CN110403848A - 一种具有抗菌作用的口腔护理产品 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有抗菌作用的口腔护理组合物，包括溶菌酶，所述溶菌酶通过微生物发酵获得。本发明口腔护理组合物对口腔致病菌有很好的抑制作用。

Description

一种具有抗菌作用的口腔护理产品
技术领域
本发明涉及口腔护理技术领域，尤其是涉及一种具有抗菌作用的口腔护理产品。
背景技术
口腔健康与口腔致病菌息息相关，比如粘性放线菌(简称粘放菌)是牙菌斑的主要成分之一，早期定植于牙面，对菌斑的构成和生长具有重要的作用。
伴放线放线杆菌，与牙周炎，特别是侵袭性牙周炎密切相关，成为牙周炎细菌病因学中研究最多的细菌之一。
变异链球菌和嗜酸乳酸杆菌是口腔主要的致龋齿菌之一，常见于牙菌斑中，可通过代谢产生的酸性物质导致龋齿的发生。
血链球菌是口腔正常菌群组份之一，随着牙齿的萌生早期定植牙面，通过植物血凝素样附着素，非植物血凝素样附着素与唾液中受体特异结合，粘附于获得性膜上。
具核梭杆菌参与牙周疾病的炎症反应，是牙周炎的可疑致病菌之一。
牙龈卟啉单胞菌是一种非酵解糖的革兰氏阴性厌氧球杆菌,是研究广泛且证据充足的重要牙周致病菌之一。
现有已知的常见口腔致病菌如下表所示：
中国专利申请201710940410.8，名称为“一种含有生物溶菌酶的牙膏”公开了在牙膏中含有0.1-15％(wt)的生物溶菌酶添加剂组合物，所述生物溶菌酶添加剂组合物由以下重量百分比的各组分组成：生物溶菌酶10-40％，改性植物胶0.01-2.0％，EDTA二钠0.01-0.3％，去离子水余量。但溶菌酶并非对所有细菌都有抑制作用，不同来源途径的溶菌酶对不同细菌会有特异性抑制，例如FEMS Microbiol Lett，259(2006)，p42-46，表1公开了鸡蛋清、鹅蛋清及花椰菜等来源的溶菌酶对不同细菌的溶菌活性各不相同，参见下表：
所以我们仍需寻找对口腔致病菌有更好抑制作用的溶菌酶。
发明内容
本申请要解决的技术问题是提供一种具有抗菌作用的口腔护理产品。该口腔护理产品可以有效抑制口腔中的致病菌。
为解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：
一种具有抗菌作用的口腔护理产品，包括溶菌酶，所述溶菌酶通过微生物发酵获得。
优选地，所述微生物选自链霉球菌、灰色链霉菌、表皮葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母菌或溶杆菌中的一种或多种。
优选地，所述口腔护理产品中的水含量≤30％；更优选地，水含量≤10％；最优选地，水含量≤2％。
作为技术方案的进一步改进，所述口腔护理组合物包括泡腾片、牙粉、漱口液或牙膏；
优选地，所述口腔护理组合物中，所述溶菌酶的含量为0.01-10％。
技术方案的进一步改进，所述口腔护理组合物进一步包含多价金属阳离子。
优选地，所述多价金属阳离子为锌离子、亚锡离子、钙离子的一种或多种。
本发明所记载的任何范围包括端值以及端值之间的任何数值以及端值或者端值之间的任意数值所构成的任意子范围。
如无特殊说明，本发明中的各原料均可通过市售购买获得，本发明中所用的设备可采用所属领域中的常规设备或参照所属领域的现有技术进行。
与现有技术相比较，本发明具有如下有益效果：
本发明口腔护理组合物对口腔致病菌有很好的抑制作用。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
一种具有抗菌作用的口腔护理组合物，包括溶菌酶，所述溶菌酶通过微生物发酵获得。
溶菌酶(lysozyme)又称胞壁质酶(muramidase)或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶(N-acetylmuramide glycanohydrlase),通过裂解细菌细胞壁达到抗菌作用。但这种裂解并非对所有细菌的细胞壁都适用。
