CN114621877B - 一种产果胶酶的长孢土赤壳菌株及其应用 - Google Patents

一种产果胶酶的长孢土赤壳菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种产果胶酶的长孢土赤壳菌株及其应用，所述菌株为长孢土赤壳菌（Illyonectria longispora）Tmq2017，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC No.23895。所述长孢土赤壳菌Tmq2017的应用为在发酵制备果胶酶中的应用，其发酵液中果胶酶的酶活高达21437U/mL，发酵液中果胶甲脂酶的酶高达4528U/mL，远远优于现有技术制备得到的果胶酶活性。本发明针对长孢土赤壳菌提供的发酵培养基原料成本低，配置简单；发酵周期短，条件温和，易于控制，产率高，具有广阔的工业应用前景。

Description

一种产果胶酶的长孢土赤壳菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种高产果胶酶的长孢土赤壳菌株及其应用。
背景技术
果胶是在高等植物细胞壁中发现的一类复合多糖，存在于位于中板层的细胞壁、初级细胞壁和次级细胞壁中，主要是作为水合剂和粘合材料使得纤维素网络结构彼此互交联在一起，从而形成复杂的细胞壁的骨架结构，起着维持细胞结构和功能稳定性的作用。果胶类物质在高等植物细胞壁中含量丰富。
果胶的存在，会导致造纸工艺中因果胶复合物的形成而使过滤过程受阻；在果汁饮料的生产过程中，使得果浆粘度较高，果汁难以澄清；在动物饲料中因果胶多糖粘度高，导致底物和和消化酶在肠道中的分散速率下降，影响消化吸收；在水果罐头加工、果酱生产、果胶生产等工业生产中产生的果胶废水，因含大量悬浮物和高浓度的果胶，导致生化处理效率大幅下降乃至失效。因此，如何去除果胶至关重要。
果胶酶是一类能够特异降解果胶类物质的多种酶的总称。果胶酶的种类丰富。根据作用底物类型与底物的作用方式，可将果胶酶分为：(Ⅰ)原果胶酶（Protopectinase )，主要作用于位于原果胶外部的连接聚半乳糖醛酸链和细胞壁成分的多糖链区域。(II)裂解酶(Pectin lyase，PL)，作用于多聚半乳糖醛酸链的a-1,4-D-糖苷键。（III)果胶甲酯酶(Pectin methylesterase,PME)，在果胶的平滑区聚半乳糖醛酸主链上脱去甲基，产生果胶酸和甲醇。(IV)多聚半乳糖醛酸酶(Polygalactronase, PGL)，根据水解作用机理的不同，聚半乳糖醛酸酶可以分为内切聚半乳糖醛酸酶和外切聚半乳糖醛酸酶，主要在果胶须状区发挥降解作用。
微生物果胶酶是工业用果胶酶的重要来源，但由于目前微生物发酵制备得到的果胶酶活性不高，导致生产工业用果胶酶的成本过高。
土赤壳菌(Ilyonectria)是一种世界性分布的土传病原真菌，寄主范围广泛，常见于木本和草本植物根内或土壤中，属于腐生或弱寄生真菌，可引起根腐病和黑腐病等。已有研究发现，土赤壳可导致葡萄藤黑脚病、苹果茎腐病、高丽参锈腐病、三七锈斑病和猕猴桃根腐病等多种作物病害的发生。
本发明旨在提供一种产高酶活果胶酶的长孢土赤壳菌株。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种产果胶酶的长孢土赤壳菌株，本发明的第二目的是提供所述产果胶酶的长孢土赤壳菌株的应用，本发明的第三目的是提供一种用于长孢土赤壳菌发酵产果胶酶的发酵培养基，本发明的第四目的是提供一种长孢土赤壳菌发酵制备果胶酶的方法。
本发明的第一目的是这样实现的，一株长孢土赤壳菌（Illyonectria longispora）Tmq2017，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2021年12月13日，编号为CGMCC No.23895。
本发明的第二目的是这样实现的，所述长孢土赤壳菌Tmq2017的应用为在发酵制备果胶酶中的应用。
本发明的第三目的是这样实现的，一种用于长孢土赤壳菌发酵产果胶酶的发酵培养基，以1L计，所述发酵培养基含马铃薯浸汁100-200 g，甘露醇2-8g，硝酸铵8-20 g，淀粉30-50g，果胶0.8-2.5 g，pH为 5.6-6.8。
