EA015492B1 - Способ получения по меньшей мере одного продукта микробного метаболизма, содежащего по крайней мере три атома углерода или по крайней мере два атома углерода и по крайней мере один атом азота, путем микробиологической ферментации сахаров и композиция на основе протеинов, полученная данным способом - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к способу получения по меньшей мере одного продукта микробиологического обмена веществ, содержащего по меньшей мере три атома углерода или по меньшей мере два атома углерода и по меньшей мере один атом азота, микробиологической ферментацией с применением сахара, который включает: a) получение сахарсодержащей жидкой среды, содержание моносахарида в которой составляет более 20 вес.%, из источника крахмала, причем сахарсодержащая жидкая среда содержит также не содержащие крахмал твердые компоненты источника крахмала; b) ферментацию сахарсодержащей жидкой среды для получения продукта(ов) обмена веществ и c) обеднение или выделение по меньшей мере одного продукта обмена веществ из ферментационного бульона, причем штамм микроорганизма, продуцирующий желаемый(ые) продукт(ы) обмена веществ, культивируют сахарсодержащей жидкой средой, которую получают: а1) измельчением источника крахмала и а2) растворением измельченного материала в водной жидкости в присутствии по меньшей мере одного фермента, растворяющего крахмал, и дальнейшим засахариванием с применением по меньшей мере одного засахаривающего фермента, причем по меньшей мере одну часть измельченного материала растворяют непрерывным или периодическим добавлением в водную жидкость.

Description

Способ получения по меньшей мере одного продукта микробного метаболизма, содержащего по крайней мере три атома углерода или по крайней мере два атома углерода и по крайней мере один атом азота, путем микробиологической ферментации сахаров и композиция на основе протеинов, полученная данным способом.

Настоящее изобретение относится к ферментативному получению тонких (чистых) химикатов измельчением, растворением и засахариванием источников крахмала и применению получаемого таких образом сахарного раствора в качестве ферментационной среды.

Способ ферментативного получения тонких химикатов, таких как, например, аминокислоты, витамины и каротиноиды, при помощи микроорганизмов является общеизвестным. В зависимости от различных условий осуществления способа используют различные источники углерода: от чистой сахарозы до мелассы, полученной из свеклы или сахарного тростника, так называемой 1ιί§1ι !ек! то1аккек (инвертная тростниково-сахарная меласса) и вплоть до глюкозы гидролизатов крахмала. При биотехнологическом получении Ь-лизина в качестве промышленно применяемых реагентов используют также уксусную кислоту и этанол (РГеГГег1е е! а1., Вю!есЬпод1са1 МапиГаеШгс оГ Ьукте, Лбуалсек ίη ВюсЕет1са1 Епдтеегтд/Вю!есйпо1оду, νο1. 79 (2003), 59-112).

На основе указанных выше источников углерода были разработаны различные методы и способы ферментативного получения тонких химикатов из сахаров. На примере Ь-лизина эти вещества были описаны, например, РГеГГег1е е! а1. (а.а.О) в отношении развития штаммов, разработки процесса и промышленного производства.

Важным источником углерода для ферментативного получения тонких химикатов посредством микроорганизмов является крахмал. Перед его применением в процессе ферментации в качестве источника углерода его необходимо сначала растворить и засахарить на предыдущих стадиях реакции. С этой целью крахмал добывают из природных источников крахмала, таких как картофель, маниока, зерновые культуры, например пшеница, кукуруза, ячмень, рожь, тритикале или рис, предпочтительно в предварительно очищенной форме, а затем ферментативно растворяют и засахаривают с целью дальнейшего использования непосредственно на стадии ферментации для получения тонких химикатов. Наряду с применением предварительно очищенных таким образом источников крахмала описано также применение предварительно не обработанных источников крахмала для получения источников углерода, используемых для ферментативного получения тонких химикатов. Как правило, при этом источники крахмала предварительно измельчают перемалыванием. Затем измельченный материал подвергают растворению и засахариванию. Поскольку этот измельченный материал наряду с крахмалом содержит еще ряд компонентов, не содержащих крахмал, которые невыгодно влияют на ферментацию, эти компоненты, как правило, выделяют перед осуществлением ферментации. Выделение можно осуществлять непосредственно перед измельчением (νθ 02/277252; 1Р 2001-072701; 1Р 56-169594; СЫ 1218111), после растворения (νθ 02/277252; СЫ 1173541) или после засахаривания (СЫ 1266102; Веикета е! а1.: Ртобисбоп оГ Гегтеп!а!юп кугирк Ьу еп/утаЬс 1зубго1ук1к оГ ро!а!оек; ро!а!ое кассНапПсабоп !о дще си1!иге тебшт (СопГегепсе ЛЬк1гас1). 8утр. Вю!есЬпо1. Кек. Ые!1. (1983), 6; ЫЬ 8302229). Однако во всех вариантах при осуществлении ферментации используют очень чистый гидролизат крахмала.

Были разработаны новейшие технологии, в частности, улучшенные методы, которые позволяют перед ферментацией осуществлять очистку, например, растворенных и засахаренных растворов крахмала (1Р 57159500) и ферментационной среды из регенерируемых источников (ЕР 1205557).

Необогащенные источники крахмала, как известно, широко используют для ферментативного получения биоэтанола. При этом в промышленных масштабах широко применяют способ сухого измельчения, растворения и засахаривания источников крахмала, известный как Огу-тШтд. Соответствующие условия осуществления способа описаны, например, в ТЬе Л1со1ю1 Тех!Ьоок - А геГегепсе Гог 1Пе Ьетегаде, Гие1 апб тбик!па1 а1соЬо1 тбик!пек, 1ас.|иек е! а1. (Нд.), ЫоШпдЬат ЬпА. Ргекк, 1995, 18ВЫ 1-8977676735, и в МсА1ооп е! а1., Ое1егттшд Не сок! оГ ргобистд е!Ьапо1 Ггот согп к!агсй апб Йдпосе11и1ок1с Геебк!оскк, ЫКЕЬ/ТР-580-28893, Ыа!юпа1 Кепе\\'аЫе Епегду ЬаЬога!огу, Ос!оЬег, 2000.

При осуществлении способа Пгу-тб11пд на первой стадии целые зерна зерновых культур, предпочтительно кукурузы, пшеницы, ячменя, пшена и ржи, тонко измельчают. При этом в противоположность так называемому способу '^е!-М111тд не используют никакую дополнительную жидкость. Измельчение на мелкие частицы служит для того, чтобы содержащийся в зернах крахмал на последующих стадиях растворения и засахаривания сделать доступным для воздействия воды и ферментов.

Поскольку при ферментативном получении биоэтанола целевой продукт получают перегонкой, то использование источников крахмала, полученных способом О1у-МШшд, в предварительно не очищенной форме не составляет никаких особых проблем. Однако при применении способа Огу-МШтд для получения тонких химикатов проблематичным является поток твердых веществ, занесенный на стадию ферментации сахарным раствором, поскольку он может отрицательно влиять на процесс ферментации и значительно усложняет последующую переработку.

Так, для многих ферментаций снабжение кислородом используемых микроорганизмов, в особенности, если они имеют большую потребность в кислороде, является лимитирующим фактором. Влияние высоких концентраций твердых веществ на переход кислорода из газообразной в жидкую фазу и, таким

- 1 015492 образом, на показатель переноса кислорода, изучено. С другой стороны, известно, что увеличение вязкости при увеличении концентрации твердых веществ ведет к уменьшению показателя переноса кислорода. Если при этом в ферментационную среду вводят поверхностно-активные агенты, содержащие твердые вещества, то они влияют на склонность к коагуляции пузырьков газа. Получаемый при этом размер пузырьков, в свою очередь, значительно влияет на перенос кислорода (Мегхтапп, А. с1 а1.: 8е1есбоп аиб Эехщп ой АегоЫс Бюгсасйоге, С1ет. Епд. Тес1то1. 13 (1990), 357-370).

При введении твердого вещества уже в процессе получения крахмалсодержащей суспензии может быть достигнуто критическое значение вязкости используемых сред, поскольку, например, суспензия, содержащая более 30 вес.% кукурузной муки, больше не может быть гомогенно смешана с водой (1пбих1па1 Еихуто1оду. 2. Аий1., Т. СобГгеу. 8. \Уех1 1996). При осуществлении обычных способов это ограничивает концентрацию глюкозы. Из соображений экономии работа с растворами незначительной концентрации, как правило, является невыгодной, поскольку это приводит к необходимости непропорционально высокого разведения ферментационного бульона. При этом достигаемая конечная концентрация целевых продуктов уменьшается, что служит причиной дополнительных затрат при их выделении, кроме того, уменьшается также пространственно-временной выход, что при том же количестве производимой продукции увеличивает потребность в объемах, т.е. приводит к увеличению капитальных затрат.

При переработке из-за повышенной концентрации твердого вещества могут возникнуть особые трудности для использования специальных методов. Так, например, при очистке ферментационного бульона ионообменной хроматографией необходимо учитывать склонность используемой хроматографической колонки к блокированию (т.е. засорению).

Ввиду этих трудностей известные до настоящего времени варианты способа Игу-МШтд не могут быть использованы для разработки источников крахмала, применяемых для ферментативного получения тонких химикатов, и поэтому не имеют особого экономического значения. Попытки внедрить концепцию Игу-МШтд и связанные с этим способом принципиальные преимущества в промышленное получение тонких химикатов до сих пор были описаны лишь при условии использования маниоки в качестве источника крахмала.

Так, например, 1Р 2001/275693 описывает способ ферментативного получения аминокислот, при котором в качестве источника крахмала используют очищенные клубни маниоки, которые подвергают сухому измельчению. Однако для осуществления способа необходимо, чтобы размер частиц измельченного материала <150 мкм. При осуществлении фильтрации более 10 вес.% используемого измельченного материала, включая не содержащие крахмал компоненты, перед растворением/засахариванием содержащегося в них крахмала и последующей ферментацией выделяют. Кроме того, при этом не возникает проблем с выделением не содержащих крахмал компонентов, поскольку продукты ферментации, например лизин, применяют как добавки к кормам и поэтому не содержащие крахмал компоненты маниоки могут оставаться в целевом продукте.

Похожий способ получения аминосодержащей добавки к кормам был описан в 1Р 2001/309751. Аналогично при осуществлении этого способа нет необходимости в очистке или выделении твердых веществ.

Однако маниока по сравнению с другими источниками крахмала является относительно непроблематичным продуктом для осуществления способа Игу-МШтд. В то время как содержание крахмала в корне маниоки в сухом состоянии составляет, как правило, по меньшей мере 80 вес.% (Мепехех е1 а1., Еиида1 се11и1охех ах ап а1б Гог Изе хассйапДсабоп оГ Саххауа, Вю1есйпо1о§у апб Вюепдтееппд, том 20 (4), 1978, 1о11п \УПеу апб 8опх, 1пс., табл. 1, с. 558), содержание сухого вещества в крахмале зерновых является значительно ниже, как правило ниже 70 вес.%, например в кукурузе примерно 68 вес.%, а в пшенице примерно 65 вес.% (1ас.|иех е1 а1., Т1е А1со1ю1 Тех1Ьоок, х.о.). Таким образом, раствор глюкозы, получаемый после растворения и засахаривания, при использовании измельченной сухим способом маниоки содержит меньшее количество примесей и, в частности, меньше твердых веществ, чем при использовании других измельченных сухим способом источников крахмала.

При повышении содержания примесей вязкость реакционной смеси увеличивается. Однако крахмал, полученный из маниоки, должен очень легко перерабатываться. По сравнению с кукурузным крахмалом он имеет более высокую вязкость при температуре набухания, зато при увеличении температуры вязкость крахмала маниоки уменьшается быстрее, чем вязкость кукурузного крахмала (Мепехех, Т.1.В. бе, 8ассйапДсабоп оГ Саххауа Гог е11зу1 а1со1ю1 ргобисбоп, Ргосехх Вюсйет1х1гу, 1978, с. 24, правая колонка). Кроме того, температуры набухания и желатирования полученного из маниоки крахмала ниже соответствующих температур крахмала, полученного из зерновых, таких как кукуруза, поэтому он является более доступных для бактериальной α-амилазы, чем крахмал зерновых (Мепехех, Т.1.В. бе, а.а.О.).

Еще одно преимущество маниоки по сравнению с другими источниками крахмала состоит в незначительном содержании целлюлозы и фитата. Целлюлоза и гемицеллюлоза, в частности, в условиях кислого засахаривания могут быть превращены в фурфуралы (1ас.|иех е1 а1., Т1е А1со1ю1 Тех1Ьоок, х.о.; Мепехех, Т.1.В. бе, х.о.), которые, в свою очередь, оказывают ингибирующее влияние на используемые в ферментации микроорганизмы. Фитат тоже ингибирует используемые в ферментации микроорганизмы.

- 2 015492

Хотя в промышленных масштабах переработка маниоки как источника крахмала способом, соответствующим Эгу-шШшд является возможной, однако, такой способ на основе маниоки является сложным, неоптимальным и поэтому не широко распространенным.

Таким образом, задача данного изобретения состояла в разработке эффективного способа ферментативного получения тонких химикатов, который бы позволял использовать множество содержащих крахмал, доступных для всех растений, например зерновых или картофеля, в качестве источников крахмала. Способ должен был отличаться простотой в использовании различных сред и, в особенности, избегать затратных стадий предварительной или окончательной очистки, например, выделения твердых не содержащих крахмал компонентов, перед ферментацией. Кроме того, способ должен был позволять легкую обработку ферментационной смеси. В рамках проведенных заявителем работ неожиданно было обнаружено, что такой способ может быть эффективно осуществлен даже несмотря не неизбежное увеличение загрузки твердого вещества.

Таким образом, объектом данного изобретения является способ получения по меньшей мере одного продукта обмена веществ микроорганизмов, содержащего по меньшей мере три атома углерода или по меньшей мере два атома углерода и по меньшей мере один атом азота, микробиологической ферментацией из сахаров, который включает:

a) получение сахарсодержащей жидкой среды, содержание моносахарида в которой составляет более 20 вес.%, из источника крахмала, причем сахарсодержащая жидкая среда содержит также не содержащие крахмал твердые компоненты источника крахмала;

b) ферментацию сахарсодержащей жидкой среды для получения продукта(ов) обмена веществ и

c) обеднение или выделение по меньшей мере одного продукта обмена веществ из ферментационного бульона, который заключается в том, что штамм микроорганизма, продуцирующий желаемый(е) продукт(ы) обмена веществ, культивируют сахарсодержащей жидкой средой, которую получают:

а1) измельчением источника крахмала и а2) растворением измельченного материала в водной жидкости в присутствии по меньшей мере одного фермента, растворяющего крахмал, и дальнейшим засахариванием с применением по меньшей мере одного засахаривающего фермента, причем по меньшей мере одну часть измельченного материала растворяют непрерывным или периодическим добавлением в водную жидкость.

В качестве источников крахмала, прежде всего, используют сухие зерна или семена, которые в высушенном состоянии содержат по меньшей мере 40 вес.% и предпочтительно по меньшей мере 50 вес.% крахмала. Такие зерна или семена находятся во многих выращиваемых на сегодняшний день в больших масштабах зерновых культурах, таких как кукуруза, пшеница, овес, ячмень, рожь, тритикале, рис и различные сорта пшена, например сорго. Предпочтительными источниками крахмала являются зерна зерновых культур, особенно предпочтительными - зерна кукурузы, ржи, тритикале и пшеницы. В принципе, способ согласно изобретению можно осуществлять также с использованием других источников крахмала, таких как, например, картофель, маниока/тапиока, или смеси различных содержащих крахмал плодов или семян.

Под содержащими в жидкой среде сахарами подразумевают предпочтительно моносахариды, такие как гексозы и пентозы, например глюкозу, фруктозу, маннозу, галактозу, сорбозу, ксилозу, арабинозу и рибозу, в частности глюкозу. Содержание отличающихся от глюкозы моносахаридов может зависеть от используемых источников крахмала и содержащихся в них компонентов, которые не содержат крахмал, и регулироваться методами осуществления способа, например, расщеплением целлюлозных компонентов путем добавления целлюлазы. Предпочтительно моносахариды сахарсодержащей жидкой среды содержат по меньшей мере от 60 вес.%, предпочтительно по меньшей мере 70 вес.% и особенно предпочтительно по меньшей мере 80 вес.% в пересчете на общее содержание сахара в жидкой среде. Как правило, содержание глюкозы составляет от 75 до 99 вес.%, в частности от 80 до 97 вес.%, в особенности от 85 до 95 вес.% в пересчете на общее содержание сахара в жидкой среде.

Согласно изобретению сахарсодержащая жидкая среда, которой культивируют штамм микроорганизма, вырабатывающий необходимые продукты обмена веществ, содержит по меньшей мере часть, предпочтительно по меньшей мере 20 вес.%, в частности по меньшей мере 50 вес.%, в особенности по меньшей мере 90 вес.% и особенно предпочтительно по меньшей мере 99 вес.% входящих в состав измельченных зерен зерновых культур не содержащих крахмал твердых компонентов в соответствии со степенью измельчения. В пересчете на содержащие крахмал компоненты измельченного материала (и на содержание моносахарида в сахарсодержащей жидкой среде) содержание твердых компонентов в сахарсодержащей жидкой среде составляет предпочтительно по меньшей мере 10 вес.%, в частности по меньшей мере 25 вес.%, например от 25 до 75 вес.%, в особенности от 30 до 60 вес.%.

Для получения сахарсодержащей жидкой среды на стадии а1) соответствующий источник крахмала измельчают с или без добавления жидкости, например воды, предпочтительно без добавления жидкости. Кроме того, сухое измельчение можно также комбинировать с последующим влажным измельчением. Для осуществления сухого измельчения используют, как правило, молотковые мельницы, роторные мельницы или валково-дробильные мельницы; для влажного измельчения подходящими являются мешалки, шаровые мельницы с мешалкой, циркуляционные, дисковые, кольцевые, вибрационные или пла

- 3 015492 нетарные мельницы. Кроме того, могут быть использованы и другие виды мельниц. Необходимое для влажного измельчения количество жидкости специалисты могут определить обычными способами. Как правило, его выбирают таким, что содержание твердого вещества составляет от 10 до 20 вес.%.

При измельчении получают необходимую для осуществления последующей стадии способа величину зерна. При этом предпочтительным оказался вариант, при котором получаемый при измельчении, в частности сухом измельчении, на стадии а1) измельченный материал содержит частицы, т.е. гранулированные компоненты, размер зерен которых составляет от 100 до 630 мкм в количестве от 30 до 100 вес.%, предпочтительно от 40 до 95 вес.% и особенно предпочтительно от 50 до 90 вес.%. Предпочтительно полученный измельченный материал содержит 50 вес.% частиц, размер зерен которых составляет более 100 мкм. Как правило, по меньшей мере 95 вес.% измельченных частиц имеют размер зерен менее 2 мм. При этом размер зерен измеряют ситовым анализом при использовании вибрационной аналитической машины. Незначительный размер зерен является предпочтительным для получения высоких выходов продукта. Однако слишком маленький размер зерен может вызывать проблемы, в частности, по причине комкования/агломерации при перемешивании измельченного материала в процессе растворения или при переработке, например при сушке твердых веществ после ферментации.

Как правило, разные виды муки отличаются степенью помола или сортом муки, причем они так соотносятся друг с другом, что при увеличении степени помола улучшается сорт муки. Степень помола соответствует весовому количеству производимой муки в пересчете на 100 вес.ч. используемого измельченного материала. В то время как при измельчении сначала получают чистую, тонко измельченную муку, например из внутренней части зерна зерновой культуры, при последующем измельчении, т.е. при увеличении степени помола, содержание необработанных волокон и оболочки в муке увеличивается, а содержание крахмала, наоборот, уменьшается. Таким образом, степень помола отражается также на так называемых сортах муки, которые используют как числовые показатели для классификации муки, в частности муки зерновых, и основывается на содержании золы в муке (так называемая зольная шкала). Сорт или тип муки при этом указывает на количество золы (минеральных веществ) в мг, которое остается при сжигании 100 г сухого вещества. Для муки из зерна зерновых культур высший сорт означает высшую степень помола, поскольку само зерно содержит приблизительно 0,4 вес.%, а оболочка - приблизительно 5 вес.% золы. При низкой степени помола мука зерновых состоит предпочтительно из измельченных частиц муки, т. е. из крахмального компонента зерна, а при более высокой степени помола мука из зерна зерновых культур содержит также измельченный содержащий белок алейроновый слой зерна зерновых культур, а в случае муки крупного помола - также компоненты содержащего белок или жир зародыша и оболочку семян, содержащую необработанное волокно и золу. Для поставленных согласно изобретению целей предпочтительной является мука высокой степени помола или высокого сорта. Если в качестве источника крахмала используют зерновые, то предпочтительно измельчают целые неочищенные зерна, а затем подвергают их дальнейшей обработке.

В случае необходимости, источник крахмала перед измельчением дробят до подходящего для измельчения размера, например при использовании больших плодов, таких как картофель или маниока. В случае зерновых культур эта стадия дробления может выпадать, при этом берут целое зерно и подвергают его измельчению.

Для растворения крахмального компонента в измельченном материале в реактор в процессе растворения, однако, перед засахариванием на стадии а2) загружают часть измельченного материала, в частности по меньшей мере 40 вес.%, предпочтительно по меньшей мере 50 вес.% и особенно предпочтительно по меньшей мере 55 вес.%. Часто это количество не превышает 90 вес.%, в частности 85 вес.%, особенно предпочтительно 80 вес.%. Предпочтительно указанное количество измельченного материала загружают в реактор при тех же условиях, при которых осуществляют растворение. Загрузку можно осуществлять периодически, т.е. несколькими порциями, которые составляют предпочтительно не более 20 вес.%, особенно предпочтительно не более 10 вес.%, например от 1 до 20 вес.%, в частности от 2 до 10 вес.%, от общего количества подвергаемого растворению измельченного материала, или непрерывно. Согласно изобретению в начале растворения в реакторе находится только часть измельченного материала, предпочтительно не более 60 вес.%, в частности не более 50 вес.% и особенно предпочтительно не более 45 вес.% измельченного материала, остальное количество измельченного материала добавляют в процессе растворения. Разжижения можно также осуществлять непрерывно, например, многоступенчатой каскадной реакцией.

Согласно изобретению растворение на стадии а2) осуществляют в присутствии по меньшей мере одного растворяющего крахмал фермента, который предпочтительно выбирают из α-амилаз. Кроме того, могут быть использованы и другие растворяющие крахмал ферменты, активные и стабильные в условиях реакции.

α-Амилаза (или используемый для растворения крахмала фермент) можно помещать в реакционный сосуд или добавлять в процессе стадии а2). Предпочтительно часть необходимой на стадии а2) αамилазы добавляют перед началом стадии а2) или это количество α-амилазы помещают в реактор. Общее количество α-амилазы составляет, как правило, от 0,002 до 3,0 вес.%, предпочтительно от 0,01 до

- 4 015492

1,5 вес.% и особенно предпочтительно от 0,02 до 0,5 вес.% в пересчете на общее количество используемого источника крахмала.

Разжижение можно осуществлять при температуре выше или ниже температуры гелеобразования. Предпочтительно растворение на стадии а2) осуществляют, по меньшей мере, частично при температуре выше температуры гелеобразования используемого крахмала (так называемый процесс варки). Как правило, температура составляет от 70 до 165°С, предпочтительно от 80 до 125°С и особенно предпочтительно от 85 до 115°С, причем температура является выше температуры гелеобразования по меньшей мере на 5°С, особенно предпочтительно по меньшей мере на 10°С.

Для оптимального воздействия α-амилазы стадию а2) предпочтительно осуществляют, по меньшей мере, частично в слабокислой среде при значении рН предпочтительно от 4,0 до 7,0, особенно предпочтительно от 5,0 до 6,5, причем, как правило, значение рН устанавливаю перед или к началу стадии а2); это значение рН контролируют в ходу растворения и, в случае необходимости, регулируют. Регулируют значение рН предпочтительно при помощи разреженных минеральных кислот, таких как Н₂§0₄ или Н₃РО₄, или при помощи разреженных щелочей, таких как ΝαΟΗ или КОН.

Согласно предпочтительной форме осуществления стадию а2) способа согласно изобретению осуществляют таким образом, что сначала часть материала в количестве не более 60 вес.%, предпочтительно не более 50 вес.% и особенно предпочтительно не более 45 вес.%, например от 10 до 60 вес.%, в частности от 15 до 50 вес.% и особенно предпочтительно от 20 до 45 вес.% в пересчете на общее количество измельченного материала суспендируют в водной среде, например в пресной воде, отведенной технологической воде, например, из стадии ферментации или обработки, или в смеси этих жидкостей, а затем растворяют.