溶菌酶名称 来源分类 供应商名称
Handary 链霉球菌发酵 Handary SA
Aegis 毕赤酵母发酵 浙江艾杰斯生物有限科技公司
BEPG 鸡蛋清 Bouwhuis Enthoven
BEFG 鸡蛋清 Bouwhuis Enthoven
NN 鸡蛋清 南宁庞博生物工程有限公司
DP 鸡蛋清 DuPont
HLYZ 人来源 Sigma
一、对上述各种溶菌酶进行最小抑菌浓度(MIC)实验：
用培养基配制样品溶液使其起始浓度为20000ppm，配制4000ppm CPC溶液作为试验的阳性对照品，所述CPC是指Cetylpyridinium Chloride，即十六烷基氯化吡啶；实验步骤如下：
1)先在96孔板中2-12列添加100μL的培养基，再在第1排每个孔注入200μL样品和对照溶液；
2)用一支8通道移液器缓慢地吸打溶液，以混匀第1列中每一个孔中的溶液，混匀后(反复吸打10-15次)，用8通道移液器从第1列的孔中转移100μL溶液到第2列的孔中，然后继续用8通道移液器混匀第2列孔中的溶液，混匀后，再转移100μL到第3列孔中，不断重复直至全部12列孔中的溶液都混匀，最后从第12列的孔中转移出100μL溶液并弃掉。得到了一系列经2倍稀释含梯度浓度的样品和对照溶液；
3)每孔均添加100μL调节好浓度的菌悬液，这样最后96孔板中的每个孔中应均有200μL溶液，然后将96孔板置于微生物培养箱中培养18-24h；
4)配制0.05％的刃天青溶液，用移液器每个孔注入一滴刃天青溶液，观察刃天青颜色变化，确定孔板中细菌的活度，结合酶标仪所测数据确定MIC值。结果见下表1所示：
表1：
溶解酶 细菌Ssa 细菌Sm 细菌Av 细菌Fn 细菌Aa 细菌Vp
Aegis 2.4 7.3 2.4 2.4 2.4 2.4
Handary 2.4 4.8 2.4 2.4 2.4 2.4
NN >10000 >10000 >10000 >10000 >10000 >10000
DP >10000 >10000 >10000 >10000 >10000 >10000
BEPG >10000 >10000 >10000 >10000 >10000 >10000
BEFG >10000 >10000 >10000 >10000 >10000 >10000
HYLZ >10000 >10000 >10000 >10000 >10000 >10000
CPC 2.4 2.4 2.4 2.4 4.8 2.4
(单位ppm)
以上数据表明：微生物溶菌酶Aegis、Handary均有较强的抑菌能力，最小抑菌浓度可达2.4ppm，与CPC、Triclosan(三氯生)接近。而鸡蛋清来源溶菌酶以及人来源溶菌酶抗口腔菌能力较弱。也就是说，经微生物发酵来源的溶菌酶才具有抑制口腔致病菌的作用；而鸡蛋清来源和人来源的溶菌酶在抑制口腔致病菌方面效果不明显。
二、对上述各种溶菌酶进行细菌生长抑制实验(GI实验)
1)用无菌水配制样品及对照品(CPC、Triclosan)浓度至1000ppm,备用。选取细菌Sm，Fn为实验用菌，用无菌水稀释细菌菌液至OD630约为0.2；
2)取稀释后的细菌菌液10mL，分装至各支反应管中；
3)用微量移液器吸取样品各25μL于反应管中，震荡5s使样品溶液充分分散于菌液中；
4)将反应管转移到相应培养箱中进行培养(分别于2h,4h，6h，和24h三个时间点取出反应管，用移液器分别从每支管中吸取300μL菌液至干净的96孔板中(对于沉淀生长的细菌，吸液前应先漩涡震荡5s使菌液充分悬浮分散)，然后将96孔板置于酶标仪中读取OD630值，并于电脑上记录数据并保存。OD值越高，菌液浓度越高，结果如下表2和表3。
表2：Sm的生长抑制实验
表3：Fn的生长抑制实验
以上数据表明：微生物溶菌酶对Sm、Fn均有较强的抑菌作用。对Sm的作用起效强，作用快，与CPC、Triclosan近似，
三、对上述各种溶菌酶进行体外抑制菌斑效果实验
