CN1346405A - 海藻糖合酶蛋白质、基因、质粒、微生物和生产海藻糖的方法 - Google Patents

海藻糖合酶蛋白质、基因、质粒、微生物和生产海藻糖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生产海藻糖的微生物和生产海藻糖的方法。本发明还涉及新的海藻糖合酶蛋白质、海藻糖合酶基因、携带所述海藻糖合酶基因的重组质粒以及用所述重组质粒转化的微生物。

Description

海藻糖合酶蛋白质、基因、质粒、微生物和 生产海藻糖的方法
发明背景
发明领域
本发明涉及生产海藻糖的微生物和生产海藻糖的方法。本发明还涉及新的海藻糖合酶蛋白质、海藻糖合酶基因、携带所述海藻糖合酶基因的重组质粒以及用所述重组质粒转化的微生物。
现有技术描述
海藻糖是一种非还原性二糖，是由α-1，1键相连的二糖：α-D-吡喃葡萄糖苷基-α-D-吡喃葡萄糖苷。海藻糖在医药、食品和化妆品领域有广泛的应用。但是，由于迄今为止其生产不足且昂贵，所以海藻糖的应用受到很大的限制。
日本特许公开专利Hei5-91890和Hei6-145186公开从酵母中提取海藻糖的方法。有数种方法可用于从发酵的微生物培养物，例如节杆菌属(T.Suzuki，Agric.Biol.Chem.，33(2)，1969)、诺卡菌属(日本特许公开专利Sho50-154485)、微球菌属(日本特许公开专利Hei6-319578)、氨基酸发酵性酵母、短杆菌属(日本特许公开专利Hei5-211882)和酵母(Yoshikwa等，Biosci.Biotech.Biochem.，1994，58，1226-12300)中分离海藻糖。另外，在M.Scher的食品加工(FoodProcessing，4月，95-96，1993)中描述了用含有能够将葡萄糖转变成海藻糖的细菌基因的重组植物生产海藻糖的方法。日本特许公开专利83-216695公开了用麦芽糖磷酸化酶和海藻糖磷酸化酶将麦芽糖转变成海藻糖的方法。但是，这些方法不太有效，因为其生产过程复杂且产率低。
最近公开了一些酶促方法。日本特许公开专利Hei7-143876和EPO628630 A2公开两步酶促转变法，其中通过麦芽寡糖基海藻糖(maltooligosyl trehalose)合酶和麦芽寡糖基海藻糖海藻糖水解酶将淀粉转变成海藻糖。日本特许公开专利Hei7-170977和韩国特许公开专利95-3444公开了一步酶促转变法，其中通过海藻糖合酶将麦芽糖直接转变成海藻糖。但是，仍然需要提高海藻糖合酶的滴度以便在产率和成本方面使得从麦芽糖中生产海藻糖更有效。
在过去数年间，我们投入了很大的努力以便从土壤中分离出能够将麦芽糖转变成海藻糖的微生物。我们已经成功地筛选出一个新菌株，它可以高度表达海藻糖，而意想不到的是不产生任何副产品，这与所有已知的微生物都不同。其形态学和生理学特征表明该菌株是一个新的司徒茨氏假单胞菌菌株(Pseudomonas stutzeri)。已将该菌株命名为司徒茨氏假单胞菌CJ38。
我们从司徒茨氏假单胞菌CJ38的染色体中分离了海藻糖合酶的基因，并通过用限制酶Sau3AI将其克隆到已知载体pUC18中而确定了其核苷酸序列。另外，还从司徒茨氏假单胞菌CJ38中分离了海藻糖合酶蛋白质并用标准方法确定了其氨基酸序列。还发现这些序列明显不同于迄今为止已知的海藻糖合酶基因和所有蛋白质的序列。本发明构建了携带海藻糖合酶基因的重组质粒以便大量表达由所述基因编码的海藻糖合酶。
发明概述
本发明提供了一种从麦芽糖生产海藻糖的新微生物，司徒茨氏假单胞菌CJ38。根据布达佩斯条约，该菌株于1999年2月12日被保藏在韩国汉城的韩国微生物培养中心，保藏号为KCCM10150。由于在将麦芽糖转变成海藻糖时，该菌株不产生副产品如葡萄糖，因此，它是非常有价值的。本发明还提供了具有下列氨基酸序列的新的海藻糖合酶蛋白质：Met Ser Ile Pro Asp Asn Thr Tyr Ile Glu Trp Leu Val Ser Gln
              5                  10                  15Ser Met Leu His Ala Ala Arg Glu Arg Ser Arg His Tyr Ala Gly
             20                  25                  30Gln Ala Arg Leu Trp Gln Arg Pro Try Ala Gln Ala Arg Pro Arg
             35                  40                  45Asp Ala Ser Ala Ile Ala Ser Val Trp Phe Thr Ala Tyr Pro Ala
             50                  55                  60Ala Ile Ile Thr Pro Glu Gly Gly Thr Val Leu Glu Ala Leu Gly
             65                  70                  75Asp Asp Arg Leu Trp Ser Ala Leu Ser Glu Leu Gly Val Gln Gly
             80                  85                  90Ile His Asn Gly Pro Met Lys Arg Ser Gly Gly Leu Arg Gly Arg
             95                 100                 105Glu Phe Thr Pro Thr Ile Asp Gly Asn Phe Asp Arg Ile Ser Phe
            110                 115                 120Asp Ile Asp Pro Ser Leu Gly Thr Glu Glu Gln Met Leu Gln Leu
            125                 130                 135Ser Arg Val Ala Ala Ala His Asn Ala Ile Val Ile Asp Asp Ile
            140                 145                 150Val Pro Ala His Thr Gly Lys Gly Ala Asp Phe Arg Leu Ala Glu
            155                 160                 165Met Ala Tyr Gly Asp Tyr Pro Gly Leu Tyr His Met Val Glu Ile
            170                 175                 180Arg Glu Glu Asp Trp Glu Leu Leu Pro Glu Val Pro Ala Gly Arg
            185                 190                 195Asp Ser Val Asn Leu Leu Pro Pro Val Val Asp Arg Leu Lys Glu
            200                 205                 210Lys His Tyr Ile Val Gly Gln Leu Gln Arg Val Ile Phe Phe Glu
            215                 220                 225Pro Gly Ile Lys Asp Thr Asp Trp Ser Val Thr Gly Glu Val Thr
            230                 235                 240Gly Val Asp Gly Lys Val Arg Arg Trp Val Tyr Leu His Tyr Phe
            245                 250                 255Lys Glu Gly Gln Pro Ser Leu Asn Trp Leu Asp Pro Thr Phe Ala
            260                 265                 270Ala Gln Gln Leu Ile Ile Gly Asp Ala Leu His Ala Ile Asp Val
            275                 280                 285Thr Gly Ala Arg Val Leu Arg Leu Asp Ala Asn Gly Phe Leu Gly
            290                 295                 300Val Glu Arg Arg Ala Glu Gly Thr Ala Trp Ser Glu Gly His Pro
            305                 310                 315Leu Ser Val Thr Gly Asn Gln Leu Leu Ala Gly Ala Ile Arg Lys
            320                 325                 330Ala Gly Gly Phe Ser Phe Gln Glu Leu Asn Leu Thr Ile Asp Asp
            335                 340                 345Ile Ala Ala Met Ser His Gly Gly Ala Asp Leu Ser Tyr Asp Phe
            350                 355                 360Ile Thr Arg Pro Ala Tyr His His Ala Leu Leu Thr Gly Asp Thr
            365                 370                 375Glu Phe Leu Arg Met Met Leu Arg Glu Val His Ala Phe Gly Ile