本发明的第四目的是这样实现的，一种长孢土赤壳菌发酵制备果胶酶的方法，是将长孢土赤壳菌接种到所述发酵培养基中，在发酵温度为22-24℃，发酵时间84-108h，摇床震荡速度为150 -200r/min的条件下进行发酵，将得到的发酵液在10000 r/min条件下离心15 min，取上清液即为果胶酶粗酶液。
本发明的有益效果为：
1）本发明提供了一株高产果胶酶的长孢土赤壳菌株，为产生果胶酶提供了新的菌种来源；本菌株发酵制备得到的发酵液果胶酶酶活高达21482U/mL，果胶甲脂酶活性达为4548U/mL，远远优于现有技术制备得到的果胶酶活性，具有广阔的应用前景。
2）本发明针对长孢土赤壳菌提供了一种针对性的高产果胶酶的发酵培养基，该培养基原料成本低，配置简单。发酵周期短，条件温和，易于控制，产率高，值得推广应用。
附图说明
图1为长孢土赤壳菌Tmq2017的显微形态图（标尺=10μm）：其中，A和B为长孢土赤壳菌Tmq2017的厚垣孢子的显微形态图；C为大分生孢子的显微形态图；D为小分生孢子的显微形态图；E-G为孢子梗的显微形态图；
图2为长孢土赤壳菌Tmq2017的系统发育树。
具体实施方式
下面结合附图与实施例对本发明作进一步的详细说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。
本发明一株长孢土赤壳菌株，该菌株为长孢土赤壳菌（Illyonectria longispora）Tmq2017，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2021年12月13日，保藏编号为CGMCC No.23895。
本发明还提供了所述长孢土赤壳菌株的应用为在发酵制备果胶酶中的应用。
所述长孢土赤壳Tmq2017发酵液中果胶酶的酶活高达21482U/mL，发酵液中果胶甲脂酶的酶高达4548U/mL。
本发明进一步提供了一种用于长孢土赤壳菌发酵产果胶酶的发酵培养基，以1L计，所述发酵培养基含马铃薯浸汁100-200 g，甘露醇2-8g，硝酸铵8-20 g，淀粉30-50g，果胶0.8-2.5 g，pH为 5.6-6.8。
本发明更进一步提供了一种长孢土赤壳菌发酵制备果胶酶的方法，该方法具体是将长孢土赤壳菌株接种到所述发酵培养基中，在发酵温度为22-24℃，发酵时间84-108h，摇床震荡速度为150-200r/min的条件下进行发酵，将得到的发酵液在10000-12000 r/min条件下离心15 min，取上清液即为果胶酶粗酶液。
实施例1 菌株Tmq2017的分离纯化与鉴定：
一、菌株Tmq2017的分离纯化
菌株Tmq2017分离于云南省彝良县小草坝乡，将病天麻用无菌水进行表面清洗，然后用75%乙醇或1%次氯酸钠进行表面消毒，取小量病块，置于常规PDA平板，25℃培养，按常规真菌纯化方法纯化培养，获得本发明菌株Tmq2017。
二、菌株Tmq2017的鉴定
通过形态学鉴定和分子生物学鉴定，鉴定结果显示菌株Tmq2017为长孢土赤壳新种。
1、形态特征（图1）
在PDA培养基上，分生孢子梗不分枝或不规则分枝，透明，壁光滑，长41.8 - 202.0μm。产孢细胞呈圆柱形至锥形，长26.8-54.7，基部直径1.8-3.1 μm，端部直径1.6-2.1 μm，有明显领环结构，周壁增厚不明显。小分生孢子0-1隔，椭圆形到卵形到近圆柱形，直，透明，壁光滑，大多数有一脐；无隔小孢子，6.5-13.6 × 3.7-4.9 μm (av. = 9.7 × 4.3 μm)，长宽比1.4-3.1；1隔小孢子11.2-17.9 ×3.6-5.8 μm (av. = 16.2 × 5.4 μm)，长宽比2.7-3.9；大分生孢子1- 3隔，直或稍弯曲，透明，壁光滑，大多数有一脐；1隔大孢子18.1-35.8 × 4.0-7.6 μm (av = 25.4 × 5.9 μm)，长宽比3.3-5.8；2隔大孢子17-38 × 4.4-8.4 μm (av. = 30.2 × 6.2 μm)，长宽比3.3-5.3；3隔大孢子25.5- 47.2 × 5.3 -7.9 μm (av. = 34.9 × 6.9 μm)，长宽比4.0-6.5。厚垣孢子近球形或椭圆形，壁光滑，11.0-16.5 × 10.5-13.6 μm，金棕色，顶生或间生，呈链状或簇生，成熟时大量形成。
2、培养特点
25℃培养14天后，菌落长满6cm PDA平板。气生菌丝呈棉絮状，致密，密度均匀。正反面均呈赭色到黄褐色。