Для осуществления способа согласно изобретению используемые для получения суспензии жидкости можно незначительно подогреть, например, до температуры от 40 до 60°С. Однако предпочтительным является использование жидкостей при комнатной температуре.

После этого в суспензию добавляют фермент, растворяющих крахмал, предпочтительно α-амилазу. Если используют α-амилазу, то предпочтительно добавляют только часть ее количества, например от 10 до 70 вес.%, в частности от 20 до 65 вес.% в пересчете на общее количество используемой на стадии а2) α-амилазы. Количество α-амилазы, добавляемое в определенный момент, зависит от активности αамилазы по отношению к используемому источнику крахмала в условиях реакции и составляет, как правило, от 0,0004 до 2,0 вес.%, предпочтительно от 0,001 до 1,0 вес.% и особенно предпочтительно от 0,02 до 0,3 вес.% в пересчете на общее количество используемого источника крахмала. Альтернативно часть α-амилазы можно добавлять перед приготовлением суспензии с используемой жидкостью.

При этом часть α-амилазы добавляют в суспензию перед нагреванием до температуры стадии растворения, в частности при комнатной или незначительно повышенной температуре, например от 20 до 30°С.

Предпочтительно количество α-амилазы и измельченного материала выбирают таким образом, чтобы вязкость в процессе гелеобразования можно было снизить до такого значения, которое бы позволяло осуществить эффективное перемешивание суспензии. Предпочтительно вязкость реакционной смеси в процессе гелеобразования составляет максимум 20 Па-с, особенно предпочтительно максимум 10 Па-с и наиболее предпочтительно максимум 5 Па-с. Измерение вязкости осуществляют, как правило, вискозиметром Хааке типа К.о1о Укко К.У20 с измерительной системой М5 и измерительным устройством ΜΎΟΙΝ при температуре 50°С и скорости сдвига 200 с^-1.

Затем приготовленную таким образом суспензию нагревают предпочтительно до температуры выше температуры гелеобразования используемого крахмала. Как правило, выбирают температуру от 70 до 165°С, предпочтительно от 80 до 125°С и особенно предпочтительно от 85 до 115°С, причем температура является выше температуры гелеобразования по меньшей мере на 5°С, особенно предпочтительно по меньшей мере на 10°С. Контролируя вязкость, постепенно в крахмалсодержащую суспензию загружают оставшиеся части источника крахмала, например от 2 до 20 вес.%, в частности от 5 до 10 вес.% в пересчете на общее количество используемого крахмала. Предпочтительно добавляемую в процессе растворения часть измельченного материала разделяют по меньшей мере на 2, предпочтительно по меньшей мере на 4 и особенно предпочтительно по меньшей мере на 6 порций. Альтернативно, добавление не использованных при приготовлении суспензии частей измельченного материала можно осуществлять непрерывно в процессе растворения. Температура при добавлении должна быть предпочтительно выше температуры гелеобразования крахмала.

После завершения подачи измельченного материала реакционную смесь, как правило, еще некоторое время, например от 30 до 60 мин или дольше, если необходимо, выдерживают при температуре выше температуры гелеобразования крахмала, т.е. уваривают. Затем реакционную смесь, как правило, охлаждают до более низкой температуры, которая, однако, является выше температуры гелеобразования, например от 75 до 90°С, перед добавление оставшегося, предпочтительно основного количества αамилазы. В зависимости от активности используемой α-амилазы в условиях реакции количество добавляемой на данный момент времени α-амилазы составляет предпочтительно от 0,002 до 2,0 вес.%, осо

- 5 015492 бенно предпочтительно от 0,01 до 1,0 вес.% и наиболее предпочтительно от 0,02 до 0,4 вес.% в пересчете на общее количество используемого источника крахмала.

При этих температурах зернистая структура крахмала разрушается (гелеобразование), что делает возможным ферментативный распад. Для полного расщепления крахмала на декстрины реакционную смесь так долго выдерживают при установленной температуре или, в случае необходимости, далее нагревают, пока реакция на йод или другой тест на выявление крахмала не будет отрицательным или, по меньшей мере, в основном отрицательным. В случае необходимости, при этом можно добавлять еще одну или несколько частей α-амилазы, например от 0,001 до 0,5 вес.%, предпочтительно от 0,002 до 0,2 вес.% в пересчете на общее количество используемого источника крахмала.

После завершения растворения крахмала непрерывно или периодически, предпочтительно непрерывно осуществляют засахаривание содержащихся в жидкой среде декстринов, т.е. их расщепление на глюкозу. Жидкую среду можно подвергать полному засахариванию в специальном резервуаре для засахаривания перед подачей на стадию ферментации Ь). С другой стороны, выгодным оказалось перед ферментацией осуществлять лишь частичное засахаривание. Так, например, действуют таким образом: часть содержащихся в жидкой среде декстринов, например от 10 до 90 вес.%, в частности от 20 до 80 вес.% в пересчете на общий вес декстринов (или первичного крахмала), засахаривают и полученную содержащую сахар жидкую среду подвергают ферментации. Затем в ферментационной среде можно осуществлять дальнейшее засахаривание ίη Й1и. Засахаривание можно также осуществлять, не используя отдельный резервуар для засахаривания, непосредственно в ферментере (ίη ЙШ).

Преимущества засахаривания ίη ЙШ. т.е. засахаривания, частично или полностью осуществляемого в ферментере, с одной стороны, состоят в уменьшении затрат, с другой стороны, благодаря замедленному высвобождению глюкозы при загрузке можно использовать более высокую концентрацию глюкозы, при этом ингибирование или изменение процесса обмена веществ используемых микроорганизмов не наблюдается. В случае Ε.εοίί повышенная концентрация глюкозы приводит, например, к образованию органических кислот (ацетата), в то время как Зассйаготусек сегегйае в этом случае переключается на сбраживание, хотя в хорошо проветриваемых ферментерах имеется достаточное количество кислорода (эффект Крэбтри).

Замедленное высвобождение глюкозы можно регулировать изменением концентрации глюкоамилазы. Таким образом, можно подавить указанные выше эффекты и подать большее количество вещества, так что необходимое разрежение подаваемого загрузочного потока можно уменьшить.

В случае засахаривания в специальном резервуаре раствор крахмала, как правило, охлаждают или доводят до оптимальной температуры засахаривающего фермента или немного ниже этой температуры, например до 50-70°С, предпочтительно до 60-65°С, после чего добавляют глюкоамилазу.

Если засахаривание осуществляют в ферментере, то раствор крахмала, как правило, охлаждают до температуры ферментации, т.е. 32-37°С, перед его подачей в ферментер. В этом случае глюкоамилазу (или по меньшей мере один засахаривающий фермент) непосредственно подают в ферментационный бульон для осуществления засахаривания. Засахаривание растворенного крахмала согласно стадии а2) осуществляют параллельно обмену веществ сахара при помощи микроорганизмов согласно стадии Ь).

Предпочтительно перед подачей глюкоамилазы устанавливают значение рН жидкой среды в диапазоне, оптимальном для используемой глюкоамилазы, предпочтительно от 3,5 до 6,0, особенно предпочтительно от 4,0 до 5,5 и наиболее предпочтительно от 4,0 до 5,0. Однако возможно также, в частности, при осуществлении засахаривания непосредственно в ферментере, работать при значении рН, выходящем за пределы указанных выше диапазонов, например от 6,0 до 8,0. Это может быть особенно выгодным или необходимым (в виду устанавливаемых условий ферментации), например, при получении лизина, пантотената и витамина В2, несмотря на ограниченную активность стандартных глюкоамилаз при таком значении рН.

Согласно предпочтительной форме осуществления засахаривание осуществляют в специальном резервуаре для засахаривания. С этой целью раствор охлаждают или доводят до оптимальной температуры для фермента или немного ниже этой температуры, а значение рН регулируют описанным выше способом в оптимальном для фермента диапазоне.

Глюкоамилазу добавляют в содержащую декстрин среду, как правило, в количестве от 0,001 до 5,0 вес.%, предпочтительно от 0,005 до 3,0 вес.% и особенно предпочтительно от 0,01 до 1,0 вес.% в пересчете на общее количество используемого источника крахмала. После подачи глюкоамилазы содержащую декстрин суспензию выдерживают при установленной температуре предпочтительно в течение 2-72 ч или дольше, если необходимо, в частности, от 5 до 48 ч, причем декстрин засахаривается до моносахаридов. За продвижением процесса засахаривания можно наблюдать известными специалистам методами, такими как, например, ВЭЖХ, ферментативные тесты или экспериментальные палочки глюкозы. Засахаривание считается завершенным, если концентрация моносахаридов больше значительно не увеличивается или снова падает.

Согласно предпочтительной форме осуществления подачу измельченного материала осуществляют периодически или непрерывно, предпочтительно периодически, в частности порциями, в присутствии по

- 6 015492 меньшей мере одной α-амилазы, а также по меньшей мере одной глюкоамилазы на стадии а2) таким образом, что вязкость жидкой среды составляет максимум 20 Па-с, предпочтительно максимум 10 Па-с и особенно предпочтительно максимум 5 Па-с. С целью контроля вязкости выгодной оказалась подача по меньшей мере 25 вес.%, предпочтительно по меньшей мере 35 вес.% и особенно предпочтительно по меньшей мере 50 вес.% от общего количества используемого измельченного материала при температуре выше температуры гелеобразования содержащегося в измельченном материале крахмала. Вязкость также можно контролировать путем порционной подачи по меньшей мере одного растворяющего крахмал фермента, предпочтительно α-амилазы, и/или по меньшей мере одного засахаривающего фермента, предпочтительно глюкоамилазы.

При осуществлении стадии а1) и а2) можно получить сахарсодержащую жидкость, содержание моносахаридов в которой составляет предпочтительно более 30 вес.%, особенно предпочтительно более 35 вес.% и наиболее предпочтительно более 40 вес.%.

Для растворения частей крахмала в измельченном материале могут быть использованы все α-амилазы (класс ферментов ЕС 3.2.1.1), в частности α-амилазы, полученные из ВасШик Ιίοΐιοηίοπηίκ или ВасШик к1аегоШегшорЫ1ик, и особенно те, которые используют для растворения полученных способом Эгу-МШшд материалов в рамках производства биоэтанола, α-амилазы, подходящие для осуществления растворения, имеются в продаже, например фирмы Νονο/утек под названием Тегтату1 120 Ь, тип Ь; или фирмы Сепепсог под названием 8рехуте. Кроме того, для осуществления растворения может быть использована комбинация различных α-амилаз.

Для засахаривания декстрина (т.е. олигосахаридов) в растворе крахмала могут быть использованы, в принципе, все глюкоамилазы (класс ферментов ЕС 3.2.1.3), в частности глюкоамилазы, полученные из Акрегдйик, и особенно те, которые используют для растворения полученных способом Эгу-МШшд материалов в рамках производства биоэтанола. Глюкоамилазы, подходящие для осуществления растворения, имеются в продаже, например, фирмы Νονο/утек под названием Оех1гохуте СА или фирмы Сепепсог под названием ОрДбех. Кроме того, для осуществления растворения может быть использована комбинация различных глюкоамилаз.

Для стабилизации подходящих ферментов, в случае необходимости, может быть установлена оптимальная для ферментов концентрация Са²⁺-ионов, например, при помощи СаС1₂. Подходящие диапазоны концентрации могут быть определены обычными для специалистов методами. Если, например, в качестве α-амилазы используют термамил, то в этом случае концентрация Са²⁺ в жидкой среде должна составлять, например, от 50 до 100 м.д., предпочтительно от 60 до 80 м.д. и особенно предпочтительно приблизительно 70 м.д.

Поскольку для получения сахарсодержащей жидкой среды согласно а) измельчают весь источник крахмала, например в случае зерновых культур целое зерно, то этот источник включает также не содержащие крахмал твердые компоненты источника крахмала. Это часто обусловливает использование определенного количества фитата из зерна плодов. Чтобы избежать вытекающей из этого факта ингибирующей активности, на стадии а2) в жидкую среду до осуществления ферментации согласно стадии Ь) предпочтительно добавляют по меньшей мере одну фитазу.

Добавление фитазы можно осуществлять до, в процессе или после растворения или засахаривания, если она обладает необходимой термостойкостью.

Могут быть использованы любые фитазы, активность которых в условиях реакции практически не ограничена. Предпочтительно используют фитазы с термостойкостью (Т50) > 50°С и особенно предпочтительно > 60°С.

Количество фитазы составляет, как правило, от 1 до 10000 ед./кг источника крахмала, в частности от 10 до 2000 ед./кг источника крахмала.

Для повышения общего выхода сахара или для получения свободных аминокислот в реакционную смесь в процессе получения сахарсодержащей жидкой среды могут быть добавлены также другие ферменты, например пуллуланазы, целлюлазы, гемицеллюлазы, глюканазы, ксиланазы, глюкозидазы или протеазы. Подавление этих ферментов может положительно влиять на вязкость, т.е. уменьшать ее (например, путем расщепления длинноцепных глюканов и/или (арабино-)ксиланов), способствовать высвобождению способных к метаболизму глюкозидов и высвобождению (остаточного) крахмала. Использование протеаз характеризуется аналогичными положительными эффектами, причем дополнительно могут высвобождаться аминокислоты как факторы роста для ферментации.

Сахарсодержащая жидкая среда может быть выгодно использована для ферментативного получения продукта обмена веществ микроорганизмов, содержащего по меньшей мере три атома углерода или по меньшей мере два атома углерода и по меньшей мере один атом азота. С этой целью полученную на стадии а) сахарсодержащую жидкую среду подвергают ферментации согласно стадии Ь). На стадии ферментации при помощи микроорганизмов получают химические реактивы, т.е. соединения, содержащие по меньшей мере три атома углерода и/или по меньшей мере один атом азота и по меньшей мере два атома углерода. Ферментацию, как правило, осуществляют известными специалистам методами. При этом объемное соотношение подаваемой сахарсодержащей жидкой среды и содержащей микроорганизмы жидкой

- 7 015492 среды в основном составляет приблизительно от 1:10 до 10:1, например от 1:2 до 2:1, в частности приблизительно 1:1. Содержание сахара в ферментационном бульоне можно регулировать при помощи скорости подачи сахарсодержащей жидкой среды. Как правило, скорость подачи устанавливают такой, что содержание моносахаридов в ферментационном бульоне составляет от >0 до приблизительно 5 вес.%; однако ферментацию можно также осуществлять при более высоком содержании моносахаридов в ферментационном бульоне, например от 10 до 20 вес.%.

Если засахаривание и ферментацию осуществляют отдельно, то получаемую на стадии а) сахарсодержащую жидкую среду перед ферментацией, в случае необходимости, можно подвергать стерилизации, причем микроорганизмы можно убивать термическими, химическими или механическими способами. При этом бульон, как правило, нагревают до температуры выше 80°С. Уничтожение или лизис клеток можно осуществлять непосредственно перед ферментацией. С этой целью всю сахарсодержащую жидкую среду подвергают лизису или уничтожению. Это можно осуществлять термическим, механическим или химическим способом. Однако в рамках способа согласно изобретению осуществление стадии стерилизации перед ферментацией, как было описано выше, оказалось бесполезным, скорее напротив, очень выгодным оказалось неосуществление такой стерилизации. Таким образом, предпочтительная форма осуществления изобретения относится к способу, при котором полученную на стадии а) жидкую среду непосредственно, т.е. без предварительной стерилизации, подвергают ферментации или осуществляют, по меньшей мере, частичное засахаривание ίη κίΐιι.

В процессе ферментации получают жидкую среду, которая наряду с желаемым нелетучим продуктом обмена веществ микроорганизмов в основном содержит также полученную при ферментации биомассу, содержащую непревращенные компоненты засахаренного раствора крахмала и, в частности, не содержащие крахмал твердые компоненты источника крахмала, такие как, например, волокна и неиспользованные сахара, а также неиспользованные буферные и питательные соли. Эту жидкую среду в данном изобретении называют также ферментационным бульоном, причем выражение ферментационный бульон включает также (сахарсодержащую) жидкую среду, в которой было осуществлено частичное или неполное ферментативное превращение содержащихся в ней сахаров, т.е. частичный или неполный микробиологический обмен веществ моносахаридов.

Под химическими реактивами подразумевают, в частности, органические моно-, ди- и трикарбоновые кислоты, в случае необходимости, содержащие 1 или более, например 1, 2, 3 или 4 гидроксильные группы, а также содержащие предпочтительно от 3 до 10 атомов углерода, такие как, например, винная, итаконовая, янтарная, фумаровая, малеиновая, 2,5-фурилдикарбоновая, 3-гидроксипропионовая, глутаровая, левулиновая, молочная, пропионовая, глюконовая, акотиновая и диаминопимелиновая кислоты, лимонная кислота; протеиногенные и непротеиногенные аминокислоты, например лизин, глутамат, метионин, фенилаланин, аспаргиновая кислота и треонин, пуриновые и пиримидиновые основания; нуклеозиды и нуклеотиды, например, никотинамидадениндинуклеотид (НАД) и аденозин-5'-монофосфат (АМФ); липиды; насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты, содержащие предпочтительно от 10 до 22 атомов углерода, например γ-линоленовая кислота, дигомо-у-линоленовая кислота, арахидоновая, эйкозапентаеновая и докозагексаеновая кислота; диолы, содержащие предпочтительно от 3 до 8 атомов углерода, например пропандиол и бутандиол; многоатомные спирты, содержащие 3 и более, например 3, 4, 5 или 6 гидроксильных групп, например глицерин, сорбитол, маннитол, ксилитол и арабинитол; длинноцепные спирты, содержащие по меньшей мере 4 атома углерода, например от 4 до 22 атомов углерода, такие как бутанол; углеводы, например гиалуроновую кислота и трегалозу; ароматические соединения, например ароматические амины, ванилин и индиго; витамины и провитамины, такие как аскорбиновая кислота витамин В6, витамин В12 и рибофлавин, кофакторы и так называемые нутрицевтические препараты; белки, такие как ферменты, например фитазы, ксиланазы и глюканазы; каротиноиды, например ликопин, β-каротин, астраксантин, цеаксантин и кантаксантин; кетоны, содержащие предпочтительно от 3 до 10 атомов углерода и, в случае необходимости, 1 или больше гидроксильных групп, например ацетон и ацетоин; лактоны, например γ-бутиролактон, циклодекстрины, биополимеры, например полигидроксиацетат, сложные полиэфиры, полисахариды, полиизопреноиды, полиамиды, полигидроксиалканоаты, например поли-3-гидроксимасляная кислота и сополиэфир других органических гидроксикарбоновых кислот, таких как 3-гидроксивалериановая, 4-гидроксимасляная кислота и другие, описанные в 81ешЬисйе1 (Нд.), Вюро1утет8, 1. АиД., 2003, ^йеу-УСН, ХУешНепп и цитированных там литературных источниках; а также исходные и производные указанных соединений. Другими химическими реактивами являются соединения, описанные в СНепйсаЕ Ьу Ееттеп1айоп, Ыоуек Эа1а Сотрогайоп (1973), Ι8ΒΝ: 0818805086 под редакцией Си1с1ю.

Понятие кофактор включает небелковые соединения, необходимые для нормальной активности ферментов. Эти соединения могут быть органическими и неорганическими; молекулы кофакторов согласно изобретению являются предпочтительно органическими. Примерами таких молекул являются НАД и никотинамидадениндинуклеотидфосфат (НАДФ); исходным веществом этих кофакторов является ниацин.

Под нутрицевтическими препаратами подразумевают добавки к пищевым продуктам, проявляю

- 8 015492 щие оздоровительное действие на растения и животных, в частности на человека. Примерами таких молекул являются витамины, антиоксиданты и определенные липиды, например, полиненасыщенные жирные кислоты.

В частности, получаемые продукты обмена веществ выбирают из ферментов, аминокислот, витаминов, дисахаридов, алифатических моно- и дикарбоновых кислот, содержащих от 3 до 10 атомов углерода, алифатических гидроксикарбоновых кислот, содержащих от 3 до 10 атомов углерода, кетонов, содержащих от 3 до 10 атомов углерода, спиртов, содержащих от 4 до 10 атомов углерода, алкандиолов, содержащих от 3 до 8 атомов углерода, и полигидроксиалканоатов.

Само собой разумеющимся для специалистов является тот факт, что получаемые ферментативным способом согласно изобретению соединения существуют в энантиомерной форме, вырабатываемой микроорганизмами (если существуют различные энантиомеры). Так, например, из аминокислот получают, как правило, соответствующий Ь-энантиомер.

Способ согласно изобретению предпочтительно используют для получения нелетучих продуктов обмена веществ микроорганизмов. В рамках данного изобретению под нелетучими продуктами обмена веществ подразумевают соединения, которые могут быть выделены из ферментационного бульона перегонкой в неразложенной форме. Температура кипения этих соединений, как правило, выше температуры кипения воды, часто выше 150°С и, в частности, выше 200°С при нормальном давлении. Как правило, речь идет о соединениях, которые в нормальных условия (298 К, 101,3 кПа) существуют в твердом состоянии.

Кроме того, способ согласно изобретению можно использовать для получения нелетучих продуктов обмена веществ микроорганизмов, которые при нормальном давлении имеют температуру кипения ниже температуры кипения воды и/или масляную консистенцию. В этом случае, как правило, в процессе переработки, в частности в процессе сушки, контролируют максимальную температуру. Предпочтительно такие соединения могут быть получены приготовлением их в квазитвердой (псевдотвердой) форме на адсорбентах. Как правило, в этом случае перед переработкой или выделением целевого продукта согласно стадии с) выделяют твердые компоненты ферментационного бульона.

Подходящими для указанных выше целей адсорбентами являются, например, активированный уголь, оксиды алюминия, силикагели, кремниевые кислоты, глина, сажи, цеолиты, неорганические соли щелочных и щелочно-земельных металлов, такие как гидроксиды, карбонаты, силикаты, сульфаты, фосфаты натрия, калия, магния, и кальция, в частности, соли магния и кальция, например, Мд(ОН)₂, МдСО₃, Мд§Ю₄, Са8О₄, СаСО₃, оксиды щелочно-земельных металлов, например МдО и СаО, другие неорганические фосфаты и сульфаты, например 2п8О₄. соли органических кислот, в частности соли кислот и щелочных и щелочно-земельных металлов, в особенности натриевые и калиевые соли, например ацетат, формиат, гидроформиат и цитрат натрия и калия, а также высокомолекулярные органический носители, такие как углеводы, например сахара, в случае необходимости, модифицированные крахмалы, целлюлоза, лигнин, а также носители, указанные ниже в связи с приготовлением продукта. Как правило, названные носители не содержат или содержат очень небольшие количества, в частности, только следы галогенов, таких как ионы хлорида, и нитратов.

Примерами соединений, которые при нормальном давлении имеют температуру кипения ниже температуры кипения воды и/или масляную консистенцию и которые предпочтительно могут быть получены способом согласно изобретению, являются γ-линоленовая кислота, дигомо-у-линоленовая кислота, арахидоновая, эйкозапентаеновая и докозагексаеновая кислота, а также пропионовая кислота, молочная кислота, пропандиол, бутанол и ацетон. И эти соединения в псевдотвердой композиции в рамках данного изобретения представляют собой нелетучие продукта обмена веществ микроорганизмов в твердой форме.

При выборе используемых на стадии ферментации микроорганизмов руководствуются, как правило, необходимыми химическими реактивами, как указано ниже. Они могут быть естественного происхождения или генетически модифицированными. Далее в табл. А приведены примеры подходящих микроорганизмов и способов ферментации.

