみられた。

【００４９】(6) 生澱粉分解酵素遺伝子の大腸菌（Esc
herichia coli）での発現 染色体ＤＮＡは制限酵素Sau3AIを用い、得られるＤＮＡ
断片の鎖長が４〜10Kbの範囲となるような条件下で部分
分解した。ベクターＤＮＡはプラスミドpUC19を用い
た。pUC19は制限酵素BamHI切断し、アルカリホスファタ
ーゼで処理した。部分分解したズーグレア・ラミゲラKO
-159（Zoogloea ramigera）KO-159株染色体ＤＮＡとBam
HI消化したプラスミドpUC19を２：１の割合で混合した
のち、宝酒造製ＤＮＡライゲーションキットを用いて16
℃、30分間の反応によって連結させた。

【００５０】大腸菌（Eschrichia coli）JM109株はHana
hanの方法（Hanahan,D.,Gene,10,63(1980)）に基づき、
カルシウム処理をほどこすことによって形質転換細胞と
して調製し、上記組み換えプラスミドを形質転換した。

【００５１】生澱粉分解酵素遺伝子を挿入したプラスミ
ドの単離 上記、形質転換体を、50μｇ／mlアンピシリン、１％ト
リブチリンを含むＬＢ培地にプレーティングした。37℃
で48時間培養したのち、約16,400個の形質転換体より14
個のコロニー周辺にクリアゾーンを形成する株を得た。
14個のクリアゾーン形成株は50μｇ／mlのアンピシリン
を含む５mlＬＢ液体培地で37℃、24時間振とう培養し
た。培養液は菌体を破砕する目的で超音波処理し、(4)
の(a)に記載の方法に準じてその生澱粉分解酵素活性を
測定した。その結果、14個のクリアゾーン形成株の中か
ら、0.025Ｕ／mlの生澱粉分解活性を示す一株を単離し
た。本形質転換体はＳＡ−３株と命名した。

【００５２】

【発明の効果】本発明により、生澱粉分解酵素をコード
する遺伝子が提供され、該遺伝子を組み込んだ形質転換
体を培養することに生澱粉分解酵素を製造することがで
きる。このようにして製造された生澱粉分解酵素は、食
品工業、繊維工業、医薬工業などの分野で利用でき、産
業上に大きく貢献できる。

【００５３】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：927 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA フラグメント型：中間部フラグメント 配列 ATG TTC GAA TGG GCC TGG CCC GAC ATC GCC ACC GAA TGC ACC CAA TGG 48 Met Phe Glu Trp Ala Trp Pro Asp Ile Ala Thr Glu Cys Thr Gln Trp 1 5 10 15 CTC GGA CCC AAG GGC TTT GGG GGC GTG CAG ATC TCG CCG CCC GGC GCC 96 Leu Gly Pro Lys Gly Phe Gly Gly Val Gln Ile Ser Pro Pro Gly Ala 20 25 30 TCC AAG AAT GCC AAT GGC TGG TGG GGC GTC TAC CAG CCG GTG AAC TAC 144 Ser Lys Asn Ala Asn Gly Trp Trp Gly Val Tyr Gln Pro Val Asn Tyr 35 40 45 GCC AAC TTG ACC AGC CGC ATG GGC ACC CCG GCG CAG CTG CAA AGC ATG 192 Ala Asn Leu Thr Ser Arg Met Gly Thr Pro Ala Gln Leu Gln Ser Met 50 55 60 ATC AGC GCC TGC CAT GCG GCC GGC GTT CGC GTC TAT GCC GAC ATC GTC 240 Ile Ser Ala Cys His Ala Ala Gly Val Arg Val Tyr Ala Asp Ile Val 65 70 75 80 GTC AAC CAG ATG GCC GAC GGC AGT GGC ACC GCC ACC GAC GGC TCC ACC 288 Val Asn Gln Met Ala Asp Gly Ser Gly Thr Ala Thr Asp Gly Ser Thr 85 90 95 TGG AAT GCC GCG ACG CTG ACC TAC CCC TTC TTC AGC GCC AAC GAC TTC 336 Trp Asn Ala Ala Thr Leu Thr Tyr Pro Phe Phe Ser Ala Asn Asp Phe 100 105 110 CAC GCC AAT TGC GTC ATC AAT GAC GCC GAC TAC AAC TCC CCG GCC GGC 384 His Ala Asn Cys Val Ile Asn Asp Ala Asp Tyr Asn Ser Pro Ala Gly 115 120 125 CGC AGC