3、分子生物学鉴定
通过特异性引物（表1）对菌株Tmq2017的ITS, TEF, TUB, HIS 片段进行PCR扩增测序，获得序列（如SEQ ID No.1-4所示）上传至NCBI，登录号分别为（ITS: OK317003 ,TEF: OK505029, TUB: OK505045, HIS：OK505015），同时利用BLAST程序在NCBI中分别查找最相似序列，ITS最相似的序列是OK317015.1和OK317012.1，TEF最相似的序列是MF350499.1, TUB最相似的序列是JF735425.1和JF735426.1, HIS最相似的序列是MF553540.1和MF350445.1。把四个位点的DNA序列比对，通过构建系统发育树（图2），将本菌株鉴定为长孢土赤壳新种。
表1 长孢土赤壳菌Tmq2017 ITS, TEF, TUB, HIS片段PCR扩增引物
Figure DEST_PATH_IMAGE001
实施例2 发酵种子液制备
准确称取已削皮切块的马铃薯200g，加热熬汁，八层纱布过滤，取清汁。向马铃薯汁中加入20g蔗糖，磷酸氢二钾6.5 g，并稀释至1000ml即得种子培养基。将平板上的长孢土赤壳菌Tmq2017纯种转接到多个250mL三角瓶中，其中装有100mL种子培养基，然后在 23℃±1℃往复式震荡摇床转速100 r/min下培养培养40h后，即得发酵种子液。
实施例3
一种用于长孢土赤壳菌发酵产果胶酶的发酵培养基，以1L计，由马铃薯浸汁100g，甘露醇8g，硝酸铵16g，淀粉31g，果胶2.5 g组成。
具体制备方法如下：将100马铃薯削皮切块，加热熬汁，八层纱布过滤，取清汁。向马铃薯汁中加入8g甘露醇，16g硝酸铵，31g淀粉并稀释至1000ml，最后加入2.5g果胶搅拌均匀，调节pH为5.6，121℃灭菌15min，自然冷却即得发酵培养基。
将实施例2制得的发酵种子液接种于本实施例制备的发酵培养基，250mL的三角瓶装液量为 150mL，接种量为9mL，于25℃，转速170 r/min下培养4d得到发酵液，在10000 r/min条件下离心15 min，上清液即为果胶酶粗酶液。
实施例4
一种用于长孢土赤壳菌发酵产果胶酶的发酵培养基，以1L计，由马铃薯浸汁100g，甘露醇6g，硝酸铵15 g，淀粉40g，果胶2 g组成。
具体制备方法如下：将100马铃薯削皮切块，加热熬汁，八层纱布过滤，取清汁。向马铃薯汁中加入6g甘露醇，15g硝酸铵，40g淀粉并稀释至1000ml，最后加入2 g果胶搅拌均匀，调节pH为6，121℃灭菌15min，自然冷却即得发酵培养基。
将实施例2制得的发酵种子液接种于本实施例制备的发酵培养基，250mL的三角瓶装液量为 150mL，接种量为5%，于23℃，转速170 r/min下培养4d得到发酵液，在10000 r/min条件下离心15 min，上清液即为果胶酶粗酶液。
实施例5
一种用于长孢土赤壳菌发酵产果胶酶的发酵培养基，以1L计，由马铃薯浸汁10 g，甘露醇2g，硝酸铵8g，淀粉25g，果胶0.8 g组成。
具体制备方法如下：200g马铃薯削皮切块，加热熬汁，八层纱布过滤，取清汁。向马铃薯汁中加入8g甘露醇，18 g硝酸铵，50g淀粉并稀释至1000ml，最后加入2.5 g果胶搅拌均匀，调节pH为6.5，121℃灭菌15min，自然冷却即得发酵培养基。
将实施例2制得的发酵种子液接种于本实施例所制备的发酵培养基，250mL的三角瓶装液量为 150mL，接种量为3%，于24℃，转速200 r/min下培养84h得到发酵液，在11000r/min条件下离心12 min，上清液即为果胶酶粗酶液。
实施例6
一种用于长孢土赤壳菌发酵产果胶酶的发酵培养基，以1L计，由马铃薯浸汁150g，甘露醇6g，硝酸铵20g，淀粉31g，果胶0.8g组成。
具体制备方法如下：将150g马铃薯削皮切块，加热熬汁，八层纱布过滤，取清汁。向马铃薯汁中加入4g甘露醇，12 g硝酸铵，30g淀粉并稀释至1000ml，最后加入1.5 g果胶搅拌均匀，调节pH为6.4，121℃灭菌15min，自然冷却即得发酵培养基。
将实施例2制得的发酵种子液接种于本实施例所制备的发酵培养基，250mL的三角瓶装液量为 150mL，接种量为3%，于22℃，转速150 r/min下培养108h得到发酵液，在12000r/min条件下离心10 min，上清液即为果胶酶粗酶液。
