KR0159782B1 - 미생물 피타아제의 클로닝 및 발현 - Google Patents
미생물 피타아제의 클로닝 및 발현Info
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Abstract
피타아제를 코드한 뉴클레오티드 서열을 단리하고 클로닝하였다.
코딩서열은 발현 구성체에 삽입되고 이것은 역으로 미생물 발현 숙주에 형질전환 시킬 수 있는 벡터에 삽입된다. 형질전환된 미생물 숙주를 사용하여 산업적 규모로 피타아제를 경제적으로 생산할 수 있다.
본 발명에 의하여 생산된 피타아제는 피틴산염의 이노시톨 및 무기인산염으로의 전환에 필요한 다양한 공정에 사용될 수 있다.
Description
[발명의 명칭]
미생물 피타아제의 클로닝 및 발현
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 피타아제의 미생물적 생산에 관한 것이다.
[발명의 배경]
인은 모든 미생물 성장의 필수요소이다. 가축생산에 있어서 무기인을 보충해 주어야 단위(單胃)동물(예컨대 돼지, 닭 및 어류)의 원만한 성장을 얻을 수 있다.
이와는 반대로, 반추동물의 사료에는 무기인산염을 첨가할 필요가 없다. 전위에 존재하는 미생물들이 피틴산염(미오-이노시톨헥사키스-포스페이트)를 이노시톨 및 무기인산염으로 전환하는 작용을 촉매하는 효소를 생산한다. 피틴산염은 식물로부터 유래하는 실질적인 모든 섭이물질에서 저장성 인(燐) 공급원으로 존재한다(Phytic acid, chemistry and applications, E. Graf (ed.) Pilatus Press; Minneapolis, MN, U.S.A. (1986) 참조). 피틴산염은 모든 견과, 곡물류, 콩류, 지방종자, 포자 및 화분의 1 내지 3%를 차지한다. 피트산의 착염은 피틴이라고 칭해진다. 피트산은 칼슘, 아연, 마그네슘, 아연과 같은 미네랄을 킬레이트하며 또한 단백질과 반응하여 영양상의 중요한 미네랄 및 단백질의 생체이용성을 감소시키기 때문에 항-영양인자로 여겨진다.
인-피틴산은 단위동물의 위장관을 통과하며 배설물로 분비된다. 일부 피틴산염의 가수분해가 결장에서 일어나지 않는다하더라도 무기인은 소장에서만 흡수되기 때문에 이렇게 유리된 무기인은 영양적으로 아무런 가치가 없다. 결과적으로, 사료에 함유되어 있더라도 영양적으로 중요한 인의 상당한 양이 단위동물에 의해서는 이용되지 않는다.
배설물의 인-피틴산의 분비는 또한 다른 중요성을 가진다. 지난 수십년동안 가축의 생산은 괄목할만큼 증가하였으며, 결과적으로 생성되는 배설물의 양도 그에 따라 증가되었으며 세계 여러곳에서 환경문제를 야기하고 있다. 이는 부분적으로 배설물로부터의 인산염이 표면수에 축적됨으로써 인하여 부영화를 야기시킨다. 피틴산염을 이노시톨 및 무기인으로 전환시키는 작용을 촉매하는, 미생물에 의해 생산되는 효소로서는 일반적으로 피타아제가 널리 알려져 있다. 피타아제를 생산하는 미생물로는 바실러스 서브틸티스 (Bacillus subtilis; V.K. Paver 및 V.J. Jagannathan(1982) J. Bacteriol. 151, 1102-1108)및 슈도노마스(Pseudonomas ;D.J.Cosglove(1970) Asutral. J. Biol. 23, 1207-1220)과 같은 박테리아, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae; N.R. Nayini 및 P. Markakis (1984) Lebensmittel Wissenschaft und Technologie 17, 24-26)과 같은 이스트 및 아스페르길러스 테레우스(Aspergillus terreus; K. Yamada, Y. Minoda 및 S. Yamamoto (1986) Agric. Biol. Chem. 32, 1275-1282)와 같은 곰팡이 등이 있다.
피타아제를 생산하는 다양한 아스페르길러스 균주들이 알려져 있으며, 이중에서 아스페르길러스 피큐움(Aspergillus ficuum)에 의하여 생산되는 피타아제가 다른 미생물에 의하여 생산된 피타아제보다 더 좋은 열안정성을 가질 뿐만 아니라 가장 높은 수준의 비활성을 가지는 것의 하나로 밝혀졌다(미공개관찰).
단위 동물의 사료에 미생물의 피타아제를 첨가하는 개념은 이미 알려져 있다(Ware, J.H., Bluff, L. 및 Shieh, T.R. (1967) U.S. Patent No. 3,297,548; Nelson, T.S., Shieh, T.R., Wodzinski, R.J. 및 Ware, J.H. (1971) J. Nutrition 101, 1289-1294). 그러나, 지금까지 이 개념의 상업적인 응용은 미생물 효소의 생산에 많은 비용이 소요되기 때문에 가능하지 않았다(Y.W. Han(1989) Animal Feed Sci. Technol. 24, 345-350). 경제적 이유에서, 무기인은 여전히 단위동물의 사료에 첨가되고 있다.
미생물 피타아제는 또한 다른 산업분야에서도 사용된다. 그 예로서 예컨대 옥수수나 밀과 같은 곡물류로부터 전분을 생산하는 산업적 과정에 사용되기도 한다. 습윤 밀링 과정에서 나오는 예컨대 옥수수 글루텐 찌꺼기를 포함하는 폐기물들은 동물사료로 판매된다. 침지(steeping) 과정동안 피타아제가 첨가될 수 있다. 조건(T=50℃, pH=5.5)은 곰팡이 피타아제에 이상적이다(Alko Ltd. 의 유럽특허출원 0321004 참조). 다행스럽게도, 이 과정에서의 폐기물로부터 얻은 동물 사료는 피틴산염 대신에 인산염을 포함하고 있다.
피타아제는 또한 콩의 처리과정에서도 이용된다는 것이 알려져 있다(Alko Ltd.(Rajamaki, Finland)에서 발행된 제품정보지(FinaseTMEnzymes Bt Alko 참조)
콩가루는 유아식품, 어류, 송아지 기타 비-반추동물의 사료로 사용하기에는 부적당한 항-영양요소인 피틴산염을 높은 수준으로 함유하고 있다. 이 가치있는 단백질원을 효소적으로 품질을 높임으로써 상업적 및 영양상의 가치를 개선시킬 수 있다.
다양한 피타아제를 특성확인하고 그 생산과정을 개선하며 또한 이들 피타아제를 이용하는데에 많은 연구자들이 관심을 가져왔다. Ullah는 야생형 아스페르길러스 피큐움(Aspergillus ficuum) 으로부터 피타아제를 정제하는 과정 및 이 정제과정에 의해 얻어진 생산물의 몇몇 생물학적 변수들에 대해 밝히고 있다(Ullah, A. (1988a) Preparative Biochem. 18, 443-458). Ullah 로부터의 관련 데이터는 하기 표1에 제시되어 있다.
A. ficuum 피타아제 단백질의 N-말단 아미노산 서열은 Ullah에 의해 2차례 제시되어 있다. (Ullah, A. (1987) Enzyme and Enginnering conference IX, October, 4-8, 1987, Santa Barbara, California (poster presentation) 및 Ullah, A(1988b) Prep. Biochem. 18, 459-471). Ullah에 의해 얻어진 아미노산 서열 데이터는 하기 제1a도 서열 E에 재현되어 있다.
Ullah의 연구문헌으로부터 몇가지 흥미로운 사실이 관찰되었다. 첫 번째로, Ullah(1988a 및 1988b)에 의해 제시된 정제 조성물은 SDS-PAGE상에서 2개의 단백질 띠로 구성된다. 그러나 본 발명자들은 A. ficuum으로부터 정제한 피타아제는 오염체(contaminant)를 포함하며 피타아제로 인식되는 SDS-PAGE상의 한 띠는 이 오염체로부터 유래한다는 사실을 발견하였다.
이러한 차이점은 Ullah에 의해 제시된 아미노산 서열 데이터로부터도 분명하다(1987, 1988b; 제1a도 서열A 및 B를 서열 C와 비교 참조). Ullah에 의해 제시된 피타아제 내부 펩티드의 아미노산 서열의 하나(제1b도 서열 E 참조)는 Ullah에 의해 제시된 과정에 따라 얻어진 조성물에 존재하는 오염된 100kDa 단백질(제1c도)에 실질적으로 속하며 SDS-PAGE상의 두 띠중의 하나임을 본 발명자들을 실질적으로 확인하였다(Ullah, 1988a 및 1988b). Ullah는 이와같은 오염 피타아제의 존재를 인식하지 않았으며 대신에 피타아제의 다른 형태로 인식하였다. 결국 이와같은 오염체의 존재는 피타아제 활성을 코드한 실제 뉴클레오티드 서열의 단리 및 선택에 있어 어려움을 증가시킨다. 더욱이, 오염체의 존재는 시험단백질의 비활성을 저하시킨다.
또한 Ullah에 의해 제시된 서열에 있어서, 위치 12의 아미노산은 글리신으로 제시되고 있음을 주지하여야 하겠다. 본 발명자들은 단백질 및 DNA 서열화 기술을 사용하여 이 잔기는 글리신이 아니라 실질적으로 시스테인임을 확실히 밝혔다(제6도 및 제8도 참조).
끝으로, 피타아제는 85kDa의 단백질이며 탈당화된 후에는 61.7kDa의 분자량을 가짐을 Ullah는 밝히고 있다(Ullah, 1988b). 초기에 제시된 76kDa 단백질(Ullah, A. 및 Gibson, D. (1988) Prep. Biochem. 17(1), 63-91) 보다 더 낮은 이 수치는 가수분해에 의하여 유리되는 탄수화물의 상대적 양 및 SDS-PAGE 상의 원단백질의 겉보기 분자량을 근거로 하였다. 그러나, 본 발명자들은 탈당화작용에 따라서, 당화 피타아제는 85kDa의 단일 겉보기 분자량을 가지는 반면 탈당화 피타아제 단백질은 48 내지 56.5kDa범위의 겉보기 분자량을 가진다는 것을 발견하였다.
또한 Mullaney외 다수(Filamentous Fungi Conference, April, 1987, Pacific Grove, California(Poster presentation)) 등은 A. ficuum으로부터의 피타아제의 특성을 제시하였다. 그러나 이 문헌에서는 정제된 단백질 조성물에 존재하는 SDS-PAGE 상의 두 단백질띠, 85kDa 및 100kDa의 띠에 대하여 언급하고 있다. 이 두 단백질 띠는 다른 형태의 피타아제 저자들에 의해 인식되었다. 미생물 숙주를 형질전환하는 방법이 제안되었으나 보도되지는 않았다. 피타아제를 코드한 DNA 서열의 단릴 및 클로닝은 제시되지 않았다.
