CN109771312A - 协同抗菌组合物 - Google Patents

Abstract

本申请涉及一种组合物，具体涉及包含螯合剂与和厚朴提取物(例如厚朴酚、和厚朴酚或其衍生物)的组合物，以及这种组合物在制备用于口腔抗菌的口腔护理组合物中的用途。本申请还涉及一种抑制口腔细菌的方法，包括使所述组合物与口腔内细菌相接触。

Description

协同抗菌组合物

技术领域

本发明主要涉及一种抗菌组合物，具体涉及一种包含GLDA与来自厚朴提取物的化合物(例如和厚朴酚、厚朴酚和/或其衍生物)的抗菌组合物。

背景技术

和厚朴酚以及厚朴酚存在于厚朴提取物中，是结构相近的两种物质，均具有抗菌活性。然而，由于水溶性极差，和厚朴酚以及厚朴酚在典型的个人护理、口腔护理或家庭护理组合物中的应用受到限制。

发明内容

一方面，本申请提供了一种组合物，包含螯合剂与来自厚朴提取物的化合物，其中所述来自厚朴提取物的化合物包含一种或多于一种选自下组的活性化合物：和厚朴酚、厚朴酚、和厚朴酚衍生物、与厚朴酚衍生物。

在一些实施方式中，所述螯合剂是谷氨酸羧酸盐；在一些实施方式中，所述谷氨酸羧酸盐是谷氨酸二乙酸盐，在一些实施方式中，所述谷氨酸羧酸盐是谷氨酸二乙酸四钠。

在一些实施方式中，所述螯合剂在所述组合物中的重量百分含量为0.1％-10％。在一些实施方式中，所述螯合剂在所述组合物中的重量百分含量为1％-8％。在一些实施方式中，所述螯合剂在所述组合物中的重量百分含量为2％-5％。

在一些实施方式中，所述和厚朴酚衍生物选自四氢和厚朴酚、丙基和厚朴酚、异丙基和厚朴酚、丁基和厚朴酚中的一种或者多种。在一些实施方式中，所述厚朴酚衍生物选自四氢厚朴酚、丙基厚朴酚、异丙基厚朴酚、丁基厚朴酚中的一种或多种。

在一些实施方式中，其中所述来自厚朴提取物的化合物包含在厚朴提取物，且所述厚朴提取物在所述组合物中的重量百分含量为0.01％-10％。在一些实施方式中，所述厚朴提取物在所述组合物中的重量百分含量为0.1％-5％。在一些实施方式中，所述厚朴提取物在所述组合物中的重量百分含量为0.3％-2％。

在一些实施方式中，所述和厚朴酚在所述厚朴提取物中的重量百分含量为1％-99％。在一些实施方式中，所述和厚朴酚在所述厚朴提取物中的重量百分含量为20％-80％。在一些实施方式中，所述和厚朴酚在所述厚朴提取物中的重量百分含量为50％-80％。

在一些实施方式中，其中所述厚朴酚在所述厚朴提取物中的重量百分含量为1％-99％。在一些实施方式中，所述厚朴酚在所述厚朴提取物中的重量百分含量为20％-80％。在一些实施方式中，所述厚朴酚在所述厚朴提取物中的重量百分含量为20％-50％。

在某些实施方式中，本申请的组合物的所述厚朴提取物中包含厚朴酚与和厚朴酚。在某些实施方式中，所述厚朴提取物中的和厚朴酚的含量高于或等于厚朴酚的含量，例如在所述厚朴提取物中，厚朴酚：和厚朴酚的重量百分比的比例为1:9，2:8，3:7，4:6，或5:5。在某些其他实施方式中，所述厚朴提取物中的和厚朴酚的含量低于厚朴酚的含量，例如在所述厚朴提取物中，厚朴酚：和厚朴酚的比例为9:1，8:2,7:3，或6:4。

在一些实施方式中，本申请的组合物进一步包含助沉剂。在一些实施方式中，所述助沉剂是甲基乙烯基醚/马来酸酐共聚物。在一些实施方式中，所述助沉剂在所述组合物中的重量百分含量为0.1％-10％。在一些实施方式中，所述助沉剂在所述组合物中的重量百分含量为1％-5％。在一些实施方式中，所述助沉剂在所述组合物中的重量百分含量为2％。

在一些实施方式中，本申请的组合物进一步包括口腔可接受的载体。在一些实施方式中，本申请的组合物所述口腔可接受的载体包含防腐剂、表面活性剂、保湿剂、增稠剂、磨擦剂、调味剂、活性成分、水中的一种或者多种。