实施例7
一种用于长孢土赤壳菌发酵产果胶酶的发酵培养基，以1L计，由马铃薯浸汁180g，甘露醇6g，硝酸铵16g，淀粉38g，果胶2.5g组成。
具体制备方法如下：将180g马铃薯削皮切块，加热熬汁，八层纱布过滤，取清汁。向马铃薯汁中加入8g甘露醇，15 g硝酸铵，50g淀粉并稀释至1000ml，最后加入2g果胶搅拌均匀，调节pH为6，121℃灭菌15min，自然冷却即得发酵培养基。
将实施例2制得的发酵种子液接种于本实施例所制备的发酵培养基，250mL的三角瓶装液量为 150mL，接种量为7%，于23℃，转速180 r/min下培养96h得到发酵液，在10000r/min条件下离心18 min，上清液即为果胶酶粗酶液。
实施例8
一种用于长孢土赤壳菌发酵产果胶酶的发酵培养基，以1L计，由马铃薯浸汁180g，甘露醇4g，硝酸铵16g，淀粉45g，果胶0.8g组成。
具体制备方法如下：将180g马铃薯削皮切块，加热熬汁，八层纱布过滤，取清汁。向马铃薯汁中加入6g甘露醇，16 g硝酸铵，38g淀粉并稀释至1000ml，最后加入2g果胶搅拌均匀，调节pH为6.0，121℃灭菌15min，自然冷却即得发酵培养基。
将实施例2制得的发酵种子液接种于本实施例所制备的发酵培养基，250mL的三角瓶装液量为 150mL，接种量为5%，于24℃，转速160 r/min下培养102h得到发酵液，在12000r/min条件下离心12 min，上清液即为果胶酶粗酶液。
对比例1
一种长孢土赤壳菌基础发酵培养基，含有10 g/L果胶，1.0 g/L K2HPO4，0.1 g/LCaCl2，0.5 g/L NaCl，0.1 g/L MgSO4，1.0 g/L (NH4)2SO4，10.0 g/L葡萄糖。
将实施例2制得的发酵种子液接种于本实施例所制备的发酵培养基，250mL的三角瓶装液量为 150mL，250mL的三角瓶装液量为 150mL，接种量为5%，于23℃，转速170 r/min下培养4d即得发酵液，在10000 r/min条件下离心15 min，取上清液为果胶酶粗酶液。
试验例1 果胶酶酶活测定
试剂：DNS溶液：
1)配制500 mL含有182 g的酒石酸钾钠热水溶液；
2)配制262 mL的2 mol/L的NaOH溶液；
3)称取6.3 g的3,5一二硝基水杨酸；
4)称取5.0g苯酚；
5)称取5.0g无水亚硫酸钠；
6)将2)、3)、4)、5)、6)各成分按顺序加入1)液中，充分溶解，冷却定容至1L，一周后使用。
1、标准曲线：半乳糖标准曲线的绘制
用pH为5的磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液配制1.0 g/L的半乳糖醛酸标准溶液，分别取标准D-半乳糖醛酸溶液(1.0 g/L) 0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4，0.5, 0.6, 0.7，0.8, 0.9ml置于50 mL比色管中(三个平行)，用缓冲液补足至1mL，各加入DNS试剂3 mL，沸水浴中煮沸10 min，然后用流动水迅速冷却，用蒸馏水定容到25mL, 10000 r/min离心2 min，用分光光度计在540 nm处测定吸光度。
以半乳糖醛酸浓度为横坐标、吸光值(OD540)为纵坐标，绘制半乳糖醛酸标准曲线。
试验方法：吸取0.8 mL果胶溶液加入50 mL的比色管中，50℃水浴加热5 min，加入0.2mL的稀释粗酶液，50℃水浴30 min，加入3mL的DNS试剂，沸水浴10 min,流水冷却，用蒸馏水定容至25 mL，混合均匀，10000 r/min离心2min，用分光光度计在540 nm处测溶液的OD值。对照组为灭活的果胶酶粗酶液。
根据半乳糖醛酸标准曲线测定实施例3-8与对比例1的果胶酶粗酶液50℃时的果胶酶酶活力，结果如表1所示。
结果：从表1可知，菌株Tmq2017在本发明提供的发酵培养基发酵得到的果胶酶粗酶液的果胶酶酶活远优于基础培养基。
试验例2 果胶甲酯酶酶活测定
试验试剂：0.5 mol/L三氯乙酸：称取8.17 g三氯乙酸定容至100 mL，保存在棕色瓶中，用锡纸包裹。
Tris-HCL缓冲溶液(pH7.5)：50 mL 0.1mol三羟甲基氨基甲烷（Tris)溶液与40.3mL 0.1mol盐酸混匀后，加水稀释至100 mL。