피타아제의 경제적인 생산방법은 특히 동물사료산업에 상당한 잇점을 부여할 것으로 기대된다. 좀 더 경제적인 피타아제를 생산하는 한 방법은 재조합 DNA 기술을 이용하여 발현 펩티드 또는 단백질을 높은 수준으로 생산하는 것으로 알려진 다양한 미생물에서 이 효소의 발현을 증대시키는 것이다. 그러나 지금까지, 피타아제 활성을 코드한 DNA 서열을 단리하고 클로닝하는 것에 대하여서는 아직 제시되지 않았다.
[발명의 요약]
본 발명은 피타아제를 코드하는 정제 및 단리된 DNA 서열을 제공한다. 본 발명을 위하여 특별히 제작된 특이적 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 이 피타아제 코딩 DNA 서열을 단리 및 정제 하였다. 피타아제를 코드한 바람직한 DNA 서열은 곰팡이 특히 Aspergillus 속의 사상균(絲狀菌)으로부터 얻을 수 있다.
본 발명의 다른 목적은 적당한 발현 숙주에서 피타아제 활성을 가지는 단백질 또는 펩티드의 높은 수준의 발현을 지휘하는 적당한 조절영역에 작동가능하게 연결된, 바람직하게는 피타아제를 코드하는 상동 DNA 서열의 적어도 한 사본을 함유하는 발현 구성체를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명에 의하여 제공되는 발현 구성체는 미생물 숙주세포에 형질전환되어 게놈에 통합될 수 있는 벡터, 바람직하게는 플라스미드에 삽입될 수도 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기의 벡터에 의하여 형질전환된 미생물 숙주, 바람직하게는 형질전환체를 제공한다.
본 발명에 의해 제공되는 형질전환된 숙주는 Aspergillus, Trichoderma, Mucor 및 Penicillium 속의 사상균, Kluyveromyces 및 Saccharomyces 속의 효모 또는 Bacillus 속의 박테리아 등이다. 특별히 바람직한 발현숙주들은 Aspergillus 속의 사상균들이다. 형질전환된 숙주는 재조합 피타아제를 경제적, 산업적 규모의 높은 수준으로 생산할 수 있다.
다른 관점에서, 본 발명은 피타아제 활성을 가지는 당화 또는 비당화 형태의 재조합 펩티드 및 단백질에 관한 것이며, 상기 비당화 펩티드 및 단백질의 생산방법에 관한 것이며, 피타아제 활성을 가지는 순수한 펩티드 및 단백질에 관한 것이며, 이들 재조합체 또는 정제 단백질과 반응하는 모노클로날 항체에 관한 것이다.
Ullah에 의해 얻어진 정제된 야생형 A. ficuum 피타아제와 본 발명에 의해 얻어진 더욱 정제된 야생형 A. ficuum 피타아제의 생화학적 파라미터의 비교결과는 하기 표 1에 도시되어 있다. 본 발명자들에 의하여 얻어진 정제단백질이 Ullah에 의해 제시된 단백질 활성의 2배에 해당하는 비활성을 가진다는 사실을 보여주는 비활성 데이터를 특히 주지하여야 하겠다.
또한 본 발명은 피타아제 활성을 나타내는 단백질을 코다한 뉴클레오티드 서열 및 이들 단백질의 아미노산 서열을 제공한다. 제공된 서열은 이후 계속해서 단리 및 클로닝될 다른 종 특히 미생물로부터 피타아제를 동정하기 위한 혼성화 스크리닝 분석에 역으로 사용될 올리고뉴클레오티드 프로브를 디자인하는데 사용된다.
또한 본 발명에 의하여 제공된 서열은 제2 세대 피타아제의 제조를 위한 출발 물질로서 사용된다. 제2 세대 피타아제란 본 발명에 의하여 제공되는 것과 같은 재조합 피타아제 또는 야생형 피타아제의 성질과는 다른 특성을 가지는, 돌연변이 기술(예컨대 부위 지정 돌연변이)에 의하여 변경된 피타아제를 의미한다. 예컨대 온도 또는 최적 pH, 비활성 또는 기질 친화력이 변경되어 특정 공정에서의 사용에 더욱 적합하도록 할 수 있다.
본 발명의 명세서에서, 피타아제는 다양한 미오이노시톨 포스페이트로부터 무기인을 제거하는 반응을 촉매하는 일단의 효소군을 모두 포괄한다.
피타아제 활성은 많은 다양한 분석법에 의하여 측정할 수 있으며 그 선택은 본 발명에서 중요하지 않다. 예컨대, pH 5.50, 37℃에서 1μmol/분 속도로 1.5mM 피틴산 나트륨으로부터 무기인을 유리시키는 효소의 양을 측정함으로써 피타아제 활성을 결정할 수 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐서 언급되는 피타아제란 용어는 피타아제 활성을 가지는 모든 펩티드 및 단백질을 포괄하는 의미로 사용됨을 주지하여야 한다.
이점은 서열 A 및 B(본 발명과정에서 얻어진 서열)와 서열 C(Ullah에 의해 제세된 서열, 1988b)을 비교한 제1a도에 잘 예시되어 있다. 이 도면은 성숙한 A. ficuum 피타아제 단백질의 최초의 4 아미노산이 결실된 단백질이 본 발명에 의하여 얻어질 수 있음을 나타낸다(서열 A의 단백질은 최초의 7 아미노산이 결실되었다). 그러나 이 단백질들은 피타아제 활성을 가진다. 대응 유도서열로부터 유도한, 피타아제 단백질의 완전한 아미노산 서열이 제 8도에 도시되어 있다.
본 발명에 의하여 제공되는 피타아제는 피틴산염의 이노시톨 및 무기 인산염으로의 전환을 필요로 하는 다양한 공정에 사용될 수 있다. 예컨대, 본 발명에 따른 피타아제의 생산은 동물사료에 피타아제를 경제적으로 사용하게 되어 결국 무기 인산염에 대한 생체내 가격/효율비를 경쟁적으로 유도하게 되어 미생물 피타아제의 생산단가를 감소시킬 수 있다. 다른 잇점으로서는, 배설물의 인 함량이 상당히 감소될 수 있다.
무기 인산염에 경쟁적인 가격으로의 피타아제의 사용은 화합사료업계가 양질의 사료를 생산할 여유가 증가된다는 사실을 인식하여야 한다. 예컨대, 사료를 피타아제를 보충할 경우, 무기 인산염은 첨가하지 않아도 되며 피탄산염을 함유하는 다양한 물질의 함량이 증가될 수 있다.
상기 언급된 동물 사료 및 콩의 가공공정에 사용하는 이외에도, 본 발명에 의하여 얻어진 피타아제는 다음과 같은 다양한 산업적 이용분야에서 사용될 수 있다:
- 돼지 또는 가금(家禽)용 액체 사료. 사료를 공급하기 전에 몇 시간동안 사료를 침지하는 것이 관행으로 되어 있다. 이 시간동안에 효소는 피틴산염을 이노시톨과 무기인산염으로 전환시킨다.
- 피틴산염으로부터 이노시톨 또는 이노시톨-포스페이트의 산업적 생산공정.
- 주류산업 등의 발효업계 및 전분 업계와 같이 피틴산염을 함유하는 기질을 사용하는 기타 산업공정.
피틴산염에 의한 금속 이온의 킬레이트화는 이들 미네날이 생산 미생물에 이용될 수 없도록 한다. 피틴산염의 효소적 가수분해는 이러한 문제점을 방지한다.
본 발명의 이러한 목적 및 기타 장점들은 하기에서 더욱 분명히 제시될 것이다.
[도면의 간단한 설명]
제1도.
a. 정제된 피타아제의 N-말단 아미노산. A 및 B 표지된 아미노산 서열은 본 발명에 의하여 제공되며 각각 5.2 및 5.4의 등전점을 가지는 피타아제 서브 형태로부터 유래한다. C 서열은 Ullah로부터 인용하였다(1987, 1988b, 상동). 서열 A 및 B의 위치 12의 아미노산 잔기는 본 발명에 의하여 글리신 잔기가 아닌 것으로 밝혀졌다. [*표시는 분명하지 않는 잔기를 표시하며,**표시는 검출되지 않은 잔기를 표시한다]
b. CNBr-절단 피타아제 내부 단편의 N-말단 아미노산 서열. A 및 B로 표지된 아미노산 서열(각각 대략 2.5kDa 및 36kDa 겉보기 분자량의 펩티드)는 본 발명에 의하여 제공된다. 서열 C 내지 E는 Ullah(1988b, 상동)로부터 인용하였다.
c. 본 발명에 의하여 조(crude) 피타아제 샘플에 존재하는 것으로 밝혀진 100kDa 단백질의 N-말단 아미노산 서열.
제2도.
a. 제1a도의 A 내지 E 펩티드로부터의 데이터에 근거하여 디자인된 올리고뉴클레오티드 프로브.
b. 제1b도의 A 및 B 펩티드로부터의 데이터에 근거하여 디자인한 올리고뉴클레오티드 프로브.
제3도. 산-포스파타아제를 코드한 유전자를 단리하기 위하여 사용한 올리고뉴클레오티드 프로브.
제4도. A. ficuum의 피타아제 좌(locus)를 함유하는 박테리오파아지 람다 AF201의 제한지도. 화살표는 피타아제 유전자의 위치 및 전사방향을 표시한다. 클론 #는 지시된 제한효소로 pUC19(다른 모든 서브클론에 대해) 및 pAN 8-1(pAF 28-1에 대해)의 파아지 AF201로부터 얻은 서브클론을 표시한다.
제5도. pAF 1-1의 물리지도. pUC19에 삽입된 10kb BamHI 단편은 A. ficuum으로부터의 산-포스파타아제를 코드하는 유전자 전체를 포함한다.
제6도. 염색체 피타아제 유전자 좌를 포괄하는 플라스미드 pAF 2-3, pAF 2-6 및 pAF 2-7의 뉴클레오티드 서열의 편집. 피타아제 코딩 영역은 뉴클레오티드 위치 210에서 위치 1713까지 존재하며, 인트론은 뉴클레오티드 위치 210에서 위치 355까지의 염색체 유전자에 존재한다. 제한 부위, 피타아제 개시 및 종결 코돈 및 인트론 위치 등의 관련 특징들이 표시되어 있다.
제7도. 서열화된 피타아제 염색체 좌의 세부적인 물리지도. 화살표는 피타아제 코딩영역의 두 엑손의 위치를 표시한다.
제8도. 피타아제 cDNA 단편의 번역되는 영역의 뉴클레오티드 서열 및 피타아제 단백질의 아미노산 서열. 성숙한 피타아제 단백질의 개시점을 위치 +1로 표시하였다. 36kDa 단백질 내부 단편의 아미노 말단은 아미노산 위치 241에 위치하며, 한편 2.5kDa 단백질 단편은 아미노산 위치 390에서 개시한다.
제9도. 피타아제 발현 카셋트 pAF 2-2S의 물리지도. 화살표는 유전자의 전사방향을 표시한다.
제10도. A. ficuum NRRL 3135 형질전환체에서 피타아제의 과발현에 대한 IEF-PAGE 증거.
