TWI386488B - 精細化學品之發酵生產 - Google Patents
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Description
本發明係關於藉由研磨、液化及醣化澱粉原料來發酵生產精細化學品及將所得糖溶液用作發酵培養基。
通常已知借助微生物生產諸如(例如)胺基酸、維生素及類胡蘿蔔素之精細化學品的發酵方法。視各種方法條件而定,吾人開發不同碳原料。吾人自經由甜菜及甘蔗糖蜜之純蔗糖延伸至已知作為高測試糖蜜者(反式甘蔗糖蜜)至來自澱粉水解產物之葡萄糖。此外,乙酸及乙醇作為在工業規模可用於生物技術生產L-離胺酸之輔助基質來提及(Pfefferle等人,Biotechnogical Manufacture of Lysine,Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology,第79卷(2003),59-112)。
基於上文所提及之碳原料,吾人建立了用於糖基發酵生產精細化學品之各種方法及程序。以L-離胺酸為例,此等係例如藉由Pfefferle等人(同上)關於菌株研製、方法開發及工業生產來描述。
用於精細化學品之微生物介導發酵生產的一種重要碳原料為澱粉。後者在其可用作發酵中之碳原料之前必須首先於先前反應步驟中液化且醣化。為此,澱粉通常以預純化形式自諸如土豆、木薯、例如小麥、玉米、大麥、黑麥、黑小麥或水稻之穀類的天然澱粉原料獲得,且隨後經酶液化及醣化,之後其於實際發酵中用於生產精細化學品。
除了使用該等經預純化之澱粉原料之外,亦已描述使用未經預處理之澱粉原料來製備用於精細化學品之發酵生產的碳原料。通常藉由研磨來初始地粉碎該等澱粉原料。接著使研磨漿經受液化及醣化。因為此研磨漿除澱粉之外天然包含不利地影響發酵之一系列非澱粉組份,所以通常在發酵之前移除此等組份。該移除可直接在研磨之後(WO 02/277252;JP 2001-072701;JP 56-169594;CN 1218111)、液化之後(WO 02/277252;CN 1173541)或醣化之後(CN 1266102;Beukema等人:Production of fermentation syrups by enzymatic hydrolysis of potatoes;potato saccharification to give culture medium(會議摘要),Symp.Biotechnol.Res.Neth.(1983),6;NL8302229)實現。然而,所有變體均涉及在發酵中使用實質純淨之澱粉水解產物。
更新近之技術尤其涉及經改良之方法,其意欲使例如經液化及醣化之澱粉溶液(JP 57159500)及來自可再生資源之發酵培養基(EP 1205557)的純化可在發酵之前。
相反,已知未經加工之澱粉原料大規模地用於生物乙醇之發酵生產中。此處,稱為"乾式研磨"之方法、澱粉原料之液化及醣化係以大工業規模來建立。合適之方法描述可在例如"The Alcohol Textbook-A reference for the beverage,fuel and industrial alcohol industries",Jaques等人(編輯),Nottingham Univ.Press 1995,ISBN 1-8977676-735及McAloon等人,"Determining the cost of producing ethanol from corn starch and lignocellulosic feedstocks",NREL/TP-580-28893,National Renewable Energy Laboratory,2000年10月中找到。
在乾式研磨方法之第一步驟中,精細地研磨整個穀類仁,較佳玉米、小麥、大麥、粟及黑麥。與稱為濕式研磨方法之方法形成對比,乾式研磨不添加額外液體。將材料研磨成精細組份之目的係使仁中所存在之澱粉易於影響隨後液化及醣化中之水及酶。
因為在生物乙醇之發酵生產中,有價值之產物藉由蒸餾法來獲得,所以未經預純化形式使用來自乾式研磨加工之澱粉原料並不構成特定問題。然而,當使用一種用於生產精細化學品之乾式研磨方法時,經由糖溶液引入發酵中之固體流有問題,因為其不僅對發酵具有不利影響,而且亦使隨後處理大體上更困難。
因此,所用微生物之氧氣供應在許多發酵中係一限制因素,尤其是在前者要求氧氣需求時。通常很少知道高固體濃度對氧氣自氣相轉變成液相的影響且因此對氧氣轉移速率的影響。另一方面,已知隨固體濃度增大之黏度導致經減小之氧氣轉移速率。此外,若表面活性物質與固體一起引入發酵培養基中,則其影響氣體泡沫凝聚之趨勢。所得泡沫尺寸進而對氧氣轉移具有實質影響(Mersmann,A.等人:Selection and Design of Aerobic Bioreactors,Chem.Eng.Technol.13(1990),357-370)。
由於固體之引入,所用培養基之臨界黏度值可早在製備含澱粉之懸浮液時便可達成,因為例如具有多於30重量%之經研磨之玉米於水中的懸浮液可不再均勻混合(Industrial Enzymology,第2版,T.Godfrey,S.West,1996)。此限制了習知程序中之葡萄糖濃度。結果,使用具有較低濃度之溶液對於加工經濟原因係不利的,因為此導致發酵液之不成比例的稀釋。此引起目標產物之可達成之最終濃度下降,其導致此等分離時之額外成本及導致空間-時間產率下降,假定產品數量相等,其導致更高的體積需求,意即更高的投資成本。
在處理期間,經增大之固體濃度可導致使用特殊方法之特定困難。因此,例如在借助離子交換層析法純化發酵液時,必須考慮所用之層析管柱趨於堵塞(意即阻塞)。
由於此等困難,乾式研磨方法之先前技術變體不適於提供用於發酵生產精細化學品之澱粉原料且因此無特定的經濟重要性。目前,對應用原則上與該方法相關聯存在之乾式研磨概念及優點、以工業規模生產精細化學品的嘗試僅使用木薯作為澱粉原料來描述。
因此,當JP 2001/275693描述一種用於發酵生產胺基酸之方法時,其中以乾燥狀態研磨之剝皮木薯塊莖用作澱粉原料,其有必要進行該製程來調節研磨漿之粒徑150μm。在用於此目的之過濾步驟中,於液化/醣化及隨後發酵所獲得之澱粉之前移除所用之多於10重量%的研磨漿(包括含非澱粉組份)。此外,該方法免除了在例如離胺酸之發酵產物意欲用作進料添加劑之範圍內移除含非澱粉之組份的問題且因此含非澱粉之木薯組份可保留於有價值之產物中。
在JP 2001/309751中描述了一種生產含胺基酸之進料添加劑的類似方法。類似地,不需要純化或移除固體。
然而,與其它澱粉原料相比,木薯在乾式研磨方法中應相對沒問題。當澱粉通常占乾燥木薯根之至少80重量%(Menezes等人,Fungal celluloses as an aid for the saccharification of Cassava,Biotechnology and Bioengineering,第20卷(4),1978,John Wiley and Sons,Inc.,表1,第558頁)時,穀類中之澱粉含量(乾燥物質)相對低的多,通常在70重量%以下,例如在玉米之狀況下其總計約68重量%且在小麥之狀況下總計約65重量%(Jaques等人,The Alcohol Textbook,同上)。因此,當使用經乾式研磨之木薯時,液化及醣化之後所獲得之葡萄糖溶液包含較使用另一經乾式研磨之澱粉原料時少的污染物,尤其是固體。
經增大之污染物量增大反應混合物之黏度。然而,木薯澱粉應相對易於加工。雖然其在膨脹溫度下具有與玉米澱粉相比更高的黏度,但相反地,黏度在增大溫度下較在玉米澱粉之狀況下下降更快(Menezes,T.J.B.de,Saccharification of Cassava for ethyl alcohol production,Process Biochemistry,1978,第24頁,右欄)。此外,木薯澱粉之膨脹及膠凝化溫度較來自諸如玉米之穀類之澱粉的彼等溫度低,此為其為何較穀類澱粉更易於獲得細菌α-澱粉酶的原因(Menezes,T.J.B.de,同上)。
木薯優於其它澱粉原料之其它優點為其低纖維素含量及其低肌醇六磷酸鹽含量。纖維素及半纖維素可轉換為糠醛,尤其是在酸性醣化條件下(Jaques等人,The Alcohol Textbook,同上;Menezes,T.J.B.de,同上),其進而可對發酵中所用之微生物具有抑制作用。肌醇六磷酸鹽同樣抑制發酵所用之微生物。
雖然自技術態樣而言可在對應於乾式研磨方法之加工中處理木薯為澱粉原料,但該木薯基加工仍複雜,未最優化且因此不廣泛使用。
因此,本發明之一目標係提供一種用於發酵生產精細化學品之有效方法,該方法允許使用多種含澱粉、全世界當地可購得之植物(例如穀類或土豆)作為澱粉原料。該方法以易於處理所用之培養基而著稱且詳言之避免複雜的預純化或主純化步驟,諸如(例如)在發酵之前移除固態的含非澱粉組份。此外,其允許容易加工發酵混合物。關於申請公司所進行之工作,吾人已驚奇地發現該方法可以一有效方式進行而不管固體之固有增大引入。
因此,本發明係關於一種借助糖基微生物發酵生產至少一種具有至少3個碳原子或具有至少2個碳原子及至少1個氮原子之微生物代謝物的方法,其包含:a)自澱粉原料製備具有多於20重量%之單醣含量的含糖液體培養基,該含糖液體培養基亦包含該澱粉原料之非澱粉固體組份;b)使該含糖液體培養基發酵以生產一或多種代謝物;及c)自發酵液耗盡或分離至少一種代謝物,其中生產所要之一或多種代謝物之微生物菌株係以該含糖液體培養基來培養,該液體培養基係藉由以下步驟來獲得:a1)研磨該澱粉原料;及a2)在至少一種澱粉液化酶存在下將研磨漿液化於一含水液體中,接著使用至少一種醣化酶醣化,其中至少一些研磨漿藉由連續或逐批添加至該含水液體來液化。
適合作為澱粉原料者主要為乾燥穀類或種子,其中在乾燥狀態下澱粉總計至少40重量%且較佳至少50重量%。其在目前以大規模種植之許多穀類植物中找到,諸如玉米、小麥、燕麥、大麥、黑麥、黑小麥、水稻及例如甜高梁及買羅高梁(milo)之多種蜀黍及粟物種。澱粉原料較佳選自穀類仁,尤佳選自玉米、黑麥、黑小麥及小麥仁。原則上,根據本發明之方法亦可以諸如(例如)土豆、木薯/木薯粉或多種含澱粉之果實或種子之混合物的其它澱粉原料來進行。
含糖液體培養基中所存在之糖較佳為單醣,諸如己醣及戊醣,例如葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、山梨糖、木糖、阿拉伯糖及核糖,尤其是葡萄糖。除了葡萄糖之外,單醣之量可視所用之澱粉原料及其中所存在之非澱粉組份而變化;其可受反應進行之影響,例如受藉由添加纖維素酶分解纖維素組份的影響。含糖液體培養基之單醣有利地包含以含糖液體培養基中所存在之糖總量計為至少60重量%、較佳至少70重量%、尤佳至少80重量%之量的葡萄糖。通常,葡萄糖總計以含糖液體培養基中所存在之糖總量計之75至99重量%、詳言之80至97重量%且尤其85至95重量%的範圍。
根據本發明,用於培養生產所要代謝物之微生物菌株的含糖液體培養基視研磨程度含有至少一些、較佳至少20重量%、詳言之至少50重量%、更特定言之至少90重量%及最特定言之至少99重量%之經研磨之穀類仁中所含有的非澱粉固體組份。基於研磨漿之澱粉組份(及因此基於含糖液體培養基中之單醣的量),含糖液體培養基中之非澱粉固體組份的比例總計較佳至少10重量%且詳言之至少25重量%,例如介於25重量%與75重量%之間且尤其介於30重量%與60重量%之間。
為了製備含糖液體培養基,在添加或不添加例如水之液體、較佳不添加液體的情況下於步驟a1)中研磨所討論之澱粉原料。亦可組合乾式研磨與隨後的濕式研磨步驟。通常用於乾式研磨之裝置為錘式研磨機、轉子研磨機或輥式粉碎機;適用於濕式研磨之彼等裝置為槳式混合機、攪拌球磨研磨機、循環式研磨機、碟式研磨機、環形室研磨機、振盪式研磨機或行星研磨機。原則上,其它研磨機亦適合。濕式研磨所需之液體的量可藉由常規實驗中之熟練工人來確定。其通常以乾燥物質含量在10至20重量%之範圍內的方式來調節。
研磨引起適用於隨後加工步驟之粒徑。在此內容中,已證明研磨步驟中(尤其是乾式研磨步驟中,步驟a1)中)所獲得之研磨漿具有粉粒,意即30至100重量%、較佳40至95重量%且尤佳50至90重量%之量之具有100至630μm範圍內之粒徑的微粒組份係有利的。較佳地,所獲得之研磨漿包含50重量%之具有多於100μm之粒徑的粉粒。通常,所獲得之粉粒的至少95重量%具有小於2 mm之粒徑。在此內容中,粒徑係借助使用振動分析器之篩分析來量測。原則上,小粒徑對於獲得高產物產量而言是不利的。然而,過小粒徑可引起問題,尤其是歸因於研磨漿在液化或加工期間、例如在發酵步驟之後乾燥固體期間成漿時之凝塊形成/聚結的問題。
通常,粉末之特徵為萃取速率或粉末等級,其相互相關以使得粉末等級之特徵隨增大之萃取速率而增大。萃取速率對應於以所應用之100重量份研磨漿計所獲得之粉末的重量量。而在研磨加工期間,初始獲得純淨超精細麵粉(例如來自穀類仁內部),麵粉中之粗纖維及外殼含量的量增大,而澱粉比例下降。因此,提取速率亦反映在稱為麵粉等級之物中,其用作將麵粉分類,詳言之穀類麵粉分類的象徵,且其基於麵粉之灰含量(稱為灰比例)。粉末等級或類型數指示100 g粉末固體燒盡時所留下的以mg為單位的灰(礦物)量。
在穀類粉末之狀況下,較高類型數意謂較高的萃取速率,因為穀類仁之核包含約0.4重量%之灰,而外殼包含約5重量%之灰。在較低萃取速率之狀況下,穀類粉末因此主要由經粉碎之胚乳(意即穀類仁之澱粉含量)組成;在較高萃取速率之狀況下,穀類粉末亦包含經粉碎之含蛋白質之穀物糊粉層;在粗研磨之狀況下,其亦包含含蛋白質及含脂肪胚及包含粗纖維及灰之外殼的組份。為本發明之目的,具有高萃取速率或高類型數之粉末在原則上係較佳的。若穀類用作澱粉原料,則較佳將完整仁連同其外殼一起研磨及加工。
若適當,例如在使用諸如土豆或木薯之相對大材料時,澱粉原料將在研磨之前粉碎至適合用於研磨之尺寸。在穀類之狀況下,可免除此粉碎步驟且採用及研磨該完整仁。
為了液化研磨漿中所存在之澱粉,在液化步驟期間但在醣化步驟之前,將至少一些研磨漿、較佳至少40重量%、詳言之至少50重量%且尤佳至少55重量%之研磨漿於步驟a2)中引入反應器中。所添加之量常常不超過90重量%,詳言之85重量%且尤佳80重量%。較佳地,將在加工期間添加之此部分研磨漿在如先前液化步驟期間所普及之條件下供應至反應器中。該添加可以在各情況下較佳不多達待液化之研磨漿總量的20重量%、尤佳不多於10重量%、例如1至20重量%、詳言之2至10重量%之若干份來逐批(意即逐份)或連續實現。在液化過程起始時僅一些研磨漿、較佳不多於60重量%、詳言之不多於50重量%且尤佳不多於45重量%之研磨漿存在於反應器中且剩餘研磨漿在液化步驟期間添加對於本發明而言係必要的。液化亦可(例如)以多步驟串聯反應來連續地進行。
根據本發明,步驟a2)中之液化在較佳選自α-澱粉酶之至少一種澱粉液化酶之存在下進行。同樣可使用在反應條件下呈活性及穩定且液化澱粉之其它酶。
α-澱粉酶(或所用之澱粉液化酶)可首先引入反應器中或在步驟a2)期間添加。較佳地,步驟a2)中所需之一些α-澱粉酶在步驟a2)起始時添加或首先置放於反應器中。α-澱粉酶之總量通常在以所用之澱粉原料總量計之0.002至3.0重量%、較佳0.01至1.5重量%且尤佳0.02至0.5重量%的範圍內。