溶液A:150 mg p-NPP 溶于50 mL异丙醇中，超声，使得 p-NPP完全溶于异丙醇中，4℃保存备用。
溶液B：2.22g Triton-100和0.56 g 阿拉伯胶加入Tris-HCL缓冲溶液(pH7.5)中，磁力搅拌器混匀，定容至500 mL，4℃保存备用。
试验方法：取5 mL果胶溶液于三角瓶中，每个样设置3个平行，50℃条件下，水浴5min。使用NaOH溶液(浓度为0.1 mol/L)调节pH至4.0，加入1ml酶活稀释B倍的粗酶液，计时。使用0.01mol/L的NaOH溶液滴定pH至4.5。反应过程中，果胶甲酯酶(PE)催化果胶快速水解，从而使得反应体系的pH值不断下降。利用酸碱自动滴定仪，滴定NaOH(浓度为0.01mol/L )，使反应体系的pH始保持在4.5直至反应停止。以滴定NaOH的量(μmoL)来计算果胶甲酯酶(PE)的酶活力。
酶活力计算公式：
Figure 982037DEST_PATH_IMAGE002
V为NaOH溶液的体积，B为酶液的稀释倍数。
按此方法测定测定实施例3-8与对比例1的果胶酶粗酶液在50℃时的果胶甲脂酶活力，结果如表2所示。
表2 实施例3-8及对比例1果胶酶粗酶液在50℃下的酶活力
Figure DEST_PATH_IMAGE003
结果：从表2可知，本菌株在本发明提供的发酵培养基发酵得到的果胶酶粗酶液的果胶甲酯酶酶活远优于基础发酵培养基。
综合表1和表2可知，本发明制备得到的果胶酶的活力为17940-21482U/mL，果胶甲酯酶的活力为3728-4548U/mL，优于现有技术制备的微生物果胶酶。
试验例3 果胶降解实验
试验方法：从市场上购买橙子、草莓和苹果两种水果，使用榨汁机将两种水果粉碎提取果浆，用纱布过滤得到果汁原浆，称量果汁原浆的质量，各分成两份，以加入实施例3制备的果胶酶的为试验组（加入量为：0.02mL酶液/g果汁），不加果胶酶的为对照组，50℃水浴环境下反应2 h,10000 rpm离心10 min，得到澄清果汁，称量澄清果汁的重量，计算果汁的出汁率，具体结果见表3。
表3果汁出汁率的测定
Figure 124305DEST_PATH_IMAGE004
注：出汁率=(澄清果汁重量/果汁原浆重量)×100%
从表3可知，草莓果汁原浆实验组的出汁率高达90.7%，远优于对照组的58.3%。其中芒果果汁原浆实验组的出汁率高达77%，为对照组出汁率的21.7%。说明本发明制备的果胶酶粗酶液（21482U/mL）在加入量为：0.02mL酶液/g果汁，反应温度为50℃条件下反应2h，与不加酶液的对照相比，果汁原浆果汁出率提高了1.4-3.5倍，提高了果汁产量，说明了该果胶酶粗酶液对果汁原浆中果胶具有优异的降解效果。
试验例4 发酵培养基条件优化过程
一、单因素试验
在本发明发酵培养基的基础上，只改变其中一个条件，配置不同的培养基，将相同量的接种量（10ml）菌种接种于250mL，装有100mL 培养液，在23℃ ±1℃，转速 150 r/min下培养培养4d。然后按实施例 1 步骤测定酶活，结果见表4-8。
表4 不同碳源对长孢土赤壳菌果胶酶活性的影响
Figure DEST_PATH_IMAGE005
表5不同氮源对长孢土赤壳菌果胶酶活性的影响
Figure 554891DEST_PATH_IMAGE006
表6不同多糖对长孢土赤壳菌果胶酶活性的影响
Figure DEST_PATH_IMAGE007
表7 不同pH对长孢土赤壳菌果胶酶活性的影响
Figure 884242DEST_PATH_IMAGE008
表8 不同维生素对长孢土赤壳菌果胶甲脂酶活性的影响
Figure DEST_PATH_IMAGE009
二、多因素试验：正交实验确定最优发酵条件
从单因素实验确定的培养基的基础上，改变各成分的溶度，和 pH 值，配置不同的培养基（如表9），将相同量的接种量（9ml）菌种接种于250mL，装有150mL 培养液，在23℃ ±1℃，转速 150 r/min 下培养培养4d。然后按试验例1 步骤测定酶活，实验结果见表10。选取正交实验最优结果和其产酶量最高的实验组号，进行验证实验。为了避免累赘实施例中的培养基配法、粗酶液的制作、酶活测定方法均与实施例2的方法相同，结果见表11。
表9正交试验设计
Figure 942196DEST_PATH_IMAGE010
表10 正交试验结果
Figure DEST_PATH_IMAGE011