동일한 조건하에서 배양한, 형질전환체 pAF 2-2S SP7(2라인) 및 A. ficuum(1 라인)의 배양 상등액 동등량을 4.5 내지 6의 pH범위에서 Phast-System(Pharmacia) IEF-PAGE 겔상에서 분석하였다. 비교용으로, 균질하게 정제된 A. ficuum 피타아제 시료를 별도로(4라인) 또는, 배양 상등액과 혼합하여(3라인) 포함시켰다. 텍스트(A)에 기술된 포스파타아제 염색 또는 일반적인 단백질 염색(Coomassie Brilliant Blue, B)으로 겔을 염색하였다. 피타아제 띠는 별표로 표시하였다.
제11도. A. niger CBS 513.88 형질전환체에서 피타아제의 과발현에 대한 IEF-PAGE 증거.
A. niger 모균주(1라인) 또는 형질전환체 pAF 2-2S #8(2라인), pFYT3 #205(3라인) 및 #282(4라인)의 배양상등액 동등량을 제10도의 설명에서와 같이 IEF-PAGE로 분석하였다. 일반적인 포스파타아제 활성 염색(A) 또는 일반적인 단백질 염색(B)으로 겔을 염색하였다. 피타아제 띠는 별표로 표시하였다.
제12도. pAB 6-1의 물리지도. pUC19의 14.5kb HindIII DNA 삽입체는 A. niger로 부터의 클루코아밀라아제(AG) 전체를 함유한다.
제13도. 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의한 AG 프로모터/피타아제 유전자 융합의 생성과정을 나타내는 도식. 사용된 모든 올리고뉴클레오티드 프라이머의 서열은 텍스트에 도시되어 있다.
제14도. 피타아제 발현 카셋트 pAF 2-2SH의 물리지도.
제15도. 중간구성체 pXXFYT1, pXXFYT2 및 피타아제 발현 카셋트 pXXFYT3의 물리지도(XX는 리이더 서열(L)을 표시한다). p18FYT# 및 p24FYT#에 각각18 aa 및 24 aa AG 리이더 서열에 삽입되고 반면에 pFYT#에 피타아제 리이더가 사용된다.
제16도. 플라스미드 pFYT3△amdS의 물리지도.
제17도. 플라스미드 pFYT3INT의 물리지도.
제18도. 피타아제/AG 대치 벡터 pREPFYT3의 물리지도.
제19도. Pvu II(A) 및 BamHI(B)로 절단하고 미생물 균종 S. cerevisiae(2라인), B. subtilis(3라인), K. lactis(4라인), P. crysogenum(5라인), P. aeruginosa(6라인), S. lividans(7라인), A. niger 1㎍(9라인). 대조블랭크(10라인), C. thermocellum(11라인)의 프로브로서 P-표식 A. ficuum 피타아제 cDNA 혼성화한 염색체 DNA의 방사선 사진. 1라인 : 마아커 DNA.
[발명의 상세한 설명]
미생물에 의하여 생산된 선택 단백질을 코드한 유전자의 클로닝은 다양한 방법으로 이루어질 수 있다. 그 한 방법은 해당 단백질을 정제한 다음 N-말단 아미노산 서열을 결정하고 이 N-말단 아미노산 서열에 근거한 DNA 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 당해 미생물의 게놈 라이브러리를 선별하는 방법이다. 이 방법을 사용한 성공적인 예에는 Cephalosporium acremonium으로부터의 이소페니실린 N-합성요소 유전자의 클로닝(S.M. Samson 외 다수, (1985) Nature 318, 191-194) 및 Aspergillus oryzae를 위한 TAKA 아밀라아제를 코드한 유전자의 단리(Boel 외 다수, (1986) EP-A-0238023) 등이 있다.
이 방법을 이용하여 피타아제를 코드하는 Aspergillus ficuum 유전자를 단리하려는 노력이 행해지고 있다. 이 단백질은 광범위하게 정제되었으며 몇몇 생화학적 파라미터들이 측정되었다. 얻어진 데이터를 Ullah(1988a)에 의해 제시된 데이터와 비교하였다. 이들 두 데이터는 하기 표 1에 주어져 있다.
피타아제 활성은 Ullah에 의해서는 37℃가 아닌 58℃에서 측정되었다. 피타아제 활성단위는 pH 5.50, 37℃에서 1μmol/분의 속도로 1.5mM 피틴산 나트륨으로부터 무기인을 유리시키는 효소의 양으로 정의하였다. 발효 수율 및 비활성을 비교하기 위하여, Ullah에 의해 제시된 활성에 대해 온도에 따른 차를 보정하였다. 보정은 Ullah(1988b)의 표3에서 제시된 58℃ 및 37℃에서 측정된 피타아제 활성의 차이에 근거한다.
SDS-PAGE에 의하여 결정된 겉보기 분자량.
IEF-PAGE에 의하여 결정된 겉보기 분자량.
피타아제를 코드한 유전자를 단리하기 위하여, 상기 기술된 방법에 따라 올리고뉴클레오티드 프로브의 제1 세트를 디자인하였다(제2a도). 이 프로브는 아미노산 서열 데이터에 근거하여 디자인되었다. 전 과정의 통제로서 Ullah 및 Cumnins((1987) Prep. Biochem. 17, 397-422)에 의해 제시된 단백질 데이터를 이용하는 유사한 단계를 취하여 산-포스파타아제를 코딩한 유전자를 단리하였다. 산-포스파타아제에 대하여서는 어려움없이 해당 유전자를 단리하였다. 그러나, 피타아제에 있어서는 그 상황이 다른 것 같았다. N-말단 아미노산 서열로부터 얻은 프로브를 사용하는 등의 여러 노력에도 불구하고, 피타아제를 코딩한 유전자를 포괄하는 양성으로 동정되는 게놈 DNA 단편 또는 게놈 라이브러리로부터의 클론은 단리되지 않았다.
이를 극복하기 위하여, 정제된 피타아제를 CNBr-지정 절단으로 얻어진 단백질 단편을 단리하였다. 이들 단편의 N-말단 아미노산 서열을 결정하고 (제1b도), 새 데이터에 근거하여(제2b도) 새로운 올리고뉴클레오티드 프로브를 디자인하였다. 놀랍게도, 새로운 올리고뉴클레오티드 프로브는 특정 DNA 단편을 동정하였으며 게놈 라이브러리로부터 클론을 명확히 동정하는데 적합하였다. 단리된 신규 클론 또는 DNA 단편들과 제1 세트의 프로브를 사용하여 단리한 제1 세트의 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 클론 사이에는 역혼성화가 관찰되지 않았다.
이와같은 제2 세트의 프로브도 관련 피타아제의 코딩 서열을 동정하는데 사용될 수 있음을 인식하여야 한다.
새로 단리한 클론을 노던 브로트 혼성화에서 프로브로 사용하였다. 피타아제 생산 균사체로부터 mRNA를 단리할 때 분리된 mRNA만 검출된다. 피타아제를 생산하지 않는 균사체로부터의 RNA로 시도할 경우 혼성화 시그날은 찾아볼 수 없다. mRNA는 약 1800b의 크기를 가지며 이론적으로 약 60kDa의 최대 분자량을 가지는 단백질을 생산한다. 이 수치는 DNA 서열로부터 유도한 단백질의 분자량 및 비당화단백질에 대하여 측정된 분자량과 일치한다.
더욱이, 형질전환에 의하여 곰팡이 세포에 도입될 경우 피타아제 활성의 증가가 나타날 수 있다. 이 사실은 전적으로 피타아제를 코드한 뉴클레오티드 서열이 정말로 단리되었음을 나타낸다. 정제된 피타아제 효소 및 이로부터 얻은 CNBr 단편에 대해 결정된 아미노산서열은 클론유전자에 대해 결정된 서열로부터 얻은 아미노산 서열과 일치한다. 뉴클레오티드 서열 및 그 아미노산 서열은 제6도 및 제8도에 도시되어 피타아제를 코드한 클론된 서열을 잘 예시한다.
피타아제를 코드한 뉴클레오티드 서열을 단리함으로써, 유전자 증폭과 같은 현대의 재조합 DNA 기술, 프로모터, 분비 시그날과 같은 조절인자의 교환 또는 이들의 조합적 사용을 통하여 산업적 규모로 피타아제를 경제적으로 생산할 수 있게 된다.
따라서 본 발명은 피타아제 활성을 가지는 펩티드 또는 단백질 및 바람직하다면 산-포스파타아제도 높은 수준으로 효율적으로 발현시킬 수 있는 형질전환 발현 숙주를 포함한다. 해당 발현 숙주로는 Aspergillus, Trichoderma, Mucor 및 Penicillium 속으로부터 선택된 사상균, Kluyveromyces 및 Saccharomyces 속의 효모 및 Bacillus 속의 박테리아 등이 있다. 내부성 단백질을 분비할 수 있는 발현 숙주를 선택하는 것이 바람직하다.
산업적으로 특히 관심이 있는 균주에는 Aspergillus 특히 niger, ficuum, awamori 또는 oryzae 등이 있다. 또는 Trichoderma reesei, Mucor miehei, Kluyveromyces lactis, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus-subtilis 또는 Bacillus licheniformis 도 사용된다.
발현 구성체는 발현될 소정의 효소 생성물을 코드한 뉴클레오티드 서열을 포함하며 일반적으로 생산 펩티드 또는 단백질의 분비를 제공하는, 숙주에서 작용하는 시그날 서열을 가진다.
본 발명에 따라 다양한 시그날 서열이 사용된다. 발현되어질 클론된 뉴클레오티드 서열에 상동적인 시그날 서열이 사용된다. 아니면 숙주의 표적부위의 유전자의 시그날 서열과 상동적인 또는 실질적으로 상동적인 시그날 서열을 사용하여 상동 재조합을 용이하게 할 수 있다. 더욱이, 분비 발현숙주로부터의 분비작용을 개선하도록 디자인된 시그날 서열도 사용될 수 있다(Von Heyne (1983) Eur. J. Biochem. 133, 17-21; Perlman 및 Halverson(1983) J. Mol. Biol. 167, 391-409 참조). 시그날 서열을 코드한 DNA 서열은 프로세싱 시그날(절단인식부위)을 코드하는 서열을 통하여 보통 10코돈 이하의 짧은 연결체를 통하여 직접적으로 소정의 단백질을 코드하는 서열에 결합될 수 있다.
본 발명의 범주 안에서 사용되는 바람직한 분비시그날 서열은 발현되어질 클론된 뉴클레오티드 서열, 18 아미노산 클루코아밀라아제(AG) 시그날 서열 및 24 아미노산 글루코아밀라아제(AG) 시그날 서열에 상동적인 시그날 서열이다. 후자의 두 서열은 발현되어질 뉴클레오티드 서열에 상동적이거나 또는 이형적이다.
발현 생성물 또는 소정의 뉴클레오티드 서열은 발현숙주에 상동적 또는 이형적이 DNA 일 수도 있다.
본 명세서에서 상동적인 DNA는 같은 속에서 유래한 DNA로 정의된다. 예컨대, Aspergillus 는 Aspergillus로부터의 DNA로 형질전환된다. 이러한 방법으로, 이전의 종에서도 존재하지 않는 새로운 특성을 도입하지 않고 곰팡이 속의 기존 특성을 개선시키는 것이 가능하다. 개선된 특성은 이전의 속에서는 존재하지 않는 것이다.