液化可在膠凝化溫度以上或以下進行。較佳地,步驟a2)中之液化在所用澱粉之膠凝溫度之至少部分以上進行(稱為蒸煮加工)。通常選擇在70℃與165℃之間、較佳80℃與125℃之間且尤佳85℃與115℃之間之範圍內的溫度,該溫度較佳在膠凝溫度之至少5℃以上且尤佳至少10℃以上。
為了達成最佳的α-澱粉酶活性,步驟a2)較佳至少部分在弱酸性範圍、較佳4.0與7.0之間、尤佳5.0與6.5之間之pH值下進行,該pH值通常在步驟a2)起始之前或之時調節;較佳地,在液化期間核對此pH值,且若適當,將其進行再調節。該pH值較佳使用諸如H2
SO4
或H3
PO4
之稀釋礦物酸或諸如NaOH或KOH之稀釋鹼金屬氫氧化物溶液來調節。
在一較佳實施例中,根據本發明之方法之步驟a2)以使得以研磨漿總量計之不多於60重量%、較佳不多於50重量%且尤佳不多於45重量%、例如10至60重量%、詳言之15至50重量%且尤佳20至45重量%的部分初始懸浮於例如淡水、例如來自發酵或加工階段之經再循環之加工用水的含水液體中或此等液體之混合物中的方式來進行,且隨後進行液化。
為了進行根據本發明之方法,可將用於生成懸浮液之液體預熱至經適度增大的溫度,例如在40℃至60℃之範圍內。然而,較佳在室溫下採用液體。
接著,將至少一種澱粉液化酶、較佳α-澱粉酶添加至此懸浮液。若使用α-澱粉酶,則僅添加一些α-澱粉酶係有利的,例如添加以步驟a2)中所用之所有α-澱粉酶計之10至70重量%、詳言之20至65重量%。在此時間點添加之α-澱粉酶的量視所討論之α-澱粉酶在反應條件下關於所用澱粉原料之活性而定,且其通常在以所用澱粉原料之總量計之0.0004至2.0重量%、較佳0.001至1.0重量%且尤佳0.02至0.3重量%的範圍內。作為一替代例,在製成懸浮液之前可將α-澱粉酶部分與所用液體混合。
在此內容中,該α-澱粉酶部分較佳在加熱至用於液化起始之溫度之前、詳言之在室溫下或僅經適度增大之溫度(例如20至30℃之範圍內)下添加。
有利地,以使得膠凝期間之黏度經足夠減小以使懸浮液能夠有效混合(例如借助攪拌)之方式選擇α-澱粉酶及研磨漿之量。較佳地,膠凝期間之反應混合物的黏度總計不多於20 Pas,尤佳不多於10 Pas且非常尤佳不多於5 Pas。通常,使用具有M5量測系統及MVDIN儀器之Haake黏度計Roto Visko RV20型在50℃之溫度及200 s- 1
之剪切速率下量測該黏度。
接著將因此所製成之懸浮液較佳在所用澱粉之膠凝溫度以上的溫度下加熱。通常選擇70與165℃之間、較佳80與125℃之間且尤佳85與115℃之間之範圍內的溫度,該溫度較佳高於膠凝溫度至少5℃且尤佳至少10℃。當監測黏度時,將其它部分之澱粉原料,例如在各情況下以所有使用澱粉計為2至20重量%且詳言之5至10重量%之澱粉原料逐漸添加至含澱粉之懸浮液中。較佳將液化步驟期間以至少2、較佳至少4且尤佳至少6部分添加之研磨漿部分添加至反應混合物。作為一替代例,不用於製成懸浮液之研磨漿部分可在液化步驟期間連續添加。在添加期間,溫度應有利地保持在澱粉之膠凝溫度以上。
在添加所有粉末之後,通常將反應混合物保持一段時間,例如30至60分鐘或更長,若必要,在設定於澱粉之膠凝溫度以上的溫度下,意即蒸煮。接著,在添加另一α-澱粉酶部分(較佳主要部分)之前,通常將反應混合物冷卻至稍微高於膠凝溫度之溫度,例如75至90℃。視所用之α-澱粉酶在反應條件下之活性而定,在此時間點添加之α-澱粉酶之量較佳為以所用澱粉原料之總量計之0.002至2.0重量%、尤佳0.01至1.0重量%且非常尤佳0.02至0.4重量%。
在此等溫度下,將澱粉之顆粒結構破壞(膠凝),使後者能夠酶降解。為了使澱粉完全降解成糊精,將反應混合物保持在設定溫度下,或若適當,進一步加熱直至借助碘偵測澱粉,或若適當,偵測澱粉之另一測試為陰性或至少基本上呈陰性。若適當,現在可將例如以所用澱粉原料之總量計在0.001至0.5重量%且較佳0.002至0.2重量%之範圍內的一或多個其它α-澱粉酶部分添加至反應混合物。
在澱粉液化結束之後,將液體培養基中所存在之糊精連續地或逐批地(較佳連續)醣化,意即分解成葡萄糖。經液化之培養基在傳送至發酵步驟b)之前可在特定醣化槽中完全醣化。另一方面,已證明在發酵之前僅進行部分醣化係有利的。舉例而言,可接著進行下列一程序:其中液體培養基中所含有之(例如)以糊精(或原始澱粉)之總重量計在10至90重量%之範圍內且尤其在20至80重量%之範圍內的部分糊精醣化,且所得含糖液體培養基用於發酵中。接著,可在發酵培養基中於原位處進行進一步醣化。此外,該醣化可直接(在原位處)於發酵罐中進行而無需存在特定的醣化槽。
原位醣化之優點為一方面減少了資金成本且另一方面在必要時更高的葡萄糖濃度可藉由延遲葡萄糖釋放來分批提供而無需抑制或代謝改變所用之微生物的事實。在大腸桿菌之狀況下,過高葡萄糖濃度可導致形成(例如)有機酸(乙酸鹽),而釀酒釀母(Saccharomyces cerevisae)在此等情況下轉移例如至發酵而不管足夠氧存在於通風發酵罐中之事實(克拉布特裏效應(Crabtree effect))。葡萄糖之延遲釋放可藉由調整葡糖澱粉酶濃度來調節。藉由此等方法可抑制上文所提及之效應及提供更多基質以使得經添加之進料流所產生之稀釋液可減少。
在醣化槽中之醣化的狀況下,經液化之澱粉溶液通常冷卻或加溫至醣化酶之最佳溫度或稍低,例如至50至70℃、較佳60至65℃,且隨後以葡糖澱粉酶進行處理。
若醣化在發酵罐中進行,則經液化之澱粉溶液通常在其喂至發酵罐之前冷卻至發酵溫度,意即32至37℃。在此狀況下,將用於醣化之葡糖澱粉酶(或至少一種醣化酶)直接添加至發酵液中。根據步驟a2)之經液化之澱粉的醣化現在與藉由如步驟b)中所述之微生物之糖代謝平行發生。
在添加葡糖澱粉酶之前,將液體培養基之pH值有利地調節至所用葡糖澱粉酶最佳活性範圍內的值,較佳在3.5與6.0之間、尤佳4.0與5.5之間且非常尤佳4.0與5.0之間之範圍內。然而,亦可調節pH值至上文所提及之範圍之外的值,例如在6.0至8.0之範圍內,尤其使當醣化作用直接於發酵罐中進行時。此通常在例如製備離胺酸、泛酸鹽及維生素B2
中可有利而不管標準葡糖澱粉酶在此pH值範圍內受限活性或由於待調節之發酵條件而變得必要。
在一較佳實施例中,醣化在一特定醣化槽中進行。為此,將經液化之澱粉溶液溫至酶最佳之溫度下或稍低,及以上文所述之方式將pH值調節至酶最佳之值。
通常,葡糖澱粉酶以所用澱粉原料總量計之0.001至5.0重量%、較佳0.005至3.0重量%且尤佳0.01至1.0重量%的量添加至含糊精之液體培養基。在添加葡糖澱粉酶之後,較佳使含糊精之懸浮液在設定溫度下保持例如2至72小時或更長之時間,若需要詳言之保持5至48小時,該等糊精醣化以產生單醣。醣化製程之進展可使用熟練工人所已知之方法來監測,例如HPLC、酶檢定法或葡萄糖測試條。當單醣濃度大體上不再上升或實際上下降時,醣化完全。
在一較佳實施例中,在至少一種α-澱粉酶及至少一種葡糖澱粉酶之存在下於步驟a2)中以使得液體培養基之黏度不多於20 Pas、較佳不多於10 Pas且尤佳不多於5 Pas之方式來進行研磨漿之不連續或連續添加、較佳不連續且詳言之逐份添加。為了輔助控制黏度,已證明在研磨漿中所存在之澱粉的膠凝化溫度以上的溫度下添加經添加之研磨漿總量的至少25重量%、較佳至少35重量%且尤佳至少50重量%係有利的。此外,控制黏度可另外受逐份添加至少一種澱粉液化酶(較佳α-澱粉酶)及/或至少一種醣化酶(較佳葡糖澱粉酶)之影響。
藉由實踐步驟a1)及a2),可生產具有較佳多於30重量%、更佳多於35重量%且最佳多於40重量%之單醣含量的含糖液體。
可用於液化研磨漿中之澱粉部分的酶原則上均為α-澱粉酶(酶類EC 3.2.1.1),詳言之自地衣芽孢桿菌(Bacillus lichenformis)或嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus staerothermophilus)獲得之α-澱粉酶及尤其是用於液化由關於生產生物乙醇之乾式研磨方法所獲得之材料的彼等α-澱粉酶。適用於液化之α-澱粉酶亦係市售的,例如以名稱Termamyl 120 L、類型L自Novozymes購得或以名稱Spezyme自Genencor購得。不同α-澱粉酶之組合亦可用於液化。
可用於醣化經液化之澱粉溶液中之糊精(意即寡糖)的酶原則上均為所有葡糖澱粉酶(酶類EC 3.2.1.3),詳言之自麴菌所獲得之葡糖澱粉酶及尤其是用於醣化由關於生產生物乙醇之乾式研磨方法所獲得之材料的彼等葡糖澱粉酶。適用於醣化之葡糖澱粉酶亦係市售的,例如以名稱Dextrozyme GA自Novozymes購得或以名稱Optidex自Genencor購得。亦可使用不同葡糖澱粉酶之組合。
為了穩定所用之酶,若適當,Ca2 +
離子之濃度例如使用CaCl2
調節至酶特定最佳值。合適濃度值可藉由常規實驗中之熟練工人來確定。若(例如)Termamyl用作α-澱粉酶,則在液體培養基中將Ca2 +
濃度調節至(例如)50至100 ppm、較佳60至80 ppm且尤佳約70 ppm係有利的。
因為全部澱粉原料用於生產a)之含糖液體培養基,例如在穀類(整個仁)之狀況下,所以亦存在澱粉原料之非澱粉固體組份。此常常引起自穀類引入一定量之肌醇六磷酸鹽,該量不可忽視。為了避免因此導致之抑制效應,在使含糖液體培養基經受發酵步驟b)之前,於步驟a2)中添加至少一種肌醇六磷酸酶至液體培養基係有利的。
若肌醇六磷酸酶在個別高溫度下足夠穩定,則其可在液化或醣化之前、期間或之後添加。
只要在各狀況下肌醇六磷酸酶之活性於反應條件下不受到大於臨界之影響,就可使用任何肌醇六磷酸酶。所用之肌醇六磷酸酶較佳具有>50℃之熱穩定性(T50)且尤佳>60℃。
肌醇六磷酸酶之量通常為1至10 000單位/公斤澱粉原料且詳言之10至2000單位/公斤澱粉原料。
為了增大總體糖產率或為了獲得游離胺基酸,可將例如支鏈澱粉酶、纖維素酶、半纖維素酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、葡糖苷酶或蛋白酶之其它酶在生產含糖液體培養基期間額外地添加至反應混合物中。添加此等酶可對黏度具有積極效應,意即經減小之黏度(例如藉由裂解較長鏈的葡聚糖及/或(阿拉伯-)木聚糖),且引起可代謝糖苷解離及(殘餘)澱粉解離。使用蛋白酶具有類似的積極效應,其可額外地解離充當發酵之成長因子的胺基酸。
含糖液體培養基可有利地用於發酵生產具有至少3個碳原子或至少2個碳原子及至少1個氮原子之微生物代謝物。為此,使步驟a)中所生產之含糖液體培養基經受如b)中所述之發酵。在該發酵中,藉由微生物生產精細化學品,意即具有至少3個碳原子及/或至少1個氮原子及至少2個碳原子之化合物。通常,該發酵製程可以熟練工人所已知之通用方式來進行。在此製程期間,經添加之含糖液體培養基與含有所提供之微生物的液體培養基的體積比通常在約1:10至10:1之範圍內,例如在約1:2或約2:1且詳言之約1:1之比率下。發酵液中之糖含量可詳言之經由含糖培養基之添加速率來調節。通常,該添加速率可以發酵液中之單醣含量在0重量%至約5重量%之範圍內的方式來設定;然而,該發酵可以發酵液中之顯著較高的單醣含量來進行,例如約10至20重量%。
若單獨執行醣化及發酵,則可在發酵之前將步驟a)中所獲得之含糖液體培養基消毒,藉以藉由熱、化學或機械方法來破壞微生物。為此,通常將該液體加熱至多於80℃之溫度。細胞之該溶解或破壞可在發酵之前直接實現。為此,使全部含糖液體分別經受溶解或破壞之步驟。溶解及/或破壞可藉由熱、機械或化學方法來進行。在根據本發明之方法的範疇內,已顯示不需要在進行發酵之前應用如本文中所述之該種消毒步驟,而甚至已顯示不應用該消毒步驟係有利的。因此,本發明之一較佳實施例係關於一種方法,其中步驟a)中所獲得之液體立即(意即無先前消毒)喂入發酵中或執行至少一部分原位醣化。
在發酵期間,液體培養基導致一物質,該物質除了所要非揮發性微生物代謝物之外基本上亦含有發酵期間所生產之生物質量、醣化澱粉溶液之未代謝組份及詳言之澱粉原料之非澱粉固體組份,諸如(例如)纖維及未經轉換之糖以及未經轉換之緩衝液及營養鹽。在本發明中,此液體培養基指定為發酵液,而術語發酵液亦包含(含糖)液體培養基,其中已發生其中所含之糖的僅部分或不完全發酵轉換,意即單醣之部分或不完全微生物代謝。
在下文中,術語精細化學品詳言之包含有機單-、二-及三羧酸,其較佳具有3至10個碳原子且若適當其附著有一或多個(例如1、2、3或4個)羥基,例如酒石酸、衣康酸、琥珀酸、反丁烯二酸、順丁烯二酸、2,5-呋喃二羧酸、3-羥基丙酸、戊二酸、乙醯丙酸、乳酸、丙酸、葡糖酸、烏頭酸及二胺基庚二酸、檸檬酸;蛋白質胺基酸及非蛋白質胺基酸,例如離胺酸、麩胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、天冬胺酸及酥胺酸;嘌呤及嘧啶鹼;核苷及核苷酸,例如菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)及腺苷-5'-單磷酸鹽(AMP);脂質;具有較佳10至22個碳原子之飽和及不飽和脂肪酸,例如γ-次亞麻油酸、二高-γ-次亞麻油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸及二十二碳六烯酸;具有較佳3至8個碳原子之二醇,例如丙二醇及丁二醇;具有3或更多(例如3、4、5或6個)OH基團之較高官能度的醇,例如甘油、山梨糖醇、甘露醇及阿拉伯糖醇;具有至少4個碳原子(例如4至22個碳原子)之較長鏈醇,例如丁醇;碳水化合物,例如玻璃醛酸及海藻糖;芳族化合物,例如芳香胺類、香蘭素及靛藍;維生素類及維生素原,例如抗壞血酸、維生素B6
、維生素B1 2
及核黃素、輔助因子及稱為保健食品者;蛋白質,諸如酶,例如肌醇六磷酸酶、木聚糖酶及葡聚糖酶;類胡蘿蔔素類,例如蕃茄紅素、β-胡蘿蔔素、蝦青素、玉米黃素及角黃素;具有較佳3至10個碳原子、若適當1或多個羥基之酮類,例如丙酮及乙偶姻(acetoin);內酯類,例如γ-丁內酯、環糊精、生物聚合物,例如聚羥基乙酸酯、聚酯、多醣、聚異戊二烯、聚醯胺、聚羥基烷酸酯,例如聚-3-羥基丁酸及與諸如3-羥基戊酸、4-羥基丁酸及Steinbchel(編輯),Biopolymers,第一版,2003,Wiley-VCH,Weinheim及其中所引用之文獻中所描述之其它酸的其它有機羥基羧酸的共聚酯;及上文所提及之化合物的前驅體及衍生物。Gutcho在Chemicals by Fermentation,Noyes Data Corporation(1973),ISBN:0818805086中描述了適合作為精細化學品之其它化合物。
術語"輔助因子"包含出現正常酶活性所需之非蛋白質化合物。此等化合物可為有機型或無機型;較佳地,本發明之輔助因子分子為有機型。該等分子之實例為NAD及菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸鹽(NADP);此等輔助因子之前驅體為菸鹼。
術語"保健食品"包含促進植物及尤其是人類之動物之健康的食品添加劑。該等分子之實例為維生素、抗氧化劑及某些脂質,例如多元不飽和脂肪酸。