在一些实施方式中，本申请的组合物是一种口腔护理组合物。

另一方面，本申请提供了所述的组合物在制备用于口腔抗菌组合物中的用途。

又一个方面，本申请提供了一种抑制口腔细菌的方法，所述方法包括使本申请所述的组合物与口腔内细菌相接触。

具体实施方式

本申请公开了本发明的多个具体特征(包括方法步骤)。需要理解的是，本说明书中的公开内容包括这些具体特征的所有可能组合。例如，当本发明的一个具体方面或实施方式或一项具体权利要求公开了一个具体特征，在可能的范围内，该特征也可以和本发明的其余特征和实施方式组合使用。在本申请中，当涉及到一个数值范围时，可以理解其公开内容包括在所述范围上下限之间并且以下限的十分之一增加的每一个中间值、以及在所述范围中的任意指定的其余值或中间值。例如，当所述范围为1-10时，应理解其中公开的内容包括1.1，1.2、1.3……直到9.9的每一个以0.1为增量的中间数值。

本发明提供了组合物，其包含螯合剂与来自厚朴提取物的化合物。不受理论限制，但认为螯合剂能够提高来自厚朴提取物的化合物的抗菌活性，并且这种提高作用在低浓度以及高浓度的来自厚朴提取物的化合物中均可以观察到，在高浓度时更加明显。

螯合剂是指能与中心原子形成螯合物的一类试剂，包括无机和有机两类。螯合剂通常对金属离子有较好的螯合作用，有软化硬水、去除水垢、茶渍等能力。常用的螯合剂的类型包括无机磷酸盐类、硅酸盐类、有机磷类、酰胺类、以及聚羧酸盐类等，例如但不限于DTPA(二乙烯三胺五乙酸)、EDTA(乙二胺四乙酸)、NTA(氨基三乙酸)、STPP(三聚磷酸钠)、MGDA(甲基甘氨酸N,N-二乙酸)和GLDA(谷氨酸二乙酸四钠)等。在本发明的一些实施方式中，所述螯合剂为谷氨酸羧酸盐。在本发明的一些实施方式中，所述谷氨酸羧酸盐是谷氨酸二乙酸盐。在本发明的一些实施方式中，所述谷氨酸二乙酸盐是谷氨酸二乙酸四钠(GLDA)。GLDA具有以下优点：A.在广泛的pH范围内有非常高的溶解性。B.有良好的生物可降解性、金属离子螯合能力、易用性。C.属于非危险化学品，对环境与人体无毒。

在某些实施方式中，所述螯合剂(例如GLDA)在本申请组合物中的重量百分含量为0.01％-10％、0.05％-10％、0.1％-10％、0.2％-10％、0.3％-10％、0.4％-10％、0.5％-10％、0.6％-10％、0.7％-10％、0.8％-10％、0.9％-10％、1％-10％、2％-10％、3％-10％、4％-10％、5％-10％、6％-10％、7％-10％、8％-10％、9％-10％、0.1％-8％、0.2％-8％、0.3％-8％、0.4％-8％、0.5％-8％、0.6％-8％、0.7％-8％、0.8％-8％、0.9％-8％、1％-8％、2％-8％、3％-8％、4％-8％、5％-8％、6％-8％、7％-8％、0.1％-6％、0.2％-6％、0.3％-6％、0.4％-6％、0.5％-6％、0.6％-6％、0.7％-6％、0.8％-6％、0.9％-6％、1％-6％、2％-6％、3％-6％、4％-6％、5％-6％、0.1％-5％、0.2％-5％、0.3％-5％、0.4％-5％、0.5％-5％、0.6％-5％、0.7％-5％、0.8％-5％、0.9％-5％、1％-5％、2％-5％、3％-5％、4％-5％、0.1％-4％、0.2％-4％、0.3％-4％、0.4％-4％、0.5％-4％、0.6％-4％、0.7％-4％、0.8％-4％、0.9％-4％、1％-4％、2％-4％、3％-4％、0.1％-2％、0.2％-2％、0.3％-2％、0.4％-2％、0.5％-2％、0.6％-2％、0.7％-2％、0.8％-2％、0.9％-2％、1％-2％、0.1％-1％、0.2％-1％、0.3％-1％、0.4％-1％、0.5％-1％、0.6％-1％、0.7％-1％、0.8％-1％或0.9％-1％。在某些实施方式中，所述螯合剂(例如GLDA)在组合物中的重量百分含量为1％-8％。在某些实施方式中，所述螯合剂(例如GLDA)在组合物中的重量百分含量为2％-5％。

本发明中的组合物含有来自厚朴提取物的化合物。厚朴提取物在本申请中是指来自植物厚朴(magnolia officinalis，属于木兰科植物的一种)的提取物，或者这类提取物或其活性成分的合成或半合成的等同物。厚朴提取物通常可以从厚朴的干燥皮质或树皮中提取。厚朴提取物可以通过本领域公知的方法获得，例如使用包括乙醇在内的有机溶剂提取，或者使用超临界二氧化碳提取，或者通过合成或半合成的方式获得。厚朴提取物中包含具有抗菌活性的活性化合物，例如，和厚朴酚或其衍生物、厚朴酚或其衍生物。