            380                 385                 390Asp Pro Ala Ser Leu Ile His Ala Leu Gln Asn His Asp Glu Leu
            395                 400                 405Thr Leu Glu Leu Val His Phe Trp Thr Leu His Ala Tyr Asp His
            410                 415                 420Tyr His Tyr Lys Gly Gln Thr Leu Pro Gly Gly His Leu Arg Glu
            425                 430                 435His Ile Arg Glu Glu Met Tyr Glu Arg Leu Thr Gly Glu His Ala
            440                 445                 450Pro Tyr Asn Leu Lys Phe Val Thr Asn Gly Val Ser Cys Thr Thr
            455                 460                 465Ala Ser Val Ile Ala Ala Ala Leu Asn Ile Arg Asp Leu Asp Ala
            470                 475                 480Ile Gly Pro Ala Glu Val Glu Gln Ile Gln Arg Leu His Ile Leu
            485                 490                 495Leu Val Met Phe Asn Ala Met Gln Pro Gly Val Phe Ala Leu Ser
            500                 505                 510Gly Trp Asp Leu Val Gly Ala Leu Pro Leu Ala Pro Glu Gln Val
            515                 520                 525Glu His Leu Met Gly Asp Gly Asp Thr Arg Trp Ile Asn Arg Gly
            530                 535                 540Gly Tyr Asp Leu Ala Asp Leu Ala Pro Glu Ala Ser Val Ser Ala
            545                 550                 555Glu Gly Leu Pro Lys Ala Arg Ser Leu Tyr Gly Ser Leu Ala Glu
            560                 565                 570Gln Leu Gln Arg Pro Gly Ser Phe Ala Cys Gln Leu Lys Arg Ile
            575                 580                 585Leu Ser Val Arg Gln Ala Tyr Asp Ile Ala Ala Ser Lys Gln Ile
            590                 595                 600Leu Ile Pro Asp Val Gln Ala Pro Gly Leu Leu Val Met Val His
            605                 610                 615Glu Leu Pro Ala Gly Lys Gly Val Gln Leu Thr Ala Leu Asn Phe
            620                 625                 630Ser Ala Glu Pro Val Ser Glu Thr Ile Cys Leu Pro Gly Val Ala
            635                 640                 645Pro Gly Pro Val Val Asp Ile Ile His Glu Ser Val Glu Gly Asp
            650                 655                 660Leu Thr Asp Asn Cys Glu Leu Gln Ile Asn Leu Asp Pro Tyr Glu
            665                 670                 675Gly Leu Ala Leu Arg Val Val Ser Ala Ala Pro Pro Val Ile
            680                 685另外，本发明还提供了具有下列核苷酸序列的新的海藻糖合酶基因：GATCGCTGGC  GTACTGCAGG  TAGAGCAGGC  GCATCGGCCC  CCAGGGCGCA  TCGGCCGGCT           60CCGCTGTGCC  CTGCTGGTTC  ATGAAGCGGA  CGAAGCGGCC  ATCGCGGAAC  CGTGGACGCC          120ATTCGGGGCT  GTCCGGGTCG  CGGCTGTCGG  TGAGCGTGCG  CCACAGGTCG  CTGCGAAACG          180GCGGACCGCT  CCAAAGCGCG  CCGTGGATGG  GATCGCCGAG  CAGTTCGTGC  AGCTCCCAGG          240AACGTTGCGA  ATGCAGCGCG  CCGAGGCTCA  GGCCATGCAG  ATACAGGCGC  GGTCGGCGTT          300CGGCCGGCAG  TTCGGTCCAG  TAGCCATAGA  TCTCGGCGAA  TAGCGCGCGG  GCCACGTCGC          360GGCCGTAGTC  GGCCTCCACC  AGCAGCGCCA  GCGGGCTGTT  CAGATAGGAG  TACTGCAACG          420CCACGCTGGC  GATATCGCCG  TGGTGCAGGT  ATTCCACTGC  GTTCATCGCC  GCCGGGTCGA          480TCCAGCCGGT  ACCGGTGGGC  GTCACCAGCA  CCAGCACCGA  TCGCTCGAAG  GCGCCGCTGC          540GCTGCAGCTC  GCGCAAGGCC  AGACGCGCCC  GCTGGCGCGG  GGTCTCTGCC  GCGCGCAGAC          600CGACGTAGAC  CCGAATCGGC  TCGAGCGCCG  AGCGGCCGCT  CAAGACGCTG  ATATCCGCCG          660CCGACGGGCC  GGAGCCGATG  AACTCGCGGC  CGGTGCGGCC  CAGCTCCTCC  CAGCGCAGCA          720ACGAGGCCCG  GCTGCCGCTT  TTCAGCGGCG  AGGCCGGTGG  CGCCGTCTCC  GGTTCGATCA          780GGGCGTCGTA  CTGCGCGAAG  GATGCGTCCA  GCATGCGCAG  TGCCCGCGCC  GCCAGCACAT          840CGCTGAGCAG  CGACCAGAAC  AGCGCCAGCG  CCACCAGCAC  GCCGATCACG  TTGGCCAGGC          900GCCGTGGCAG  CACGCGGTCG  GCGTGCCGCG  AGACGAAGCG  CGACACCAGC  CGATACAGAC          960GCGCCAGCGT  CAGCAGGATG  AGAAAGGTCG  CCAGCGCGGT  GAGAATGACT  TCGAGCAGGT         1020GCGCACTGCT  CACCGGCGGC  ATGCCCATCA  GCGCGCGTAC  CGCGTTCTGC  CAGCCGGCGA         1080CCTGGCTGAG  GAAATACCCG  GCCAGCAGCA  GGCAGCCGAC  CGCGATCAGC  AGATTGACCC         1140GCTCGCGCTG  CCAGCCTGGG  CGCTCCGGCA  GTTCCAGATA  GCGCCACAGC  CAGCGCCAGA         1200ACACGCCGAG  GCCATAGCCC  ACCGCCAGCG  CCGCGCCGGC  CAGCACGCCC  TGGCTCAGCG         1260TCGAGCGCGG  CAGCAGCGAT  GGCGTCAGCG  CCGCGCAGAA  GAACAGCGTG  CCCAGCAGCA         1320GGCCGAAACC  GGACAGCGAG  CGCCAGATAT  AGAGGACGGG  CAGGTGCAGC  ATGAAGATCT         1380CCGCGGTCGG  GTGACGGCGT  CGCGCCTCGG  CATATCGAGG  CGTGTCCGGT  CGTGCGGTTC         1440CCGTGATGGT  CCGCAGCAGG  CCAATCCGAT  GCAACGATGG  CCGAGCGGCC  GACTCAAACG         1500TCTACATTTC  CCTAGTGCTG  CCGGAACCGA  TCGCCG                                     1536ATG  AGC  ATC  CCA  GAC  AAC  ACC  TAT  ATC  GAA  TGG  