詳言之,所生產之代謝物係選自由以下各物組成之群:酶、胺基酸、維生素、雙醣、具有3至10個C原子之脂族單羧酸及二羧酸、具有3至10個C原子之脂族羥基羧酸、具有3至10個C原子之酮、具有4至10個C原子之烷醇、具有3至8個C原子之烷二醇及多羥基烷酸酯。
對於熟習此項技術者而言,應瞭解藉由根據本發明之發酵來製備之化合物各以藉由所用之微生物所生產之對映異構體的形式來獲得(若存在不同對映異構體)。因此,通常自胺基酸獲得相應的L-對映異構體。
根據本發明之方法較佳用於生產非揮發性微生物代謝物。為了本發明之目的,非揮發性代謝物應理解為意指在不經歷分解之情況下通常無法藉由蒸餾自發酵液移除的化合物。通常,此等化合物在大氣壓力下具有在水沸點以上、常常在150℃以上且詳言之在200℃以上的沸點。通常,此等為在正常條件下(298 K,101.3 kPa)呈固態的化合物。
然而,亦可實施根據本發明之方法用於製備展示低於水沸點之熔點及/或油稠度之非揮發性微生物代謝物。在此狀況下,通常控制處理期間、詳言之乾燥期間之最高溫度。此等化合物亦可藉由以類固體形式(假固體形式)將其於吸附材料上調配來有利地生產。在此狀況下,於耗盡或分離根據步驟c)之有價值產物之前分離發酵液之固體組份。
用於上文所提及之目的之合適吸附材料為例如活性碳;氧化鋁;矽膠;矽酸;黏土;碳黑;沸石;無機鹼及鹼土金屬鹽,諸如鈉、鉀、鎂及鈣之氫氧化物、碳酸鹽、矽酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽,詳言之鎂及鈣鹽,例如Mg(OH)2
、MgCO3
、MgSiO4
、CaSO4
、CaCO3
;鹼土金屬氧化物,例如MgO及CaO;其它無機磷酸鹽及硫酸鹽,例如ZnSO4
;有機酸之鹽,詳言之其之鹼及鹼土金屬鹽且尤其是其鈉及鉀鹽,例如鈉及鉀之乙酸鹽、甲酸鹽、甲酸氫鹽及檸檬酸鹽;以及高碳分子有機載劑,諸如碳水化合物,例如糖、適當時經改質之澱粉、纖維素、木質素;以及通常下文關於產物調配物所引用之載劑材料。上文所提及之載劑材料通常不展示比例或僅展示低比例,詳言之僅展示痕量鹵素,諸如氯離子及硝酸鹽。
展示低於水沸點之熔點及/或油稠度且可以藉由根據本發明之方法之方式來有利地生產的非揮發性微生物代謝物的實例除了丙酸、乳酸、丙二醇、丁二醇及丙酮之外為γ-次亞麻油酸、二高-γ-次亞麻油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸及二十二碳六烯酸。假固體調配物中之此等化合物亦理解為根據本發明之固體形式的非揮發性微生物代謝物。
如下文所詳細規定,發酵中所用之微生物以本身已知之方式視所討論之精細化學品而定。其可為天然來源或經基因改質。合適微生物及發酵方法之實例於下文表A中給出:
根據本發明之方法之較佳實施例係關於生產酶,諸如肌醇六磷酸酶、木聚糖酶、葡聚糖酶;胺基酸,諸如離胺酸、甲硫胺酸及酥胺酸;維生素,諸如泛酸及核黃素;其前驅體及衍生物;及係關於生產上文所提及之單-、二-及三羧酸,尤其是具有3至10個C原子之脂族單-及二羧酸,諸如丙酸及琥珀酸;具有3至10個C原子之脂族羥基羧酸,諸如乳酸;上文酸提及之較長鏈烷醇,尤其是具有4至10個C原子之烷醇,諸如丁醇;上文所提及之二醇,尤其是具有3至8個C原子之烷二醇,諸如丙二醇;上文所提及之酮,尤其是具有3至10個C原子之酮,諸如丙酮;上文所提及之碳水化合物,尤其是雙醣,諸如海藻糖;及多羥基烷酸酯。
在一較佳實施例中,發酵中所用之微生物因此係選自過度生產下列代謝物之至少一種的天然或重組微生物:酶,諸如肌醇六磷酸酶、木聚糖酶、葡聚糖酶;胺基酸,諸如離胺酸、甲硫胺酸及酥胺酸;維生素,諸如泛酸及核黃素;其前驅體及/或衍生物;雙醣,諸如海藻糖;具有3至10個C原子之脂族單-及二羧酸,諸如丙酸及琥珀酸;具有3至10個C原子之脂族羥基羧酸,諸如乳酸;具有3至10個C原子之酮,諸如丙酮;具有4至10個C原子之烷醇,諸如丁醇;具有3至8個C原子之烷二醇,諸如丙二醇;及多羥基烷酸酯。
詳言之,該等微生物係選自以下屬:棒狀桿菌(Corynebacterium)、芽孢桿菌(Bacillus)、囊菌(Ashbya)、埃希氏菌(Escherichia)、麴菌(Aspergillus)、產鹼菌(Alcaligenes)、放線桿菌(Actinobacillus)、厭氧螺菌(Anaerobiospirillum)、乳酸桿菌(Lactobacillus)、丙酸菌(Propionibacterium)及梭菌(Clostridium),詳言之選自以下菌株:麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、棉病囊菌(Ashbya gossypii)、大腸埃希氏菌(Escherichia coli)、黑麴菌(Aspergillus niger)或協腹產鹼桿菌(Alcaligenes latus)、產琥珀酸厭氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniproducens)、產琥珀酸放線桿菌(Actinobacillus succinogenes)、德氏乳酸桿菌(Lactobacillus delbrckii)、賴氏乳酸桿菌(Lactobacillus leichmannii)、阿拉伯糖丙酸菌(Propionibacterium arabinosum)、謝氏丙酸菌(Propionibacterium schermanii)、費氏丙酸菌(Propionibacterium freudenreichii)、丙酸梭菌(Clostridium propionicum)及丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutlicum)。
在一具體較佳實施例中,在發酵中藉由微生物所生產之代謝物為離胺酸。為進行發酵,可採用與例如Pfefferle等人(同上)及US 3,708,395中用於其它碳原料之條件及程序類似的條件及程序。原則上,連續及不連續(分批或分批進料)模式之操作均合適,以分批進料模式為較佳。
在另一尤佳實施例中,在發酵中藉由微生物所生產之代謝物為甲硫胺酸。為進行發酵,可採用與例如WO 03/087386及WO 03/100072中描述用於其它碳原料之條件及程序類似的條件及程序。
在另一尤佳實施例中,在發酵中藉由微生物所生產之代謝物為泛酸。為進行發酵,可採用與例如WO 01/021772中描述用於其它碳原料之條件及程序類似的條件及程序。
在另一尤佳實施例中,在發酵中藉由微生物所生產之代謝物採用多羥基烷酸酯之形式,諸如聚-3-羥基丁酸酯及與諸如3-羥基戊酸、4-羥基丁酸及Steinbchel(同上)中所述之其它酸之其它有機羥基羧酸(包括例如較長鏈羥基羧酸,諸如3-羥基辛酸、3-羥基癸酸及3-羥基十四酸)的共聚酯及此等之混合物。為進行發酵,可採用與例如S.Y.Lee,Plastic Bacteria?Progress and prospects for polyhydroxyalkanoate production in bacteria,Tibtech,第14卷,(1996),第431-438頁中描述用於其它碳原料之條件及程序類似的條件及程序。
在另一尤佳實施例中,在發酵中藉由微生物所生產之代謝物為核黃素。為進行發酵,可採用與例如WO 01/011052、DE 19840709、WO 98/29539、EP 1186664及Fujioka,K:New biotechnology for riboflavin(vitamin B2)and character of this riboflavin.Fragrance Journal(2003),31(3),44-48中描述用於其它碳原料之條件及程序類似的條件及程序。
在另一尤佳實施例中,在發酵中藉由微生物所生產之代謝物為肌醇六磷酸酶。為進行發酵,可採用與例如WO 98/55599中描述用於其它碳原料之條件及程序類似的條件及程序。
若適當,則如上文所述在進一步加工發酵液之前(意即步驟c之前)進行一消毒步驟。
根據步驟c)自發酵液分離或耗盡代謝物通常以使得至少一種代謝物自發酵液分離或耗盡以獲得剩餘發酵液中之此代謝物的含量在各情況下以剩餘發酵液總量計為總計至多20重量%、詳言之至多10重量%、尤其至多5重量%且最佳至多2.5重量%的方式來進行。
根據步驟c)自發酵液分離或耗盡精細化學品可以一或多個步驟來執行。此內容中之一基本步驟為自發酵液移除固體組份。此可在分離有價值之產物之前或之後進行。此項技術中所習知使用之亦包含用於粗清洗及精細純化有價值之產物及調配之步驟的方法已知用於分離有價值之產物及移除固體,意即固-液相分離(例如描述於Belter,P.A,Bioseparations:Downstream Processing for Biotechnology,John Wiley & Sons(1988)and Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry,CD-ROM上之第5版,Wiley-VCH中)。
為了分離有價值之產物,接著可有利地進行一程序,其中首先(例如)借助離心或過濾自發酵液移除固體組份,及隨後(例如)藉由結晶、沉澱、吸附或蒸餾自液相分離有價值之產物。作為一替代例,亦可例如藉由使用層析方法或萃取方法自發酵液直接分離有價值之產物。必須提及之層析方法詳言之為離子交換層析法,其中有價值之產物可於層析管柱上進行選擇性分離。在此狀況下,自剩餘發酵液移除固體係例如藉由傾析、蒸發及/或乾燥來有利地進行。
習知過濾方法之實例為濾餅過濾及深層過濾(例如描述於A.Rushton、A.S.Ward、R.G.Holdich:Solid-Liquid Filtration and Separation Technology,VCH Verlagsgesellschaft,Weinheim 1996,第177 ff.頁,K.J.Ives中、A.Rushton(編輯):Mathematical Models and Design Methods in Solid-Liquid Separation,NATO ASI系列E第88號,Martinus Nijhoff,Dordrecht 1985,第90 ff.頁中)及錯流過濾,詳言之用於移除>0.1μm之固體的微過濾(例如描述於J.Altmann,S.Ripperger,J.Membrane Sci.124(1997)119-128中)。
慣用離心方法描述於例如G.Hultsch、H.Wilkesmann,"Filtering Centrifuges,"in D.B.Purchas,Solid-Liquid Separation,Upland Press,Croydon 1977,第493-559頁中;及H.Trawinski,Diequivalente Klrflche von Zentrifugen[The equivalent clarifying area of centrifuges],Chem.Ztg.83(1959)606-612中。可採用各種設計,諸如管式離心機、籃式離心機及尤其是推渣離心機、滑動過濾離心機及碟式分離機。
習知提取方法包含逐批或逐步方法及以平行流或逆流之示差連續方法。在此內容中,該方法可涉及兩種或一種流動相。其中兩種相之有價值之產物及待移除之二級組份的溶解度可受溶劑選擇、平衡離子變化及改變pH值所影響(Treybal,R.E.,Mass Transfer Operations,第3版,New York,McGraw-Hill,1979;Kula,M.、Kroner,K.H.、Hustedt,H.及Schutee,H.,Technical aspects of extractive enzyme purification,Ann.N.Y.Acad.Sci.,341(1981);Robinson,R.G.及Cha,D.Y.,Controlled pH extraction in the separation of weak acids and bases,Biotech.Progress,1(1),18(1985))。
慣用吸附方法描述於例如D.M.Ruthven:Principles of Adsorption and Adsorption Processes,J.Wiley & Sons,New York 1984.;G.Wedler:Adsorption,Verlag Chemie,Weinheim 1970中。亦可採用固體床、移動床及流化床吸附器。該吸附可逐批進行或連續進行(K.Hauffe、S.R.Morrison:De Gruyter Studienbuch"Adsorption,"De Gruyter,Berlin 1974.;W.Kast:Adsorptionstechnik[Adsorption techniques],VCH Verlagsgesellschaft,Weinheim 1988)。除了許多吸附劑之外,亦可採用活性碳、離子交換樹脂、天然或合成沸石及活性氧化鋁。此外,亦可採用親和吸附方法(例如描述於Arnold,F.H.、Blanch,H.W.及Wilke,C.R.,Analysis of Affinity separations.Chem.Engr.J.,30,B9(1985)中)。
可詳言之用於純化精細化學品之方法為例如層析法、沉澱法、超濾法、微過濾法、奈米過濾法、逆滲透法、電泳法、電滲析法及等電子聚焦法。
層析方法可逐批進行或連續進行。連續層析法包括例如連續旋轉環形層析法(CRAC)(例如描述於A.J.P.Martin,Discuss.Farraday Soc.7(1949)中)、真實移動床層析法(TMBC)(例如描述於K.Takeuchi,T.Miyauchi,Y.Uraguchi,J.Chem.Eng.Japan 11(1978)216-220中)及模擬移動床層析法(SMB)(例如描述於D.B.Broughton,Universal Oil Products Co.,US 2,985,589,1961中)。所採用之固體相為例如活性氧化鋁、矽膠、經乙二醇浸漬之矽藻土、右旋糖酐、磺化苯乙烯的聚合物、聚丙烯醯胺及聚合體束縛蛋白質(Arnold,F.H.、Blanch,H.W.及Wilke,C.R.,Analysis of Affinity separations.Chem.Engr.J.,30,B9(1985);Gibbs,S.J.及Lightfoot,E.N.,Scaling up gradient elution chromatography,IEC Fund.,25,490(1986);King,C.J.,Separation Processes,第2版,New York,McGraw-Hill(1979);Yau,W.W.、Kirlland,J.J.及Bly,D.D.,Modern Size-Exclusion Liquid Chromatography,Wiley,New York (1979))。