人工口腔生物膜动态模型是目前公认的较好的牙菌斑研究体外模型，能够模拟人体口腔环境，观察细菌形成生物膜动态过程，是一种有效的菌斑生长和控制的研究方法。实验具体步骤如下：
1)收集3人的刺激性唾液，离心取上清液，紫外照射60分钟灭菌；
2)将高压灭菌的羟基磷灰石片(Hydroxyapatite，HAP)放入唾液中，浸泡过夜形成获得性膜；
3)收集以上3人的刺激性唾液(收集前受试者应24小时无口腔清洁卫生活动)，混入到培养基中；
4)吸取刺激性唾液混合液到人工口腔流动室内，HAP片充分浸泡在溶液中。置于42.5℃水浴锅内，培养基以脉冲模式流动，培养菌斑；
5)菌斑生长8小时后，将流动室中的营养基泵出。将样品管道放入上述组合物样品溶液中，以最大流速使样品溶液快速充满整个流动室；
6)计时1min后，将测试样品溶液全部泵出；
7)将培养基溶液泵入流动室，继续培养16h，终止实验；
8)用OD法处理实验结果：用镊子将HAP片取出，于蒸馏水中蘸洗5次后放入装有2mL生理盐水的无菌试管中，用漩涡震荡器充分震荡均匀；
9)吸取300μL上一步骤中悬浊液到96孔细胞培养板中，用酶标仪(Tecan，InfiniteM200)在630纳米波长下检测细菌，OD630值表示细菌浓度，OD630越小，抗菌效果越好。
选取三位受试者，分别标记为受试者1、2、3。三位受试者的人工口腔OD630值见表4。
表4：
CPC Handary Aegis NN DP BEPG BEFG HYLZ PBS
受试者1 0.219 0.501 0.987 1.416 1.373 1.321 1.327 1.403 1.226
受试者2 0.297 0.785 0.573 1.476 1.411 1.432 1.455 1.441 1.315
受试者3 0.328 0.876 0.802 1.566 1.604 1.597 1.58 1.611 1.459
以上表4数据表明，微生物来源溶菌酶也具有很好的抗微生物膜的作用，而其它来源的溶菌酶抑菌效果不及作为阴性对照的磷酸盐缓冲溶液(PBS)。
小结：以上实验表明，微生物来源溶菌酶对试验中的口腔细菌有明显的抑制作用。
一种具有抗菌作用的口腔护理产品，包括溶菌酶，所述溶菌酶通过微生物发酵获得。
在本发明某些实施方式中，所述微生物选自链霉球菌、灰色链霉菌、表皮葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母菌、溶杆菌中的一种或多种。
在本发明某些实施方式中，所述口腔护理产品中的水含量≤30％；更优选地，水含量≤10％；最优选地，水含量≤2％。
在本发明某些实施方式中，所述溶菌酶在口腔护理组合物中的含量为0.01-10％；在一些优选实施方式中，所述溶菌酶在口腔护理组合物中的含量为0.01-8％，0.01-7％，0.01-6％，0.01-5％，0.01-4％，0.01-3％，0.01-2％，0.01-1％，0.05-0.8％，0.05-0.5％，0.05-0.3％，0.05-0.2％，0.05-0.1％。
在本发明某些实施方式中，所述口腔护理组合物进一步包含多价金属阳离子。
在本发明某些优选实施方式中，所述多价金属阳离子为锌离子、亚锡离子、钙离子的一种或多种。
在本发明某些优选实施方式中，所述锌离子来自柠檬酸锌、硫酸锌、氧化锌、氟化锌、氯化锌、乳酸锌、葡萄糖酸锌、苹果酸锌、酒石酸锌、碳酸锌、磷酸锌中的一种或多种。
在本发明某些优选实施方式中，所述钙离子来自氯化钙、柠檬酸钙、磷酸钙、溴化钙、碘化钙、葡萄糖酸钙、乳酸钙、次氯酸钙、高氯酸钙、硝酸钙、醋酸钙中的一种或多种。
在本发明某些优选实施方式中，所述亚锡离子来自氟化亚锡、氯化亚锡、焦磷酸亚锡、磷酸亚锡、溴化亚锡、碘化亚锡、氧化亚锡、硫化亚锡、偏磷酸亚锡、乙酸亚锡、酒石酸亚锡、柠檬酸亚锡、苹果酸亚锡、丙二酸亚锡、葡萄糖酸亚锡、、草酸亚锡中的一种或多种。
在本发明某些实施方式中，所述口腔护理组合物包括泡腾片、牙粉、漱口液或牙膏；
