KR101317064B1

KR101317064B1 - 정밀 화학물질의 발효 제조

Info

Publication number: KR101317064B1
Application number: KR1020067024942A
Authority: KR
Inventors: 마르쿠스 폼페유스; 슈테판 프라이어; 마르쿠스 로슈하이츠; 오스카르 젤더; 마티아스 보이
Original assignee: 바스프 에스이
Priority date: 2004-05-28
Filing date: 2005-05-27
Publication date: 2013-10-16
Also published as: JP2008500823A; AR049122A1; DE102004026152A1; EA015492B9; MY148904A; CN1981045A; KR101479583B1; AU2005248061A1; ZA200610738B; TW200613557A; TWI386488B; KR20120101724A; WO2005116228A3; KR20070021226A; EP1753868A2; US9109244B2; MXPA06013512A; WO2005116228A2; CA2566475A1; US20090162892A1

Abstract

본 발명은 a) 전분 공급원료로부터, 단당류 함량이 20 중량％를 초과하며 전분 공급원료 중의 비-전분 고체 성분도 포함하는 당-함유 액체 배지를 제조하는 단계; b) 대사 산물(들)을 생성하기 위해 당-함유 액체 배지를 발효시키는 단계; 및 c) 발효 브로쓰로부터 1종 이상의 대사 산물을 단리하는 단계를 포함하며, 목적하는 대사 산물(들)을 생산하는 미생물 균주를, 당-함유 액체 배지와 배양하는 것을 포함하고, 여기서 액체 배지는 a1) 전분 공급원을 분쇄하고; a2) 연마된 물질을 1종 이상의 전분-액화 효소의 존재하에서 수성 액체 중에 액화시킨 후 (이 때, 분말기재의 적어도 일부는 수성 액체로의 연속식 또는 배치식 첨가로 액화됨), 1종 이상의 당화 효소를 사용하여 당화시킴으로써 수득되는 것인, 당-기재 미생물 발효에 의한, 3개 이상의 탄소 원자를 갖거나, 2개 이상의 탄소 원자와 1개 이상의 질소 원자를 갖는 1종 이상의 미생물 대사 산물의 제조 방법에 관한 것이다.

전분 공급원료, 당-함유 액체 배지, 당-기재 미생물 발효, 미생물 대사물

Description

정밀 화학물질의 발효 제조 {FERMENTATIVE PRODUCTION OF FINE CHEMICALS}

본 발명은 전분 공급원료의 연마, 액화 및 당화에 의한 정밀 화학물질의 발효 제조 및 생성된 당 용액의 발효 배지로서의 용도에 관한 것이다.

미생물을 이용한 정밀 화학물질, 예컨대 아미노산, 비타민 및 카로티노이드의 제조를 위한 발효 방법은 일반적으로 공지되어 있다. 다양한 공정 조건에 따라, 이들은 상이한 탄소 공급원료를 이용한다. 상기 공급원료는 순수한 수크로스에서부터 사탕무 및 사탕수수 당밀을 통해 고도 당밀 (전환 사탕수수 당밀)로 알려진 것에까지 확장되고, 전분 가수분해물에서 글루코스까지 확장된다. 게다가, 아세트산 및 에탄올은 L-리신의 생물공학적 제조를 위해 공업적 규모로 사용할 수 있는 공동기질로서 언급되어 있다 (Pfefferle et al., Biotechnological Manufacture of Lysine, Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Vol. 79 (2003), 59-112).

상기언급된 탄소 공급원료를 바탕으로, 정밀 화학물질의 당-기재 발효 제조를 위한 다양한 방법 및 절차가 확립되어 있다. L-리신을 예로 들면, 균주 개발, 공정 발달 및 공업적 제조에 관해 상기 문헌 (Pfefferle et al.)에 기재되어 있다.

정밀 화학물질의 미생물-매개 발효 제조를 위한 중요한 탄소 공급원료는 전 분이다. 전분은 발효시 탄소 공급원료로서 이용될 수 있기 이전에 먼저 선행 반응 단계에서 액화되고 당화되어야 한다. 이를 위해, 전분은 보통 감자, 카사바, 곡류, 예를 들어 밀, 옥수수, 보리, 호밀, 라이밀 또는 쌀과 같은 천연 전분 공급원료로부터 예비정제된 형태로 수득되고, 그 후, 효소에 의해 액화되고 당화된 후, 정밀 화학물질의 제조를 위한 실제 발효에 이용된다.

이러한 예비-정제된 전분 공급원료의 사용 이외에도, 정밀 화학물질의 발효 제조를 위한 탄소 공급원료를 제조하기 위한, 사전처리되지 않은 전분 공급원료의 사용이 또한 기재되어 있다. 전형적으로, 전분 공급원료는 초기에 연마에 의해 세분된다. 그 후, 분말기재를 액화 및 당화시킨다. 이 분말기재는 본래 전분 이외에 발효에 역효과를 주는 일련의 비-전분 성분을 포함하기 때문에, 이들 성분을 보통 발효 전에 제거한다. 이러한 제거는 연마 직후에 (WO　02/277252; JP　2001-072701; JP　56-169594; CN　1218111), 액화 후에 (WO　02/277252; CN　1173541) 또는 당화 후에 (CN　1266102; Beukema et al.: Production of fermentation syrups by enzymatic hydrolysis of patato; potato saccharification to give culture medium (Conference Abstract), Symp. Biotechnol. Res. Neth. (1983), 6; NL8302229) 수행할 수 있다. 그러나, 이 모든 방법들은 발효에 실질적으로 순수한 전분 가수분해물을 이용한다는 것을 포함한다.

보다 최근의 기술은 특히, 발효 전에 예를 들면 액화 및 당화된 전분 용액 (JP　57159500) 및 재생가능한 자원에서 얻은 발효 배지 (EP　1205557)의 정제를 가 능하게 하려는 개선된 방법에 대한 것이다.

이와 반대로, 가공되지 않은 전분 공급원료가 바이오에탄올의 발효 제조에서 대규모로 사용된다고 공지되어 있다. 여기서, 전분 공급원료의 "건조 분쇄", 액화 및 당화라고 알려진 방법은 큰 공업적 규모로 이루어진다. 적합한 공정에 대한 기재는 예를 들어 문헌 ["The Alcohol Textbook - A reference for the beverage, fuel and industrial alcohol industries", Jaques et al. (ed.), Nottingham Univ. Press 1995, ISBN　1-8977676-735] 및 [McAloon et al., "Determining the cost of producing ethanol from corn starch and lignocellulosic feedstocks", NREL/TP-580-28893, National Renewable Energy Laboratory, October 2000]에서 발견할 수 있다.

건조 분쇄 방법의 제1 단계에서는, 통곡물 인(kernel), 바람직하게는 옥수수, 밀, 보리, 기장 및 호밀을 미세하게 연마한다. 습식 분쇄 방법으로 알려진 것과는 반대로, 추가의 액체는 첨가되지 않는다. 물질을 미세 성분으로 연마하는 목적은 인에 존재하는 전분이 이후의 액화 및 당화에서 물 및 효소의 영향을 받기 쉽게 하려는 것이다.

바이오에탄올의 발효 제조에서 가치있는 생성물은 증류로 수득되기 때문에, 건조 분쇄 공정으로부터의 전분 공급원료를 예비-정제되지 않은 형태로 사용하는 것은 특정한 문제를 유발하지 않는다. 그러나, 정밀 화학물질의 제조를 위해 건조 분쇄 방법을 사용하는 경우, 당 용액을 통해 발효물로 도입되는 고체 스트림은 발효에 역효과를 줄 뿐 아니라 이후의 공정을 실질적으로 더 어렵게 만들기 때문에 문제가 있다.

따라서, 사용되는 미생물로의 산소 공급은 많은 발효에서, 특히 미생물이 산소 요건을 요구하는 경우에 제한 요인이다. 일반적으로, 기체상에서 액상으로의 산소의 이동, 그리고 이에 따른 산소 전달률에 대한, 높은 고체 농도의 효과에 대해서는 거의 알려지지 않았다. 반면에, 고체 농도의 증가와 함께 증가되는 점도는 산소 전달률을 감소시키는 것으로 알려져 있다. 더욱이, 표면-활성 물질을 고체와 함께 발효 배지로 도입시킨다면, 이는 가스 버블이 응집하는 경향에 영향을 준다. 생성된 버블 크기는 차례대로 산소 전달에 실질적인 영향을 준다 (Mersmann, A. et al.: Selection and Design of Aerobic Bioreactors, Chem. Eng. Technol. 13 (1990), 357-370).

예를 들어, 물 중 연마된 옥수수 30 중량％ 초과를 함유하는 현탁액은 더이상 균질하게 혼합될 수 없기 때문에, 고체를 도입한 결과, 사용되는 배지의 임계 점도값은 전분-함유 현탁액의 제조 중에 일찍 도달될 수 있다 (Industrial Enzymology, 2nd　ed., T.　Godfrey, S.　West, 1996). 이는 통상적인 절차에서 글루코스 농도를 제한한다. 그 결과, 농도가 낮은 용액을 사용하는 것은 발효액의 불균형한 희석을 초래하므로 공정상의 경제적 이유로 불리하다. 이는 달성할 수 있는 표적 생성물의 최종 농도를 떨어뜨리므로, 이들을 단리할 때의 추가 비용, 및 공시 수율이 감소되고, 동일한 생산량이 제공되면서도 더 높은 수량적 요구, 즉, 더 높은 투자 비용이 얻어진다.

후처리 동안, 증가된 고체 농도는 구체적인 방법의 사용을 특별히 어렵게 할 수 있다. 따라서, 예를 들면, 이온-교환 크로마토그래피에 의해 발효액을 정제하는 경우, 사용된 크로마토그래피 컬럼이 막히는 (즉, 차단) 경향이 있음을 고려해야 한다.

이러한 어려움 때문에, 종래 다양한 건조 분쇄 방법들은 정밀 화학물질의 발효 제조를 위해 전분 공급원료를 제공하기에 적합하지 않았고, 그러므로 특별한 경제적 중요성이 없었다. 현재까지, 건조 분쇄 개념과 원칙적으로 상기 방법과 관련되어 존재하는 장점들을 공업적 규모의 정밀 화학물질 제조에 적용하려는 시도는 오직 전분 공급원료로서 카사바를 기재한 것 뿐이었다.

따라서, 건조 상태로 연마된 박리된 카사바 괴경을 전분 공급원료로서 사용한 아미노산의 발효 제조 방법이 JP　2001/275693에 기재되어 있으나, 분말기재의 입도를 150　㎛ 이하로 조정하는 것이 상기 방법의 수행에 필수적이다. 상기 목적을 위해 사용되는 여과 단계에서, 비-전분-함유 성분을 함유하는 사용되는 분말기재의 10 중량％ 초과는 수득된 전분이 액화/당화되기 전에 제거되고, 그 후, 발효된다. 더욱이, 상기 방법은 발효 산물, 예를 들어 리신을 식품 첨가제 및 비-전분-함유 카사바 성분으로서 사용하려는 의도인 한, 비-전분-함유 성분의 제거 문제가 없으므로, 가치 있는 생성물로 남아있을 수 있다.

JP　2001/309751에는 아미노산-함유 식품 첨가제의 제조를 위한 유사한 방법이 기재되어 있다. 이는 유사하게 정제 또는 고체 제거가 요구되지 않는다.

그러나, 카사바는 다른 전분 공급원료에 비해서 건조 분쇄 방법과 관련하여 비교적 문제가 없어야 한다. 전분이 전형적으로 건조 카사바 뿌리의 80 중량％ 이 상을 차지하는 반면 (Menezes et al., Fungal celluloses as an aid for the saccharification of Cassava, Biotechnology and Bioengineering, Vol.　20 (4), 1978, John Wiley and Sons, Inc., Table　1, page　558), 곡물 중의 전분 함량 (건조 물질)은 비교적 훨씬 낮아 일반적으로 70 중량％ 미만이며, 예를 들어 옥수수의 경우 대략 68 중량％를 차지하고, 밀의 경우 대략 65 중량％를 차지한다 (Jaques et al., The Alcohol Textbook, ibid.). 따라서, 액화 및 당화 후 수득된 글루코스 용액은 다른 건조-분쇄된 전분 공급원료를 사용하는 경우보다 건조-분쇄된 카사바를 사용하는 경우에 더욱 적은 오염물질, 특히 더욱 적은 고체를 포함한다.

오염물질의 양이 증가되면 반응 혼합물의 점도가 증가된다. 그러나, 카사바 전분은 가공이 비교적 쉬워야 한다. 카사바 전분은 옥수수 전분에 비해 팽윤 온도에서 더 높은 점도를 갖지만, 반대로 온도 증가시 옥수수 전분에 비해 점도가 더욱 빠르게 떨어진다 (Menezes,　T.J.B. de, Saccharification of Cassava for ethyl alcohol production, Process Biochemistry, 1978, page　24, right column). 더욱이, 카사바 전분의 팽윤 및 젤라틴화 온도는 옥수수와 같은 곡류로부터 얻은 전분의 온도보다 낮은데, 이는 카사바 전분이 곡류 전분보다 세균의 α-아밀라제에 더욱 쉽게 접근가능하기 때문이다 (Menezes,　T.J.B. de, loc. cit.).

다른 전분 공급원료에 비해 카사바가 갖는 추가적인 장점은 그의 낮은 셀룰로스 함량 및 낮은 피테이트 함량이다. 셀룰로스 및 헤미셀룰로스는 특히 산성 당화 조건하에서 푸르푸랄로 전환될 수 있고 (Jaques et al., The Alcohol Textbook, ibid.; Menezes,　T.J.B. de, ibid.), 이는 차례로 발효에 사용되는 미생물에 대한 억제 효과를 가질 수 있다. 피테이트도 마찬가지로 발효에 사용되는 미생물을 억제한다.

따라서, 기술적 측면에서 건조 분쇄 방법에 상응하는 방법에서 전분 공급원료로 카사바를 가공하는 것이 가능하지만, 이러한 카사바를 바탕으로 하는 방법은 여전히 복잡하고, 최적이지 않으며, 그러므로 널리 사용되지 않는다.

따라서, 본 발명의 목적은 전분을 함유하는 전세계 지방에서 입수가능한 다양한 식물, 예를 들어 곡류 또는 감자를 전분 공급원료로서 사용하는, 정밀 화학물질의 발효 제조를 위한 효율적인 방법을 제공하는 것이다. 이 방법은 사용되는 배지의 손쉬운 취급성을 특징으로 하며, 특히, 발효 이전 복잡한 예비-정제 또는 주요 정제 단계, 예를 들어 고체 비-전분-함유 성분의 제거를 피할 수 있다. 더욱이, 이 방법으로 발효 혼합물의 손쉬운 가공이 가능하다. 출원인이 수행한 작업과 관련하여, 놀랍게도, 이러한 방법이 본래 증가된 고체의 혼입에도 불구하고 효율적인 방식으로 수행될 수 있음이 밝혀졌다.

따라서, 본 발명은

a) 전분 공급원료로부터, 단당류 함량이 20 중량％를 초과하며 전분 공급원료 중의 비-전분-함유 고체 성분도 포함하는 당-함유 액체 배지의 제조 단계;

b) 대사물(들)의 제조를 위한 당-함유 액체 배지의 발효 단계; 및

c) 발효액으로부터 1종 이상의 대사물의 단리 단계를 포함하며, 목적하는 대사물(들)을 생산하는 미생물 균주를, 당-함유 액체 배지와 배양하는 것을 포함하고, 여기서 액체 배지는

a1) 전분 공급원료를 분쇄하고;

a2) 분말기재를 1종 이상의 전분-액화 효소의 존재하에서 수성 액체 중에 액화시킨 후 (이 때, 분말기재의 적어도 일부는 수성 액체로의 연속식 또는 배치식 첨가로 액화됨), 1종 이상의 당화 효소를 사용하여 당화시킴으로써 수득되는 것인,

당-기재 미생물 발효에 의한, 3개 이상의 탄소 원자를 갖거나, 2개 이상의 탄소 원자와 1개 이상의 질소 원자를 갖는 1종 이상의 미생물 대사물의 제조 방법에 관한 것이다.

전분 공급원료로는 주로 전분의 양이 건조 상태로 40 중량％ 이상, 바람직하게는 50 중량％ 이상인 건조 인 또는 종자가 적합하다. 이는 현재 대규모로 재배되는 곡류 식물, 예를 들어 옥수수, 밀, 귀리, 보리, 호밀, 라이밀, 쌀 및 각종 사탕수수 및 기장 종, 예를 들어 소르고 및 마일로 등 다수에서 발견된다. 전분 공급원료는 곡류 인, 특히 바람직하게는 옥수수, 호밀, 라이밀 및 밀의 인 중에서 선택되는 것이 바람직하다. 원칙적으로, 본 발명에 따른 방법은 또한 다른 전분 공급원료, 예를 들어, 감자, 카사바/타피오카 또는 각종 전분-함유 과일 또는 종자의 혼합물로도 수행할 수 있다.

당-함유 액체 배지에 존재하는 당은 바람직하게는 단당류, 예를 들어 헥소스 및 펜토스, 예를 들어 글루코스, 프룩토스, 만노스, 갈락토스, 소르보스, 크실로스, 아라비노스 및 리보스, 특히 글루코스이다. 글루코스 이외의 단당류의 양은 사용되는 전분 공급원료 및 거기에 존재하는 비-전분 성분에 따라 달라질 수 있고, 이는 반응의 수행, 예를 들어 셀룰라제 첨가로 인한 셀룰로스 성분 분해에 의해 영향받을 수 있다. 당-함유 액체 배지 중의 단당류는 당-함유 액체 배지에 존재하는 당의 총량을 기준으로 60 중량％ 이상, 바람직하게는 70 중량％ 이상, 특히 바람직하게는 80 중량％ 이상의 양으로 글루코스를 포함하는 것이 유리하다. 보통, 글루코스 양은 당-함유 액체 배지에 존재하는 당의 총량을 기준으로 75 내지 99 중량％, 특히 80 내지 97 중량％, 구체적으로 85 내지 95 중량％ 범위이다.

본 발명에 따르면, 목적하는 대사 산물을 제조하는 미생물 균주가 배양되는 당-함유 액체 배지는 추출률에 따라, 분쇄된 곡류 인에 존재하는 비전분 고체 성분의 적어도 일부, 바람직하게는 20 중량％ 이상, 특히 50 중량％ 이상, 구체적으로 90 중량％ 이상, 매우 구체적으로 99 중량％ 이상을 포함한다. 분말기재 중의 전분 성분 (따라서 당-함유 액체 배지 중의 단당류의 양)을 기준으로, 당-함유 액체 배지 중의 비전분 고체 성분은 바람직하게는 10 중량％ 이상, 특히 25 중량％ 이상, 예를 들어 25 내지 75 중량％, 구체적으로 30 내지 60 중량％를 차지한다.

당-함유 액체 배지를 제조하기 위하여, 해당 전분 공급원료는 단계 a1)에서 액체, 예를 들어 물을 첨가하거나 첨가하지 않고, 바람직하게는 액체의 첨가 없이 분쇄한다. 건조 분쇄를 그 후의 습식-분쇄 단계와 통합하는 것도 가능하다. 건조 분쇄에 전형적으로 사용되는 기구는 해머 밀, 로터 밀 또는 롤러 크러셔이고, 이들 중 패들 혼합기, 교반 볼 밀, 순환 밀, 디스크 밀, 환상 챔버 밀, 진동 밀 또는 유성 밀이 습식 연마에 적합하다. 원칙적으로는 다른 밀도 적합하다. 습식 연마에 요구되는 액체의 양은 당업자가 일상적인 실험으로 결정할 수 있다. 이는 보통 건조 물질 함량이 10 내지 20 중량％ 범위이도록 조정된다.

연마를 통해 입도는 그 후의 가공 단계에 적합해진다. 이와 관련하여, 분쇄 단계, 특히 단계　a1)에서의 건조 분쇄 단계로 수득한 분말기재는 가루 입자, 즉, 입도가 100 내지 630　㎛인 미립자 성분을 30 내지 100 중량％, 바람직하게는 40 내지 95 중량％, 특히 바람직하게는 50 내지 90 중량％의 양으로 함유할 때 유익함이 증명되었다. 바람직하게는, 수득된 분말기재는 입도가 100　㎛ 초과인 가루 입자를 50 중량％ 포함한다. 대개, 수득된 가루 입자의 95 중량％ 이상은 입도가 2　mm 미만이다. 이와 관련하여, 입도는 진동 분석기를 이용하여 스크린 분석으로 측정한다. 원칙적으로, 작은 입도가 높은 제조 수율을 얻는다는 면에서 유익하다. 그러나, 지나치게 작은 입도는 액화 또는 가공 중에, 예를 들어 발효 단계 이후 고체를 건조하는 중에 분말기재가 슬러리화될 때 문제, 특히 덩어리 형성/응집으로 인한 문제를 일으킬 수 있다.

보통, 가루는 추출률 또는 가루 등급으로 특성화되며, 이들 서로의 상관관계는 추출률 증가에 따라 가루 등급의 특성이 증가된다는 것이다. 추출률은 적용된 분말기재 100　중량부를 기준으로 수득된 가루의 중량과 상관된다. 분쇄 공정 중, 예를 들어 곡류 인의 외부로부터 나온 순수한 초미세 가루가 처음에 수득되지만, 전분의 비율이 감소하면서 가루 중 조섬유(crude fiber) 및 외피(husk) 함량이 증가된다. 그러므로, 추출률은 가루 등급으로 알려진 것에 또한 반영되며, 상기 가루 등급은 가루, 특히 곡류 가루를 분류하기 위한 숫자로서 사용되고, 가루 중의 재 함량 (재 등급(ash grade)으로 알려짐)을 기준으로 한다. 가루 등급 또는 유형 번호는 가루 고체 100　g이 소각되는 경우 남아있는 재(무기물)의 mg 양을 나타낸다. 곡류 가루의 경우, 곡류 인의 코어는 대략 0.4 중량％의 재를 함유하는 반면, 외피는 대략 5 중량％의 재를 함유하기 때문에, 높은 유형 번호는 높은 추출률을 의미한다. 따라서, 낮은 추출률의 경우 곡류 가루는 세분된 배젖, 즉 곡류 인의 전분 함량으로 주로 이루어지고, 높은 추출률의 경우 곡류 가루는 또한 인의 세분된 단백질-함유 호분층을 포함하며, 조질 밀의 경우 이들은 단백질-함유 및 지방-함유 배아 및 원섬유 및 재를 포함하는 외피 성분을 포함한다. 본 발명의 목적상, 추출률이 높거나 유형 번호가 높은 가루가 원칙적으로 바람직하다. 곡류를 전분 공급원료로서 사용한다면, 그의 외피와 함께 그대로의 인을 분쇄하고 가공하는 것이 바람직하다.