本发明中所指的和厚朴酚属于羟基联苯化合物，具有如下结构，其在口腔中具有抗菌的作用。

和厚朴酚

在某些实施方式中，本发明所述和厚朴酚衍生物选自四氢和厚朴酚、丙基和厚朴酚、异丙基和厚朴酚、丁基和厚朴酚中的一种或者多种。

本发明中所指的厚朴酚属于羟基联苯化合物，具有如下结构，其与和厚朴酚互为异构体，在口腔中具有抗菌的作用。

厚朴酚

在某些实施方式中，本发明所述厚朴酚衍生物选自四氢厚朴酚、丙基厚朴酚、异丙基厚朴酚、丁基厚朴酚中的一种或多种。在某些实施方式中，所述厚朴酚包含在厚朴提取物中。

在某些实施方式中，本发明所述的组合物包含厚朴提取物。所述厚朴提取物在组合物中的重量百分含量可以为，例如，0.01％-10％、0.01％-9％、0.01％-8％、0.01％-7％、0.01％-6％、0.01％-5％、0.01％-4％、0.01％-3％、0.01％-2％、0.01％-1％、0.05％-5％、0.1％-5％、0.2％-5％、0.3％-5％、0.4％-5％、0.5％-5％、0.6％-5％、0.7％-5％、0.8％-5％、0.9％-5％、1％-5％、2％-5％、3％-5％、4％-5％、0.1％-4％、0.2％-4％、0.3％-4％、0.4％-4％、0.5％-4％、0.6％-4％、0.7％-4％、0.8％-4％、0.9％-4％、1％-4％、2％-4％、3％-4％、0.1％-3％、0.2％-3％、0.3％-3％、0.3％-3％、0.5％-3％、0.6％-3％、0.7％-3％、0.8％-3％、0.9％-3％、1％-3％、2％-3％、0.1％-2％、0.2％-2％、0.3％-2％、0.4％-2％、0.5％-2％、0.6％-2％、0.7％-2％、0.8％-2％、0.9％-2％、1％-2％、0.1％-1％、0.2％-1％、0.3％-1％、0.4％-1％、0.5％-1％、0.6％-1％、0.7％-1％、0.8％-1％或0.9％-1％。在某些实施方式中，所述厚朴提取物在组合物中的重量百分含量为0.1％-5％。在某些实施方式中，所述厚朴提取物在组合物中的重量百分含量为0.3％-2％。

在某些实施方式中，本发明所述和厚朴酚或其衍生物在所述厚朴提取物中的重量百分含量为1％-99％。在某些实施方式中，本发明所述和厚朴酚或其衍生物在所述厚朴提取物中的重量百分含量为20％-80％。在某些实施方式中，本发明所述和厚朴酚或其衍生物在所述厚朴提取物中的重量百分含量为50％-80％。和厚朴酚或其衍生物在所述厚朴提取物中的重量含量可以通过本领域公知的方法测得。例如，可以使用高效液相色谱法，用适当的流动相(例如一定比例的甲醇和水混合物)进行色谱分析，在柱内和厚朴酚或其衍生物被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对样品的定量分析。

在某些实施方式中，本发明所述厚朴酚或其衍生物在所述厚朴提取物中的重量百分含量为1％-99％。在某些实施方式中，本发明所述厚朴酚或其衍生物在厚朴提取物中的重量百分含量为20％-80％。在某些实施方式中，本发明所述厚朴酚或其衍生物在厚朴提取物中的重量百分含量为20％-50％。厚朴酚或其衍生物在厚朴提取物中的重量含量可以通过本领域公知的方法测得。例如，使用高效液相色谱法，用适当的流动相(例如一定比例的甲醇和水混合物)进行色谱分析，在柱内厚朴酚或其衍生物被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对样品的定量分析。

在某些实施方式中，所述厚朴提取物中包含和厚朴酚(或其衍生物)以及厚朴酚(或其衍生物)。在某些实施方式中，所述厚朴提取物中的和厚朴酚的含量高于或等于厚朴酚的含量，例如在所述厚朴提取物中，厚朴酚：和厚朴酚的重量百分比的比例为1:9，2:8，3:7，4:6，或5:5。在某些其他实施方式中，所述厚朴提取物中的和厚朴酚的含量低于厚朴酚的含量，例如在所述厚朴提取物中，厚朴酚：和厚朴酚的比例为9:1，8:2,7:3，或6:4。