AAT GTG CAG AAC TGC CGG CTC GGT GGA CTT CCC GAC CTG GCG 432 Arg Ser Asn Val Gln Asn Cys Arg Leu Gly Gly Leu Pro Asp Leu Ala 130 135 140 ACG GAG AGC AGC TAT GTG CAG GGC CAG ATC GTC AAC TAT TTG AAG TCG 480 Thr Glu Ser Ser Tyr Val Gln Gly Gln Ile Val Asn Tyr Leu Lys Ser 145 150 155 160 CTG CTG GCA CTG GGC ATC GAC GGC TTT CGG ATT GAC GCG GCC AAG CAC 528 Leu Leu Ala Leu Gly Ile Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Ala Lys His 165 170 175 ATG CCG GCC AGT GCG TGG ACA TCG ATC ATG AGC GCC GTG AAG ACG GCC 576 Met Pro Ala Ser Ala Trp Thr Ser Ile Met Ser Ala Val Lys Thr Ala 180 185 190 TAC CCC AAG ACG CTG CAG GGC GAG AAC ATC TGG CTG ACG CAG GAA ATC 624 Tyr Pro Lys Thr Leu Gln Gly Glu Asn Ile Trp Leu Thr Gln Glu Ile 195 200 205 ATC AAC GAC GGC GAG GTG GAT CGG CCC AGC TAC TTC CCC ATC GGC ACC 672 Ile Asn Asp Gly Glu Val Asp Arg Pro Ser Tyr Phe Pro Ile Gly Thr 210 215 220 ATC AAT GAA TTC CAG TTC ACC TAC GCC ATG CGC GAC GTG TTC CGG GGC 720 Ile Asn Glu Phe Gln Phe Thr Tyr Ala Met Arg Asp Val Phe Arg Gly 225 230 235 240 AAC AAC GGC AAC AGC CTC TCC AGC ATT CCC GGC ATC ATG GGC ACC TGG 768 Asn Asn Gly Asn Ser Leu Ser Ser Ile Pro Gly Ile Met Gly Thr Trp 245 250 255 GGC AAT TGG GGC GGC AGC TGG GGC TTC ATC CAG CCG CAG AAC GCC ACC 816 Gly Asn Trp Gly Gly Ser Trp Gly Phe Ile Gln Pro Gln Asn Ala Thr 260 265 270 GTG TTC ATC ACC AAT TGG GAC ACG GAG CGC AAC GGC AGT TCG CTG AAC 864 Val Phe Ile Thr Asn Trp Asp Thr Glu Arg Asn Gly Ser Ser Leu Asn 275 280 285 ATC AAC AAT GCG GCC GGC AAT GAC GCG GCC AAT CAG CGC TAC ACG CTG 912 Ile Asn Asn Ala Ala Gly Asn Asp Ala Ala Asn Gln Arg Tyr Thr Leu 290 295 300 GCC AAC ATC TTC ATG 927 Ala Asn Ile Phe Met 305

【００５４】配列番号：2 配列の長さ：2197 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ズーグレア・ラミゲラ （Zoogloea ramigera） 株名：KO-159株 配列の特徴 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：220..315 特徴を決定した方法：E 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：316..2091 特徴を決定した方法：E 特徴を表す記号：promoter 存在位置：96..101 特徴を決定した方法：E 特徴を表す記号：promoter 存在位置：110..105 特徴を決定した方法：E 特徴を表す記号：SD配列 存在位置：211..215 特徴を決定した方法：E 配列 TGGGACGGGT AACAAAACTA CACCGCGTAC GCCATCCATT CCCTGACCAC TTCATGGACA 60 TAAAGCGCGG ATTAGTAGTT TTCCTACGAC CGATCTTCAC AAGCCTGACT AGAGTTGGAG 120 CACTTTCCGA