CTG  GTC  AGC  CAG  TCC 1584ATG  CTG  CAT  GCG  GCC  CGC  GAG  CGG  TCG  CGT  CAT  TAC  GCC  GGC  CAG  GCG 1632CGT  CTC  TGG  CAG  CGG  CCT  TAT  GCC  CAG  GCC  CGC  CCG  CGC  GAT  GCC  AGC 1680GCC  ATC  GCC  TCG  GTG  TGG  TTC  ACC  GCC  TAT  CCG  GCG  GCC  ATC  ATC  ACG 1728CCG  GAA  GGC  GGC  ACG  GTA  CTC  GAG  GCC  CTC  GGC  GAC  GAC  CGC  CTC  TGG 1776AGT  GCG  CTC  TCC  GAA  CTC  GGC  GTG  CAG  GGC  ATC  CAC  AAC  GGG  CCG  ATG      1824AAG  CGT  TCC  GGT  GGC  CTG  CGC  GGA  CGC  GAG  TTC  ACC  CCG  ACC  ATC  GAC      1872GGC  AAC  TTC  GAC  CGC  ATC  AGC  TTC  GAT  ATC  GAC  CCG  AGC  CTG  GGG  ACC      1920GAG  GAG  CAG  ATG  CTG  CAG  CTC  AGC  CGG  GTG  GCC  GCG  GCG  CAC  AAC  GCC      1968ATC  GTC  ATC  GAC  GAC  ATC  GTG  CCG  CCA  CAC  ACC  GGC  AAG  GGT  GCC  GAC      2016TTC  CGC  CTC  GCG  GAA  ATG  CCC  TAT  GGC  GAC  TAC  CCC  GGG  CTG  TAC  CAC      2064ATG GTG   GAA  ATC  CGC  GAG  GAG  GAC  TGG  GAG  CTG  CTG  CCC  GAG  GTG  CCG      2112GCC  GGG  CGT  GAT  TCG  GTC  AAC  CTG  CTG  CCG  CCG  GTG  GTC  GAC  CGG  CTC      2160AAG  GAA  AAG  CAC  TAC  ATC  GTC  GGC  CAG  CTG  CAG  CGG  GTG  ATC  TTC  TTC      2208GAG  CCG  GGC  ATC  AAG  GAC  ACC  GAC  TGG  AGC  GTC  ACC  GGC  GAG  GTC  ACC      2256GGG  GTC  GAC  GGC  AAG  GTG  CGT  CGC  TGG  GTC  TAT  CTG  CAC  TAC  TTC  AAG      2304GAG  GGC  CAG  CCG  TCG  CTG  AAC  TGG  CTC  GAC  CCG  ACC  TTC  GCC  GCG  CAG      2352CAG  CTG  ATC  ATC  GGC  GAT  GCG  CTG  CAC  GCC  ATC  GAC  GTC  ACC  GGC  GCC      2400CGG  GTG  CTG  CGC  CTG  GAC  GCC  AAC  GGC  TTC  CTC  GGC  GTG  GAA  CGG  CGC      2448GCC  GAG  GGC  ACG  GCC  TGG  TCG  GAG  GGC  CAC  CCG  CTG  TCC  GTC  ACC  GGC      2496AAC  CAG  CTG  CTC  GCC  GGG  GCG  ATC  CGC  AAG  GCC  GGC  GGC  TTC  AGC  TTC      2544CAG  GAG  CTG  AAC  CTG  ACC  ATC  GAT  GAC  ATC  GCC  GCC  ATG  TCC  CAC  GGC      2592GGG  GCC  GAT  CTG  TCC  TAC  GAC  TTC  ATC  ACC  CGC  CCG  GCC  TAT  CAC  CAT      2640GCG  TTG  CTC  ACC  GGC  GAT  ACC  GAA  TTC  CTG  CGC  ATG  ATG  CTG  CGC  GAA      2688GTG  CAC  GCC  TTC  GGC  ATC  GAC  CCG  GCG  TCA  CTG  ATC  CAT  GCG  CTG  CAG      2736AAC  CAT  GAC  GAG  TTG  ACC  CTG  GAG  CTG  GTG  CAC  TTC  TGG  ACG  CTG  CAC      2784GCC  TAC  GAC  CAT  TAC  CAC  TAC  AAG  GGC  CAG  ACC  CTG  CCC  GCC  GGC  CAC      2832CTG  CGC  GAA  CAT  ATC  CGC  GAG  GAA  ATG  TAC  GAG  CGG  CTG  ACC  GGC  GAA      2880CAC  GCG  CCG  TAC  AAC  CTC  AAG  TTC  GTC  ACC  AAC  GGG  GTG  TCC  TGC  ACC      2928ACC  GCC  AGC  GTG  ATC  GCC  GCG  GCG  CTT  AAC  ATC  CGT  GAT  CTG  GAC  GCC      2976ATC  GGC  CCG  GCC  GAG  GTG  GAG  CAG  ATC  CAG  CGT  CTG  CAT  ATC  CTG  CTG      3024GTG  ATG  TTC  AAT  GCC  ATG  CAG  CCC  GGC  GTG  TTC  GCC  CTC  TCC  GGC  TGG      3072GAT  CTG  GTC  GGC  GCC  CTG  CCG  CTG  GCG  CCC  GAG  CAG  GTC  GAG  CAC  CTG      3120ATG  GGC  GAT  GGC  GAT  ACC  CGC  TGG  ATC  AAT  CGC  GGC  GGC  TAT  GAC  CTC      3168GCC  GAT  CTG  GCG  CCG  GAG  GCG  TCG  GTC  TCC  GCC  GAA  GGC  CTG  CCC  AAG      3216GCC  CGC  TCG  CTG  TAC  GGC  AGC  CTG  GCC  GAG  CAG  CTG  CAG  CGG  CCA  GGC      3264TCC  TTC  GCC  TGC  CAG  CTC  AAG  CGC  ATC  CTC  AGC  GTG  CGC  CAG  GCC  TAC      3312GAC  ATC  GCT  GCC  AGC  AAG  CAG  ATC  CTG  ATT  CCG  GAT  GTG  CAG  GCG  CCG      3360GGA  CTC  CTG  GTG  ATG  GTC  CAC  GAG  CTG  CCT  GCC  GGC  AAG  GGC  GTG  CAG      3408CTC  ACG  GCA  CTG  AAC  TTC  AGC  GCC  GAG  CCG  GTC  AGC  GAG  ACC  ATC  TGC      3456CTG  CCC  GGC  GTG  GCG  CCC  GGC  CCG  GTG  GTG  GAC  ATC  ATT  CAC  GAG  AGT      3504GTG  GAG  GGC  GAC  CTC  ACC  GAC  AAC  TGC  GAG  CTG  CAG  ATC  AAC  CTC  GAC      3552CCG  TAC  GAG  GGG  CTT  GCC  CTG  CGT  GTG  GTG  AGC  GCC  GCG  CCG  CCG  GTG      3600ATC  TGA  GCGC                                                                      3610CCTCTTCGCG  CGCCCCGGGT  CCGCCGCTAT  AGTGCGCAGC  GCCTGGGGCG  CGCATTGCCC              3670TCGCCGTCGA  GACCAGCCCG  TGTCGTTCAC  TTCGCTTTTC  CGCCTTGCGC  TGCTGCCGCT              3730GGCGCTGCTT  GCCGCACCCG  TCTGGGCGCA  GACCGCCTGC  CCGCCCGGCC  AGCAGCCGAT              3790CTGCCTGAGC  GGCAGCTGCC  TCTGCGTGCC  GGCCGCCGCC  AGCGATCCAC  AGGCGGTCTA              3850CGACCGCGTG  CAGCGTATGG  CTACGCTGGC  CCTGCAGAAC  TGGATCCAGC  AGTCGCGCGA              3910CCGCCTGATG  GCCGGCGGCG  TCGAGCCGAT  ACCGCTGCAC  ATCCGCTCGC  AGCTCGAGCC              3970GTATTTCGAT  CTTGCCGTGC  TGGAGAGTGC  GCGGTACCGC  GTCGGCGACG  AGGTGGTGCT              4030GACTGCCGGC  AACACCCTGC  TGCGCAACCC  GGACGTCAAT  GCCGTGACCC  TGATCGACGT              4090CATCGTCTTC  CGCCACGAGG  AGGATGCCCG  GGACAACGTC  GCGCTCTGGG  CCCATGAGCT              