- 9 015492

Таблица А

Вещество	Микроорганизм	Ссылка
Винная кислота	Ьас(оЬас1Н1, (например, £ас(оЬаа//из <3е15гиески)	РеПт, Н-3 Вю1ес1то1оду, И/е/л/?е/т, ЗОН, 1980 и 1993-1995, Зи(с1ю, Скетюа/з Ру Регтеп1а1юп, Иоуез Оа(а Согрогакоп (1973),
Итаконовая кислота	Азрегд/Низ (еггеиз, Азрегд/Низ Засотсиз	ЗакиЬошзка, ιη Зи/ίΛ и Ра1етап (Нгзд), Оепексз апЗ РРуз1о!оду οίАзрегд1киз, ЬопЗоп АсаЗетс Ргезз 1977, М1аН, т Розе (Нгзд), Есопотю М1сгоЬю1оду, νοί 2, 3 47-119, ί,οηόοη АсаЗет/с Ргезз 1978, из 3044941 (1962)
Янтарная кислота	АскпоРас/Низ зр 130Ζ, АпаагоЬюзр1Г1Нит зисатрюск/сепз, АскпоРас/Низ зисстодепез, Е сок	ΙηΙ 3 Зуз( Вас1епо1 26, 498-504 (1976), ЕР 249773 (1987), Ег( Ретте и ЛаПа, 133 5504004 (1996), Ег{ ЗиеШег, Зат и Зот, Агск МюгоЬк>1 167, 332-342 (1997), <ЗиеИ1ег МУ Рит1егО Зат МК ,АскпоЬаакиз зисстодепез зр ηον а ηονβΙ зисапю-ас10-ртсЗис1пд з(гат (тт те Ρον/пе гитеп Ιηί й Зуз1 Вас(епо1 1999 Зап,49 Р11 207-16, 035723322, 085573931,1155521075,\ЛГО99/06532,085869301,ив 5770435
Гидроксипропионовая кислота	1_ас1оЬааНиз МЬтскп, ί 1е1сктаппп об Зрою1ас1оЬас1киз тикпиз	РОМРР Опкпе Уегзюп 2 2
Пропионовая кислота	Ргор1отЬас(епит, ζ В Р агаЬтозит, Р зскегтапн, Р (геиЗепгеюкп, С1оз1ткигп ргорюпюит,	Ре/т, Н-3 Вю1ескпо1оду, У/етке/т, ЗСН, 1980» 1993-1995, ΰυΙοΡο, СЬетса1з Ьу Регтеп1акоп, Ноуев ΰβίβ Согрогакоп (1973),
Диаминопимелиновая кислота	СогупеЬас1епит дШатюит	РеЬт, Н-3 Вю(есЬпо1оду, УЗетке/т, ЗСН, 1980» 1993-1995, <Зи1сЬо, Скет/са/а Ьу Еегтеп1акоп, Иоуез Оа(а Согрогакоп (1973),

- 10 015492

Лимонная кислота	АзрегдШиз п!дег, АзрегдШиз теШИ	СЖ Яеи. ΒίοΙβοΡποΙ. 3, 331 -373 (1986); Роос! ВЫесЬпо!. 7, 221-234 (1993); 10, 13-27(1998).
Аконитовая кислота	АзрегдШиз п/дег, АзрегдШиз ίνβηίϋ	СгН. Ρ,βν. ΒίοίβοΡηοΙ. 3, 331 -373 (1986); Роос! ΒίοίβοΡηοΙ. 7, 221-234 (1993); 10, 13-27 (1996) ; Рект, Η.-3.: Вю(ос6по/оду, ЖетЬе/т, 9СН, 1980 υπό 1993-1995;
Яблочная кислота	АзрегдНН, ζ.Β. АзрегдШиз Науиз, А. гндег, А. огугае, СогупеЬас(епит	из 3063910
Глюконовая кислота	АзрегдНН,ζ.Β. А. тдег	Си1сЬо, СЬет1са1з Ьу Регтеп1аИоп, Λ/оуев Оа1а СогрогаИоп (1973),
Масляная кислота	С!оз(псИит (ζ. В. С1о8(псНит асе1оЬи1Нсит, С. Ьи(упсит)	Верт, Н.-З.: В1о1есИпо1оду, И/е/пбе/ш, \/СН, 1980 и 1993-1995;
Молочная кислота	Ьас(оЬасШиз ζ.Β. Ь. Ье1Ы0скИ, С Ιθϊοϊιιτιβηηϋ.	РеЬт, Н.-З.: В1о1ес1то1оду, ОУетЬет, УСН, 1980 и 1993-1995;
Лизин	СогупеЬас1епит дШапжит	1кес1а, Μ.: Атто Аас! РгоОисИоп Ргосезз (2003), ΑΟν. ВюсИет. Епдт/Вю1ес1то1 79, 1-35.
Глутамат	СогупеЬас(епит д!и(атюит	1кеОа, М.: Атто Аск1 РгоИисИоп Ргосезз (2003), ΑΡν. ВюсИет. ЕпдШВкХесГто! 79, 1-35.
Метионин	СогупеЬас1епит д1и(агтсит	!кес!а, М.: Атто Аас! РгоИисНоп Ргосезз (2003), Αϋν. ВюсИет. Епдт/Вю(есИпо1 79, 1-35.
Фенилалаин	СогупеЬас1епит дМатюит, Е.соН	ТгепЬз В!о(есИпо1. 3, 64-68 (1985); 3. Регтеп) ВЮепд. 70, 253-260 (1990).
Треонин	е сон	1кес!а, Μ.: Αιτιίηο ΑοίίΙ РгоИисИоп Ргосезз (2003), ΑΡν. ВюсИет. Епдт/ВЫесЬпо! 79, 1-35.
Аспарагиновая кислота	Е. соН	1кес!а, М.: Атто Аск! РгоИисИоп Ргосезз (2003), АсК'. ВюсЬет. Епдт/Вю1ес!то! 79, 1-35+Оог1. ζιί Ш., <3и!с!ю, СИет1са1з Ьу Регтеп(аИоп, 1Чоуез Са1а СогрогаИоп (1973)

- 11 015492

Пуриновые и пиримидиновые основания	ВасШиз зиЫШз	Яейт, Н.-З.: Вю(ес11гю/оду, \Λ'θίηΙ)βίω, УСН, 1980» 1993-1995; Си(с9о, СИет1са1з Ьу Регтеп1а(юп, Шоуез Оа1а СогрогаИоп (1973), ,
Никотинамидадениндинуклеотид(НАД)	ВасШиз зиЫШз	РеИт, Н.-З.: Вю1есЬпо/оду, УУеиФе/т, УСН, 1980 и 1993-1995; ΰυίοϊιο, СИегт'са1з Ьу Регтеп1аИоп, Шоуоз Оа(а СогрогаИоп (1973),
Аденозин-5'монофосфат (АМФ)	ВасШиз зиЬИНз	Р.еИт. Н.-З.: Вю1ес!;по!оду. УИеюйе/т, УСН, 1980 и 1993-1995; ΰυίοίιο, СИеггмса1з Ьу РегтеШаНоп, Шоуез Ва1а СогрогаИоп (1973),
γ-линоле новая кислота	Мисог, МогИеИа, АзрегдШиз брр.	СШ, Рао, У.: Ро1уипза1ига(еЗ {аИуасиЗз, раг11: оссигепсе, Ыо1од)са1 ас1МИез апО аррИсаИопз (1997). ТгепОз ίη Вю(есИпо1оду 15 (10), 401-409; ΖΟυ, Н.: иИПгаИоп οίΡίοβ Вга/п Ьу Ру1Ыит 1ггеди1аге 1ог ЫрШ РгоОисИоп. Ма1зег ТЬез/з Ьоиз/ала 51а1е ипШегзПу, 31.10.2002 (υΡΝ еШ-1111102-205855).
Дигомо^линоленовая кислота	МогИеНа, СопкИоЬо1из, Зарго1едт'а зрр.	ОШ, 1., Рао, V.: Ро1уипза1ига(е<31а1(уаск1з, рап 1: оссигепсе, Ыо1одюа1 асИуШез ап<1 аррИсаИопз (1997). ТгепЗз ίη Вю(есИпо1оду 15 (10), 401-409; Ζ5ν, Η.: υαΐϊζβίίοπ οίΡίοβ ΒΓβίη Ьу Ру1Ыит 1'ггеди1аге 1ог Ирш РгоЗисИоп. Ма1зег ТЪе&з Ьоиз/апа 51а1е ипШегзОу, 31.10.2002 (υΡΝ еШ-1111102-205855).
Арахидоновая кислота	МогИеНа, РНуИит зрр.	СШ, Рао, У.: Ро1уипза1ига1еЗ 1аКу ас/Ьз, раг11: оссигепсе, Ыо1одка1 асИуШез апО аррИсаИопз (1997). ТгепЗз/П Вю1есИпо1оду 15 (10), 401-409; ΖΗυ, Н.: (ЗИНгаИоп οΐΡ/се Вга1п Ьу Ру1Ыит 1ггеди1аге (ог ЫрШ РгоЬисИоп. Ма1зег ТИезгз 1_оиз!апа 31а1е ипШегзИу, 31.10.2002 (υΡΝ еГсИ 111102-205855).
Эйкозапемтаеновая кислота	МогИеНа, РЬуНит зрр·. РИоЬорзеиИотопаз, ВЬешапеИа зрр.	СШ, Рао, V.: Ро1уипза1ига1&31аИу асШз, раг11: оссигепсе, Ыо!од!са1 ас1МПез ап<3 аррИсаИопз (1997). Тгепс1з1п ВЫесНпо!оду 15 (10), 401-409; Ζ5υ, Η.: ΙΛίίίζβϋοη οίΡίοβ Вга1п Ьу Ру1Ыигп 1ггеди1аге 1ог Цж1 РгоЗисИоп. МаРзег ТЬез/з Ьоиз/'апа 3(а1е

- 12 015492

		ишУегзНу, 3110 2002 (υΚΝ аЮ-1111102-205355)
Докозагексаеновая кислота	ТРгаиз1осРу1пит, Еп1оторЫРога зрр, РРоборзеис/отопаз, ЗРатапеИа зрр	<3ιΙΙ, 1, Рао, V Ро1уипза1ига1ес11аРу асгбз, ра.А1 оссигеосе, Ью1од1са1 ас(мрез апЬ аррксайопа (1997) ТгепЬз т Вю1есРпо1оду 15 (10), 401-409, 2Ри, Η υίιΐιζβίιοη οίΡιοβ Вгат Ьу Ру(1иит нгеди1аге ίΟΓϋριά Рго<1ис(юп Ма1зег ТРез/з Ьоиз/апа 8(а/е ипп/егзйу, 31 10 2002 (ЮНН е(Ь-1111102-205855)
Пропандиол	Е со!)	ϋΕ 3924423, и5 440379, ννθ 9635799, 1)5 5164309
Бутандиол	Еп1егоЬас1ег аегодервз, Вас/Низ ευϋίιΐΐδ, К/еЬз/еИа оху1оса	РаРт, Н-3 Вю(есРпо1оду, У/етЬет, УСН 1980и 1993-1995, биГсйо, СРет1са1з Ьу Регтеп1а1юп, Ноуез Оа(а СогрогаЬоп (1973), Н. В. 5СН1_Е(ЗЕ1_ апс! Н. IV. ЗАМГМЗСН, 1981, А(зсРаг е1 а! ΜιΡίοΡιβΙΙβ РгоЬиМюп νοη 2,3- Ви1апЬю1 С/Г 64 (6), 2004 570-571
Бутанол	С1озМ1ит (ζ В С1озМ1ит асе(оЬиИюит, С рюрютсит)	РеРт, Н-3 Вю1есРпо1оду, И/атЬе/т, УСН, 1980 и 1993-1995, <Зи1сРо, СРетюа1з Ьу Регтеп1аЬоп, Λ/оуез Са/а СогрогаРоп (1973),
Глицерин	Не/е, ЗассЬаготусаз гоихн	<Зи1сРо, СЬетюа1з Ьу Регтеп1аЬоп, Ыоуаз Оа1а СогрогаРоп (1973),
Маннитол	Азрегд/Ииз сатМи, Тоги1орз)з тапп11о7ас1епз	ΰυίαΡο, СРагп1са1з Ьу Рагтеп1а1юп, Ноуез Оа1а СогрогаРоп (1973),
Арабитол	ЗасаРаготусаз гоихн, 8 тейз, 5с1ею1шт д1исатсит, ΡιοΡιβ оРтеп	ΰυίοΡο, СРетюа1з Ьу Регтеп1а(юп, Ноуез Оа1а СограгаРоп (1973),
Ксилитол	Засс^аготусез сегем&ае	Си1сРо, СРетюа/з Ьу РегтеШаРоп, Иоуез Оа1а СогрогаРоп (1973),

- 13 015492

Гиалуроновая кислота	31ге(ососсиз зр.	Карт, Н.-1.: Вю1есЬпо1оду, Ме/пЬе/т, УСН, 1980 и 1993-1995,-
Трегалоза	Вг&лЬас&пит, СогупеЬаскепит, М1сгоЬас1епит, АЬ(тЬас1ег зрр., Р!еиго1из депиз, РНоказ/Ыит Доп/огте	1Р 05099974, ЗР 06311891, ЕР. 2671099, ЕР 0555540, 1Р 3053791, М/уагаМ, 3.-Ι., М1уадаюа, Κ.-Ι., Зид/'уата, Υ.: ТгеЬа!озе Ассити!а1юп Ьу Ваз1сИотусоОпои5 Уеаз1, РИоЬаз!Ыит ЯогНЪгте. Зоигпа! οίРегтеШаНоп апЬ ВЮепдШееПпд 81, (1996) 4, 315-319.
Аскорбиновая кислота	61исопоЬас(ег та1аподепез	КОМРР ОпНпе Уагзюп 2.2
Витамин В12	РгорютЬас1епит зрр., Рзеис1отопаз ЬепПпИсапз	Скет. Вег. 1994, 923 -927; Р0МРР ОпНпе Уегз/оп 2.2
Рибофлавин	ВасШиз виЫШз, АзкЬуа ЗоззурН	\Л/О 01/011052, ϋΕ 19840709, Ж) 98/29539, ЕР 1186664; Рибока, К.: Кеш Ыо1ескпо/оду 1огπΡοίΙβνίη (νίίβηιίη В а) ап<1 скагас(ег о( 1Ыз π-ύοίΐβνίη. Ргадгапсе Зоигпа/ (2003), 31(3), 44-48.
Витамин В6	РЫгоЫит ΐΓορΐοί, К. теШоО	ЕР0765939
Фермент	АрегдИП (ζ.Β. АзрегдШиз п/дег А. огугае), ТгккоОегта, ЕсоН, Напзе1ипа оОегР/сЫа (ζ.Β. РюЫа раз1опиз), ВасШиз (ζ.Β. ВасШиз ИсЬепИогт/з, В. зиЬИНз) и. ν. а.	Рект. Н.-1.: ВЫескпо/оду, И/е/лйе/т, УСН. 1980 и 1993-1995; Ои1с1ю, Скет1са1з Ьу Регтеп1аНоп, Яоуез Оа/а СогрогаНоп (1973),
Зеаксантин	ОипаПеИа заИпа	Лп е( а! (2003) ВЫеск.В/оепд. 81:115-124
Кантаксантин	ВгеУ/Ьас1ег/ит	МеНз е/ а! (1991) 1 Арр! Вас1епо1 70:181-191
Ликопин	В1акез!еа (пзрога, СапсШа и(Шз	УНО 03/056028, ЕР 01/201762, Ж> 01/12832, ννθ 00/77234,

- 14 015492

		Мшга е(а! (1998) ΑρρΙ ΕηνίΓΟπ М/сгоЫо! 64 1226- 1229
β-каротин	В1акез1эа (пзрога, СапМа υΐίΐίδ	Кт 3., Зео И/, Рагк У., ЕпЬапсеЬргобисИоп о1Ье(асаго(апе (гот В1акез1еа Юзрога \м1Ь 5рап 20, Вю1есЬпо1оду ЬаИагз, Уо! 19, Νο 6, 1997, 561-562; Мап(оипдои Р., Роиказ Т.: Είΐβοί οί/Ле аегаОоп га1е апб адИабоп зреес) оп Ье(а-саго1епе ргоЗисИоп апр тогрМоду о(В1акез!еа (пзрога ίη а зОггес/ !апк геас1ог: та15етаИса1 тоРеШпд, Вюскетюа! Епдкюеппд Ройта! 10 (2002), 123-135; АО 93/20183; АО 98/03480, М/ига θί а/ (1998) Αρρί Εηνίηοη МюгоЫо! 64:1226-1229
Астаксантин	РЬаЯ/а НЬоЬогута: СапсНЬа иННз	ББ 00/5599711; ив 90/00558; АО 91/02060, М/ига θί а! (1998) ΑρρΙ ΕηνίΓοη М!сгоЫо1 64:12261229
Полигидроксиал каноат, сложный полиэфир	ЕзсЬегсЫа соН, АкгаНдепез 1а[из, и.у.а.	5. У. !_ее, Р1аз0с 8ас(епа? Ргодгезз апд РгозресГз юг ро!уЬу<1гохуа1капоа1:е ргоЗисПоп ίη Ьас1еп'а, ТИХ/есЬ, /о. 14, (1996), 5. 431-438., 81е!пЬисМ, 2003; ЗЬетЬисЬе! (Нд.), Βίοροίγιτι&δ, 1. АиН, 2003, \УИеуУСН, кУе!пкет\л цитированные там источники
Полисахариды	1_еисопоз1ос теаеп/его/с/ез, Е с1ек1гатсит, ХапИютопаз сатрез(пз, и. ν. а.	НеЬт, Н.-З.: Вю(есЬпо1оду, Ае/лЬе/т, УСН, 1980 и 1993-1995; Си1сРо, СЬетюа1з Ьу Регтеп1аИоп, Ыоувз Оа/а СогрогаЬоп (1973),
Полиизопреноиды	/.ас/алшз зр., НудгорЬогиз зр., Киззи/а зр.	ΒίβϊηΜΙοΡθΙ (Нд.), Вк>ро1утегз, 1. Аи(!„ 2003, \МИеу\7СН,]Л/етЬет и цитированные там источники
Ацетон	С/озЬкИит (ζ.Β. С!оз(псНит асе1оЬи№сит, С. ргорюпюит)	РеЬт, Н.-1.: В101есЬпо1оду, Ше/пЬет, УСН, 1980 и 1993-1995; Ои1сЬо, СЬепжа1з Ьу Регтеп1аИоп, Иоуез Ва1а СогрогаЬоп (1973)

- 15 015492

Ацетоин	Еп(егоЬас(ег аегодепез, С1оз1псНит асеЫ>и(уНсит, £ас(ососсиа 1асИз	кепде!ег, А. И/., Огем/8, ЗсЫеде!, Н.З.: Нгзд., ВЫоду οΓίί/е Ртсагуо(ез, ТЫете, ЗСиКдаг! (1999), 3.307; ΒΰΜΡΡ ОпИпе-ЕсППоп
Ванилин	Рзеидотопаз ри(к1а, Атусо1а1орз1з зр.	Ρπβίβιΐ, Н., РаЬепЬогз!, А., ЗетЬиске! А. В!о1ес!то1од)са! ргобисПоп οίνβηίίίίη. Арр! МюгоЫо!. ВЫесЬло/. 56, 296-314 (2001)
Туригенсин	ВасШиз (Риппд1епз13	Αϊβη-ΖΙιοης Аопд е1 а!.: Рес1-Ьа*ск сиНиге οίВасШиз 1ίιυπηςίθΠΞί3 Гог 1киппдепз1п ргоОисПоп ίη а Ютег 1уре ЫогеасЪэг. Вю1есЬпо1оду апА Вюепдтеегтд 48 (3) (2004), 207-213.
Поликетин	3(гер(отусез ТгасНае, Зогапдшт се!1и1озит	ΚΪΓΒί: Регтеп1аИоп-0етес! сотроипАз аз а зоигсе ίΟΓ пет ргос1ис1з. Риге &Арр1. Скет. 70 (2), (1998), 335-338; ΖίΜο е1 а!.: Не1его1одоиз ргоОисИоп οίΐίΐθ апШипда! ро1укеИАе βηίΐύίοίίο зогаркеп Α οί Зогапдшт се!1и1озит Зо се26 ίη 31пер1отусез /ΐνκ/апз. МюгоЫо1оду 150 (8), (2004), 2761-74.
Г иббереллино- вая кислота	СПЬЬегеНа йу/Аиго/	НоНтапп е1 а!.: Ех1гакЦу-Регтеп{аИоп νοη аЫзегеШпзаиге тк (ЗНзЬегеНа Λ/Дого/. С/Г 7 (1995), 892-895.
Индиго	ЕзсЬетМа соН АВ 102	Веггу, А., ОоАде, Т.С., Ρβρείη, М., УУеу1ег, И<; АррИсаИоп οί теСаЬоНс епдтееппд (о ί/ηριονθ ΰοίΡ 1Ье ргсАисПоп ап<А изо о1Ыо1еск ίη-0/до. Аоигпа! οί 1п0из1па1 МюгоЫо1оду & Вю1есЛпо1оду 28 (2002), 127-133.

Предпочтительные варианты осуществления способа согласно изобретению относятся к получению ферментов, таких как фитазы, ксиланазы, глюканазы; аминокислот, таких как лизин, метионин, треонин; витаминов, таких как пантотеновая кислота и рибофлавин; их исходных соединений и производных; а также к получению указанных выше моно-, ди- и трикарбоновых кислот, в частности алифатических моно- и дикарбоновых кислот, содержащих от 3 до 10 атомов углерода, таких как пропионовая и янтарная кислота, алифатических гидроксикарбоновых кислот, содержащих от 3 до 10 атомов углерода, таких как молочная кислота; указанных выше длинноцепных спиртов, например спиртов, содержащих от 4 до 10 атомов углерода, таких как бутанол; указанных выше диолов, в частности алкандиолов, содержащих от 3 до 8 атомов углерода, таких как пропандиол; указанных выше кетонов, в частности кетонов, содержащих от 3 до 10 атомов углерода, таких как ацетон; указанных выше углеводов, в частности дисахаридов, таких как трегалоза; и полигидроксиалканоатов.

Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения используемые в ферментации микроорганизмы выбирают из естественных или рекомбинантных микроорганизмов, которые вырабатывают по меньшей мере один из таких продуктов обмена веществ: ферменты, такие как фитазы, ксиланазы, глюканазы; аминокислоты, такие как лизин, метионин, треонин; витамины, такие как пантотеновая кислота и рибофлавин; их исходные соединения и/или производные; дисахариды, такие как трегалоза; алифатические моно- и дикарбоновые кислоты, содержащие от 3 до 10 атомов углерода, такие как пропионовая и янтарная кислота; алифатические гидроксикарбоновые кислоты, содержащие от 3 до 10 атомов углерода, такие как молочная кислота; кетоны, содержащие от 3 до 10 атомов углерода, такие как ацетон; спирты, содержащие от 4 до 10 атомов углерода, такие как бутанол; алкандиолы, содержащие от 3 до 8 атомов углерода, такие как пропандиол; и полигидроксиалканоаты,

В частности, микроорганизмы выбирают из таких родов, как СогупсЬаеЮпит. ВасШик, ЛкНЬуа. ЕксЕепсЫа, АкрегдШик, А1са11депек, АсЕпоЬасШик, АпаегоЬюкриШит, Ьас1оЬасШик, РгорютЬас1епит и С1ок1пйшт, в особенности, из штаммов СогупеЬас1епит д1Шатюит, ВасШик киЫШк, АкйЬуа доккури, ЕксЕепсЫа со11, АкрегдШик шдег или А1са11депек 1аШк, АпаегоЬюкрш11ит кисатргойисепк, АсйпоЬасШик киссшодепек, 1ас1оЬасШик йе1Ьгиски, ЬасЮЬасШик ЫсЬтаппл, РгорюшЬас1епит агаЫпокит, РгорютЬас^егшт ксйегтапи, РгорютЬаЛегшт Ггеийепгеюйи, С1ок1пйшт ргорюшсит и С1ок1пйшт асеШЬиШсит.

Согласно специальному предпочтительному варианту осуществления изобретения под продуктом распада веществ, вырабатываемым микроорганизмами и используемым на стадии ферментации, подра

- 16 015492 зумевают лизин. Для осуществления ферментации в этом случае могут быть использованы обычные условия и методы, которые были описаны для других источников углерода, например в Р£е££ег1е е! а1., а.а.О. и И8 3708395. В принципе, используют как непрерывный, так и периодический режим (режим Ва1с11 или Реб-ВаКй), предпочтительным является Реб-Ва1с11 режим.

Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления продуктом распада веществ, вырабатываемым микроорганизмами и используемом на стадии ферментации, подразумевают метионин. Для осуществления ферментации в данном случае можно использовать аналогичные условия и методы, которые были описаны для других источников углерода, например, в АО 03/087386 и АО 03/100072.

Согласно другому особенно предпочтительному варианту осуществления продуктом распада веществ, вырабатываемым микроорганизмами и используемом на стадии ферментации, подразумевают пантотеновую кислоту. Для осуществления ферментации в данном случае можно использовать аналогичные условия и методы, которые были описаны для других источников углерода, например в АО 01/021772.