TTCCGGAAAG ACGGCCATGG CGTCCTGAGG CGTGGCCGAA TCCAGCTGCC 180 CCGCAACGAG GGTGGCGGTC GATCAACACC GGAGACAAC ATG CCC CAG CTG CCC 234 Met Pro Gln Leu Pro -30 TTT TTG AGC CGC AGG CTC GCT CAC GCC CTG ACG GTC ACC GCC AGC GCT 282 Phe Leu Ser Arg Arg Leu Ala His Ala Leu Thr Val Thr Ala Ser Ala -25 -20 -15 GCC CTG ACC GTC TTT GCC AGC CCG GCG CAG GCG CTC AAC CCG AAT TCG 330 Ala Leu Thr Val Phe Ala Ser Pro Ala Gln Ala Leu Asn Pro Asn Ser -10 -5 1 5 ACG TCG GTG CAG ATG TTC GAA TGG GCC TGG CCC GAC ATC GCC ACC GAA 378 Thr Ser Val Gln Met Phe Glu Trp Ala Trp Pro Asp Ile Ala Thr Glu 10 15 20 TGC ACC CAA TGG CTC GGA CCC AAG GGC TTT GGG GGC GTG CAG ATC TCG 426 Cys Thr Gln Trp Leu Gly Pro Lys Gly Phe Gly Gly Val Gln Ile Ser 25 30 35 CCG CCC GGC GCC TCC AAG AAT GCC AAT GGC TGG TGG GGC GTC TAC CAG 474 Pro Pro Gly Ala Ser Lys Asn Ala Asn Gly Trp Trp Gly Val Tyr Gln 40 45 50 CCG GTG AAC TAC GCC AAC TTG ACC AGC CGC ATG GGC ACC CCG GCG CAG 522 Pro Val Asn Tyr Ala Asn Leu Thr Ser Arg Met Gly Thr Pro Ala Gln 55 60 65 CTG CAA AGC ATG ATC AGC GCC TGC CAT GCG GCC GGC GTT CGC GTC TAT 570 Leu Gln Ser Met Ile Ser Ala Cys His Ala Ala Gly Val Arg Val Tyr 70 75 80 85 GCC GAC ATC GTC GTC AAC CAG ATG GCC GAC GGC AGT GGC ACC GCC ACC 618 Ala Asp Ile Val Val Asn Gln Met Ala Asp Gly Ser Gly Thr Ala Thr 90 95 100 GAC GGC TCC ACC TGG AAT GCC GCG ACG CTG ACC TAC CCC TTC TTC AGC 666 Asp Gly Ser Thr Trp Asn Ala Ala Thr Leu Thr Tyr Pro Phe Phe Ser 105 110 115 GCC AAC GAC TTC CAC GCC AAT TGC GTC ATC AAT GAC GCC GAC TAC AAC 714 Ala Asn Asp Phe His Ala Asn Cys Val Ile Asn Asp Ala Asp Tyr Asn 120 125 130 TCC CCG GCC GGC CGC AGC AAT GTG CAG AAC TGC CGG CTC GGT GGA CTT 762 Ser Pro Ala Gly Arg Ser Asn Val Gln Asn Cys Arg Leu Gly Gly Leu 135 140 145 CCC GAC CTG GCG ACG GAG AGC AGC TAT GTG CAG GGC CAG ATC GTC AAC 810 Pro Asp Leu Ala Thr Glu Ser Ser Tyr Val Gln Gly Gln Ile Val Asn 150 155 160 165 TAT TTG AAG TCG CTG CTG GCA CTG GGC ATC GAC GGC TTT CGG ATT GAC 858 Tyr Leu Lys Ser Leu Leu Ala Leu Gly Ile Asp Gly Phe Arg Ile Asp 170 175 180 GCG GCC AAG CAC ATG CCG GCC AGT GCG TGG ACA TCG ATC ATG AGC GCC 906 Ala Ala Lys His Met Pro Ala Ser Ala Trp Thr Ser Ile Met Ser Ala 185 190 195 GTG AAG ACG GCC TAC CCC AAG ACG CTG CAG GGC GAG AAC ATC TGG CTG 