4150CAAGCACGTC  GAGCAATATC  TGGACTGGGG  CGTCGCCGAG  TTCGCCCGGC  GCTATACGCA              4210GGATTTCCGT  GCCGTGGAGC  GCCCGGCCTA  TGCGCTGGAG  CGTGAGGTGG  AAGAGGCCCT              4270GCGCGAGACG  CAGACGCGGC  GCTGAGCGAG  CTGATCGGTG  CTGCTGCCCG  CACTGGGCTG              4330AAGCCCACCA  ATGACGCCGG  CGAAAACGAA  AAACCCCGCC  GAGGCGGGGT  TTCTGACGCG              4390GGTTGTGCGG  TCAGCTCAGA  ACGCCGGGAC  CACGGCGCCC  TTGTACTTTT  CCTCGATGAA              4450CTGGCGTACT  TGCTCGCTGT  GCAGCGCGGC  AGCCAGTTTC  TGCATGGCAT  CGCTGTCCTT              4510GTTGTCCGGA  CGGGCGACCA  GAATGTTCAC  GTATGGCGAG  TCGCTGCCCT  CGATCACCAG              4570GGCGTCCTGG  GTCGGGTTCA  GCTTGGCTTC  CAGCGCGTAG  TTGGTGTTGA  TCAGCGCCAG              4630GTCGACCTGG  GTCAGCACGC  GCGGCAGAGT  CGCGGCTTCC  AGTTCGCGGA  TCTTGATCTT              4690CTTCGGGTTC  TCGGCGATGT  CTTCGGCGTG  GCGGTGATGC  CCGCGCCGTC  CTTCAGACCG              4750ATC                                                                                 4753
本发明还提供了携带具有上述核苷酸序列的海藻糖合酶基因的重组质粒。在优选的实施方案中，本发明提供了重组质粒pCJ104，其中将本发明海藻糖合酶基因的4.7kb Sau3AI DNA片段克隆到载体质粒pUC18中。这样可以有效且高水平表达海藻糖合酶基因。在更优选的实施方案中，本发明提供了重组质粒pCJ122，其中在载体质粒pUC18中含有本发明海藻糖合酶基因的2.5kb BamHI-BglII DNA片段，这样可以更高水平表达海藻糖合酶基因。
本发明提供了用重组质粒转化的大肠杆菌，所述重组质粒含有具有上述核苷酸序列的海藻糖合酶基因。在优选的实施方案中，本发明提供了用重组质粒pCJ104转化的大肠杆菌，这样可以高水平生产海藻糖合酶蛋白质。在更优选的实施方案中，本发明提供了用重组质粒pCJ122转化的大肠杆菌，这样可以以更高的水平生产海藻糖合酶蛋白质。
本发明提供了生产海藻糖的方法，该方法包括将具有上述氨基酸序列的海藻糖合酶蛋白质与麦芽糖溶液反应得到海藻糖。
本发明提供了生产海藻糖的方法，该方法包括破碎用含有海藻糖合酶基因的重组质粒转化的大肠杆菌，所述海藻糖合酶基因具上述核苷酸序列，然后将破碎的细胞与麦芽糖溶液反应得到海藻糖。在优选的实施方案中，本发明提供了生产海藻糖的方法，该方法包括破碎用质粒pCJ104转化的大肠杆菌，将破碎的细胞离心，然后将所得的上清液与麦芽糖溶液反应得到海藻糖。在更优选的实施方案中，本发明提供了生产海藻糖的方法，该方法包括破碎用质粒pCJ122转化的大肠杆菌，将破碎的细胞离心，然后将所得的上清液与麦芽糖溶液反应得到海藻糖。
附图简述
图1用薄层层析对含有司徒茨氏假单胞菌CJ38的声处理液和麦芽糖溶液的反应溶液进行糖分析。G、M和T分别代表葡萄糖、麦芽糖和海藻糖。
图2表示用气相层析对含有司徒茨氏假单胞菌CJ38的声处理液和麦芽糖溶液的反应溶液(A)以及标准海藻糖样品(B)进行糖分析。Tre代表海藻糖。
图3表示用高效液相层析对标准海藻糖样品(A)和样品(B)和(C)进行糖分析。在含司徒茨氏假单胞菌CJ38的声处理液和麦芽糖溶液的溶液完全反应后得到样品(B)。在含司徒茨氏假单胞菌CJ38的声处理液和麦芽糖溶液的溶液反应完成后，通过将海藻糖酶加到反应溶液中得到样品(C)。符号Tre、Mal和Glu分别代表海藻糖、麦芽糖和葡萄糖。
图4表示含本发明海藻糖合酶基因的重组质粒pCJ104的构建图。
图5表示在本发明重组质粒pCJ104中的4.7kb Sau3AI片段的限制图谱。
图6表示本发明重组质粒pCJ121和pCJ122的构建图。
发明详述
从土壤中分离了可通过海藻糖合酶从麦芽糖生产海藻糖的微生物，并鉴定其具有司徒茨氏假单胞菌的形态学和生理学特征。尚没有报道司徒茨氏假单胞菌可将麦芽糖转变成海藻糖。因此，我们分离的微生物可以被认为是一个新的司徒茨氏假单胞菌菌株并已命名为司徒茨氏假单胞菌CJ38。
我们用各种限制酶构建了本发明重组质粒pCJ104的限制图谱。已知两种海藻糖合酶基因序列(Biochim.Biophys.Acta 1996，1290，1-3和Biochim.Biophys.Acta 1997，1334，28-32)。将本发明与已知的限制图谱比较，表明pCJ104与已知的图谱不同。
来自已知微生物的海藻糖合酶蛋白质在N-末端相似。但是发现本发明海藻糖合酶蛋白质的N-末端序列与已知海藻糖合酶蛋白质的N-末端不同。结果列于下列表1。
       表1海藻糖合酶蛋白质的N-末端序列
    海藻糖合酶的来源     N-末端序列
  已知微生物   栖热水生菌ATCC 33923     M-D-P-L-W-Y-K-D-A-V-I-Y-Q-
  脂肪杆菌R48  S-T-V-L-G-E-E-P-E-W-F-R-T-A-V-F-Y-E-
恶臭假单胞菌H262     G-K-W-P-R-P-A-A-F-I-D-
  本发明的转化的大肠杆菌     S-I-P-D-N-T-Y-I-E-W-L-V-
确定在本发明重组质粒pCJ104内的4.7kb Sau3AI片段的核苷酸序列和由其表达的海藻糖合酶蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。
另外，将本发明海藻糖合酶蛋白质的完整序列与Biochim.Biophys.Acta 1996，1290，1-3和Biochim.Biophys.Acta 1997，1334，28-32中公开的海藻糖合酶蛋白质的序列进行比较。比较结果表明它们之间没有相似性。
用含重组质粒pCJ104或pCJ122的破碎的大肠杆菌转化体完成酶促转变反应。结果，来自本发明破碎细胞的海藻糖合酶的滴度显著高于野生型司徒茨氏假单胞菌CJ38的滴度。
下列表2中列出了本发明所用和制备的质粒和微生物的特性和获得途径。
    表2
微生物和质粒     特性   获得途径
  司徒茨氏假单胞菌CJ38   生产本发明海藻糖合酶的野生型菌株 KFCC-10985
  大肠杆菌NM522  hsdΔ5，Δ(lac-pro)[F’，Pro+，lacIqZΔM15]   Amersham
  大肠杆菌ATCC3 5467     [malP，Q∷Tn5 ompBCS1 F-araD139A(argF-lac)205U169 rpsL150relA1 flbB5301 deoCl ptsF25]    ATCC
    pCJ104 含4.7kb Sau3AI DNA片段(海藻糖合酶基因)的pUC18，Apr   构建的
    pCJ121 含3.35kb KpnI DNA片段(海藻糖合酶基因)的pUC18，Apr   构建的(对照)
    pCJ122 含2.5kb BamHI-BglII DNA片段(海藻糖合酶基因)的pUC18，Apr   构建的
    pCJ123   含1.2kb BamHI-EcoRI DNA片段的pUC18   构建的(对照)
   pUC18和pUC19           Apr，2.7kb   新英格兰生物实验室
营养培养基(0.3％肉汤，0.5％胨，pH 6.8)和LB培养基(1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，pH 7.0)分别用于培养司徒茨氏假单胞菌和大肠杆菌。为了培养通过电穿孔转化的细胞，使用SOC培养基(2％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，10mM NaCl，2.5mM KCl，10mM MgCl2，10mM MgSO4，20mM葡萄糖)。在克隆海藻糖合酶基因时使用MacConkey琼脂培养基(4％细菌培养用Macconkey琼脂基，2.0％麦芽糖，pH 7.0)。加入浓度为50mg/L的氨苄青霉素。在通过电穿孔转化大肠杆菌时使用Gene Pulser(Bio-Rad)。按照《分子克隆，实验室操作手册》(Molecular Cloning，Laboratory Manual，第2版，Sambrook，J.，E.F.Frishc和T.Maniatis)和《分子克隆技术指南》(Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods in Enzymol.Vol.152，Berger，S.L，A.R.Kimme)中所述的方法完成本发明中使用的遗传操作。
酶促反应在pH 6.0-7.0，优选pH 7.0-10，温度4℃-45℃，优选20℃-40℃下完成。麦芽糖在浓度小于50％时可作为底物。海藻糖合酶可以纯的形式或在破碎细胞中使用。
下列实施例具体说明本发明。从前述和下列实施例可以确信本领域技术人员完全能够完成本发明。实施例1
筛选微生物
将一铂环从土壤中分离的微生物接种到含50毫升LB培养溶液(0.5％酵母提取物，1.0％细菌用胰蛋白胨，0.5％盐)的500毫升锥形烧瓶中，然后在28℃培养2天。将培养液在4℃、8000rpm下离心5分钟。收集细胞，然后用生理盐水洗涤。将洗涤过的细胞悬浮在10毫升磷酸盐缓冲液(10mM，pH 7.0)中。用超声仪将细胞破碎，然后将破碎的细胞在4℃、1200rpm离心20分钟，上清液作为粗的酶溶液。用Bredford方法确定粗酶溶液中的蛋白质浓度。将100微克蛋白质与20微升100mM麦芽糖和10微升100mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)混合。将蒸馏水加到混合物中直到总体积达到100微升，反应在30℃进行20小时。用TLC、HPLC和GC分析反应溶液中的糖。实施例2