Согласно еще одному особенно предпочтительному варианту осуществления продуктом распада веществ, вырабатываемым микроорганизмами и используемом на стадии ферментации, подразумевают полигидроксиалканоаты, такие как поли-3-гидроксибутират и сополиэфиры других органических гидроксикарбоновых кислот, таких как 3-гидроксивалериановая, 4-гидроксимасляная кислота и другие, описанные в 81етЬисйе1 (а.а.О.), а также таких длинноцепных гидроксикарбоновых кислот, как 3гидроксиоктановая, 3-гидроксидекановая и 3-гидрокситетрадекановая кислота, а также их смеси. Для осуществления ферментации в данном случае можно использовать аналогичнсые условия и методы, которые были описаны для других источников углерода, например, в 8.Υ. Ьее, Р1ай£с Вас1епа. Ргодгскк апб ргокресй £ог ро1уйубгохуа1капоа1е ргобисйоп ίη Ьас1епа, Т1Ыесй, Вб. 14, (1996), с. 431-438.

Согласно еще одному особенно предпочтительному варианту осуществления продуктом распада веществ, вырабатываемым микроорганизмами и используемом на стадии ферментации, подразумевают рибофлавин. Для осуществления ферментации в данном случае можно использовать аналогичные условия и методы, которые были описаны для других источников углерода, например, в АО 01/011052, ΌΕ 19840709, АО 98/29539, ЕР 1186664 и Рирока, К.: Ыете Ь1о1ссйпо1о§у £ог пЬоПаут (νίΐηιηίπ В2) анб сйагаЛег о£ 111й пЬоПаут. Ртди-тсе £оита1 (2003), 31(3), 44-48.

Согласно другому особенно предпочтительному варианту осуществления продуктом распада веществ, вырабатываемым микроорганизмами и используемым на стадии ферментации, подразумевают фитазу. Для осуществления ферментации в данном случае можно использовать аналогичные условия и методы, которые были описаны для других источников углерода, например, в АО 98/55599.

Перед осуществлением дальнейшей переработки ферментационного бульона (т. е. стадии с), в случае необходимости, осуществляют стадию стерилизации, как описано выше.

Обеднение или выделение продукта обмена веществ из ферментационного бульона согласно стадии с) осуществляют, как правило, таким образом: из ферментационного бульона выделяют по меньшей мере один продукт обмена веществ, причем содержание этого продукта обмена веществ в оставшемся ферментационном бульоне составляет не более 20 вес.%, в частности не более 10 вес.%, предпочтительно не более 5 вес.% и наиболее предпочтительно не более 2,5 вес.% в пересчете на общий вес оставшегося ферментационного бульона.

Выделение или обеднение тонких химикатов (т.е. продукта обмена веществ микроорганизмов) из ферментационного бульона согласно стадии с) можно осуществлять одним или несколькими этапами. Важным этапом при этом является выделение твердых компонентов из ферментационного бульона. Этот этап можно осуществлять до или после выделения целевого продукта. Как выделение целевых продуктов, так и выделение твердых веществ, т.е. разделение твердой и жидкой фаз, осуществляют известными в области науки методами, которые также включают этапы грубой и тонкой очистки целевых продуктов, а также разделение (описанные, например, в Вейег, Р.А., В^ο8ера^аΐ^οη8: ^ο^η8ί^еат Ргосекктд £ог Вю1ссйпо1о§у, 1о1т А11еу & 8он5 (1988), и ШтагпА Εηсус1οреб^а о£ ШбикйгЦ СйетШгу, 5. Аи£1. аи£ СОКОМ, А11еу-УСН).

При выделении целевого продукта поступают предпочтительно таким образом: сначала из ферментационного бульона удаляют твердые компоненты, например, центрифугированием или фильтрацией, затем целевой продукт выделяют из жидкой фазы, например, кристаллизацией, осаждением, адсорбцией или дистилляцией. Альтернативно, целевой продукт можно также выделять непосредственно из ферментационного бульона, например, используя хроматографический способы или способы экстракции. Как хроматографический способ, в особенности, следует назвать ионообменную хроматографию, при которой целевой продукт может быть селективно выделен на хроматографической колонке. В этом случае выделение твердых веществ из оставшегося ферментационного бульона осуществляют предпочтительно декантацией, выпариванием и/или сушкой.

Обычными способами фильтрации являются, например, обычная и глубокая фильтрация (описанные, например, в А. КцкЫоп, А.8. Аагб, К.С. Но1б1сй 8о1|б-Ыс.|шб фильтрация аиб Бераи-Июа Тссйпо1о§у, УСН УепадкдекеШсйай, АетНепп 1996, р. 177££., Кб. 1уе§, ίη А. КцкЫоп (Нд.): Ма111етабса1 Мобек аиб Вейда МеИобк ίη Бойб-Ыдшб Бераи-Июа, ЫАТО А81 5епе5 Ε №. 88, Майш ик №_)йо££, ОогбгесЫ 1985,

- 17 015492

р. 90ГГ.) и фильтрация в поперечном потоке, в частности микрофильтрация для выделения твердых веществ >0,1 мкм (описанная, например, в 1. ЛИтаии, 8. Я1ррегдег, 1. МетЬтаие 8с1. 124 (1997), 119-128.).

Обычные способы центрифугирования описаны, например, в Ο. Ни1!ксй, Н. Айкектаии, ЕШепид СеийНидек, ίη И.В. Ритсйак, 8о116-Ь1дш6 8ератайои, ир1аиб Ргекк, Сгоубои 1977, р. 493-559; ииб Н. Ттатешкк1, Э|е ас.|щуа1еЩе К1атйасйе νοη 2еийтГидеи, СНет. 2!д. 83 (1959), 606-612. При этом могут быть использованы различные конструкции, такие как трубчатая и корзинчатая центрифуга, а также, в особенности, центрифуга с пульсирующим поршнем, фильтровальная центрифуга и центрифуга тарельчатого типа.

Обычные способы экстракции включают периодические или ступенчатые и различные непрерывные способы в прямотоке или противотоке. При этом можно работать как с двумя, так и с одной подвижной фазой. Растворимость целевого продукта и выделяемых примесей в обеих фазах можно регулировать выбором растворителя, вариацией противоионов и вариацией значения рН (ТгеуЬа1, Я.Е., Макк ТгаикГег Орегайоик, 3. АиГ1., Ыете Уогк, Мс Ота^-НШ, 1979; Ки1а, М., Кгоиег, К.Н., Ник!еб!, Н. ииб 8сйи!ее, Н., Тес11шса1 акрес!к оГ ех!тасЮе енхуте рцпйсайои, Аии. Ν.Υ. Асаб. 8ск, 341 (1981); ЯоЬткои, КО., аиб СНа, Ό.Υ., Сои!го11еб рН ех!тасйои ш !йе кератайои оГ\теак аабк аиб Ьакек, Вю!есй. Ргодгекк, 1(1), 18 (1985)).

Обычные способы адсорбции описаны, например, в Э.М. РиШтеи Рпис1р1ек оГ Абкотрйои аиб Абкотрйои Ргосеккек, 1. Айеу & 8оик, №\ν Уогк, 1984; О. Аеб1ег Абкотрйои, Уег1ад Сйет1е, АетНепи (1970). При этом могут быть использованы адсорберы с неподвижным, подвижным и псевдоожиженным слоем. Адсорбцию можно осуществлять периодически или непрерывно (К. НаиГГе, 8.Я. Моткои: Эе Огиу1ег 8!иб1еиЬисй Абкотрйои, Эе Огиу1ег, Ветйи, 1974; А. Как!: Абкогрйоик!есйшк, УСН Уег1адкдеке11кс11аГ1 Аешйе1т, 1988). Наряду со многими другими адсорбентами могут быть использованы активированный уголь, ионообменные смолы, природные или синтетические цеолиты и активированные оксиды алюминия. Кроме того, могут быть использованы также способы аффинной адсорбции (описанные, например, в Агио1б, Е.Н., ВЕшсй Н.А., аиб Айке, С.Я., Аиа1ук1к оГ АГйийу кератайоик. СНет. Еидг. 1., 30, В9 (1985)).

В частности, для очистки тонких химикатов могут быть использованы, например, такие методы, как хроматография, осаждение, ультра-, микро- и нанофильтрация, обратный осмос, электрофорез, электродиализ и изоэлектрическое фокусирование.

Хроматографические способы можно осуществлять периодически или непрерывно. К непрерывным хроматографическим способам относятся, например, непрерывно вращающийся кольцевидный хроматограф (Соийииоик Яо!айид Лптйаг СНтота!одгарй (СЯАС)) (описанный, например, в А.1.Р. Матйи, Э1ксикк. Еаттабау 8ос. 7 (1949)), хроматограф с подвижным слоем (Тгие Мον^ид Веб СНтота!одгарй (ТМВС)) (описанный, например, в К. ТакеисЫ, Т. М1уаисЫ, Υ. итадисЫ, 1. СНет. Еид. 1араи 11 (1978) 216-220) и хроматограф с псевдоподвижным слоем (81ти1а!еб Мον^ид Веб Сйтота!одгарй (8МВ)) (описанный, например, в Э.В. ВтоидЫои, ииКетка1 Ой Ргобис!к Со., И8 2985589, 1961). В качестве твердой фазы используют, например, активированные оксиды алюминия, силикагели, пропитанные гликолем диатомовые земли, декстрины, полимеры сульфонированных стиролов, полиакриламиды, а также иммобилизованные на полимере белки (Агио1б, Е.Н., ВЕшсй Н.А., ииб Айке, С.Я., Аиа1ук1к оГ АШийу кератайоик. СНет. Еидг.

1., 30, В9 (1985); О1ЬЬк, 8.1., ииб ЫдЫГоок Е.К, 8сайид ир дгаб1еи! е1ийои сйтота!одгарйу, 1ЕС Еииб., 25, 490 (1986); Кшд, С.1., 8ератайои Ргосеккек, 2. АиД., №\ν Уогк, МсСга\\-НП1 (1979); Υаи, А.А., КиНаиб,

1.1, ииб В1у, Ό.Ό., Мобеги 81хе-Ехс1икюи Ыс.|шб Сйтота!одгарйу, Айеу, №\ν Уогк (1979)).

При осуществлении осаждения осаждают либо целевые продукты, либо побочные компоненты (1. А. МиШи: Стук!а1йхайои, 3гб еб., Βийе^νο^!й-Не^иетаиη, ОхГогб, 1993) Осаждение может, например, быть начато путем введения растворителей, солей и путем изменения температуры. Образующийся осадок может быть выделен обычными описанными выше способами выделения твердых веществ из бульона.

При осуществлении микро-, ультра-, нанофильтрации и обратного осмоса могут быть использованы, например, микропористые (А.8. М1сйае1к: и1!гаГй!гайои, ш Е.8. Репу (еб.): Ргодгекк ш 8ератайои аиб РитШсайои, νο1. 1, 1и!еткс1еисе РиЬ1., №\ν Уогк, 1968), однородные (1. Сгаик, О.8. Рагк (ебк.): ПШикши 1и Ро1утегк, Асабетю Ргекк, №\ν Уогк, 1968; 8. А. 8!еги: ТНе 8ерагайои оГ Оакек Ьу 8е1есй\^ге Реттеайои, ш Р. Меагек (еб) МетЬгаие 8ерагайои Ргосеккек, ЕГе^че!; Атк!егбат, 1976), асимметрические (Я.Е. Кекйид: 8уи!йейс Ро1утепс МетЬгаиек, А 8!гис!ига1 РегкресЮе, Айеу-1и!егкс1еисе, №\ν Уогк, 1985) и электрически заряженные (Е. НеШепсй: Ии-Ех^а^е, МсОта^-НШ, Ьоибои, 1962) мембраны, полученные различными способами (Я. 2к1дтоибу, И8 1421341, 1922; И.В. Ра11, И8 4340479, 1982; 8. ЬоеЬ, 8. 8οи^^^а^аη, и8 3133132, 1964). Типичными материалами являются сложные эфиры целлюлозы, нилон, поливинилхлорид, акрилнитрил, полипропилен, поликарбонат и керамика. Используют эти мембраны как пластинчатый модуль (Я. Е. Мабкеи, НуретДИтайои аиб и1!гаГй!гайои 1и Р1а!е-аиб-Егате 8ук!етк, ЕГе^че!; Атк!егбат, 1977), спиральный модуль (И8 3417870, 1968 (Э.Т. Вгау)), пучок труб или модуль из полых волокон (Н. 8111111111^1111-1: 8уи!йейс МетЬгаиек аиб (Ней Ртератайои, ш М.С. Рог!ег (еб.): НаибЬоок оГ 1ибик!па1 МетЬгаие Тесйηο1οду, №уек РиЬйсайои, Рагк Я1бде, N1 1990, р. 1-60). Кроме того, возможным является использование жидких мембран (Ν.Ν. Ы: Реттеайои Тйгоидй Ыс.|шб 8игГас1аЩ МетЬгаиек, А1СНЕ 1. 17

- 18 015492 (1971), 459; 8.6. Кттига, 8.Ь. Ма!коп, А.1. Аагб III. 1пбик1па1 Аррйсайопк οί Еас11йа!еб Тгапкрог!, ίη Ν.Ν. Ь1 (еб.): Весеп! Эеуе1ортеп15 ίη 8ератайоп 8с1епсе, Вб. V, СКС Ргекк, Воса Ва!оп, Попба. 1979, р. 1125). Целевой продукт можно обогащать на входе и отводить через поток отстающих фракций или обеднять на входе и отводить через поток фильтратов/пермеатов.

Электрофоретические способы описаны, например, в Вибде, 8.В., ЬабксЬ, М.В., Ргосекк сопк1бега!юпк Гог кса1е-ир оГ 1к|шб сНготаЮдгарНу апб е1ес!торЬотек1к, ш 8ерата!юп Весоуету апб РипйсаГюп ш Вю!есЬпо1оду, I. Акеп)о ипб I. Нопд, Нд., АС8 8утрокшт 8епек, 314, 122 (1986). Могут быть использованы их многочисленные варианты, например, изоэлектрическое фокусирование в гранулированных гелеобразных слоях, непрерывное изоэлектрическое фокусирование с рециркуляцией, ротофор-клетка, прямоточное фокусирование с рециркуляцией и многокомпонентный электролиз с изоэлектрическими мембранами. В качестве матричных материалов используют ацетат целлюлозы, агарозные гели и гели на основе амида полиакрилата.

Обычные способы кристаллизации описаны, например, в 1аиею, 8.Ι., Сгоо!ксЬо1!еп, Р.А., 1пбик!па1 Стук!а1Й7а!юп, №\ν Уотк, Асабетк, 1984; А.А. ВатГоПЬ: 1пбик!па1 Сгук!аШ/а!юп, Ьеопатб Н111, Ьопбоп, 1965; 6. Ма1х: Кпк!аШка!юп, 2. Аий, 8рппдет Vе^1ад, Ветйп, 1969; I. Ννν11: 1пбик!па1 Стук!аШ/а!юп-8!а!е оГ Ле Аг!. \^;СН Vе^1адкдек., АешЬет, 1982; 8.1. 1апск', Р.А.М. Сгоо!ксЬо1!еп: 1пбик!па1 Сгук!аШ/а!юп, Ке1бе1, Эогбесй!, 1984; О. 8бЬпе1, I. 6агк1бе: РтеарйаГюп, Ви!!етиог!Ь-Нешетапп, ОхГогб, 1992; А.8. Муегкоп (Нд.): НапбЬоок оГ 1пбик!па1 Сгук!аШ/а!юп, Ви!!етиог!Ь-Нететап, Вок!оп 1993; 1.А. МиШп: СгуктШ/аРоп, 3. Аий., Ви!!егиог!й-Нешетапп, ОхГогб, 1993; А. Мегктапп (Нд.): СгуНаШхаРоп ТесЬпо1оду НапбЬоок, Магсе1 Эеккет, №\ν Уотк, 1995. Кристаллизацию можно осуществлять, например, охлаждением, выпариванием, кристаллизацией в вакууме (адиабатическим охлаждением), реакционной кристаллизацией или высаливанием. Кристаллизацию можно осуществлять, например, в котлах с или без мешалки, способом прямого контакта, в испарительных вакуум-аппаратах (В.К. Ми1!ег, СЬет Епд. (Ν.Υ.) 89 (1982), МагсЬ, 87-89), в вакуум-кристаллизаторах поэтапно или непрерывно, например, в кристаллизаторах с принудительной циркуляцией (8иепкоп Готсеб-с1гси1а!юп сгук!а11ег) или в кристаллизаторах с псевдоожиженным слоем (типа Осло) (А.Э. Вапбо1рЬ, М.А. Ьаткоп: ТЬеогу оГ Рат!1си1а!е Ргосеккек, 2. Аий. Асабетк Ргекк, Υο^к, 1988; I. ВоЬшкоп, ЕЕ. ВоЬег!к, Сап. I. СЬет. Епд. 35 (1957), 105-112; I. Νγν1!:

Эеидп, оГ Сгук!а111/егк, СКС Ргекк, Воса Ва!оп, 1992). Возможной является также дробная кристаллизация (Ъ. Сотбоп, М.Ь. 8а1и!кку, Н.Н. АШатб: Ртеарйайоп Ггот Нотодепеоик 8о1и!юп, А11еу-1п!егкскпсе, Υο^к, 1959). Кроме того, могут быть выделены энантиомеры и рацематы (I. 1асциек, А. Со11е!, 8.Н. АШеп: Епапйотетк, Васета!ек апб Веко1и!юпк, А11еу, Υο^к, 1981; К.А. 8Ье1боп: СЫто!есЬио1оду, Магсе1 Эеккет, №\ν Υο^к, 1993; А.К СоШпк, С. Ν. 8Ье1бгаке, I. СгокЬу (Нд.): СЫта1йу ш 1пбик!гу, А11еу, Хеи Υο^к, 1985).

Обычные способы сушки описаны, например, в О. КпксЬет, А. Как!: Э1е иккепксЬаййсЬеп Сгипб1адеп бег Тгоскпипдк!есЬшк, 3. АиГ1., 8рппдет, Ве^1^п-Ηе^бе1Ье^д-Nеи Υο^к, 1978; В. В. Кееу: Эгушд: Рппс1р1ек апб РтасГке, Регдатоп Ргекк, ОхГогб, 1972; К. Кгб11: Тгоскпег ипб ТгоскпипдксегГаНгеп, 2. АиГ1., 8рппдет, Ве^1^п-Ηе^бе1Ье^д-Nеи Υο^к 1978; Аййатк-Сатбепег, А.: 1пбик!па1 Эгутд, Ноик!оп, Си1Г, 1977; К. Кгб11, А. Как!: Тгоскпеп ипб Тгоскпег ш бег Ртобик!юп, 8рппдет, Ве^1^п-Ηе^бе1Ье^д-Nеи Υο^к, 1989. Примерами способов сушки являются многочисленные способы конвекционной сушки, например в сушильной печи, туннельной сушилке, ленточной сушилке, дисковой сушилке, струйной сушилке, сушилке с псевдоожиженным слоем, вентилируемой, а также вращающейся барабанной сушилке, распылительной сушке, сушилке с потоком воздуха, циклонной сушилке, сушилке с мешалкой, пастоизмельчительной сушилке, измельчительной сушилке, кольцеобразной сушилке, шахтной сушилке, вращающейся трубчатой сушилке, карусельной сушилке. Для осуществления других способов необходима контактная сушка, например, в лопастной сушилке; вакуумная сушка или сушка вымораживанием, в конусной сушилке, в нутче, дисковой сушилке, в контактной сушилке с тонким слоем, вальцовой сушилке, твердофазной сушилке, тарельчатой сушилке, спиральной сушилке, сдвоенной конусной сушилке; или теплоизлучение (инфракрасное, например, инфракрасная вращающаяся сушилка) или диэлектрическая энергия (микроволны) для сушки. Сушильные аппараты, используемые для осуществления термической сушки, как правило, нагреваются паром, маслом, газом или электрическим током и могут в зависимости от технических параметров частично работать в вакууме.

Наряду с сушкой могут быть использованы также способы приготовления, описанные ниже для получения белковой композиции. Эти способы включают также подачу вспомогательных веществ, как указано ниже.

В предпочтительном варианте осуществления выделение тонких химикатов из ферментационного бульона согласно стадии с) осуществляют ионообменной хроматографией. При этом общие условия и методы этого способа известны специалистам и описаны, например, в Вбтрр Ьех1коп бег СЬет1е, 10. Аийаде, 1997, Сеогд ТЫете Vе^1ад, 8!и!!даг!; Ае1к, НапбЬисЬ бег 1опепсЬтота!одгарЫе, 1991, νί’Ή Vе^1адкдеке11ксЬаГ!, АешЬет. В общем, действуют таким образом: вырабатываемое микроорганизмами соединение селективно связывают с ионообменником и ионообменник перед элюированием вырабатываемого микроорганизмами соединения промывают, например, водой.

- 19 015492

Перед подачей содержащего твердые вещества ферментационного бульона на колонку ионообменного хроматографа твердые вещества, в случае необходимости, могут быть выделены известными специалистам способами, например фильтрацией и центрифугированием.

Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления изобретения выделение веществ перед подачей ферментационного бульона на колонку ионообменного хроматографа не осуществляют. В этом случае через ионообменник предпочтительно против силы тяжести пропускают содержащий твердые вещества ферментационный бульон, так что твердые вещества не приводят к блокированию (т.е. засорению) ионообменной колонки.

Если под вырабатываемым микроорганизмами продуктом обмена веществ подразумевают основную аминокислоту, то ее можно выделять из ферментационного бульона ионообменной хроматографией, при этом используют кислую катионообменную колонку. В этом случае основную аминокислоту, например лизин, селективно связывают с ионообменной колонкой. Перед элюированием возможной является очистка промыванием, например, водой. Элюирование основной аминокислоты осуществляют подходящими элюентами, например аммиачной водой, предпочтительно 5 об.%-ной аммиачной водой.

Использование ионообменной хроматографии для выделения или очистки основных аминокислот, таких как лизин, описано, например, в АО 01/072689 и Ьее е1 а1., ТЬе ике οΓ ίοη ехс1икюп сНготаЮдгарНу ак аррго\^геб ΐο 1Не 1тогта1 ίοη ехсНапде сНготаЮдгарНу ίο ас1не\^ге а итоге еГПс1еп1 1укше ^есονе^у Ггот Гегтеп1а1юп Ьго111. Епхуте апб М1сгоЫа1 ТесЬитокду 30 (2002), 798-303.

Остаток ферментационного бульона можно обрабатывать аналогично описанным выше способам, т.е. обрабатывать или перерабатывать, причем в результате получают содержащий белок побочный продукт.

Если под вырабатываемым микроорганизмами продуктом обмена веществ подразумевают метионин, то выделение целевого продукта осуществляют предпочтительно центрифугированием или фильтрацией. При этом можно использовать аналогичные условия и методы, которые были описаны для других источников углерода, например, в более ранней заявке ΌΕ 10359668.2. После завершения ферментации полученный ферментационный бульон нагревают, чтобы растворить весь метионин. Затем твердые вещества выделяют центрифугированием или фильтрацией. С целью выделения твердого вещества раствор предпочтительно концентрируют частичным или полным выпариванием, при этом метионин выкристаллизовывается. Затем метионин сушат, в случае необходимости, после предварительной фильтрации.

Выделенные центрифугированием или фильтрацией твердые вещества содержат в основном полученную в процессе ферментации биомассу и компоненты засахаренного раствора крахмала, которые не подверглись обмену веществ, например, волокна. Этот остаток ферментационного бульона можно обрабатывать или перерабатывать аналогичным образом, как описано ниже, так что в результате получают содержащий белок побочный продукт.

Если под вырабатываемым микроорганизмами продуктом обмена веществ подразумевают пантотеновую кислоту, то выделение целевого продукта также предпочтительно осуществляют центрифугированием или фильтрацией. При этом можно использовать аналогичные условия и методы, которые были описаны для других источников углерода, например, в ЕР 1050219 и АО 01/83799. В остальном выделение можно осуществлять соответствующим образом, как было описано выше для метионина. Предпочтительно в случае пантотеновой кислоты дополнительно перед выделением твердых веществ осуществляют пастеризацию всего ферментационного бульона. С целью выделения твердого вещества смесь предпочтительно частично выпаривают, в случае необходимости добавляют хлорид кальция и сушат, предпочтительно подвергают распылительной сушке.

Для получения пантотеновой кислоты действуют также таким образом: на стадии с) осуществляют выделение клеток и нерастворенных или твердых не содержащих крахмал компонентов декантированием, центрифугированием, фильтрацией и технологией обработки продуктов с помощью мембран (микрофильтрацией, ультрафильтрацией, нанофильтрацией) и/или комбинацией этих методов. Поток, обедненный или не содержащие твердые вещества, содержит пантотеновую кислоту. Этот поток можно подвергать, например, дальнейшему сгущиванию и/или сушке или формованию. Поток, содержащий твердые вещества, можно аналогично описанным ниже способам перерабатывать до содержащего белок побочного продукта.