在某些实施方式中，本发明所述组合物还进一步包含助沉剂。本发明所述的助沉剂是指这样的物质，其可以增强和厚朴酚和/或厚朴酚在牙齿表面的沉积，延长和厚朴酚和/或厚朴酚在牙齿表面的停留时间，从而提高其在牙齿上的抗菌活性。在某些实施方式中，本发明所述助沉剂是甲基乙烯基醚/马来酸酐共聚物。甲基乙烯基醚/马来酸酐共聚物可以通过商业途径获得，例如其可以以商品名Gantrez通过供应商获得。在某些实施方式中，所述助沉剂在组合物中的重量百分含量为0.1％-10％。在某些实施方式中，所述助沉剂在组合物中的重量百分含量为1％-5％。在某些实施方式中，所述助沉剂在组合物中的重量百分含量为2％。

在某些实施方式中，本发明所述组合物还进一步包括口腔可接受的载体。“口腔可接受的载体”是指这样一种载体，其能够作为口腔护理组合物中的成分，适用于口腔的生理环境，且不导致过度的对口腔的副作用。所述载体可包含合适的美容和/或治疗活性物质。多种本领域公知的口腔可接受的载体都可以使用，例如但不限于，防腐剂、表面活性剂、保湿剂、增稠剂、磨擦剂、调味剂、活性成分、水等。

“防腐剂”包括但不限于例如苯甲酸钠，维生素和叶绿素化合物等。

“表面活性剂”可在口腔护理组合物中起到乳化香精和起泡的作用。示例的表面活性剂包括但不限于：阴离子表面活性剂(例如，十二烷基磺酸钠，十二烷基硫酸钠SLS等)、两性表面活性剂(例如，甜菜碱)、氨基酸表面活性剂(例如，月桂纯碱酸钠)，或非离子表面活性剂(例如，聚氧乙烯与聚氧丙烯共聚物、聚乙二醇等)。按质量百分比计，表面活性剂在口腔护理组合物中的重量比例通常为0.1～4％。

“保湿剂”是防止口腔护理组合物脱水变硬的成分。示例的保湿剂包括但不限于如甘油、丙二醇、山梨醇、低分子量的聚乙二醇等。按质量百分比计，保湿剂在口腔护理组合物中的含量通常为10～80％。

“增稠剂”是一种增加溶液或液体/固体混合物的粘度，但基本上不会改变其性质的物质。加入增稠剂的目的是为了给产品提供骨架、流动性和稳定性。示例的增稠剂包括但不限于以下的一种或多种：羟乙基纤维素、羧甲基纤维素及其盐(如，羧甲基纤维素钠CMCNa)、角叉菜聚糖(Carrageenan)、羧基乙烯基聚合物、黄原胶(Xanthan gum)、卡拉胶、明胶、支链淀粉、海藻酸钠、卡泊姆等。在某些实施方式中，所述增稠剂包括黄原胶、卡拉胶或羧甲基纤维素钠中的一种或多种。按质量百分比计，增稠剂在口腔护理组合物中的含量通常为0～70％。

“磨擦剂”是口腔护理组合物中起清洁作用的主要成分，磨擦剂的选择应全面考虑其硬度、大小、形状和含量，确保有效清洁的通式不磨损牙齿。示例的磨擦剂包括但不限于以下的一种或多种：碳酸钙、磷酸氢钙、焦磷酸钙、磷酸三钙、二氧化硅、硅酸铝、氢氧化铝、氧化铝、沸石、氧化钛、硅酸、高岭土等。在某些实施方式中，所述磨擦剂包括二氧化硅，如摩擦型二氧化硅。按质量百分比计，磨擦剂在口腔护理组合物中的重量比例通常为0～50％。

“调味剂”是指用于改善口腔护理组合物感官性质的物质。示例的调味剂包括但不限于：糖精钠、调味油(如，绿薄荷油、欧薄荷油、冬青油、黄樟油、丁香油、杨素草油、桉油、肉桂油、柠檬油和橙皮油)、香精、水杨酸甲酯或丁香酚。按质量百分比计，调味剂在口腔护理组合物中的重量比通常为0.5～2％。

“活性成分”是指能够治疗或缓解口腔状况或疾病的成分。在某些具体实施方式中，所述活性成分包括抗龋剂、抗敏剂、抗菌剂、抗结石剂、美白剂中的一种或多种。其中：

“抗龋剂”是指对龋病有抑制作用的物质，例如可以通过降低牙釉质羟基磷灰石的溶解度增强牙齿的抗龋能力的物质，或控制菌斑、抑制细菌生长的物质。示例的抗龋剂包括但不限于，氟化物离子源(如，氟化钠、氟化钾、氟化钙、氟化镁、氟化亚锡、氟化铵、单氟磷酸钠、单氟磷酸钾、氟硅酸盐等)、含磷试剂(磷酸钙、三偏磷酸钠、甘油磷酸镁、乳磷酸钙、酪蛋白酸钠等)、或精氨酸及其衍生物。优选地，在某些具体实施方式中，所述抗龋剂包含氟化物离子源。