用薄层层析分析海藻糖(图1)
反应完成后，将5微升反应溶液加到Kieselgel 60 TLC(Merck，Germany)上，放在含正丁醇-吡啶-水(7∶3∶1)溶剂体系的容器中展开样品。喷20％硫酸的甲醇溶液，然后在110℃干燥10分钟。由此确定样品中的糖。在所研究的至少1000种土壤微生物中，确定有两种可将麦芽糖转变成海藻糖。图1表示在反应前的样品中不存在海藻糖，但在反应完成后，在标准海藻糖样品的位点上可检测到糖。实施例3
用气相层析分析海藻糖(图2)
反应完成后，用减压干燥器将10微升反应溶液干燥。将干燥的产物溶解于20微升二甲基甲酰胺中，将所得溶液与相同体积的双(三甲基)三氟乙酰胺混合形成三甲基硅烷衍生物。将1微升样品用于GC分析。如图2所示，在与标准海藻糖样品相同的时间点观察到反应溶液的峰。实施例4
用高效液相层析分析海藻糖(图3)
反应完成后，将一半反应溶液与相同体积的苯酚混合除去蛋白质。将由此得到的样品溶液用于HPLC分析。在与标准海藻糖样品相同的时间点观察到样品的峰。将剩下的一半反应溶液加热到100℃，10分钟以除去酶活性。其与特异性作用于α-1，1-海藻糖的海藻糖酶(Sigma)在37℃反应10分钟。反应完成后，将溶液与相同体积的苯酚溶液混合以除去蛋白质。将由此所得的溶液用于HPLC，结果在与标准海藻糖相同的时间点不出现峰。实施例5
鉴定能够将麦芽糖转变成海藻糖的微生物
通过电子显微镜观察本发明的土壤微生物，所述微生物是带有鞭毛的棒形细菌。其通过O/F试验被鉴定为需氧细菌，并且是革兰氏阴性菌。表1中总结了所述微生物的生理学特征。将本发明微生物的这些特征与Bergy’s Manual of Systemic Bacteriology，1984和专利文献中描述的微生物进行比较，将本发明的微生物鉴定为司徒茨氏假单胞菌，因为其与该种微生物在生理学和形态学上最相近。
                        表1
DP3  -URE  -MLT  +INO  -ARA  -TLA  - OFG+CIT+MAN+ADO-GLU- GC+MAL+XYL-COU-ARG- ACE-TDA-RAF-H2S-LYS- ESC-PXB-SOR-ONP-ORN- PLI-LAC-SUC-RHA-OXI-
实施例6
克隆海藻糖合酶基因(图4)
(1)从司徒茨氏假单胞菌分离染色体DNA
让司徒茨氏假单胞菌在营养培养基中生长，在静止期早期，离心回收细胞。将回收的细胞用TE溶液(10mM Tris-HCl，pH 8.0，1mMEDTA，pH 8.0)洗涤两次。将洗涤的细胞悬浮在20毫升STE缓冲液(20％蔗糖，10mM Tris，pH 8.0，1mM EDTA，pH 8.0)中，将5mg/mL溶菌酶和RNase A加到悬浮液中。在37℃反应2小时。反应完成后，将SDS加到浓度为1％，然后在37℃继续反应30分钟。将该溶液与相同体积的苯酚反应4小时，然后离心。将5M NaCl加到所得的上清液中直到其浓度达到0.1M。用玻璃棒，加入2倍体积的无水乙醇得到染色体DNA。将染色体DNA用70％乙醇洗涤，然后溶于TE溶液用于接下来的试验。
(2)制备基因组文库
在37℃，将从司徒茨氏假单胞菌分离的纯染色体DNA用限制酶Sau3AI部分消化15-30分钟。加热使限制酶失活，完成琼脂糖凝胶电泳以得到3-10 kb DNA片段。如图5所示，将质粒pUC18用BamHI消化，然后用牛肠磷酸酶处理。将裂解的DNA与预先得到的3-10kbDNA片段混合，在15℃用T4 DNA连接酶连接16小时。将由此所得的重组体用于转化。按如下所述通过电穿孔完成转化。将大肠杆菌NM522在LB培养基中培养14-15小时。将所得的培养物接种在1升LB上以便开始在600nm的吸收值为0.07-0.1，然后进行培养直到吸收值为0.8。将细胞离心，然后悬浮在1升HEPES[N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(2-乙烷磺酸)]缓冲液中。再将细胞离心，并悬浮在500毫升冷无菌去离子蒸馏水中。再将细胞离心，然后悬浮于20毫升10％甘油溶液。再将细胞离心，然后悬浮于2-3毫升10％甘油溶液以便将细胞浓度调整到2-4×1，010/ml。将细胞悬浮液快速冷冻，于-70℃保存。冷冻的细胞可在约一个月的时间使用，在此期间其转化频率不会降低。将40微升冷冻细胞悬浮液在冰中融解，将复原的悬浮液与已连接的DNA溶液混合。将混合物放在直径为0.2cm的基因脉冲仪杯中，将电场的电容和强度分别固定在25uF和12.5kV/cm。在电阻为200-400Ω通过一个电脉冲后，立即加入1毫升SOC培养基并在37℃培养1小时。在LB-氨苄青霉素琼脂培养基上对培养物划线，然后培养24小时得到至少5万个菌落。将这些菌落一起在LB肉汤中培养2小时。用碱溶解分离纯DNA，然后由此构建基因组文库。
(3)海藻糖合酶基因的克隆
通过电穿孔用上述得到的基因组文库转化不能以麦芽糖作为碳源的大肠杆菌ATCC35467。在含20g/L麦芽糖的MacConkey-氨苄青霉素琼脂培养基上对转化的细胞划线。在司徒茨氏假单胞菌的海藻糖合酶基因被导入大肠杆菌后，麦芽糖通过大肠杆菌中的海藻糖酶就转变成葡萄糖。由于所得葡萄糖被代谢，因此，pH降低，MacConkey琼脂培养基上菌落的颜色由黄色变成红色。该原理适用于本发明的克隆系统。将用基因组文库转化的大肠杆菌ATCC35467在MacConkey琼脂培养基上培养得到红色菌落。质粒DNA的分离表明其含有约4.7kbDNA片段。将该质粒命名为pCJ104。为了检测酶，培养大肠杆菌ATCC35467/pUC18(对照)、大肠杆菌ATCC35467/pCJ104和野生型司徒茨氏假单胞菌CJ38。使大肠杆菌细胞在LB培养基上生长直到静止期早期。使司徒茨氏假单胞菌CJ38在营养培养基上生长。离心分离细胞并破碎。在pH 8.5-9.0、温度为35℃，将破碎的细胞在缓冲液20mM二乙醇胺中与作为底物的20％麦芽糖反应。将1.0％三氯乙酸加到反应溶液中，然后离心，用高效液相层析检测麦芽糖和海藻糖的量。结果列于下列表3。
                            表3酶滴定
    微生物     非酶活性(U*/mg蛋白质)   培养物滴度(U/ml培养物溶液)
  司徒茨氏假单胞菌CJ38     0.1     0.023
大肠杆菌ATCC35467/pUC18     0     0
大肠杆菌ATCC35467/pCJ104     0.26     0.175
*U＝μmol海藻糖/分钟实施例7
海藻糖合酶基因的限制图谱构建(图5)
用常规方法分离质粒pCJ104，然后用各种限制酶处理以构建限制图谱。
用约20种酶，例如AatII、BamHI、EcoRI、EcoRV、KpnI、NcoI、NdeI、PstI、SacI、SacII、SalI、SphI和XhoI对质粒pCJ104进行单、双和三消化。用琼脂糖凝胶电泳分析DNA片段，然后进行比较以构建限制图谱。实施例3
海藻糖合酶基因的亚克隆和酶检测
(1)海藻糖合酶基因的亚克隆(图6)
完成亚克隆以确定海藻糖合酶基因在4.7kb质粒pCJ104中的位点。将质粒pCJ104用KpnI裂解，然后分离出3.35kb片段。将该片段导入载体pUC18/KpnI/CIP中，用所得的重组体转化大肠杆菌NM522。构建了将3.35kb片段定向克隆到pUC18/KpnI中的重组质粒pCJ121。另外，用BamHI和BglII对质粒pCJ104进行双裂解。纯化由此得到的2.5kb BamHI-BglII片段，然后连接到pUC18/BamHI/CIP中，再用该重组体转化大肠杆菌NM522。构建了将2.5kb BamHI-BglII片段定向克隆到pUC18/BamHI中的重组质粒pCJ122。最后，用BamHI和EcoRI对质粒pCJ104进行双消化，纯化所得的1.2kb BamHI-EcoRI片段。将该片段连接到载体pUC18/BamHI/EcoRI中，然后用所得的重组体转化大肠杆菌NM522。构建重组质粒pCJ123。
用构建的各重组质粒转化大肠杆菌ATCC35467。将转化体在含2.0％麦芽糖(20g/L)的MacConkey-氨苄青霉素培养基上培养，观察由此形成的菌落颜色。观察到携带pCJ121和pCJ122的大肠杆菌ATCC35467形成红色菌落，但携带pCJ123的大肠杆菌ATCC35467由于不能分解麦芽糖而形成黄色菌落。因此，可以看出海藻糖合酶基因位于较长的2.5kb BamHI-BglII片段，而不是1.2kb BamHI-EcoRI片段上。
(2)滴定含亚克隆质粒的转化体的海藻糖合酶
将转化的大肠杆菌ATCC35467/pCJ121、ATCC35467/pCJ122和ATCC35467/pCJ123在LB-Ap培养基上培养至静止期早期。离心回收细胞，用适宜体积的20mM二乙醇胺溶液洗涤两次。将洗涤的细胞悬浮在适宜体积的20mM二乙醇胺溶液中，用超声仪破碎。将破碎的细胞离心，将由此得到的上清液用作酶液体。在35℃，将上清液与pH8.5-9.0的含20mM二乙醇胺的20％麦芽糖溶液反应。将1.0％三氯乙酸加到反应溶液中，离心并进行HPLC分析。将一单位酶活性定义为其每分钟产生1μmol海藻糖时的酶量。结果列于下列表5。
根据双滴定，大肠杆菌ATCC35467/pCJ122的酶滴度最高。在5升发酵罐中，于下列表6所列的条件下，高密度培养大肠杆菌ATCC35467/pCJ122。结果，非酶活性为5.0U/mg蛋白质，与在LB培养基中培养得到的相同，在高密度培养物中海藻糖合酶的滴度提高到30U/ml培养物(表5)。与野生型司徒茨氏假单胞菌相比，大肠杆菌ATCC35467/pCJ122的非酶活性和培养物滴度分别提高了50和约1300倍。
                         表5
    微生物   非酶活性(U/mg蛋白质) 5升发酵罐的培养物滴度(U/ml培养物)
    大肠杆菌ATCC35467/pCJ121     0.43     -
    大肠杆菌ATCC35467/pCJ122     4.95     30
    大肠杆菌ATCC35467/pCJ 123     0     -
                      表6
    发酵培养基     g/L   培养条件
    甘油     50     pH 7.0
  (NH4)2SO4     6     33℃
  KH2PO4     2     800rpm
  MgSO4·7H2O     1     1.0vvm