В случае необходимости осуществляют лизис или уничтожение клеток. Это можно осуществлять непосредственно перед ферментацией. С этой целью весь ферментационный бульон подвергают лизису или уничтожению. Это можно осуществлять термическим, механическим или химическим способом. Лизис клеток можно осуществлять также после выделения твердых веществ. При этом лизису подвергают только содержащий твердые вещества поток.

Согласно предпочтительному варианту осуществления при переработке пантотеновой кислоты действуют таким образом: после ферментации осуществляют термическое уничтожение клеток, после чего клетки и не содержащие крахмал твердые компоненты удаляют при помощи декантатора, центрифуги, фильтра или мембранной технологией и/или комбинацией этих методов. Обедненный или не содержащий твердые вещества поток содержит пантотеновую кислоту. Этот поток можно, например, подвергать

- 20 015492 дальнейшему концентрированию. До, в процессе или после концентрирования предпочтительно в обедненный твердыми веществами бульон добавляют описанные ниже вспомогательные вещества. Таким образом, можно сократить возможное пенообразование и/или образование осадка. Затем концентрированный поток непосредственно подвергают сушке или формованию. При этом до, в процессе или после сушки или формования также могут быть добавлены описанные ниже вспомогательные вещества. Таким образом, можно уменьшить гигроскопичность продукта, улучшить текучесть продукта и/или повысить стабильность при хранении. В этом случае содержащий твердые вещества поток предпочтительно перерабатывают до содержащего белок побочного продукта, как описано ниже.

Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления вспомогательные вещества, содержащие специальные катионы, можно добавлять уже в процессе ферментации, как описано, например, в №0 02/072857.

Другой предпочтительный вариант осуществления переработки пантотеновой кислоты центрифугированием, декантированием, ультрафильтрацией и/или диафильтрацией описан в №0 05/028659.

Кроме того, возможным является также выделение пантотеновой кислоты из ферментационного бульона электродиализом или ионообменом. Однако эти способы являются нежелательными, поскольку при этом иногда могут возникать проблемы.

Ферментационный остаток, остающийся после обеднения или выделения пантотеновой кислоты, т.е., в частности, выделенные твердые вещества, можно обрабатывать или перерабатывать, как описано выше, в результате чего образуется содержащий белок побочный продукт.

Если под вырабатываемым микроорганизмами продуктом обмена веществ подразумевают полигидроксиалканоаты, то выделение целевого продукта также предпочтительно осуществляют экстракцией с растворителем, как описано, например, в И8 4310684 или ЕР 355307. Оставшиеся твердые вещества могут быть выделены обычными способами, например фильтрацией или центрифугированием. В остальном выделение твердых веществ можно осуществлять соответствующим образом, как было описано выше для метионина. Предпочтительно в случае полигидроксиалканоатов дополнительно перед выделением твердых веществ осуществляют пастеризацию всего ферментационного бульона. С целью выделения твердого вещества смесь предпочтительно частично выпаривают, в случае необходимости добавляют хлорид кальция и сушат, предпочтительно подвергают распылительной сушке. Дальнейшую очистку полигидроксиалканоатов осуществляют известными способами, как описано, например, в И8 4310684 или ЕР 355307.

Ферментационный остаток, т. е., в частности, выделенные твердые вещества, можно обрабатывать или перерабатывать, как описано выше, в результате чего образуется содержащий белок побочный продукт.

Ферментационный бульон, остающийся после выделения целевого продукта, например основной аминокислоты, такой как лизин, содержит в основном полученную в процессе ферментации биомассу, компоненты засахаренного раствора крахмала, которые не подверглись обмену веществ, например волокна, и неиспользованные сахара, а также неиспользованные буферные и питательные соли. Эти твердые вещества могут быть выделены из оставшегося ферментационного бульона методом, описанным для побочного продукта, образующегося при получении биоэтанола (который называют П181111ет'8 Эпсб Оташв \νί11ι 8о1иЫе8 (ΌΌΟ8) и распространяют под таким названием). При этом можно осуществлять полное или частичное выделение твердых веществ из ферментационного бульона. Получаемый таким образом содержащий белок побочный продукт, в дальнейшем называемый белковой композицией, как до, так и после осуществления стадий обработки или переработки может быть использован как корм или кормовая добавка для животных, предпочтительно для сельскохозяйственных животных, особенно предпочтительно для крупного рогатого скота, свиней и птицы, наиболее предпочтительно для крупного рогатого скота.

Обработку или переработку ферментационного бульона до белковой композиции можно осуществлять известными методами, в частности изменением содержания сухого вещества (например, сушкой или выпариванием), измельчением и формованием (например, введением добавок, формовочными способами, такими как гранулирование и экструдирование). Кроме того, обработка или переработка продукта включает также смешивание с другими кормами или кормовыми добавками, например, с целью стандартизации содержания питательных веществ.

Белковую композицию, как правило, получают таким образом: после обеднения или выделения по меньшей мере одного продукта обмена веществ согласно стадии с), по меньшей мере, частично выделяют летучие компоненты ферментационного бульона. При этом получают белковую композицию в твердой или полутвердой форме. Содержание обедненного или выделенного продукта обмена веществ в ферментационном остатке составляет, как правило, не более 20 вес.%, в частности не более 15 вес.%, предпочтительно не более 10 вес.% и особенно предпочтительно не более 5 вес.% в пересчете на общий вес остатка ферментационного бульона.

Для получения белковой композиции после выделения целевого продукта, как правило, весь оставшийся бульон частично выпаривают, как правило, многостадийным способом, после чего полученные твердые вещества выделяют, например, декантатором или выделение твердого вещества осуществляют

- 21 015492 непосредственно из всего ферментационного бульону. Для выделения твердых веществ могут быть использованы такие способы, как центрифугирование, фильтрация, микрофильтрация, ультрафильтрация, нанофильтрация, обратный осмос или комбинация этих способов, например, в многостадийном устройстве. Содержание сухого вещества в выделенных при этом твердых веществах составляет, как правило, от 10 до 80 вес.%, предпочтительно от 15 до 60 вес.% и особенно предпочтительно от 20 до 50 вес.%. Содержание сухого вещества в готовой белковой композиции, получаемой дальнейшей обработкой или переработкой, составляет предпочтительно примерно 90 вес.%, так что опасность разложения при хранении уменьшается.

Белковая композиция может также быть получена концентрированием твердых компонентов остатка ферментационного бульона после стадии с) термическими способами (например, выпариванием), механическими способами (например, при использовании фильтров, декантаторов, центрифуг) и известными специалистам обычными комбинациями указанных способов. Путем концентрирования бульона получают твердый или полутвердый, например пастообразный, остаток, который в незначительных количествах содержит полученный согласно изобретению продукт обмена веществ, как правило, от 0 до 10 вес.%, в частности от 0 до 5 вес.% в пересчете на общий вес остатка, и нелетучие, как правило, твердые не содержащие крахмал компоненты источника крахмала или по меньшей мере их части в количестве по меньшей мере 90 вес.% либо общее количество твердых не содержащих крахмал компонентов источника крахмала, а также биомассу из ферментации. Этот полутвердый или твердый остаток аналогично неконцентрированному полученному на стадии с) ферментационному бульону можно непосредственно подвергать сушке или формованию.

Жидкая фаза, выделенная при получении побочного продукта, частично может быть повторно использована как технологическая вода. Эта часть жидкой фазы может быть частично или полностью использована при получении сахарсодержащей жидкости согласно стадии а) или для приготовления растворов буферной или питательной соли для применения на стадии ферментации. При подаче повторно используемой технологической воды на стадию а) необходимо обращать внимание на то, что слишком большое количество может отрицательно сказываться на ферментации избытком определенных минеральных веществ и ионов, например ионов натрия и лактатионов. Поэтому содержание повторно используемой технологической воды при приготовлении суспензии для растворения крахмала согласно изобретению не должно превышать 75 вес.%, предпочтительно не более 60 вес.% и особенно предпочтительно не более 50 вес.% в пересчете на общее количество воды, используемой при приготовлении суспензии. Предпочтительно содержание технологической воды при приготовлении суспензии согласно предпочтительному варианту осуществления стадии а2) составляет от 5 до 60 вес.%, предпочтительно от 10 до 50 вес.% в пересчете общее количество воды, используемой при приготовлении суспензии.

Жидкую фазу, повторно не используемую в процессе, многоступенчатым выпариванием можно сгустить до сиропа. Содержание сухого вещества в полученном таким образом сиропе составляет, как правило, от 20 до 90 вес.%, предпочтительно от 30 до 80 вес.% и особенно предпочтительно от 40 до 70 вес.%. Этот сироп может быть смешан с выделенными при декантировании (или другим способом) твердыми веществами, а затем высушен. Сушку можно осуществлять, например, в барабанной, распылительной или лопастной сушилке, предпочтительно в барабанной сушилке. Сушку предпочтительно осуществляют таким образом, что содержание остаточной влажности в полученном твердом веществе составляет не более 30 вес.%, предпочтительно не более 20 вес.% и особенно предпочтительно не более 10 вес.%.

Путем добавления вспомогательных веществ, таких как носители и покрывающие материалы, связывающие агенты, а также других добавок можно целенаправленно регулировать свойства высушенного побочного продукта (т.е. белковой композиции), который вместе с твердыми компонентами подлежит ферментации, исходя из различных параметров, таких как размер зерна, форма частиц, склонность к пылеобразованию, гигроскопичность, стабильность, в частности стабильность при хранении, цвет, запах, текучесть, склонность к агломерации, электростатический заряд, свето- и термочувствительность, механическая стабильность и способность к редиспергированию.

К обычно применяемым вспомогательным веществам принадлежат, например, связывающие агенты, носители, средства для припудривания/средства, улучшающие текучесть, а также пигменты, биоциды, диспергаторы, антивспениватели, вещества, регулирующие вязкость, кислоты, щелоки, антиоксиданты, стабилизаторы ферментов, ингибиторы ферментов, продукты адсорбции, жиры, жирные кислоты, масла или их смеси. Такие вспомогательные вещества используют в качестве вспомогательных сушильных агентов предпочтительно в способах формования и сушки, таких как распылительная сушка, сушка в псевдоожиженном слое и сушка вымораживанием.

Примерами связывающих агентов являются углеводы, в частности сахара, такие как моно-, ди-, олиго- и полисахариды, например декстрин, трегалоза, глюкоза, сироп глюкозы, мальтоза, сахароза, фруктоза и лактоза; коллоидные вещества, такие как белки животного происхождения, например желатин, казеин, в частности казеинат натрия, белки растительного происхождения, например белок сои, гороха, бобовых, люпин, зеин, белок пшеницы, кукурузы и риса, синтетические полимеры, например, полиэтиленгликоль, поливиниловый спирт и, в частности, вещества марки КоШбоп фирмы ВА8Б, в случае

- 22 015492 необходимости, модифицированные биополимеры, например лигнин, хитин, хитозан, полилактид, и модифицированные крахмалы, например ангидрид октенилсукцината (ОСА); гуммы, например гуммиакация, производные целлюлозы, например, метилцеллюлоза, этилцеллюлоза, (гидроксиэтил)метилцеллюлоза (ГЭМЦ), (гидроксипропил)метилцеллюлоза (ГПМЦ), карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ); мука, например кукурузная, пшеничная, ржаная, ячменная и рисовая мука.

Примерами носителей являются углеводы, в частности сахара, описанные выше как связывающие агенты, а также крахмал, например, из кукурузы, риса, картофеля, пшеницы и маниоки; модифицированные крахмалы, например ангидрид октенилсукцинида; целлюлоза и микрокристаллическая целлюлоза; неорганические минералы или суглинок, например глина, уголь, кизельгур, кремниевая кислота, жир и каолин; крупа, например пшеничная крупа, отруби, например пшеничные отруби, мука, описанная выше как связывающий агент; соли, такие как соли металлов, в частности соли щелочных и щелочноземельных металлов и органических кислот, например Мд-, Са-, 2п-, Ыа-, К-цитрат, -ацетат, -формиат и -гидроформиат, неорганические соли, например Мд-, Са-, 2п-, Ыа-, К-сульфаты, -карбонаты, -силикаты или -фосфаты; оксиды щелочно-земельных металлов, такие как СаО и МдО; неорганические буферные вещества, такие как гидрофосфаты щелочных металлов, в частности гидрофосфаты натрия и калия, например К₂НРО₄, КН₂РО₄ и Ыа₂НРО₄; а также адсорбенты, указанные выше при описании способа получения продуктов обмена веществ согласно изобретению, имеющих низкую температуру кипения или масляную консистенцию.

Примерами средств для припудривания или средств, улучшающих текучесть, является кизельгур, кремниевая кислота, например, торговой марки 81регпа£ фирмы Эедихха; глина, уголь, жир и каолин; указанные выше как носители крахмалы, модифицированные крахмалы, неорганические соли, соли органических кислот и буферные вещества; целлюлоза и микрокристаллическая целлюлоза.

Относительно других добавок в качестве примеров следует назвать пигменты, такие как Т1О₂; биоциды; диспергаторы; антивспениватели; вещества, регулирующие вязкость; неорганические кислоты, такие как фосфорные кислоты, азотная, соляная, серная кислота; органические кислоты, такие как насыщенные и ненасыщенные моно-и дикарбоновые кислоты, например муравьиная, уксусная, пропионовая, масляная, валериановая, пальмитиновая, стеариновая, щавелевая, малоновая, янтарная, глутаровая, адипиновая, пимелиновая, малеиновая и фумаровая кислота; щелоки, такие как гидроксиды щелочных металлов, например ЫаОН и КОН; антиоксиданты; стабилизаторы ферментов; ингибиторы ферментов; адсорбенты; жиры; жирные кислоты и масла.

Содержание указанных выше добавок и, в случае необходимости, других добавок, таких как покрывающие материалы, в соответствии со специальными требованиями определенного продукта обмена веществ, а также в зависимости от свойств используемых добавок можно варьировать в широких диапазонах, например от 0,1 до 80 вес.%, в частности от 5 до 70 вес.%, в особенности от 10 до 60 вес.% в пересчете на общий вес готового продукта или смеси.

Добавление вспомогательных веществ можно осуществлять до, в процессе или после переработки ферментационного бульона (называемого также композицией или образцом твердых веществ) и, в частности, в процессе сушки. Добавление вспомогательных веществ перед концентрированием оставшегося после осуществления стадии с) ферментационного бульона может быть предпочтительным для улучшения обрабатываемости веществ или продуктов. Вспомогательные вещества можно добавлять как в полученный в твердой форме побочный продукт, так и в один из растворов или суспензий, содержащие этот продукт, например, после осуществления стадии с) непосредственно в ферментационный бульон или в получаемый в процессе переработки раствор или суспензию перед заключительной сушкой.

Таким образом, вспомогательные вещества могут быть примешаны, например, в суспензию, полученную концентрированием ферментационного бульона, оставшегося после осуществления стадии с); такую суспензию можно также добавлять на носитель, например, примешиванием. В частности, добавление вспомогательных веществ осуществляют после сушки, например, путем нанесения оболочек или покрытий/слоев на высушенные частицы. Как после сушки, так и после нанесения покрытия в продукт можно добавлять другие вспомогательные вещества. Полученные формованием частицы могут быть высушены описанными выше способами сушки до необходимого содержания остаточной влаги.

Все полученные в твердой форме побочные продукты, например частицы, грануляты и экструдаты, могут быть покрыты оболочкой или покрытием, т.е. по меньшей мере еще одним слоем веществ. Нанесение покрытия осуществляют, например, в смесителях или псевдоожиженных слоях, в которых частицы кружат вихрем или псевдоожиживают, а затем обрызгивают материалами для нанесения покрытия. Материал для нанесения покрытия может существовать в сухой форме, например, как порошок, или в форме раствора, дисперсии, эмульсии или суспензии в растворителе таком как вода, органические растворители и их смеси, в частности, в воде. В случае использования растворителя его удаляют в процессе или после распыления частиц выпариванием. Кроме того, могут быть нанесены такие покрывающие материалы, как жиры, в виде расплавов.

Материалы для нанесения покрытия, разбрызгиваемые в виде водной дисперсии или суспензии, описаны, например, в \УО 03/059087. К ним принадлежат, в частности, полиолефины, такие как полиэтилены, полипропилены, полиэтиленовые воски, воски, неорганические или органические соли, акрилаты,

- 23 015492 например, сополимер бутилакрилата и метилакрилата, вещества под торговой маркой 8!угоГап фирмы ВА8Е, например, на основе стирола и бутадиена, и гидрофобные вещества, описанные в \УО 03/059086. При нанесении таких материалов содержание твердого вещества в материале составляет, как правило, от 0,1 до 20 вес.%, в частности от 0,2 до 10 вес.%, в особенности от 0,4 до 5 вес.% в пересчете на общий вес конечного продукта.

Материалами для нанесения покрытия, разбрызгиваемыми в виде растворов, могут быть, например, полиэтиленгликоли, производные целлюлозы, такие как метилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза и этилцеллюлоза, поливиниловый спирт, белки, такие как желатин, неорганические и органические соли, углеводы, такие как сахар, например глюкоза, лактоза, фруктоза, сахароза и трегалоза; крахмалы и модифицированные крахмалы. При нанесении таких материалов содержание твердого вещества в материале составляет, как правило, от 0,1 до 20 вес.%, в частности от 0,2 до 10 вес.%, в особенности от 0,4 до 5 вес.% в пересчете на общий вес конечного продукта.

Материалы для нанесения покрытия, разбрызгиваемые в виде расплавов, описаны, например, в ΌΕ 19929257 и \УО 92/12645. К ним принадлежат, в частности, полиэтиленгликоли, синтетические жиры и воски, например, Ро1удеп \УЕ® фирмы ВА8Е, природные жиры, такие как жиры животного происхождения, например пчелиный воск, и жиры растительного происхождения, например канделильский воск, жирные кислоты, например жиры животного происхождения, сальные кислоты, пальмитиновая кислота, стеариновая кислота, триглицериды, продукты марки Ебепог, продукты марки Уедео1е, горные воски, например Ьиетах Е® фирмы ВАМ. При нанесении таких материалов содержание твердого вещества в материале составляет, как правило, от 1 до 25 вес.%, в частности от 2 до 25 вес.%, в особенности от 3 до 20 вес.% в пересчете на общий вес конечного продукта.

После сушки и/или формования в продукт или белковую композицию могут быть добавлены целые или измельченные зерна зерновых культур, таких как кукуруза, пшеница, ячмень, пшено и/или рожь.

Таким образом, еще одним объектом данного изобретения является белковая композиция, полученная согласно изобретению из сахарсодержащей микробиологической ферментации, для получения продукта обмена веществ, содержащего по меньшей мере три атома углерода или по меньшей мере два атома углерода и по меньшей мере один атом азота, который получают описанным выше способом. Эта белковая композиция содержит, как правило, белковый материал, т.е. биомассу из ферментации, не содержащие крахмал компоненты источника крахмала, в частности волокна, и продукт ферментации (метаболит). В частности, белковая композиция содержит в основном такие сухие компоненты:

a) от 1 до 90 вес.%, в частности от 5 до 85 вес.%, предпочтительно от 10 до 75 вес.% биомассы из ферментации;

b) от 1 до 90 вес.%, в частности от 5 до 85 вес.%, предпочтительно от 10 до 80 вес.% и наиболее предпочтительно от 15 до 75 вес.% не содержащих крахмал компонентов источника крахмала, в частности волокон;

c) от 0,01 до 10 вес.%, в частности от 0,1 до 5 вес.%, предпочтительно от 0,2 до 5 вес.% и наиболее предпочтительно от 0,3 до 5 вес.% продукта микробиологического обмена веществ, содержащего по меньшей мере три атома углерода или по меньшей мере два атома углерода и по меньшей мере один атом азота;

б) от 0 до 90 вес.%, в частности от 5 до 80 вес.%, предпочтительно от 10 до 70 вес.% обычных добавок и

е) от 0 до 40 вес.%, в частности от 0,5 до 30 вес.%, предпочтительно от 1 до 20 вес.% других неметаболизированных компонентов ферментационного бульона, в частности остатков сахара, крахмала, питательных и буферных солей;

причем сумма компонентов а)-е) в сухой массе равна 100 вес.%. Выражение в основном означает здесь, что содержание других отличающихся от а)-е) компонентов является незначительным, как правило, не превышает 10 вес.%, в частности 5 вес.% в пересчете на общее количество сухой массы белковой композиции; предпочтительно содержание составляет менее 1 вес.%, в частности около 0 вес.%.

К биомассе (компоненту а)) принадлежит, в частности, неочищенный белок в белковой композиции. Его содержание составляет, как правило, по меньшей мере 40 вес.%, в частности от 40 до 90 вес.%, предпочтительно от 45 до 85 вес.% и особенно предпочтительно от 50 до 80 вес.% в пересчете на общее количество сухой массы белковой композиции.

Белковые композиции согласно изобретению содержат, как правило, одну или несколько важных аминокислот, в частности по меньшей мере одну аминокислоту, выбранную из лизина, метионина, треонина и триптофана. Важные аминокислоты, в частности, указанные выше, содержатся, как правило, в количестве, которое превышает количество обычного ЭОСЗ-побочного продукта, образующегося при ферментативном получении биоэтанола, на 1,5 порядка. Если соответствующие аминокислоты входят в состав белковой композиции, то содержание лизина в этой композиции составляет, как правило, по меньшей мере 1 вес.%, в частности от 1 до 5 вес.%, содержание метионина составляет по меньшей мере 0,8 вес.%, в частности от 0,8 до 5 вес.%, содержание треонина составляет по меньшей мере 1,5 вес.%, в частности от 1,5 до 5 вес.% и/или содержание триптофана составляет по меньшей мере 0,4 вес.%, в част

- 24 015492 ности от 0,4 до 5 вес.% в пересчете на общее количество сухой массы белковой композиции.

Белковые композиции согласно изобретению содержат, как правило, еще незначительное количество воды, часто от 0 до 25 вес.%, в особенности от 0,5 до 15 вес.%, предпочтительно от 1 до 10 вес.% и наиболее предпочтительно от 1 до 5 вес.% воды, в пересчете на общий вес белковой композиции.

Еще одним объектом данного изобретения является описанный выше способ, отличающийся тем, что:

(ί) от полученной на стадии а) сахарсодержащей жидкой среды, которая включает не содержащие крахмал твердые компоненты источника крахмала, отделяют одну часть, не более 50 вес.%, и оставшееся количество подвергают ферментации согласно Ь) для получения первого продукта обмена веществ (А), а (ίί) из этой части полностью или частично выделяют не содержащие крахмал твердые компоненты источника крахмала, после чего ее подвергают ферментации согласно Ь) для получения второго продукта обмена веществ (В), который идентичен или отличается от продукта обмена веществ (А).

В предпочтительном варианте осуществления выделение не содержащих крахмал твердых компонентов согласно (ίί) осуществляют таким образом, что содержание твердого вещества в оставшейся части сахарсодержащей жидкой среды составляет не более 50 вес.%, предпочтительно не более 30 вес.%, особенно предпочтительно не более 10 вес.% и наиболее предпочтительно не более 5 вес.%.

Этот метод позволяет использовать в отдельной ферментации согласно (ш) микроорганизмы, для которых необходимо выполнять минимальные требования, например, относительно показателя транспорта кислорода. Такими используемыми в отдельной ферментации согласно (ш) микроорганизмами являются, например, ВасШнк креаек, предпочтительно ВасШик киЫШк. Соединениями, вырабатываемыми такими микроорганизмами в отдельной ферментации, являются, в частности, витамины, кофакторы и нутрицевтические препараты, пуриновые и пиримидиновые основания, нуклеозиды и нуклеотиды, липиды, насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты, ароматические соединения, белки, каротиноиды, в особенности, витамины, кофакторы и нутрицевтические препараты.

В частности, этот метод позволяет осуществлять способ согласно изобретению даже в том случае, если вырабатываемые химические реактивы при осуществлении ферментации образуются в виде твердого вещества.

Предпочтительный вариант осуществления этого метода относится к параллельному получению одинаковых продуктов обмена веществ (А) и (В) в двух отдельных ферментациях. В особенности, это является предпочтительным тогда, когда для различных целей применения одного и того же продукта обмена веществ предъявляют различные требования к чистоте. Таким образом, получают первый продукт обмена веществ (А), например, используемую в качестве кормовой добавки аминокислоту, такую как лизин, при использовании содержащего твердые вещества ферментационного бульона и точно такой же второй продукт обмена веществ (В), например, ту же используемую в качестве пищевой добавки аминокислоту, такую как лизин, при использовании полученного согласно (ίί) обедненного твердыми веществами ферментационного бульона. Путем полного или частичного выделение не содержащих крахмал твердых компонентов можно сократить затраты на очистку при переработке продукта обмена веществ, область применения которого требует высокой чистоты продукта, например, в качестве пищевой добавки.

Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления этого метода под продуктом обмена веществ (В), вырабатываемым микроорганизмами на стадии ферментации, подразумевают рибофлавин. Для осуществления ферментации в данном случае могут быть использованы аналогичные условия и методы, которые были описаны для других источников углерода, например, в XVО 01/011052, ΌΕ 19840709, νθ 98/29539, ЕР 1186664 и Еццока, К.: Νον Ью1ескпо1оду кот пЬоПаут (убатт В2) апб с11агас1ег ок 1Н18 пЬоПаут. Ргадгапсе коитпа1 (2003), 31(3), 44-48.

Для осуществления данного варианта способа можно действовать таким образом: осуществляют предпочтительно масштабную ферментацию для получения продуктов обмена веществ А, например тонких химикатов, таких как лизин, в соответствии со стадиями а)-с) способа согласно изобретению. Согласно (ί) берут часть полученной на стадии а) сахарсодержащей жидкой среды и согласно (ίί) обычными способами, например, центрифугированием или фильтрацией, ее полностью или частично освобождают от твердых веществ. Полученную при этом сахарсодержащую жидкую среду, полностью или частично освобожденную от твердых веществ, согласно (ίί) подают на стадию ферментации для получения продукта обмена веществ, например рибофлавина. Выделенный согласно (ίί) поток твердых веществ предпочтительно возвращают в поток сахарсодержащей жидкой среды масштабной ферментации.

Полученный таким образом согласно (ίί) ферментационный бульон, содержащий рибофлавин, можно подвергать обработке при использовании аналогичных условий и методов, которые были описаны для других источников углерода, например, в ΌΕ 4037441, ЕР 464582, ЕР 438767 и ΌΕ 3819745. После лизиса клеточной массы осуществляют выделение кристаллического рибофлавина, предпочтительно декантированием. Возможными являются также другие виды выделения твердых веществ, например фильтрация. Затем рибофлавин сушат, предпочтительно в распылительной сушилке или в сушилке с псевдоожиженным слоем. Альтернативно полученную согласно (ίί) ферментационную смесь, содержащую рибофлавин, можно подвергать обработке при использовании аналогичных условий и методов, которые были описа

- 25 015492 ны, например, в ЕР 1048668 и ЕР 730034. После пастеризации ферментационный бульон центрифугируют и оставшуюся содержащую твердые вещества фракцию обрабатывают минеральной кислотой. Образующийся рибофлавин отфильтровывают из водно-кислой среды, в случае необходимости, промывают, а затем сушат.

Выделенные твердые вещества в рамках параллельно осуществляемой масштабной ферментации могут быть, как описано выше, переработаны до побочного продукта.

Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления этого метода под продуктом обмена веществ (В), вырабатываемым микроорганизмами на стадии ферментации, подразумевают пантотеновую кислоту. Для осуществления ферментации в данном случае могут быть использованы аналогичные условия и методы, которые были описаны для других источников углерода, например, в №0 01/021772.

Для осуществления этого варианта способа можно действовать, например, как описано выше для рибофлавина. Предварительно очищенную согласно (ίί), предпочтительно в основном не содержащую твердые вещества сахарсодержащую жидкую среду подвергают ферментации согласно (ίί) для получения пантотеновой кислоты. При этом особенно предпочтительной является более низкая вязкость по сравнению с содержащей твердые вещества жидкой средой. Выделенный поток твердых веществ предпочтительно возвращают в поток сахарсодержащей жидкой среды масштабной ферментации.

Полученный таким образом согласно (ίί) ферментационный бульон, содержащий пантотеновую кислоту, можно подвергать обработке при использовании аналогичных условий и методов, которые были описаны для других источников углерода, например, в ЕР 1050219 и №0 01/83799. После пастеризации всего ферментационного бульона оставшиеся твердые веществ выделяют, например, центрифугированием или фильтрацией. С целью выделения твердого вещества смесь предпочтительно частично выпаривают, в случае необходимости, добавляют хлорид кальция и сушат, предпочтительно подвергают распылительной сушке.

Выделенные твердые вещества в рамках параллельно осуществляемой масштабной ферментации могут быть, как описано выше, переработаны до побочного продукта.

Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления этого метода под продуктом обмена веществ (В), вырабатываемым микроорганизмами на стадии ферментации, подразумевают полигидроксиалканоаты. Для осуществления ферментации в данном случае могут быть использованы аналогичные условия и методы, которые были описаны для других источников углерода, например, в 8.Υ. Ьее, Р1аз(1с Вас1епа. Ргодгекк апб рго5рес15 £ог ро1у11убгохуа1капоа1е ргобиеРоп ίη Ьае1епа. Т1Ыеск, Вб. 14, (1996), с. 431-438.

Для осуществления этого варианта способа можно действовать, например, как описано выше для рибофлавина. Предварительно очищенную согласно (ίί), предпочтительно в основном не содержащую твердые вещества сахарсодержащую жидкую среду подвергают ферментации согласно (ίί) для получения полигидроксиалканоатов. Выделенный поток твердых веществ предпочтительно возвращают в поток сахарсодержащей жидкой среды масштабной ферментации.

Полученный таким образом согласно (ίί) ферментационный бульон, содержащий полигидроксиалканоаты, можно подвергать обработке при использовании аналогичных условий и методов, которые были описаны для других источников углерода, например, в И8 4310684 и ЕР 355307. После пастеризации всего ферментационного бульона оставшиеся твердые веществ выделяют, например, центрифугированием или фильтрацией. С целью выделения твердого вещества смесь предпочтительно частично выпаривают, в случае необходимости, добавляют хлорид кальция и сушат, предпочтительно подвергают распылительной сушке. Дальнейшую очистку полигидроксиалканоатов осуществляют известными способами, описанными, например, в И8 4310684 или ЕР 355307.

Выделенные твердые вещества в рамках параллельно осуществляемой масштабной ферментации могут быть, как описано выше, переработаны до побочного продукта.

Приведенные ниже примеры поясняют некоторые аспекты данного изобретения, ни в коем разе не ограничивая объем его охраны.

Примеры.

I. Измельчение источника крахмала.

Используемые в дальнейшем измельченные материалы измельчают таким образом: целые зерна кукурузы полностью перемалывают при использовании роторной мельницы. Применяя различные бичевые роторы, отбойные плиты или просеивающие устройства, получают материалы с тремя различными значениями дисперсности. В результате проведения ситового анализа измельченного материала при помощи лабораторного вибрационного сита (вибрационный аналитический прибор: Ре15с11 У|Ьго1гоп1с типа УЕ1; время просеивания 5 мин; амплитуда 1,5 мм) получают указанные в табл. 1 результаты.

- 26 015492

Таблица 1

Эксперимент №	Т 70/03	Т 71/03	Т 72/03
< 2 мм / %	99,4	100	100
< 0,8 мм / %	66	100	99
< 0,63 мм / %	58,6	98,5	91
< 0,315 мм / %	48,8	89	65
< 0,1 мм / %		25	9,6
< 0,04 мм 1 %		8	3,2
Общее количество измельченного материала	20 кг	11,45 кг	13,75 кг

II. Ферментативное растворение и засахаривание крахмала.

ΙΙ.1. Без использования фитазы на стадии засахаривания.

11.1а). Ферментативное растворение крахмала.

Из 320 г сухой измельченной кукурузной муки (Т71/03) при непрерывном перемешивании готовят суспензию в 480 г воды и добавляют 310 мг хлорида кальция. Перемешивание не прекращают в процессе осуществления всего способа. После установления значения рН 6,5 при помощи Н₂8О₄ и нагревания до 35°С добавляют 2,4 г Тегтату1 120Ь типа Ь (Νονο/утек А/8). Через 40 мин реакционную смесь нагревают до температуры 86,5°С, причем значение рН, в случае необходимости, повторно регулируют №1ОН до указанного показателя. В течение 30 мин добавляют еще 400 г сухой измельченной кукурузной муки (Т71/03), причем температуру повышают до 91°С. Реакционную смесь примерно 100 мин выдерживают при такой температуре. Затем добавляют еще 2,4 г Тегтату1 120Ь и температуру поддерживают примерно в течение 100 мин. Растворение контролируют на протяжении всего способа реакцией крахмала на йод. Поддерживают температуру 100°С, а реакционную смесь кипятят в течение 20 мин. К этому моменту крахмал больше не обнаруживается. Реактор охлаждают до 35°С.

11.1Ь). Засахаривание.

Полученную на стадии 11.1а) реакционную смесь при непрерывном перемешивании нагревают до 61°С. Перемешивание не прекращают в процессе осуществления всего способа. После установления значения рН 4,3 при помощи Н₂8О₄ добавляют 10,8 г (9,15 мл) Оех1гохуте СА (Νονο/утек А/8). Температуру поддерживают примерно 3 ч, причем продвижение реакции контролируют экспериментальные палочки глюкозы (8-глюкотест фирмы ВοеЬ^^ηде^). Результаты указаны ниже в табл. 2. Затем реакционную смесь нагревают до 80°С, после чего охлаждают. Получают примерно 1180 г жидкого продукту плотностью примерно 1,2 кг/л, содержание сухой массы в котором, определенное инфракрасной сушилкой, составляет примерно 53,7 вес.%. После промывки водой содержание сухой массы (без растворимых в воде компонентов) составляет примерно 14 вес.%. Содержание глюкозы в реакционной смеси, определенное ВЭЖХ, составляет 380 г/л (ср. табл. 2, эксперимент № 7).

Таблица 2

ΙΙ.2. С использованием фитазы на стадии засахаривания.

11.2а). Растворение крахмала.

Образец сухой измельченной кукурузной муки растворяют в соответствии с 11.1а).

11.2Ь). Засахаривание.

Полученную на стадии 11.2а) реакционную смесь при непрерывном перемешивании нагревают до 61°С. Перемешивание не прекращают в процессе осуществления всего способа. После установления значения рН 4,3 при помощи Н₂8О₄ добавляют 10,8 г (9,15 мл) Оех1го/уте СА (Νονο/утек А/8) и 70 мкл фитазы (700 Ипйк РЬу1аке, №11ир11у1 Ыс.|шб 10000Б фирмы ВА8Р АкДепдеке11ксЬай) Температуру поддерживают примерно 3 ч, причем продвижение реакции контролируют экспериментальные палочки глюкозы (8-глюкотест фирмы ВοеЬ^^ηде^). Затем реакционную смесь нагревают до 80°С, а затем охлаждают. Полученный продукт сушат в инфракрасной сушилке и промывают водой. Содержание глюкозы в реакционной смеси определяют ВЭЖХ.

- 27 015492

ΙΙ.3. Другие методы ферментативного растворения и засахаривания крахмала.

11.3а). Кукурузная мука.

360 г деионизированной воды помещают в реакционный сосуд. В раствор добавляют 1,54 мл исходного раствора СаС1₂ (100 г СаС1₂х2 Н₂О/л) до конечной концентрации примерно 70 м.д. Са²⁺. При непрерывном перемешивании 240 г кукурузной муки медленно смешивают с водой. После установления значения рН 6,5 при помощи 50 вес.%-ного водного раствора ЫаОН добавляют 4,0 мл (=2 вес.% фермент/сухая масса) Тегтату1 120 Ь типа Ь (Ыоуохутех А/8). Затем раствор быстро нагревают до 85°С. При этом постоянно необходимо контролировать и, в случае необходимости, регулировать значение рН.

После достижения конечной температуры начинают добавлять оставшееся количество муки, сначала 50 г. Затем в раствор добавляют 0,13 мл исходного раствора СаС1₂, чтобы концентрация Са²⁺ составляла 70 м.д. В процессе добавления поддерживают постоянную температуру 85°С. Выжидают по меньшей мере 10 мин до полного осуществления реакции, после чего подают следующую порцию (50 г муки и 0,13 мл раствора СаС1₂). После подачи двух порций добавляют 1,67 мл Тегтату1; затем подают еще две порции (по 50 г муки и 0,13 мл раствора СаС1₂). Достигают содержания сухой массы 55 вес.%. После подачи температуру повышают до 100°С, затем раствор кипятят в течение 10 мин.

Берут пробу и охлаждают ее до комнатной температуры. После разрежения пробы деионизированной водой (примерно 1:10) добавляют каплю концентрированного раствора Люголя (смесь 5 г I и 10 г К1 на литр). Темно-синяя окраска свидетельствует о содержании крахмала; проба окрашивается в коричневый цвет в том случае, если крахмал был полностью гидролизован. Если в результате эксперимента обнаруживают содержание крахмала, то температуру снова понижают до 85°С и поддерживают при таком значении. Добавляют еще 1,67 мл Тегтату1, пока реакция на йод не будет отрицательной.

При отрицательной реакции смесь подвергают засахариванию при 61°С. Путем добавления 50%-ного раствора серной кислоты устанавливают значение рН 4,3. В течение реакции поддерживают такое значение рН. Температуру поддерживают в области 61°С. Добавляют 5,74 мл (=1,5 вес.% фермент/сухая масса) Оех1гохут СА (Ыохо/утех А/8), чтобы превратить растворенный крахмал в глюкозу. Реакцию осуществляют в течение 1 ч. Для дезактивации фермента смесь нагревают до 85°С. Горячую смесь выливают в стерильные резервуары и после охлаждения хранят их при 4°С.

11.3Ь). Ржаная мука (включая предварительную обработку целлюлазой/гемицеллюлазой).

360 г деионизированной воды помещают в реакционный сосуд. При непрерывном перемешивании 155 г ржаной муки медленно смешивают с водой. Поддерживают постоянную температуру 50°С. После установления значения рН 5,5 при помощи 50 вес.%-ного водного раствора ЫаОН добавляют 3,21 мл (=2,5 вес.% фермент/сухая масса) У1хсо/уте Ь (Ыохо/утех А/8). Через 30 мин начинают подачу оставшегося количества муки, сначала добавляют 55 г. Через следующие 30 мин снова добавляют 50 г муки; еще через 30 мин - 40 г муки. Через 30 мин после последней подачи можно начинать процесс растворения.

Добавляют 1,7 мл исходного раствора СаС1₂ (100 г СаС1₂х2 Н₂О/л). После установления значения рН 6,5 при помощи 50 вес.%-ного водного раствора ЫаОН добавляют 5,0 мл (=2 вес.% фермент/сухая масса) Тегтату1 120 Ь типа Ь (Ыоуохутех А/8). Затем раствор быстро нагревают до 85°С. При этом постоянно необходимо контролировать и, в случае необходимости, регулировать значение рН.

После достижения конечной температуры начинают добавлять оставшееся количество муки, сначала 60 г. Затем в раствор добавляют 0,13 мл исходного раствора СаС1₂, чтобы концентрация Са²⁺ составляла 70 м.д. В процессе добавления поддерживают постоянную температуру 85°С. Выжидают по меньшей мере 10 мин до полного осуществления реакции, после чего подают следующую порцию (40 г муки и 0,1 мл раствора СаС1₂). Добавляют 1,1 мл Тегтату1; затем подают еще одну порцию (40 г муки и 0,1 мл раствора СаС1₂). Достигают содержания сухой массы 55 вес.%. После подачи температуру повышают до 100°С, затем раствор кипятят в течение 10 мин.

Берут пробу и охлаждают ее до комнатной температуры. После разрежения пробы деионизированной водой (примерно 1:10) добавляют каплю концентрированного раствора Люголя (смесь 5 г I и 10 г К1 на литр). Темно-синяя окраска свидетельствует о содержании крахмала; проба окрашивается в коричневый цвет в том случае, если крахмал был полностью гидролизован. Если в результате эксперимента обнаруживают содержание крахмала, то температуру снова понижают до 85°С и поддерживают при таком значении. Добавляют еще 1,1 мл Тегтату1, пока реакция на йод не будет отрицательной.

При отрицательной реакции смесь подвергают засахариванию при 61°С. Путем добавления 50%-ного раствора серной кислоты устанавливают значение рН 4,3. В течение реакции поддерживают такое значение рН. Температуру поддерживают в области 61°С. Добавляют 5,74 мл (=1,5 вес.% фермент/сухая масса) Оех1гохут СА (Ыохо/утех А/8), чтобы превратить растворенный крахмал в глюкозу. Реакцию осуществляют в течение 1 ч. Для дезактивации фермента смесь нагревают до 85°С. Горячую смесь выливают в стерильные резервуары и после охлаждения хранят их при 4°С.

11.3с). Пшеничная мука (включая предварительную обработку ксиланазой).

360 г деионизированной воды помещают в реакционный сосуд. Воду нагревают до 55 °С и путем добавления 50 вес.%-ного водного раствора ЫаОН устанавливают значение рН 6,0. После установления

- 28 015492 температуры и значения рН добавляют 3,21 мл (=2,5 вес.% фермент/сухая масса) Меагхуше 500Ь (Ыо\^гохутек А/8). При непрерывном перемешивании 155 г пшеничной муки медленно примешивают в раствор. Температуру и значение рН поддерживают постоянными. Через 30 мин начинают подачу оставшегося количества муки, сначала добавляют 55 г муки. Через следующие 30 мин снова добавляют 50 г муки; еще через 30 мин - 40 г муки. Через 30 мин после последней подачи можно начинать процесс растворения.

Растворение и засахаривание осуществляют, как описано в п.11.3Ь).

III. Построение сверхпродуцирующего лизин штамма С. д1и!атюит АТСС13032 1укС^£Ьг.

ΙΙΙ.1. Построение плазмиды рС18 1укС.

На первой стадии построения штамма осуществляют аллельный обмен кодирующего фермент аспартаткиназу гена дикого типа (1укС) в С. д1и!ат1сит АТСС13032. При этом в гене 1укС осуществляют нуклеотидный обмен таким образом, что в полученном белке аминокислоту ТЬг в положении 311 заменяют 11е. Исходя из хромосомной ДНК из АТСС13032 в качестве матрицы для РСК реакции 1укС усиливают олигонуклеотидными праймерами

и

5‘-СТСТСТСТСТСОАСОААТТСААТСТТАССеССТе-3‘ (ЗЕО Ю N0:2)

При помощи системы РГи-ТигЬо РСК (8!га!адепе, И8А) в соответствии с инструкциями от производителя. Хромосомную ДНК из С. д1и!атюит АТСС13032 препарируют согласно ТаисЬ е! а1. (1995), Р1акт1б 33:168-179 или Е1ктаппк е! а1. (1994), МюгоЬю1оду 140:1817-1828. Усиленный фрагмент на его 5'конце фланкируют сайтом рестрикции 8а11, а на 3'-конце - сайтом рестрикции М1и1. Перед клонированием усиленный фрагмент переваривается обоими ферментами рестрикции и очищается ОЕХ™РСК, ΌΝΑ апб Се1 Вапб Рипйса!юп Κι! (АтегкЬат РЬагтааа, ЕгеШигд).

Полученный нуклеотид клонируют сайтом рестрикции 8а11 ипб М1и1 в рСЫК5 МС8 йИедгабт 8асВ, в дальнейшем называемый рС18, (МО ΙΌ ЫО:3) и трансформируют в Е.соЕ ХЬ-1 Ь1ие. Селекцию несущей плазмиду клетки достигают платированием на содержащем канамицин (20 мкг/мл) ЬВ араге (Ьеппох, 1955, Упо1оду, 1:190). Плазмиду выделяют и секвенцированием подтверждают ожидаемую нуклеотидную последовательность. Препарацию плазмиды ДНК осуществляют методами и материалами фирмы Ошадеп. Реакции секвенцирования осуществляют согласно 8апдег е! а1. (1977), Ргосеебтдк оГ !Ье Ыа!юпа1 Асабету оГ 8с1епсек И8А, 74:5463-5467. Реакции секвенцирования разделяют и оценивают при помощи секвенатора типа АВ1 Рпкш 377 (РЕ Аррйеб Вюкук!етк, ^е1!егк!аб!). Полученную плазмиду называют рС18 1укС (МО ΙΌ ЫО:4). Она включает следующие важные подобласти:

Положение	Вид последовательности	Описание
155-1420	СОЗ	1узС
Комплемент (3935..5356)	СОЗ	8асВ\ВасШи8 зиЫШз
Комплемент (5357..5819)	Промотор	Промотор\засВ
Комплемент (3913..3934)	С регион	засВ\обпасть Оо\л/пз1геат
1974..2765	СОЗ	Стойкость по отношению к канамицину
Комплемент (3032..3892)	СОЗ	РепликацияХЕсо/Лплазмида рМВ

ΙΙΙ.2. Мутагенез гена 1укС из С. д1и!ат1сит.

Направленный мутагенез гена 1укС из С. д1и!ат1сит осуществляют при помощи набора ОшскСЬапде (8!га!адепе, И8А) в соответствии с инструкциями от производителя. Мутагенез осуществляют в плазмиде 1укС (МО ΙΌ ЫО:4). Для замены 1Ьг311 на 31111е с использованием метода ОшскСЬапде (81га1адепе) синтезируют такие олигонуклеотидные праймеры:

бхССССАССАСССАСАТСАТС ГГСАССтеСССТССТТССО -3‘ (8Е0 I ϋ ΝΟ: 5)

5-СОСААССАОСОСАбОТСААСАТСАТСТСООТОСТОССС -3' (ЗЕО Ю N0:6)

Использование олигонуклеотидных праймеров в реакции ОшскСЬапде в гене 1укС (МО ΙΌ ЫО:7) приводит к замене нуклеотида в положении 932 (с С на Т). Получаемый в результате аминокислотный обмен ТЬг311Пе в гене 1укС подтверждается трансформацией в Е.соЬ ХЫ-Ь1ие и препарацией плазмиды реакцией секвенцирования. Плазмида получает название рСК 1укС !Ьг311йе (МО ΙΌ ЫО:8). Она включает следующие важные подобласти:

- 29 015492

Положение	Вид последовательности	Описание
155-1420	СОВ	1_у®С (1Ьг311ΪΙΘ)
Комплемент (3935..5356)	СОЗ	8асВ\ВасН1из зиЫШз
Комплемент (5357..5819)	Промотор	Промотор\засВ
Комплемент (3913..3934)	С регион	засВХобласть Оотз1геат
1974.2765	СОЗ	Стойкость по отношению к канамицину
Комплемент (3032..3392)	СОЗ	Репликация\Есо/Лплазмида рМВ

ΙΙΙ.3. Трансформация рС1Б 1укС 1Нг311Пе в С. дкИатюит (штамм АТСС13032).

Плазмиду рС1Б 1укС !11г31Н1е трансформируют в С. д1и!ат1сит АТСС13032 электропорацией, как описано в ЫеЬ1 е! а1., РЕМ8 МюгоЬю1оду Ьейегк, 53:299-303 (1989). Модификации протокола описаны в ΌΕ 10046870. Хромосомное расположение локуса 1укС отдельных трансформантов контролируют стандартными методами Саузерн блот-гибридизации, как описано в БатЬгоок е! а1., Мо1еси1аг Йошид. А ЬаЬога1огу Магшак Со1б Бргтд НагЬог (1989). Тем самым устанавливают, что под трансформатами подразумевают такие, которые интегрируют трансформированную плазмиду гомологичной рекомбинацией в локусе 1укС. После роста таких колоний в течение ночи в средах, которые не содержат никаких антибиотиков, клетки платируют на планшет со в среду сазароза-СМ-агар (10% сахарозы) и инкубируют в течение 24 ч при 30°С.

Поскольку содержащийся в векторе рС1Б 1укС 1Нг31111е ген касВ превращает сахарозу в токсичный продукт, могут возрастать только такие колонии, которые на второй стадии гомологичной рекомбинации делетируют ген касВ между геном дикого типа 1укС и мутированным геном 1укС 1Нг31111е. В процессе гомологичной рекомбинации вместе с геном касВ может быть делетирован либо ген дикого типа, либо мутированный ген. Если ген касВ удаляют вместе с геном дикого типа, то получают мутированный трансформант.

Возрастающие колонии отбирают и исследуют на сенситивный к канамицину фенотип. Клоны с делетированным геном БасВ должны одновременно проявить сенситивный к канамицину рост. Такие сенситивные к канамицину клоны исследуют в шейкере на их продуктивность в отношении лизина. Для сравнения берут не обработанный С. д1и!ат1сит АТСС13032. Клоны с повышенной продуктивностью в отношении лизина по сравнению с контрольным образцом отбирают, добывают хромосомные ДНК и усиливают соответствующую область гена 1укС РСК реакцией (Р£и-ТигЬо РСК Буйетк; Бΐ^аΐадеηе, ИБА) в соответствии с инструкциями от производителя и секвенцируют (согласно Баидег е! а1., а.а.О.). Такой клон со свойством повышенного синтеза лизина и доказанной мутацией в 1укС в положении 932 называют АТСС13032 1укС^£Ьг.