954 Val Lys Thr Ala Tyr Pro Lys Thr Leu Gln Gly Glu Asn Ile Trp Leu 200 205 210 ACG CAG GAA ATC ATC AAC GAC GGC GAG GTG GAT CGG CCC AGC TAC TTC 1002 Thr Gln Glu Ile Ile Asn Asp Gly Glu Val Asp Arg Pro Ser Tyr Phe 215 220 225 CCC ATC GGC ACC ATC AAT GAA TTC CAG TTC ACC TAC GCC ATG CGC GAC 1050 Pro Ile Gly Thr Ile Asn Glu Phe Gln Phe Thr Tyr Ala Met Arg Asp 230 235 240 245 GTG TTC CGG GGC AAC AAC GGC AAC AGC CTC TCC AGC ATT CCC GGC ATC 1098 Val Phe Arg Gly Asn Asn Gly Asn Ser Leu Ser Ser Ile Pro Gly Ile 250 255 260 ATG GGC ACC TGG GGC AAT TGG GGC GGC AGC TGG GGC TTC ATC CAG CCG 1146 Met Gly Thr Trp Gly Asn Trp Gly Gly Ser Trp Gly Phe Ile Gln Pro 265 270 275 CAG AAC GCC ACC GTG TTC ATC ACC AAT TGG GAC ACG GAG CGC AAC GGC 1194 Gln Asn Ala Thr Val Phe Ile Thr Asn Trp Asp Thr Glu Arg Asn Gly 280 285 290 AGT TCG CTG AAC ATC AAC AAT GCG GCC GGC AAT GAC GCG GCC AAT CAG 1242 Ser Ser Leu Asn Ile Asn Asn Ala Ala Gly Asn Asp Ala Ala Asn Gln 295 300 305 CGC TAC ACG CTG GCC AAC ATC TTC ATG CTG GCG CAG GGC TAT GCG GAG 1290 Arg Tyr Thr Leu Ala Asn Ile Phe Met Leu Ala Gln Gly Tyr Ala Glu 310 315 320 325 GCG CAG CTT TAT TCC GGC TTC AAG TTC AGC AAC ACC GAC GCC GAC CGC 1338 Ala Gln Leu Tyr Ser Gly Phe Lys Phe Ser Asn Thr Asp Ala Asp Arg 330 335 340 CCC ACC ACC AGC CCC TAC TCC GGC GGC GTG CCG CAG ATC AAT GTG GTG 1386 Pro Thr Thr Ser Pro Tyr Ser Gly Gly Val Pro Gln Ile Asn Val Val 345 350 355 TGG GAC TTC GCG CAC CGC TGG ACG CCG CTG GCC AAC ATG GTG GGC TTT 1434 Trp Asp Phe Ala His Arg Trp Thr Pro Leu Ala Asn Met Val Gly Phe 360 365 370 CGC AAT GCC AGC ATC GGG CAG CCG CAG CAG AAC TGG ATC GTG GGC AAC 1482 Arg Asn Ala Ser Ile Gly Gln Pro Gln Gln Asn Trp Ile Val Gly Asn 375 380 385 AAC GGC AAC CAG GTG GCG TTC AGC CGC GGC AAT GTC GGC TTC GTA GCC 1530 Asn Gly Asn Gln Val Ala Phe Ser Arg Gly Asn Val Gly Phe Val Ala 390 395 400 405 TTG AAC AAC AGC GGT AGC GCG TGG ACG CGA AGC TTC GCG ACT GGA CTG 1578 Leu Asn Asn Ser Gly Ser Ala Trp Thr Arg Ser Phe Ala Thr Gly Leu 410 415 420 GCC GCA GGC ACC TAT TGC AAT GTC ATC AAT GGC ACG AAG AAC GCC GCG 1626 Ala Ala Gly Thr Tyr Cys Asn Val Ile Asn gly thr Lys Asn Ala Ala 425 430 435 GGC ACG GCC TGC ACG GCG GAC TCG GTG ACC GTG GAT GCC AGC GGC AAC 1674 Gly Thr Ala Cys Thr Ala