  酵母提取物     5
    痕量元素     1毫升
氨基酸(苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、组氨酸、精氨酸)     0.5

Claims (9)

1.具有下列氨基酸序列的海藻糖合酶蛋白质：Met Ser Ile Pro Asp Asn Thr Tyr Ile Glu Trp Leu Val Ser Gln
              5                  10                  15Ser Met Leu His Ala Ala Arg Glu Arg Ser Arg His Tyr Ala Gly
             20                  25                  30Gln Ala Arg Leu Trp Gln Arg Pro Try Ala Gln Ala Arg Pro Arg
             35                  40                  45Asp Ala Ser Ala Ile Ala Ser Val Trp Phe Thr Ala Tyr Pro Ala
             50                  55                  60Ala Ile Ile Thr Pro Glu Gly Gly Thr Val Leu Glu Ala Leu Gly
             65                  70                  75Asp Asp Arg Leu Trp Ser Ala Leu Ser Glu Leu Gly Val Gln Gly
             80                  85                  90Ile His Asn Gly Pro Met Lys Arg Ser Gly Gly Leu Arg Gly Arg
             95                 100                 105Glu Phe Thr Pro Thr Ile Asp Gly Asn Phe Asp Arg Ile Ser Phe
            110                 115                 120Asp Ile Asp Pro Ser Leu Gly Thr Glu Glu Gln Met Leu Gln Leu
            125                 130                 135Ser Arg Val Ala Ala Ala His Asn Ala Ile Val Ile Asp Asp Ile
            140                 145                 150Val Pro Ala His Thr Gly Lys Gly Ala Asp Phe Arg Leu Ala Glu
            155                 160                 165Met Ala Tyr Gly Asp Tyr Pro Gly Leu Tyr His Met Val Glu Ile
            170                 175                 180Arg Glu Glu Asp Trp Glu Leu Leu Pro Glu Val Pro Ala Gly Arg
            185                 190                 195Asp Ser Val Asn Leu Leu Pro Pro Val Val Asp Arg Leu Lys Glu
            200                 205                 210Lys His Tyr Ile Val Gly Gln Leu Gln Arg Val Ile Phe Phe Glu
            215                 220                 225Pro Gly Ile Lys Asp Thr Asp Trp Ser Val Thr Gly Glu Val Thr
            230                 235                 240Gly Val Asp Gly Lys Val Arg Arg Trp Val Tyr Leu His Tyr Phe
            245                 250                 255Lys Glu Gly Gln Pro Ser Leu Asn Trp Leu Asp Pro Thr Phe Ala
            260                 265                 270Ala Gln Gln Leu Ile Ile Gly Asp Ala Leu His Ala Ile Asp Val
            275                 280                 285Thr Gly Ala Arg Val Leu Arg Leu Asp Ala Asn Gly Phe Leu Gly
            290                 295                 300Val Glu Arg Arg Ala Glu Gly Thr Ala Trp Ser Glu Gly His Pro
            305                 310                 315Leu Ser Val Thr Gly Asn Gln Leu Leu Ala Gly Ala Ile Arg Lys
            320                 325                 330Ala Gly Gly Phe Ser Phe Gln Glu Leu Asn Leu Thr Ile Asp Asp
            335                 340                 345Ile Ala Ala Met Ser His Gly Gly Ala Asp Leu Ser Tyr Asp Phe
            350                 355                 360Ile Thr Arg Pro Ala Tyr His His Ala Leu Leu Thr Gly Asp Thr
            365                 370                 375Glu Phe Leu Arg Met Met Leu Arg Glu Val His Ala Phe Gly Ile
            380                 385                 390Asp Pro Ala Ser Leu Ile His Ala Leu Gln Asn His Asp Glu Leu
            395                 400                 405Thr Leu Glu Leu Val His Phe Trp Thr Leu His Ala Tyr Asp His
            410                 415                 420Tyr His Tyr Lys Gly Gln Thr Leu Pro Gly Gly His Leu Arg Glu
            425                 430                 435His Ile Arg Glu Glu Met Tyr Glu Arg Leu Thr Gly Glu His Ala
            440                 445                 450Pro Tyr Asn Leu Lys Phe Val Thr Asn Gly Val Ser Cys Thr Thr
            455                 460                 465Ala Ser Val Ile Ala Ala Ala Leu Asn Ile Arg Asp Leu Asp Ala
            470                 475                 480Ile Gly Pro Ala Glu Val Glu Gln Ile Gln Arg Leu His Ile Leu
            485                 490                 495Leu Val Met Phe Asn Ala Met Gln Pro Gly Val Phe Ala Leu Ser
            500                 505                 510Gly Trp Asp Leu Val Gly Ala Leu Pro Leu Ala Pro Glu Gln Val
            515                 520                 525Glu His Leu Met Gly Asp Gly Asp Thr Arg Trp Ile Asn Arg Gly
            530                 535                 540Gly Tyr Asp Leu Ala Asp Leu Ala Pro Glu Ala Ser Val Ser Ala
            545                 550                 555Glu Gly Leu Pro Lys Ala Arg Ser Leu Tyr Gly Ser Leu Ala Glu
            560                 565                 570Gln Leu Gln Arg Pro Gly Ser Phe Ala Cys Gln Leu Lys Arg Ile