적절하게는, 예를 들어 감자 또는 카사바와 같은 비교적 큰 물질을 사용하는 경우, 전분 공급원료를 분쇄 전에 분쇄에 적합한 크기로 세분할 것이다. 곡류의 경우, 상기 세분 단계 없이 수행할 수 있고 그대로의 인을 사용하고 분쇄한다.

분말기재에 존재하는 전분을 액화하기 위하여, 단계　a2)에서 분말기재의 적어도 일부, 바람직하게는 40 중량％ 이상, 특히 50 중량％ 이상, 매우 특히 바람직하게는 55 중량％ 이상을 액화 단계 중에 당화 단계 이전에 반응기에 혼입한다. 주로, 첨가량은 90 중량％, 특히 85 중량％, 특히 바람직하게는 80 중량％을 초과하지 않을 것이다. 바람직하게는, 상기 공정 중에 첨가되는 상기 분말기재 일부는 액화 단계 동안 우세한 것과 같은 조건 하에 반응기에 공급된다. 첨가는 배치식으로 즉, 몇 부분으로 조금씩 (각 경우에 바람직하게는 액화될 분말기재의 총량의 20 중량％ 이하, 특히 바람직하게는 10 중량％ 이하, 예를 들어 1 내지 20 중량％, 특히 2 내지 10 중량％의 양으로) 또는 연속적으로 수행할 수 있다. 본 발명의 경우, 액화 공정의 시작시 분말기재의 오직 일부, 바람직하게는 분말기재의 60 중량％ 이하, 특히 50 중량％ 이하, 특히 바람직하게는 45 중량％ 이하가 반응기에 존재하고, 분말기재의 나머지는 액화 단계 중에 첨가되는 것이 중요하다. 액화는 연속적으로, 예를 들어 다단계 반응 캐스케이드로 수행할 수도 있다.

본 발명에 따르면, 단계　a2)에서의 액화는 1종 이상의 전분-액화 효소, 바람직하게는 α-아밀라제로부터 선택된 효소의 존재하에 수행한다. 활성이며 반응 조건하에서 안정하고, 안정한 전분을 액화시키는 다른 효소도 마찬가지로 사용할 수 있다.

α-아밀라제 (또는 사용된 전분-액화 효소)는 먼저 반응 용기로 도입되거나, 단계　a2) 중에 첨가될 수 있다. 바람직하게는, 단계　a2)에서 요구되는 α-아밀라제의 일부가 단계　a2)의 시작시 첨가되거나, 처음에 반응기에 놓여진다. α-아밀라제의 총량은 사용된 전분 공급원료의 총량을 기준으로 보통 0.002 내지 3.0 중량％, 바람직하게는 0.01 내지 1.5 중량％, 특히 바람직하게는 0.02 내지 0.5 중량％의 범위이다.

액화는 겔화 온도 초과 또는 미만에서 수행할 수 있다. 바람직하게는, 단계　a2)에서의 액화는 사용된 전분의 겔화 온도 초과에서 적어도 일부 수행한다 (요리 과정으로 알려져 있음). 대개, 70 내지 165℃, 바람직하게는 80 내지 125℃, 특히 바람직하게는 85 내지 115℃ 범위의 온도를 선택하며, 상기 온도는 바람직하게는 겔화 온도보다 적어도 5℃ 초과, 특히 바람직하게는 적어도 10℃ 초과이다.

최적의 α-아밀라제 활성을 달성하기 위하여, 단계　a2)는 바람직하게는 약산성 범위인 pH, 바람직하게는 4.0 내지 7.0, 특히 바람직하게는 5.0 내지 6.5에서 적어도 일부 수행하며, pH는 보통 단계　a2)를 시작하기 전에 또는 시작할 때 조정하고, 바람직하게는 상기 pH를 액화 중에 점검하고, 적절하게는 재조정한다. pH는 바람직하게는 H₂SO₄ 또는 H₃PO₄와 같은 희석 무기산 또는 NaOH 또는 KOH와 같은 희석 알칼리 수산화물 용액을 이용하여 조정한다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법의 단계　a2)는 분말기재의 총량을 기준으로 60 중량％ 이하, 바람직하게는 50 중량％ 이하, 특히 바람직하게는 45 중량％ 이하, 예를 들어 10 내지 60 중량％, 특히 15 내지 50 중량％, 특히 바람직하게는 20 내지 45 중량％의 양에 해당하는 일부를 초기에 수성 액체, 예를 들어 신선한 물, 예를 들어 발효 또는 가공 단계로부터 재순환된 공정수, 또는 이들 액체의 혼합물 중에 현탁시키는 방식으로 수행하고, 그 후 액화를 수행한다.

본 발명에 따른 방법을 수행하기 위하여, 현탁액 생성에 사용되는 액체를 온화하게 증가된 온도, 예를 들어 40 내지 60℃ 범위로 예비가열하는 것이 가능하다. 그러나, 액체를 실온에서 사용하는 것이 바람직하다.

그 후, 1종 이상의 전분-액화 효소, 바람직하게는 α-아밀라제를 상기 현탁액에 첨가한다. α-아밀라제를 사용하는 경우, α-아밀라제의 일부, 예를 들어 단계　a2)에서 사용된 α-아밀라제 전량을 기준으로 10 내지 70 중량％, 특히 20 내지 65 중량％를 첨가하는 것만이 유익하다. 이 시점에서 첨가되는 α-아밀라제의 양은 사용되는 전분 공급원료와 관련된 반응 조건 하에서 해당 α-아밀라제의 활성에 따라 달라지며, 일반적으로 사용되는 전분 공급원료의 총량을 기준으로 0.0004 내지 2.0 중량％, 바람직하게는 0.001 내지 1.0 중량％, 특히 바람직하게는 0.02 내지 0.3 중량％의 범위이다. 별법으로, α-아밀라제 부분을 현탁액을 제조하기 전에 사용되는 액체와 혼합할 수 있다.

이와 관련하여, α-아밀라제 부분은 액화에 사용되는 온도로 가열하기 전에, 특히 실온 또는 단지 온화하게 증가된 온도, 예를 들어 20 내지 30℃ 범위에서 첨가하는 것이 바람직하다.

유리하게는, α-아밀라제 및 분말기재의 양은, 현탁액의 혼합, 예를 들어 교반에 의한 혼합이 효과적일 수 있도록 겔화 공정 중의 점도가 충분히 감소되는 방식으로 선택될 것이다. 바람직하게는, 겔화 중의 반응 혼합물의 점도는 20　Pa·s 이하, 특히 바람직하게는 10　Pa·s 이하, 매우 특히 바람직하게는 5　Pa·s 이하의 양이다. 대개, 점도는 50℃의 온도 및 200　s^-1의 전단율에서 M5 측정 시스템 및 MVDIN 수단을 구비한 하아케(Haake) 점도계 유형 로토 비스코(Roto　Visko)　RV20을 이용하여 측정한다.

그 후, 이렇게 제조된 현탁액을 바람직하게는 사용된 전분의 겔화 온도보다 높은 온도에서 가열한다. 대개, 70 내지 165℃, 바람직하게는 80 내지 125℃, 특히 바람직하게는 85 내지 115℃ 범위의 온도를 선택하며, 상기 온도는 겔화 온도보다 적어도 5℃ 초과의 온도가 바람직하고, 적어도 10℃ 초과의 온도가 특히 바람직하다. 점도를 모니터링하는 동안, 전분 공급원료의 추가 부분, 예를 들어 각 경우에 사용된 전분 전량을 기준으로 2 내지 20 중량％, 특히 5 내지 10 중량％를 전분-함유 현탁액에 점차적으로 첨가한다. 분말기재의 일부를 액화 단계 동안 2개 이상, 바람직하게는 4개 이상, 특히 바람직하게는 6개 이상의 소부분으로 반응 혼합물에 첨가하는 것이 바람직하다. 별법으로, 현탁액 제조에 사용되지 않은 분말기재의 부분을 액화 단계 중에 연속적으로 첨가할 수 있다. 이 첨가 중에, 온도는 유리하게는 전분의 겔화 온도보다 높도록 유지해야 한다.

가루를 모두 첨가한 후, 반응 혼합물을 보통 소정의 시간 동안, 예를 들어 30 내지 60분 이상 동안, 필요하다면 전분의 겔화 온도보다 높은 온도에서 방치, 즉 요리한다. 그 후, 반응 혼합물을 대개 겔화 온도보다 약간 적게 상승된 온도로, 예를 들어 75 내지 90℃로 냉각시킨 후, 추가의 α-아밀라제 부분, 바람직하게는 주요 부분을 첨가한다. 사용된 α-아밀라제의 반응 조건 하에서의 활성에 따라, 이 시점에서 사용되는 α-아밀라제의 양은 사용되는 전분 공급원료의 총량을 기준으로 바람직하게는 0.002 내지 2.0 중량％, 특히 바람직하게는 0.01 내지 1.0 중량％, 매우 특히 바람직하게는 0.02 내지 0.4 중량％이다.

상기 온도에서, 전분의 과립 구조가 파괴되어 (겔화), 이의 효소 분해가 가능해진다. 전분을 덱스트린으로 완전히 파괴하기 위하여, 반응 혼합물을 설정된 온도에 두거나, 요오드 또는 적절하게는 전분 검출을 위한 다른 시험을 통해 전분의 검출이 음성이거나 최소한 본질적으로 음성일 때까지 적절하게는 추가 가열한다. 적절하게는, 이 때 하나 이상의 추가의 α-아밀라제 부분, 예를 들어 사용되는 전분 공급원료의 총량을 기준으로 0.001 내지 0.5 중량％, 바람직하게는 0.002 내지 0.2 중량％ 범위의 α-아밀라제 부분을 반응 혼합물에 첨가할 수 있다.

전분 액화가 종결된 후, 액체 배지에 존재하는 덱스트린을 연속식 또는 배치식으로, 바람직하게는 연속적으로 당화시킨다, 즉, 글루코스로 분해한다. 액화된 배지를 발효 단계 (b)로 공급하기 전에 특정 당화 탱크에서 연속적으로 당화시킬 수 있다. 반면, 발효 전에 오직 부분적인 당화만을 수행하는 것이 유익함이 입증되었다. 예를 들면, 액체 배지에 존재하는 덱스트린의 일부, 예를 들어 덱스트린 (또는 원래의 전분)의 총 중량을 기준으로 10 내지 90 중량％, 특히 20 내지 80 중량％ 범위를 당화시키고 생성된 당-함유 액체 배지를 발효에 사용하는 절차가 이후에 수반될 수 있다. 그 후, 추가의 당화가 발효 배지에서 동일 계내 수행될 수 있다. 또한, 당화는 별도의 당화 탱크 없이 발효기에서 직접 수행될 수 있다 (동일 계내).

동일 계내 당화, 즉, 발효기에서 부분적으로 또는 전부 수행되는 당화의 잇점은 첫째로 감소된 자본 지출이며, 둘째로, 글루코스가 지연 방출되므로 미생물의 억제 또는 대사 변화가 일어나지 않으면서 보다 높은 글루코스 농도를 초기에 배치로 제공한다는 것이다. 예를 들어, 이. 콜라이(E. coli)의 경우, 지나치게 높은 글루코스 농도로 인해 유기산 (아세테이트)이 형성되지만, 예를 들어, 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)는 이러한 경우 충분한 산소가 공기혼입된 발효기에 존재할지라도 발효로 전환된다 (크라브트리(Carbtree) 효과). 글루코스의 지연 방출은 글루코아밀라제 농도를 조절함으로써 조정할 수 있다. 이렇게 함으로써, 상기언급된 효과를 억제하는 것이 가능하고, 더 많은 기질이 초기에 공급될 수 있어 공급 스트림으로 인한 희석이 감소될 수 있다.

당화 탱크에서의 당화의 경우, 액화된 전분 용액을 보통 당화 효소의 최적 온도 또는 그의 약간 아래, 예를 들어 50 내지 70℃, 바람직하게는 60 내지 65℃로 냉각 또는 가온하고, 그 후 글루코아밀라제로 처리한다.

당화를 발효기에서 수행한다면, 액화된 전분 용액은 대개 발효 온도, 즉, 32 내지 37℃로 냉각된 후, 발효기로 공급될 것이다. 이 경우, 당화를 위한 글루코아밀라제 (또는 1종 이상의 당화 효소)를 발효액에 직접 첨가한다. 여기서, 단계　a2)에 따른 액화된 전분의 당화는 단계　b)에서 기재한 바와 같은 미생물에 의한 당의 대사와 병행하여 수행된다.

글루코아밀라제의 첨가 전에, 액체 배지의 pH를 사용된 글루코아밀라제의 최적 활성 범위인 값으로, 바람직하게는 3.5 내지 6.0, 특히 바람직하게는 4.0 내지 5.5, 매우 특히 바람직하게는 4.0 내지 5.0 범위로 조정하는 것이 유리하다. 그러나, 특히 발효기에서 직접 당화를 수행하는 경우에는, pH를 상기언급된 범위 외의 값, 예를 들어 6.0 내지 8.0 범위로 조정하는 것도 가능하다. 이는 일반적으로 유익하거나, 또는 그 pH 범위에서 표준 글루코아밀라제의 활성이 제한됨에도 불구하고 예를 들어 리신, 판토테네이트 및 비타민 B₂의 제조시 확립될 발효 조건에 따라 요구될 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 당화를 특정 당화 탱크에서 수행한다. 이를 위해, 액화된 전분 용액을 효소에 최적인 온도로 또는 약간 아래로 가온하고, pH를 효소에 최적인 값으로 상기 기재된 방식에 따라 조정한다.

보통, 글루코아밀라제는 사용되는 전분 공급원료의 총량을 기준으로 0.001 내지 5.0 중량％, 바람직하게는 0.005 내지 3.0 중량％, 특히 바람직하게는 0.01 내지 1.0 중량％의 양으로 덱스트린-함유 액체 배지에 첨가한다. 글루코아밀라제의 첨가 후, 필요하다면, 덱스트린이 당화되어 단당류를 생성하도록 덱스트린-함유 현탁액을 설정된 온도에서 예를 들어 2 내지 72시간 이상, 특히 5 내지 48시간의 기간 동안 방치하는 것이 바람직하다. 당화 공정의 진행을 당업자에게 공지된 방법, 예를 들어 HPLC, 효소 분석 또는 글루코스 시험 스트립(strip)을 이용하여 모니터링할 수 있다. 단당류 농도가 더이상 실질적으로 올라가지 않거나 사실상 떨어진다면 당화가 완료된 것이다.

바람직한 실시양태에서, 단계　a2)에서 1종 이상의 α-아밀라제 및 1종 이상의 글루코아밀라제의 존재하에서, 분말기재의 비연속식 또는 연속식 첨가, 바람직하게는 비연속식, 특히 조금씩의 첨가를 액체 배지의 점도가 20　Pa·s 이하, 바람직하게는 10　Pa·s 이하, 특히 바람직하게는 5　Pa·s 이하이도록 수행한다. 점도 제어를 보조하기 위하여, 분말기재에 존재하는 전분의 젤라틴화 온도보다 높은 온도에서, 첨가된 분말기재의 총량의 25 중량％ 이상, 바람직하게는 35 중량％ 이상, 특히 바람직하게는 50 중량％ 이상을 첨가하는 것이 유익함이 입증되었다. 더욱이, 점도 제어는 1종 이상의 전분-액화 효소, 바람직하게는 α-아밀라제 및/또는 1종 이상의 당화 효소, 바람직하게는 글루코아밀라제를 조금씩 첨가함으로써 추가로 수행할 수 있다.

단계　a1) 및 a2)를 실시함으로써, 단당류 함량이 바람직하게는 30 중량％ 초과, 특히 바람직하게는 35 중량％ 초과, 매우 특히 바람직하게는 40 중량％ 초과인 당-함유 액체를 제조하는 것이 가능하다.

분말기재 중의 전분 부분을 액화시키기 위해 사용될 수 있는 효소는 원칙적으로 모든 α-아밀라제 (효소 등급 EC　3.2.1.1), 특히 바실러스 리켄포르미스(Bacillus lichenformis) 또는 바실러스 스타애로테르모필러스(Bacillus staerothermophilus)로부터 수득한 α-아밀라제 및 구체적으로는 바이오에탄올의 제조과 관련하여 건조 분쇄 방법에 의해 수득한 물질의 액화에 사용되는 것이다. 액화에 적합한 α-아밀라제는 또한 예를 들어 테르마밀(Termamyl)　120　L, 유형　L이란 이름으로 노보자임스(Novozymes)에서 시판하거나, 스페자임(Spezyme)이란 이름으로 제넨코어(Genencor) 에서 시판한다. 상이한 α-아밀라제들의 조합 또한 액화에 사용할 수 있다.

액화된 전분 용액 중의 덱스트린 (즉, 올리고당)의 당화에 사용할 수 있는 효소는 원칙적으로 모든 글루코아밀라제 (효소 등급 EC　3.2.1.3), 특히 아스페르길러스(Aspergilus)로부터 수득한 글루코아밀라제 및 구체적으로는 바이오에탄올의 제조과 관련하여 건조 분쇄 방법에 의해 수득한 물질의 액화에 사용되는 것이다. 당화에 적합한 글루코아밀라제는 또한 예를 들어 덱스트로자임 (Dextrozyme)　GA란 이름으로 노보자임스에서 시판하거나, 옵티덱스(Optidex)란 이름으로 제넨코어에서 시판한다. 상이한 글루코아밀라제들의 조합 또한 사용할 수 있다.

사용된 효소를 안정화시키기 위하여, Ca²⁺ 이온의 농도를 적절하게는 예를 들어 CaCl₂를 이용하여 효소-특이적 최적값으로 조정할 수 있다. 적합한 농도 값은 당업자가 일상적인 실험으로 결정할 수 있다. 예를 들어, 테르마밀을 α-아밀라제로서 사용한다면, 액체 배지에서 Ca²⁺ 농도를 예를 들어 50 내지 100　ppm, 바람직하게는 60 내지 80　ppm, 특히 바람직하게는 약 70　ppm으로 조정하는 것이 유익하다.

모든 전분 공급원료 (예를 들어 곡류의 경우 전체의 인)가 a)의 당-함유 액체 배지의 제조에 사용되기 때문에, 전분 공급원료의 비-전분 고체 성분 또한 존재한다. 이는 종종 곡류로부터의 소정량의 피테이트의 도입을 유발시키는데, 이 양을 간과해서는 안된다. 이렇게 유발되는 억제 효과를 피하기 위하여, 당-함유 액체 배지를 발효 단계　b)에 적용시키기 전에, 단계　a2)에서 1종 이상의 피타제를 액체 배지에 첨가하는 것이 유익하다.

피타제는 각각의 높은 온도에서 충분히 안정하다면 액화 또는 당화 전에, 그 중에 또는 후에 첨가할 수 있다.

각각의 경우 피타제의 활성이 반응 조건하에서 영향을 받는 한계치 이하라면 임의의 피타제를 사용할 수 있다. 사용되는 피타제는 바람직하게는 50℃ 초과, 특히 바람직하게는 60℃ 초과의 열 안정성 (T50)을 갖는다.

피타제의 양은 보통 전분 공급원료 1 kg 당 1 내지 10　000　단위, 특히 전분 공급원료 1 kg 당 10 내지 2000　단위이다.

전체적인 당 수율을 증가시키기 위하여 또는 유리 아미노산을 수득하기 위하여, 추가의 효소, 예를 들어 풀룰라나제, 셀룰라제, 헤미셀룰라제, 글루카나제, 크실라나제, 글루코시다제 또는 프로테아제를 당-함유 액체 배지의 제조 중에 반응 혼합물에 더 첨가할 수 있다. 이들 효소의 첨가는 점도에 대해 양의 효과를 가질 수 있고, 즉, 점도를 감소시킬 수 있고 (예를 들어 장쇄 글루칸 및/또는 (아라비노-)크실란을 절단함으로써), 대사가능한 글루코시드의 유리 및 (잔류) 전분의 유리를 야기시킨다. 프로테아제의 사용은 유사한 양의 효과를 가지며, 이는 추가로 발효에 대한 성장 인자로서 작용하는 아미노산을 유리시킬 수 있다.

당-함유 액체 배지는 3개 이상의 탄소 원자 또는 2개 이상의 탄소 원자와 1개 이상의 질소 원자를 갖는 미생물 대사물의 발효 제조에 유리할 수 있다. 상기 목적을 위하여, 단계　a)에서 제조된 당-함유 액체 배지를 b)에 기재된 바와 같이 발효시킨다. 발효에서, 정밀 화학물질, 즉, 3개 이상의 탄소 원자 및/또는 2개 이상의 탄소 원자와 1개 이상의 질소 원자를 갖는 화합물이 미생물에 의해 제조된다. 대개, 발효 과정은 당업자에게 공지된 통상적인 방식으로 수행할 수 있다. 공급된 당-함유 액체 배지와 미생물을 함유하며 처음에 도입된 액체 배지의 부피비는 일반적으로 대략 1:10 내지 10:1 범위, 예를 들어 대략 1:2 또는 대략 2:1, 특히 대략 1:1이다. 발효액에서의 당 함량은 특히 당-함유 액체 배지의 공급률을 통해 조절할 수 있다. 대개, 공급률은 발효액 중의 단당류 함량이 0 중량％ 이상 내지 대략 5 중량％의 범위이도록 조정될 것이나, 발효액 중의 현저히 높은 단당류 함량, 예를 들어 대략 10 내지 20 중량％에서 발효를 수행할 수도 있다.

당화 및 발효를 동시에 수행한다면, 단계 a)에서 제조된 당-함유 액체 배지를 적절하게는 발효시키기 전에 멸균하여, 이 과정 동안 미생물을 열, 화학적 또는 기계적 방법으로 파괴할 수 있다. 이를 위해, 액체를 보통 80℃ 초과의 온도에서 가열한다. 세포의 파괴 또는 용균은 발효 직전에 수행할 수 있다. 이를 위해, 당-함유 액체 배지 전부를 용균하거나 파괴한다. 이는 열, 화학적 또는 기계적 수단으로 수행할 수 있다. 그러나, 본 발명에 따른 방법의 목적상, 본원에 기재된 바와 같이 발효 전에 멸균 단계를 수행하는 것은 필수적인 것이 아님이 입증되었고, 오히려, 이러한 멸균 단계를 수행하지 않는 것이 유익함이 입증되었다. 따라서, 본 발명의 바람직한 실시양태는 단계 a)에서 제조된 액체 배지를 직접, 즉, 이전의 멸균 없이 발효시키거나, 당화를 동일 계내에서 적어도 부분적으로 수행하는 방법에 관한 것이다.

발효에 의해, 목적하는 비휘발성 미생물 대사 산물 이외에, 발효 중에 제조된 생물자원, 당화된 전분 용액의 미대사 성분, 및 특히 전분 원료의 비전분 고체 성분, 예를 들어, 섬유 및 이용되지 않은 당 뿐만 아니라 이용되지 않은 완충염 염 및 영양 염류를 필수적으로 포함하는 액체 배지가 생성된다. 상기 액체 배지는 또한 본 출원에서 발효액이라 언급되며, 발효액이라는 용어는 또한 존재하는 당의 초기의 부분적이거나 불완전한 발효적 전환, 즉, 단당류의 부분적이거나 불완전한 미생물 대사가 발생한 (당-함유) 액체 배지를 포함한다.