沉澱可涉及沉澱有價值之產物或二級組份(J.W.Mullin:Crystallization,第3版,Butterworth-Heinemann,Oxford 1993)。沉澱可例如藉由添加另一溶劑、添加鹽及改變溫度來起始。所得沉澱物可藉由上文所述之用於分離固體的習知方法自液體分離。
可用於微過濾、超濾、奈米過濾及逆滲透之材料的實例為微孔薄膜(A.S.Michaels:"Ultrafiltration,"E.S.Perry(編輯):Progress in Separation and Purification,第1卷,Interscience Publ.,New York 1968)、均質薄膜(J.Crank、G.S.Park(編輯):Diffusion in Polymers,Academic Press,New York 1968;S.A.Stern:"The Separation of Gases by Selective Permeation,"P.Meares(編輯):Membrane Separation Processes,Elsevier,Amsterdam 1976)、不對稱薄膜(R.E.Kesting:Synthetic Polymeric Membranes,A Structural Perspective,Wiley-lnterscience,New York 1985)及帶電薄膜(F.Helfferich:Ion-Exchange,McGraw-Hill,London 1962),所有該等薄膜係藉由不同方法來生產(R.Zsigmondy,US 1 421 341,1922;D.B.Pall,US 4 340 479,1982;S.Loeb,S.Sourirajan,US 3 133 132,1964)。典型材料為纖維素酯、耐綸、聚氯乙烯、丙烯腈、聚丙烯、聚碳酸脂及陶瓷。此等薄膜用作平板模組(R.F.Madsen,Hyperfiltration and Ultrafiltration in Plate-and-Frame Systems,Elsevier,Amsterdam 1977)、螺旋模組(US 3 417 870,1968(D.T.Bray))、管束模組或中空纖維模組(H.Strathmann:"Synthetic Membranes and their Preparation,"M.C.Porter(編輯):Handbook of Industrial Membrane Technology,Noyes Publication,Park Ridge,NJ 1990,第1-60頁)。此外,可使用液體薄膜(N.N.Li:"Permeation Through Liquid Surfactant Membranes,"AIChE J.17(1971)459;S.G.Kimura,S.L.Matson,W.J.Ward III:"Industrial Applications of Facilitated Transport,"N.N.Li(編輯):Recent Developments in Separation Science,第V卷,CRC Press,Boca Raton,Florida,1979,第11-25頁)。所要之有價值產物不僅可於進料側富集及經由滯留流移除,且亦可於進料側耗盡及經由濾液/滲透流移除。
電泳方法描述於例如Rudge,S.R.、Ladisch,M.R.,Process considerations for scale-up of liquid chromatography and electrophoresis,in Separation Recovery and Purification in Biotechnology,J.Asenjo及J.Hong編輯,ACS Symposium Series,314,122(1986)中。使用大量變體,諸如(例如)於經造粒之凝膠層中等電聚焦、具有再循環之連續等電聚集、"Rotofor"cell、再循環及多區塊電解等電薄膜之自由流聚焦。其中所採用之基質材料為醋酸纖維素、瓊脂糖凝膠及聚丙烯醯胺凝膠。
慣用結晶方法描述於例如Janeic,S.J.、Grootscholten,PA.,Industrial Crystallization,New York,Academic,1984;A.W.Bamforth:Industrial Crystallization,Leonard Hill,London 1965;G.Matz:Kristallisation,第2版,Springer Verlag,Berlin 1969;J.Nvlt:Industrial Crystallization-State of the Art.VCH Verlagsges.,Weinheim 1982;S.J.Janci,P.A.M.Grootscholten:Industrial Crystallization,Reidel,Dordecht 1984;O.Shnel,J.Garside:Precipitation,Butterworth-Heinemann,Oxford,1992;A.S.Myerson(編輯):Handbook of Industrial Crystallization,Butterworth-Heineman,Boston 1993;J.W.Mullin:Crystallization,第3版,Butterworth-Heinemann,Oxford 1993;A.Mersmann(編輯):Crystallization Technology Handbook,Marcel Dekker,New York 1995中。結晶可例如藉由冷卻、蒸發、真空結晶(絕熱冷卻)、反應結晶及鹽析來達成。結晶可例如在攪拌及未攪拌槽中、以直接接觸方法於蒸發結晶器中(R.K.Multer,Chem Eng.(N.Y.)89(1982)三月,87-89)、於真空結晶器中逐批或連續進行,例如於強制循環結晶器中(Swenson強制循環結晶器)或流化床結晶器(Oslo型)(A.D.Randolph,M.A.Larson:Theory of Particulate Processes,第2版Academic Press,New York 1988;J.Robinson,J.E.Roberts,Can.J.Chem.Eng.35(1957)105-112;J.Nvlt:Design of Crystallizers,CRC Press,Boca Raton,1992)中進行。亦可分步結晶(L.Gordon、M.L.Salutsky、H.H.Willard:Precipitation from Homogeneous Solution,Wiley-Interscience,New York 1959)。同樣,可分離對映異構體及消旋體(J.Jacques、A.Collet、S.H.Willen:Enantiomers,Racemates and Resolutions,Wiley,New York 1981;R.A.Sheldon:Chirotechnology,Marcel Dekker,New York 1993;A.N.Collins、G.N.Sheldrake、J.Crosby(編輯):Chirality in Industry,Wiley,New York 1985)。
習知乾燥方法描述於例如O.Krischer、W.Kast:Die wissenschaftlichen Grundlagen der Trocknungstechnik[The scientific bases of drying technology],第3版,Springer,Berlin-Heidelberg-New York 1978;R.B.Keey:Drying:Principles and Practice,Pergamon Press,Oxford 1972;K.Krll:Trockner und Trocknungsverfahren[Dryers and drying methods],第2版,Springer,Berlin-Heidelberg-New York 1978;Williams-Gardener,A.:Industrial Drying,Houston,Gulf,1977;K.Krll,W.Kast:Trocknen und Trockner in der Produktion[Drying and dryers in production],Springer,Berlin-Heidelberg-New York 1989中。乾燥方法之實例為用於在例如乾燥烘箱、隧道式乾燥器、帶式乾燥器、碟式乾燥器、噴射乾燥器、流化床乾燥器、通風或旋轉鼓乾燥器、噴霧乾燥器、流動式乾燥器、旋風乾燥器、混合乾燥器、糊狀物研磨乾燥器、研磨乾燥器、環式乾燥器、塔式乾燥器、撓管式乾燥器、圓盤傳送帶乾燥器中對流乾燥的方法。其它方法利用接觸式乾燥,例如葉片式乾燥器;真空或凍結乾燥器,例如錐形乾燥器、真空乾燥器、碟式乾燥器、薄膜接觸式乾燥器、圓筒式乾燥器、黏相乾燥器、平板式乾燥器、螺旋式乾燥器、雙錐形乾燥器;或用於乾燥之熱輻射(紅外線,例如紅外線撓管乾燥器)或介電能(微波)。用於熱乾燥方法之乾燥裝置大多由油、氣體或電來加熱且可視構造類型而定部分在真空下操作。
除了乾燥方法之外,亦可應用調配方法,該等調配方法連同蛋白質組合物之生產描述於下文。該等方法亦涉及如下文所述添加調配助劑。
在一較佳實施例中,自c)之發酵液之分離精細化學品係借助離子交換層析法來進行。此處,通用條件及程序對於熟習工人而言係已知的且其描述於例如Rmpp Lexikon der Chemie[Dictionary of Chemistry],第10版,1997,Georg Thieme Verlag,Stuttgart;Weis,Handbuch der lonenchromatographie [Ion Chromatography Manual],1991,VCH Verlagsgesellschaft,Weinheim。通常,接著進行一程序,其中藉由微生物所生產之化合物選擇性地束縛於離子交換器上且該離子交換器在溶離藉由微生物所生產之化合物之前(例如)經水洗滌。
在將裝載固體之發酵液施用至離子交換層析管柱之前,若適當,該等固體可借助熟習工人所熟悉之習知方法(例如過濾及離心)來移除。
在一尤佳實施例中,在將裝載固體之發酵液施用至離子交換層析管柱之前不移除固體。在此狀況下,裝載固體之發酵液流入離子交換器中有利地抵抗了重力以使得所存在之固體不導致離子交換管柱阻塞(意即堵塞)。
若經由微生物生產之代謝物為鹼性胺基酸,則後者可藉由採用酸性陽離子交換管柱之離子交換層析自發酵液有利地移除。在此狀況下,例如離胺酸之鹼性胺基酸選擇性地束縛於該離子交換管柱上。溶離之前可藉由洗滌(尤其詳言之以水)來純化。接著,以合適溶離劑,例如氨水,較佳以5體積%之強氨水來溶離該鹼性胺基酸。
在例如WO 01/072689及Lee等人之The use of ion exclusion chromatography as approved to the normal ion exchange chromatography to achieve a more efficient lysine recovery from fermentation broth,Enzyme and Microbial Technology 30(2002),798-303中描述了使用離子交換層析法用於移除或純化諸如離胺酸之鹼性胺基酸。
可類似於下文所述般來處理所得發酵殘餘物,意即分別對其進行處理或加工,藉以獲得含蛋白質之副產物。
若藉由微生物所生產之代謝物為甲硫胺酸,則有價值之產物係藉由離心或過濾來有利地分離。此處,可使用與例如先前申請案DE 10359668.2中描述用於其它碳原料之條件及程序類似的條件及程序。當發酵結束時,將生成之發酵液加熱以溶解所有甲硫胺酸。接著藉由離心或過濾分離出固體。來自固體分離步驟之澄清溢流較佳藉由部分或完全蒸發來濃縮,在該製程期間甲硫胺酸結晶出來。此後,乾燥甲硫胺酸,若適當則接著進一步進行一前述過濾步驟。
藉由離心或過濾分離之固體基本上包含發酵期間所生產之生物質量及醣化澱粉溶液之未代謝組份,例如纖維。可類似於下文所述般來處理此剩餘發酵殘餘物,產生含蛋白質之副產物。
若藉由微生物所生產之代謝物為泛酸,則有價值之產物之分離同樣係藉由過濾或離心來有利地進行。在此內容中,可採用與例如EP 1050219及WO 01/83799中描述用於其它碳原料之條件及程序類似的條件及程序。否則,可類似於上文在甲硫胺酸之狀況下所述來進行處理。在泛酸之狀況下,在固體分離出之前較佳額外地進行所有發酵液之巴氏滅菌(pasteurization)。較佳將自固體分離步驟所獲得之澄清溢流部分蒸發,若適當以氯化鈣進行處理且將其乾燥(較佳噴霧乾燥)。
為了獲得泛酸,亦可在步驟c)後藉由傾析、離心、過濾技術或薄膜技術(微過濾、超濾、奈米過濾)及/或此等技術之組合來分離未溶解或呈固體狀之細胞及非澱粉組份。具有低固體含量或無固體之流含有泛酸。該流可例如進一步濃縮及/或分別傳送至乾燥步驟或調配步驟。可類似於下文所述般來處理含固體之流,藉以獲得含蛋白質之副產物。
若適當,則分別進行細胞之溶解或破壞。該溶解或破壞可直接在發酵之後實現。為此,使全部發酵液分別經受溶解或破壞之步驟。溶解及/或破壞可藉由熱、機械或化學方法來進行。細胞之溶解亦可在固體分離之後進行。在此狀況下,僅具有高固體含量之流傳送至上文所提及之溶解步驟。
根據一較佳實施例,實現泛酸之處理以使得在發酵後進行細胞之熱破壞及藉由傾析、離心、過濾技術或薄膜技術及/或此等技術之組合來分離細胞及非澱粉固體組份。具有低固體含量或無固體之流含有泛酸。該流可例如進一步濃縮。在濃縮步驟之前、期間或之後,將諸如下文所提及之彼等的助劑有利地添加至具有低固體含量之液體中。藉此可減少泡沫及/或薄膜之潛在形成。接著將經濃縮之流分別直接傳送至乾燥步驟或調配步驟。在此狀況下,亦可在濃縮步驟之前、期間或之後添加下文所提及之助劑。藉此可減小產物之吸濕性。產物之流動行為可改良及/或儲存穩定性可增大。在此狀況下,較佳類似於下文描述來處理含固體之流,藉以獲得含蛋白質之副產物。
根據另一較佳實施例,泛酸之處理提供在已經發酵期間添加具有特定陽離子之助劑的可能性。例如WO 02/072857中描述了該種程序。
WO 05/028659中描述了借助離心、傾析、超濾及/或透濾處理泛酸之又一較佳實施例。
亦可借助電透析或離子交換自發酵液分離泛酸。然而,此等方法並非較佳,因為其可涉及一些問題。
通常可以類似於下文所述之方式的方式來處理(treat or work up)泛酸分離或耗盡之後所剩餘的發酵殘餘物,意即尤其是經分離之固體,藉以獲得含蛋白質之副產物。
若藉由微生物所生產之代謝物採用多羥基烷酸酯形式,則有價值之產物之分離係藉由以諸如(例如)US 4310684或EP 355307中所述之溶劑萃取來有利地進行。剩餘固體可以慣用方式來移除,例如藉由過濾或離心。否則,可類似於上文在甲硫胺酸之狀況下所述般來進行處理。在多羥基烷酸酯之狀況下,在固體分離出之前較佳額外地進行所有發酵液之巴氏滅菌。較佳將自固體分離步驟所獲得之澄清溢流部分蒸發,若適當以氟化鈣進行處理且將其乾燥(較佳噴霧乾燥)。多羥基烷酸酯之進一步純化係以諸如例如US 4310684或EP 355307中所描述之已知方式來進行。