            575                 580                 585Leu Ser Val Arg Gln Ala Tyr Asp Ile Ala Ala Ser Lys Gln Ile
            590                 595                 600Leu Ile Pro Asp Val Gln Ala Pro Gly Leu Leu Val Met Val His
            605                 610                 615Glu Leu Pro Ala Gly Lys Gly Val Gln Leu Thr Ala Leu Asn Phe
            620                 625                 630Ser Ala Glu Pro Val Ser Glu Thr Ile Cys Leu Pro Gly Val Ala
            635                 640                 645Pro Gly Pro Val Val Asp Ile Ile His Glu Ser Val Glu Gly Asp
            650                 655                 660Leu Thr Asp Asn Cys Glu Leu Gln Ile Ash Leu Asp Pro Tyr Glu
            665                 670                 675Gly Leu Ala Leu Arg Val Val Ser Ala Ala Pro Pro Val Ile
            680                 685
2.具有下列核苷酸序列的海藻糖合酶基因：GATCGCTGGC  GTACTGCAGG  TAGAGCAGGC  GCATCGGCCC  CCAGGGCGCA  TCGGCCGGCT              60CCGCTGTGCC  CTGCTGGTTC  ATGAAGCGGA  CGAAGCGGCC  ATCGCGGAAC  CGTGGACGCC             120ATTCGGGGCT  GTCCGGGTCG  CGGCTGTCGG  TGAGCGTGCG  CCACAGGTCG  CTGCGAAACG             180GCGGACCGCT  CCAAAGCGCG  CCGTGGATGG  GATCGCCGAG  CAGTTCGTGC  AGCTCCCAGG             240AACGTTGCGA  ATGCAGCGCG  CCGAGGCTCA  GGCCATGCAG  ATACAGGCGC  GGTCGGCGTT             300CGGCCGGCAG  TTCGGTCCAG  TAGCCATAGA  TCTCGGCGAA  TAGCGCGCGG  GCCACGTCGC             360GGCCGTAGTC  GGCCTCCACC  AGCAGCGCCA  GCGGGCTGTT  CAGATAGGAG  TACTGCAACG             420CCACGCTGGC  GATATCGCCG  TGGTGCAGGT  ATTCCACTGC  GTTCATCGCC  GCCGGGTCGA             480TCCAGCCGGT  ACCGGTGGGC  GTCACCAGCA  CCAGCACCGA  TCGCTCGAAG  GCGCCGCTGC             540GCTGCAGCTC  GCGCAAGGCC  AGACGCGCCC  GCTGGCGCGG  GGTCTCTGCC  GCCCGCAGAC             600CGACGTAGAC  GCGAATCGGC  TCGAGCGCCG  AGCGGCCGCT  CAAGACGCTG  ATATCCGCCG             660CCGACGGGCC  GGAGCCGATG  AACTCGCGGC  CGGTGCGGCC  CAGCTCCTCC  CAGCGCAGCA             720ACGAGGCCCG  GCTGCCGCTT  TTCAGCGGCG  AGGCCGGTGG  CGCCGTCTCC  GGTTCGATCA             780GGGCGTCGTA  CTGCGCGAAG  GATGCGTCCA  GCATGCGCAG  TGCCCGCGCC  GCCAGCACAT             840CGCTGAGCAG  CGACCAGAAC  AGCGCCAGCG  CCACCAGCAC  GCCGATCACG  TTGGCCAGGC             900GCCGTGGCAG  CACGCGGTCG  GCGTGCCGCG  AGACGAAGCG  CGACACCAGC  CGATACAGAC             960GCGCCAGCGT  CAGCAGGATG  AGAAAGGTCG  CCAGCGCGGT  GAGAATGACT  TCGAGCAGGT            1020GCGCACTGCT  CACCGGCGGC  ATGCCCATCA  GCGCGCGTAC  CGCGTTCTGC  CAGCCGGCGA            1080CCTGGCTGAG  GAAATACCCG  GCCAGCAGCA  GGCAGCCGAC  CGCGATCAGC  AGATTGACCC            1140GCTCGCGCTG  CCAGCCTGGG  CGCTCCGGCA  GTTCCAGATA  GCGCCACAGC  CAGCGCCAGA            1200ACACGCCGAG  GCCATAGCCC  ACCGCCAGCG  CCGCGCCGGC  CAGCACGCCC  TGGCTCAGCG            1260TCGAGCGCGG  CAGCAGCGAT  GGCGTCAGCG  CCGCGCAGAA  GAACAGCGTG  CCCAGCAGCA            1320GGCCGAAACC  GGACAGCGAG  CGCCAGATAT  AGAGGACGGG  CAGGTGCAGC  ATGAAGATCT            1380CCGCGGTCGG  GTGACGGCGT  CGCGCCTCGG  CATATCGAGG  CGTGTCCGGT  CGTGCGGTTC            1440CCGTGATGGT  CCGCAGCAGG  CCAATCCGAT  GCAACGATGG  CCGAGCGGCC  GACTCAAACG            1500TCTACATTTC  CCTAGTGCTG  CCGGAACCGA  TCGCCG                                        1536ATG  AGC  ATC  CCA  GAC  AAC  ACC  TAT  ATC  GAA  TGG  CTG  GTC  AGC  CAG  TCC    1584ATG  CTG  CAT  GCG  GCC  CGC  GAG  CGG  TCG  CGT  CAT  TAC  GCC  GGC  CAG  GCG    1632CGT  CTC  TGG  CAG  CGG  CCT  TAT  GCC  CAG  GCC  CGC  CCG  CGC  GAT  GCC  AGC    1680GCC  ATC  GCC  TCG  GTG  TGG  TTC  ACC  GCC  TAT  CCG  GCG  GCC  ATC  ATC  ACG    1728CCG  GAA  GGC  GGC  ACG  GTA  CTC  GAG  GCC  CTC  GGC  GAC  GAC  CGC  CTC  TGG    1776AGT  GCG  CTC  TCC  GAA  CTC  GGC  GTG  CAG  GGC  ATC  CAC  AAC  GGG  CCG  ATG    1824AAG  CGT  TCC  GGT  GGC  CTG  CGC  GGA  CGC  GAG  TTC  ACC  CCG  ACC  ATC  GAC            1872GGC  AAC  TTC  GAC  CGC  ATC  AGC  TTC  GAT  ATC  GAC  CCG  AGC  CTG  GGG  ACC            1920GAG  GAG  CAG  ATG  CTG  CAG  CTC  AGC  CGG  GTG  GCC  GCG  GCG  CAC  AAC  GCC            1968ATC  GTC  ATC  GAC  GAC  ATC  GTG  CCG  GCA  CAC  ACC  GGC  AAG  GGT  GCC  GAC            2016TTC  CGC  CTC  GCG  GAA  ATG  GCC  TAT  GGC  GAC  TAC  CCC  GGG  CTG  TAC  CAC            2064ATG  GTG  GAA  ATC  CGC  GAG  GAG  GAC  TGG  GAG  CTG  CTG  CCC  GAG  GTG  CCG            2112GCC  GGG  CGT  GAT  TCG  GTC  AAC  CTG  CTG  CCG  CCG  GTG  GTC  GAC  CGG  CTC            2160AAG  GAA  AAG  CAC  TAC  ATC  GTC  GGC  CAG  CTG  CAG  CGG  GTG  ATC  TTC  TTC            2208GAG  CCG  GGC  ATC  AAG  GAC  ACC  GAC  TGG  AGC  GTC  ACC  GGC  GAG  GTC  ACC            2256GGG  GTC  GAC  GGC  AAG  GTG  CGT  CGC  TGG  GTC  TAT  CTG  CAC  TAC  TTC  AAG            2304GAG  GGC  CAG  CCG  TCG  CTG  AAC  