이형 DNA는 하나 이상의 속으로부터 유래한 즉, 상기 단락에 주어진 예에 있어서 Aspergillus가 아닌 속에서 유래하지만 Aspergillus에서 발현되는 DNA로 정의된다.
피타아제 활성을 코드하는 뉴클레오티드 서열은 곰팡이원으로부터 얻어지는 것이 바람직하다. Aspergillus 속으로부터 얻어지는 피타아제 코딩 뉴클레오티드 서열이 더욱 바람직하다. Aspergillus ficuum 또는 Aspergillus niger 종으로부터 얻어지는 서열이 가장 바람직하다.
소정의 뉴클레오티드 서열에서 개방리딩프레임의 5'영역은 전사개시조절영역(또는 프로모터)을 포함한다. 발현되어질 피타아제-코딩 뉴클레오티드 서열에 상동적인 프로모터 등의 숙주에서 기능적인 영역들이 채용될 수 있다. 그러나, 대부분의 경우에, 채용되는 영역은 표적 좌의 영역과 상동적이다. 이는 표적 좌의 발현생성물을 소저의 발현 생성물로 치환시키는 효과를 가진다. 표적 좌 코드화된 단백질의 발현 및 분비 수준이 효율적인 생산을 제공하는 한, 이 전사개시조절영역은 보통 만족스러운 것으로 여겨질 것이다. 그러나, 일부 경우에, 표적 좌 유전자보다 더 높은 수준의 전사수준을 요구하거나 또는 특정 유도제를 사용한 유도발현을 원할 경우가 있다. 이러한 경우에는 표적 좌 유전자에서의 영역과는 상이한 전사개시조절영역이 사용된다. 사상균에서 기능을 나타내는 많은 전사개시조절영역이 알려져 있다. 이들 영역은 글루코아밀라아제 (AG), 곰팡이 아밀라아제, 산-포스파타아제, GAPDH, TrpC, AmdS, ALcA,AldA, 히스톤 H2A, Pyr4, PyrG, 이소페니실린 N 합성효소, PGK, 산-프로테아제, 아실 전이효소 등을 코드한 유전자의 영역들이다.
표적 좌는 발현정도가 매우 높은 단백질 유전자 즉, 최종 발효공정에서 적어도 약 0.1g/ℓ 농도로 발현 생성물이 발현되는 유전자를 바람직하게 코드한다. 이 공정의 지속은 무엇보다도 소정의 단백질 생성물에 따라 다르다. 이와 같은 유전자로서 글루코아밀라아제(AG)를 코드하는 유전자를 예로 들 수 있다. 소정의 기타 유전자로는 곰팡이 α-아밀라아제, 산-포스파타아제, 프로테아제, 산-프로테아제, 리파아제, 피타아제 및 셀로비오히드로라아제 등이 있다. 특히 바람직한 표적 좌로는 A. niger의 글루코아밀라아제 유전자, A. oryzae의 곰팡이 아밀라아제 유전자, T. reesei의 셀로비오히드롤라아제 유전자, Mucor miehei의 산-프로테아제 유전자, Kluyveromyces lactis의 락타아제 유전자 또는 Saccharomyces cerevisiae 의 전환효소 등이 있다.
전사종결 조절영역은 소정의 유전자, 표적 좌 또는 기타 적당한 서열로부터 얻어진다. 구성체가 소정의 유전자의 소정의 하류부 서열(전사방향으로)을 더 포함하는 경우에는 전사 종결 조절영역이 표적 좌와 상동적이다면 상동적인 프랭킹(flanking)영역보다 더 작아야만 한다.
발현 구성체의 일부이거나 또는 발현 구성체와 분리된 선택표지(marker)가 보통 사용되며 소정의 유전자와 다른 부위에 통합된다. 본 발명의 재조합 분자는 산업적 생산에 사용될 수 있는 숙주에 바람직하게 형질전환되기 때문에 형질전환을 모니터하는 선택 표지는 우성(優性) 선택표지가 바람직하다. 즉 돌연변이가 이들선택 표지를 이용할 수 있는 숙주에 도입되지 않아야 한다. 이러한 표지의 예로는 한정된 영양원에서 형질전환체를 자라게 하는 표지(예컨대, A. nidulans amds 유전자는 유일한 질소원으로서 아세트아미드에서만 A. niger 형질전환체를 자라게 한다) 또는 항생제에 내성을 부여하는 표지(예컨대, ble 유전자는 플레오마이신에 내성을 부여하여 hph 유전자는 히그로마이신 B에 내성을 부여한다) 등이 있다.
선택 유전자는 자체의 전사 및 번역 개시 및 종결조절영역을 가지며 표지를 독자적으로 발현시킨다. 많은 전사개시 조절영역이 이미 알려져 있으며 표지 유전자와 결합하여 사용되고 있다. 항생제 내성을 채용할 경우 선택을 위한 항생제 농도는 일반적으로 항생제의 약 30 내지 300㎍/㎖ 범위에서 항생제에 따라 다양하다.
제한절단, 상보적 제한부위의 결합 및 연결, 어긋난 부분을 채워서 평활 말단화시키고 평활연결시킴, Bal31 절제, 프라이머 수복, 시험관내 돌연변이 등과 같은 공지기술에 따라 다양한 서열을 결합할 수 있다. 폴리링커 및 어뎁터도 적당하게 사용되며, 공지 기술에 따라 제거 또는 도입되어 발현 구성체의 결합을 용이하게 한다. 구성체 합성의 각각의 단계에서, 단편을 클로닝하고, 제한 효소, 서열화 및 혼성화 등으로 분석한다. 많은 벡터들이 클로닝에 사용가능하며 특정 벡터의 선택은 본 발명에서 중요하지 않다. 보통, 클로닝은 E. coli에서 일어난다.
측근영역은 표적 좌의 개방 리딩프레임의 적어도 일부, 특히 시그날 서열, 표적 좌 유전자의 5' 및 3' 조절영역을 포함하거나 또는 조절영역을 넘어 확상될 수도 있다. 일반적으로는 프랭킹 영역은 적어도 100bp, 보통 적어도 200bp이며 500bp 또는 그 이상일수도 있다. 표적 유전자를 분열시키고 그 발현을 저지시키기 위하여 플랭킹영역을 선택한다. 이는 5'영역에 가장 가까운 개방 리딩프레임에 발현 카셋트(발현될 뉴클레오티드 서열을 포함하며 시그날 서열, 전사개시조절영역 서열 및/ 또는 전사번역 종결조절영역서열 등의 부수인자를 선택적으로 포함한다)를 삽입함으로써 또는 표적 유전자의 일부 또는 전부를 발현 구성체로 치환함으로써 또는 표적 좌의 전사개시 조절영역과 개방 리딩프레임 사이를 발현 구성체로 간섭하게 함으로써 이루어질 수 있다. 이미 밝혀졌듯이, 종결조절영역이 표적 좌의 영역과 상동적일 경우 3'- 플랭킹 영역은 구성체에 존재하는 종결조절영역보다 실질적으로 더 커야 한다.
또한 본 발명은 제2 세대 피타아제 즉 본 명세서에서 단리된 효소와는 다른 특성을 가지는 피타아제 효소를 제조하기 위한 출발물질을 제공한다. 제2 세대 피타아제는 변화된 최적 온도 또는 pH, 기질에 대한 변화된 비활성 또는 친화력 또는 제한된 공정에서 사용하기에 더욱 적합한 효소의 기타 변화된 특질을 가진다. 이와 같은 돌연변이(예컨대 부위-지정돌연변이)에 가장 좋은 숙주는 E. coli 이다. E. coli는 피타아제 유전자에 존재할 수도 있는 인트론을 제거하는 스플라이싱 기작이 결여되어 있기 때문에 피타아제의 cDNA 클론을 E. coli에서 발현시킬 서열로 선택한다. 이 cDNA 서열은 공지기술에 의하여 용이하게 돌연변이될 수 있으며 그 후 돌연변이된 유전자는 바람직한 발현 구성체에 도입된다.
구성체는 선형 또는 환형 크로닝 벡터로서 숙주에 형질전환되며 바람직한 대로 클로닝 벡터로부터 제거된다. 클로닝 벡터는 바람직하게는 플라스미드이다. 플라스미드는 해당 유전자의 약 1kbp 내에서 보통 선형화된다. 바람직하게는 본 발명의 피타아제 생산을 위한 발현 구성체는 선택 발현 숙주의 게놈에 통합된다.
사상균의 형질 전환을 위한 다양한 기술이 존재한다 이러한 기술에는 원형질체 융합 또는 형질전환, 일렉트로포레이션 및 미세돌출발사(micro projectile firing) 등이 있다. 원형질체 형질전환은 성공적인 것으로 밝혀졌으며 유익하게 사용된다.
소정의 곰팡이 균주의 균사체는 KCl 또는 소르비톨과 같은 삼투 안정제의 존재하에 세포벽을 효소분해함으로써 먼저 원형질체로 전환시킨다. CaCl및 폴리에틸렌 글리콜의 농축액을 첨가하여 원형질체에 의한 DNA 흡수를 증진시킨다. 후자 물질은 원형질체의 응집을 야기시키며 이 과정에 의하여 형질전환 DNA가 응집체에 포함되어 원형질체에 흡수된다. 계속해서 원형질체는 삼투 안정체 및 바람직하다면 형질전환 DNA에 의해 코드화되는 내성을 위한 선택제를 함유하는 고체 배지에서 재생시킨다.
형질전환체를 선택한 후, 소정의 유전자의 존재를 다양한 방법으로 측정하였다. 발현 생성물이 숙주에 이질적인 경우에는 항체를 사용함으로써 소정의 유전자의 발현 존재를 검출할 수 있다. 또한, 통합된 유전자 또는 그 전사생성물의 존재를 검출하기 위하여 서던 또는 노던 브로팅 방법을 이용할 수도 있다.
소정의 뉴클레오티드 또는 발현 구성체의 증폭은 형질전환벡터에 다수의 구성체 사본을 도입하거나 또는 선택 표지로서 amdS 유전자를 사용하는 것과 같은 표준 기술에 따라 이루어 질 수 있다(예컨대, Weinans 외 다수(1985) Current Genetics, 9, 361-368). 증폭될 DNA 서열은 상기의 발현 숙주에 상동적 또는 이질적인 DNA를 포함한다.
그 다음, 세포를 적당한 영양배지에서 성장시킨다. 낮은 농도의 프로테아제 저해제 예컨대 페닐메틸술포닐 플루오라이드, α2-마크로글로불린, 펩스타틴 등을 사용한다. 일반적으로 농도는 약 1㎍/㎖ 내지 1㎎/㎖ 범위에 있다. 요구되는 단백질의 분해를 회피 또는 줄이기 위하여 프로테아제 유전자는 불활성될 수 있다.