이하, 정밀 화학물질이라는 용어는 특히 바람직하게는 3 내지 10개의 탄소 원자를 갖고, 적절하게는 상기 탄소 원자에 부착된 하나 이상의, 예를 들어 1, 2, 3 또는 4개의 히드록실기를 갖는 유기 모노-, 디- 및 트리카르복실산, 예를 들어 타르타르산, 이타콘산, 숙신산, 푸마르산, 말레산, 2,5-푸란디카르복실산, 3-히드록시프로피온산, 글루타르산, 레불산, 락트산, 프로피온산, 글루콘산, 아코니트산 및 디아미노피멜산, 시트르산; 단백질생성 및 비단백질생성 아미노산, 예를 들어 리신, 글루타메이트, 메티오닌, 페닐알라닌, 아스파르트산, 및 트레오닌; 퓨린 및 피리미딘 염기; 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드, 예를 들어 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NAD) 및 아데노신-5'-모노포스페이트 (AMP); 지질; 바람직하게는 10 내지 22개의 탄소 원자를 갖는 포화 및 불포화 지방산, 예를 들어 γ-리놀렌산, 디호모-γ-리놀렌산, 아라키돈산, 에이코사펜타엔산 및 도코사헥사엔산; 바람직하게는 3 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 디올, 예를 들어 프로판디올 및 부탄디올; 3개 이상, 예를 들어 3, 4, 5 또는 6개의 OH기를 갖는 고-관능성 알콜, 예를 들어 글리세롤, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨 및 아라비니톨; 4개 이상의 탄소 원자, 예를 들어 4 내지 22개의 탄소 원자를 갖는 장쇄 알콜, 예를 들어 부탄올; 탄수화물, 예를 들어 히알루론산 및 트레할로스; 방향족 화합물, 예를 들어 방향족 아민, 바닐린 및 인디고; 비타민 및 프로비타민, 예를 들어 아스코르브산, 비타민　B₆, 비타민　B₁₂ 및 리보플라빈, 조인자 및 기능식품으로 알려진 것; 단백질, 예컨대 효소, 예를 들어 피타제, 크실라나제 및 글루코나제; 카로티노이드, 예를 들어 리코펜, β-카로틴, 아스타잔틴, 제아잔틴 및 칸타잔틴; 바람직하게는 3 내지 10개의 탄소 원자 및 적절하게는, 1개 이상의 히드록실기를 갖는 케톤, 예를 들어 아세톤 및 아세토인; 락톤, 예를 들어 γ-부티로락톤, 시클로덱스트린, 생중합체, 예를 들어 폴리히드록시아세테이트, 폴리에스테르, 다당류, 폴리이소프레노이드, 폴리아미드, 폴리히드록시알카노에이트, 예를 들어 폴리-3-히드록시부티르산 및 다른 유기 히드록시카르복실산, 예컨대 3-히드록시-발레르산, 4-히드록시부티르산 및 문헌 [Steinbuehel (Ed.), Biopolymers, 1st　Ed., 2003, Wiley-VCH, Weinheim] 및 이 문헌에서 인용된 문헌에 기재된 다른 것과의 코폴리에스테르; 및 상기언급된 화합물의 전구물질 및 유도체를 포함한다. 정밀 화학물질로서 적합한 다른 화합물은 문헌 [Gutcho, Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation (1973), ISBN:　0818805086]에 기재되어 있다.

용어 "조인자"는 정상 효소 활성이 발생하기 위해 요구되는 비단백질생성 화합물을 포함한다. 이들 화합물 유기물이거나 무기물일 수 있고, 바람직하게는 본 발명의 조인자 분자는 유기물이다. 이러한 분자의 예는 NAD 및 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트 (NADP)이고, 상기 조인자의 전구체는 니아신이다.

용어 "기능식품"은 식물 및 동물, 특히 인간의 건강을 향상시키는 식품 첨가제를 포함한다. 이러한 분자의 예는 비타민, 항산화제 및 특정 지질, 예를 들어 다중불포화 지방산이다.

특히, 제조되는 대사 산물은 효소, 아미노산, 비타민, 이당류, 탄소 원자수 3 내지 10의 지방족 모노- 및 디카르복실산, 탄소 원자수 3 내지 10의 지방족 히드록시카르복실산, 탄소 원자수 3 내지 10의 케톤, 탄소 원자수 4 내지 10의 알칸올, 탄소 원자수 3 내지 8의 알칸디올 및 폴리히드록시알카노에이트로부터 선택된다.

본 발명에 따라 발효적 경로를 통해 제조된 화합물은 각각의 경우 사용된 미생물에 의해 제조된 거울상이성질체 형태로 수득된다는 것은 당업자에게 명백하다 (다른 거울상이성질체가 존재하는 경우). 예를 들어, 아미노산의 경우, 대개 얻어지는 것은 각각의 L 거울상이성질체이다.

본 발명에 따른 방법은 비휘발성 미생물 대사물의 제조에 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 목적상, 비휘발성 대사물은 일반적으로 분해되지 않고는 발효액으로부터의 증류로 제거할 수 없는 화합물을 의미하는 것으로 이해된다. 대개, 이들 화합물의 비등점은 대기압에서 물의 비등점보다 높고, 종종 150℃ 초과, 특히 200℃ 초과이다. 대개, 이들은 표준 조건 (298 K, 101·3 kPa)하에서 고체 상태인 화합물이다.

그러나, 표준 조건하에서 물의 비등점보다 낮은 융점 및/또는 오일성 밀도를 갖는 비휘발성 미생물 대사 산물의 제조를 위해서도 본 발명에 따른 방법을 사용하는 것이 가능하다. 이 경우, 대개 최대 온도는 후처리 중에, 특히 건조 중에 제어될 것이다. 상기 화합물은 유리하게는 흡착제 상에 사실상 고체 형태 (유사-고체 형태)로 제제화되는 방식으로 제조할 수 있다. 이러한 경우, 발효액의 고체 성분은 단계 c)에 따른 관심 생성물의 단리 전에 제거될 것이다.

상기 목적에 적합한 흡수제는 예를 들어 활성탄, 알루미나, 실리카 겔, 규산, 점토, 그을음, 제올라이트, 무기 알칼리 금속 및 알칼리 토금속 염, 예컨대 나트륨, 칼륨, 마그네슘 및 칼슘의 수산화물, 탄산염, 규산염, 황산염 및 인산염, 특히 마그네슘염 및 칼슘염, 예를 들어 Mg(OH)₂, MgCO₃, MgSiO₄, CaSO₄, CaCO₃, 알칼리 토금속 산화물, 예를 들어 MgO 및 CaO, 기타 무기 인산염 및 황산염, 예를 들어 ZnSO₄, 유기산의 염, 특히 그의 알칼리 금속 및 알칼리 토금속 염, 구체적으로 그의 나트륨 및 칼륨 염, 예를 들어 아세트산나트륨, 포름산나트륨, 포름산수소나트륨, 시트르산나트륨, 아세트산칼륨, 포름산칼륨, 포름산수소칼륨 및 시트르산칼륨 및 고분자량 유기 담체, 예컨대 탄수화물, 예를 들어 당, 임의로 개질된 전분, 셀룰로스, 리그닌, 및 일반적으로 생성물 형성과 관련하여 상기 언급한 담체 물질이다. 대개, 상기 언급한 담체 물질은 염화 이온과 같은 할로겐 및 질산염을 매우 적은 양으로, 특히 미량으로만 함유하거나 전혀 함유하지 않을 것이다.

표준 조건하에서 물의 비등점보다 낮은 융점 및/또는 오일성 밀도를 가지며 본 발명에 따른 방법에 의해 상기 방식으로 유리하게 제조할 수 있는 화합물의 예는 γ-리놀렌산, 디호모-γ-리놀렌산, 아라키돈산, 에이코사펜타엔산 및 도코사헥사엔산, 추가로 프로피온산, 락트산, 프로판디올, 부탄올 및 아세톤이다. 본 발명의 의미 내에서는, 유사-고체 제형인 이들 화합물도 고체 형태인 비휘발성 미생물 대사물로 간주한다.

발효에 사용되는 미생물은 하기 상세히 설명하는 바와 같이 그 자체로 공지된 방식으로 해당 정밀 화학물질에 의존한다. 이들은 자연 발생되거나 유전적으로 변형될 수 있다. 적합한 미생물 및 발효 방법의 예는 하기 표 A에 제시한 것이다:

본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태는 효소, 예컨대 피타제, 크실라나제, 글루카나제; 아미노산, 예컨대 리신, 메티오닌, 트레오닌; 비타민, 예컨대 판토텐산 및 리보플라빈; 이들의 전구체 및 유도체의 생산; 및 상기 언급된 모노-, 디- 및 트리카르복실산, 특히 3 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 지방족 모노- 및 디카르복실산, 예컨대 프로피온산 및 숙신산, 3 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 지방족 히드록시카르복실산, 예컨대 락트산; 상기 언급된 장쇄 알칸올, 특히 4 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 알칸올, 예컨대 부탄올; 상기 언급된 디올, 특히 3 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 알칸디올, 예컨대 프로판디올; 상기 언급된 케톤, 특히 3 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 케톤, 예컨대 아세톤; 상기 언급된 탄수화물, 특히 이당류, 예컨데 트레할로스; 및 폴리히드록시알카노에이트의 생산에 관한 것이다.

따라서, 바람직한 실시양태, 발효에 사용되는 미생물은 하기 대사물 중 1종 이상을 생산하는 천연 또는 재조합 미생물 사이에서 선택된다: 효소, 예컨대 피타제, 크실라나제, 글루카나제; 아미노산, 예컨대 리신, 트레오닌, 메티오닌; 비타민 예컨대 판토텐산 및 리보플라빈; 이들의 전구체 및/또는 유도체; 이당류, 예컨대 트레할로스; 특히 3 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 지방족 모노- 및 디카르복실산, 예컨대 프로피온산 및 숙신산, 3 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 지방족 히드록시카르복실산, 예컨대 락트산; 3 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 케톤, 예컨대 아세톤; 4 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 알칸올, 예컨대 부탄올; 3 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 알칸디올, 예컨대 프로판디올; 및 폴리히드록시알카노에이트.

특히, 미생물은 속 코리네박테리움(Corynebacterium), 바실러스(Bacillus), 아쉬비아(Ashbya), 에쉐리키아(Escherichia), 아스페르길러스(Aspergillus), 알칼리게네스(Alcaligenes), 악티노바실러스(Actinobacillus), 아나에로비오스피릴룸(Anaerobiospirillum), 락토바실러스(Lactobacillus), 프로피오니박테리움(Propionibacterium) 및 클로스트리듐(Clostridium)로부터, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 아쉬비아 고시피(Ashbya gossypii), 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli), 아스페르길러스 니게르(Aspergillus niger) 또는 알칼리게네스 라투스(Alcaligenes latus), 아나에로비오스피릴룸 숙시니프로두센스(Anaerobiospirillum succiniproducens), 악티노바실러스 숙시노게네스(Actinobacillus succinogenes), 락토바실러스 델브뤽키(Lactobacillus delbruekii), 락토바실러스 레이크만니(Lactobacillus leichmanni), 프로피오니박테리움 아라비노숨(Propionibacterium arabinosum), 프로피오니박테리움 쉐르마니(Propionibacterium schermanii), 프로피오니박테리움 프레우덴레이치(Propionibacterium freudenreichii), 클로스트리듐 프로피오니쿰(Clostridium propionicum) 및 클로스트리듐 아세토부틀리쿰(Clostridium acetobutlicum)의 종 중에서 선택된다.

특정 바람직한 실시양태에서, 발효시 미생물에 의해 생성되는 대사물은 리신이다. 발효를 수행하기 위해, 다른 탄소 공급원료에 대해 기재된, 예를 들어 문헌 [Pfefferle et al., loc. cit.] 및 US　3,708,395에 기재된 것과 유사한 조건 및 절차를 이용할 수 있다. 이론상, 연속식 및 비연속식 (배치식 또는 공급-배치식) 작동 방식이 적합하고, 공급-배치식 방식이 바람직하다.

추가의 특히 바람직한 실시양태에서, 발효시 미생물에 의해 생성되는 대사물은 메티오닌이다. 발효를 수행하기 위해, 다른 탄소 공급원료에 대해 기재된, 예를 들어 WO　03/087386 및 WO　03/100072에 기재된 것과 유사한 조건 및 절차를 이용할 수 있다.

추가의 특히 바람직한 실시양태에서, 발효시 미생물에 의해 생성되는 대사물은 판토텐산이다. 발효를 수행하기 위해, 다른 탄소 공급원료에 대해 기재된, 예를 들어 WO　01/021772에 기재된 것과 유사한 조건 및 절차를 이용할 수 있다.

추가의 특히 바람직한 실시양태에서, 발효시 미생물에 의해 생성되는 대사물은 폴리히드록시알카노에이트, 예컨대 폴리-3-히드록시부티레이트, 및 다른 유기 히드록시카르복실산, 예컨대 3-히드록시발레르산, 4-히드록시부티르산 및 예를 들어 3-히드록시옥탄산, 3-히드록시데칸산 및 3-히드록시테트라데칸산과 같은 장쇄 히드록시카르복실산을 비롯한 문헌 [Steinbuechel (loc. cit.)]에 기재된 다른 유기 카르복실산과의 코폴리에스테르, 및 이들의 혼합물 형태를 취한다. 발효를 수행하기 위해, 다른 탄소 공급원료에 대해 기재된, 예를 들어 문헌 [S.Y.　Lee, Plastic Bacteria Progress and prospects for polyhydroxyalkanoate production in bacteria, Tibtech, Vol.　14, (1996), pp.　431-438]에 기재된 것과 유사한 조건 및 절차를 이용할 수 있다.

추가의 특히 바람직한 실시양태에서, 발효시 미생물에 의해 생성되는 대사물은 리보플라빈이다. 발효를 수행하기 위해, 다른 탄소 공급원료에 대해 기재된, 예를 들어 WO　01/011052, DE　19840709, WO　98/29539, EP　1186664 및 문헌 [Fujioka,　K: New biotechnology for riboflavin (vitamin B2) and character of this riboflavin. Fragrance Journal (2003), 31(3), 44-48]에 기재된 것과 유사한 조건 및 절차를 이용할 수 있다.

추가의 특히 바람직한 실시양태에서, 발효시 미생물에 의해 생성되는 대사물은 피타제이다. 발효를 수행하기 위해, 다른 탄소 공급원료에 대해 기재된, 예를 들어 WO 98/55599에 기재된 것과 유사한 조건 및 절차를 여기에 이용할 수도 있다.

적절하게는, 발효액을 추가로 처리하기 전에 (즉, 단계 (c) 전에) 상기 기재된 방식으로 멸균 단계를 수행한다.

단계 c)에 따라 발효액으로부터의 대사물의 단리는 대체적으로 남아있는 발효액 중 상기 대사물의 함량이 남아있는 발효액의 총량을 기준으로 하여 각 경우에 20 중량％ 이하, 특히 10 중량％ 이하, 구체적으로는 5 중량％ 이하, 매우 구체적으로는 2.5 중량％ 이하의 양이 되는 방식으로 1종 이상의 대사물이 발효액으로부터 단리되는 방식으로 수행된다.

단계 c)에 따라 정밀 화학물질 (즉, 미생물 대사물)의 단리는 하나 이상의 단계로서 수행할 수 있다. 당해의 필수 단계는 발효액으로부터 고체 성분을 제거하는 것이다. 이는 가치있는 생성물을 단리하기 전에 또는 후에 수행할 수 있다. 가치있는 생성물의 간단 세척 및 정밀 정제 단계를 또한 포함하는, 당업계에서 통상적으로 사용하는 방법은 가치있는 생성물의 단리 및 고체의 제거, 즉 고체-액체 상 분리 둘다를 위해 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Belter,　P.A, Bioseparations: Downstream processing for Biotechnology, John Wiley ＆, Sons (1988)], 및 [Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 5th　ed. on CD-ROM, Wiley-VCH]에 기재되어 있음).

가치있는 생성물을 단리하기 위해, 먼저 고체 성분을 발효액으로부터, 예를 들어 원심분리 또는 여과에 의해 제거하고, 후속적으로 가치있는 생성물을 액체상으로부터, 예를 들어 결정화, 침전, 흡착 또는 증류에 의해 단리하는 절차를 유리하게 수행할 수 있다. 별법으로, 가치있는 생성물은 또한 발효액으로부터, 예를 들어 크로마토그래피 방법 또는 추출 방법을 사용하여 직접 단리할 수 있다. 언급해야 하는 크로마토그래피 방법은, 특히 가치있는 생성물을 크로마토그래피 컬럼 상에서 선택적으로 단리할 수 있는 이온-교환 크로마토그래피이다. 이 경우, 남아있는 발효액으로부터 고체를 제거하는 것은, 유리하게는 예를 들어 경사분리, 증발 및/또는 건조에 의해 수행할 수 있다.

통상적인 여과 방법의 예로는 케이크 여과 및 다층 여과(depthe filtration) (예를 들어, 문헌 [A.　Rushton, A.S.　Ward, R.G.　Holdich: Solid-Liquid Filtration and Separation Technology, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim 1996, pp.　177　ff., K.J.　Ives, in A.　Rushton (Ed.): Mathematical Models and Design Methods in Solid-Liquid Separation, NATO ASI series　E No.　88, Martinus Nijhoff, Dordrecht 1985, pp. 90　ff.]에 기재되어 있음) 및 교차-흐름 여과, 특히 0.1　㎛ 초과의 고체 제거용 미세여과 (예를 들어, 문헌 [J.　Altmann, S.　Ripperger, J. Membrane Sci. 124 (1997) 119-128]에 기재되어 있음)가 있다.

전통적인 원심분리 방법은, 예를 들어 문헌 [G.　Hultsch, H.　Wilkesmann, "Filtering Centrifuges," in D.B. Purchas, Solid-Liquid Separation, Upland Press, Croydon 1977, pp.　493-559]; 및 [H.　Trawinski, Die aequivalente Klaerflaeche von Zentrifugen [The equivalent clarifying area of Centrifuges], Chem. Ztg. 83 (1959) 606-612]에 기재되어 있다. 각종 디자인, 예컨대 관형 원심분리기, 원통형 원심분리기, 및 구체적으로는 푸셔형(pusher) 원심분리기, 슬릿-필터형(slip-filter) 원심분리기 및 디스크형 분리기를 이용할 수 있다.

통상적인 추출 방법은 배치식 또는 단계식 방법, 및 병류 또는 향류의 시차 연속 방법을 포함한다. 당해에서, 상기 방법은 2종 또는 1종의 이동상(들)을 포함할 수 있다. 가치있는 생성물 및 제거되는 제2 성분의 상 둘다에서의 용해도는 특히 용매의 선택, 반대이온의 변동률 및 pH의 변화에 따라 영향을 받을 수 있다 (문헌 [Treybal,　R.E., Mass Transfer Operations, 3rd　ed., New York, McGraw-Hill, 1979]; [Kula,　M., Kroner,　K.H., Hustedt,　H. and Schutee,　H., Technical aspects of extractive enzyme purification, Ann. N.Y. Acad. Sci., 341 (1981)]; [Robinson,　R.G., and Cha,　D.Y., Controlled pH extraction in the separation of weak acids and bases, Biotech. Progress, 1(1), 18 (1985)]).

전통적인 흡착 방법은, 예를 들어 문헌 [D.M.　Ruthven: Principles of Adsorption and Adsorption Processes, J. Wiley ＆ Sons, New York 1984]; [G.　Wedler: Adsorption, Verlag Chemie, Weinheim 1970]에 기재되어 있다. 고체-베드, 이동식-베드 및 유동식-베드 흡착기를 이용할 수 있다. 흡착은 배치식 또는 연속식으로 수행할 수 있다 (문헌 [K.　Hauffe, S.R.　Morrison: De　Gruyter Studienbuch "Adsorption," De Gruyter, Berlin 1974.]; [W.　Kast: Adsorptionstechnik [Adsorption techniques], VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim 1988]). 다수의 다른 흡착제에 더하여, 활성탄, 이온-교환 수지, 천연 또는 합성 제올라이트 및 활성화 알루미나를 사용할 수 있다. 게다가, 친화성 흡착 방법을 또한 이용할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Arnold,　F.H., Blanch,　H.W. and Wilke,　C.R., Analysis of Affinity Separations. Chem. Engr. J., 30, B9 (1985)]에 기재되어 있음).

특히 정밀 화학물질을 정제하기 위해 이용할 수 있는 방법으로는, 예를 들어 크로마토그래피, 침전, 한외여과, 미세여과, 나노여과, 역삼투, 전기영동, 전해투석 및 등전 집중이 있다.

크로마토그래피 방법은 배치식 또는 연속식으로 수행할 수 있다. 연속 크로마토그래피로는, 예를 들어 연속 회전 환상 크로마토그래프(continuous rotating annular chromatograph; CRAC) (예를 들어, 문헌 [A.J.P.　Martin, Discuss. Farraday Soc. 7 (1949)]에 기재되어 있음), 진성 이동식-베드 크로마토그래프 (TMBC) (예를 들어, 문헌 [K.　Takeuchi, T.　Miyauchi, Y.　Uraguchi, J. Chem. Eng. Japan 11 (1978) 216-220.]에 기재되어 있음) 및 모사 이동식-베드 크로마토그래프 (SMB) (예를 들어, 문헌 [D.B.　Broughton, Universal Oil Products Co., US　2,985,589, 1961]에 기재되어 있음)를 포함한다. 사용하는 고체 상으로는, 예를 들어, 활성화 알루미나, 실리카 겔, 글리콜-침지된 규조토, 덱스트란, 술폰화된 스티렌의 중합체, 폴리아크릴아미드 및 중합체-결합된 단백질 (문헌 [Arnold,　F.H., Blanch,　H.W. and Wilke,　C.R., Analysis of Affinity Separations. Chem. Engr. J., 30, B9 (1985)]; [Gibbs,　S.J., and Lightfoot,　E.N., Scaling up gradient elution chromatography, IEC Fund., 25, 490 (1986)]; [King,　C.J., Separation Processes, 2nd　ed., New York, McGraw-Hill (1979)]; [Yau,　W.W., Kirlland,　J.J. and Bly,　D.D., Modern Size-Exclusion Liquid Chromatography, Wiley, New York (1979)])이 있다.

침전은 가치있는 생성물 또는 제2 성분의 침전을 포함할 수 있다 (문헌 [J.W.　Mullin: Crystallization, 3rd ed., Butterworth-Heinemann, Oxford 1993]). 침전은, 예를 들어 추가 용매의 첨가, 염 첨가 및 온도 변화에 의해 개시될 수 있다. 생성된 침전물은 고체를 분리하기 위한 상기 기재의 통상적인 방법에 의해 분리할 수 있다.