在本发明某些实施方式中，所述口腔护理组合物中可进一步包括磨擦剂、保湿剂和/或增稠剂等辅料。
在本发明某些实施方式中，所述口腔护理组合物中可进一步包括抗菌剂、抗龋剂、抗敏剂、抗结石剂和/或美白剂等活性成分。
本发明口腔护理组合物包括牙膏、牙粉、凝胶或漱口液。
“磨擦剂”是牙膏的主体原料，一般占配方的20％-50％，在牙膏中最重要的作用就是去除牙垢，减轻牙结石。磨擦剂的选择应全面考虑其硬度、大小、形状和含量，确保有效清洁的通式不磨损牙齿。示例的磨擦剂可包括但不限于以下的一种或多种：碳酸钙、磷酸氢钙、焦磷酸钙、二氧化硅、磷酸三钙、硅酸铝、氢氧化铝、氧化铝、沸石、氧化钛、硅酸、高岭土等。
“保湿剂”是防止口腔护理组合物脱水变硬的成分。示例的保湿剂包括但不限于如甘油、丙二醇、山梨醇、低分子量的聚乙二醇等。按质量百分比计，保湿剂在口腔护理组合物中的含量通常为10-80％。
“增稠剂”是一种增加溶液或液体/固体混合物的粘度，但基本上不会改变其性质的物质。加入增稠剂的目的是为了给产品提供骨架、流动性和稳定性。示例的增稠剂包括，但不限于，以下一种或多种:羟乙基纤维素、羧甲基纤维素及其盐(例如羧甲基纤维素钠)、角叉菜聚糖(carrageenan)、羧基乙烯基聚合物、黄原胶(xanthan gum)、卡拉胶、明胶、支链淀粉、海藻酸钠等。在某些实施方式中，所述增稠剂包括黄原胶、卡拉胶或羧甲基纤维素钠中的一种或多种。增稠剂在口腔护理组合物中的重量比例通常为0.2-2％。
“表面活性剂”是在牙膏中起到乳化香精和起泡的目的，在某种程度上可以辅助羟基磷灰石-多羧基化合物复合物的充分和完全分散。示例的表面活性剂包括，但不限于，阴离子表面活性剂，例如十二烷基磺酸钠；两性表面活性剂，例如甜菜碱；氨基酸表面活性剂如月桂醇肌氨酸钠和非离子表面活性剂，例如聚氧乙烯与聚氧丙稀共聚物、聚乙二醇等。表明活性剂在口腔护理组合物中的重量比例通常为0.5-2.5％。
根据本申请的某些实施方式，所述口腔护理组合物中可进一步包括抗菌剂、抗龋剂、抗敏剂、抗结石剂和/或美白剂等活性成分；
“抗菌剂”是指能够在一定时间内，使口腔护理组合物中某些微生物的生长或繁殖保持在必要水平以下的化学物质。示例的抗菌剂包括但不限于：氧化锌、氯化亚锡、四氢姜黄素、氯化十六烷基吡啶、三氯生等。
“抗龋剂”是指对龋病有抑制作用的物质，例如可以通过降低牙釉质羟基磷灰石的溶解度增强牙齿的抗龋能力的物质，或控制菌斑、抑制细菌生长的物质。示例的抗龋剂包括但不限于，氟化物离子源(如，氟化钠、氟化钾、氟化钙、氟化镁、氟化亚锡、氟化铵、单氟磷酸钠、单氟磷酸钾、氟硅酸盐等)、含磷试剂(磷酸钙、三偏磷酸钠、甘油磷酸镁、乳磷酸钙、酪蛋白酸钠等)、或精氨酸及其衍生物。优选地，在某些具体实施方式中，所述抗龋剂包含氟化物离子源。
“抗敏剂”是指通过抑制神经冲动或能够封闭牙本质小管或降低其通透性，从而预防或治疗牙本质过敏症的物质。示例的抗敏剂包括但不限于：甘草酸二钾、氟化钾、硝酸钾、氯化钾等钾离子源。优选地，在某些具体实施方式中，所述抗敏剂包含钾离子源。
“抗结石剂”是指能起到抗牙齿结石的作用的金属离子络合物。示例的抗结石剂包括但不限于：焦磷酸盐、三聚磷酸盐、六偏磷酸盐或柠檬酸盐。
“美白剂”是指对牙齿能起到美白作用的物质。示例的美白剂包括但不限于：过氧化物漂白剂、木瓜蛋白酶、葡萄糖氧化酶。
实施例1
一种泡腾片，按下表配方按常规方法制得：
将泡腾片：水＝1：99的重量比例配制漱口水，混匀后离心，取上清液，得样品1。
实施例2
一种牙膏，按下表配方按常规方法制得：
原料 含量(％)
山梨醇 15.02
甘油 20
聚乙二醇-12 5.55
羧甲基纤维素钠 0.8
单氟磷酸钠 0.76
糖精钠 0.25
二氧化硅 22
香精 1.1
月桂醇硫酸酯钠 2
二氧化钛 0.3
Aegis溶菌酶 0.01
焦磷酸四钠 2.44
水 29.77
将牙膏：水＝1：1的重量比例配制牙膏水，混匀后离心，取上清液，得样品2。
实施例3-4