TGG  CTC  GAC  CCG  ACC  TTC  GCC  GCG  CAG            2352CAG  CTG  ATC  ATC  GGC  GAT  GCG  CTG  CAC  GCC  ATC  GAC  GTC  ACC  GGC  GCC            2400CGG  GTG  CTG  CGC  CTG  GAC  GCC  AAC  GGC  TTC  CTC  GGC  GTG  GAA  CGG  CGC            2448GCC  GAG  GGC  ACG  GCC  TGG  TCG  GAG  GGC  CAC  CCG  CTG  TCC  GTC  ACC  GGC            2496AAC  CAG  CTG  CTC  GCC  GGG  GCG  ATC  CGC  AAG  GCC  GGC  GGC  TTC  AGC  TTC            2544CAG  GAG  CTG  AAC  CTG  ACC  ATC  GAT  GAC  ATC  GCC  GCC  ATG  TCC  CAC  GGC            2592GGG  GCC  GAT  CTG  TCC  TAC  GAC  TTC  ATC  ACC  CGC  CCG  GCC  TAT  CAC  CAT            2640GCG  TTG  CTC  ACC  GGC  GAT  ACC  GAA  TTC  CTG  CGC  ATG  ATG  CTG  CGC  GAA            2688GTG  CAC  GCC  TTC  GGC  ATC  GAC  CCG  GCG  TCA  CTG  ATC  CAT  GCG  CTG  CAG            2736AAC  CAT  GAC  GAG  TTG  ACC  CTG  GAG  CTG  GTG  CAC  TTC  TGG  ACG  CTG  CAC            2784GCC  TAC  GAC  CAT  TAC  CAC  TAC  AAG  GGC  CAG  ACC  CTG  CCC  GGC  GGC  CAC            2832CTG  CGC  GAA  CAT  ATC  CGC  GAG  GAA  ATG  TAC  GAG  CGG  CTG  ACC  GGC  GAA            2880CAC  GCG  CCG  TAC  AAC  CTC  AAG  TTC  GTC  ACC  AAC  GGG  GTG  TCC  TGC  ACC            2928ACC  GCC  AGC  GTG  ATC  GCC  GCG  GCG  CTT  AAC  ATC  CGT  GAT  CTG  GAC  GCC            2976ATC  GGC  CCG  GCC  GAG  GTG  GAG  CAG  ATC  CAG  CGT  CTG  CAT  ATC  CTG  CTG            3024GTG  ATG  TTC  AAT  GCC  ATG  CAG  CCC  GGC  GTG  TTC  GCC  CTC  TCC  GGC  TGG            3072GAT  CTG  GTC  GGC  GCC  CTG  CCG  CTG  GCG  CCC  GAG  CAG  GTC  GAG  CAC  CTG            3120ATG  GGC  GAT  GGC  GAT  ACC  CGC  TGG  ATC  AAT  CGC  GGC  GGC  TAT  GAC  CTC            3168GCC  GAT  CTG  GCG  CCG  GAG  GCG  TCG  GTC  TCC  GCC  GAA  GGC  CTG  CCC  AAG            3216GCC  CGC  TCG  CTG  TAC  GGC  AGC  CTG  GCC  GAG  CAG  CTG  CAG  CGG  CCA  GGC            3264TCC  TTC  GCC  TGC  CAG  CTC  AAG  CGC  ATC  CTC  AGC  GTG  CGC  CAG  GCC  TAC            3312GAC  ATC  GCT  GCC  AGC  AAG  CAG  ATC  CTG  ATT  CCG  GAT  GTG  CAG  GCG  CCG            3360GGA  CTC  CTG  GTG  ATG  GTC  CAC  GAG  CTG  CCT  GCC  GGC  AAG  GGC  GTG  CAG            3408CTC  ACG  GCA  CTG  AAC  TTC  AGC  GCC  GAG  CCG  GTC  AGC  GAG  ACC  ATC  TGC    3456CTG  CCC  GGC  GTG  GCG  CCC  GGC  CCG  GTG  GTG  GAC  ATC  ATT  CAC  GAG  AGT    3504GTG  GAG  GGC  GAC  CTC  ACC  GAC  AAC  TGC  GAG  CTG  CAG  ATC  AAC  CTC  GAC    3552CCG  TAC  GAG  GGG  CTT  GCC  CTG  CGT  GTG  GTG  AGC  GCC  GCG  CCG  CCG  GTG    3600ATC  TGA  GCGC                                                                    3610CCTCTTCGCG  CGCCCCGGGT  CCGCCGCTAT  AGTGCGCAGC  GCCTGGGGCG  CGCATTGCCC            3670TCGCCGTCGA  GACCAGCCCG  TGTCGTTCAC  TTCGCTTTTC  CGCCTTGCGC  TGCTGCCGCT            3730GGCGCTGCTT  GCCGCACCCG  TCTGGGCGCA  GACCGCCTGC  CCGCCCGGCC  AGCAGCCGAT            3790CTGCCTGAGC  GGCAGCTGCC  TCTGCGTGCC  GGCCGCCGCC  AGCGATCCAC  AGGCGGTCTA            3850CGACCGCGTG  CAGCGTATGG  CTACGCTGGC  CCTGCAGAAC  TGGATCCAGC  AGTCGCGCGA            3910CCGCCTGATG  GCCGGCGGCG  TCGAGCCGAT  ACCGCTGCAC  ATCCGCTCGC  AGCTCGAGCC            3970GTATTTCGAT  CTTGCCGTGC  TGGAGAGTGC  GCGGTACCGC  GTCGGCGACG  AGGTGGTGCT            4030GACTGCCGGC  AACACCCTGC  TGCGCAACCC  GGACGTCAAT  GCCGTGACCC  TGATCGACGT            4090CATCGTCTTC  CGCCACGAGG  AGGATGCCCG  GGACAACGTC  GCGCTCTGGG  CCCATGAGCT            4150CAAGCACGTC  GAGCAATATC  TGGACTGGGG  CGTCGCCGAG  TTCGCCCGGC  GCTATACGCA            4210GGATTTCCGT  GCCGTGGAGC  GCCCGGCCTA  TGCGCTGGAG  CGTGAGGTGG  AAGAGGCCCT            4270GCGCGAGACG  CAGACGCGGC  GCTGAGCGAG  CTGATCGGTG  CTGCTGCCCG  CACTGGGCTG            4330AAGCCCACCA  ATGACGCCGG  CGAAAACGAA  AAACCCCGCC  GAGGCGGGGT  TTCTGACGCG            4390GGTTGTGCGG  TCAGCTCAGA  ACGCCGGGAC  CACGGCGCCC  TTGTACTTTT  CCTCGATGAA            4450CTGGCGTACT  TGCTCGCTGT  GCAGCGCGGC  AGCCAGTTTC  TGCATGGCAT  CGCTGTCCTT            4510GTTGTCCGGA  CGGGCGACCA  GAATGTTCAC  GTATGGCGAG  TCGCTGCCCT  CGATCACCAG            4570GGCGTCCTGG  GTCGGGTTCA  GCTTGGCTTC  CAGCGCGTAG  TTGGTGTTGA  TCAGCGCCAG            4630GTCGACCTGG  GTCAGCACGC  GCGGCAGAGT  CGCGGCTTCC  AGTTCGCGGA  TCTTGATCTT            4690CTTCGGGTTC  TCGGCGATGT  CTTCGGCGTG  GCGGTGATGC  CGGCGCCGTC  CTTCAGACCG            4750ATC                                                                               4753
3.一种重组质粒，含权利要求1的海藻糖合酶基因。
4.根据权利要求1的重组质粒，其为重组质粒pCJ122。
5.用权利要求1的重组质粒转化的大肠杆菌。
6.根据权利要求5的转化体，其中所述重组质粒是pCJ122。
7.生产海藻糖的方法，该方法包括将权利要求1的海藻糖合酶与麦芽糖溶液反应得到海藻糖。
8.生产海藻糖的方法，该方法包括破碎权利要求5的已转化的大肠杆菌，离心已破碎的细菌，将所得上清液与麦芽糖溶液反应得到海藻糖。
9.一种从麦芽糖生产海藻糖的新微生物司徒茨氏假单胞菌CJ38。
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