미세여과, 한외여과, 나노여과 및 역삼투에 이용할 수 있는 물질의 예로는 미세다공성 막 (문헌 [A.S.　Michaels: "Ultrafiltration," in E.S.　Perry (ed.): Progress in Separation and Purification, vol.　1, Interscience Publ., New York 1968.]), 균일성 막 (문헌 [J.　Crank, G.S.　Park (eds.): Diffusion in Polymers, Academic Press, New York 1968]; [S.A.　Stern: "The Separation of Gases by Selective Permeation," in P.　Meares (ed.): Membrane Separation Processes, Elsevier, Amsterdam 1976]), 비대칭성 막 (문헌 [R.E.　Kesting: Synthetic Polymeric Membranes, A Structural Perspective, Wiley-Interscience, New York 1985]) 및 하전된 막 (문헌 [F.　Helfferich: Ion-Exchange, McGraw-Hill, London 1962]), 다른 방법에 의해 제조된 모든 막 (R.　Zsigmondy, US　1　421　341, 1922; D.B.　Pall, US　4　340　479, 1982; S.　Loeb, S.　Sourirajan, US　3　133　132, 1964)이 있다. 전형적인 물질로는 셀룰로스 에스테르, 나일론, 염화폴리비닐, 아크릴로니트릴, 폴리프로필렌, 폴리카르보네이트 및 세라믹이 있다. 이들 막은 평판 모듈 (문헌 [R.F.　Madsen, Hyperfiltration and Ultrafiltration in Plate-and-Frame Systems, Elsevier, Amsterdam 1977]), 나선형 모듈 (US　3　417　870, 1968 (D.T.　Bray)), 관군형 또는 중공사형 모듈 (문헌 [H.　Strathmann: "Synthetic Membranes and their Preparation," in M.C.　Porter (ed.): Handbook of Industrial Membrane Technology, Noyes Publication, Park Ridge, NJ 1990, pp.　1-60])로서 이용한다. 또한, 액체 막도 이용할 수 있다 (문헌 [N.N.　Li: "Permeation Through Liquid Surfactant Membranes," AIChE J. 17 (1971) 459]; [S.G.　Kimura, S.L.　Matson, W.J.　Ward　III: "Industrial Applications of Facilitated Transport," in N.N.　Li (ed.): Recent Developments in Separation Science, vol.　V, CRC Press, Boca Raton, Florida, 1979, pp.　11-25]). 목적하는 가치있는 생성물은 공급부 상에 풍부하여 보전물 스트림을 통해 분리될 뿐만 아니라 공급부 상에서 고갈되어 여액/투과액 스트림을 통해 분리된다.

전기 영동 방법은, 예를 들어 문헌 [Rudge,　S.R., Ladisch,　M.R., Process considerations for scale-up of liquid chromatography and electrophoresis, in Separation Recovery and Purification in Biotechnology, J.　Asenjo and J.　Hong, eds., ACS Symposium Series, 314, 122 (1986)]에 기재되어 있다. 다수의 변법, 예컨대, 과립형 겔 층에서의 등전 집중, 재순환되는 연속식 등전 집중, "로토포르(Rotofor)" 셀, 재순환되는 자유-흐름 집중 및 등전막을 갖는 다중-분획 전기영동을 이용한다. 사용되는 매트릭스 물질로는, 특히 셀룰로스 아세테이트, 아가로스 겔 및 폴리아크릴아미드 겔이 있다.

통상적인 결정화 방법은, 예를 들어 문헌 [Janeic,　S.J., Grootscholten,　P.A., Industrial Crystallization, New York, Academic, 1984]; [A.W.　Bamforth: Industrial Crystallization, Leonard Hill, London 1965]; [G.　Matz: Kristallisation, 2nd　ed., Springer Verlag, Berlin 1969]; [J.　Nyvlt: Industrial Crystallization -State of the Art. VCH Verlagsges., Weinheim 1982]; [S.J.　Jancic, P.A.M.　Grootscholten: Industrial Crystallization, Reidel, Dordecht 1984]; [O.　Soehnel, J.　Garside: Precipitation, Butterworth-Heinemann, Oxford, 1992]; [A.S.　Myerson (ed.): Handbook of Industrial Crystallization, Butterworth-Heineman, Boston 1993]; [J.W.　Mullin: Crystallization, 3rd　ed., Butterworth-Heinemann, Oxford 1993]; [A.　Mersmann (ed.): Crystallization Technology Handbook, Marcel Dekker, New York 1995]에 기재되어 있다. 결정화는, 예를 들어 냉각, 증발, 진공 결정화 (단열 냉각), 반응 결정화 및 염석에 의해 달성될 수 있다. 결정화는, 예를 들어 교반 및 비교반 탱크에서, 직접-접촉 방법으로, 증발식 결정화기 (문헌 [R.K.　Multer, Chem Eng. (N.Y.) 89 (1982) March, 87-89])로, 배치식 또는 연속식 진공 결정화기로, 예를 들어 강제-순환 결정화기 (스웬손(Swenson) 강제-순환 결정화기) 또는 유동식-베드 결정화기 (오슬로형(Oslo type)) (문헌 [A.D.　Randolph, M.A.　Larson: Theory of Particulate Processes, 2nd　ed. Academic Press, New York 1988]; [J.　Robinson, J.E.　Roberts, Can. J. Chem. Eng. 35 (1957) 105-112]; [J.　Nyvlt: Design of Crystallizers, CRC Press, Boca Raton, 1992])로 수행할 수 있다. 분별 결정화도 가능하다 (문헌 [L.　Gordon, M.L.　Salutsky, H.H.　Willard: Precipitation from Homogeneous Solution, Wiley-Interscience, New York 1959]). 마찬가지로, 거울상이성질체 및 라세미체를 분리할 수 있다 (문헌 [J.　Jacques, A.　Collet, S.H.　Willen: Enantiomers, Racemates and Resolutions, Wiley, New York 1981]; [R.A.　Sheldon: Chirotechnology, Marcel Dekker, New York 1993]; [A.N.　Collins, G.N.　Sheldrake, J.　Crosby (ed.): Chirality in Industry, Wiley, New York 1985]).

통상적인 건조 방법은, 예를 들어 문헌 [O.　Krischer, W.　Kast: Die wissenschaftlichen Grundlagen der Trocknungstechnik [The scientific bases of drying technology], 3rd　ed., Springer, Berlin-Heidelberg-New York 1978]; [R.B.　Keey: Drying: Principles and Practice, Pergamon Press, Oxford 1972]; [K.　Kroell: Trockner und Trocknungsverfahren [Dryers and drying methods], 2nd　ed., Springer, Berlin-Heidelberg-New York 1978]; [Williams-Gardener,　A.: Industrial Drying, Houston, Gulf, 1977]; [K.　Kroell, W.　Kast: Trocknen und Trockner in der Produktion [Drying and dryers in production], Springer, Berlin-Heidelberg-New York 1989]에 기재되어 있다. 건조 방법의 예로는 대류식 건조 방법, 예를 들어 건조 오븐, 터널형 건조기, 벨트형 건조기, 디스크형 건조기, 제트형 건조기, 유동식-베드형 건조기, 통기 및 회전형 드럼 스피너(spinner), 분무형 건조기, 공기-대류형 건조기, 시클론형 건조기, 혼합기형 건조기, 또한 페이스트용 분쇄형 건조기; 고리형 건조기, 터널-튜브형 건조기, 회전형 건조기, 회전목마형 건조기를 포함한다. 다른 방법은 접촉에 의한 건조, 예를 들어 패들형 건조기; 진공 또는 동결 건조, 원뿔형 건조기, 흡인식 건조기, 디스크형 건조기, 접촉에 의해 작동하는 필름형 건조기, 드럼형 건조기, 점성-상 건조기, 판형 건조기, 회전-코일형 건조기, 이중-원뿔형 건조기; 또는 열 복사 (적외선, 예를 들어 적외선 회전형 건조기) 또는 건조를 위한 유전 에너지 (마이크로파)를 이용한다. 대부분의 경우, 열 건조 방법에 이용되는 건조 설비는 스팀, 오일, 가스 또는 전기에 의해 가열되며, 특정한 경우에는 그들의 디자인에 따라 감압하에서 작동될 수 있다.

건조에 더하여, 단백질 조성물의 제조를 위해 하기에 기재되는 바와 같이 또한 제제화 방법을 이용할 수 있다. 이들은 또한 하기에 상술되는 바와 같이 제제 보조제의 첨가를 포함한다.

바람직한 실시양태에서, c) 발효액으로부터 정밀 화학물질의 단리는 이온-교환 크로마토그래피에 의해 수행한다. 여기서, 일반적인 조건 및 절차는 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Roempp Lexikon der Chemie [Dictionary of Chemistry], 10th　edition, 1997, Georg Thieme Verlag, Stuttgart]; [Weis, Handbuch der Ionenchromatographie [Ion Chromatography Manual], 1991, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim]에 기재되어 있다. 일반적으로, 미생물에 의해 생성되는 화합물을 이온 교환제 상에 선택적으로 결합시키고, 상기 이온 교환제를, 예를 들어 물로 세척한 다음 미생물에 의해 생성된 화합물을 용리하는 절차를 수행할 것이다.

고체-적하된 발효액을 이온-교환 크로마토그래피 컬럼 상에 적용하기 전에, 상기 고체를 적절하게는 여과 및 원심분리와 같은 당업자에게 잘 알려진 통상적인 방법으로 제거할 수 있다.

특히 바람직한 실시양태에서, 고체-적하된 발효액은 이온-교환 크로마토그래피 컬럼에 적용하기 전에 제거하지 않는다. 이 경우, 고체-적하된 발효액의 이온 교환제로의 흐름은 중력에 대향하기 때문에 존재하는 고체는 이온 교환제 컬럼을 차단 (즉, 막힘)시키지 않는다.

미생물을 통해 생성된 대사물이 염기성 아미노산인 경우, 이는 유리하게는 산성 양이온 교환제 컬럼을 이용하는 이온-교환 크로마토그래피에 의해 발효액으로부터 분리할 수 있다. 이 경우, 염기성 아미노산, 예를 들어 리신은 이온 교환제 컬럼 상에 선택적으로 결합한다. 특히 물로 세척함으로써 정제한 다음 용리하는 것이 가능하다. 이어서, 염기성 아미노산을 적합한 용리액, 예를 들어, 암모니아수, 바람직하게는 5 부피％ 고농도의 암모니아수로 용리한다.

염기성 아미노산, 예컨대 리신의 분리 또는 정제를 위한 이온-교환 크로마토그래피의 사용은, 예를 들어 리(Lee) 및 그의 동료들의 WO　01/072689에 기재되어 있다. 발효 브로쓰로부터 보다 유효한 리신 회수를 달성하기 위해 정상 이온 교환 크로마토그래피에 대해 승인된 바와 같은 이온 배제 크로마토그래피의 사용은 문헌 [Enzyme and Microbial Technology 30 (2002), 798-303]에 기재되어 있다.

남아있는 발효 잔류물은 후처리할 수 있으며, 즉 하기에 기재되는 방법과 유사하게 처리하고/하거나 가공하여 단백질성 부산물을 생성시킨다.

미생물에 의해 생성된 대사물이 메티오닌인 경우, 가치있는 생성물은 유리하게는 원심분리 또는 여과에 의해 단리한다. 여기서, 다른 탄소 공급원, 예를 들어 선행 출원 DE　10359668.2에 기재된 바와 유사한 조건 및 절차를 사용할 수 있다. 발효가 종료된 때에, 생성된 발효액을 가열하여 모든 메티오닌을 용해시킨다. 이어서, 고체를 원심분리 또는 여과에 의해 분리한다. 고체 분리 단계로부터의 투명한 유체 액체는 바람직하게는 부분 또는 완전 증발에 의해 농축시키며, 상기 방법 동안 메티오닌은 결정화된다. 이후에, 상기 메티오닌을 건조시키고, 적절하게는 상기의 추가 여과 단계를 수행한다.

원심분리 또는 여과에 의해 분리된 고체는 본질적으로 발효 동안 생성된 생물자원 및 당화 전분 용액의 비대사성 성분, 예를 들어 섬유를 포함한다. 이러한 남아있는 발효 잔류물은 하기에 기재되는 방법과 유사하게 처리하거나 가공하여 단백질-함유 이차 생성물을 제공할 수 있다.

미생물에 의해 생성된 대사물이 판토텐산인 경우, 가치있는 생성물의 단리는 마찬가지로 유리하게는 여과 또는 원심분리에 의해 수행된다. 당해에서, 다른 탄소 공급원료에 대해 기재된 바, 예를 들어 EP　1050219 및 WO　01/83799와 유사한 조건 및 절차를 이용할 수 있다. 또한, 메티오닌 경우에 상기 기재된 방법과 유사하게 후처리를 수행할 수 있다. 판토텐산의 경우에, 모든 발효액을 추가로 저온살균한 다음 고체를 분리하는 것이 바람직하다. 고체 분리 단계로부터 수득한 투명한 유출 액체를 바람직하게는 부분 증발시키고, 적절하게는 염화칼슘으로 처리하고 건조시키고, 바람직하게는 분무-건조시킨다.

판토텐산을 수득하기 위해, 단계 c)후에 세포 및 불용성, 즉 고체, 비전분 성분을 경사분리기, 원심분리기, 여과 기술 또는 막 기술 (미세여과, 한외여과, 나노여과), 및/또는 이들 방법의 조합에 의해 분리하는 절차를 또한 수행할 수 있다. 고체가 적게 존재하거나 존재하지 않은 스트림은 판토텐산을 함유한다. 상기 스트림은, 예를 들어 추가로 농축하고/하거나 건조 또는 제제화 단계에 적용할 수 있다. 고체-함유 스트림을 하기에 기재되는 바와 같이 후처리하여 단백질성 부산물을 수득할 수 있다.

적절하게는, 세포를 용해하거나 파괴한다. 발효 후에 상기를 바로 수행할 수 있다. 상기 목적을 위해, 모든 발효액을 용해 또는 파괴 단계에 적용하며, 이는 열적으로, 기계적으로 또는 화학적으로 수행할 수 있다. 고체를 제거한 후에 상기 세포를 또한 용해할 수 있다. 상기를 행한 경우, 고체-풍부 스트림만을 상기에서 언급한 용해 단계에 적용한다.

바람직한 실시양태에서, 발효 후에 세포를 열적으로 파괴하여 상기 세포 및 비전분 고체 성분을 경사분리, 원심분리, 여과 기술 또는 막 기술 및/또는 이들의 조합에 의해 제거하는 방식으로 판토텐산의 후처리를 수행한다. 고체가 적게 존재하거나 존재하지 않는 스트림은 판토텐산을 함유한다. 상기 스트림은, 예를 들어 추가로 농축할 수 있다. 농축 단계 전에, 동안 또는 후에 보조제, 예컨대 고체가 낮게 존재하는 액체에 하기에 언급되는 보조제를 첨가하는 것이 유리하다. 이는 임의의 포말 형성 및/또는 코팅 형성의 감소를 가능하게 한다. 이어서, 바로 농축 스트림을 건조시키거나 제제화한다. 또한, 건조 또는 제제화 단계 전에, 동안 또는 후에 하기에 언급되는 보조제를 첨가하여 생산물의 흡습성 감소, 생산물의 흐름 거동 개선 및/또는 저장 안정성을 증가시킬 수 있다. 이러한 경우에, 하기에 기재되는 방법과 유사하게 고체-함유 스트림을 바람직하게 가공하여 단백질성 부산물을 수득한다.

판토텐산을 후처리하는 것에 대한 추가의 바람직한 실시양태는 발효 단계 동안만큼 초기에 특정 양이온을 갖는 보조제의 첨가 가능성을 제공한다. 이는, 예를 들어 WO 02/072857에 기재되어 있다.

원심분리, 경사분리, 한외여과 및/또는 투석에 의해 판토텐산을 후처리하는 것에 대한 추가의 더 바람직한 실시양태는 WO　05/028659에 기재되어 있다.

또한, 판토텐산을 발효액으로부터 전해투석 또는 이온 교환에 의해 분리하는 것은 가능하다. 그러나, 이들 방법은 문제가 예상될 수 있기 때문에 바람직하지 않다.

판토텐산의 단리 후에 남아있는 발효 잔류물, 즉 특히 분리되는 고체를 하기에 기재되는 방법과 유사하게 처리하거나 가공하여 단백질성 이차 생성물을 제공할 수 있다.

미생물에 의해 생성된 대사물이 폴리히드록시알카노에이트의 형태를 취하는 경우, 가치있는 생성물의 단리는 유리하게는 예를 들어 US　4310684 또는 EP　355307에 기재된 것과 같이 용매로 추출함으로써 수행한다. 남아있는 고체를 전통적인 방식, 예를 들어 여과 또는 원심분리에 의해 제거할 수 있다. 또한, 메티오닌의 경우에 상기 기재된 방법과 유사하게 후처리를 수행할 수 있다. 폴리히드록시알카노에이트의 경우에, 추가로 모든 발효액의 저온살균을 수행한 다음 고체를 분리하는 것이 바람직하다. 고체 분리 단계로부터 수득한 투명한 유출 액체를 바람직하게는 부분 증발시키고, 적절하게는 염화칼슘으로 처리하고, 건조시키고, 바람직하게는 분무-건조시킨다. 폴리히드록시알카노에이트의 추가의 정제는 공지된 방식, 예컨대 US　4310684 또는 EP　355307에 기재된 방식으로 수행한다.

남아있는 발효 잔류물, 즉, 특히 분리되는 고체를 하기 기재되는 방법과 유사하게 처리하거나 가공하여 단백질성 이차 생성물을 수득한다.

관심의 산물, 예를 들어 염기성 아미노산, 예컨대 리신을 분리한 후에 남아있는 발효액은 본질적으로 당화 전분 용액이 비대사성 성분, 예컨대 섬유 및 비이용된 당의 발효동안 생성되는 생물자원 및 비이용된 완충액 또는 영양분 염을 포함한다. 이들 고체는 바이오에탄올의 제조 중에 생성되는 이차 생성물과 유사하게 남아있는 발효액으로부터 수득될 수 있다 (당해에서 "주정박(distiller's dried grains with soluble; DDGS)"로 지칭하며, 이 명칭으로 시판됨). 당해에서, 발효액은 고체로부터 본질적으로 완전히 분리되거나 또는 어느 정도로만 분리될 수 있다.

상기 방식으로 수득한 단백질성 이차 생성물 (이후, 또한 단백질 조성물로 지칭)은 후처리 또는 가공 단계 전후 둘다에서 동물 (특히, 농가 가축, 특히 바람직하게는 소, 돼지, 가금류, 특히 더 바람직하게는 소) 사료 또는 식품 첨가제로서 사용할 수 있다.

단백질 조성물을 수득하기 위한 발효액의 후처리 또는 가공은 당업자에게 공지된 방법으로, 특히 건조물 함량을 변경 (예를 들어, 건조 또는 증발에 의함)하고, 분쇄하고, 제제화함으로써 (예를 들어, 첨가제의 첨가, 성형 방법, 예컨대 펠렛팅 및 사출 성형) 수행할 수 있다. 더욱이, 이차 생성물의 후처리 및 가공은, 예를 들어 영양분 함량을 표준화하기 위해 또한 다른 사료 또는 식품 첨가제와 혼합하는 것을 포함한다.

대체적으로, 단계 c)에 따라 1종 이상의 대사물의 단리 후에 발효액 중의 휘발 성분의 최소한 일부를 제거하여 단백질 조성물을 제조한다. 이는 단백질 조성물을 고체 또는 반-고체 형태로 제공한다. 남아있는 발효액 중의 단리된 대사물의 함량은 대체적으로 남아있는 발효액의 총 중량을 기준으로 각 경우에 20 중량％ 이하, 특히 15 중량％ 이하, 구체적으로 10 중량％ 이하, 더 구체적으로 5 중량％ 이하이다.

관심의 산물을 분리한 후 단백질 조성물을 수득하기 위해, 대체적으로 다단계 절차인 증발 단계에서 남아있는 모든 액체를 부분적으로 증발시키고, 후속적으로 예를 들어 경사 분리기를 이용하여 생성된 고체를 분리하거나, 또는 고체를 모든 발효액으로부터 바로 분리하는 것이 통상적이다. 고체를 제거하기 위해, 예를 들어 다단계 플랜트에서 원심분리, 여과, 미세여과, 한외여과, 나노여과, 역삼투 또는 이들 방법의 조합을 이용하는 것이 가능하다. 분리하는 고체는 대체적으로 10 내지 80 중량％, 바람직하게는 15 내지 60 중량％ 및 특히 바람직하게는 20 내지 50 중량％ 범위의 건조물 함량을 갖는다. 추가의 후처리 또는 가공에 의해 수득한 완성된 단백질 조성물은 유리하게는 대략 90 중량％의 건조물 함량을 가지므로 저장 동안 부패의 위험이 감소된다.

단백질 조성물은 또한 단계 c) 후에 당업자에게 통상적인 열적 방법 (예를 들어, 증발), 기계적 방법 (예를 들어, 여과기, 경사분리기, 원심분리기) 및 상기 개별 방법의 조합을 이용하여 남아있는 발효액 중의 고체 성분을 농축함으로써 수득할 수 있다. 액체의 농축물은 고체 또는 반-고체, 예를 들어 반죽같은 잔류물을 제공하며, 이는 여전히 대체적으로 잔류물의 총 중량을 기준으로 0 내지 10 중량％의 범위, 특히 0 내지 5 중량％의 범위의 본 발명에 따라 생성된 대사물의 소량, 및 전분 공급원의 비휘발성, 일반적으로 고체, 비전분 성분 또는 그의 최소한 대량, 종종 90 중량％ 이상 또는 전분 공급원의 모든 고체 비전분 성분, 및 발효의 결과인 생물자원을 포함한다. 이러한 반-고체 또는 고체 잔류물을 단계 c) 후에 남아있는 비농축 발효액과 유사하게 건조시키거나 제제화할 수 있다.

이차 생성물을 수득할 때 분리한 액체 상의 일부는 공정수로 재순환할 수 있다. 액체 상의 이러한 재순환부는 유리하게는 단계 a)에 따라 당-함유 액체의 제조에 이들 전부 또는 일부를 사용하거나, 또는 발효에 사용하는 완충액 또는 영영분 염을 제조하는데 사용할 수 있다. 단계 a)에서 재순환 공정수를 혼합하는 경우, 과도한 고비율은 특정 미네랄 및 이온, 예를 들어 나트륨 이온 및 락테이트 이온의 과잉 공급을 초래하여 부작용을 일으킬 수 있음을 고려해야 한다. 따라서, 바람직하게는, 본 발명에 따른 전분 액화의 목적을 위해 현탁액을 제조하는 경우의 재순환 공정수의 양은 현탁액을 제조하는데 사용하는 물의 총량을 기준으로 각 경우에 75 중량％ 이하, 바람직하게는 60 중량％ 이하 및 특히 바람직하게는 50 중량％ 이하로 제한된다. 단계 a2)의 바람직한 실시양태에서 현탁액을 제조하는 경우에 공정수의 양은 유리하게는 현탁액을 제조하는데 사용하는 물의 총량을 기준으로 각 경우에 5 내지 60 중량％의 범위 및 바람직하게는 10 내지 50 중량％의 범위이다.