형질전환체는 영양배지를 단리하고 요구되는 단백질을 추출하는 회분 또는 연속 발효용기에서 성장시킨다. 필요하다면 크로마토그래피(예컨대 HPLC), 용매-용매추출, 전기영동 또는 이들의 조합 등의 생성물을 정제하는 다양한 방법을 사용한다.
또한 본 발명은 발효 브로스(선택적으로 정제)를 여과한 후, 제2의 무균(germ-free)여과한 다음 여과된 용액을 농축하는 하류 프로세싱 공정을 제공한다. 이리하여 얻어진 액체 농축물은 다음과 같이 사용된다:
a) 계속해서 교반하면서 최종용량 60%(v/v)로 아세톤을 첨가하여 액체농축물로부터 피타아제 및 기타 단백질을 침전시킨다. 35℃ 진공상에서 침전물을 건조시킨다. 건조 파우더를 분쇄한 후, 효소 생성물을 응용 실험에 사용한다. 회수율은 약 90%이다.
b) 종래의 분사-건조 기술을 이용하여 액체 농축물을 분사-건조한다. 회수율은 80%에서 90%로 다양하다.
c) 밀기울과 같은 담체물질과 함께 액체 농축물을 혼합한다. 얻어진 혼합물을 분사타워 또는 액체 베드에서 건조한다.
d) 예컨대 소르비톨을 첨가하여 액체 농축물을 삼투적으로 안정화시킨다. 미생물의 오염을 방지하기 위하여 벤조산과 같은 방부제를 첨가한다.
4개의 모든 제형들은 예비혼합 제조업자, 화학 사료업계, 기타 판매업자 및 농부들에게 판매된다.
본 명세서에서의 실시예들은 예시의 목적으로 제시되었으며 결코 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 피타아제 유전자를 다른 미생물로부터의 피타아제 코딩 유전자를 단리하는 이질적 혼서화 실험에 사용될 수 있음은 본 분야에서 통상의 지식을 가진자에게 자명한 사실이다.
[실시예 1]
A. ficuum NRRL 3135의 발효
Aspergillus ficuum 균주 NRRL 3135를 Northern Region Reseach Lab(USDA, 1815 North University Street, Peoria, Illnois, USA)로부터 얻었다. 다음의 표준 기술에 따라 곰팡이 포자를 제조하였다. 포자 및 그후의 세포를 Erlenmeyer 플라스크에서 일련의 회분발효후 10ℓ 발효탱크에 전이하였다. 회분 배양 후 발효탱크의 내용물을 최종 500리터의 회분 발효를 위한 접종원으로 사용하였다.
사용한 배지는 다음을 함유한다 : 91g/ℓ 옥수수전분(BDH Chemicals Ltd.), 38g/ℓ 글루코오스·HO, 0.6g/ℓ MgSO·7HO, 0.6g/ℓ KCl, 0.2g/ℓ FeSO·7HO 및 12g/ℓ KNO, pH는 4N NaOH 또는 4N HSO로 자동적정에 의하여 4.6±0.3에서 유지하였다.
25% 공기포화의 자동 조절 용해산소농도, 28℃에서 세포를 성장시켰다.
발효 후 10일 째에 피타아제 생산이 5-10 U/㎖의 최대 수준에 도달했다.
[실시예 2]
A. ficuum 피타아제의 정제 및 특성확인
A. 피타아제 활성 분석(assay)
하기의 조성물을 가지는 배양 혼합물에 100μl 브로스 여과물(필요한 경우에는 희석) 또는 상등액 또는 대조용으로 100μl 데미워터를 첨가하였다:
- 0.25M 아세트산나트륨 완충용액 pH 5.5 또는
- 글리신 HCL-완충용액 pH 2.5
- 1mM 피틴산 나트륨염
- 900μl 까지의 데미워터
얻어진 혼합물을 37℃에서 30분간 배양하였다. 10% TCA(트리클로로아세트산) 1㎖를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 반응이 종결 후, 시약(암모늄 몰리브데이트 용액(2.5g(NH)MoO·4HO 및 8㎖ HSO, 데미워터로 250㎖까지 희석함) 50㎖에 3.66g의 FeSO·7HO) 2㎖를 첨가하였다.
750nm에서 청색조의 세기를 분광측광으로 측정하였다. 이 측정은 포스페이트의 눈금곡선에 관련하여 0-1mMol/ℓ 범위의 유리된 포스페이트의 양을 나타낸다.
포스파타아제 염색
일반적인 포스파타아제 염색을 사용하는 등전점 분화 전기영동법으로 포스파타아제 활성을 갖는 구성성분을 검출하였다. 0.6M 아세트산나트륨 완충용액 pH 5.5에서 α-나프틸포스페이트 및 Fast Garnet GBC 염(Sigma, 각각 0.1 0.2%(w/v)) 용액으로 그 겔을 배양하였다. 흑색 침전물이 나타나는 이 반응을 메탄올: 아세트산(30:10%, v/v)으로 종결시키거나 피타아제 활성을 가지는 단백질이 더 필요하다면 증류수로 세정하였다.
B. A. ficuum 피타아제의 정제
A. ficuum NRRL 3135의 배양 브로스로부터 피타아제를 균일하게 정제하였다. 브로스를 먼저 여과하여 무균상태로 만들었다. 30kD 차단 필터로 Filtron 한외여기기에서 배양여과물을 연속해서 더 농축하였다. 시료의 pH 및 이온세기는 시료를 10mM 아세트산나트륨 완충용액 pH 4.5로 세정함으로써 정제 공정에 적합하게 조정하였다. 이 한외여과 공정에서 최종농도는 대략 20배이었다.
그 다음, Waters Preparative 650 Advanced Protein Prification System의 양이온 교환기(S-Sepharose Fast-Flow in a HR 16/20 20㎖ Column, Pharmacia 로부터 구입)에 시료를 적용시켰다. 결합된 단백질을 아세트산나트륨 완충용액에서 0 내지 1M까지 염화나트륨 구배로 용출하였다. 대략 250mM NaCl에서 피타아제가 용출되었다. 피타아제 활성 함유 단편을 모아서 농축하고 한외여과로 탈염시켰다. 얻어진 용액을 음이온 교환기(Q-Sepharose Fast-Flow in a HR 16/10 20㎖ Column Pharmacia)에 작용시키고 상기의 아세트 산염 완충용액에서 0 내지 1M까지 염화나트륨 구배로 단백질을 다시 용출하였다. 이 칼럼으로부터 대략 200mM NaCl에서 피타아제가 용출되었다.
이 정제 단계의 결과는 25배 정제를 나타내는 대략 40-50U/mg단백질의 비활성을 갖는 부분적 정제 피타아제 제조물이었다.
부분적 정제 피타아제의 순도분석결과는 대략 100kDa 분자량을 가지는 주요 불순물의 존재를 나타냈다(제1b도, 서열 E). 등전점 분화 전기영동법은 3-4의 피타아제 서브형태(등전점은 5.0-5.4로 다양함)를 포함하여, 효소를 함유하는 많은 포스파타아제 활성의 존재를 제시한다(제1a도, 서열 A 및 B).
동질의 피타아제 제조물을 얻기 위하여 Ampholine PAG 플레이트(4-6.5pH 범위)상의 LKB Multiphor 시스템에서 등전점 분화 전기영동법에 의하여 부분적 정제 피타아제의 구성성분을 연이어 분리함으로써 2배 더 정제하였다. 포스파타아제 활성(피타아제 포함)을 갖는 단백질을 상기의 일반적인 포스파타아제 염색 공정에 따라 검출하였다. 그 겔로부터 해당 띠를 잘라내고 10mM 아세트산나트륨 완충용액 pH 5.5에서 겔 슬라이스를 16시간 배양하여 활성 단백질을 용출하였다. 실시예 2에 기술된 대로 단백질 단편을 특이 피타아제 활성분석법으로 분석하여 기타 산-포스파타아제로부터 피타아제 단편을 분별하였다. 피타아제의 최종 정제 요소는 약 60배(최종 제조물 100U/mg 단백질의 비활성)이었다. 최종 정제 단계에서 피타아제의 다른 서브형태를 단리하는 것이 또한 가능하였다(제1a도 서열 A 및 B).
효율적인 정제 공정을 제공하는, A. ficuum 피타아제에 대한 모노클로날 항체를 제조하였다. 항체는 세아노겐 브로마이드 활성 Sepharose 4B(5mg/㎖겔)에 결합하였으며 이 매트릭스를 면역친화 칼럼에서 사용하였다. 매트릭스는 대략 1㎖당 1mg 피타아제가 결합한 것으로 나타났다. 활성을 유지하면서 pH 2.5 완충용액(100mM 글리신-HCl, 500mM NaCl)로 친화컬럼으로부터 피타아제를 용출하였다. 이 과정은 단일 단계로 조 배양 여과물로부터 동질의 피타아제를 80% 회수율 및 60배 정제로 단리할 수 있다.
C. 피타아제의 탈당화
0.2M 인산나트륨 완충용액 pH 8.6 및 10mM 1, 10-펜안트롤린의 총 용량 30μl에서 2.5U N-Glycanase(Genzyme)으로 A. ficuum 피타아제(70㎍ 단백질)를 배양하였다.
37℃에서 16시간 후, 탈당화의 정도를 전기영동법(Phast System, Pharamacia)으로 검사하였다. 피타아제의 겉보기 분자량을 85kDa에서 대략 56.5kDa로 감소한 것으로 나타났다. 당단백질로서 원 피타아제를 식별하는 Periodic Acid Sohiff(PAS) 당 염색은 단백질에 부착된 잔류 당질을 검출하지 못했다. 당질의 완전한 제거는 민감성 렉틴-블로팅법에 의해 실체화 되었다. 탈당화 피타아제 및 원 피타아제(각각 1.5㎍)를 표준 SDS-PAGE 겔상에 적용시키고 25mM Tris-글라이신 완충용액 pH 8.3, 20% (v/v) 메탄올에서 30V, 16시간동안 전기영동을 PVDF 막에 전이시켰다.
인산염 완중식염수에서 1%(w/v) 소 혈청 알부민으로 그 막을 계속해서 배양하고 콘카나발린 A-과산화효소(Sigma, 인산염 완충 식염수에서 1㎍/㎖)로 배양하였다. 그 다음 과산화효소를 4-클로로-1-나프톨(Sigma)로 염색하였다.
이 민감성법은 탈당화 피타아제에 부착된 잔류당질을 검출하지 못했다. 탈당화 후 피타아제는 효소의 응집으로 인하여 그 활성을 완전히 상실하였다.
[실시예 3]
피타아제 아미노산 서열의 결정 및 올리고뉴클레오티드 프로브의 디자인
A. N-말단 아미노산 서열의 결정
피타아제를 SDS-PAGE 또는 IEF-PAGE로부터 PVDF 블로팅 막(Immobilon, Millipore)에 전기영동으로 전이시켰다. 10mM CAPS(3-클로로헥실아민-프로판술폰산) 완충용액 pH 11.0에서 10%(v/v) 메탄올로 4℃, 30V에서 16시간동안 전기블로팅을 실시하였다.