注 : Ⅰ1为各因素水平1的所有酶活力之和，Ⅱ2为各因素水平2的所有酶活力之和，Ⅲ3为各因素水平3的所有酶活力之和，Ⅳ4为各因素水平4的所有酶活力之和，R为极差，酶活力的数字代表3次重复的平均值(mean)±标准差(S.D)。
表11 培养基优化验证试验
Figure 204550DEST_PATH_IMAGE012
正交结果分析表明：最佳因素组合是A4B3C2D4E1，即甘露醇8 g/L，硝酸铵16 g/L，淀粉31 g/L，果胶2.5 g/L，pH 5.6，且结果与验证试验相符合。表2变化因子的极差值R分别为甘露醇(7632)、氮源（5208)、淀粉(2088)、果胶 (7120) 和 pH(5936)，表明甘露醇、氮源、淀粉、果胶和pH的变化与土赤壳菌属真菌产果胶酶的培养基息息相关，尤其是甘露醇和果胶的变化对该真菌产酶的影响更大。相对而言，淀粉含量的改变对产酶的影响较小。
SEQUENCE LISTING
<110> 乔胤淇
<120> 一种产果胶酶的土赤壳菌及其应用
<130> 20220106
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 521
<212> DNA
<213> Illyonectria longispora IMF1.06934
<400> 1
acaaggtctc cgtatggtga accagcggag ggatcattac cgagtttaca actcccaaac 60
ccctgtgaac ataccatttg ttgcctcggt ggtgcctgct tcggcagccc gccagaggac 120
ccaaaccctt gattttatac agtatcttct gagtaaatga ttaaataaat caaaactttc 180
aacaacggat ctcttggttc tggcatcgat gaagaacgca gcgaaatgcg ataagtaatg 240
tgaattgcag aattcagtga atcatcgaat ctttgaacgc acattgcgcc cgccagtatt 300
ctggcgggca tgcctgttcg agcgtcattt caaccctcaa gcccccgggc ttggtgttgg 360
agatcggcgt gccctccggg gcgcgccggc tcccaaatat agtggcggtc tcgctgtagc 420
ttcctctgcg tagtagcaca cctcgcactg ggaaacagcg tggccacgcc gttaaacccc 480
ccacttctga aaggttgacc tcggatcagg taggatccat c 521
<210> 2
<211> 498
<212> DNA
<213> Illyonectria longispora YMF1.06934
<400> 2
tcatgttctt gatgaagtca cggtgaccgg gggcatctgt tgagtgagag ttagaatgtg 60
ccaagtgaag aagaaactca gagccagtga caacttacca atgacggtga caaagtagcg 120
gggagtctcg aacttccaca gggcaatgtc gatggtgata ccacgctcac gctcggcctt 180
gagcttgtca agaacccagg catacttgaa ggaacccttg ccgagctcgg cagcttcctg 240
taagagggca ctgtcagtat tctgtgcata gcatgtgaag aggcccgcga tgatgatttg 300
atgatgctgt ggtggggcgg ggcaattttc aaccaccagt gtgcggcggg gtaaaattcg 360
cccccaccaa aaaaacaatg gagagtggtg aaaatttttg atcgaggggt gaggggttgt 420
gtttcgtgtg cagacgcagc gacgtggaaa tcgacggtcg tcgagggcag aatcggggaa 480
cagaggacca accttctc 498
<210> 3
<211> 534
<212> DNA