공정으로 재순환되지 않는 액상부는 다단계 증발 절차에서 농축되어 시럽을 제공할 수 있다. 시럽은 통상적으로 건조 물질 함량을 20 내지 90 중량％, 바람직하게는 30 내지 80 중량％, 특히 바람직하게는 40 내지 70 중량％의 범위로 갖는다. 상기 시럽을 경사분리 단계 (또는 임의의 다른 방식) 동안 분리한 고체와 혼합하고, 이어서 건조시킬 수 있다. 예를 들어, 드럼형 건조기, 분무형 건조기 또는 패들형 건조기에 의해 건조를 수행할 수 있으며, 드럼형 건조기를 이용하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 생성된 고체가 30 중량％ 이하, 바람직하게는 20 중량％ 이하, 특히 바람직하게는 10 중량％ 이하의 잔류 수분 함량을 갖도록 건조를 수행한다.

고체 발효 성분과 함께 존재하는 (즉, 단백질 조성물 중의) 건조된 이차 생성물의 특성은 각종 파라미터, 예컨대 입도, 입자 모양, 먼지날림에 대한 감수성, 흡습성, 안정성, 특히 저장 안정성, 색상, 냄새, 흐름 거동, 응집에 대한 감수성, 정전기 하전, 빛 및 고온에 대한 감수성, 기계적 안정성 및 재분산성에 대해 그 자체로 공지된 방식으로 제제화 보조제, 예컨대 담체 및 코팅 물질, 결합제 및 다른 첨가제를 첨가함으로써 완성할 수 있다.

통상적으로 사용하는 제제화 보조제로는, 예를 들어 결합제, 담체, 분말-코팅 물질/유동 개선제, 또한 색상 안료, 살생제, 분산제, 기포방지제, 점도 조절제, 산, 가성 알칼리 용액, 항산화제, 효소에 대한 안정화제, 효소 억제제, 흡착물, 지방, 지방산, 오일 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 이러한 제제화 보조제는 유리하게는 제제화 및 건조 방법, 예컨대 분무 건조, 유동식-베드 건조 및 동결건조에 사용하는 경우 건조 보조제로서 사용할 수 있다.

결합제의 예로는 탄수화물, 특히 당, 예컨대 단당류, 이당류, 올리고당류 및 다당류, 예를 들어 덱스트린, 트레할로스, 글루코스, 글루코스 시럽, 말토스, 수크로스, 프룩토스 및 락토스; 콜로이드 물질, 예컨대 동물성 단백질, 예를 들어 젤라틴, 카세인, 특히 카세인나트륨, 식물성 단백질, 예를 들어, 대두 단백질, 완두 단백질, 강낭콩 단백질, 루핀콩, 제인, 밀 단백질, 옥수수 단백질 및 쌀 단백질, 합성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 알콜 및 특히 바스프사의 콜라이돈(Kollidon) 상품, 임의로 개질된 생중합체, 예를 들어 리그닌, 키틴, 키토산, 폴리락티드 및 개질된 전분, 예를 들어 옥테닐 숙시네이트 무수물 (OSA); 고무, 예를 들어, 아카시아 고무; 셀룰로스 유도체, 예를 들어 메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스, (히드록시에틸)메틸셀룰로스 (HEMC), (히드록시-프로필셀룰로스 (HPMC), 카르복시메틸셀룰로스 (CMC); 가루, 예를 들어 옥수수 가루, 밀 가루, 호밀 가루, 보리 가루 및 쌀 가루를 포함한다.

담체 물질의 예로는 탄수화물, 특히 결합제로서 상기에서 언급된 당, 및 전분, 예를 들어, 옥수수 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 밀 전분 및 카사바 전분; 개질된 전분, 예를 들어, 옥테닐 숙시네이트 무수물; 셀룰로스 및 미세결정질 셀룰로스; 무기 광물 또는 양토, 예를 들어, 점토, 숯, 규조토, 규산, 활석 및 고령토; 조분, 예를 들어, 조 밀가루, 겨, 예를 들어, 밀 겨, 결합제로서 상기에서 언급된 가루; 염, 예컨대 금속 염, 특히 유기산의 알칼리 금속 염 및 알칼리 토금속 염, 예를 들어, Mg, Ca, Zn, Na 및 K 시트레이트, 아세테이트, 포르메이트 및 수소 포르메이트, 무기 염, 예를 들어, Mg, Ca, Zn, Na 및 K 술포네이트, 카르보네이트, 실리케이트 또는 포스페이트; 알칼리 토금속 산화물, 예컨대 CaO 및 MgO; 무기 완충제, 예컨대 알칼리 금속 수소 포스페이트, 특히 나트륨 및 칼륨 수소 포스페이트, 예를 들어, K₂HPO₄, KH₂PO₄ 및 Na₂HPO₄; 및 일반적으로 저융점 또는 오일성 경도를 갖는 대사물의 본 발명에 따른 생성물과 관련하여 언급된 흡착제가 있다.

분말-코팅제 또는 유동 보조제의 예로는 규조토, 규산, 예를 들어, 데구사(Degussa)사의 시페르네트(Sipernat) 상품; 점토, 숯, 수지 및 고령토; 전분, 개질된 전분, 무기염, 유기산의 염 및 담체로서 상기에서 언급된 완충제; 셀룰로스 및 미세결정질 셀룰로스가 있다.

다른 첨가제에 대해, 언급할 수 있는 예로는 색상 안료, 예컨대 TiO₂; 살생제; 분산제; 거품방지제; 점도 조절제; 무기산, 예컨대 인산, 질산, 염산, 황산; 유기산, 예컨대 포화 또는 불포화 모노- 및 디카르복실산, 예를 들어 포름산, 아세트산, 프로피온산, 부티르산, 발레산, 팔미트산, 스테아르산, 옥살산, 말론산, 숙신산, 글루타르산, 아디프산, 피멜산, 말레산 및 푸마르산; 가성 알칼리 용액, 예컨대 알칼리 금속 수산화물, 예를 들어 NaOH 및 KOH; 항산화제; 효소에 대한 안정화제; 효소 억제제; 흡착물, 지방; 지방산 및 오일이 있다.

상기 언급된 첨가제, 및 적절하게는 추가의 첨가제, 예컨대 코팅 물질의 양은 광범위한 제한 내에서 당해의 대사물의 특정한 요건 및 사용하는 첨가제의 특성에 따라, 예를 들어 완성되고 제제화된 생성물의 총 중량을 기준으로, 또는 완성되고 제제화된 생성물 또는 조성물의 총 중량을 기준으로 각 경우에 0.1 내지 80 중량％의 범위, 특히 5 내지 70 중량％ 범위 및 구체적으로 10 내지 60 중량％ 범위로 달라질 수 있다.

제제화 보조제의 첨가 (또한, 생성물 당제화(confectioning) 또는 고체 디자인으로 지칭됨)는 발효액의 가공 전에, 동안에, 또는 후에, 특히 건조 동안에 수행할 수 있다. 단계 c) 후에 남아있는 발효액을 농축하기 전에 제제화 보조제를 첨가하는 것은 후처리하는 물질 또는 생성물의 가공성을 개선하는데 있어 특히 유리할 수 있다. 제제화 보조제는 고체 형태로 수득되는 이차 생성물, 및 예를 들어 단계 c) 후에 발효액에 바로 첨가할 수 있는, 상기 이차 생성물을 포함하는 용액 또는 현탁액, 또는 후처리 동안 및 최종 건조 단계 전에 수득되는 용액 또는 현탁액 둘다에 첨가할 수 있다.

따라서, 상기 보조제는 예를 들어 단계 c) 후에 남아있는 발효액을 농축함으로써 수득되는 현탁액과 혼합할 수 있으며; 상기 현탁액은, 예를 들어 혼합함으로써 담체 물질에 또한 적용할 수 있다. 제제화 보조제의 첨가는 특히 건조 후에, 예를 들어 코팅시 또는 건조된 입자의 코팅층에 적용시에 수행할 수 있다. 추가의 보조제는 건조 후 및 수행하는 임의의 코팅 단계 후 둘다에서 첨가할 수 있다. 제제화 방법에 의해 수득된 입자는 상기 기재된 건조 방법을 이용함으로써 목적하는 잔류 수분 함량으로 건조시킬 수 있다.

고체 형태, 예를 들어 입자, 과립 및 압출체로 수득된 모든 이차 생성물은 코팅제, 즉 1종 이상의 추가 물질층으로 코팅될 수 있다. 코팅은, 예를 들어 혼합기 또는 코팅될 입자가 유동화되어 코팅 물질이 분무되는 유동식 베드에서 수행된다. 코팅 물질은 건조 형태, 예를 들어 분말 형태, 또는 용매 (예를 들어, 물, 유기 용매 및 이들의 혼합물, 특히 물) 중 용액, 분산액, 유액 또는 현탁액 형태로 존재할 수 있다. 용매가 존재하는 경우, 입자 상에 분무하는 동안 또는 그 후에 용매를 증발시켜서 제거한다. 더욱이, 코팅 물질, 예컨대 지방은 또한 용해물 형태로 적용할 수 있다.

수성 분산액 또는 현탁액의 형태로 분무될 수 있는 코팅 물질은, 예를 들어 WO 03/059087에 기재되어 있다. 이들은, 특히 폴리올레핀, 예컨대 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌 왁스, 왁스, 무기염 및 유기염, 아크릴, 예를 들어 부틸 아크릴레이트/메틸 아크릴레이트 공중합체, 바스프(BASF)사의 스티로판(Styrofan) 상품, 예를 들어 스티렌 및 부타디엔 상에 기재된 것들, 및 WO 03/059086에 기재된 바와 같은 소수성 물질이 있다. 상기 물질을 적용하는 경우, 코팅 물질의 고체 함량은 전형적으로 제제화된 최종 생성물의 총 중량을 기준으로 각 경우에 0.1 내지 20 중량％의 범위, 특히 0.2 내지 10 중량％의 범위 및 구체적으로 0.4 내지 5 중량％의 범위이다.

용액 형태로 분무될 수 있는 코팅 물질로는, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 셀룰로스 유도체 예컨대 메틸셀룰로스, 히드록시프로필-메틸셀룰로스 및 에틸셀룰로스, 폴리비닐 알콜, 단백질 예컨대 젤라틴, 무기염 및 유기염, 탄수화물, 예컨대 당, 예를 들어, 글루코스, 락토스, 프룩토스, 수크로스 및 트레할로스; 전분 및 개질된 전분이 있다. 상기 물질을 적용하는 경우, 코팅 물질의 고체 함량은 전형적으로 제제화된 최종 생성물의 총 중량을 기준으로 각 경우에 0.1 내지 20 중량％의 범위, 특히 0.2 내지 10 중량％의 범위 및 구체적으로 0.4 내지 5 중량％의 범위이다.

용해물 형태로 분무될 수 있는 코팅 물질로는, 예를 들어 DE 199 29 257 및 WO 92/12645에 기재되어 있다. 이들로는 특히 폴리에틸렌 글리콜, 합성 지방 및 왁스, 예를 들어 바스프사의 폴리겐 WE(등록상표), 천연 지방, 예컨대 동물성 지방, 예를 들어 밀랍, 및 식물성 지방, 예를 들어 칸델라 왁스, 지방산, 예를 들어 동물 왁스, 수지 지방산, 팔미트산, 스테아르산, 트리글리세리드, 에데노르(Edenor) 제품, 베게올레(Vegeole) 제품, 몬탄(Montan) 에스테르 왁스, 예를 들어 바스프사의 루왁스이(LuwaxE(등록상표))를 포함한다. 상기 물질을 적용하는 경우, 코팅 물질의 고체 함량은 전형적으로 제제화된 최종 생성물의 총 중량을 기준으로 각 경우에 1 내지 25 중량％의 범위, 특히 2 내지 25 중량％의 범위 및 구체적으로 3 내지 20 중량％의 범위이다.

건조 및/또는 제제화 단계 후에, 통곡물 인 또는 연마된 곡류의 인, 바람직하게는 옥수수, 밀, 보리, 기장/사탕수수 및/또는 호밀을 이차 생성물, 즉 단백질 조성물에 첨가할 수 있다.

이와 같이, 본 발명은 3개의 탄소 원자를 갖거나, 또는 2개 이상의 탄소 원자와 1개 이상의 질소 원자를 갖는 대사물의 제조를 위해 본 발명에 따라 수행되는 당-기재 미생물 발효로부터의 단백질 조성물에 관한 것이며, 여기서 단백질 조성물은 상기 기재된 바와 같이 수득가능하다. 이러한 단백질 조성물은 통상적으로 단백질 물질, 발효로부터의 생물자원, 전분 공급원의 비전분 성분, 특히 섬유, 및 발효 산물 (대사물)을 포함한다. 특히, 단백질 조성물은 본질적으로 하기 건조-물질 성분을 포함한다.

a) 발효로부터의 생물자원 1 내지 90 중량％, 바람직하게는 5 내지 85 중량％ 및 구체적으로 10 내지 75 중량％;

b) 전분 공급원의 비전분 성분, 특히 섬유 1 내지 90 중량％, 특히 5 내지 85 중량％, 구체적으로 10 내지 80 중량％ 및 더 구체적으로 15 내지 75 중량％;

c) 3개의 탄소 원자를 갖거나, 또는 2개 이상의 탄소 원자와 1개 이상의 질소 원자를 갖는 미생물 대사물 0.01 내지 10 중량％, 특히 0.1 내지 5 중량％, 구체적으로 0.2 내지 5 중량％ 및 더 구체적으로 0.3 내지 5 중량％;

d) 전통적인 제제화 보조제 0 내지 90 중량％, 특히 5 내지 80 중량％ 및 구체적으로 10 내지 70 중량％; 및

e) 발효액의 비대사성 추가 성분, 특히 당, 전분, 영양 염 및/또는 완충제 염의 잔류물 0 내지 40 중량％, 특히 0.5 내지 30 중량％ 및 구체적으로 1 내지 20 중량％,

여기서, 성분 a) 내지 e)는 건조 물질의 100 중량％ 이하로 첨가한다. 본원에서, 용어 "본질적으로"는 a) 내지 e)와 상이한 다른 성분의 양이 낮다는 것을 의미한다. 대체적으로, 이는 단백질 조성물의 총 건조 물질을 기준으로 각 경우에 10 중량％, 특히 5 중량％를 넘지 않을 것이며; 구체적으로, 이 양은 1 중량％ 미만, 특히 대략 0 중량％이다.

생물자원 (성분 a))은, 특히 단백질 조성물 중 조 단백질의 양을 포함한다. 이 양은 통상적으로 40 중량％ 이상이고, 일반적으로 단백질 조성물 중 총 건조 물질을 기준으로 각 경우에 40 내지 90 중량％의 범위, 구체적으로 40 내지 90 중량％의 범위, 구체적으로 45 내지 85 중량％의 범위 및 구체적으로 50 내지 80 중량％의 범위이다.

본 발명에 따른 단백질 조성물은 통상적으로 1종 이상의 필수 아미노산, 특히 리신, 메티오닌, 트레오닌 및 트립토판 중에서 선택된 1종 이상의 아미노산을 포함한다. 상기 필수 아미노산, 특히 언급된 것들은 대체적으로 각 경우에 바이오에탄올의 발효 제조시에 생성되는 전통적인 DDGS 이차 생성물과 비교하여 1.5 이상의 비율까지 증가하는 양으로 존재한다. 당해의 상기 아미노산이 단백질 조성물 중에 존재하는 경우, 후자는 대체적으로 단백질 조성물 중 총 건조 물질을 기준으로 각 경우에 1 중량％ 이상, 특히 1 내지 5 중량％의 범위의 리신 함량, 0.8 중량％ 이상, 특히 0.8 내지 5 중량％의 범위의 메티오닌 함량, 1.5 중량％ 이상, 특히 1.5 내지 5 중량％의 범위의 트레오닌 함량, 및/또는 0.4 중량％ 이상, 특히 0.4 내지 5 중량％의 범위의 트립토판 함량을 갖는다.

일반적으로, 본 발명에 따른 단백질 조성물은 단백질 조성물의 총 중량을 기준으로 각 경우에 소량의 물, 종종 물 0 내지 25 중량％의 범위, 특히 0.5 내지 15 중량％의 범위, 구체적으로 1 내지 10 중량％의 범위 및 더 구체적으로 1 내지 5 중량％의 범위를 포함한다.

또한, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 방법에 관한 것이며, 여기서

(i) 50 중량％ 이하의 부분을 전분 공급원료의 비-전분 고체 성분을 포함하는 단계 a)에서 수득된 당-함유 액체 배지로부터 제거하고, b)에 기재된 바와 같은 발효를 잔여물로 수행하여 제1 대사물을 생성하고;

(ii) 전분 공급원료의 비-전분 고체 성분의 전부 또는 일부를 상기 부분으로부터 분리하고, b)에 기재된 바와 같은 발효를 상기 부분으로 수행하여, 대사물 (A)와 동일하거나 또는 상이한 제2 대사물을 생성한다.

바람직한 실시양태에서, (ii)의 비-전분 고체 성분의 제거는 당-함유 액체 배지의 잔류물의 고체 함량이 50 중량％ 이하, 바람직하게는 30 중량％ 이하, 특히 바람직하게는 10 중량％ 이하, 더 특히 바람직하게는 5 중량％ 이하의 양으로 존재하는 방식으로 수행한다.

상기 절차는, (iii)의 분리 발효에서, 예를 들어 산소 전달 비율에 대한 특정 최소 요구를 만족시키는 미생물의 사용을 가능하게 한다. (iii)의 분리 발효에 사용하는 적합한 미생물은, 예를 들어 바실러스 종, 바람직하게는 바실러스 서브틸리스이다. 분리 발효에서 상기 미생물에 의해 생성되는 화합물은 비타민, 조인자 및 기능식품, 퓨린 및 피리미딘 염기, 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드, 지질, 포화 및 불포화 지방산, 방향족 화합물, 단백질, 카로티노이드, 구체적으로 비타민, 조인자 및 기능식품, 단백질 및 카로티노이드, 및 더 구체적으로 리보플라빈 및 판토텐산칼슘으로부터 선택된다.

특히, 이 절차는 생산된 정밀 화학물질이 발효에서 고체로 수득되는 경우에도 본 발명에 따른 방법의 이로운 용도를 허용한다.

상기 절차의 바람직한 실시양태는 2가지의 분리 발효에서 동일한 대사물 (A) 및 (B)의 병행 제조에 관한 것이다. 이는 특히 동일한 대사물의 상이한 적용이 상이한 순도 요건을 갖는 것인 경우에 특히 유리하다. 이에 따라, 제1 대사물 (A), 예를 들어 식품 첨가제로 사용되는 아미노산, 예를 들어 리신을 고체-함유 발효액을 사용하여 생산하며, 동일한 제2 대사물 (B), 예를 들어 식품 첨가제로서 사용되는 동일한 아미노산, 예를 들어 본 발명의 경우에는 리신을 단계 (ii)의 고체-고갈된 발효액을 사용하여 생산한다. 비-전분 고체 성분의 완전 또는 부분 제거로 인해, 대사물 적용 분야에서, 예를 들어 식품 첨가제로서 높은 순도 요건을 갖는 대사물의 후처리시 정제의 복잡성은 감소될 수 있다.

상기 절차의 또다른 바람직한 실시양태에서, 발효시 미생물에 의해 생성되는 대사물 B는 리보플라빈이다. 발효를 수행하기 위해, 다른 탄소 공급원료에 대해 기재된, 예를 들어 WO　01/011052, DE　19840709, WO　98/29539, EP　1186664 및 문헌 [Fujioka,　K.: New biotechnology for riboflavin (vitamin B2) and character of this riboflavin. Fragrance Journal (2003), 31(3), 44-48]에 기재된 것과 유사한 조건 및 절차를 이용할 수 있다.

예를 들어, 하기 절차는 상기 방법의 이러한 변형을 수행하는 데 이용될 수 있다. 바람직하게는 대용량 발효는 본 발명에 따른 방법 단계 a) 내지 c)에 따라 대사물 A, 예를 들어 정밀 화학물질, 예컨대 리신의 제조를 위해 제공된다. (i)에 따라, 단계 a)에서 수득된 당-함유 액체 배지의 일부를 제거하고, (ii)에 따라 전통적인 방법, 예를 들어 원심분리 또는 여과에 의해 고체로부터 완전 또는 부분적으로 제거한다. 본질적으로 고체로부터 완전 또는 부분적으로 제거된, 이들로부터 수득된 당-함유 액체 배지는 (ii)에 따라 대사물 B, 예를 들어 리보플라빈의 제조를 위해 발효에 공급된다. (ii)에 따라 분리된 고체 스트림은 유리하게는 대용량 발효의 당-함유 액체 배지의 스트림으로 되돌아간다.

이와 같이, 단계 (ii)에 따라 생성된 리보플라빈-함유 발효액은 다른 탄소 공급원료에 대해 기재된, 예를 들어 DE　4037441, EP　464582, EP　438767 및 DE　3819745에 기재된 것과 유사한 조건 및 절차에 의해 처리될 수 있다. 세포 생물자원을 용해시킨 후에, 결정형으로 존재하는 리보플라빈을 바람직하게는 경사분리하여 분리하였다. 고체를 분리하는 다른 방법으로는, 예를 들어 여과법을 이용할 수도 있다. 이후에, 리보플라빈을 바람직하게는 분무 건조시 및 유동층 건조기를 이용하여 건조시켰다. 별법으로, 단계 (ii)에 따라 생산된 리보플라빈-함유 발효 혼합물은 예를 들어 EP　1048668 및 EP　730034에 기재된 것과 유사한 조건하에서 유사한 절차를 이용하여 처리될 수 있다. 저온살균시킨 후에, 발효액을 원심분리하고, 남아있는 고체-함유 분획을 무기산으로 처리하였다. 형성된 리보플라빈을 여과에 의해 산성 수용액 배지로부터 분리하고, 세척하고, 적절하게는 그 후에 건조시켰다.

분리된 고체는, 이미 상기에 기재된 바와 같이, 대용량 발효 방법의 범위 내에서 가공할 수 있으며, 이를 동시에 작용하여 이차 생성물을 수득한다.

상기 절차의 또다른 바람직한 실시양태에서, 발효시 미생물에 의해 생성되는 대사물 B는 판토텐산이다. 발효를 수행하기 위해, 다른 탄소 공급원료에 대해 기재된, 예를 들어 WO　01/021772에 기재된 것과 유사한 조건 및 절차를 유사한 조건 및 절차를 이용할 수 있다.