Пример 1.

1а). Ферментативное растворение и засахаривание крахмала.

500 г сухой измельченной кукурузной муки суспендируют в 750 мл воды и снова тонко измельчают в смесителе. Суспензию делят на 4 образца № 1-4, каждый из которых обрабатывают примерно 3 г теплоустойчивой α-амилазы (образцы № 1 и 2: Тегтату1 Ь; образцы № 3 и 4: Брехуте). После этого образцы № 2 и 4 обрабатывают примерно 7 г/л глюкоамилазы (образец № 2: Оех!гохуте СА; образец № 4: Орйбех). Получают желтоватые вязкие образцы, содержащиеся в них твердые веществ выделяют центрифугированием, причем над прозрачной жидкой фазой всплывает слой гидрофобных твердых веществ.

Пренебрегая или учитывая образующийся центрифугат, чистый остаток этих образцов в концентрированной форме или при 10-кратном разрежении анализируют ВЭЖХ. Если образующийся центрифугат берут во внимание, то содержание сухой массы в нем составляет 50 вес.%. Результаты, исходя из первичных образцов, приведены ниже в табл. 3.

- 30 015492

Таблица 3

	Образец №
1	2	3	4
Остаток, 10-кратное разрежение, без центрифуаата
Глюкоза [г/кг]	73,0	287,3	63,7	285,1
Фруктоза [г/кг]	3,4	2,3	5,3	2,7
Олигосахариды [г/кг]	202,1	38,2	150,8	31,5
Сахар, общее содержание [г/кг]	278	328	220	319
Остаток, 10-кратное разрежение, с центрифугатом
Глюкоза [г/кг]		178		168
Сахар, общее содержание [г/кг]	172	203	130	188
Остаток, без разрежения, с центрифугатом
Глюкоза [г/кг]		198		189

1Ь). Ферментация.

Два гидролизата кукурузной муки, полученные согласно примеру ΙΙ.1, исследуют при помощи шейкера в присутствии СогупеЬас1епит дкЦатюит (колбы 4-9) Кроме того, параллельно используют гидролизат пшеничной муки, полученный аналогично примеру ΙΙ.1 (колбы 1-3).

1Ь.1). Получение инокулята.

Клетки после нанесения на стерильный СМ-агар (состав: см. табл. 4; 20 мин при 121°С) инкубируют в течение 48 ч при 30°С. Затем клетки соскабливают с пластин и ресуспендируют в солевой раствор. 25 мл среды (см. табл. 5) помещают в 250 мл колбу Эрленмейера и затравляют таким же количеством полученной указанным выше методом суспензии клеток, при этом достигается оптическая плотность 0Ό₆₀₀=1 при 600 нм.

Таблица 4

Состав СМ-агаровых пластин

Концентрация	Компонент
10,0 г/л	Э-глюкоза
2,5 г/л	№С1
2,0 г/л	Карбамид
10,0 г/л	Бактопептон (ΰίίοο)
5,0 г/л	Дрожжевой экстракт (Οί/со)
5,0 г/л	Мясной экстракт (Οί/со)
22,0 г/л	Агар

1Ь.2). Получение ферментационного бульона.

Составы сред, находящихся в колбах 1-9, указаны в табл. 5.

- 31 015492

Таблица 5

Находящиеся в колбах среды

	Колба №
	1-3 4-6 7-9
Пшеница 399,66 г/кг	250 г/л
Кукуруза 1 283,21 г/кг ”	353 г/л
Кукуруза II 279,15 г/кг ”	358 г/л “
(ΝΗ.,)23Ο.,	50 г/л
Мд8О4.7Н2О	0,4 г/л
КН2РО4	0,6 г/л
Ее8О4.7Н2О	2 мг/л
Мп8О4.Н2О	2 мг/л
Тиамин. НС1	0,3 мг/л
Биотин	1 мг/л
СаСО3	50 г/л
рН*	7,8

* Значение, полученное разреженным водным раствором №1ОН.

** Концентрация глюкозы в гидролизате.

*** Навеска гидролизата на 1 л среды.

После внесения затравки в колбу ее в течение 48 ч при 30°С и при вращении (200 об/мин) инкубируют в увлажняемом качающемся шкафу. После прекращения ферментации содержание сахаров и лизина определяют ВЭЖХ. ВЭЖХ осуществляют прибором 1100 8епек ЬС 8ук1ет фирмы Ащ1еп1. Предколоночная дериватизация ортофталальдегидом позволяет определить количество образовавшейся аминокислоты, смесь продуктов выделяют на колонке НурегкП АА фирмы АдПеп1. Результаты указаны ниже в табл. 6.

Таблица 6

Колба №.	Фруктоза, г/л	Глюкоза, г/л	Сахароза, г/л	Общее содержание сахара, г/л
	1	0,00	0,00	4,71	4,71
	2	0,00	7,75	4,82	12,57
	3	0,00	13,85	4,57	18,42
	4	0,00	17,20	11,38	28,58
	5	0,00	21,08	11,31	32,39
	6	0,00	25,51	11,29	36,80
	7	0,00	32,59	9,83	42,42
	8	0,00	24,10	10,01	34,11
	9	0,00	39,26	9,94	49,20

Во всех колбах лизин получают в сопоставимых количествах примерно от 30 до 40 г/л, в соответствии с выходом, достигаемым стандартной ферментацией смесью глюкоза/питательный раствор.

Пример 2. Ферментация.

Используя полученный согласно примеру II. 1 гидролизат кукурузной муки, ферментацию осуществляют аналогично примеру 1Ь), причем используют описанный в пункте III. Штамм АТСС13032 1укС^ГЬг. Клетки после нанесения на стерильный СМ-агар (состав: см. табл. 4; 20 мин при 121°С) инкубируют в течение 48 ч при 30°С. Затем клетки соскабливают с пластин и ресуспендируют в солевой раствор. 25 мл среды 1 или 2 (см. табл. 5) помещают в 250 мл колбу Эрленмейера и затравляют таким же количеством полученной указанным выше методом суспензии клеток, при этом достигается оптическая плотность ОЭ₆|₀=1 при 610 нм. Образцы в течение 48 ч при 30°С и при вращении (200 об/мин) инкубируют в увлажняемом качающемся шкафу (относительная влажность воздуха 85%). Концентрацию лизина в средах определяют ВЭЖХ. Во всех случаях получают примерно одинаковые количества лизина.

Пример 3.

Гидролизат кукурузной муки, полученный согласно примеру П.3, исследуют при помощи шейкера в присутствии ^гу^Ьа^^ю ДШатюит (АТСС13032 1укС^ГЬг) (колбы 1+2). Кроме того, параллельно используют гидролизат пшеничной муки (колбы 3+4) и гидролизат ржаной муки (колбы 5+6), полученные аналогично примеру П.3.

3.1). Получение инокулята.

Клетки после нанесения на стерильный СМ+СаАс-агар (состав: см. табл. 7; 20 мин при 121°С) инкубируют в течение 48 ч при 30°С, затем пересевают на новую пластину и инкубируют в течение ночи при 30°С. После этого клетки соскабливают с пластин и ресуспендируют в солевой раствор. 23 мл среды

- 32 015492 (см. табл. 8) помещают в 250 мл колбу Эрленмейера с двумя рефлекторами и затравляют таким же количеством полученной указанным выше методом суспензии клеток, при этом достигается оптическая плотность ΟΌ₆ι₀=0,5 при 610 нм.

Таблица 7

Состав СМ+СаАс-агаровых пластин

Концентрация	Компонет
10,0 г/л	Э-глюкоза
2,5 г/п	ЫаС1
2,0 г/л	Карбамид
5,0 г/л	Бактопептон (О/'/со)
5,0 г/л	Дрожжевой экстракт (О//со)
5,0 г/л	Мясной экстракт (Ωί/οο)
20,0 г/л	Казаминовые кислоты
20,0 г/л	Агар

3.2). Получение ферментационного бульона.

Составы сред, находящихся в колбах 1-6, указаны в табл. 8.

В контрольной среде вместо гидролизата муки используют соответствующее количество раствора глюкозы.

Таблица 8

Находящиеся в колбах среды

- 33 015492

* Значение, полученное разреженным водным раствором ЫаОН. ** Концентрация глюкозы в гидролизате.

*** Навеска гидролизата на 1 л среды.

После внесения затравки в колбу ее в течение 48 ч при 30°С и при вращении (200 об/мин) инкубируют в увлажняемом качающемся шкафу. После прекращения ферментации содержание сахаров и лизина определяют ВЭЖХ. ВЭЖХ осуществляют прибором 1100 8епех ЬС 8ух1ет фирмы АдПеШ. Предколоночная дериватизация ортофталальдегидом позволяет определить количество образовавшейся аминокислоты, выделение осуществляют на колонке 2огЬах Ех£епб С18 фирмы АдПеШ. Результаты указаны ниже в табл. 9.

Таблица 9

Во всех колбах лизин получают в сопоставимых количествах примерно от 10 до 12 г/л, в соответствии с выходом, достигаемым стандартной ферментацией смесью глюкоза/питательный раствор.

3.3). Выделение лизина.

Для выделения лизина на первой стадии, как правило, твердые вещества удаляют из ферментационного бульона центрифугированием. Альтернативно центрифугированию можно также осуществлять фильтрацию, например фильтрацию через мембранный фильтр. Затем не содержащий твердые вещества ферментационный бульон подкисляют (например, серной кислотой), в результате чего получают лизин в моно- или дипротонированной форме. После этого этот подкисленный бульон пропускают через катионообменник так, что лизин связывается с ионообменником. После промывания водой через ионообменник пропускают водный раствор аммиака для элюирования лизина; затем лизин, содержащийся в элюате как свободное основание, путем добавления соляной кислоты превращают в хлорид лизина и выкристаллизовывают. Выделение кристаллов из суспензии осуществляют центрифугированием, пока они окончательно не высохнут. Таким образом получают кристаллический лизин высокой чистоты (>98,5 вес.% лизин-НС1). Подробное описание этого способа, а также альтернативных методов переработки лизина приведены в 1кеба, М.: Атшо Ас1б РгобиШюп Ргосеххех. Абуапсех т ВюсПет1са1 Епдшеегшд/Вю£есЬпо1оду, уо1. 79 (2003), 1-35 и Негтапп, Т.: 1пбих£г1а1 ргобисбоп оГ атшо аабх Ьу согупеГогт ЬаШепа. Йоита1 оГ Вю£есЬпо1оду 104 (2003), 155-172.

Пример 4.

Гидролизат кукурузной муки, полученный согласно примеру 11.3а), исследуют при помощи шейкера (колбы 1-3). В качестве штамма, вырабатывающего пантотенат, используют ВасШих РА824 (точное описание в \УО 02/061108). Кроме того, параллельно используют гидролизат пшеничной муки (колбы 46) и гидролизат ржаной муки (колбы 7-9), полученные аналогично примеру ΙΙ.3.

4.1). Получение инокулята.

мл предварительной культурной среды (см. табл. 10) помещают в 250 мл колбу Эрленмейера с двумя рефлекторами, затравляют 0,4 мл замороженной культуры и в течение 24 ч при 43°С при вращении (250 об/мин) инкубируют в увлажняемом качающемся шкафу.

- 34 015492

Таблица 10

Состав предварительной культурной среды

Компонент	Концентрация
Мальтоза	28,6 г/л
Соевая мука	19,0 г/л
(ΝΗ4)28Ο4	7,6 г/л
Глутамат мононатрия	4,8 г/л
Цитрат натрия	0,95 г/л
Ее8О4 х 7 Н2О	9,5 мг/л
МпС12 х 4 Н2О	1,9 мг/л
ΖηδΟ4 х 7 Н2О	1,4 мг/л
СоС12 х 6 Н2О	1,9 мг/л
СиЗО4 х 5 Н2О	0,2 мг/л
МагМо04 х 2 НгО	0,7 мг/л
К2НРО4хЗН2О	15,2 г/л
КН2РО4	3,9 г/л
МдС12 х 6 Н2О	0,9 г/л
СаС12 х 2 Н2О	0,09 г/л
МОР8	59,8 г/л
рН*	7,2

* Значение, полученное разреженным водным раствором КОН.

мл основной культурной среды (см. табл. 11) в 250 мл колбе Эрленмейера с двумя рефлекторами затравляют 1 мл предварительной культуры.

4.2). Получение ферментационного бульона.

Составы сред, находящихся в колбах 1-9, указаны в табл. 11.

В контрольной среде вместо гидролизата муки используют соответствующее количество раствора глюкозы.

Таблица 11

Находящиеся в колбах среды

	Колба №
	1-3	4-6	7-9
Кукуруза 381,4 г/кг **	75 г/л ***
Пшеница 342,0 г/кг **		84 г/л ***
Рожь 303,0 г/кг “			94 г/л ™
Соевая мука	19,0 г/л
(ΝΗ4)25Ο4	7,6 г/л
Глутамат мононатрия	4,8 г/л
Цитрат натрия	0,95 г/л
РеЗО4 х 7 Н2О	9,5 мг/л
МпС12 X 4 Н2О	1,9 мг/л
ΖηδΟ4 х 7 Н2О	1,4 мг/л
СоС12 х 6 Н2О	1,9 мг/л
СиЗО4 х 5 НгО	0,2 мг/л
Ν82Μο04 х 2 НаО	0,7 мг/л
К2НРО4 х 3 НгО	15,2 г/л
КН2РО4	3,9 г/л
МдС12 х 6 Н2О	0,9 г/л
СаС12 х 2 Н2О	0,09 г/л
МОР8	59,8 г/л
рН*	7,2

* Значение, полученное разреженным водным раствором ΝηΟΗ.

** Концентрация глюкозы в гидролизате.

*** Навеска гидролизата на 1 л среды.

- 35 015492

После внесения затравки в колбу ее в течение 24 ч при 43°С и при вращении (250 об/мин) инкубируют в увлажняемом качающемся шкафу. После прекращения ферментации содержание глюкозы и пантотеновой кислоты определяют ВЭЖХ. Определение содержания глюкозы осуществляют на колонке Атшех НРХ-87Н фирмы Βίο-Рай. Определение концентрации пантотеновой кислоты осуществляют разделением на колонке Адиа С18 фирмы Рйеиотеиех. Результаты приведены ниже в табл. 12.

Таблица 12

Во всех колбах пантотеновую кислоту получают в сопоставимых количествах примерно от 1,5 до 2 г/л в соответствии с выходом, достигаемым стандартной ферментацией смесью глюкоза/питательный раствор.

Переработку продукта можно осуществлять, например, как описано в νϋ 02/24001, νϋ 02/072857 и νϋ 05/028659.

Пример 5.

Гидролизат кукурузной муки, полученный согласно примеру 11.3а), исследуют при помощи шейкера в присутствии АзрегдШив шдет (колбы 1-3). Кроме того, параллельно используют гидролизат пшеничной муки (колбы 4-6) и гидролизат ржаной муки (колбы 7-9), полученные аналогично примеру ΙΙ.3.

5.1) . Штаммы.

Штамм АзрегдШиз шдет, вырабатывающий фитазу, с 6 копиями рйуА-гена из АзрегдШиз Пенит под контролем §1а А-промотора получают аналогично подробно описанному в νϋ 98/46772 получению ΝΡ505-7. В качестве контрольного образца используют штамм с 3 модифицированными д1аА АтрЖопз (аналогично Ι8Ο505), однако без интегрированных рйуА-экспрессионных кассет.

5.2) . Получение инокулята.

мл предварительной культурной среды (см. табл. 13) помещают в 100 мл колбу Эрленмейера с двумя рефлекторами, затравляют 10 мкл замороженной культуры и в течение 24 ч при 34°С при вращении (170 об/мин) инкубируют в увлажняемом качающемся шкафу.

Таблица 13

Состав предварительной культурной среды

Компонент	Концентрация
Глюкоза	30,0 г/л
Пептон из казеина	10,0 г/л
Дрожжевой экстракт	5,0 г/л
КН2РО4	1,0 г/л
МдЗО4 х 7 Н2О	0,5 г/л
ΖηΟΙ2	30 мг/л
СаС12	20 мг/л
Мп8О4х1 Н2О	9 мг/л
ЕбЗОд X 7 НаО	3 мг/л
Ти/еел 80	3,0 г/л
Пенициллин	50000 м.ед./л
Стрептомицин	50 мг/л
рН*	5,5

* Значение, полученное разреженной серной кислотой.

- 36 015492 мл основной культурной среды (см. табл. 14) в 250 мл колбе Эрленмейера с двумя рефлекторами затравляют 5 мл предварительной культуры.

5.3). Получение ферментационного бульона.

Составы сред, находящихся в колбах 1-9, указаны в табл. 14.

В контрольной среде вместо гидролизата муки используют соответствующее количество раствора глюкозы.

Таблица 14

Находящиеся в колбах среды

* Значение, полученное разреженной серной кислотой. ** Концентрация глюкозы в гидролизате.

*** Навеска гидролизата на 1 л среды.

После внесения затравки в колбу ее в течение 6 дней при 34°С и при вращении (170 об/мин) инкубируют в увлажняемом качающемся шкафу. После прекращения ферментации определяют селективность фитазы фитиновой кислотой как субстратом на подходящем уровне активности фитазы (стандарт: 0,6 ед./мл) в 250 мМ смеси уксусная кислота/ацетат натрия/Т\тееп 20 (0,1 вес.%) при рН 5,5. Исследование стандартизируют для осуществления на микротитровальных пластинах (МТП) 10 мкл ферментного раствора смешивают с 140 мкл 6,49 мМ раствора фитата в 250 мМ буферном растворе ацетата натрия, рН 5,5 (фитат:додеканатриевая соль фитиновой кислоты). Через 1 ч инкубации при 37°С реакцию останавливают добавлением такого же объема (150 мкл) трихлоруксусной кислоты. Аликвотную часть этой смеси (20 мкл) переводят в 280 мкл раствора, содержащего 0,32 N Н₂§0₄, 0,27 вес.% молибдата аммония и 1,08 вес.% аскорбиновой кислоты. Затем осуществляют 25-минутную инкубацию при 50°С. Скорость абсорбции голубого раствора измеряют при 820 нм. Результаты приведены ниже в табл. 15.

Таблица 15

	Активность фитазы [ЕФМ/мл]’
Кукуруза	433
Пшеница	476
Рожь	564
Контрольный образец	393

* ЕФМ=единицы мутности формазина.

Продукт можно подвергать переработке, как описано в №0 98/55599.

Пример 6.

Гидролизат кукурузной муки, полученный согласно примеру 11.3а), исследуют при помощи шейкера в присутствии А^НЬуа докури (колбы 1-4). Кроме того, параллельно используют гидролизат пшеничной муки (колбы 5-8) и гидролизат ржаной муки (колбы 9-12), полученные аналогично примеру ΙΙ.3.

6.1). Штамм.

Под используемым штаммом, вырабатывающим рибофлавин, подразумевают АзЬЬуа докури АТСС, 10895 (см. 8с1шнб1 6., е1 а1. [пЫЬШоп о£ рипПеб 18осНга1е 1уа§е |бепрПеб Цасопа1е апб оха1а1е а§ ро1епНа1 апПте1аЬоШе5 £ог Не пЬоПахт оуегргобисег АкЬЬуа докури. МютоЬю1оду 142: 411-417, 1996).

- 37 015492

6.2). Получение инокулята.

Клетки после нанесения на стерильный НМС-агар (состав: см. табл. 16; 20 мин при 121°С) инкубируют 72 ч при 28°С.

Таблица 16

Состав НМС-агаровых пластин

Компонент	Концентрация
0-глюкоза	4,0 г/л
Дрожжевой экстракт	4,0 г/л
Солодовый экстракт	10,0 г/л
Араг	30,0 г/л
РН	7,2

Затем 50 мл предварительной культурной среды (см. табл. 17) помещают в 250 мл колбу Эрленмейера с двумя рефлекторами, затравляют затравкой клеток и в течение 24 ч при 28°С при вращении (180 об/мин) инкубируют в увлажняемом качающемся шкафу.

Таблица 17

Состав предварительной культурной среды

Компонент	Концентрация
Бактопептон	10,0 г/л
Дрожжевой экстракт	1,0 г/л
Мио-инозит	0,3 г/л
ϋ-глюкоза	10,0 г/л
рН*	7,0

* Значение, полученное разреженным водным раствором №ОН.

мл основной культурной среды (см. табл. 18) в 250 мл колбе Эрленмейера с двумя рефлекторами затравляют 5 мл предварительной культуры.

6.3). Получение ферментационного бульона.

Составы сред, находящихся в колбах 1-12, указаны в табл. 18.

В контрольной среде вместо гидролизата муки используют соответствующее количество раствора глюкозы.

Таблица 18

Находящиеся в колбах среды

* Значение, полученное разреженным водным раствором №ОН.

** Концентрация глюкозы в гидролизате.

*** Навеска гидролизата на 1 л среды.

После внесения затравки в колбу ее в течение 6 дней при 28°С и при вращении (180 об/мин) инкубируют в увлажняемом качающемся шкафу. После прекращения ферментации содержание витамина В2 определяют ВЭЖХ. Результаты приведены ниже в табл. 19.

Таблица 19

	Витамин В-
Кукуруза	2,73 г/л
Пшеница	2,15 г/л
Рожь	2,71 г/л
Контрольный образец	0,12 г/л

Продукт можно перерабатывать, как описано в ЕР 00345717.

- 38 015492

Пример 7.

Гидролизат кукурузной муки, полученный согласно примеру 11.3а), исследуют при помощи шейкера в присутствии СогупеЬас1е1шт д1и1ат1сит (колбы 1-3). Кроме того, параллельно используют гидролизат пшеничной муки (колбы 4-6) и гидролизат ржаной муки (колбы 7-9), полученные аналогично примеру II.3.

7.1) . Штаммы.

Штаммы СогупеЬас£егшт, вырабатывающие метионин, известны специалистам. Получение таких штаммов описано, например, в Китаг Ό. Сотех й. Вю1есЬпо1оду Абуапсех, 23(1):41-61, 2005; Китаг Ό. е1 а1., Ргосехх Вюс1ет1х£гу, 38:1165-1171, 2003; АО 04/024933 и АО 02/18613.

7.2) . Получение инокулята.

Клетки после нанесения на стерильный СМ+Кап-агар (состав: см. табл. 20; 20 мин при 121°С) инкубируют в течение 24 ч при 30°С. Затем клетки соскабливают с пластин и ресуспендируют в солевой раствор. 25 мл среды (см. табл. 5) помещают в 250 мл колбу Эрленмейера и затравляют таким же количеством полученной указанным выше методом суспензии клеток, при этом достигается оптическая плотность ОО₆1₀=1 при 610 нм.

Таблица 20

Состав СМ+Кап-агаровых пластин

Концентрация	Компонент
10,0 г/л	0-глкжоза
2,5 г/л	ЫаС1
2,0 г/л	Карбамид
10,0 г/л	Бактопептон (О//со)
5,0 г/л	Дрожжевой экстракт (О/'/со)
5,0 г/л	Мясной экстракт (ОНсо)
20 мкг/мл	Канамицин
25,0 г/л	Агар

7.3). Получение ферментационного бульона.

Составы сред, находящихся в колбах 1-9, указаны в табл. 21.

В контрольной среде вместо гидролизата муки используют соответствующее количество раствора глюкозы.

- 39 015492

Находящиеся в колбах среды

Таблица 21

	Колба №
	1-3 4-6 7-9
Кукуруза 381,4 г/кг ** ***	157,2г/л*“
Пшеница 342,0 г/кг **	175,6 г/л
Рожь 303,0 г/кг **	198,0 г/л
(ΝΗ4)2δΟ4	20 г/л
Карбамид	5 г/л
КНгРО4	0,113 г/л
К2НРО4	0,138 г/л
АСЕ8	52 г/л
ΜΟΡδ	21 г/л
Лимонная кислота х Н2О	0,49 г/л
3,4-дигид рокси бензойная
кислота	3,08 мг/л
ЫаС1	2,5 г/л
ΚΟΙ	1 г/л
МдЗО4 х Ί Н2О	0,3 г/л
Ре6О4 х 7 Н2О	25 мг/л
Мп8Од х 4 - 6 Н2О	5 мг/л
ΖηΟΙ2	10 мг/л
СаС12	20 мг/л
Н3ВО3	150 мкг/л
СоС1 X 6 Н2О	100 мкг/л
СиС1гх2 Н2О	100 мкг/л
ΝίδΟ4 х 6 НгО	100 мкг/л
На2МоО4 х 2 Н2О	25 мкг/л
Биотин(вит Н)	1050 мкг/л
Тиамин х НС1 (вит В,)	2100 мкг/л
Никотинамид	2,5 мг/л
Пантотеновая кислота	125 мг/л
Цианокобаламин (вит В12)	1 мкг/л
4-аминобензойная кислота
(РАВА; вит Ηι)	600 мкг/л
Фолиевая кислота	1,1 мкг/л
Пиридоксин (вит В6)	30 мкг/л
Рибофлавин (вит В2)	90 мкг/л
С81.	40 мл/л
Канамицин	25 мкг/мл
рН*	6,85

* Значение, полученное разреженным водным раствором №ЮН.