“抗敏剂”是指通过抑制神经冲动或能够封闭牙本质小管或降低其通透性，从而预防或治疗牙本质过敏症的物质。示例的抗敏剂包括但不限于：甘草酸二钾、氟化钾、硝酸钾、氯化钾等钾离子源。优选地，在某些具体实施方式中，所述抗敏剂包含钾离子源。

“抗菌剂”是指能够在一定时间内，使口腔护理组合物中某些微生物的生长或繁殖保持在必要水平以下的化学物质。示例的抗菌剂包括但不限于：氧化锌、氯化亚锡、四氢姜黄素、氯化十六烷基吡啶、三氯生等。

“抗结石剂”是指能起到抗牙齿结石的作用的金属离子络合物。示例的抗结石剂包括但不限于：焦磷酸盐、三聚磷酸盐、六偏磷酸盐或柠檬酸盐。

“美白剂”是指对牙齿能起到美白作用的物质。示例的美白剂包括但不限于：过氧化物漂白剂、木瓜蛋白酶、葡萄糖氧化酶。

在某些实施方式中，本发明所述组合物是一种口腔护理组合物。本发明的口腔护理组合物可以是本领域已知的任何适用于口腔护理的产品。口腔护理产品是指在一般使用过程中不是被故意吞咽，而是在口腔中保留足够长的时间，以基本上接触所有的牙齿表面和/或口腔组织以获得口腔活性的产品。例如，包括但不限于：牙膏、凝胶、漱口水、牙线、被用于清洁口腔表面的糊剂、粉末、片剂、或液体制剂等洁牙剂、牙胶、牙贴、口腔喷剂、牙粉、泡沫、口香糖、唇膏、海绵、漱口剂、或义齿产品等。在一些实施方式中，所述口腔护理产品为牙膏、牙粉、凝胶、牙贴或漱口水。

在某些实施方式中，本发明所述组合物可用于制备用于口腔抗菌的组合物。

本申请还提供了一种抑制口腔细菌的方法，所述方法包括使本申请所述的组合物与口腔内细菌相接触。例如，当本申请所述的组合物是牙膏或凝胶时，所述方法包括用所述牙膏或凝胶刷牙，以允许与口腔内的细菌相接触。再例如，当本申请所述的组合物是是漱口水时，所述方法包括用所述漱口水接触牙齿，以允许与口腔内的细菌相接触。

具体实施例

实施例1：GLDA与厚朴提取物组合物的协同抗菌作用

本实施例验证了GLDA与厚朴提取物具有协同抗菌作用。在单独菌种的试验中，选用目前比较公认的口腔致病菌，包括具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum,F.n)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.g)、伴放线放线杆菌(Actinobacillusactinomycetemcomitans,Aa)等牙周致病菌；还有一些在菌斑的形成和滋长中起着重要作用的细菌，如：变形链球菌(Streptococcus mutans,S.m)和粘性放线菌(Actinomycesviscosus,A.v)等。实验中具体使用的菌种和菌株如下所示。

按如表1所示配方制备组合物。其中的厚朴提取物是通过超临界二氧化碳的方法从厚朴提取得到的，为干粉形式。

表1

将上述配制好的组合物进行如下实验：

1.抑菌圈实验：

1)HAp片的处理：将HAp片浸泡在100ml组合物溶液中，浸泡30min后取出，晾干之后HAp片表面没有明水，待用；

2)试验平板的配制：按照供应商提供培养基中加入1.5％的Agar进行配制，500ml培养基加入7.5gAgar后高温高压灭菌；将培养活化好的菌液梯度稀释到10-1，取10-1梯度进行涂布，每个平板取0.20ml稀释菌液涂布，涂布一个重复；将准备好的HAp片轻放至涂布好的平板中央位置，用镊子使正面朝下，后轻压使完全接触平板表面；将平板正面放入37℃的CO2恒温培养箱培养24h，后取出测量抑菌圈直径数据直径。直径越大，抑菌效果越好。得到的组合物抑菌圈直径如表2所示：

表2

注：以上表格直径单位以cm计；HAP片本身的直径为1.25cm

将上述表1所示的组合物进行抑菌圈实验，得到上述表2所示的抑菌圈实验结果。通过比较该实验结果可以看出：当组合物中包含GLDA而不含厚朴提取物时(参见组合物2)其抑菌圈实验结果与空白对照相当，说明GLDA本身不具有抗菌作用；而当组合物中分别包含相同量的厚朴提取物(参见组合物1)或阳性对照三氯生(参见组合物8)时，这两种组合物的抑菌圈实验结果非常接近，说明其抗菌效果相当；当组合物中同时包含GLDA与厚朴提取物时(参见组合物3与4)，其抗菌效果明显好于单单含有厚朴提取物的组合物(参见组合物1)，说明GLDA与厚朴提取物联用产生了协同效果。在没有GLDA存在时，单纯提高厚朴提取物的量(参见组合物6)并没有相应提高抗菌效果(参见组合物1)。但是，我们意想不到的发现，当将高浓度厚朴提取物与GLDA联用时(参见组合物7)，其抗菌效果大大提高(2-3倍)，这同样说明了GLDA与高浓度的厚朴提取物也具有明显的协同抗菌作用。基于以上发现，我们推测，高含量的厚朴提取物的抗菌效果没有相应提高，可能是由于厚朴提取物在水溶液中的溶解度比较差，从而限制了抗菌活性的提高。而GLDA和厚朴提取物的联用就很好地提高了厚朴提取物的抗菌效果。