一种牙粉，按下表配方按常规方法制得：
原料 实施例3 实施例4
甘油 7 9
溶菌酶 3 3
二氧化硅 80 80
月桂基硫酸酯钠 8 8
水 2 0
分别将实施例3和4的牙粉与水按1：50的(牙粉：水＝1：50)重量比例配制牙粉水，混匀后离心，取上清液，得样品3和4。
按上述最小抑菌浓度(MIC)实验步骤测试样品1和样品2的MIC值，结果如下表5所示：
表5：配制4000ppm CPC溶液作为试验的阳性对照品
Sm Fn
样品1 4.8 2.4
样品2 7.3 4.8
样品3 4.8 4.8
CPC 2.4 2.4
实施例5-9
一种牙膏，按下表配方按常规方法制得：
各实施例产品外观变化实验：
按照实施例1-9配方制作的产品起始外观为白色，但在40℃条件下放置(老化)3个月后，产品外观发生如表6所示的变化：
表6：产品老化前后的外观对比
由表6可知，水会影响包含溶菌酶的组合物的稳定，组合物中水含量越低，组合物会更加稳定。此外多价金属阳离子也可以提高组合物的稳定性。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (15)

1.一种具有抗菌作用的口腔护理组合物，包括溶菌酶，其特征在于，所述溶菌酶通过微生物发酵获得。
2.根据权利要求1所述口腔护理组合物，其特征在于：所述微生物选自链霉球菌、灰色链霉菌、表皮葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母菌或溶杆菌中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述口腔护理组合物，其特征在于：所述口腔护理产品中的水含量≤30％。
4.根据权利要求3所述口腔护理组合物，其特征在于：所述口腔护理产品中的水含量≤10％。
5.根据权利要求4所述口腔护理组合物，其特征在于：所述口腔护理产品中的水含量≤2％。
6.根据权利要求1所述口腔护理组合物，其特征在于：所述溶菌酶在口腔护理组合物中的含量为0.01-10％。
7.根据权利要求6所述口腔护理组合物，其特征在于：所述溶菌酶在口腔护理组合物中的含量为0.01-8％、或0.01-7％、或0.01-6％、或0.01-5％、或0.01-4％、或0.01-3％、或0.01-2％、或0.01-1％、或0.05-0.8％、或0.05-0.5％、或0.05-0.3％、或0.05-0.2％、或0.05-0.1％。
8.根据权利要求1所述口腔护理组合物，其特征在于：所述口腔护理组合物中还包含多价金属阳离子。
9.根据权利要求8所述口腔护理组合物，其特征在于：所述多价金属阳离子为锌离子、亚锡离子和钙离子中的一种或多种。
10.根据权利要求9所述口腔护理组合物，其特征在于：所述锌离子选自柠檬酸锌、硫酸锌、氧化锌、氟化锌、氯化锌、乳酸锌、葡萄糖酸锌、苹果酸锌、酒石酸锌、碳酸锌、磷酸锌中的一种或多种。
11.根据权利要求9所述口腔护理组合物，其特征在于：所述钙离子来自氯化钙、柠檬酸钙、磷酸钙、溴化钙、碘化钙、葡萄糖酸钙、乳酸钙、次氯酸钙、高氯酸钙、硝酸钙、醋酸钙中的一种或多种。
12.根据权利要求9所述口腔护理组合物，其特征在于：所述亚锡离子来自氟化亚锡、氯化亚锡、焦磷酸亚锡、磷酸亚锡、溴化亚锡、碘化亚锡、氧化亚锡、硫化亚锡、偏磷酸亚锡、乙酸亚锡、酒石酸亚锡、柠檬酸亚锡、苹果酸亚锡、丙二酸亚锡、葡萄糖酸亚锡、草酸亚锡中的一种或多种。
13.根据权利要求1所述口腔护理组合物，其特征在于：所述口腔护理组合物包括泡腾片、牙粉、漱口液或牙膏。
14.根据权利要求1所述口腔护理组合物，其特征在于：所述口腔护理组合物中还包括磨擦剂、保湿剂和/或增稠剂等辅料。
15.根据权利要求1所述口腔护理组合物，其特征在于：所述口腔护理组合物中还包括抗菌剂、抗龋剂、抗敏剂、抗结石剂和/或美白剂等活性成分。
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