<213> Illyonectria longispora YMF1.06934
<400> 3
cttgtggttg cccgccccca acgacgcgtt ccgttacctg ctcggkcgat gctggcccct 60
gattctaccc cgccgtagca tttccactgc cttcaggaca acaaagctcg ggacttcaac 120
cacgacgtga ttttgggaca agatggctga ccatgacttt cttctgcaat ataggtccac 180
ctccagaccg gccagtgcgt aagtgcttca tcctcttcaa cgatccgacg tgcggggatt 240
cgctaacgat gcgtggatag ggtaaccaaa ttggtgctgc tttctggsag accatctctg 300
gcgagcacgg kctcgacagc aatggtgtct acaacggwwc ctccgagctg cagctcgagc 360
gcatgarcgt ctacttcaac gaggtacgtg aaatccactc atctgcccat atccaggagg 420
tgttgaactc acatcacgca ggcctcygga aacaagtatg tccctgcgcg ccgtccttgt 480
cgatctcgag cccggtacca tggacgctgt ccgtgccggt cctttcggcc agct 534
<210> 4
<211> 494
<212> DNA
<213> Illyonectria longispora YMF1.06934
<400> 4
gcaaggcccc ccgcaagcag cttgcttcca aggctggtga gttctatcct gtgcagacct 60
gaccgtcctg tcctctgctc gacgcgtctc gcaacatcgc acatcccggg catctccctc 120
acatactgac atcacacagc ccgcaagagc gcaccctcta ccggtggtgt caagaagcct 180
caccgctaca agcccggtac cgtcgccctt cgtgagattc gtcgatacca gaagtcgacc 240
gagctcctca tccgcaagct ccccttccag cgtctggtaa gcatcaatca tacccatgtg 300
tcacaccaag catccactct aacacgatca acacaggtcc gtgagatcgc ccaggacttc 360
aagagcgacc ttcgcttcca gtcctccgcc atcggcgccc ttcaggagtc cgtcgagtcc 420
tacctcgtct ccctcttcga ggacaccaac ctgtgcgcca tccacgccca agcgtgtcac 480
catccagtcc aagg 494

Claims (4)

1.一株长孢土赤壳菌（Illyonectria longispora）Tmq2017， 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC No.23895。
2.权利要求1所述长孢土赤壳菌Tmq2017在发酵制备果胶酶中的应用。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，果胶酶的制备方法如下：将长孢土赤壳菌Tmq2017接种到发酵培养基中进行发酵，将得到的发酵液在10000 -12000r/min条件下离心15 min，取上清液即为果胶酶粗酶液，将所述果胶酶粗酶液进一步纯化即得纯果胶酶；所述发酵培养基含马铃薯浸汁100-200 g，甘露醇2-8g，硝酸铵8-20 g，淀粉30-50g，果胶0.8-2.5 g，pH为 5.6-6.8。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，发酵温度为22-24℃，发酵时间84-108h，摇床震荡速度为150-200r/min。
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