2.体外抑制菌斑效果研究_人工口腔

人工口腔生物膜动态模型是目前公认的较好的牙菌斑研究体外模型，能够模拟人体口腔环境，观察细菌形成生物膜动态过程，是一种有效的菌斑生长和控制的研究方法。

1)收集3人的刺激性唾液，离心取上清液，紫外照射60分钟灭菌。

2)将高压灭菌的羟基磷灰石片(Hydroxyapatite，HAP)放入唾液中，浸泡过夜形成获得性膜。

3)收集以上3人的刺激性唾液(收集前受试者应24小时无口腔清洁卫生活动)，混入到培养基中。

4)吸取刺激性唾液混合液到人工口腔流动室内，HAP片充分浸泡在溶液中。置于42.5℃水浴锅内，培养基以脉冲模式流动，培养菌斑。

5)菌斑生长8小时后，将流动室中的营养基泵出。将样品管道放入上述组合物样品溶液中，以最大流速使样品溶液快速充满整个流动室。

6)计时1min后，将测试样品溶液全部泵出。

7)以最大流速将无菌水泵入流动室，浸泡10s，泵出。

8)将培养基溶液泵入流动室，继续培养16小时，终止实验。

9)用OD法处理实验结果：用镊子将HAP片取出，于蒸馏水中蘸洗5次后放入装有2mL生理盐水的无菌试管中，用漩涡震荡器充分震荡均匀。

10)吸取300μL上一步骤中悬浊液到96孔细胞培养板中，用酶标仪(Tecan，InfiniteM200)在630纳米波长下检测细菌，OD630nm值表示细菌浓度，OD630nm越小，抗菌效果越好。

选取三位受试者，分别标记为受试者1、2、3。三位受试者的人工口腔OD630nm值见表3。

表3

将上述表1所示的组合物进行体外抑制菌斑效果研究实验，得到上述表3所示的人工口腔OD630nm值。通过比较该实验结果可以看出：当组合物中包含GLDA而不含厚朴提取物时(参见组合物2)其人工口腔OD630nm值与空白对照相当，说明GLDA本身不具有抗菌作用；当组合物中同时包含GLDA与厚朴提取物时(参见组合物3与4)，其抗菌效果明显好于单单含有厚朴提取物的组合物(参见组合物1)的抗菌效果，说明GLDA与厚朴提取物联用产生了协同效果，且当GLDA含量较高时(组合物4的GLDA含量高于组合物3)，协同效果更好。我们进一步意想不到地发现，当在GLDA与厚朴提取物联用的基础上进一步联用Gantrez(参见组合物5)时，其抗菌效果相对于GLDA与厚朴提取物二者联用(参见组合物4)得到了进一步的提高。我们推测，这是可能因为Gantrez可以帮助活性物延长在牙齿表面的停留时间。

实施例2：在牙膏中GLDA与厚朴提取物组合物的协同抗菌作用

按照表4中所列制备如下牙膏配方。其中的厚朴提取物是通过超临界二氧化碳的方法从厚朴提取得到的，为干粉形式。

表4

1.表4中牙膏配方OD630nm值的测定

用培养测试细菌(F.n，S.m)的空白培养基将菌液稀释到OD630＝0.25。将稀释后的菌液分装到各支反应管中，每支反应管各装10ml。用微量移液器吸取每种样品牙膏浆(牙膏：水＝1：2)各25μl于相对应的做好记号的反应管中，震荡5s使样品溶液充分分散于菌液中；将反应管转移到相应培养箱中进行培养，于2h、4h、6h、22h和24h五个时间点取出反应管读取其OD630nm值。OD630nm值越小，抑菌效果越好。

实验所得OD630nm值见表5：

表5

测定上述表4所示牙膏配方针对两种菌种S.m以及F.n的OD630nm值，得到上述表5所示的OD630nm值实验结果。通过比较该实验结果可以看出：当牙膏配方中同时包含GLDA与厚朴提取物时(参见牙膏配方2)，其抗菌效果明显好于单单包含相同量厚朴提取物的牙膏配方(参见牙膏配方8)，说明GLDA与厚朴提取物联用产生了协同效果。结果表明，当厚朴提取物中厚朴酚与和厚朴酚的比例不同时牙膏配方的抗菌能力也不相同，和厚朴酚比例越高，其抗菌能力越强(参见牙膏配方2、3、5，其中厚朴酚：和厚朴酚分别为2:8、8:2、5:5)。而且，我们还意想不到的发现，当与GLDA联用时，厚朴提取物的含量越高抗菌效果更好(参见牙膏配方5和6)。