** Концентрация глюкозы в гидролизате.

*** Навеска гидролизата на 1 л среды.

После внесения затравки в колбу ее при 30°С и при вращении (200 об/мин) инкубируют в увлажняемом качающемся шкафу до полного израсходования глюкозы. После прекращения ферментации содержание метионина определяют ВЭЖХ (колонка АдПеи! 2ОЯВАХ Есйрке ААА; метод И. Есйрке ААА рго!осо1, ТесНшса1 №(е 5980-1193). Результаты приведены ниже в табл. 22.

- 40 015492

Таблица 22

	Колба	Метионин [мкмоль/л]
Кукуруза	1	9643,1
	2	9509,2
	3	9395,3
Пшеница	4	6839,9
	5	7133,9
	6	7028,9
Рожь	7	7894,7
	8	7526,5
	9	6998,9
Контрольный образец	10	1920,8
	11	1916,3

Переработку продукта можно осуществлять, например, как описано в АО 05/007862 и более ранней заявке ΌΕ 10359668.2.

Пример 8.

Гидролизат кукурузной муки, полученный согласно примеру 11.3а), исследуют при помощи шейкера в присутствии бактерии 13 0Ζ.

8.1) . Штамм.

Как штамм, вырабатывающий сукцинат, используют бактерию 130Ζ (АТСС № 55618).

8.2) . Получение ферментационного бульона.

мл основной культурной среды (см. табл. 23) помещают в 120 мл склянку сыворотки и затравливают 1 мл замороженной культуры. Перед закупориванием в склянку нагнетают СО2 (0,7 бар).

Состав среды указан в табл. 23 (ср. ИБ 5504004). В контрольной среде вместо гидролизата муки используют соответствующее количество раствора глюкозы (конечная концентрация глюкозы: 100 г/л). Таблица 23

Среда*

Компонент	Концентрация
Кукуруза 381,4 г/кг **	262 г/л
ЫаС1	0,1 г/л
К2НРО4	0,3 г/л
МдС12 х 6 Н2О	20 мг/л
СаС12 х Н2О	20 мг/л
(ΝΗ4)23Ο4	0,1 г/л
Биотин	200 мкг/л
СЗБ	15,0 г/л
10 % дрожжевой экстракт	15,0 г/л
МдСОз	80,0 г/л

* Газированная и дозирования в атмосфере СО₂/Ы₂.

** Концентрация глюкозы в гидролизате. *** Навеска гидролизата на 1 л среды.

После внесения затравки склянку сыворотки в течение 46 ч при 30°С и при вращении (160 об/мин) инкубируют в увлажняемом качающемся шкафу. После прекращения ферментации содержание глюкозы и сукцината определяют ВЭЖХ. Определение осуществляют при помощи колонки Атшех НРХ-87Н фирмы Вю-Каб. Результаты приведены ниже в табл. 24.

Таблица 24

Να.	Глюкоза [г/л]	Сукцинат [г/л]
1	30,93	42,501
2	29,273	44,114
Контрольный образец	17,414	47,73

- 41 015492

Пример 9.

Гидролизат кукурузной муки, полученный согласно примеру 11.3а), исследуют при помощи шейкера в присутствии ЕксйепсЫа со11 (колбы 1-3). Кроме того, параллельно используют гидролизат пшеничной муки (колбы 4-6) и гидролизат ржаной муки (колбы 7-9), полученные аналогично примеру ΙΙ.3.

9.1) . Штамм.

Штаммы ЕксйепсШа сой, вырабатывающие Ь-треонин, известны специалисту. Получение таких штаммов описано, например, в ЕР 1013765 А1, ЕР 1016710 А2, И8 5538873.

9.2) . Получение инокулята.

Клетки наносят на стерильный ЬВ-агар. К ЬВ-агару добавляют антибиотики, если в соответствующем штамме находятся подходящие гены резистентности как маркеры. С этой целью могут быть использованы, например, канамицин (40 мкг/мл) или ампициллин (100 мг/л). Штаммы инкубируют в течение 24 ч при 30°С. Затем клетки соскабливают с пластин и ресуспендируют в солевой раствор. 25 мл среды (см. табл. 25) помещают в 250 мл колбу Эрленмейера и затравляют таким же количеством полученной указанным выше методом суспензии клеток, при этом достигается оптическая плотность ΟΌ₆ι₀=0,5 при 610 нм.

9.3) . Получение ферментационного бульона.

Составы сред, находящихся в колбах 1-9, указаны в табл. 25.

В контрольной среде вместо гидролизата муки используют соответствующее количество раствора глюкозы.

Таблица 25

Находящиеся в колбах среды

	Колба №
	1-3	4-6	7-9
Кукуруза 381,4 г/кг**	157,2 г/л***
Пшеница 342,0 г/кг**		175,6 г/л***
Рожь 303,0 г/кг**			198,0 г/л “*
(ΝΗ4)23Ο4	22 г/л
К2НРО4	2 г/л
ИаС!	0,8 г/л
МдЗО4 х 7 Н2О	0,8 г/л
ЕеЗО, х 7 Н2О	20 мг/л
МпЗО4 х 5 Н2О	20 мг/л
Тиамин х НС! (λ/ϊΐ Вц	200 мг/л
Дрожжевой экстрат	1,0 г/л
СаСО3 (отдельно стерилизованный)	30 г/л
Канамицин	50 мг/л
Ампициллин	100 мг/л
рН*	6,9 ± 0,2

* Значение, полученное разреженным водным раствором Ν;·ιΟΗ.

** Концентрация глюкозы в гидролизате.

*** Навеска гидролизата на 1 л среды.

После внесения затравки в колбу ее при 30°С и при вращении (200 об/мин) инкубируют в увлажняемом качающемся шкафу до полного израсходования глюкозы. После прекращения ферментации содержание Ь-треонина определяют ВЭЖХ с обращенными фазами, как описывают ЫпбтоШ е( а1., Апа1уйса1 С’НетЩгу 51: 1167-1174, 1979.

Затем из готового ферментационного бульона выделяют содержащийся в Ь-треонин, очищают его и перерабатывают, как, например, описано в И8 5538873 и в Вюкаепсе, Вю1есйпо1оду апб ВюсйетШгу 61 (11), 1877-1882, 1997 под редакцией Окато1о е1 а1.

Пример 10.

Аналогичным образом, как описано в примере 9, при использовании соответствующих штаммов получают другие Ь-аминокислоты, такие как глутамат, лизин, гистидин, пролин и аргинин. Соответствующие штаммы описаны, например, в ЕР 1016710.

Пример 11.

Получаемый аналогично примеру ΙΙ.3 гидролизат маниоковой муки исследуют при помощи шейкера в присутствии описанного в п.11.2) вырабатывающего лизин штамма СогупеЬас!егшт д1и1атюит (колбы 1-4). Используемая мука имеет такое распределение величины: 45% < 100 мкм, 56% < 200 мкм, 79% < 630 мкм.

- 42 015492

Уже в начале стадии засахаривания вязкость суспензии является относительно высокой, так что сначала маниоковую муку используют в количестве, которое соответствует содержанию сухой массы 35 вес.%. Осуществляют неоднократную подачу муки, чтобы в результате достичь содержания сухой массы 55 вес.%. Вязкость суспензии в процессе засахаривания остается относительно высокой. Кроме того, маниоковая мука имеет склонность к склеиванию; комки растворяются только частично. Содержащиеся комки при проведении теста на содержание крахмала йодом через несколько минут окрашиваются в темно-синий цвет; это также означает, что склеившийся крахмал, несмотря на неоднократное кипячение и длительное выдерживание, не может быть полностью превращен.

11.1) . Штамм.

Используют описанный в п.Ш модифицированный ген дикого типа аспартаткиназу при дерегуляции с обратной связью АТСС13032 1укС^ГЬг.

11.2) . Получение инокулята.

Клетки после нанесения на стерильный СМ+СаАс-агар (состав: см. табл. 26, 20 мин при 121°С) инкубируют в течение 24 ч при 30°С. Затем клетки соскабливают с пластин и ресуспендируют в солевой раствор. 23 мл среды (см. табл. 27) помещают в 250 мл колбу Эрленмейера и затравляют таким же количеством полученной указанным выше методом суспензии клеток, при этом достигается оптическая плотность ОО₆1₀=0,5 при 610 нм.

Таблица 26

Состав СМ+СаАс-агаровых пластин

Концентрация	Компонент
10,0 г/л	О-глюкоза
2,5 г/л	ИаС1
2,0 г/л	Карбамид
5,0 г/л	Бактопептон (О/Тсо)
5,0 г/л	Дрожжевой экстракт (О/Гсо)
5,0 г/л	Мясной экстракт (О//со)
20,0 г/л	Казаминовые кислоты
20,0 г/л	Агар

11.3). Получение ферментационного бульона.

Состав среды, находящейся в колбе, указан в табл. 27.

В контрольной среде вместо гидролизата муки используют соответствующее количество раствора глюкозы.

- 43 015492

Таблица 27

Находящаяся в колбе среда

** Концентрация глюкозы в гидролизате.

*** Навеска гидролизата на 1 л среды.

После внесения затравки в колбу ее в течение 48 ч при 34°С и при вращении (200 об/мин) инкубируют в увлажняемом качающемся шкафу. После прекращения ферментации определяют содержание глюкозы и лизина ВЭЖХ ВЭЖХ осуществляют приборами 1100 8епек ЬС фирмы Адйеп!. Содержание глюкозы определяют на колонке Атшех НРХ-87Н фирмы Вю-Ваб. Определение концентрации аминокислоты осуществляют ВЭЖХ прибором 1100 8епек ЬС 8ук!ет фирмы Адйеп!. Предколоночная дериватизация ортофталальдегидом позволяет определить количество образовавшейся аминокислоты, смесь продуктов выделяют на колонке Нурегкй АА фирмы Адйеп!. Результаты указаны ниже в табл. 28.

- 44 015492

Таблица 28

Во всех колбах лизин получают в сопоставимых количествах примерно от 10 до 14 г/л в соответствии с выходом, достигаемым стандартной ферментацией смесью глюкоза/питательный раствор.

Пример 12.

Частично засахаренный гидролизат кукурузной муки исследуют при помощи шейкера в присутствии ЛкрегдШик шдег.

12.1) . Растворение и (частичное) засахаривание.

Растворение осуществляют аналогично примеру 11.3а). После охлаждения суспензии до 61°С и установления значения рН 4,3 добавляют 5,38 г (=1,5 вес.% фермент/сухая смесь) Оех1гохуте СА (Νονοζνιικδ А/8). Соответственно через 10, 15, 20, 30, 45 и 60 мин после добавления фермента берут 50 г образца и суспендируют в 25 мл стерильной охлажденной льдом полностью деминерализованной воды. Образцы помещают в ледяную ванну и сразу же используют в исследованиях в колбах. Дезактивация фермента не наблюдается.

12.2) . Ферментация.

Используют применяемый в примере 5.1) штамм. Получение инокулята осуществляют, как описано в примере 5.2).

Для получения ферментационного бульона используют указанные в табл. 29 составы среды. Каждый образец помещают в две колбы.

Таблица 29

Находящиеся в колбах среды

* Значение, полученное разреженной серной кислотой.

*** Навеска частично засахаренного гидролизата на 1 л среды.

После внесения затравки в колбу ее в течение 6 дней при 34°С и при вращении (170 об/мин) инкубируют в увлажняемом качающемся шкафу. После прекращения ферментации определяют активность фитазы при помощи исследования (как описано в примере 5.3). Результаты приведены ниже в табл. 30.

- 45 015492

Таблица 30

Пример 13.

Частично засахаренный гидролизат кукурузной муки исследуют при помощи шейкера в присутствии СогупеЬас£егшт д1и1аткит.

13.1) . Растворение и (частичное) засахаривание.

Растворение осуществляют аналогично примеру П.3а). После охлаждения суспензии до 61°С и установления значения рН 4,3 добавляют 5,38 г (=1,5 вес.% фермент/сухая смесь) Оех1гохуте СА (Ыоуохутех А/8). Соответственно через 10, 15, 20, 30, 45 и 60 мин после добавления фермента берут 50 г образца и суспендируют в 25 мл стерильной охлажденной льдом полностью деминерализованной воды Образцы помещают в ледяную ванну и сразу же используют в исследованиях в колбах. Дезактивация фермента не наблюдается.

13.2) . Ферментация.

Используют применяемый в примере 3 штамм. Получение инокулята осуществляют, как описано в примере 3.1).

Для получения ферментационного бульона используют указанные в табл. 31 составы среды. Каждый образец помещают в три колбы.

- 46 015492

Таблица 31

Находящиеся в колбах среды

Кукуруза	4,5 г/л ***
(ΝΗ4)2304	20 г/л
Карбамид	5 г/л
КН2РО4	0,113 г/л
к2нро4	0,138 г/л
АСЕ8	52 г/л
МОРЗ	21 г/л
Лимонная кислота х Н2О	0,49 г/л
3,4-дигидроксибензойная кислота	3,08 мг/л
ИаС1	2,5 г/л
КС!	1 г/л
МдЗО4 х 7 Н2О	0,3 г/л
ЕеЗО4х7 Н2О	25 мг/л
МпЗО4х4-6Н2О	5 мг/л
ΖηΟΙ2	10 мг/л
СаС12	20 мг/л
Н3ВОз	150 мкг/л
СоС1 х 6 Н2О	100 мкг/л
СиС12 х 2 Н2О	100 мкг/л
Νι3Ο4 х 6 Н2О	100 мкг/л
Ма2МоО4 х 2 Н2О	25 мкг/л
Биотин(вит Н)	1050 мкг/л
Тиамин х НС1 (вит В,)	2100 мкг/л
Никотинамид	2,5 мг/л
Пантотеновая кислота	125 мг/л
Цианокобаламин (вит В12)	1 мкг/л
4-аминобензойная кислота (РАВА, вит Нр	600 мкг/л
Фолиевая кислота	1,1 мкг/л
Пиридоксин (вит Вз)	30 мкг/л
Рибофлавин (вит В2)	90 мкг/л
С8б	40 мл/л
рН* *	6,85

* Значение, полученное разреженным водным раствором ΝοΟΗ.

*** Навеска гидролизата на 1 л среды.

После внесения затравки в колбу ее в течение 48 ч при 30°С и при вращении (200 об/мин) инкубируют в увлажняемом качающемся шкафу. После прекращения ферментации определяют содержание глюкозы и лизина ВЭЖХ ВЭЖХ осуществляют приборами 1100 8епе5 ЬС фирмы Адйеп!. Содержание глюкозы определяют на колонке Атшех НРХ-87Н фирмы Βίο-Кай. Определение концентрации аминокислоты осуществляют ВЭЖХ прибором 1100 8епе5 ЬС 8у§!ет фирмы Адйеп!. Предколоночная дериватизация ортофталальдегидом позволяет определить количество образовавшейся аминокислоты, смесь продуктов выделяют на колонке Нурегай АА фирмы Адйеп!. Результаты указаны в табл. 32

- 47 015492

Таблица 32

Пример 14.

Ферментацией, осуществляемой аналогично примеру 3, для получения лизина после выделения лизина из ферментационного бульона согласно стадии с) в качестве сухого ферментационного остатка получают белковую композицию. В табл. 33 указаны основные компоненты композиции в вес.ч. и приведено их сравнение с обычной ΌΌΟδ-композицией.

Таблица 33

Результаты анализов в пересчете на сухую массу в вес.%**

	Белковая композиция	Табличные данные* **	Отношение
Неочищенный белок	68,1	29,7	2,29
Жир-сырец	8,4	10,0	0,84
Необработанное волокно	1,5	(8,8)	0,17
Зола	7,9	5,2	1,52
Кислый детергент	4,6	19,7	0,23
Нейтральный детергент	17,9	38,8	0,46
Лизин	3,72	0,67	5,55
Метионин	0,87	0,54	1,61
Треонин	1,93	1,02	1,89
Триптофан	0,46	0,26	1,77
Фосфор	0,54	0,83	0,65
Кальций	<0,11	0,22	-

* ΌΌ68 (ЭЩШег'к бпеб дгат \\'ί11ι ко1иЬ1ек, побочный продукт при получении биоэтанола) согласно №1Ропа1 Кекеагск СоипсП (ΝΚΤ), Ш1пеп1 КецшгетеШк £ог Иа1гу Сай1е, 8еуеп111 Кеущеб Еб1Иоп, №1Нопа1 Асабету Ргекк, 2001 (Ьх\у. 8р1еНк МЛ., №1йпеу М.Н. апб 8Ьигкоп 6.С.: МйпегИ ба1аЬаке £ог б1кШ1ег'к бпеб дгатк \\Ч11 ко1иЬ1ек ргобисеб £гот пе\у е111апо1 р1ап(к т Мтпеко1а апб 8ои111 Иако1а, 1оита1 о£ Ашта1 8с1епсе 80, 2002, 2639-2645).

** Указанные параметры и необходимые для этого методы анализа известны специалистам.

Claims (21)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ получения по меньшей мере одного продукта микробного метаболизма, содержащего по крайней мере три атома углерода или по крайней мере два атома углерода и по крайней мере один атом азота, путем микробиологической ферментации сахаров, заключающийся в том, что осуществляют следующие этапы:

   а) получают сахарсодержащую жидкую среду из источника крахмала, в которой содержание моносахарида составляет более 20 вес.%, причем указанная среда также содержит по меньшей мере 20 вес.% не содержащих крахмал твердых компонентов, полученных из указанного источника крахмала;

   б) проводят ферментацию среды, полученной, как указано в а), с получением метаболического продукта (продуктов) и

   в) отделяют или выделяют по меньшей мере один метаболический продукт из ферментационного бульона, причем микроорганизм, продуцирующий желаемый(е) метаболический(е) продукт(ы), культивируют в сахарсодержащей среде а), которую получают:

   а1) сухим измельчением указанного в а) источника крахмала, в качестве которого используют зерна зерновых культур, и а2) разжижением измельченного материала в жидкости на основе воды в присутствии по меньшей мере одного фермента, расщепляющего крахмал, и дальнейшим осахариванием с применением по меньшей мере одного осахаривающего фермента, причем во время разжижения по меньшей мере 40% измельченного материала добавляют непрерывно или периодически в жидкость на основе воды, а разжижение осуществляют, по меньшей мере, частично при температуре выше температуры гелеобразования используемого крахмала, и по меньшей

   - 59 015492 мере 25 вес.% общего количества добавляемого в процессе разжижения измельченного материала подают при температуре выше температуры гелеобразования содержащегося в измельченном материале крахмала.
2. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что фермент, расщепляющий крахмал, выбирают из α-амилаз, и по меньшей мере один фермент, осахаривающий крахмал, выбирают из глюкоамилаз.
3. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что зерновые культуры выбирают из кукурузы, ржи, тритикале и пшеницы.
4. 4. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что измельченный материал, полученный на стадии а1), содержит по меньшей мере 50 вес.% частиц муки, размер зерен которой составляет более 100 мкм.
5. 5. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что разжижение и осахаривание измельченного материала на стадии а2) осуществляют таким образом, чтобы вязкость жидкой среды составляла не более 20 Па-с.
6. 6. Способ по любому из пп.2-5, отличающийся тем, что на стадии а2) до или в начале процесса разжижения в жидкость на основе воды добавляют первую часть указанного фермента, расщепляющего крахмал, выбранного из α-амилаз, а затем добавляют остаточную часть фермента.
7. 7. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что на стадии а) получают сахарсодержащую жидкую среду, содержание моносахарида в которой составляет более 40 вес.%.
8. 8. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что в сахарсодержащую жидкую среду перед осуществлением стадии ферментации б) добавляют по меньшей мере одну фитазу.
9. 9. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что микроорганизм выбирают из природных или рекомбинантных микроорганизмов, которые продуцируют по меньшей мере один из следующих метаболических продуктов: ферменты, аминокислоты, витамины, дисахариды, алифатические моно- и дикарбоновые кислоты, содержащие от 3 до 10 атомов углерода, алифатические гидроксикарбоновые кислоты, содержащие от 3 до 10 атомов углерода, кетоны, содержащие от 3 до 10 атомов углерода, алканолы, содержащие от 4 до 10 атомов углерода, и полигидроксиалканоаты.
10. 10. Способ по п.9, отличающийся тем, что микроорганизм выбран из группы, включающей СогупеЬас1егшт, ВасШик, АкйЬуа, ЕксйепсЫа, АкрегдШик, А1сайдепек, АсйпоЬасШик, АпаегоЬюкрт11ит, Ьас!оЬасШик, РгорюшЬас1епит и С1ок1пбшт, в частности, из штаммов СогупеЬас1егшт д1и1атюит, ВасШик киЫШк, АкНЬуа доккури, ЕксйепсЫа сой, АкрегдШик шдег или А1са11депек 1а!ик, АпаегоЬюкрт11ит кисаюргобисепк, АсйпоЬасШик кисстодепек, ЬасЮЬасШик бе1Ьгйски, Ьас1оЬасШик 1еюйтаппи, РгорюшЬас1епит агаЬтокит, РгорющЬас1егшт ксйегтапи, РгорющЬас1егшт кгеибепгекйп, С1ок1пбшт ргорюшсит и С1ок1пбшт асе1оЬиШсит.
11. 11. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что отделяют или выделяют микробиологический продукт из ферментационного бульона согласно стадии в) ионообменной хроматографией.
12. 12. Способ по п.11, отличающийся тем, что продукт избирательно связывают с ионообменником, и, в случае необходимости, ионообменник перед элюированием продукта промывают.
13. 13. Способ по любому из пп.11 или 12, отличающийся тем, что через ионообменник против силы тяжести пропускают содержащий твердые компоненты ферментационный бульон.
14. 14. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что:

    (ί) от полученной на стадии а) сахарсодержащей жидкой среды, которая включает не содержащие крахмал твердые компоненты источника крахмала, отделяют одну часть, не более 50 вес.%, и оставшееся количество подвергают ферментации согласно б) для получения первого метаболического продукта (А), а (ίί) из указанной отделенной части полностью или частично выделяют не содержащие крахмал твердые компоненты источника крахмала, после чего ее подвергают ферментации согласно б) для получения второго метаболического продукта (В), который идентичен продукту (А) или отличен от него.
15. 15. Способ по п.14, отличающийся тем, что выделение не содержащих крахмал твердых компонентов согласно (ίί) осуществляют таким образом, что содержание твердых компонентов в оставшейся части сахарсодержащей жидкой среды составляет не более 50 вес.%.
16. 16. Способ по п.14 или 15, отличающийся тем, что метаболический продукт (В) представляет собой фитазу, рибофлавин, пантотеновую кислоту и полигидроксиалканоаты.
17. 17. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что после отделения или выделения метаболического продукта согласно стадии в) из ферментационного бульона, по меньшей мере, частично выделяют летучие компоненты с получением твердой или полутвердой композиции на основе протеинов.
18. 18. Композиция на основе протеинов, пригодная в качестве корма или кормовой добавки, получаемая способом по п.17, содержащая следующие компоненты:

    a) 1-90 вес.% протеинового материала из ферментационного бульона;

    b) 1-90 вес.% не содержащих крахмал компонентов источника крахмала;

    - 60 015492

    с) 0,01-10 вес .% микробиологического продукта, содержащего по крайней мере три атома углерода или по крайней мере два атома углерода и по крайней мере один атом азота;

    й) 0-90 вес.% целевых добавок и

    е) 0-40 вес.% других неметаболизированных компонентов ферментационного бульона, причем сумма компонентов а)-е) равна 100 вес.% сухой массы.
19. 19. Композиция по п.18, содержание сырого протеина в которой составляет 40-90 вес.% в пересчете на сухую массу композиции.
20. 20. Композиция по одному из пп.18 или 19, которая содержит по меньшей мере одну незаменимую аминокислоту, выбранную из лизина, метионина, треонина и триптофана.
21. 21. Применение сахарсодержащей жидкой среды согласно определению в одном из пп.1-16 для ферментативного получения продукта микробного метаболизма, содержащего по крайней мере три атома углерода или по крайней мере два атома углерода и по крайней мере один атом азота.