Coomassie Brilliant Blue 염색으로 단백질의 위치를 식별하였다. 해당 띠를 잘라내어 메탄올에서 탈색시키고 가스-상 서열화에 적용시켰다. 다른 각각의 제조물을 사용하여 이 과정을 수차례 실시하였다. 얻어진 결과는 제1a도 (서열 A 및 B)에 나타나 있다.
조 생성물에 존재하는 100kDa 단백질에 대한 아미노산 서열을 분석하였다. 이 서열은 Aspergillus niger로부터 단리한 산-포스파타아제와 상당한 상동성을 나타냈다(Mackae외 다수, (1988) Gene 71, 339-348).
B. 내부 아미노산 서열의 결정
브롬화 시아노겐에 의한 단백질의 단편화
균일하게 정제된 피타아제를 한외여과(Microconcentrator Centricon 30, Amicon)에 의해 100mM NaHCO에 전이시켰다. 계속해서 단백질을 냉동건조하고 70% 트리플루오로아세트산(v/v)에 용해하고 대략 300몰배의 과량의 CNBr으로 6시간 배양하였다. 물로 혼합물을 희석함으로 반응을 종결하였다. 얻어진 단편을 다시 냉동건조하였다. 그 다음 DTT(디티오트레이톨)을 함유하는 SDS-PAGE 시료 완충용액에 시료를 용해하고 단편화 정도를 PAGE에 의해 측정하였다. PAGE 분석은 Pharmacia Phast-System 기기 20% SDS-PAGE 겔상에서 실시하였다.
작은 펩티드의 분리를 향상시키기 위해 겔을 미리 러닝시켜 연속적인 완충시스템을 만들었다(매뉴얼에 따라서).
Coomassie Brilliant Blue는 가장작은 펩티드를 검출할 수 없기 때문에 공지의 은-염색법을 이용하여 펩티드를 검출하였다. 이 과정의 결과 피타아제를 2.5kDa, 36kDa, 57kDa 및 80kDa의 분자량을 가지는 펩티드로 완전히 분해하였다.
가스-상 서열화 분석을 위한 펩티드를 상기의 SDS-Tricine-PAGE(Schagger Jagow (1987) Anal. Biochem. 166, 368-379)에 의해 단리하고 상기와 같이 전기블로팅하였다.
57kDa 단편의 N-말단은 처음의 4 아미노산이 결실된 것만 제외하고 Ullah(1988b, 상기)에 의한 피타아제 N-말단과 동일하다(제1a도 서열 B). 2.5kDa 및 36kDa 펩티드의 N-말단 서열은 제1b도의 서열 A 및 B에 도시되어 있다.
C. 올리고뉴클레오티드 프로브
제1a도 및 제1b도에 주어진 아미노산 서열에 근거하여 올리고뉴클레오티드 프로브를 디자인하고 Applied Biosystems ABI 380B DNA 합성기를 사용하여 제조하였다. 이들 올리고뉴클레오티드는 제2a도 및 제2b도에 도시되어 있다.
[실시예 4]
게놈 블로트 및 게놈 라이브러리와 제1세트의 올리고뉴클레오티드 프로브와의 혼성화
A. ficuum으로부터의 게놈 DNA를 표준방법(예컨대, Yelton외 다수(1984) Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 1470-1474)을 이용하여 액체질소에서 균사체를 분쇄하여 단리하였다. 표준기술(예컨대, Maniatis 외 다수(1982) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)에 따라 A. ficuum NRRL 3135 염색체 DNA의 Sau3A 부분절단을 이용하여 박테리오파아지 벡터 람다 EMBL3에 게놈 라이브러리를 제조하였다. 얻어진 게놈 라이브러리는 A. ficuum 게놈의 60 내지 70배를 포함한다. 람다 EMBL3 스터퍼 단편과의 혼성화에 의하여 삽입체가 없는 플라그의 존재에 대하여 라이브러리를 검사하였다. 1% 이하의 플라그가 람다 EMBL3 프로브에 혼성하는 것으로 관찰되었다. 삽입체의 크기는 13 내지 17kb이었다.
게놈 라이브러리의 스크리닝에 적합한 조건 및 프로브를 선별하기 위하여 게놈 DNA를 몇몇 제한효소로 절단하고 아가로스 겔에서 분리한 다음 제조자의 지시에 따라 Genescreen plus로 블로팅하였다. 그 블로트는 모든 올리고뉴클레오티드 프로브와 혼성화하였다. 다양한 스트린전시(stringency) 조건(6×SSC, 40 내지 60℃ 혼성화, 0.2×SSC 까지, 65℃세척)하에서 혼성화를 실시하였다. 두 프로브와 특이적으로 혼성화하는 공통 DNA 단편이 동정되지 않았더라도, 게놈 라이브러리의 선별을 위한 프로브 1068 및 1024(제2a도)를 선택하였다. 산-포스파타아제 프로브 1025(제3도)는 특이적이고 별개의 분리 혼성화 시그날을 제공하므로 이 프로브를 산-포스파타아제 유전자를 위한 게놈 라이브러리 선별용으로 선택하였다.
세 프로브 모두를 사용하여, 혼성화 플라그가 게놈 라이브러리에서 동정되었다. 프로브 1025(산-포스파타아제)에 상응하는 혼성화 시그날은 강력하며 재생적이다. 프로브 1024 및 1068(피타아제)를 이용한 다양한 강도의 혼성화 시그날이 관찰되었다. 두 계열 사이의 역 혼성화는 관찰되지 않았다. 플라그의 세 계열 모두를 재선별하고 8개의 단일 양성 혼성화 플라그(Maniatis 외 다수, 상기)로부터 DNA를 단리하였다. 각 계열에서, 동일한 혼성화 단편을 포함한 클론이 동정되며 이 사실은 상기 클론의 삽입체가 연관되어 있으며 아마 동일한 게놈 DNA 영역에 중복됨을 나타낸다. 또한 두 피타아제 특이 계열(프로브 1024 및 1068)을 사용하여도 역 혼성화는 밝혀지지 않았으며 이는 비록 두 계열의 클론을 단리하기 위하여 사용된 두 프로브가 단백질의 N-말단 아미노산 서열로부터 얻어질지라도 상이한 게놈 DNA 단편이 동정 및 클론되었다.
클론의 세 계열 모두를 유도 및 비-유도 균사체로부터 단리한 mRNA를 함유하는 노던블로트로 혼성화되었다(실시예 6). 산-포스파타아제 특이 클론 뿐만 아니라 이들 클론으로부터의 단리된 내부 3.1kb Sall 단편도 유도 mRNA 시료에 전적으로 혼성화하였다. 산-포스파타아제-특이 프로브에 의해 동정된 mRNA는 대략 1800b 길이이며 이는 이미 알려진 단백질의 크기와 동일하다(68kDa, Ullah 및 Cummins(1987) Prep. Biochem. 17, 397-422).
피타아제-특이 클론과 특이 mRNA's와의 혼성화는 밝혀지지 않았다. 따라서 본 발명자들은 상기 방법이 피타아제를 코드한 유전자의 클로닝에는 성공적이지 못하다는 결론을 내렸다. 또한 이 방법은 산-포스파타아제 코드한 유전자를 동정하는데에는 성공적으로 사용되었기 때문에 이 실패는 방법에 있어서의 잘못이 아니다라는 결론을 내렸다. 산-포스파타아제 유전제를 함유한는 람다 클론은 1989년 4월 24일자로 CBS(The Central Bureauvoor Shimmelcultures, Baarn, The Netherlands)에 기탁 되었으며 수탁번호 CBS 214.89가 부여되었다. 파아지 Z1으로부터 10kb BamHI 단편을 단리하고 pUC19에 서브클로닝하였다. 이 서브클론은 산-포스파타아제를 코드한 전체 유전자를 포함한다. 서브클론 pAF 1-1(제5도)는 1989년 4월 24일자로 CBS 213.89로 기탁되었다.
[실시예 5]
제2 세트의 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용한, 피타아제를 코드하는 유전자의 단리
CNBr-생성단편의 N-말단 아미노산 서열을 이용하여 프로브를 디자인하고(제2b도, 프로브 1295, 1296 및 1297) 상기와 같이 게놈 DNA와 혼성화하였다. 피타아제를 코드한 유전자의 단리에 이들 프로브의 사용 가능성은 게놈블로트와 프로브와의 서던 혼성화에 의해 다시 분석하였다. 여기서, 프로브가 비중첩 영역으로부터 유래하였다는 사실에도 불구하고 이들 세 브로브 모두를 사용하여 대응길이의 혼성화 단편을 동정할 수 있다. 제1세트의 프로브를 사용하여 단리된 클론과 새로운 프로브 세트 사이의 혼성화는 밝혀지지 않았다(실시예 4). 그러므로, 별도의 실험에서 세 프로브 모두를 사용하여 게놈 라이브러리를 재선별하였다. 각각의 개개 프로브로 단리된 서브세트 클론(람다 AF201, 219, 241 및 243)도 두 다른 프로브와 혼성화되었는데 이는 이 경우에서 다른 세 프로브를 사용하여 단일 게놈 영역으로부터 클론이 단리되었음을 나타낸다. 프로브 1024 및 1068과 새로이 단리된 클론을 혼성화하려고 시도하였다. 두 경우에 두 프로브가 이들 프로브를 사용하여 단리된 클론에 성공적으로 혼성화하는 조건에서 새로이 단리된 클론과의 혼성화는 관찰되지 않았다(실시예 4 참조). 이는 새로이 단리된 클론이 정제된 피타아제의 N-말단에서 유래한 프로브와 상동성을 갖지 않음을 나타낸다.
세 프로브(1295-1297) 모두에 혼성화하는 람다 EMBL3-클론을 람다 AF201(제4도)로 명명하고, 1989년 3월 9일자로 CBS 155.890로 기탁하였다.
세 올리고뉴클레오티드 프로브 모두와 혼성화하는 람다 AF201(pUC19에 서브클론되었으며 pAF2-3으로 명명함, 제4도 참조)의 5.1kb BamHI 단편을 사용하여 노던 블로트를 프로브하기 위해 사용하였다. 이 경우에, 1800b 크기의 분리 mRNA을 동정하였다. 이 mRNA는 유도 균사체에서만 발견되었다. 올리고뉴클레오티드 프로브로 사용할 경우 유사한 결과를 얻었다. 그러므로, 새로운 군의 프로브를 사용하여 유도mRNA에 특이적으로 혼성화하는 공통 DNA 단편을 동정하였다. 이mRNA(1800b)의 길이는 약 60kDa 단백질을 코드하기에 충분하며 이는 비당화 단백질의 크기이다. 분명히 단리된 단편은 피타아제를 코드한 유전자의 적어도 일부를 포함한다.
[실시예 6]
유도 및 비-유도 mRNA의 단리
A. ficuum에 의한 피타아제의 합성은 엄격한 포스페이트-의존 조절을 필요로 한다는 것이 문헌에 제시되어 있다(Han and Callagher (1987) J. Indust. Microbiol. 1, 295-301). 그러므로 단리된 유전자가 유사한 조절을 필요로 한다는 실증은 해당 유전자가 클론되었다는 증거를 뒷받침할 수 있는 것으로 여겨진다.