상기 방법의 변법을 수행하기 위해, 리보플라빈에 대해 상기 기재된 것과 같은 절차를 수행할 수 있다. (ii)에 따라 정제하고, 바람직하게는 본질적으로 고체로부터 분리된 당-함유 액체 배지를 판토텐산의 제조를 위해 (ii)에 따라 발효에 공급한다. 여기서, 고체-함유 액체 배지와 비교시 점도가 감소되었다는 사실은 특히 유리하다. 상기 분리된 고체 스트림은 바람직하게는 대용량 발효의 당-함유 액체 배지의 스트림으로 되돌아간다.

(ii)에 따라 제조된 판토텐산-함유 발효액은 다른 탄소 공급원료에 대해 기재된 바, 예를 들어 EP　1050219 및 WO　01/83799에 기재된 바와 유사한 조건하에서 유사한 절차를 이용하여 제조될 수 있다. 모든 발효액을 저온살균한 후에, 남아있는 고체를 예를 들어 원심분리 또는 여과에 의해 분리한다. 고체 분리 단계에서 수득한 투명한 유출 액체를 부분적으로 증발시키고, 적절하게는 염화칼슘으로 처리하고, 건조시키고, 특히 분무 건조시킨다.

분리된 고체를, 이미 상기에 기재된 바와 같이, 대용량 발효 방법의 범위 내에서 가공할 수 있으며, 이를 병행 작동시켜 이차 생성물을 수득한다.

상기 절차의 또다른 바람직한 실시양태에서, 발효시 미생물에 의해 생산된 대사물 B는 폴리히드록시알카노에이트 형태를 취한다. 발효를 수행하기 위해, 다른 탄소 공급원료에 대해 기재된 바, 예를 들어 문헌 [S.Y.　Lee, Plastic Bacteria? Progress and prospects for polyhydroxyalkanoates production in bacteria, Tibtech, Vol. 14, (1996), pp.　431-438]에 기재된 바와 유사한 조건 및 절차를 이용할 수 있다.

상기 방법의 변법을 수행하기 위해, 리보플라빈에 대해 기재된 바와 같은 절차를 수행할 수 있다. (ii)에 따라 정제하고, 바람직하게는 본질적으로 고체로부터 분리된 당-함유 액체 배지를 폴리히드록시알카노에이트의 제조를 위해 (ii)에 따라 발효에 공급한다. 고체 분리 단계에서 수득한 투명한 유출 액체를 부분적으로 증발시키고, 적절하게는 염화칼슘으로 처리하고, 건조시키고, 특히 분무 건조시킨다.

(ii)에 따라 제조된 폴리히드록시알카노에이트-함유 발효액은 다른 탄소 공급원료에 대해 기재된 바, 예를 들어 US　4310684 및 EP　355307에 기재된 바와 유사한 조건하에서 유사한 절차를 이용하여 제조될 수 있다. 발효액을 모두 저온살균시킨 후에, 남아있는 고체를 예를 들어 원심분리 또는 여과에 의해 분리한다. 고체 분리 단계에서 수득한 투명한 유출 액체를 부분적으로 증발시키고, 적절하게는 염화칼슘으로 처리하여 건조, 특히 분무 건조시킨다. 폴리히드록시알카노에이트를 공지된 방식으로, 예를 들어 US　4310684 또는 EP　355307에 기재된 바와 같이 추가로 정제하였다.

하기 실시예는 본 발명의 각각의 측면을 설명하고자 하는 것이며, 본 발명을 한정하는 것으로 이해되어서는 안된다.

I. 전분 공급원료의 분쇄

하기 사용되는 분말기재는 다음과 같이 제조된다. 회전 분쇄기를 이용하여 전체 옥수수 인을 완전히 연마하였다. 상이한 회전날, 분쇄 경로 또는 스크린 요소를 이용하여, 3가지 정도의 분말도를 수득하였다. 실험실용 전동 스크린 (진동 분석기: 렛슈 바이브로트로닉형(Retsch Vibrotronic type)　VE1; 스크리닝 시간 5분, 진폭: 1.5　mm)에 의한 분말기재의 스크린 분석은 표 1에 나타나는 결과를 제공하였다.

II.　효소적 전분 액화 및 전분 당화

II.1.　당화 단계에서의 피타제 부재

II.1a) 효소적 전분 액화

건조-분쇄된 옥수수 가루 (T71/03) 320　g을 물 480　g과 함께 현탁하고, 염화칼슘 310　mg을 지속적으로 교반하여 혼합하였다. 교반을 전체 실험 동안 지속하였다. H₂SO₄를 사용하여 pH를 6.5로 맞추고, 혼합물 35℃로 가열한 후에, 테르마밀 120 L형 (노보자임스 A/S) 2.4　g을 첨가하였다. 40분의 시간 동안, 필요한 경우에 NaOH를 사용하여 pH를 상기 값으로 재조정하면서 반응 혼합물을 86.5℃의 온도로 가열하였다. 30분 이내에, 추가의 건조-분쇄된 옥수수 가루 (T71/03) 400　g을 첨가하고, 이 방법 동안 온도를 91℃로 상승시켰다. 반응 혼합물을 상기 온도에서 대략 100분 동안 유지하였다. 추가의 테르마밀 120L 2.4　g을 후속적으로 첨가하고, 상기 온도를 대략 100분 동안 유지하였다. 요오드-전분 반응을 이용하여 실험 동안 액화의 진행을 모니터링하였다. 상기 온도를 최종적으로 100℃로 상승시키고, 반응 혼합물을 추가 20분 동안 비등시켰다. 이 시점에서 전분은 더 이상 검출되지 않았다. 반응기를 35℃로 냉각시켰다.

II.1b) 당화

II.1a)에서 수득한 반응 혼합물을 일정하게 교반하면서 61℃로 가열하였다. 교반을 전체 실험 동안 지속하였다. H₂SO₄를 사용하여 pH를 4.3으로 조정한 후에 덱스트로자임　GA (노보자임스 A/S) 10.8　g (9.15　ml)을 첨가하였다. 온도를 대략 3시간 동안 유지하고, 이 시간 동안 반응의 진행을 글루코스 시험대 (베링거(Boehringer)사의 S-글루코테스트(Glucotest))로 모니터링하였다. 결과를 하기 표 2에 나타냈다. 그 후에, 반응 혼합물을 80℃로 가열하고, 이어서 냉각시켰다. 이는 대략 1.2　kg/ℓ의 밀도, 및 적외선 건조기에 의해 측정한 바와 같은 대략 53.7 중량％의 건조 물질 함량를 갖는 액체 생성물 대략 1180　g을 제공하였다. 물로 세척한 후에, 건조 물질 함량 (수용성 성분 무함유)은 대략 14 중량％였다. 반응 혼합물의 글루코스 함량은 HPLC로 측정한 바에 의하면 380　g/ℓ였다 (표　2, 샘플 7번 참조).

II.2.　당화 단계에서 피타제 함유

II.2a) 전분 액화

건조-분쇄된 옥수수 가루 샘플을 II.1a)에 기재된 바와 같이 액화하였다.

II.2b) 당화

II.2a)에서 수득한 반응 혼합물을 계속 교반하면서 61℃로 가열하였다. 실험하는 동안 내내 계속 교반하였다. H₂SO₄를 사용하여 pH를 4.3으로 상승시킨 후에 덱스트로자임　GA (노보자임스 A/S) 10.8　g (9.15　ml)을 첨가하고, 피타제 (피타제 700 유닛, 바스프 아게사의 나투피트(Natuphyt) 액체 10000L) 70 ㎕를 첨가하였다. 온도를 대략 3시간 동안 유지하고, 이 시간 동안 반응의 진행을 글루코스 시험대 (베링거사의 S-글루코테스트)로 모니터링하였다. 그 후에, 반응 혼합물을 80℃로 가열하고, 이어서 냉각시켰다. 수득한 생산물을 적외선 건조기를 이용하여 건조시키고, 물로 세척하였다. 반응 혼합물 중 글루코스 함량은 HPLC에 의해 결정하였다.

II.3 효소적 전분 액화 및 전분 당화를 위한 다른 프로토콜

II.3a) 옥수수 가루

탈이온수 360 g을 반응 용기에 도입하였다. CaCl₂ 원액 (100 g CaCl₂×2H₂O/ℓ) 1.54　ml를 맥아즙 중 대략 70　ppm Ca²⁺의 최종 농도로 첨가하였다. 옥수수 가루 240　g을 일정하게 교반하면서 물에 서서히 넣었다. 50 중량％의 NaOH 수용액을 사용하여 pH를 6.5로 상승시킨 후에, 테르마밀 120 L형 (노보자임스 A/S) 4.0 ml (= 효소 2 중량％/건조 물질)를 첨가하였다. 이어서, 맥아즙을 신속히 85℃로 가열하였다. 이 방법 동안, 계속적으로 모니터링하고, 적절하게는 pH를 조정하는 것이 필요하다.

최종 온도에 도달한 후에, 초기에 가루 50　g으로 시작하여 추가의 가루를 첨가하였다. 또한, Ca²⁺ 농도를 70 ppm에서 유지하기 위해 CaCl₂ 원액 0.13 ml를 맥아즙에 첨가하였다. 첨가하는 동안, 온도를 85℃에서 일정하게 유지하였다. 추가 부분 (가루 50　g 및 CaCl₂ 원액 0.13　ml)을 첨가하기 전에 반응을 확실하게 완료시키기 위해 적어도 10분 동안 통과하도록 하였다. 2회 분량을 첨가한 후에, 테르마밀 1.67　ml를 첨가하고; 이어서, 추가 2회 분량 (각 경우에 가루 50　g 및 CaCl₂ 원액 0.13　ml)을 첨가하였다. 55 중량％의 건조 물질 함량에 이르렀다. 첨가 후에, 온도를 100℃로 올리고, 맥아즙을 10분 동안 비등시켰다.

샘플을 채취하고, 실온으로 냉각시켰다. 샘플을 탈이온수로 희석 (대락 1:10)시킨 후에, 농축된 루골(Lugol) 용액 (리터 당 I 5 g과 KI 10 g의 혼합물)을 한 방울을 첨가하였다. 진한 청색은 남아있는 전분의 함량을 나타내며, 전분이 모두 가수분해되었을 때 갈색으로 변한다. 시험에서 전분이 여전히 남아있는 것으로 나타나는 경우, 온도를 다시 85℃로 내리고, 그 온도로 일정하게 유지하였다. 요오드/전분 반응이 음성이 될 때까지 추가의 테르마밀 1.67 ml를 첨가하였다.

이어서 전분에 대해 음성인 것으로 시험된 혼합물을 후속의 당화 반응을 위해 61℃가 되게 하였다. 50％의 진한 황산을 첨가하여 pH를 4.3으로 조정하였다. 반응하는 동안 pH를 상기 값으로 유지하였다. 온도를 61℃에서 유지하였다. 덱스트로자임 GA (노보자임스 A/S) 5.74 ml (= 효소 1.5 중량％/건조 물질)를 첨가하여 액화 전분을 글루코스로 전환시켰다. 반응을 1시간 동안 진행하였다. 효소를 불활성화시키기 위해, 혼합물을 85℃에서 가열하였다. 멸균시킨 용기를 고온의 혼합물로 충전하고, 냉각시킨 후에 4℃에 보관하였다.

II.3b) 호밀 가루 (셀룰라제/헤미셀룰라제를 사용한 예비처리 포함)

탈이온수 360 g을 반응 용기에 도입하였다. 호밀 가루 155　g을 일정하게 교반하면서 물에 천천히 풀었다. 온도를 50℃에서 일정하게 유지하였다. NaOH 수용액 50 중량％를 사용하여 pH를 5.5로 맞춘 후, 비스코자임(Viscozyme) L (노보자임스 A/S 3.21 ml (= 효소 2.5 중량％/건조 물질)을 첨가하였다. 30분 후, 추가의 가루의 첨가를 시작하였다; 처음에 가루 55 g을 첨가하였다. 추가의 30분 후 또다른 50 g의 가루를 첨가하고, 30분 후 또다른 40 g의 가루를 첨가하였다. 마지막 첨가 30분 후 액화를 시작할 수 있었다.

CaCl₂ 원료 용액 1.7 ml (100 g CaCl₂·2H₂O/l)을 첨가하였다. NaOH 수용액 50 중량％를 사용하여 pH를 5.5로 맞춘 후, 테르마밀 120 L형 L (노보자임스 A/S) 5.0 ml (= 효소 2 중량％/건조 물질)을 첨가하였다. 그 후, 매쉬를 급속하게 85℃로 가열하였다. 상기 공정 동안, pH를 계속 모니터링하고, 적절하게는 조절하였다.

최종 온도에 도달한 후, 추가의 가루의 첨가를 처음에 가루 60 g으로 시작하였다. 또한, CaCl₂ 원료 용액 0.13 ml을 매쉬에 첨가하여 Ca²⁺ 농도를 70 ppm으로 유지하였다. 첨가 동안, 온도를 일정한 85℃에서 유지하였다. 10분 이상의 시간이 경과하도록 하여 반응이 종료되도록 한 후, 추가의 부분 (가루 40　g 및 CaCl₂ 원료 용액 0.1　ml)을 첨가하였다. 2 부분의 첨가 후, 테르마밀 1.1 ml을 첨가한 후, 추가의 부분 (가루 40　g 및 CaCl₂ 원료 용액 0.1　ml)을 첨가하였다. 55 중량％의 건조 물질 함량에 도달하였다. 첨가 후, 온도를 100℃로 상승시킨 후, 매쉬를 10분 동안 비등시켰다.

샘플을 취하고, 실온으로 냉각시켰다. 샘플을 탈이온수로 희석한 후 (대략 1:10), 농축된 루골 용액 (리터당 I 5 g 및 KI 10 g의 혼합물) 한 방울을 첨가하였다. 짙은 청색은 잔류 전분 함량을 지시하며, 색상은 모든 전분이 가수분해되었을 때 변한다. 시험은 전분이 여전히 잔류함을 지시하였으며, 온도를 다시 85℃로 내리고, 일정하게 유지하였다. 추가의 1.1 ml의 테르마밀을 요오드/전분 반응이 음성이 될 때까지 첨가하였다.

그 후, 전분에 대해 음성으로 시험된 혼합물을 후속의 당화 반응을 위해 61℃로 맞추었다. 50％ 농도의 황산을 첨가하여 pH를 4.3으로 맞추었다. 반응 과정 동안 pH를 상기 값에서 유지하였다. 온도를 61℃에서 유지하였다. 덱스트로자임 GA (노보자임스 A/S) 5.74 ml (= 효소 1.5 중량％/건조 물질)를 첨가하여 액화된 전분을 글루코스로 전환시켰다. 반응을 1시간 동안 계속하였다. 효소를 불활성화시키기 위해, 혼합물을 85℃에서 가열하였다. 멸균 용기를 고온 혼합물로 충전하고, 냉각시킨 후, 4℃에서 저장하였다.

II.3c) 밀 가루 (크실라나제를 사용한 예비처리 포함)

탈이온수 360 g을 반응 용기에 도입하였다. 물을 55℃로 가열하고, NaOH 수용액 50 중량％를 사용하여 pH를 6.0으로 조정하였다. 온도 및 pH를 조정한 후, 쉐아르자임(Shearzyme) 500L (노보자임스 A/S) 3.21 ml ( = 효소 2.5 중량％/건조 물질)을 첨가하였다. 밀 가루 155 g을 일정하게 교반하면서 용액에 천천히 풀었다. 온도 및 pH를 일정하게 유지하였다. 30분 후, 추가의 가루를 첨가하였다; 처음에 가루 55 g을 첨가하였다. 추가의 30분 후, 또다른 50 g의 가루를 첨가하고, 30분 후 추가의 40 g의 가루를 첨가하였다. 마지막 첨가 30분 후 액화를 시작할 수 있었다.

액화 및 당화는 II.3b에 기재된 바와 같이 수행하였다.

III.　리신-과생성 씨. 글루타미쿰 균주 ATCC13032 lysC^fbr의 제작

III.1　플라스미드 pCIS lysC의 제작

균주 제작의 제1 단계에서, 효소 아스파르테이트 키나제 (lysC)를 코딩하는 야생형 유전자의 대립유전자 치환을 씨. 글루타미쿰 ATCC13032에서 수행하였다. 여기서, 생성된 단백질에서 311 위치의 아미노산 Thr이 Ile로 치환되도록 뉴클레오티드 치환을 lysC 유전자에서 수행하였다. PCR 반응에 대한 주형으로서 ATCC13032로부터의 염색체 DNA로부터 출발하여, lysC를 올리고뉴클레오티드 프라이머

및

를 사용해 Pfu-터보(Turbo) PCR 시스템 (스트라타진(Stratagene), 미국)로 제조업자의 지시서에 따라 증폭시켰다. 씨. 글루타미쿰 ATCC 13032로부터의 염색체 DNA를 문헌 [Tauch et al. (1995) Plasmid 33:168-179] 또는 [Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140:1817-1828]의 방법에 의해 제조하였다. 증폭된 단편을 그의 5' 말단에서 SalI 제한 절단 부위 및 그의 3' 말단에서 MluI 제한 절단 부위에 의해 플랭킹시켰다. 클로닝 전, 증폭된 단편을 상기 2개의 제한 효소로 다이제스쳔하고, GFX(상표명)PCR, DNA 및 겔 밴드 정제 키트 (아머샴 파마시아(Amersham Pharmacia) 프라이부르크 소재)로 정제하였다.

생성된 폴리뉴클레오티드를 SalI 및 MluI 제한 절단을 통해 pCLIK5 MCS 인테그라티브(integrativ) SacB (이하 pCIS, (서열 3)으로 지칭함)로 클로닝하고, 이. 콜라이 XL-1 블루 내로 형질전환시켰다. 플라스미드-함유 세포에 대한 선별은 LB 한천 (문헌 [Lennox, 1955, Virology, 1:190])을 함유하는 카나마이신 (20 ㎍/ml) 상에 플레이팅함으로써 수행하였다. 플라스미드를 단리하고, 예측된 뉴클레오티드 서열을 시퀀싱에 의해 확인하였다. 플라스미드 DNA의 제조는 퀴아젠(Quiagen)사의 방법 및 재료에 의해 수행하였다. 시퀀싱 반응은 문헌 [Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467]의 방법에 의해 수행하였다. 시퀀싱 반응은 ABI　프리즘(Prism)　377 (PE 어플라이드 바이오시스템스(PE Applied Biosystems), 바이터스타트 소재)에 의해 분리하고 평가하였다. 생성된 플라스미드를 pCIS lysC (서열 4)로 지칭하였다. 이는 하기 필수 부분을 포함한다.

III.2 씨. 글루타미쿰 lysC 유전자의 돌연변이유발

씨. 글루타미쿰 lysC 유전자의 지정 돌연변이유발을 퀵체인지 키트(QuickChange Kit) (스트라타진, 미국)을 사용하여 제조업자의 지시서에 따라 수행하였다. 돌연변이유발을 플라스미드 pCIS　lysC (서열 4)에서 수행하였다. thr　311를 311　ile로 치환하기 위해 하기 올리고뉴클레오티드 프라이머를 퀵체인지 방법 (스트라타진)으로 합성하였다.

퀵체인지 반응에서 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머의 사용은 lysC 유전자 (서열 7)에서 932 위치의 뉴클레오티드의 치환 (C를 T로)을 유도하였다. lysC 유전자에서 생성된 아미노산 치환 Thr 311Ile를, 이. 콜라이 XL1-블루의 형질전환 및 플라스미드 제조 후 시퀀싱 반응에 의해 확인하였다. 플라스미드를 pCIS lysC thr311ile (서열 8)라 칭하였다. 이는 하기 필수 부분을 포함한다.

III.3 pCIS lysC thr311ile의 씨. 글루타미쿰 (균주 ATCC13032) 내로의 형질전환

플라스미드 pCIS lysC thr311ile를 문헌 [Liebl et al., FEMS Microbiology Letters 53:299-303 (1989)]에 기재된 바와 같은 전기천공에 의해 씨. 글루타미쿰 ATCC13032 내로 형질전환시켰다. 프로토콜의 변형은 DE　10046870에 기재되어 있다. 개별 형질전환체의 lysC 좌위의 염색체 배열을 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (1989)]에 기재된 바와 같은 서던 블롯 및 혼성화에 의한 표준 방법을 사용하여 확인하였다. 그에 의해, 형질전환체는 형질전환된 플라스미드가 동형 재조합에 의해 lysC 좌위에 통합된 것임이 입증되었다. 이러한 콜로니를 항생제가 없는 배지에서 밤새 성장시키고, 세포를 공급원 CM 한천 배지 (10％ 공급원) 상에 플레이팅하고, 30℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다.

벡터 pCIS lysC thr311ile에 존재하는 scaB 유전자가 공급원을 독성 생성물로 전환시켰기 때문에, 야생형 유전자 lysC 및 돌연변이된 유전자 lysC thr311ile 사이의 제2 동형 재조합 단계에 의해 결실된 sacB 유전자를 갖는 상기 콜로니만이 성장할 수 있었다. 동형 재조합 동안, 야생형 유전자 또는 돌연변이된 유전자는 sacB 유전자에 의해 함께 결실될 수 있었다. sacB 유전자를 야생형 유전자와 함께 제거할 경우, 돌연변이된 형질전환체가 생성된다.

성장하는 콜로니를 집어 내어서 카나마이신-감수성 표현형에 대해 연구하였다. 결실된 sacB를 갖는 클론은 동시에 카나마이신-감수성 성장 거동을 입증해야 한다. 이러한 카나마이신-감수성 클론을 진탕 플라스크에서 그의 리신 생산성에 대해 연구하였다. 비교용으로, 비처리된 씨. 글루타미쿰 ATCC13032를 성장시켰다. 리신 생산이 대조군에 비해 증가된 클론을 선별하고, 염색체 DNA를 수득하고, lysC 유전자의 상응하는 영역을 PCR 반응 (Pfu-터보 PCR 시스템; 스트라타진, 미국)에 의해 제조업자의 지시서에 따라 증폭하고, 시퀀싱하였다 ([Sanger et al.] 상기 문헌의 방법에 의해). 향상된 리신 합성 및 위치 932에서 lysC의 확인된 돌연변이라는 특징을 갖는 이러한 클론을 ATCC13032 lysC^fbr이라 지칭하였다.

실시예 1

a)　효소적 전분 액화 및 전분 당화

건조-분쇄된 옥수수 가루 500 g을 물 750　ml에 현탁시키고, 다시 블렌더에서 미세 분쇄하였다. 현탁액을 4개의 샘플 번호 1 내지 번호 4로 나누고, 각각을 대략 3 g의 열-안정성 α-아밀라제 (샘플 번호　1 및 2: 테르마밀　L; 샘플 번호 3 및 4: 스페자임)로 처리하였다. 이어서, 샘플 번호　2 및 4를 대략 7　g/l 글루코아밀라제 (샘플 번호　2: 덱스트로자임　GA; 샘플　번호　4: 옵티덱스)로 처리하였다. 이로써 고체 내용물이 각각의 경우에 원심분리에 의해 분리된 담황성 점성 샘플을 수득하였으며, 공정 동안 소수성 고체층은 투명 액상의 상부 위에 부동하였다.