2.表4中牙膏配方的抑菌圈实验

1)HAp片的处理：取牙膏样品按质量比牙膏：水＝1：2配制牙膏浆，将HAp片浸泡在100ml配制好的牙膏浆中，浸泡30min后取出，晾干之HAp片表面没有明水，待用；

2)试验平板的配制：按照供应商提供培养基中加入1.5％的Agar进行配制，500ml培养基加入7.5gAgar后高温高压灭菌；将培养活化好的菌液梯度稀释到10-1，取10-1梯度进行涂布，每个平板取0.20ml稀释菌液涂布，涂布一个重复；将准备好的HAp片轻放至涂布好的平板中央位置，用镊子使正面朝下，后轻压使完全接触平板表面；将平板正面放入37℃的CO2恒温培养箱培养24h，后取出测量抑菌圈直径数据直径。直径越大，抑菌效果越好。得到的牙膏配方抑菌圈直径如表6所示：

表6

注：以上表格直径单位以cm计；HAP片本身的直径为1.25cm

将上述表4所示牙膏配方进行抑菌圈实验，得到上述表6所示的抑菌圈实验结果。通过比较该实验结果可以看出：当牙膏配方中同时包含GLDA与厚朴提取物时(参见牙膏配方2)，其抗菌效果明显好于单单包含相同量厚朴提取物的牙膏配方(参见牙膏配方8)，说明GLDA与厚朴提取物联用产生了协同效果。而当厚朴提取物中厚朴酚与和厚朴酚的比例不同时牙膏配方的抗菌能力也不相同，和厚朴酚比例越高，其抗菌能力越强(参见牙膏配方2、3、5，其中厚朴酚：和厚朴酚分别为2:8、8:2、5:5，同样抗菌能力也依次为牙膏配方2>牙膏配方5>牙膏配方3)。由此进一步验证了在牙膏配方中GLDA与厚朴提取物的协同抗菌能力。而且，我们还意想不到的发现，当与GLDA联用时，厚朴提取物的含量越高抗菌效果更好(参见牙膏配方5和6)。

实施例3.GLDA可提高厚朴提取物在水溶液中的溶解度

1.厚朴酚/和厚朴酚回收率的测定：

按照表7所列配制牙膏配方10、11、12、13，并测定上述配方厚朴酚/和厚朴酚的回收率。测定步骤如下：称取5g牙膏至烧杯中，加15g水，磁力搅拌3min，得到搅拌均匀的牙膏浆。所得牙膏浆用Hettich32型高速离心机6000rpm离心15分钟得上清液，取2ml上清液至100ml容量瓶，用甲醇定容至刻度，摇匀。用HPLC检测牙膏浆中厚朴酚/和厚朴酚浓度，计算厚朴酚/和厚朴酚的溶出度，并计算回收率。实验重复5次，取平均值，计算标准偏差。

测定结果一并列于表7。厚朴酚和厚朴酚的回收率越高说明在水溶液中的溶解度越高。

表7

通过表7的实验结果可以看出：当牙膏配方中包含厚朴酚而不包含GLDA时(参见牙膏配方13)，其厚朴酚与和厚朴酚的回收率要低于同时包含厚朴酚与GLDA的牙膏配方(参见牙膏配方10)，可见GLDA可提高厚朴酚在水溶液中的溶解度。而当牙膏配方中包含厚朴酚与和厚朴酚而不包含GLDA时(参见牙膏配方12)，其厚朴酚与和厚朴酚回收率要低于同时包含厚朴酚与和厚朴酚与GLDA的牙膏配方(参见牙膏配方11)，可见GLDA可提高厚朴酚与和厚朴酚在水溶液中的溶解度。

2.厚朴提取物在水溶液中溶解情况测定

如表8所示，制备组合物。其中的厚朴提取物是通过超临界二氧化碳的方法从厚朴提取得到的，为干粉形式。

表8

检测具有不同组成的组合物在水溶液中厚朴酚与和厚朴酚的浓度，可以比较各组合物的溶解情况。由实验结果可以看出：由于厚朴提取物本身在水溶液中的溶解度不高，因此组合物中含有的厚朴提取物在水溶液中并不能完全溶解，例如，组合物10中含有0.3％的厚朴提取物，而在溶液中检测到的厚朴酚与和厚朴酚浓度仅有0.22％；组合物15中含有2％的厚朴提取物，而在溶液中检测到的厚朴酚与和厚朴酚浓度仅有0.23％，可见厚朴提取物在水溶液中的溶解度有限，且并不随着厚朴提取物浓度的增加而增加。