可以類似於下文所述之方式的方式來處理剩餘發酵殘餘物,意即尤其是經分離之固體,藉以獲得含蛋白質之副產物。
在移除有價值之產物(例如諸如離胺酸之鹼性胺基酸)後所剩餘的發酵液基本上包含發酵期間所生產之生物質量、經醣化之澱粉溶液的未代謝組份,諸如例如纖維及未利用之糖及未利用之緩衝液及營養鹽。此等固體可類似於得自生物乙醇(其在該內容中稱為"具有可溶物之蒸餾乾燥穀物(DDGS)"且同樣有銷售)之生產之二級組份自剩餘發酵液獲得。就此而言,可進行發酵液自固體之基本完全或僅部分分離。因此所獲得之含蛋白質副產物(在下文中亦稱為蛋白質組合物)可在進一步處理(treatment or working up)之步驟之前以及之後用作動物(較佳農業生產性家畜、尤佳牛、豬及家禽,尤其最佳牛)進料之進料原料或進料添加劑。
根據熟練者所已知之程序,尤其是借助改質乾燥物質含量(例如藉由乾燥或蒸發)、研磨及調配(例如添加添加劑、形成諸如製粒及擠壓之程序)可進行發酵液之處理(意即處理及加工)以使得獲得蛋白質組合物。此外,二級組份之處理及加工亦包含與其它進料原料或進料添加劑混合以(例如)使營養物含量標準化。
通常,該蛋白質組合物係藉由在耗盡或分離至少一種根據步驟c)之代謝物後至少部分移除發酵液之揮發性組份來生產。藉此獲得固體或半固體蛋白質組合物。剩餘發酵液中之經耗盡或分離之代謝物的含量通常在各狀況下總計以剩餘發酵液總量計之不多於20重量%、詳言之不多於15重量%、更特定言之不多於10重量%且最特定言之不多於5重量%。
為了在移除有價值之產物之後獲得蛋白質組合物,通常於正常為多階段蒸發步驟之蒸發步驟中部分蒸發全部剩餘液體且隨後(例如)借助傾析器移除所獲得之固體,或直接自全部發酵液進行固體之移除。為了移除固體,例如於多階段裝置中可採用離心、過濾、微過濾、超濾、奈米過濾、逆滲透或此等技術之組合。因此移除之固體通常具有在10至80重量%、較佳15至60重量%且尤佳20至50重量%之範圍內的乾燥物質含量。藉由處理之進一步步驟所獲得之所得蛋白質組合物有利地具有約90重量%之乾燥物質含量以使得儲存期間中之損壞危險減小。
蛋白質組合物亦可藉由將步驟c)後所剩餘之發酵液的固體組份濃縮來獲得,該濃縮可藉由熱程序(例如蒸發)、機械程序(例如藉由使用過濾器、傾析器、離心機)且熟練者通常所涵蓋之上文提及之個別程序的組合來達成。自液體濃縮獲得固體或半固體(例如糊狀)殘餘物,其中該殘餘仍包含少量根據本發明之方法所生產之代謝物,該代謝物通常在以殘餘物總重量計之0至10重量%之範圍內且詳言之在0至5重量%之範圍內;且其中該殘餘物包含澱粉原料之非揮發性非澱粉組份,其通常為固體或包含其之至少大量,常常包含澱粉原料之固體非澱粉的至少90重量%或全部量;且其中該殘餘物包含來自發酵之生物質量。該固體或半固體殘餘物可類似於步驟c)後所剩餘之未濃縮之發酵液直接傳送至乾燥或調配步驟。
可使獲得二級組份時已移除之液相的一些作為過程水返回。液相之此返回部分可有利地(例如)以其全部或部分用於生產步驟a)之含糖液體或可用於製造供發酵步驟使用之緩衝液或營養鹽溶液。當於步驟a)中混合經返回之過程水時,其必須考慮由於某些礦物質及例如鈉及乳酸鹽離子之離子的過高存在,過高比例可對發酵具有不利影響。因此較佳根據本發明將製造用於澱粉液化之懸浮液時之經返回之加工用水的量限制至各情況下以製造懸浮液所用之水總量計為75重量%之最大量、較佳60重量%之最大量且尤佳50重量%之最大量。有利地,當於步驟a2)之較佳實施例中時製造懸浮液時的加工用水的量在各情況下以用於製造懸浮液之水總量計的5至60重量%且較佳10至50重量%的範圍內。
將不返回於製程中之液相部分在多步驟蒸發製程中濃縮以產生一糖漿。所得糖漿通常具有在20至90重量%、較佳30至80重量%且尤佳40至70重量%之範圍內的乾燥物質含量。將此糖漿與傾析步驟期間及隨後乾燥中所移除之固體混合。乾燥可例如借助轉筒式乾燥器、噴霧乾燥器或槳式乾燥器來實現;較佳採用轉筒式乾燥器。以使得所得固體具有不多於30重量%、較佳不多於20重量%且尤佳不多於10重量%之殘餘水分含量的方式來進行乾燥。
連同發酵之固體組份一起存在之經乾燥之二級組份的特性(意即蛋白質組合物之特性)可以一藉由添加諸如載劑或塗佈材料、黏合劑及其它添加劑之調配助劑的所要方式來改質,可以已知方式影響之各種特性參數為穀物尺寸、粒子形狀、灰塵形成之趨向、吸濕性、穩定性(尤其是儲存穩定性)、顏色、氣味、流動行為、聚結之趨向、帶靜電、對光及溫度之敏感性、機械穩定性及再分散性。
通常採用之調配助劑包含例如黏合劑、塗佈材料、粉末/防黏劑,此外包含彩色顏料、殺生物劑、分散劑、消泡劑、黏度調節劑、酸、鹼、抗氧化劑、酶穩定劑、酶抑制劑、吸附物、脂肪、脂肪酸、油或其混合物。該等調配助劑尤其在採用調配及諸如噴霧乾燥、流化床乾燥及藉由凍乾法乾燥之乾燥程序時有利地用作乾燥助劑。
黏合劑之實例為碳水化合物,詳言之諸如單-、二-、寡-及多醣之糖,例如糊精、海藻糖、葡萄糖、葡萄糖糖漿、麥芽糖、蔗糖、果糖及乳糖;諸如動物蛋白質之膠狀物質,例如明膠、酪蛋白,詳言之酪蛋白酸鈉、植物蛋白質,例如大豆蛋白質、豌豆蛋白質、豆蛋白質、羽扁豆、玉米蛋白、小麥蛋白質、玉米蛋白質及水稻蛋白質;合成聚合物,例如聚乙二醇、聚乙烯醇及詳言之BASF公司之Kollidon商標,若適當,則為經改質之生物聚合物,例如木質素、幾丁質(chitin)、幾丁聚糖、聚丙交酯及經改質之澱粉,例如辛烯基琥珀酸酐(OSA);膠,例如阿拉伯膠;纖維素衍生物,例如甲基纖維素、乙基纖維素、(羥基乙基)甲基纖維素(HEMC)、(羥基丙基)甲基纖維素(HPMC)、羧基甲基纖維素(CMC);麵粉,例如玉米麵粉、小麥麵粉、黑麥麵粉、大麥麵粉及水稻麵粉。
載劑材料之實例為碳水化合物,詳言之上文作為黏合劑列出之糖,及例如來自玉米、水稻、馬鈴薯、小麥及木薯之澱粉;經改質之澱粉,例如辛烯基琥珀酸酐;纖維素及微晶纖維素;無機礦物質或黏土,例如黏土、煤、矽藻土、矽酸、滑石及高嶺土;粗麵粉(semolina),例如小麥粗麵粉、例如小麥麩皮之麩皮、上文作為黏合劑提及之麵粉;鹽,諸如金屬鹽,詳言之有機酸之鹼金屬鹽及鹼土金屬鹽,例如檸檬酸、乙酸、甲酸之Mg、Ca、Zn、Na、K鹽及其甲酸氫鹽,無機鹽,例如硫酸、碳酸、矽酸或磷酸之Mg、Ca、Zn、Na、K鹽;鹼土金屬氧化物,諸如CaO及MgO;無機緩衝劑,諸如鹼金屬磷酸氫鹽,詳言之磷酸氫鈉及磷酸氫鉀,例如K2
HPO4
、KH2
PO4
及Na2
HPO4
;及通常與根據本發明生產分別具有低熔點或油稠度之代謝物相關來提及之吸附劑。
粉末/防黏劑之實例為矽藻土、矽酸,例如Degussa公司之Sipernat商標;黏土、煤、滑石及高嶺土;上文作為載劑材料提及之澱粉、經改質之澱粉、無機鹽、有機酸之鹽及緩衝劑;纖維素及微晶纖維素。
關於其它添加劑,可提及下列實例:彩色顏料,諸如TiO2
;殺生物劑;分散劑;消泡劑;黏度調節劑;無機酸,諸如磷酸及含磷之酸、硝酸、鹽酸、硫酸;有機酸,諸如飽和及不飽和單-及二羧酸,例如甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、棕櫚酸、硬脂酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、順丁烯二酸及反丁烯二酸;鹼,諸如鹼金屬氫氧化物,例如NaOH及KOH;抗氧化劑;酶穩定劑;酶抑制劑;吸附物;脂肪;脂肪酸及油。
上文提及之助劑及若適當諸如塗佈材料之其它助劑的量可視個別代謝物之特定需求及所用助劑之特性而較大程度地變化,且其可在各狀況下分別以經完全調配之產物或產物混合物之總重量計的0.1至80重量%的範圍內、詳言之在5至70重量%的範圍內且詳言之在10至60重量%的範圍內。
調配助劑之添加可在發酵液加工(亦稱為產物調配或固體設計)之前、期間或之後進行且詳言之在乾燥步驟期間進行。在將步驟c)之後所剩餘之發酵液濃縮之前添加調配助劑對為了分別改良待處理之物質或產物的加工性係尤其有利的。調配助劑可添加至以固體形式獲得之二級組份及含有該二級組份之溶液或懸浮液,例如直接添加至步驟c)之後之發酵液或添加至最終乾燥步驟之前之處理期間所獲得之溶液或懸浮液。
因此,可將助劑例如混合於藉由將步驟c)之後所得之發酵液濃縮來獲得之懸浮液中;該懸浮液亦可例如藉由精細混合來應用至載劑材料。尤其在乾燥之後,例如當保護層或塗層/塗料層應用至乾燥粒子時添加調配助劑。乾燥之後及一可能之塗佈步驟之後,可將其它添加劑添加至產物。藉由調配製程所獲得之粒子可藉由上文所述之乾燥製程來乾燥,直至達成所要程度之殘餘濕度。
以例如粒子、顆粒及擠出物之固體形式獲得之所有二級組份可分別塗佈一保護層或塗層,意即其塗佈至少一個其它材料層。該塗佈步驟例如在混合器或流化床裝置中進行,其中待塗佈之粒子分別旋轉或流化且接著將保護層材料或塗層材料噴塗於其上。該塗層材料可以例如粉末之乾燥形式或於例如水之溶劑、有機溶劑及其混合物(詳言之於水中)中之溶液、分散液、乳液或懸浮液的形式存在。若存在溶劑,則在將其噴塗於粒子期間或之後經由蒸發來將其移除。此外,諸如脂肪之塗層材料亦可以熔融物之形式應用。
可以含水分散液或懸浮液形式噴塗之塗佈材料描述於例如WO 03/059087中。該等塗佈材料尤其包含聚烯烴,諸如聚乙烯、聚丙烯、聚乙烯蠟、蠟、無機及有機鹽、丙烯酸酯類(Acronal),例如丙烯酸丁酯-丙烯酸甲酯共聚物、BASF公司之Styrofan商標,例如以苯乙烯及丁二烯為基礎,及疏水性物質,諸如WO 03/059086中所述之彼等。若應用該等材料,則該等塗佈材料之固體物質含量通常在各狀況下以經調配之最終產物總重量計之0.1重量%變化至20重量%、詳言之自0.2重量%變化至10重量%且詳言之自0.4重量%變化至5重量%。
可以溶液形式噴塗之塗佈材料例如為聚乙二醇、諸如甲基纖維素、羥基丙基甲基纖維素及乙基纖維素之纖維素衍生物、聚乙烯醇、諸如明膠之蛋白質、無機及有機鹽、碳水化合物,諸如糖,例如葡萄糖、乳糖、果糖、蔗糖及海藻糖;澱粉及經改質之澱粉。若應用該等材料,則該等塗佈材料之固體物質含量通常在各狀況下以經調配之最終產物總重量計之0.1重量%變化至20重量%、詳言之自0.2重量%變化至10重量%且詳言之自0.4重量%變化至5重量%。
可以熔融物形式噴塗之塗佈材料描述於例如DE 199 29 257及WO 92/12645中。該等塗佈材料尤其包含聚乙二醇、合成脂肪及蠟,例如BASF公司之Polygen WE;天然脂肪,諸如例如蜂蠟之動物脂肪及例如蠟大戟蠟之植物脂肪;脂肪酸,例如動物蠟、動物脂脂肪酸、棕櫚酸、硬脂酸、甘油三酯、edenor產物、vegeole產物、褐煤酯蠟,例如BASF公司之Luwax E。若應用該等材料,則該等塗佈材料之固體物質含量通常在各狀況下以經調配之最終產物總重量計之1重量%變化至25重量%,詳言之自2重量%變化至25重量%且詳言之自3重量%變化至20重量%。
在乾燥及/或調配整穀物或經研磨之穀物之後,較佳可將玉米、小麥、大麥、高粱及/或黑麥分別添加至二級組份或蛋白質組合物。
因此,本發明之另一目標係來自糖基微生物發酵之蛋白質組合物,該發酵根據本發明進行以生產具有至少3個碳原子或具有2個碳原子及至少1個氮原子之代謝物,該蛋白質組合物可如上文所述來獲得。此蛋白質組合物通常含有蛋白質材料,意即來自發酵之生物質量、澱粉原料之非澱粉組份,詳言之纖維及發酵產物(代謝物)。特定言之,該蛋白質組合物基本上包含下列乾燥物質組份:a)來自發酵之1至90重量%、詳言之5至85重量%且詳言之10至75重量%的生物質量;b)1至90重量%、詳言之5至85重量%、詳言之10至80重量%且最特定言之15至75重量%之澱粉原料之非澱粉組份,詳言之纖維;c)0.01至10重量%、詳言之0.1至5重量%、更特定言之0.2至5重量%且最特定言之0.3至5重量%之具有至少3個碳原子或具有2個碳原子及至少1個氮原子的微生物代謝物;d)0至90重量%、詳言之5至80重量%且詳言之10至70重量%之慣用調配助劑;及e)0至40重量%、詳言之0.5至30重量%且詳言之1至20重量%之發酵液之未代謝的其它組份,詳言之殘餘糖、澱粉、營養鹽及/或緩衝鹽;其中組份a)至e)之和為100重量%之乾燥物質。本文中所用之術語"基本上"意在理解為不同於a)至e)之其它組份的重量部分通常較低,該部分在各狀況下以蛋白質組合物之總乾燥物質計將不多於10重量%且詳言之不多於5重量%;詳言之,該部分總計小於1重量%、詳言之約0重量%。
生物質量(組份a))尤其包含蛋白質組合物中之粗蛋白質部分。該部分通常為各狀況下以蛋白質組合物總乾燥物質計之至少40重量%且詳言之在40至90重量%之範圍內、更特定言之在45至85重量%之範圍內且最特定言之在50至80重量%之範圍內。
根據本發明之蛋白質組合物通常包含一或多種基本胺基酸,詳言之至少一種選自由離胺酸、甲硫胺酸、酥胺酸及色胺酸組成之群之胺基酸。該等基本胺基酸(詳言之此處所提及之基本胺基酸)各自以多於其於習知DDGS二級組份中所存在之量之至少1.5倍的量存在,其引起發酵性生物乙醇生產。若蛋白質組合物中存在個別胺基酸,則該蛋白質組合物通常具有在各狀況下以蛋白質組合物總乾燥物質計為至少1重量%、詳言之在1至5重量%之範圍內的離胺酸含量、至少0.8重量%、詳言之在0.8至5重量%之範圍內的甲硫胺酸含量、至少1.5重量%、詳言之在1.5至5重量%之範圍內的酥胺酸含量及/或至少0.4重量%、詳言之在0.4至5重量%之範圍內的色胺酸含量。
根據本發明之蛋白質組合物通常包含少量水,常常在各狀況下以蛋白質組合物總乾燥物質計之0至25重量%的範圍內、詳言之在0.5至15重量%之範圍內、更特定言之在1至10重量%之範圍內且最特定言之在1至5重量%之範圍內的水。
此外,本發明係關於一種如上文所述之方法,其中(i)自步驟a)中所獲得之包含澱粉原料之非澱粉固體組份的含糖液體培養基移除不多於50重量%的一部分,且以剩餘物進行如b)中所述之發酵以生產一第一代謝物(A);及(ii)自此部分分離澱粉原料之所有或一些非澱粉固體組份且以此部分進行如b)中所述之發酵以生產與代謝物(A)相同或不同的第二代謝物(B)。
在一較佳實施例中,(ii)之非澱粉固體組份之移除係以使得含糖液體培養基之剩餘物之固體含量總計不多於50重量%、詳言之不多於30重量%、尤佳不多於10重量%且非常尤佳不多於5重量%的方式來進行。
此程序使在(iii)之獨立發酵中可使用必須(例如)關於氧氣轉移速率滿足某些最小需求的微生物。(iii)之獨立發酵中所用之合適微生物為例如桿菌物種,較佳枯草芽孢桿菌。藉由分離發酵中該等微生物所生產之化合物詳言之係選自維生素、輔助因子及保健食品、嘌呤及嘧啶鹼、核苷及核苷酸、脂質、飽和及不飽和脂肪酸、芳族化合物、蛋白質、類胡蘿蔔素,尤其係選自維生素、輔助因子及保健食品、蛋白質及類胡蘿蔔素且非常尤佳選自核黃素及泛酸鈣。
特定言之,此程序允許有利地使用根據本發明之方法,即使是在發酵中以固體獲得所生產之精細化學品時亦如此。
此程序之一較佳實施例係關於在兩個獨立發酵中平行生產相同代謝物(A)及(B)。此尤其在同一代謝物之不同應用具有不同純度需求的狀況下有利。因此,第一代謝物(A),例如用作進料添加劑之胺基酸,例如離胺酸,係使用含固體之發酵液來生產且相同第二代謝物(B),例如用作食物添加劑之相同胺基酸,在目前狀況下為例如離胺酸,係使用(ii)之耗盡固體之發酵液來生產。歸因於非澱粉固體組份之完全或部分移除,處理應用領域具有較高純度需求(例如作為食物添加劑)之代謝物時之純化的複雜度可降低。