생산 및 비-생산 조건하에서 합성된 mRNA를 단리하기 위하여, A. ficuum에 NRRL 3135를 다음과 같이 배양하였다. 먼저 비-유도 배지에서 포자를 하룻밤동안 배양하였다. 그 다음날, 균사체를 모아 멸균수로 세정한 후 유도 또는 비-유도 배지에 접종하였다. 그 배지(1리터당)에는 20g 옥수수전분, 7.5g 클루코오스, 0.5g MgSO·7HO, 0.2g FeSO·7HO 및 7.2g KNO가 함유되어 있다. 피타아제의 유도에 있어서는 2g/ℓ까지는 옥수수 침지액을 배지에 첨가하는 반면, 비-유도 배지는 2g/ℓ KHPO를 함유한다. 균사체를 최소한 100시간 더 배양하였다. 시료를 선택 시간간격으로 취하였다. 피타아제 생성후 실시예 2A에서와 같이 피타아제 분석을 실시하였다. 전기 영동으로 변성 mRNA를 분리하고, Genescreen Plus에 블로팅하였다. 블로트는 P-표지된 pAF2-3 또는 실시예 4로부터의 pAF1-1(산-포스파타아제)로부터 단리된 3.1kb Sall 단편과 혼성화하였다. 그 결과는 표 2에 도시되어 있다.
피타아제 특이 5.1kb BamHI 단편 및 산-포스파타아제 특이 3.1kb Sall 단편과 단리된 mRNA와의 양성 혼성화는 피타아제 및 산-포스파타아제의 합성을 유도하는 것으로 밝혀진 조건하에서 세포들이 성장할 경우에만 관찰되었다. 이 결과로부터 단리된 유전자들은 피타아제 및 산-포스파타아제에서 예상했던 것과 동일하게 조절된다는 결론을 내렸다.
피타아제 특이 5.1kb BamHI 단편 (A) 또는 산-포스파타아제 특이 3.1kb Sall 단편(B)을 포로브로 사용한 노던 블로트의 혼성화 : +는 1800b 피타아제 mRNA 또는 1800b 산-포스파타아제 mRNA의 존재를 표시한다. 상대적인 피타아제 활성은 24시간 후 시료에서 측정하였다; 유도 배양은 비-유도 배양보다 10배의 피타아제 활성을 가진다.
[실시예 7]
피타아제 유전자의 클로닝 증거
피타아제를 코드한 유전자의 성공적인 단리의 결정적 증거를 얻기 위하여 또한 클론된 유전자의 발현을 증가시킬 수 있는 기능성을 탐구하기 위하여 피타아제 유전자를 적당한 벡터에 서브클론하고 A. niger 402(ATCC 9092)에 형질전환시켰다. 이를 위하여, 피타아제 유전자를 람다 AF201로부터 10kb Nrul 단편으로 단리하고, 선택표지로서 ble 유전자(플레오마이신에 대한 내성을 부여함)를 함유하는 벡터 pAN8-1(Mattern, I.E. 및 Punt, P.J. (1988) Fungal Genetics Newsletter, 35, 25)의 StuI 부위에 클로닝하였다. 얻어진 구성체를 pAF 28-1(제4도)로 명명하고 실시예 9에 기술된 과정에 따라 A. niger 402에 형질전환시켰다. 단, 원형질체는 30㎍ 플레오마이신/㎖로 보충되고 0.75% 아가로 고형화된 Aspergillus 최소배지에 도말하였다. 단일 형질전환체를 정제하고 단리하여 실시예 1 및 실시예 2에서 기술된 것과 같이 진동 플라스크에서 생산성을 테스트하였다(표 3). pAF 28-1를 함유하는 A. niger 402만이 A. ficuum 피타아제에 대한 특이 모노클로날 항체와 반응하는 피타아제를 생산하는 것으로 나타났다. 이 모노클로날 항체와 반응하는 피타아제는 pH2.5에서의 면역친화 칼럼으로 부터 용출되었으며 A. ficuum 피타아제와 비활성, 분자량, 당화정도 및 등전점등이 동일한 것으로 나타냈다. 이러한 발견사실은 pAF28-1로 형질전환된 A. niger 402 세포가 A. ficuum 피타아제와 실질적으로 동일한 피타아제를 발현한다는 분명한 증거를 제공한다. 대조 세포의 어느 군에서도 유사한 발현은 관찰되지 않았다.
유도조건(실시예 6) 하에서 균주를 배양하였다. 성장 96시간 후에 샘플을 취하였다.
[실시예 8]
피타아제 유전자의 특성확인
피타아제 유전자를 포함하는 람다 클론을 다양한 제한요소로 절단하여 분석하였다. 피타아제를 포괄하는 게놈영역의 지도는 제4도에 도시되어 있다. 뚜렷한 제한 단편을 제4도에 도시된 대로 클로닝 벡터 pUC19에 서브클로닝하였다.
pAF2-3에 존재하는 5.1kb BamHI 단편은 피타아제 유전자의 적어도 일부를 포괄한다는 사실은 이미 밝혀져 있다(실시예 5). 더욱이 올리고뉴클레오티드 1295 및 1297 (제2b도)는 pAF2-7 (pAF2 클론의 위치는 제4도에 제시되어 있음)로부터의 Sall 삽입체에 혼성화하는 것으로 밝혀졌으며 한편, 프로브 1296은 아마 pAF2-6과 pAF2-7의 사이의 Sall 부위에 걸쳐 있을 것이다. 이 실험의 결과로부터 피타아제 코딩서열은 pAF2-3의 BamHI 삽입체의 좌측부에 위치한다는 사실을 알 수 있다.
계속해서, 디데옥시 사슬종결법(Sanger 외 다수(1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467) 및 shotgun 방법(Messing 외 다수 (1981) Nucl. Acids Res. 9, 309-321)을 이용하여 플라스미드 pAF2-3, pAF2-6 및 pAF2-7의 삽입체의 뉴클레오티드 서열을 완전히 결정하였다.
또한 서열화 공정 동안에 얻은 뉴클레오티드 서열 정보에 근거하여 특이 올리고뉴클레오티드를 합성하였다.
염색체 피타아제 유전자 부위를 포괄하는 pAF2-3, pAF2-6 및 pAF2-7 클론의 완전한 뉴클레오티드 서열은 제6도에 편집하였으며 시각적 도식은 제7도에 도시하였다.
완전한 서열의 단백질 코드 능력의 분석결과, 성숙 단백질의 N-말단 아미노산 서열은 뉴클레오티드 위치 381로 부터 개시하도록 코드되어 있는 것으로 나타났다(Ullah에 의해 제시된 N-말단은 369 위치에 위치한다). 더욱이, 36kDa 및 2.5kDa 내부 펩티드 단편의 N-말단 아미노산 서열(제1b도 B 및 A 서열 참조)은 각각 뉴클레오티드 위치 1101 및 1548에 코드된 것으로 나타났다. 개방 리딩프레임은 뉴클레오티드 위치 1713에서 종결한다.
이러한 관찰 결과들은 특성확인된 염색체 부위의 실체가 피타아제 코딩 DNA 서열을 함유함을 명확히 증명한다.
성숙된 피타아제 단백질을 코드한 염색체 서열의 바로 상류의 성숙의 단백질 개방 리딩프레임에 근접한 개방 프레임 안에서 ATG 개시 코돈이 발견되지 않는다:
그러나 인트론-엑손 경계 특성확인을 이용하여 프레임내 뉴클레오티드 210 위치의 ATG개시코돈을을 성숙 피타아제 코딩 개방 리딩 프레임으로 가져가도록 뉴클레오티드 위치 254와 355 사이에 인트론을 가정할 수 있다. 이 N-말단 신장의 유래된 아미노산 서열은 Von Heyne(1983, Eur. J. Biochem. 133, 17-21)에 의해 제시된 분비 시그날 서열에 대한 규칙에 잘 맞는다.
이 가설을 확증하기 위하여, 하기의 공정에 따라, 특이 피타아제 프라이머 및 총 mRNA/cDNA 군을 주형으로 하는 PCR-증폭반응에 의하여 피타아제 cDNA를 단리하였다.
Aspergillus ficuum으로부터 폴리 A 의 단리
실시예 6에서 언급된 유도 조건하에서 성장시킨 A. ficuum HRRL 3135로부터 총 RNA을 단리하였다. 액체질소로 건조균사체를 냉동하고 분쇄하였다. 계속해서, 0℃ 3M LiCl, 6M 요소에서 Ultra-Turrax(1분간 전속력으로)로 파우더를 균질화하고 Auffrey 및 Rougeon(Eur. J. Biochem., 107, 303-314,1980)에 의해 제시된 대로 4℃에서 하룻밤동안 유지하였다. 30분간 16,000g에서 원심분리하고 페놀: 클로로포름: 이소아밀알코올(50:48:2)로 2회 연속 추출하여 총 세포 DNA를 얻었다. 에탄올로 RNA를 침전시키고, 1㎖ 10mM Tris-HCl(pH7.4), 0.5% SDS 에 용해하였다. 폴리 A 선택을 위하여, 총 RNA 샘플을 60℃에서 5분간 가열하고 0.5M NaCl에 적응시키고 계속해서 올리고(dT)- 셀룰로오스 칼럼에 적용시켰다. 10mM Tris-HCl pH7.4, 0.5% SDS 및 0.1M NaCl를 함유하는 용액으로 수차례 세정한 후, 폴리 A RNA를 10mM Tris-HCl pH7.4 및 0.5% SDS로 용출하여 수집하였다.
mRNA/cDNA 복합체의 제조
제1 cDNA 가닥의 합성을 위하여 5㎍의 폴리 A RNA를16.5㎕ HO에 용해하고 다음 성분을 첨가하였다:
2.5㎕ RNasin(30U/㎕); 50mM Tris-HCl pH7.6, 6mM MgCl및 40mM KCl를 함유하는 완충용액 10㎕, 5㎕, 0.1M DTT, 0.5㎕ 올리고(dT)(2.5mg/㎖), 5㎕ 8mM dNTP-혼합물; 5㎕ BSA(1mg/㎖) alc 2.5㎕ 콜로니 MLV 역전사효소(200U/㎖), 이 혼합물을 37℃에서 30분간 배양하고, 0.2M EDTA 10㎕ 및 50㎕ HO를 첨가하여 반응을 종결시켰다. 클로로포름으로 추출하고 원심분리 후 110㎕ 5M NHCl 및 440㎕ 에탄올을 계속해서 상등액에 첨가하였다. 30분간 드라이아이스/에탄올 용액에서 mRNA/cDNA 복합체를 침전시켰다. 원심분리로 mRNA/cDNA를 모아서 70% 아이스-냉각 에탄올로 계속해서 세척하고 20㎕ HO에 용해하였다.
피타아제 cDNA 단편의 클로닝
cDNA-코딩 피타아제 서열의 단리를 두 단편에서 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의해 실시하였다. 제6도에 제시된 게놈 피타아제 서열에 근거하여 4개의 합성올리고뉴클레오티드 프라이머를 디자인하였다.