Asp Ser Val Thr Val Asp Ala Ser Gly Asn 440 445 450 GCC AGC TTC ACC GTG CCG GCC AAC AAC AGC GGC AGC ACG CCT GCC GTG 1722 Ala Ser Phe Thr Val Pro Ala Asn Asn Ser Gly Ser Thr Pro Ala Val 455 460 465 GCG ATC TAC ACC GGC CAG AAG GTG ACG GGT GGT GGC GGG GGT GGC ACC 1770 Ala Ile Tyr Thr Gly Gln Lys Val Thr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Thr 470 475 480 485 GGC ACC TGC GCG GTG ACC TTC ACC ATT GCC AAT GCC AAC ACG GTG GTG 1818 Gly Thr Cys Ala Val Thr Phe Thr Ile Ala Asn Ala Asn Thr Val Val 490 495 500 GGC CAG AAC CTG CGT GTG GTG GGC AGT GTG ACC GGG CTG GGC GCC TGG 1866 Gly Gln Asn Leu Arg Val Val Gly Ser Val Thr Gly Leu Gly Ala Trp 505 510 515 GCG CCG GCC TCC GGC TTT GCA CTG ACG ATC CAG GGG TCC GGC GCC AAT 1914 Ala Pro Ala Ser Gly Phe Ala Leu Thr Ile Gln Gly Ser Gly Ala Asn 520 525 530 GTG CCT TGG AGT GGC ACC GTC ACG CTG CCG GCC GGC GCG GCG ATC CAG 1962 Val Pro Trp Ser Gly Thr Val Thr Leu Pro Ala Gly Ala Ala Ile Gln 535 540 545 AAC AAG TAT GTG AAG TGG AAT GGA TCG ACC GCA GTG TGG GAA AGC AAT 2010 Asn Lys Tyr Val Lys Trp Asn Gly Ser Thr Ala Val Trp Glu Ser Asn 550 555 560 565 CAG ACC ACC AGC AGC GGG AAT CGC GAG TTC ACC AGC TGC GCC AGC GGC 2058 Gln Thr Thr Ser Ser Gly Asn Arg Glu Phe Thr Ser Cys Ala Ser Gly 570 575 580 TCG CAG GCG CGG TCG GAC GGG AAC TTC AAG TTC TGA TGA GACGACTGGA 2107 Ser Gln Ala Arg Ser Asp Gly Asn Phe Lys Phe Opa Opa 585 590 TGGGGGCATC GCCCTCATCA GGCGTGGTGG CACCCGCGTA GGTGCCACCC GCCTTGGCCC 2167 CTGGCCGCTC AGACAAAGAG TTGGCGAAGC 2197

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 38/46 Ａ６１Ｋ 37/54 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/26 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列番号：２の配列中のアミノ酸番号１か
   らアミノ酸番号529で表されるアミノ酸配列をコードす
   る生澱粉分解酵素遺伝子。
2. 【請求項２】配列番号：２の配列中のアミノ酸番号−32
   からアミノ酸番号−１で表されるアミノ酸配列をコード
   するシグナルペプチドを更に５’−末端に有する請求項
   １記載の生澱粉分解酵素遺伝子。
3. 【請求項３】生澱粉分解酵素遺伝子と、該遺伝子の発現
   を促進する機能をコードするDNA配列を含んでなる組換
   え体DNAを有する微生物を培養し、培養物より生澱粉分
   解酵素を採取することを特徴とする生澱粉分解酵素の製
   造法。
4. 【請求項４】微生物が大腸菌（Escherichia coli）であ
   る請求項３記載の生澱粉分解酵素の製造法。
5. 【請求項５】遺伝子発現を促進する機能をコードするDN
   A配列が、配列番号：２の塩基番号96乃至塩基番号101、
   若しくは塩基番号110乃至塩基番号115で表される塩基配
   列をコードするプロモータ部位及び配列番号：２の塩基
   番号211乃至塩基番号215で表される塩基配列をコードす
   るSD配列部位である請求項３又は請求項４記載の製造
   法。