농축된 형태 및 10배 희석된 생성된 샘플의 투명 상청액을, 스펀-다운(spun-down) 펠릿을 무시하거나 고려한 HPLC에 의해 분석하였다. 펠릿을 고려할 때, 펠릿 건조-물질 함량을 50 중량％로 가정하였다. 출발 샘플을 기준으로 한 결과는 하기 표 3에 열거되어 있다.

b) 발효

실시예 II.1에 따라 수득된 2개의 옥수수 가루 가수분해물을 코리네박테리움 글루타미쿰를 사용한 진탕-플라스크 실험 (플라스크 4 내지 9)에 사용하였다. 또한, 실시예 II.1과 유사하게 제조된 밀 가루 가수분해물을 병행으로 사용하였다 (플라스크 1 내지 3).

1b.1) 접종물의 제조

세포를 멸균 CM 한천 (조성: 하기 표 4 참조; 121℃에서 20분) 상에 스트리킹(streaking)한 후, 30℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 플레이트로부터 스크랩하고, 염수에 재현탁시켰다. 250 ml 엘른마이어 플라스크 내의 배지 25 ml (하기 표 5 참조)을, 각각의 경우에 이렇게 제조된 세포 현탁액의 양이 광학 밀도가 600 nm에서 OD₆₀₀값 1에 도달하도록 접종하였다.

1b.2)　발효액의 제조

플라스크 배지 1 내지 9의 조성은 하기 표 5에 열거되어 있다.

^* 희석 NaOH 수용액으로 조정함

^** 가수분해물 중 글루코스 농도

^*** 배지의 리터당 칭량된 가수분해물의 양

접종 후, 플라스크를 습화된 진탕기에서 진탕하면서 (200 rpm) 30℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 발효가 종료된 후, 당 및 리신 함량을 HPLC에 의해 측정하였다. HPLC는 아질런트(Agilent) 1100 시리즈 LC 시스템으로 수행하였다. 오르토-프탈데히드를 사용한 프레-컬럼 유도체화는 형성된 아미노산의 정량을 가능하게 한다. 생성물 혼합물을 아질런트 히페르실(Agilent Hypersil)　AA 컬럼을 사용하여 분리하였다. 결과는 하기 표 6에 나타나 있다.

모든 플라스크에서, 글루코스 영양분 용액을 사용한 표준 발효에서 수득된 수율에 상응하는 대략 30 내지 40 g/l 정도의 필적할만한 양으로 리신이 생성되었다.

실시예 2: 발효

실시예 II.1에 기재된 바와 같이 수득된 옥수수 가루 가수분해물을 사용하여, 발효를 III에 기재된 균주 ATCC13032 lysC^fbr를 사용하여 실시예 1b)와 유사하게 수행하였다. 세포를 멸균 CM 한천 (조성: 표 4; 121℃에서 20분) 상에서 30℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 플레이트로부터 스크랩하고, 염수에 재현탁시켰다. 250 ml 엘른마이어 플라스크에서 배지 1 또는 2 (표 5 참조) 25 ml을 각각의 경우에 이렇게 제조된 세포 현탁액의 양이 광학 밀도가 610 nm에서 OD₆₁₀값 1에 도달하도록 접종하였다. 그 후, 샘플을 습화된 진탕기 (상대 대기 습도 85％)에서 200 rpm으로 30℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 배지 중 리신 농도를 HPLC에 의해 측정하였다. 모든 경우에, 대략 동일한 리신 양이 생성되었다.

실시예 3

실시예 II.3a에 따라 수득된 옥수수 가루 가수분해물을 코리네박테리움 글루타미쿰 (ATCC13032 lysC^fbr)을 사용하여 진탕-플라스크 실험 (플라스크 1+2)에 사용하였다. 또한, 실시예 II.3과 유사하게 제조된 호밀 가루 가수분해물 (플라스크 5+6) 및 밀 가루 가수분해물 (플라스크 3+4)을 병행 사용하였다.

3.1) 접종물의 제조

멸균 CM+CaAc 한천 (조성: 하기 표 7 참조; 121℃에서 20분) 상에 스트리킹한 후, 세포를 30℃에서 48시간 동안 인큐베이션한 후, 신선한 플레이트 상에 접종하고, 30℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 플레이트로부터 스크랩하고, 염수에 재현탁시켰다. 2개의 배플(baffle)이 구비된 250 ml 엘른마이어 플라스크에 배지 23 ml (하기 표 8 참조)을, 각각의 경우 이렇게 제조된 세포 현탁액의 양이 광학 밀도가 610 nm에서 OD₆₁₀값 0.5에 도달하도록 접종하였다.

3.2) 발효액의 제조

배지 1 내지 6의 조성은 하기 표 8에 나타나 있다. 적합한 양의 글루코스 용액을 가루 가수분해물 대신 대조군 배지에 사용하였다.

^* 희석 NaOH 수용액으로 조정함

^** 가수분해물 중 글루코스 농도

^*** 배지의 리터당 칭량된 가수분해물의 양

접종 후, 플라스크를 습화된 진탕기에서 진탕하면서 (200 rpm) 30℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 발효가 종료된 후, 당 및 리신 함량을 HPLC에 의해 측정하였다. HPLC 분석은 아질런트 1100 시리즈 LC 시스템으로 수행하였다. 아미노산의 정량은 오르토-프탈데히드를 사용한 프레-컬럼 유도체화를 필요로 하고, 분리는 아질런트 조르박스 익스텐드(Agilent Zorbax Extend) C18 컬럼 상에서 수행하였다. 결과는 하기 표 9에 나타나 있다.

모든 플라스크에서, 글루코스 영양분 용액을 사용한 표준 발효에서 수득된 수율에 상응하는 대략 10 내지 12 g/l 정도의 필적할만한 양으로 리신이 생성되었다.

3.3) 리신의 단리

리신을 단리하기 위해, 고체를 원심분리에 의해 발효액으로부터 분리하는 제1 단계를 수행하는 것이 통상적이다. 예를 들어 막 여과와 같은 여과 방법은 또한 원심분리에 대한 별법으로서 사용될 수 있다. 그 후, 이제 고체가 없는 발효액을 산성화시키고 (예를 들어 황산 사용), 그에 의해 리신이 단독 또는 이중 양성자화된 형태로 존재한다. 이어서, 상기 산성화된 액을 양이온 교환제에 통과시켜 리신이 이온 교환제에 결합되도록 하였다. 물로 세척한 후, 암모니아수를 이온 교환제에 통과시켜 리신을 용리하였다. 용리액을 증발시켰다. 이어서, 이제 유리 염기 형태로 용리액에 존재하는 리신을 염산 첨가에 의해 리신 염화물로 전환시키고, 결정화하였다. 결정체를 원심분리에 의해 결정성 현탁액으로부터 분리한 후, 최종 단계에서 건조시켰다. 본 방법으로 고 순도 (98.5 중량％ 이상의 리신^* HCl)의 결정질 리신을 수득하였다. 본 방법 뿐만 아니라 리신 후처리에 대한 별법의 상세한 설명은 문헌 ["Ikeda, M.: Amino Acid Production Processes. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Vol. 79 (2003), 1-35"] 및 ["Hermann, T.: Industrial production of amino acids by coryneform bacteria. Journal of Biotechnology 104 (2003), 155-172"]에서 발견할 수 있다.

실시예 4

실시예 II.3a에 기재된 바와 같은 옥수수 가루 가수분해물을 진탕-플라스크 실험 (플라스크 1 내지 3)에 사용하였다. 바실러스 PA824 (상세한 설명은 WO 02/061108 참조)를 판토테네이트-생산 균주로서 사용하였다. 또한, 실시예 II.3과 유사하게 제조된 호밀 가루 가수분해물 (플라스크 7 내지 9) 및 밀 가루 가수분해물 (플라스크 4 내지 6)을 병행으로 사용하였다.

4.1) 접종물의 제조

2개의 배플이 구비된 250 ml 엘른마이어 플라스크에 예비배양 배지 (하기 표 10 참조) 42 ml을 각각의 경우에 동결된 배양물 0.4 ml로 접종하고, 습화된 진탕기에서 진탕하면서 (250 rpm) 43℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다.

^* 희석 KOH 수용액으로 조정함

2개의 배플이 구비된 250 ml 엘른마이어 플라스크에 주 배양 배지 (하기 표 11 참조) 42 ml을 각각의 경우 예비배양물 1 ml로 접종하였다.

4.2) 발효액의 제조

플라스크 배지 1 내지 9의 조성은 하기 표 11에 나타나 있다. 적합한 양의 글루코스 용액을 가루 가수분해물 대신 대조군 배지에 사용하였다.

^* 희석 NaOH 수용액으로 조정함

^** 가수분해물 중 글루코스 농도

^*** 배지의 리터당 칭량된 가수분해물의 양

접종 후, 플라스크를 습화된 진탕기에서 진탕하면서 (250 rpm) 43℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 발효가 종료된 후, 글루코스 및 판토텐산 함량을 HPLC에 의해 측정하였다. 글루코스를 바이오-래드(Bio-Rad)사의 아미넥스(Aminex) HPX-87H 컬럼으로 측정하였다. 판토텐산 농도를 페노메넥스(Phenomenex)사의 아쿠아(Aqua) C18-컬럼 상의 분리에 의해 측정하였다. 결과는 하기 표 12에 나타나 있다.

모든 플라스크에서, 글루코스 영양분 용액을 사용한 표준 발효에서 수득된 수율에 상응하는 대략 1.5내지 2 g/l 정도의 필적할만한 양으로 리신이 생성되었다.

생성물은 예를 들어 WO 02/24001, WO 02/072857 및 WO 05/028659에 기재된 바와 같이 후처리할 수 있다.

실시예 5

실시예 II.3a에 기재된 바와 같이 수득된 옥수수 가루 가수분해물을 아스페르길러스 니게르를 사용한 진탕-플라스크 실험 (플라스크 1 내지 3)에 사용하였다. 또한, 실시예 II.3과 유사하게 제조된 호밀 가루 가수분해물 (플라스크 7 내지 9) 및 밀 가루 가수분해물 (플라스크 4 내지 6)을 병행으로 사용하였다.

5.1) 균주

glaA 프로모터의 제어하에 아스페르길러스 피쿰 phyA 유전자의 6개 카피를 갖는 아스페르길러스 니게르 피타제 생산 균주를 WO 98/46772에 상세히 기재된 NP505-7의 제조와 유사하게 제조하였다. 3개의 변형된 glaA 앰플리콘을 갖지만 (ISO505와 유사) 통합된 phyA 발현 카세트를 갖지 않는 균주를 대조군으로서 사용하였다.

5.2) 접종물의 제조

1개의 배플이 구비된 100 ml 엘른마이어 플라스크에 예비배양 배지 (하기 표 13 참조) 20 ml을 각각의 경우 동결된 배양물 100 ㎕로 접종하고, 습화된 진탕기에서 진탕하면서 (170 rpm) 34℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다.

^* 희석 황산으로 조정함

1개의 배플이 구비된 250 ml 엘른마이어 플라스크에 주 배양 배지 (하기 표 14 참조) 50 ml을 각각의 경우 예비배양물 5 ml로 접종하였다.

5.3) 발효액의 제조

플라스크 배지 1 내지 9의 조성은 하기 표 14에 나타나 있다. 적합한 양의 글루코스 용액을 가루 가수분해물 대신 대조군 배지에 사용하였다.

^* 희석 황산으로 조정함

^** 가수분해물 중 글루코스 농도

^*** 배지의 리터당 칭량된 가수분해물의 양

접종 후, 플라스크를 습화된 진탕기에서 진탕하면서 (170 rpm) 34℃에서 6일 동안 인큐베이션하였다. 발효가 종류된 후, 피타제 활성을 분석으로 측정하였다. 발효가 종료된 후, 피타제 활성을, 기질로서 피트산을 사용해 250 mM 아세트산/나트륨 아세테이트/트윈 20 (0.1 중량％) 중 적합한 피타제 활성 수준 (표준: 0.6 U/ml)으로, pH 5.5 완충액에서 측정하였다. 분석을 미량역가판 (MTP)에 사용하기 위해 표준화하였다. 효소 용액 10 ㎕을 pH 5.5의 250 mM 아세트산나트륨 완충액 중 6.49 mM 피테이트 용액 140 ㎕ (피테이트: 피트산 도데카나트륨 염)과 혼합하였다. 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 동일한 부피 (150 ㎕)의 트리클로로아세트산의 첨가에 의해 반응을 종료시켰다. 상기 혼합물의 분취액 (20 ㎕)을 0.32N H₂SO₄, 몰리브덴산암모늄 0.27 중량％ 및 아스코로브산 1.08 중량％를 포함하는 용액 280 ㎕로 옮겼다. 청색 용액의 흡수도를 820 nm에서 측정하였다. 결과는 하기 표 15에 나타나 있다.

생성물을 WO 98/55599에 기재된 바와 같이 후처리하였다.

실시예 6

실시예 II.3a에 기재된 바와 같이 수득된 옥수수 가루 가수분해물을 아쉬비아 고시피를 사용한 진탕-플라스크 실험 (플라스크 1 내지 4)에 사용하였다. 또한, 실시예 II.3과 유사하게 제조된 호밀 가루 가수분해물 (플라스크 9 내지 12) 및 밀 가루 가수분해물 (플라스크 5 내지 8)을 병행으로 사용하였다.

6.1) 균주

사용된 리보플라빈-생산 균주는 아쉬비아 고시피 ATCC 10895 (또한 문헌 [Schmidt G. et al. Inhibition of purified isocitrate lyase identified itaconate and oxalate as potential antimetabolites for the riboflavin overproducer Ashbya gossypii. Microbiology 142: 411-417, 1996] 참조)였다.

6.2) 접종물의 제조

세포를 멸균 HMG 한천 (조성: 하기 표 16 참조; 121℃에서 20분) 상에 스트리킹한 후, 28℃에서 72시간 동안 인큐베이션하였다.

그 후, 2개의 배플이 구비된 250 ml 엘른마이어 플라스크에 예비배양 배지 (하기 표 17 참조) 50 ml을 각각의 경우 1개의 루프-풀(loop-full)의 세포로 접종하고, 습화된 진탕기에서 진탕하면서 (180 rpm) 28℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다.

^* 희석 NaOH 수용액으로 조정함

2개의 배플이 구비된 250 ml 엘른마이어 플라스크에 주 배양 배지 (하기 표 18 참조) 50 ml을 각각의 경우 예비배양물 5 ml로 접종하였다.

6.3) 발효액의 제조

플라스크 배지 1 내지 12의 조성은 하기 표 18에 나타나 있다. 적합한 양의 글루코스 용액을 가루 가수분해물 대신 대조군 배지에 사용하였다.

^* 희석 NaOH 수용액으로 조정함

^** 가수분해물 중 글루코스 농도

^*** 배지의 리터당 칭량된 가수분해물의 양

접종 후, 플라스크를 습화된 진탕기에서 진탕하면서 (180 rpm) 28℃에서 6일간 인큐베이션하였다. 발효가 종료된 후, 비타민 B₂ 함량을 HPLC에 의해 측정하였다. 결과는 하기 표 19에 나타나 있다.

생성물을 EP 00345717에 기재된 바와 같이 후처리할 수 있다.

실시예 7

실시예 II.3a에 기재된 바와 같이 수득된 옥수수 가루 가수분해물을 코리네박테리움 글루타미쿰를 사용한 진탕-플라스크 실험 (플라스크 1 내지 3)에 사용하였다. 또한, 실시예 II.3과 유사하게 제조된 호밀 가루 가수분해물 (플라스크 7 내지 9) 및 밀 가루 가수분해물 (플라스크 4 내지 6)을 병행으로 사용하였다.

7.1) 균주

당업자는 메티오닌을 생산하는 코리네박테리움 균주를 숙지하고 있다. 이러한 균주의 제조는 예를 들어 문헌 [Kumar D. Gomes J. Biotechnology Advances, 23(1):41-61, 2005]; [Kumar D. et al. Process Biochemistry, 38:1165-1171, 2003]; WO 04/024933 및 WO 02/18613에 기재되어 있다.

7.2) 접종물의 제조

멸균 CM+Kan 한천 (조성: 하기 표 20 참조; 121℃에서 20분)에서 스트리킹한 후, 세포를 30℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 플레이트로부터 스크랩하고, 염수에 재현탁시켰다. 2개의 배플이 구비된 250 ml 엘른마이어 플라스크에 배지 35 ml (표 5 참조)을, 각각의 경우 이렇게 제조된 세포 현탁액의 양이 광학 밀도가 610 nm에서 OD₆₁₀값 0.5에 도달하도록 접종하였다.

7.3) 발효액의 제조

플라스크 배지 1 내지 9의 조성은 하기 표 21에 나타나 있다. 적합한 양의 글루코스 용액을 가루 가수분해물 대신 대조군 배지에 사용하였다.

^* 희석 NaOH 수용액으로 조정함

^** 가수분해물 중 글루코스 농도

^*** 배지의 리터당 칭량된 가수분해물의 양

접종 후, 플라스크를 습화된 진탕기에서 진탕하면서 (200 rpm) 30℃에서 글루코스가 소비될 때까지 인큐베이션하였다. 발효가 종료된 후, 메티오닌 함량을 HPLC (컬럼: 아질런트 조르박스 이클립스 AAA; 방법 lt. 이클립스 AAA 프로토콜, 테크니컬 노트 5980-1193)에 의해 측정하였다. 결과는 하기 표 22에 나타나 있다.

생성물은 예를 들어 WO 05/007862 및 선행 출원 DE 10359668.2에 기재된 바와 같이 후처리할 수 있다.

실시예 8

실시예 II.3a에 기재된 바와 같이 수득된 옥수수 가루 가수분해물을 박테리움 130Z를 사용하여 진탕-플라스크 실험에 사용하였다.

8.1) 균주

박테리움 130Z (ATCC 번호 55618)를 숙시네이트-생산 균주로서 사용하였다.

8.2) 발효액의 제조

120 ml 세럼 플라스크에 주 배양 배지 (하기 표 23 참조) 50 ml을 각각의 경우 동결된 배양액 1 ml로 접종하였다. 세럼 플라스크를 밀봉하기 전에, CO₂를 주입하였다 (0.7 bar).

배지의 조성은 하기 표 23에 열거되어 있다 (참조: 미국 특허 제5,504,004호). 가루 가수분해물 대신, 상응하는 양의 글루코스 용액을 대조군 배지 (최종 글루코스 농도: 100 g/l)에 사용하였다.

^* CO₂/N₂ 분위기하에, 또한 플라스크를 충전하는 동안

^** 가수분해물 중 글루코스 농도

^*** 배지의 리터당 칭량된 가수분해물의 양

접종 후, 세럼 플라스크를 진탕기에서 진탕하면서 (160 rpm) 37℃에서 46시간 동안 인큐베이션하였다. 발효가 종료된 후, 글루코스 및 숙시네이트 함량을 HPLC에 의해 측정하였다. 측정은 바이오-래드사의 아미넥스 HPX-87H 컬럼으로 수행하였다. 결과는 하기 표 24에 나타나 있다.

실시예 9

실시예 II.3a에 기재된 바와 같이 수득된 옥수수 가루 가수분해물을 에쉐리키아 콜라이를 사용한 진탕-플라스크 실험 (플라스크 1 내지 3)에 사용하였다. 또한, 실시예 II.3과 유사하게 제조된 호밀 가루 가수분해물 (플라스크 7 내지 9) 및 밀 가루 가수분해물 (플라스크 4 내지 6)을 병행으로 사용하였다.

9.1) 균주

L-트레오닌을 생산하는 에쉐리키아 콜라이 균주는 당업자에게 공지되어 있다. 이러한 균주의 제조는 예를 들어 EP　1013765 A1, EP 1016710 A2, US 5,538,873에 기재되어 있다.

9.2) 접종물의 제조

세포를 멸균 LB 한천 상에 스트리킹하였다. 적합한 내성 유전자가 당해 균주에 마커로서 존재할 경우 항생제를 LB 한천에 첨가하였다. 예를 들어 카나마이신 (40 ㎍/ml) 또는 암피실린 (100 mg/l)을 상기 목적에 사용할 수 있다. 균주를 30℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 플레이트로부터 스크랩하고, 염수에 재현탁시켰다. 2개의 배플이 구비된 250 ml 엘른마이어 플라스크에 배지 (하기 표 25 참조) 25 ml을, 각각의 경우 이렇게 제조된 세포 현탁액의 양이 광학 밀도가 610 nm에서 OD₆₁₀값 0.5에 도달하도록 접종하였다.

9.3) 발효액의 제조

플라스크 배지 1 내지 9의 조성은 하기 표 25에 나타나 있다. 적합한 양의 글루코스 용액을 가루 가수분해물 대신 대조군 배지에 사용하였다.

^* 희석 NaOH 수용액으로 조정함

^** 가수분해물 중 글루코스 농도

^*** 배지의 리터당 칭량된 가수분해물의 양

접종 후, 플라스크를 습화된 진탕기에서 진탕하면서 (200 rpm) 30℃에서 글루코스가 소비될 때까지 인큐베이션하였다. 발효가 종료된 후, L-트레오닌 함량을 문헌 [Lindroth et al., Analytical Chemistry 51: 1167-1174, 1979]에 기재된 바와 같은 역상 HPLC에 의해 측정하였다.

그 후, 발효액을 수거하고, 발효액에 존재하는 L-트레오닌을 예를 들어 미국 특허 제5,538,873호 및 문헌 [Okamoto et al., Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 61 (11), 1877-1882, 1997]에 기재된 바와 같이 단리하고, 정제하거나 후처리할 수 있다.

실시예 10

추가의 L-아미노산 글루타메이트, 리신, 히스티딘, 프롤린 및 아르기닌을 적합한 균주를 사용함으로써 실시예 9에 기재된 절차와 유사하게 제조하였다. 당해 균주는 예를 들어 EP 1016710에 기재되어 있다.

실시예 11

실시예 II.3과 유사하게 수득된 카사바 가루 가수분해물을 11.2)에 기재된 리신-생산 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 사용하여 진탕-플라스크 실험 (플라스크 1 내지 4)에 사용하였다. 사용된 가루는 하기 크기 분포를 가졌다: 45％ < 100 ㎛, 56％ < 200　㎛, 79％ < 630　㎛.