在此程序之另一較佳實施例中,藉由發酵中之微生物所生產之代謝物B為核黃素。為了進行發酵,可採用與例如WO 01/011052、DE 19840709、WO 98/29539、EP 1186664及Fujioka,K.:New biotechnology for riboflavin(vitamin B2)and character of this riboflavin.Fragrance Journal(2003),31(3),44-48中描述用於其它碳原料之條件及程序類似的條件及程序。
舉例而言,下列程序可用於進行該製程之此變量。根據本發明之方法步驟a)至c)實施一較佳大體積之發酵用於生產代謝物A,例如精細化學品,諸如離胺酸。根據(i),步驟a)中所獲得之一些含糖液體培養基係根據(ii)藉由例如離心或過濾之慣用方法自固體完全或部分移除及游離於固體。根據(ii)將自其獲得之基本上完全或部分游離於固體之含糖液體培養基喂至發酵中以用於生產代謝物B,例如核黃素。根據(ii)分離之固體流有利地返回至大體積發酵之含糖液體培養基之流。
因此根據(ii)產生之含核黃色之發酵液可藉由與例如DE 4037441、EP 464582、EP 438767及DE 3819745中描述用於其它碳原料之條件及程序類似的條件及程序來加工。在細胞生物質量溶解之後,分離以結晶形式存在之核黃素,較佳將其傾析。分離固體之其它方法(例如過濾)亦可。之後,較佳借助噴霧乾燥器及流化床乾燥器來乾燥核黃素。作為一替代例,根據(ii)所生產之含核黃素之發酵混合物可在與例如EP 1048668及EP 730034中所述之條件類似的條件下及使用與其中所述之程序類似的程序加工。在巴氏滅菌之後,將發酵液離心且以一無機酸處理剩餘含固體部分。藉由過濾使形成之核黃素自含水酸性培養基移除,若適當將其洗滌且隨後將其乾燥。
移除之固體可如上文所述在平行進行之大體積發酵製程之範疇內進行加工以獲得二級組份。
在此程序之另一較佳實施例中,藉由發酵中之微生物所生產之代謝物B為泛酸。為了進行發酵,可採用與例如WO 01/021772中描述用於其它碳原料之條件及程序類似的條件及程序。
為了進行此製程變體,接著可進行諸如上文描述用於核黃素之程序的程序。將已根據(ii)純化且較佳基本游離於固體之含糖液體培養基喂至根據(ii)之發酵以用於生產泛酸。此處,與含固體之液體培養基相比黏度減小之事實係尤其有利的。經分離之固體流較佳返回大體積發酵之含糖液體培養基之流。
根據(ii)生產之含泛酸之發酵液可在與例如EP 1050219及WO 01/83799中描述用於其它碳原料之條件類似的條件下及使用與其中描述用於其它碳原料之程序類似的程序來加工。在將所有發酵液巴氏滅菌之後,例如藉由離心或過濾分離剩餘固體。將固體分離步驟中所獲得之澄清溢流部分蒸發,若適當,以氯化鈣處理且將其乾燥,詳言之噴霧乾燥。
已分離出之固體可如上文所述在平行操作之大體積發酵製程之範疇內進行加工以產生二級組份。
在此程序之另一較佳實施例中,藉由發酵中之微生物所生產之代謝物B採用多羥基烷酸酯之形式。為了進行發酵,可採用與例如S.Y.Lee,Plastic Bacteria?Progress and prospects for polyhydroxyalkanoate production in bacteria,Tibtech,第14卷,(1996),第431-438頁中描述用於其它碳原料之條件及程序類似的條件及程序。
為了進行此製程變體,可接著進行諸如上文描述用於核黃素之程序的程序。將已根據(ii)純化且較佳基本游離於固體之含糖液體培養基喂至根據(ii)之發酵以用於生產多羥基烷酸酯。將固體分離步驟中所獲得之澄清溢流部分蒸發,若適當,以氯化鈣處理且將其乾燥,詳言之噴霧乾燥。
根據(ii)生產之含多羥基烷酸酯之發酵液可在與例如US 4310684及EP 355307中描述用於其它碳原料之條件類似的條件下及使用與其中描述用於其它碳原料之程序類似的程序來加工。在將所有發酵液巴氏滅菌之後,例如藉由離心或過濾分離剩餘固體。將固體分離步驟中所獲得之澄清溢流部分蒸發,若適當,以氯化鈣處理且將其乾燥,詳言之噴霧乾燥。多羥基烷酸酯之進一步純化係以一本身已知之方式來進行,例如如US 4310684或EP 355307中所述之方式。
已分離出之固體可如上文所述在平行操作之大體積發酵製程之範疇內進行加工以產生二級組份。
接下來的實例意欲說明本發明之個別態樣,但不以任何方式理解為限制。
如下生產下文中所用之研磨漿。使用轉子研磨機完全研磨整玉米仁。使用不同打漿機、研磨路徑或篩元件,獲得三種不同程度之精細度。借助實驗室振動篩(振動分析器:Retsch Vibrotronic VE1型;篩選時間5分鐘,振幅:1.5 mm)之研磨漿篩分析產生表1中所列之結果。
II.1.醣化步驟中無肌醇六磷酸酶II.1a)酶澱粉液化以480 g水使320 g經乾式研磨之玉米粗粉(T71/03)懸浮且藉由連續攪拌與310 mg氯化鈣混合。在整個實驗中持續攪拌。在以H2
SO4
使pH值達到6.5及混合物加熱至35℃之後,添加2.4 g之Termamyl 120L L型(Novozymes A/S)。在40分鐘期間,將反應混合物加熱至86.5℃之溫度,若必要,以NaOH將pH值再調節至以上值。在30分鐘內,添加另一400 g經乾式研磨之玉米粗粉(T71/03),在該過程期間使溫度上升至91℃。將反應混合物在此溫度下保持約100分鐘。隨後添加另一2.4 g之Termamyl 120L且將溫度保持約100分鐘。在實驗期間使用碘-澱粉反應監測液化進程。最後將溫度上升至100℃且將反應混合物煮另一20分鐘。在此時間點下,不可再可偵測到澱粉。使反應器冷卻至35℃。
II.1b)醣化藉由持續攪拌將II.1a)中所獲得之反應混合物加熱至61℃。在整個實驗期間持續攪拌。在以H2
SO4
使pH值達到4.3之後,添加10.8 g(9.15 ml)之Dextrozyme GA(Novozymes A/S)。將溫度保持約3小時,在該時間期間以葡萄糖測試條(Boehringer之S-Glucotest)監測反應進程。結果列於下文表2中。隨後將反應混合物加熱至80℃且接著將其冷卻。此產生約1180 g之液體產物,其具有約1.2 kg/l之密度及如紅外線乾燥器所測定總計約53.7重量%之乾燥物質含量。乾燥物質含量(無水溶性組份)在經水洗滌之後總計約14重量%。如藉由HPLC所測定,反應混合物之葡萄糖含量總計380 g/l(參見表2,樣品7號)。
II.2.醣化步驟中具有肌醇六磷酸酶II.2a)澱粉液化如II.1a)中所述液化經乾式研磨之玉米粗粉樣品。
II.2b)醣化藉由持續攪拌將II.2a)中所獲得之反應混合物加熱至61℃。在整個實驗中持續攪拌。在以H2
SO4
使pH值達到4.3之後,添加10.8 g(9.15 ml)之Dextrozyme GA(Novozymes A/S)及70μl肌醇六磷酸酶(700個單位之肌醇六磷酸酶,來自BASF AG之Natuphyt液體10000L)。將溫度保持約3小時,在該時間期間以葡萄糖測試條(Boehringer之S-Glucotest)監測反應進程。隨後將反應混合物加熱至80℃且接著將其冷卻。獲得之產物借助紅外線乾燥器乾燥且經水洗滌。藉由HPLC測定反應混合物中之葡萄糖含量。
II.3用於澱粉之酶液化及醣化的進一步實驗程序II.3a)玉米麵粉將360 g去離子水置於一容器中。添加1.54 ml CaCl2
儲備溶液(100 g CaCl2
×2 H2
O/l)以達到漿料中之約70 ppm Ca2 +
的最終濃度。在恆定攪拌下,使240 g玉米粗粉緩慢的滴於水中。在以NaOH水溶液(50重量%)將pH值調節至6.5之後,以4.0 ml(=2% w酶
/wD M
)Termamyl 120L L型(Novozymes A/S)補充漿狀物。接著將漿料快速加熱至85℃。在加熱期間恆定地控制及再調節pH值。
當達到最終溫度時,以添加50 g粗粉至漿狀物來開始進料。除了粗粉之外,以0.13 ml CaCl2
儲備溶液補充該漿料以維持70 ppm之Ca2 +
濃度。在整個進料過程中,將溫度恆定保持在85℃下。在等待至少10分鐘以確保完全反應之後,將下一劑量(50 g粗粉,0.13 ml CaCl2
儲備溶液)置於該容器中。在兩個進料步驟之後,添加1.67 ml Termamyl;接著進行兩個進料步驟(各50 g粗粉,0.13 ml CaCl2
儲備溶液)。最後,達到55重量%之乾燥物質含量。在進料之後,將溫度上升至100℃且將漿料蒸煮10分鐘。
樣品取出且將其冷卻至室溫。在以去離子水稀釋(約1:10)樣品之後,添加一滴經濃縮之Lugol氏溶液(每公升5 g I與10 g KI之混合物)。深藍色顯示殘留澱粉,當澱粉完全水解時出現棕色。若測試指示殘留澱粉,則將溫度再降低至85℃且保持恆定。添加另一1.67 ml Termamyl且允許反應進行直至碘-澱粉-反應為陰性。
接著將"澱粉陰性"漿狀物冷卻至61℃用於下列醣化反應。藉由添加50%硫酸將漿狀物pH值調節至4.3。在反應期間,將pH值維持在此值下。將溫度保持在61℃下。添加5.74 ml(=1.5% w酶
/wD M
)Dextrozyme GA(Novozymes A/S)以使經液化之澱粉轉換成葡萄糖。反應允許進行1小時。對於酶滅活而言,接著將漿狀物加熱至85℃。將熱漿狀物填充於消毒燒瓶中且在冷卻後儲存於4℃下。
II.3b)黑麥麵粉(包括以纖維素酶/半纖維素酶之預處理)將360 g去離子水置於一容器中。在恆定攪拌下,將155 g黑麥粗粉緩慢地滴於水中。將溫度恆定維持在50℃下。在以NaOH水溶液(50重量%)將pH值調節至5.5之後,以3.21 ml(=2.5% w酶
/wD M
)Viscozyme L(Novozymes A/S)補充漿狀物。在30分鐘之後,以添加55 g粗粉至漿料來開始進料。在另一30分鐘之後,添加50 g粗粉;在30分鐘後再添加40 g粗粉。在最後進料步驟之後30分鐘可開始液化。
將1.7 ml CaCl2
儲備溶液(100 g CaCl2
×2 H2
O/l)添加至漿料。在以50重量%之NaOH水溶液將pH值調節至6.5之後,以5.0 ml(=2% w酶
/wD M
)Termamyl 120L L型(Novozymes A/S)補充漿狀物。接著將漿料快速地加熱至85℃。在加熱期間恆定地控制且再調節pH值。
當達到最終溫度時,以添加60 g粗粉至漿狀物來開始進料。除了粗粉之外,以0.13 ml CaCl2
儲備溶液補充該漿料以維持70 ppm之Ca2 +
濃度。在整個進料過程中,將溫度恆定保持在85℃下。在等待至少10分鐘以確保完全反應之後,將下一劑量(40 g粗粉,0.1 ml CaCl2
儲備溶液)置於該容器中。添加1.1 ml Termamyl;接著進行另一進料步驟(40 g粗粉,0.1 ml CaCl2
儲備溶液)。最後,達到55重量%之乾燥物質含量。在進料之後,將溫度上升至100℃且將漿料蒸煮10分鐘。
樣品取出且將其冷卻至室溫。在以去離子水稀釋(約1:10)樣品之後,添加一滴經濃縮之Lugol氏溶液(每公升5 g I與10 g KI之混合物)。深藍色顯示殘留澱粉,當澱粉完全水解時出現棕色。若測試指示殘留澱粉,則將溫度再降低至85℃且保持恆定。添加另一1.1 ml Termamyl且允許反應進行直至碘-澱粉-反應為陰性。
接著將"澱粉陰性"漿狀物冷卻至61℃用於下列醣化反應。藉由添加50%硫酸將漿狀物pH值調節至4.3。在反應期間,將pH值維持在此值下。將溫度保持在61℃下。添加5.74 ml(=1.5% w酶
/wD M
)Dextrozyme GA(Novozymes A/S)以使經液化之澱粉轉換成葡萄糖。反應允許進行1小時。對於酶滅活而言,接著將漿狀物加熱至85℃。將熱漿狀物填充於消毒燒瓶中且在冷卻後儲存於4℃下。
II.3c)小麥麵粉(包括以木聚糖酶之預處理)將360 g去離子水置於一容器中。將該水加熱至55℃且以NaOH水溶液(50重量%)調節pH值6.0。在溫度及pH值調節之後,添加3.21 ml(=2.5% w酶
/wD M
)Shearzyme 500L(Novozymes A/S)。在恆定攪拌下,接著將155 g小麥粗粉滴於此溶液中。溫度及pH值保持恆定。在30分鐘之後,以添加55 g粗粉至漿料來開始進料。在另一30分鐘之後,添加50 g粗粉;在30分鐘後再添加40 g粗粉。在最後進料步驟之後30分鐘可開始液化。
如實例II.3b中所述進行液化及醣化。
III.1構建質體pCIS lysC在菌株構建之第一步驟中,於麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032中進行將酶天冬胺酸酯激酶(lysC)編碼之野生型基因的對偶基因取代。此處,於lysC基因中進行核苷酸取代以使得在所得蛋白質中位置311處之胺基酸Thr由Ile置換。自來自ATCC13032之染色體DNA作為用於PCR反應之模板起始,lysC藉由寡核苷酸引子5'-GAGAGAGAGACGCGTCCCAGTGGCTGAGACGCATC-3'(SEQ ID NO:1)及5'-CTCTCTCTGTCGACGAATTCAATCTTACGGCCTG-3'(SEQ ID NO:2)
在Pfu-Turbo PCR系統(Stratagene,USA)之輔助下按照製造商說明書擴增。來自麩胺酸棒狀桿菌ATCC 13032之染色體DNA係藉由Tauch等人之(1995)Plasmid 33:168-179或Eikmanns等人之(1994)Microbiology 140:1817-1828的方法來製備。擴增片段藉由Sall限制性裂解在其5'末端且藉由Mlul限制性裂解在其3'末端側接。在選殖之前,以此等兩種限制性酶消化該擴增片段且以GFXT M
PCR,DNA及Gel Band Purification Kit(Amersham Pharmacia,Freiburg)將其純化。
所得聚核苷酸經由Sall及Mlul限制性裂解選殖於下文稱為pCIS,(SEQ ID NO:3)之pCLIK5 MCS integrativ SacB中且轉化成大腸桿菌XL-1藍。含質體之細胞之選擇係藉由在含有卡那黴素(20μg/ml)之LB瓊脂(Lennox,1955,Virology,1:190)(kanamycin)上接種來達成。分離該質體且藉由測序來檢驗所預期之核苷酸序列。使用來自Quiagen之方法及材料來進行質體DNA之製備。測序反應係藉由Sanger等人之(1977)Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467的方法來進行。測序反應係借助ABI Prism 377(PE Applied Biosystems,Weiterstadt)來分離且對其進行評估。所得質體稱為pCIS lysC(SEQ ID NO:4)。其包含下列基本部分:
III.2麩胺酸棒狀桿菌lysC基因突變麩胺酸棒狀桿菌lysC基因之定點突變係使用QuickChange Kit(Stratagene,USA)按照製造商說明書來進行。該突變於質體pCIS lysC(SEQ ID NO:4)中進行。合成下列寡核苷酸引子以用於在Quickchange方法(Stratagene)之輔助下由311 ile取代thr 311:5'-CGGCACCACCGACATCATCTTCACCTGCCCTCGTTCCG-3'(SEQ ID NO:5)5'-CGGAACGAGGGCAGGTGAAGATGATGTCGGTGGTGCCG-3'(SEQ ID NO:6)
在Quickchange反應中使用此等寡核苷酸引子於lysC基因(SEQ ID NO:7)中導致位置932中之核苷酸的取代(由T取代C)。lysC基因中之所得胺基酸取代物Thr311Ile係藉由轉化成大腸桿菌XL1-藍及製備質體之後之測序反應來檢驗。該質體命名為pCIS lysC thr311ile(SEQ ID NO:8)。其包含下列基本部分:
III.3 pCIS lysC thr311ile轉化成麩胺酸棒狀桿菌(菌株ATCC13032)質體pCIS lysC thr311ile係借助如Liebl等人之FEMS Microbiology Letters 53:299-303(1989)所述之電穿孔法轉化成麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032。協定之修改描述於DE 10046870中。個別轉化株lysC軌跡的染色體排列係使用借助Sambrook等人之Molecular Cloning.A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor(1989)中所述之南方墨點及雜交的標準方法來檢驗。進而確保該等轉化株為具有藉由同源重組整合於lysC軌跡處之經轉化之質體的彼等轉化株。在該等菌落於無抗生素之培養基中隔夜生長之後,將細胞接種於蔗糖CM瓊脂培養基(10%蔗糖)上且在30℃下培育24小時。
因為載體pCIS lysC thr311ile中所存在之sacB將蔗糖轉換為毒性產物,所以僅彼等在野生型基因lysC及突變基因lysC thr311ile之間具有藉由第二同源重組步驟刪除之sacB基因的菌落可生長。在同源重組期間,野生型基因或突變基因可與sacB基因一起刪除。當sacB基因與野生型基因一起移除時,生成一突變轉化株。
選出生長菌落且研究其對卡那黴素敏感的表型。純系與經刪除之sacB必須同時證明對卡那黴素敏感之生長行為。研究該等對卡那黴素敏感之純系於震盪燒瓶中之離胺酸生產率。為了對照,栽培未經處理之麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032。選擇離胺酸生產率增大超過對照組之純系,獲得染色體DNA,且lysC基因之相應區域藉由PCR反應(Pfu-Turbo PCR系統;Stratagene,USA)按照製造商說明書擴增且將其測序(藉由Sanger等人(同上)之方法)。具有經增強之離胺酸合成及lysC中位置932處經確認之突變之特徵的該種純系稱為ATCC13032 lysCf b r
。
實例1 a)酶澱粉液化及澱粉醣化使500 g經乾式研磨之玉米粗粉懸浮於750 ml水中且將其於一摻合器中再次精細研磨。將該懸浮液分成4個樣品1號至4號,以約3 g熱穩定之α-澱粉酶處理每一個樣品(樣品1號及2號:Termamyl L;樣品3號及4號:Spezyme)。隨後以約7 g/l葡糖澱粉酶處理樣品2號及4號(樣品2號:Dextrozyme GA;樣品4號:Optidex)。次產生淡黃色之黏性樣品,其固體內容物在各狀況下均藉由離心來分離,在該製程期間一層疏水性固體漂浮於澄清液相之頂部。
以濃縮形式及10倍稀釋之所得樣品的澄清上清液係藉由忽視或考慮經降級使用(spun down)之顆粒的HPLC方法來分析。當考慮顆粒時,假定50重量%之顆粒乾燥物質內容物。基於起始樣品,結果列於下文表3中。
b)發酵在使用麩胺酸棒狀桿菌之震盪燒瓶實驗中(燒瓶4-9)採用根據實例II.1所獲得之兩種玉米粗粉水解產物。此外,平行使用類似於實例II.1製備之小麥麵粉水解產物(燒瓶1-3)。
1b.1)製備接種物將細胞劃線於消毒CM瓊脂上(組合物:參見表4;於121℃下20分鐘)且接著將其在30℃下培育48小時。隨後自培養盤刮出細胞且使其再懸浮於鹽水中。在各狀況下以使得在600 nm下光學密度達到1之OD6 0 0
值之量的因此製備的細胞懸浮液接種250 ml錐形瓶中之25 ml培養基(參見表5)。
1b.2)製備發酵液燒瓶培養基1至9之組合物列於表5中。
在接種之後,將燒瓶在30℃下培育48小時且在經潤濕之震盪器中震盪(200 rpm)。在發酵終止之後,藉由HPLC測定糖及離胺酸含量。HPLC以Agilent 1100系列LC系統來進行。鄰苯二甲醛之預管柱衍生物允許形成之胺基酸之定量;產物混合物係使用Agilent Hypersil AA管柱來分離。結果編輯於表6中。
在所有燒瓶中,離胺酸以在約30至40 g/l左右之對應於葡萄糖營養物溶液之標準發酵中所獲得之產量的相當量生產。
實例2:發酵使用如實例II.1中所述獲得之玉米粗粉水解產物,類似於實例1b)來進行發酵,使用III下所述之菌株ATCC13032 lysCf b r
。將細胞在30℃下於消毒CM瓊脂(組合物表4;121℃下20分鐘)上培育48小時。隨後自培養盤刮出細胞且使其再懸浮於鹽水中。在各狀況下以使得在610 nm下光學密度達到1之OD6 0 0
值之量的因此製備的細胞懸浮液接種250 ml錐形瓶中之25 ml培養基1或2(參見表5)。接著將樣品在200 rpm及30℃下於經潤濕之震盪器中(相對大氣濕度85%)培育48小時。藉由HPLC測定培養基中之離胺酸濃度。在所有狀況下,生產約相同的離胺酸數量。
實例3在使用麩胺酸棒狀桿菌(ATCC13032 lysCf b r
)震盪燒瓶實驗(燒瓶1+2)中採用根據實例II.3a中所獲得之玉米粗粉水解產物。此外,平行使用類似於實例II.3製備之小麥麵粉水解產物(燒瓶3+4)及黑麥麵粉水解產物(燒瓶5+6)。
3.1)製備接種物將細胞劃線於消毒CM+CaAc瓊脂上(組合物:參見表7;於121℃下20分鐘)且接著將其在30℃下培育48小時。隨後使該等細胞接種於新的培養盤上且將其在30℃下培育隔夜。接著自該等培養盤刮出細胞且使其再懸浮於鹽水中。在各狀況下以使得在610 nm下光學密度達到0.5之OD6 1 0
值之量的因此製備的細胞懸浮液接種具有兩個隔板之250 ml錐形瓶中之23 ml培養基(參見表8)。
3.2製備發酵液燒瓶培養基1至6之組合物列於表8中。
相應量之葡萄糖溶液代替麵粉水解產物用於對照培養基中。
在接種之後,將燒瓶在30℃下培育48小時同時於經潤濕之震盪器中震盪(200 rpm)。在發酵終止之後,藉由HPLC測定葡萄糖及離胺酸含量。該HPLC分析以Agilent 1100系列LC系統來進行。胺基酸之測定需要鄰苯二甲醛之預管柱衍生物;在Agilent Zorbax Extend C18管柱上執行分離。結果編輯於表9中。
在所有燒瓶中,離胺酸以在約10至12 g/l左右之對應於葡萄糖營養物溶液之標準發酵中所獲得之產量的相當量生產。
3.3)分離離胺酸為了分離離胺酸,通常借助離心於第一步驟中自發酵液移除固體組份。作為離心之替代,可採用過濾方法,諸如(例如)薄膜過濾。接著將無固體之發酵液酸化(例如以硫酸酸化),藉以使離胺酸以單質子或雙質子形式存在。接著使此經酸化之液體經過陽離子交換器以使離胺酸於離子交換器處結合。在以水沖洗之後,使液態氨經過離子交換器以使該離胺酸溶離。將溶離液蒸發;隨後藉由添加鹽酸使於溶離液中作為游離鹼存在之離胺酸轉化成離胺酸鹽酸鹽且結晶出來。在最終乾燥之前,經由離心作用可發生晶體自晶體懸浮液之移除。使用此方法製得高純度之結晶離胺酸(98.5重量%之離胺酸★
HCl)。此方法及製備離胺酸之替代性方法的詳細描述可在"Ikeda,M.:Amino Acid Production Processes.Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology,第79卷(2003),1-35"及"Hermann,T.:Industrial production of amino acids by coryneform bacteria.Journal of Biotechnology 104(2003),155-172"中找到。
實例4在震盪燒瓶實驗中(燒瓶1-3)採用根據實例II.3a所獲得之玉米粗粉水解產物。桿菌PA824用作生產泛酸酯之菌株(確切描述於WO 02/061108中)。此外,平行使用類似於實例II.3製備之小麥麵粉水解產物(燒瓶4-6)及黑麥麵粉水解產物(燒瓶7-9)。
4.1)製備接種物在各狀況下以0.4 ml凍結培養物接種具有兩個隔板之250 ml錐形瓶中之42 ml製備培養基(參見表10)且將其在43℃下接種24 h同時於經潤濕之震盪器中震盪(250 rpm)。
在各狀況下以1 ml預備培養物接種具有兩個隔板之250 ml錐形瓶中之42 ml主培養基(參見表11)。
4.2製備發酵液燒瓶培養基1至9之組合物列於表11中。
相應量之葡萄糖溶液代替麵粉水解產物用於對照培養基中。
在接種之後,將燒瓶在43℃下培育24小時且在經潤濕之震盪器中震盪(250 rpm)。在發酵終止之後,藉由HPLC測定葡萄糖及泛酸含量。葡萄糖之測定係使用來自Bio-Rad公司之Aminex HPX-87H管柱來進行。泛酸濃度之測定係借助於來自Phenomenex公司Aqua C18管柱上分離來進行。結果編輯於表6中。
在所有燒瓶中,泛酸以在約1.5至2 g/l左右之對應於葡萄糖營養物溶液之標準發酵中所獲得之產量的相當量生產。
產物之加工可如例如WO 02/24001、WO 02/072857及WO 05/028659中所述來進行。
實例5在使用黑麴菌之震盪燒瓶實驗(燒瓶1-3)中採用根據實例II.3a所獲得之玉米粗粉水解產物。此外,平行使用類似於實例II.3所製備之小麥麵粉水解產物(燒瓶4-6)及黑麥麵粉水解產物(燒瓶7-9)。
5.1)菌株在控制glaA引子下類似於WO 98/46772中所詳細描述之NP505-7生產來生產具有6個來自無花果麴菌之phyA基因之複本的生產肌醇六磷酸酶的黑麴菌菌株。使用具有3個經改質之glaA ampicons(類似於ISO505)而無完整phyA表達序列盒的菌株。
5.2)製備接種物在各狀況下以100μl凍結培養物接種具有一隔板之100 ml錐形瓶中之20 ml預備培養基(參見表13)且將其在34℃下接種24 h同時於經潤濕之震盪器中震盪(170 rpm)。
在各狀況下以5 ml預備培養物接種具有一隔板之250 ml錐形瓶中之50 ml主培養基(參見表14)。
5.3製備發酵液燒瓶培養基1至9之組合物列於表14中。
對應量之葡萄糖溶液代替麵粉水解產物用於對照培養基中。
在接種之後,將燒瓶在34℃下培育6天同時於一經潤濕之震盪器中震盪(170 rpm)。在發酵終止之後,借助檢定法測定肌醇六磷酸酶活性。在發酵終止之後,以肌醇六磷酸作為基質及在合適水平之肌醇六磷酸酶活性(標準:0.6 U/ml)下於250 mM乙酸/乙酸鈉/Tween 20(0.1重量%)、pH值為5.5之緩衝液中調節肌醇六磷酸酶活性。將檢定法標準化用於微量滴定盤(MTP)上。將10μl酶溶液與140μl之6.49 mM肌醇六磷酸鹽溶液於250 mM pH值為5.5(肌醇六磷酸鹽:肌醇六磷酸之十二鈉鹽)之乙酸鈉緩衝液中混合。在37℃下培育1小時之後,藉由添加相同體積(150μl)之三氯乙酸來停止反應。將此混合物之一等分試樣(20μl)給予含有0.32 N H2
SO4
、0.27重量%鉬酸銨及1.08重量%抗壞血酸之280μl溶液。隨後在50℃下進行25分鐘培育。在820 nm下量測帶藍色溶液之吸附性。結果編輯於表15中。
產物可如WO 98/55599中所述來加工。
實例6在使用棉病囊菌之震盪燒瓶實驗中(燒瓶1-4)採用根據實例II.3a所獲得之玉米粗粉水解產物。此外,平行使用類似於實例II.3所製備之小麥麵粉水解產物(燒瓶5-8)及黑麥麵粉水解產物(燒瓶9-12)。
6.1)菌株所用之生產核黃素之菌株為棉病囊菌ATCC 10895(亦參見Schmidt G.等人之Inhibition of purified isocitrate lyase identified itaconate and oxalate as potential antimetabolites for the riboflavin overproducer Ashbya gossypii.Microbiology 142:411-417,1996)。
6.2)製備接種物將細胞劃線於消毒HMG瓊脂(組合物:參見表16;在121℃下20分鐘)上且接著將其在28℃下培育72小時。
隨後在各狀況下以充滿細胞之接種環接種具有兩個隔板之250 ml錐形瓶中之50 ml預備培養基(參見表17)且將其在28℃下培育24 h同時於經潤濕之震盪器中震盪(180 rpm)。
在各狀況下以5 ml預備培養物接種具有兩個隔板之250 ml錐形瓶中之50 ml主培養基(參見表18)。
6.3製備發酵液燒瓶培養基1至12之組合物列於表18中。
相應量之葡萄糖溶液代替麵粉水解產物用於對照培養基中。
在接種之後,將燒瓶在28℃下培育6天同時於經潤濕之震盪器中震盪(180 rpm)培育。在發酵終止之後,藉由HPLC測定維生素B2
含量。結果編輯於表19中。
產物可如EP 00 345 717中所述來加工。
實例7在使用麩胺酸棒狀桿菌之震盪燒瓶實驗中(燒瓶1-3)採用根據實例II.3a所獲得之玉米粗粉水解產物。此外,平行使用類似於實例II.3所製備之小麥麵粉水解產物(燒瓶4-6)及黑麥麵粉水解產物(燒瓶7-9)。
7.1)菌株熟習此項技術者已知生產甲硫胺酸之棒狀桿菌菌株。該等菌株之生產描述於例如Kumar D.Gomes J.Biotechnology Advances,23(1):41-61,2005;Kumar D.等人,Process Biochemistry,38:1165-1171,2003;WO 04/024933及WO 02/18613中。
7.2)製備接種物將細胞劃線於消毒CM+Kan瓊脂(組合物:參見表20;在121℃下20分鐘)上且接著在30℃下培育24小時。接著自培養盤刮出細胞且使其再懸浮於鹽水中。在各狀況下以使得在610 nm下光密度達到0.5之OD6 1 0
值之量的因此製備的細胞懸浮液接種具有兩個隔板之250 ml錐形瓶中之25 ml培養基(參見表5)。
7.3製備發酵液燒瓶培養基1至9之組合物列於表21中。
對應量之葡萄糖溶液代替麵粉水解產物用於對照培養基中。
在接種之後,將燒瓶在30℃下培育同時於經潤濕之震盪瓶中震盪(200 rpm)直至葡萄糖用完。在發酵終止之後,藉由HPLC測定甲硫胺酸含量(管柱:Agilent ZORBAX Eclipse AAA;Method It.Eclipse AAA protocol,technical note 5980-1193)。結果編輯於表22中。