当组合物中含有GLDA时(参见组合物12、13)，检测到的水溶液中溶解的厚朴酚与和厚朴酚的浓度相对于不含有GLDA的组合物(参见组合物10)会有所提高，由此可见，GLDA可以提高厚朴提取物在水溶液中的溶解度。特别地，在厚朴提取物含量较高的情形下，加入GLDA(参见组合物16)与不加入GLDA相比(参见组合物15)，所检测到的水溶液中溶解的厚朴酚与和厚朴酚的浓度大大提高，可见GLDA对于提高高浓度厚朴提取物在水环境中的溶解度效果更为明显。

Claims (30)

1.一种组合物，包含螯合剂与来自厚朴提取物的化合物，其中所述来自厚朴提取物的化合物包含至少一种选自下组的活性化合物：和厚朴酚、厚朴酚、和厚朴酚衍生物、与厚朴酚衍生物。

2.如权利要求1所述的组合物，所述螯合剂是谷氨酸羧酸盐。

3.如权利要求2所述的组合物，其中所述谷氨酸羧酸盐是谷氨酸二乙酸盐。

4.如权利要求2所述的组合物，其中所述谷氨酸羧酸盐是谷氨酸二乙酸四钠。

5.如上述权利要求任一所述的组合物，其中所述螯合剂在所述组合物中的重量百分含量为0.1％-10％。

6.如上述权利要求任一所述的组合物，其中所述螯合剂在所述组合物中的重量百分含量为1％-8％。

7.如上述权利要求任一所述的组合物，其中所述螯合剂在所述组合物中的重量百分含量为2％-5％。

8.如上述权利要求任一所述的组合物，其中所述和厚朴酚衍生物选自四氢和厚朴酚、丙基和厚朴酚、异丙基和厚朴酚、丁基和厚朴酚中的一种或者多种。

9.如权利要求1-7任一所述的组合物，所述厚朴酚衍生物选自四氢厚朴酚、丙基厚朴酚、异丙基厚朴酚、丁基厚朴酚中的一种或多种。

10.如上述权利要求任一所述的组合物，其中所述来自厚朴提取物的化合物包含在厚朴提取物中，且所述厚朴提取物在组合物中的重量百分含量为0.01％-10％。

11.如权利要求10所述的组合物，其中所述厚朴提取物在所述组合物中的重量百分含量为0.1％-5％。

12.如权利要求10所述的组合物，其中所述厚朴提取物在所述组合物中的重量百分含量为0.3％-2％。

13.如权利要求10-12中任一所述的组合物，其中所述和厚朴酚或其衍生物在所述厚朴提取物中的重量百分含量为1％-99％。

14.如权利要求13中任一所述的组合物，其中所述和厚朴酚或其衍生物在所述厚朴提取物中的重量百分含量为20％-80％。

15.如权利要求14中任一所述的组合物，其中所述和厚朴酚或其衍生物在所述厚朴提取物中的重量百分含量为50％-80％。

16.如权利要求10-15中任一所述的组合物，其中所述厚朴酚或其衍生物在所述厚朴提取物中的重量百分含量为1％-99％。

17.如权利要求16所述的组合物，其中所述厚朴酚或其衍生物在所述厚朴提取物中的重量百分含量为20％-80％。

18.如权利要求17所述的组合物，其中所述厚朴酚或其衍生物在所述厚朴提取物中的重量百分含量为20％-50％。

19.如权利要求10-18任一所述的组合物，其中所述厚朴提取物中包含和厚朴酚以及厚朴酚，且和厚朴酚的含量高于或等于厚朴酚的含量。

20.如权利要求19所述的组合物，其中在所述厚朴提取物中厚朴酚：和厚朴酚的重量百分比的比例为1:9，2:8，3:7，4:6，或5:5。

21.如上述权利要求任一所述的组合物，其进一步包含助沉剂。

22.如权利要求21所述的组合物，所述助沉剂是甲基乙烯基醚/马来酸酐共聚物。

23.如权利要求21或22所述的组合物，其中所述助沉剂在所述组合物中的重量百分含量为0.1％-10％。

24.如权利要求23所述的组合物，其中所述助沉剂在所述组合物中的重量百分含量为1％-5％。

25.如权利要求24所述的组合物，其中所述助沉剂在所述组合物中的重量百分含量为2％。

26.如上述权利要求任一所述的组合物，进一步包括口腔可接受的载体。

27.如权利要求26所述的组合物，其中所述口腔可接受的载体包含选自防腐剂、表面活性剂、保湿剂、增稠剂、磨擦剂、调味剂、活性成分、水中的一种或者多种。

28.如权利要求27所述的组合物，所述组合物是一种口腔护理组合物。

29.如上述权利要求任一所述的组合物在制备用于口腔抗菌的组合物中的用途。

30.一种抑制口腔细菌的方法，所述方法包括使上述权利要求任一所述的组合物与口腔内细菌相接触。