액화 단계의 시작에서도, 현탁액의 점도는 상대적으로 높아서 카사바 가루는 처음에 35 중량％의 건조 물질 함량에 상응하는 양으로 사용되었다. 그 후, 가루의 적합하게 증가하는 첨가에 의해 마지막에는 55 중량％의 건조 물질 함량에 도달하였다. 현탁액의 점도는 전체 액화 및 당화 공정 동안 상대적으로 높게 유지되었다. 더욱이, 카사바 가루는 공정 과정 동안 응집되는 경향성을 가지며, 응집체는 일부 정도로만 용해되었다. 요오드-전분 시험에서, 존재하는 응집체는 수 분 후 짙은 청색으로 염색되었고, 이는 응집된 전분이 반복된 비등 및 오래 기다린 시간에도 불구하고 완전히 전환되지 않았음을 암시한다.

11.1) 균주

III에 기재된 피드백-조절해제된 아스파르토키나제 ATCC13032 lysC^fbr를 사용해 변형된 야생형을 사용하였다.

11.2) 접종물의 제조

세포를 멸균 CM+CaAc 한천 (조성: 하기 표 26 참조; 121℃에서 20분) 상에 스트리킹한 후, 세포를 30℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 플레이트로부터 스크랩하고, 염수에 재현탁시켰다. 2개의 배플이 구비된 250 ml 엘른마이어 플라스크에 배지 (하기 표 27 참조) 23 ml을, 각각의 경우 이렇게 제조된 세포 현탁액의 양이 광학 밀도가 610 nm에서 OD₆₁₀값 0.5에 도달하도록 접종하였다.

11.3) 발효액의 제조

플라스크 배지의 조성은 하기 표 27에 나타나 있다. 적합한 양의 글루코스 용액을 가루 가수분해물 대신 대조군 배지에 사용하였다.

^* 희석 NaOH 수용액으로 조정함

^** 가수분해물 중 글루코스 농도

^*** 배지의 리터당 칭량된 가수분해물의 양

접종 후, 플라스크를 습화된 진탕기에서 진탕하면서 (200 rpm) 30℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 발효가 종류된 후, 글루코스 및 리신 함량을 HPLC에 의해 측정하였다. HPLC 분석은 아질런트 1100 시리즈 LC 시스템으로 수행하였다. 글루코스를 바이오-래드사의 아미넥스 HPX-87H 컬럼에 의해 측정하였다. 아미노산 농도를 아질런트 1100 시리즈 LC 시스템 HPLC 상의 고압 액체 크로마토그래피에 의해 측정하였다. 오르토프탈데히드를 사용한 프레-컬럼 유도화는 형성된 아미노산의 정량을 가능하게 하며, 아미노산 혼합물은 히페르실 AA 컬럼 (아질런트)로 분리하였다. 결과는 하기 표 28에 나타나 있다.

모든 플라스크에서, 글루코스 영양분 용액을 사용한 표준 발효에서 수득된 수율에 상응하는 대략 10 내지 14 g/l 정도의 필적할만한 양으로 리신이 생성되었다.

실시예 12

부분적으로 당화된 옥수수 가루 가수분해물을 아스페르길러스 니게르를 사용한 진탕-플라스크 실험에 사용하였다.

12.1) 액화 및 (부분적) 당화

액화를 실시예 II.3a와 유사하게 수행하였다. 현탁액을 61℃로 냉각시킨 후, pH를 4.3으로 조정하고, 덱스트로자임 GA (노보자임스 A/S) 5.38 ml (= 효소 1.5 중량％/건조 물질)를 첨가하였다. 효소 첨가 후 매 10, 15, 20, 30, 45 및 60분에, 샘플 50 g을 취하고, 멸균 빙냉 완전 탈염수 25 ml에 현탁시켰다. 샘플을 빙조에 넣고, 즉시 플라스크 시험에 사용하였다. 효소의 불활성화가 일어나지 않았다.

12.2) 발효

실시예 5.1)에 사용된 균주를 사용하였다. 접종물을 실시예 5.2)에 기재된 바와 같이 제조하였다.

하기 표 29에 열거된 플라스크 배지의 조성을 발효액의 제조에 사용하였다. 각각의 샘플은 2개의 플라스크에 대해 사용하였다.

^* 희석 황산으로 조정함

^*** 배지의 리터당 칭량된 부분적으로 당화된 가수분해물

접종 후, 플라스크를 습화된 진탕기에서 진탕하면서 (170 rpm) 34℃에서 6일 동안 인큐베이션하였다. 발효가 종료된 후, 피타제 활성을 분석 (실시예 5.3에 기재된 바와 같음)에 의해 측정하였다. 결과는 하기 표 30에 나타나 있다.

실시예 13

부분적으로 당화된 옥수수 가루 가수분해물을 코리네박테리움 글루타미쿰을 사용한 진탕-플라스크 실험에 사용하였다.

13.1) 액화 및 (부분적) 당화

13.2) 발효

실시예 3)에서 사용된 균주를 사용하였다. 접종물을 실시예 3.1)에 기재된 바와 같이 제조하였다.

하기 표 31에 열거된 플라스크 배지의 조성을 발효액의 제조에 사용하였다. 각각의 샘플을 3개의 플라스크에 대해 사용하였다.

^* 희석 NaOH 수용액으로 조정함

^*** 배지의 리터당 칭량된 가수분해물의 양

접종 후, 플라스크를 습화된 진탕기에서 진탕하면서 (200 rpm) 30℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 발효가 종류된 후, 글루코스 및 리신 함량을 HPLC에 의해 측정하였다. HPLC 분석은 아질런트 1100 시리즈 LC 시스템으로 수행하였다. 글루코스를 바이오-래드사의 아미넥스 HPX-87H 컬럼에 의해 측정하였다. 아미노산 농도를 아질런트 1100 시리즈 LC 시스템 HPLC 상의 고압 액체 크로마토그래피에 의해 측정하였다. 오르토프탈데히드를 사용한 프레-컬럼 유도화는 형성된 아미노산의 정량을 가능하게 하며, 아미노산 혼합물은 히페르실 AA 컬럼 (아질런트)로 분리하였다. 결과는 하기 표 32에 나타나 있다.

실시예 14

실시예 3과 유사하게 수행된 리신의 생산을 위한 발효에서, 단백질 조성물을 단계 c)에 따른 발효액으로부터 리신의 고갈 후 건조된 발효 잔류물로서 수득하였다. 하기 표 33은 조성물의 필수 성분 및 그의 중량에 의한 양을 확인시켜 주며, 이들을 전통적인 DDGS 조성과 비교하였다.

^* [National Research Council (NRC), Nutrient Requirements for Dairy Cattle, Seventh Revised Edition, National Academy Press, 2001] (또는 [Spiehs M.J., Whitney M.H. and Shurson G.C: Nutrient database for distiller's dried grains with solubles produced from new ethanol plants in Minnesota and South Dakota, Journal of Animal Science 80, 2002, 2639-2645])에 따른 DDGS (주정박, 바이오에탄올 생산으로부터의 이차 생성물)

^**언급된 파라미터 및 필요한 분석 방법은 당업자에게 공지되어 있음

<110> BASF Aktiengesellschaft <120> Fermentative production of fine chemicals <130> M/44156 <160> 8 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 1 gagagagaga cgcgtcccag tggctgagac gcatc 35 <210> 2 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 2 ctctctctgt cgacgaattc aatcttacgg cctg 34 <210> 3 <211> 4327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasmid pCIS <400> 3 tcgagaggcc tgacgtcggg cccggtacca cgcgtcatat gactagttcg gacctaggga 60 tatcgtcgac atcgatgctc ttctgcgtta attaacaatt gggatcctct agacccggga 120 tttaaatgat ccgctagcgg gctgctaaag gaagcggaac acgtagaaag ccagtccgca 180 gaaacggtgc tgaccccgga tgaatgtcag ctactgggct atctggacaa gggaaaacgc 240 aagcgcaaag agaaagcagg tagcttgcag tgggcttaca tggcgatagc tagactgggc 300 ggttttatgg acagcaagcg aaccggaatt gccagctggg gcgccctctg gtaaggttgg 360 gaagccctgc aaagtaaact ggatggcttt cttgccgcca aggatctgat ggcgcagggg 420 atcaagatct gatcaagaga caggatgagg atcgtttcgc 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tttgactttc ttgacggaag aatgatgtgc 4500 ttttgccata gtatgctttg ttaaataaag attcttcgcc ttggtagcca tcttcagttc 4560 cagtgtttgc ttcaaatact aagtatttgt ggcctttatc ttctacgtag tgaggatctc 4620 tcagcgtatg gttgtcgcct gagctgtagt tgccttcatc gatgaactgc tgtacatttt 4680 gatacgtttt tccgtcaccg tcaaagattg atttataatc ctctacaccg ttgatgttca 4740 aagagctgtc tgatgctgat acgttaactt gtgcagttgt cagtgtttgt ttgccgtaat 4800 gtttaccgga gaaatcagtg tagaataaac ggatttttcc gtcagatgta aatgtggctg 4860 aacctgacca ttcttgtgtt tggtctttta ggatagaatc atttgcatcg aatttgtcgc 4920 tgtctttaaa gacgcggcca gcgtttttcc agctgtcaat agaagtttcg ccgacttttt 4980 gatagaacat gtaaatcgat gtgtcatccg catttttagg atctccggct aatgcaaaga 5040 cgatgtggta gccgtgatag tttgcgacag tgccgtcagc gttttgtaat ggccagctgt 5100 cccaaacgtc caggcctttt gcagaagaga tatttttaat tgtggacgaa tcaaattcag 5160 aaacttgata tttttcattt ttttgctgtt cagggatttg cagcatatca tggcgtgtaa 5220 tatgggaaat gccgtatgtt tccttatatg gcttttggtt cgtttctttc gcaaacgctt 5280 gagttgcgcc tcctgccagc agtgcggtag 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tcgtacagaa atatggcggt tcctcgcttg agagtgcgga acgcattaga 60 aacgtcgctg aacggatcgt tgccaccaag aaggctggaa atgatgtcgt ggttgtctgc 120 tccgcaatgg gagacaccac ggatgaactt ctagaacttg cagcggcagt gaatcccgtt 180 ccgccagctc gtgaaatgga tatgctcctg actgctggtg agcgtatttc taacgctctc 240 gtcgccatgg ctattgagtc ccttggcgca gaagcccaat ctttcacggg ctctcaggct 300 ggtgtgctca ccaccgagcg ccacggaaac gcacgcattg ttgatgtcac tccaggtcgt 360 gtgcgtgaag cactcgatga gggcaagatc tgcattgttg ctggtttcca gggtgttaat 420 aaagaaaccc gcgatgtcac cacgttgggt cgtggtggtt ctgacaccac tgcagttgcg 480 ttggcagctg ctttgaacgc tgatgtgtgt gagatttact cggacgttga cggtgtgtat 540 accgctgacc cgcgcatcgt tcctaatgca cagaagctgg aaaagctcag cttcgaagaa 600 atgctggaac ttgctgctgt tggctccaag attttggtgc tgcgcagtgt tgaatacgct 660 cgtgcattca atgtgccact tcgcgtacgc tcgtcttata gtaatgatcc cggcactttg 720 attgccggct ctatggagga tattcctgtg gaagaagcag tccttaccgg tgtcgcaacc 780 gacaagtccg aagccaaagt aaccgttctg ggtatttccg ataagccagg cgaggctgcg 840 aaggttttcc gtgcgttggc tgatgcagaa 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cctgactgct ggtgagcgta tttctaacgc tctcgtcgcc atggctattg agtcccttgg 420 cgcagaagcc caatctttca cgggctctca ggctggtgtg ctcaccaccg agcgccacgg 480 aaacgcacgc attgttgatg tcactccagg tcgtgtgcgt gaagcactcg atgagggcaa 540 gatctgcatt gttgctggtt tccagggtgt taataaagaa acccgcgatg tcaccacgtt 600 gggtcgtggt ggttctgaca ccactgcagt tgcgttggca gctgctttga acgctgatgt 660 gtgtgagatt tactcggacg ttgacggtgt gtataccgct gacccgcgca tcgttcctaa 720 tgcacagaag ctggaaaagc tcagcttcga agaaatgctg gaacttgctg ctgttggctc 780 caagattttg gtgctgcgca gtgttgaata cgctcgtgca ttcaatgtgc cacttcgcgt 840 acgctcgtct tatagtaatg atcccggcac tttgattgcc ggctctatgg aggatattcc 900 tgtggaagaa gcagtcctta ccggtgtcgc aaccgacaag tccgaagcca aagtaaccgt 960 tctgggtatt tccgataagc caggcgaggc tgcgaaggtt ttccgtgcgt tggctgatgc 1020 agaaatcaac attgacatgg ttctgcagaa cgtctcttct gtagaagacg gcaccaccga 1080 catcatcttc acctgccctc gttccgacgg ccgccgcgcg atggagatct tgaagaagct 1140 tcaggttcag ggcaactgga ccaatgtgct ttacgacgac caggtcggca aagtctccct 1200 cgtgggtgct ggcatgaagt ctcacccagg tgttaccgca gagttcatgg aagctctgcg 1260 cgatgtcaac gtgaacatcg aattgatttc cacctctgag attcgtattt ccgtgctgat 1320 ccgtgaagat gatctggatg ctgctgcacg tgcattgcat gagcagttcc agctgggcgg 1380 cgaagacgaa gccgtcgttt atgcaggcac cggacgctaa agttttaaag gagtagtttt 1440 acaatgacca ccatcgcagt tgttggtgca accggccagg tcggccaggt tatgcgcacc 1500 cttttggaag agcgcaattt cccagctgac actgttcgtt tctttgcttc cccacgttcc 1560 gcaggccgta agattgaatt cgtcgacatc gatgctcttc tgcgttaatt aacaattggg 1620 atcctctaga cccgggattt aaatcgctag cgggctgcta aaggaagcgg aacacgtaga 1680 aagccagtcc gcagaaacgg tgctgacccc ggatgaatgt cagctactgg gctatctgga 1740 caagggaaaa cgcaagcgca aagagaaagc aggtagcttg cagtgggctt acatggcgat 1800 agctagactg ggcggtttta tggacagcaa gcgaaccgga attgccagct ggggcgccct 1860 ctggtaaggt tgggaagccc tgcaaagtaa actggatggc tttcttgccg ccaaggatct 1920 gatggcgcag gggatcaaga tctgatcaag agacaggatg aggatcgttt cgcatgattg 1980 aacaagatgg attgcacgca ggttctccgg ccgcttgggt ggagaggcta ttcggctatg 2040 actgggcaca acagacaatc ggctgctctg atgccgccgt gttccggctg tcagcgcagg 2100 ggcgcccggt tctttttgtc aagaccgacc tgtccggtgc cctgaatgaa ctgcaggacg 2160 aggcagcgcg gctatcgtgg ctggccacga cgggcgttcc ttgcgcagct gtgctcgacg 2220 ttgtcactga agcgggaagg gactggctgc tattgggcga agtgccgggg caggatctcc 2280 tgtcatctca ccttgctcct gccgagaaag tatccatcat ggctgatgca atgcggcggc 2340 tgcatacgct tgatccggct acctgcccat tcgaccacca agcgaaacat cgcatcgagc 2400 gagcacgtac tcggatggaa gccggtcttg tcgatcagga tgatctggac gaagagcatc 2460 aggggctcgc gccagccgaa ctgttcgcca ggctcaaggc gcgcatgccc gacggcgagg 2520 atctcgtcgt gacccatggc gatgcctgct tgccgaatat catggtggaa aatggccgct 2580 tttctggatt catcgactgt ggccggctgg gtgtggcgga ccgctatcag gacatagcgt 2640 tggctacccg tgatattgct gaagagcttg gcggcgaatg ggctgaccgc ttcctcgtgc 2700 tttacggtat cgccgctccc gattcgcagc gcatcgcctt ctatcgcctt cttgacgagt 2760 tcttctgagc gggactctgg ggttcgaaat gaccgaccaa gcgacgccca acctgccatc 2820 acgagatttc gattccaccg ccgccttcta tgaaaggttg ggcttcggaa tcgttttccg 2880 ggacgccggc tggatgatcc tccagcgcgg ggatctcatg ctggagttct tcgcccacgc 2940 tagcggcgcg ccggccggcc cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc 3000 gcatcaggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc 3060 ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata 3120 acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg 3180 cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct 3240 caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa 3300 gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc 3360 tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt 3420 aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg 3480 ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg 3540 cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct 3600 tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc 3660 tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg 3720 ctggtagcgg 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Claims

목적하는 대사물을 생산하는 미생물 균주를, 당-함유 액체 배지를 사용하여 배양하는 것을 포함하는 방법으로,

a) 전분 공급원료로부터, 단당류 함량이 20 중량％를 초과하며 전분 공급원료 중의 비-전분성 고체 성분도 50 중량% 이상 포함하는 당-함유 액체 배지를 제조하는 단계;

b) 당-함유 액체 배지를 사용하여 대사물 생성을 위해 발효하는 단계; 및

c) 발효액으로부터 1종 이상의 대사물을 단리하는 단계를 포함하며,

여기서 액체 배지는

a1) 곡류 인(kernel)으로부터 선택되는 전분 공급원료를 분쇄하여 분말기재를 수득하고;

a2) 분말기재를 1종 이상의 전분-액화 효소의 존재하에서 수성 액체 중에 액화시킨 후 1종 이상의 당화 효소를 사용하여 당화시킴으로써 수득되는 것이고,

이 때, 분말기재의 전부 또는 일부는 액화 단계의 과정에서 수성 액체에 연속식 또는 배치식으로 첨가되고, 여기서, 액화 동안 첨가된 분말기재의 총량의 25 중량％ 이상이 분말기재에 존재하는 전분의 겔화 온도 초과의 온도에서 첨가되는 것인,

당-기재 미생물 발효에 의한, 3개 이상의 탄소 원자를 갖거나, 2개 이상의 탄소 원자와 1개 이상의 질소 원자를 갖는 1종 이상의 미생물 대사물의 제조 방법.
삭제
제1항에 있어서, 1종 이상의 전분-액화 효소가 α-아밀라제, 및 글루코아밀라제로부터의 1종 이상의 당화 효소로부터 선택된 것인 제조 방법.
삭제
제1항에 있어서, 곡류가 옥수수, 호밀, 라이밀 및 밀의 인으로부터 선택된 것인 제조 방법.
제1항에 있어서, 단계 a1)에서 분쇄 동안 수득된 분말기재가 100 ㎛ 초과의 입도를 갖는 가루 입자를 50 중량％ 이상 포함하는 것인 제조 방법.
제1항에 있어서, 단계 a2)에서 분말기재의 액화 및 당화를, 액체 배지의 점도가 20 Pa·s 이하가 되도록 수행하는 제조 방법.
삭제
제3항에 있어서, 단계 a2)에서, 1종 이상의 α-아밀라제의 일부를 액화 동안 수성 액체에 첨가하는 제조 방법.
제1항에 있어서, 단당류 함량이 40 중량％ 초과인 당-함유 액체 배지가 수득되는 제조 방법.
제1항에 있어서, 1종 이상의 피타제를 발효 단계 b) 전에 당-함유 액체 배지에 첨가하는 제조 방법.
제1항에 있어서, 생성된 대사물이 비-휘발성 물질로부터 선택된 것인 제조 방법.
제1항에 있어서, 생성된 대사물이, 히드록실기가 부착될 수 있고 3 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 유기 모노-, 디- 및 트리카르복실산, 단백질생성 및 비단백질생성 아미노산, 퓨린 염기, 피리미딘 염기, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 지질, 포화 및 불포화 지방산, 3 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 디올, 3개 이상의 히드록실기를 갖는 고-관능성 알콜, 4개 이상의 탄소 원자를 갖는 장쇄 알콜, 탄수화물, 방향족 화합물, 비타민, 프로비타민, 조인자, 단백질, 카로티노이드, 3개 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 케톤, 락톤, 생중합체, 시클로덱스트린, 및 이들과 상이한 기능식품으로부터 선택된 것인 제조 방법.
제1항에 있어서, 생성된 대사물이 효소, 아미노산, 비타민, 이당류, 3개 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 지방족 모노- 및 디카르복실산, 3개 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 지방족 히드록시카르복실산, 3개 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 케톤, 4개 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 알칸올, 3개 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 알칸디올, 및 폴리히드록시알카노에이트로부터 선택된 것인 제조 방법.
제1항에 있어서, 미생물이 다음 대사물: 효소, 아미노산, 비타민, 이당류, 3개 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 지방족 모노- 및 디카르복실산, 3개 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 지방족 히드록시카르복실산, 3개 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 케톤, 4개 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 알칸올, 3개 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 알칸디올, 및 폴리히드록시알카노에이트 중 1종 이상을 생산하는 천연 또는 재조합 미생물로부터 선택된 것인 방법.
제15항에 있어서, 미생물이 속 코리네박테리움(Corynebacterium), 바실러스(Bacillus), 아쉬비아(Ashbya), 에쉐리키아(Escherichia), 아스페르길러스(Aspergillus), 알칼리게네스(Alcaligenes), 악티노바실러스(Actinobacillus), 아나에로비오스피릴룸(Anaerobiospirillum), 락토바실러스(Lactobacillus), 프로피오니박테리움(Propionibacterium) 및 클로스트리듐(Clostridium)으로부터 선택된 것인 제조 방법.
제1항에 있어서, 단계 c)에 기재된 발효액으로부터의 대사물의 단리를 이온-교환 크로마토그래피에 의해 수행하는 것인 제조 방법.
제17항에 있어서, 대사물이 이온 교환제에 선택적으로 결합하는 것이고, 이온 교환제는 생성물의 용리 전에 세척될 수 있는 것인 제조 방법.
제17항에 있어서, 고체-적하된 발효액이 중력과 반대로 이온 교환제를 향해 흐르는 것인 방법.
제1항에 있어서,

(i) 전분 공급원료의 비-전분성 고체 성분을 포함하는 단계 a)에서 수득된 당-함유 액체 배지의 50 중량％ 이하의 부분을 제거하고, 제1항의 단계 b)에 기재된 발효를 잔여물로 수행하여 제1 대사물 (A)을 생성하고;

(ii) 전분 공급원료의 비-전분성 고체 성분의 전부 또는 일부를 상기 (i)에서 수득된 부분으로부터 분리하고, 제1항의 단계 b)에 기재된 발효를 상기 (i)에서 수득된 부분으로 수행하여, 대사물 (A)와 동일하거나 상이한 제2 대사물 (B)를 생성하는 것을 포함하는 제조 방법.
제20항에 있어서, (ii)의 비-전분성 고체 성분의 분리를, 당-함유 액체의 잔여물의 고체 함량이 50 중량％ 이하가 되도록 수행하는 제조 방법.
제20항에 있어서, 대사물 (B)가 피타제, 리보플라빈, 판토텐산 및 폴리히드록시알카노에이트로부터 선택된 것인 제조 방법.
제1항에 있어서, 단계 c)에 따른 대사물의 단리 후, 발효액의 전부 또는 일부의 휘발성 성분을 제거하여 고체 또는 반고체 조성물을 수득하는 제조 방법.
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