產物之加工可如例如WO 05/007862及先前申請案DE 103 59 668.2中所述來進行。
實例8在使用細菌130Z之震盪燒瓶實驗中採用根據實例II.3a所獲得之玉米粗粉水解產物。
8.1)菌株細菌130Z(ATCC No.55618)用作生產琥珀酸鹽之菌株。
8.2)製備發酵液在各狀況下以1 ml凍結培養物接種120 ml血清瓶中之50 ml主培養基(參見表23)。在密封該等血清瓶之前,以CO2
(0.7巴)壓縮其內容物。
培養基之組合物列於表23中(參見US 5,504,004)。
相應量之葡萄糖溶液代替麵粉水解產物用於對照培養基中(最終葡萄糖濃度:100 g/l)。
在接種之後,將該等血清瓶在37℃下培育46 h同時於經潤濕之震盪瓶中震盪(160 rpm)。在發酵終止之後,藉由HPLC測定葡萄糖及琥珀酸鹽含量。該測定係借助來自Bio-Rad之Aminex HPX-87H管柱來進行。結果編輯於表24中。
實例9在使用大腸埃希氏菌之震盪燒瓶實驗中(燒瓶1-3)採用根據實例II.3a中所獲得之玉米粗粉水解產物。同樣,平行使用類似於實例II.3所製備之小麥麵粉水解產物(燒瓶4-6)及黑麥麵粉水解產物(燒瓶7-9)。
9.1)菌株熟習此項技術者已知生產L-酥胺酸之大腸埃希氏菌菌株。該等菌株之生產描述於例如EP 1013765、EP 1016710 A2、US 5,538,873中。
9.2)製備接種物將細胞劃線於消毒LB瓊脂上。將抗生素添加至LB瓊脂,若合適,抗性基因在相應菌株中作為標記存在。為此,可使用例如卡那黴素(40μg/ml)或氨苄西林(Ampicillin)(100 mg/l)。將菌株在30℃下培育24 h。接著自培養盤刮出細胞且使其再懸浮於鹽水中。在各狀況下以使得在610 nm下光密度達到0.5之OD6 1 0
值之量的因此製備的細胞懸浮液接種具有兩個隔板之250 ml錐形瓶中之25 ml培養基(參見表25)。
9.3製備發酵液燒瓶培養基1至9之組合物列於表25中。對應量之葡萄糖溶液代替麵粉水解產物用於對照培養基中。
在接種之後,將燒瓶在30℃下培育同時於經潤濕之震盪瓶中震盪(200 rpm)直至葡萄糖用完。在發酵終止之後,可借助逆相HPLC來測定L-酥胺酸含量,如藉由Lindroth等人之Analytical Chemistry 51:1167-1174,1979所述。
接著可收集發酵液且以如例如US 5,538,873及Okamoto等人之Bioscience,Biotechnology and Biochemistry 61(11),1877-1882,1997中所述之另一方法來分離、純化及加工該發酵液中之L-酥胺酸。
實例10類似於實例9中所述之方法,使用相應菌株可生產其它L胺基酸麩胺酸酯、離胺酸、組胺酸、脯胺酸及精胺酸。個別菌株描述於例如EP 1016710中。
實例11在使用II.2)下所述之麩胺酸棒狀桿菌之生產離胺酸的菌株的震盪燒瓶實驗中(燒瓶1-4)採用根據實例II.3中所獲得之木薯麵粉水解產物。所用之麵粉具有下列粒徑分佈:45%<100μm、56%<200μm、79%<630μm。
懸浮液之黏度在液化步驟開始時已相對較高,以使得初始木薯麵粉以對應於35重量%之乾燥物質含量的量採用。添加經相應增大之量的粉末以最終亦獲得55重量%之乾燥質量。懸浮液之黏度在整個液化及醣化步驟過程中保持相對較高。此外,木薯麵粉趨於結塊;小塊在此製程之剩餘期間僅部分溶解。經受碘-澱粉測試,懸浮液中所存在之小塊在幾分鐘之後變成深藍色;此係結塊澱粉即使在重複煮及等待更長時間之情況下亦不可完全轉換的指示。
11.1)菌株使用具有III下所述之反饋解除之天冬胺酸激酶ATCC13032 lysCf b r
的經改質的野生型。
11.2)製備接種物將細胞劃線於消毒CM+CaAc瓊脂上(組合物:參見表26;在121℃下20分鐘)且接著將其在30℃下培育24小時。接著自培養盤刮出細胞且使其再懸浮於鹽水中。在各狀況下以使得在610 nm下光密度達到0.5之OD6 1 0
值之量的因此製備的細胞懸浮液接種具有兩個隔板之250 ml錐形瓶中之23 ml培養基(參見表27)。
11.3製備發酵液燒瓶培養基1之組合物列於表27中。相應量之葡萄糖溶液代替麵粉水解產物用於對照培養基中。
在接種之後,將燒瓶在30℃下培育48小時同時於經潤濕之震盪器中震盪(200 rpm)。在發酵終止之後,藉由HPLC測定葡萄糖及離胺酸含量。HPLC分析以Agilent 1100系列LC系統來進行。在來自Bio-Rad之Aminex HPX-87H管柱的幫助下測定葡萄糖。借助高壓液體層析法於Agilent 1100系列LC HPLC系統上實現胺基酸濃度之測定。具有鄰苯二甲醛之預管柱衍生物允許形成之胺基酸的定量;使用Hypersil AA管柱(Agilent)分離胺基酸混合物。結果編輯於表28中。
在所以燒瓶中,離胺酸以在約10至14 g/l左右之對應於葡萄糖營養物溶液之標準發酵中所獲得之產量的相當量生產。
實例12在使用黑麴菌之震盪燒瓶實驗中採用部分醣化之玉米粗粉水解產物。
12.1)液化及(部分)醣化類似於實例II.3a進行液化。在懸浮液冷卻至61℃及pH值調節至4.3之後,添加5.38 ml(=1.5重量%酶/乾燥物質)dextrozyme GA(Novozymes A/S)。在添加酶之後分別10、15、20、30、45及60分鐘,移除50 g樣品且使其懸浮於25 ml消毒冰冷VE水中。將樣品置放於冰浴中且立即經受燒瓶測試。不進行酶滅活。
12.2)發酵採用實例5.1)中所用之菌株。如實例5.2)中所述進行接種物之製備。
表29中所列之燒瓶培養基組合物用於製備發酵液。自各樣品製備兩個燒瓶培養基。
在接種之後,將燒瓶在34℃下培養6天同時於經潤濕之震盪器中震盪(170 rpm)。在發酵終止之後,借助一檢定法(如實例5.3中所述)來測定肌醇六磷酸酶活性。結果編輯於表30中。
實例13在使用麩胺酸棒狀桿菌之震盪燒瓶實驗中採用部分醣化之玉米粗粉水解產物。
13.1)液化及(部分)醣化類似於實例II.3a進行液化。在懸浮液冷卻至61℃及pH值調節至4.3之後,添加5.38 ml(=1.5重量%酶/乾燥物質)dextrozyme GA(Novozymes A/S)。在添加酶之後分別10、15、20、30、45及60分鐘,移除50 g樣品且使其懸浮於25 ml消毒冰冷VE水中。將樣品置放於冰浴中且立即經受燒瓶測試。不出現酶滅活。
13.2)發酵採用實例3)中所用之菌株。如實例3.1)中所述進行接種物之製備。
表31中所列之燒瓶培養基組合物用於製備發酵液。自各樣品製備三個燒瓶培養基。
在接種之後,將燒瓶在30℃下培育48小時同時於經潤濕之震盪器中震盪(200 rpm)。在發酵終止之後,藉由HPLC測定葡萄糖及離胺酸含量。HPLC分析以Agilent 1100系列LC系統來進行。在來自Bio-Rad之Aminex HPX-87H管柱的幫助下測定葡萄糖。借助高壓液體層析法於Agilent 1100系列LC HPLC系統上實現胺基酸濃度之測定。具有鄰苯二甲醛之預管柱衍生物允許形成之胺基酸的定量;使用Hypersil AA管柱(Agilent)分離胺基酸混合物。結果編輯於表32中。
實例14在根據實例3進行之生產離胺酸之發酵步驟期間,在自發酵液移除離胺酸之後獲得作為根據步驟c)之乾燥發酵殘餘物的蛋白質組合物。在表33中,指示組合物之基本組份連同其重量比例且與習知DDGS組合物相比較。
<110> BASF Aktiengesellschaft <120> 發酵生產精細化學品<130> M/44156 <140> 094117528 <150> 2005-05-27 <160> 8 <170> 版本3.1中之專利<210> 1 <211> 35 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> PCR引子<400> 1<210> 2 <211> 34 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> PCR引子<400> 2<210> 3 <211> 4327 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 質體pCIS <400> 3 <210> 4 <211> 5860 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 質體pCIS lysC <400> 4 <210> 5 <211> 38 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> PCR引子<400> 5<210> 6 <211> 38 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> PCR引子<400> 6<210> 7 <211> 1266 <212> DNA <213> 麩胺酸棒狀桿菌<400> 7 <210> 8 <211> 5860 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 質體pCIS lysC thr311ile <400> 8
Claims (21)
- 一種借助糖基微生物發酵作用生產至少一種具有至少3個碳原子或具有至少2個碳原子及至少1個氮原子之微生物代謝物的方法,其包含:a)自一選自於穀類仁之澱粉原料製備具有多於20重量%之單醣含量的含糖液體培養基,該含糖液體培養基亦包含至少50重量%之該澱粉原料之非澱粉固體組份;b)使該含糖液體培養基發酵以生產一或多種代謝物;及c)自該發酵液耗盡或分離至少一種代謝物,其包含與含糖液體培養基一起培養生產所要代謝物之微生物菌株,該液體培養基係藉由以下步驟來獲得:a1)研磨選自於穀類仁之澱粉原料以獲得研磨漿;及a2)在至少一種澱粉液化酶存在下將研磨漿液化於一含水液體中,接著使用至少一種醣化酶醣化,其中在液化步驟過程中至少一些研磨漿係藉由連續或逐批添加至該含水液體,其中液化期間所添加之研磨漿之總量之至少25重量%係於研磨漿中所存在之澱粉的膠凝化溫度以上的溫度下添加。
- 如請求項1之方法,其中該至少一種澱粉液化酶係選自α-澱粉酶且該至少一種醣化酶選自葡糖澱粉酶。
- 如請求項1之方法,其中該穀類係選自玉米、黑麥、黑小麥及小麥仁。
- 如請求項1或2之方法,其中在步驟a1)中之研磨期間所獲 得之研磨漿包含至少50重量%之具有多於100 μm粒度的麵粉顆粒。
- 如請求項1之方法,其中步驟a2)中之研磨漿的液化及醣化係以使得液體培養基之黏度總計不多於20 Pas的方式來進行。
- 如請求項3之方法,其中在步驟a2)中至少一種α-澱粉酶之一些於液化期間添加至該含水液體。
- 如請求項1之方法,其中獲得具有多於40重量%之單醣含量的含糖液體培養基。
- 如請求項1之方法,其中至少一種肌醇六磷酸酶在發酵步驟b)之前添加至該含糖液體培養基。
- 如請求項1之方法,其中所生產之代謝物係選自非揮發性物質。
- 如請求項1之方法,其中所生產之代謝物係選自以下各物:視情況附著有羥基且具有3至10個碳原子之有機單-、二-及三羧酸、蛋白質胺基酸及非蛋白質胺基酸、嘌呤鹼、嘧啶鹼、核苷、核苷酸、脂質、飽和及不飽和脂肪酸、具有3至10個碳原子之二醇、具有3個或更多個羥基之較高官能度醇、具有至少4個碳原子之較長鏈醇、碳水化合物、芳族化合物、維生素、維生素原、輔助因子、保健食品、蛋白質、類胡蘿蔔素、具有3至10個碳原子之酮、內酯、生物聚合物及環糊精。
- 如請求項1之方法,其中所生產之代謝物係選自以下各物:酶、胺基酸、維生素、雙醣、具有3至10個碳原子之 脂族單-及二羧酸、具有3至10個碳原子之脂族羥基羧酸、具有3至10個碳原子之酮、具有4至10個碳原子之烷醇、具有3至8個碳原子之烷二醇及多羥基烷酸酯。
- 如請求項1之方法,其中該等微生物係選自生產下列代謝物之至少一種的天然或重組微生物:酶、胺基酸、維生素、雙醣、具有3至10個碳原子之脂族單-及二羧酸、具有3至10個碳原子之脂族羥基羧酸、具有3至10個碳原子之酮、具有4至10個碳原子之烷醇、具有3至8個碳原子之烷二醇及多羥基烷酸酯。
- 如請求項12之方法,其中該等微生物係選自棒狀桿菌(Corynebacterium)、芽孢桿菌(Bacillus)、囊菌(Ashbya)、埃希氏菌(Escherichia)、麴菌(Aspergillus)、產鹼菌(Alcaligenes)、放線桿菌(Actinobacillus)、厭氧螺菌(Anaerobiospirillum)、乳酸桿菌(Lactobacillus)、丙酸菌(Propionibacterium)及梭菌(Clostridium)。
- 如請求項13之方法,其中該等微生物係選自以下菌株:麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、棉病囊菌(Ashbya gossypii)、大腸埃希氏菌(Escherichia coli)、黑麴菌(Aspergillus niger)或協腹產鹼桿菌(Alcaligenes latus)、產琥珀酸厭氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniproducens)、產琥珀酸放線桿菌(Actinobacillus succinogenes)、德氏乳酸桿菌(Lactobacillus delbrückii)、賴氏乳酸桿菌(Lactobacillus leichmannii)、阿拉伯糖丙酸菌(Propionibacterium arabinosum)、謝氏丙酸菌(Propionibacterium schermanii)、費氏丙酸菌(Propionibacterium freudenreichii)、丙酸梭菌(Clostridium propionicum)及丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutlicum)。
- 如請求項1之方法,其中如步驟c)中所述自發酵液耗盡或分離該等代謝物係借助離子交換層析法來進行。
- 如請求項15之方法,其中該代謝物係選擇性地束縛於該離子交換器上且若適當,在產物溶離之前洗滌該離子交換器。
- 如請求項15之方法,其中裝載固體之發酵液抵抗重力朝向該離子交換器流動。
- 如請求項1之方法,其中(i)自步驟a)中所獲得之包含該澱粉原料之非澱粉固體組份的含糖液體培養基移除不多於50重量%的一部分,且以剩餘物進行如b)中所述之發酵以生產一第一代謝物(A);及(ii)自此部分分離澱粉原料之所有或一些非澱粉固體組份且以此部分進行如b)中所述之發酵以生產與代謝物(A)相同或不同的第二代謝物(B)。
- 如請求項18之方法,其中(ii)之非澱粉固體組份之分離係以使得含糖液體之剩餘物的固體含量總計不多於50重量%的方式來進行。
- 如請求項18之方法,其中該代謝物(B)係選自肌醇六磷酸酶、核黃素、泛酸及多羥基烷酸酯。
- 如請求項1之方法,其中在根據步驟c)耗盡或分離該代謝物後,移除至少部分程度之該發酵液之揮發性組份,得到一固體或半固體狀之蛋白質組合物。
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