올리고 1은 EcoRI-부위가 5'- 경계에 플랭크된 피타아제 ATG 개시코돈(위치 210 내지 231)의 하류 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 올리고 2는 부가적인 EcoRI 부위가 플랭크된 SalI- 부위(위치 1129 내지 1109)의 바로 상류 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 올리고 3은 BamHI 부위(위치 845 내지 865)주위의 뉴클레오티드 서열을 포함하여 올리고 4는 부가적인 PstI- 부위가 플랭크된 피타아제 종결코돈(위치 1890 내지 1867)의 하류 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
Taq-중합효소(Cetus)의 공급자의 지시에 따라 중합효소 연쇄반응을 실시하였다. mRNA/cDNA 하이브리드(상기 기술)를 함유하는 용액(1.5㎕)을 주형으로 사용하고 N-말단 피타아제 cDNA 부를 증폭하기 위한 반응에서는 올리고 1 및 2, C-말단 피타아제 cDNA부를 증폭하기 위한 반응에서는 올리고 3 및 4 각각을 0.3㎍씩 프라이머로 사용하였다(제8도).
변성(100℃, 7분) 및 2U의 Taq-중합효소 첨가후 Perkin-Elmer/Cetus의 DNA-증폭기에서 25회 증폭 사이클(각각 55℃에 2', 72℃에 3', 94℃에 1')에 반응 혼합물을 작용시켰다.
절단(N- 말단 cDNA 부분에 대해서는 EcoRI 및 C-말단 cDNA 부분에 대해서는 BamHI 및 PstI) 후 두 cDNA 단편을 pTZ18R(Promega)의 적당한 부위에 클로닝하였다.
얻어진 두 PCR 단편의 뉴클레오티드 서열을 염색체 피타아제 유전자 서열에 따라 디자인 된 합성 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 또한 클론된 cDNA 단편 및 전체증폭 DNA를 주형으로 사용하여 디데옥시 사슬종결기술(Sanger, 상기)에 따라 측정하였다. 피타아제 단백질을 코드한 cDNA 영역의 서열 및 그 아미노산 서열은 제8도에 도시되어 있다.
cDNA 서열은 상기 가정된 인트론의 위치를 확증했으며 이는 염색체 유전자 서열내에 다른 인트론이 존재하지 않음을 제시한다.
피타아제 유전자는 467 아미노산(MW 51091)의 1차 번역 산물을 코드한다; 시그날 펩티드의 절단에 의한 1차 번역 산물의 프라세싱 결과 444(MW 48851) 또는 448(Ullah에 의해 밝혀진 처음의 4개 N-말단 아미노산을 포함, MW 49232) 아미노산의 성숙 피타아제 단백질이 생성된다.
[실시예 9]
부가적인 피타아제 게놈 DNA 사본의 도입에 의한 Aspergillus에서 피타아제의 과잉발현.
pAF 2-2S 발현 벡터의 제조.
Maniatis 외 다수 (Moleculer Cloning(1982), A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.)에 의해 기술되었듯이 표준 분자 생물학적 공정에 따라 모든 구성체를 제조하였다.
피타아제 게놈 클론 람다 AF201의 6kb PvuII DNA 단편을 pUC19의 SmaI 부위에 클로닝하으로써 발현 백터 pAF 2-2S를 제조하였다. 얻어진 플라스미드를 pAF 2-2(제4도)로 명명하였다. Aspergillus로 형질전환의 선택 마커로서 상동 Aspergillus nidulans amds 유전자를 함유하는 플라스미드 pGW325 (Wernars K.(1986). Thesis, Agriculture University, Wageningen, The Netherlands)의 EcoRI/KpnI DNA 단편을 pAF 2-2의 EcoRI/KpnI 부위에 삽입하였다. 얻어진 발현 벡터를 pAF 2-2S로 명명하고 제9도에 도시하였다.
A. A. ficuum NRRL 3135에서 피타아제의 과발현
다음변화를 가한 Tilburn, J. 외 다수(Gene (1983) 26, 205-221) 및 Kelly, J. 외 Hynes, M (EMBO J., (1985) 4, 475-479)에 의해 기술된 형질전환공정을 이용하여 A. ficuum NRRL 3135에 플라스미드 pAF 2-2S를 도입하였다.
- 10mM 아르기닌 및 10mM 프롤린이 보충된 Aspergillus 최소배지(Cove, D. (1966) Biochem. Biophys, Acta, 113, 51-56)하에서 30℃ 16시간동안 300rpm 로터리 진동기에서 균사체를 배양하였다.
- 헬리카제는 제외하고 Novezym 234(Novo industri)만을 원형질체 형성에 사용하였다.
- 원형질체 형성 90분 후에 STC 완충액(1.2M sorbitol, 10mM Tris-HCl pH7.5, 50mM CaCl2) 1부피를 원형질체 현탁액에 첨가하고 회전 버킷 로터에서 4℃ 10분간 2500g에서 원심분리하였다. 원형질을 세정하고 108세포/㎖ 농도로 STC-완충액에 재현탁하였다.
- 원형질체 현탁액 100㎕에 플라스미드 DNA를 TE 완충액(10mM Tris-HCl pH7.5; 0.1mM EDTA)에서 100㎕ 부피로 첨가하였다.
- 0℃에서 25분간 DNA-원형질체 현탁액을 배양한 후, PEG 용액(25% PEG 4000(Merck) 10mM Tris-HCl pH7.5, 50mM CaCl2) 200㎕를 적가하였다. 계속해서, PEG 용액(10mM Tris-HCl pH7.5에서 60% PEG 4000, 50mM CaCl2)1㎖를 천천히 첨가하면서 튜브를 반복해서 혼합하였다. 상온에서 배양한 후, STC-완충액으로 현탁액을 희석하고 역으로 혼합하고 4℃, 10분간 2000g에서 원심분리하였다. 원형질체를 200㎕ STC-완충액에 천천히 재현탁하고 유일한 질소원으로서의 10mM 아세트아미드, 10mM CsCl, 1M 수크로스를 포함하고 0.75% 박테리오파아지 아가 #1(옥소이드)로 고형화된 Aspergillus 최소배지에 도말하였다. 33℃에서 6-10일간 배양시켰다.
SP4, SP7 및 SP8로 명명한 단일 형질전환체를 단리하고 정제하여 실시예 1 및 2에서 기술된 과정에 따라 진동 플라스크에서 피타아제 생성을 테스트하였다. 대조용으로 형질전환되지 않은 숙주 및 벡터(pUC19에서 amds유전자)만을 프로세싱하는 형질전환체를 테스트하였다.
유도조건하에서(실시예 6참조) 균주를 배양하고 시료를 성장후 96시간때에 채취하였다. 피타아제 활성 (표4) 를 측정하고 등전점 분화 폴리아크릴아미드겔 전기영동(IEF-PAGE)에 의한 분석을 실시하였다.
동일한 조건하에서 성장시킨 A. ficuum 및 A. ficuum pAF2-2S SP7의 발효물로부터 동등량의 시료를 채취하고 IEF-PAGE겔(4.5-6 pH 범위, Phast-System, Pharmacia)에 작용시켰다. 제조자의 지시에 따라 전기영동을 실시하였다. 계속해서, 겔을 일반적인 단백질 염색법(Coomassie Brilliant Blue)으로 염색하거나(제10b도) 또는 실시예 2에 기술된 일반적인 포스파타아제 활성 염색법으로 염색하였다(제10a도). 균일하게 정제된(실시예 7에 기술된 면역친화 크로마토그래피에 의하여) A. ficuum 피타아제 시료를 배양 상등액과 함께 또는 단독으로 사용하였다. 본 발명에서 언급된 바와 같이 많은 동위형태(isoform)의 피타아제가 다양한 시료에 존재한다(별도로 표시). 두 착색 공정에서 (A와 B)의 3라인 및 4라인의 정제 피타아제에서 주요한 두 동위형태를 명확하게 인식할 수 있다. 모균주 A. ficuum에서는 피타아제 띠는 거의 볼 수 없으며 pAF2-2S SP7 형질전환체 균주에서 상당히 증가한다.
B. A. niger CBS 513.88에서 피타아제의 과발현
A. ficuum에 대해 기술된 형질전환 공정에 따라 발현 벡터 pAF2-2S를 A. niger CBS 513.88에 도입하였다. 단일 형질전환체를 단리하고 정제하여 실시예 6에서 기술된 유도 성장 조건하에서의 진동 플라스크에서 피타아제 생성을 테스트하였다.
몇몇 형질전환체(A. niger pAF2-2S #8, #20 및 #30으로 명명) 및 대조균주의 피타아제 발현 수준을 실시예 9A에 기술된 대로 측정하고 표 5에 도시하였다.
A. niger 형질전환체는 A. ficuum 형질전환체에 비교할 만한 피타아제 발현수준을 가진다. 또한 이 결과는 A. ficuum 피타아제 프로모터가 A. niger에서 활성을 가짐을 나타낸다.
또한 상기의 Phast-System (Pharmacia)에서 4.5-6pH 범위의 IEF-PAGE 겔상의 전기영동에 의하여 형질전환 pAF2-2S #S의 배지를 분석하였다. 동일한 조건하에서 성장시킨 형질전환체 pAF2-2s #8 및 A. niger 모균주의 배양 상등액의 동등량을 겔에 적용시켰다. 겔을 러닝시키고 계속해서 상기와 같이 염색하였다.
모균주 A. niger는 겔 전기영동에 의해 검출될 수 없는 매우 적은 양의 피타아제를 생산한다. pAF 2-2S #S 균주는 대략 90배 이상의 피타아제를 생산하며 이러한 차이점은 제11도에서 분명히 알 수 있다.
일부 피타아제 효소의 동위형태가 검출된다(별도로 표시). 일반적인 단백질 염색결과, 피타아제 단백질 띠의 강도는 급격히 증가하는 반면 다른 주요단백질 띠는 보이지 않는다.
[실시예 10]
A. niger 아밀로글루코시다아제(AG) 유전자의 프로모터 및/또는 시그날 서열에 융합된 A. ficuum 피타아제 유전자를 함유하는 발현벡터로 형질전환된 A. niger에서 피타아제의 발현.
발현 벡터의 구성
A. niger에서 피타아제의 과발현을 얻기 위하여, 다른 시그날 서열과 조합하여 A. niger 아밀로글루코시다아제(AG) 프로모터의 제어하의 A. ficuum 피타아제 유전자에서 부가적 발현 카셋트를 유도한다. p18FYT3 및 p24FYT3 에서, A. niger로부터의 AG 유전자의 각각의 18 및 24 아미노산 리이더 서열은 성숙단백질을 코드하는 피타아제 유전자 단편과 융합된다. 발현카셋트는 pFYT3에서, AG 프로모터 서열은 피타아제 리이더 서열을 포함하는 피타아제를 홀드하는 서열과 융합한다.
p18FYT3의 제조
성숙단백질을 코드하는 피타아제 서열에 AG- 프로모터 및 18-aa AG 리이더 서열의 융합은 중합효소 연쇄반응법에 의하여 이루어진다. PCR 반응에서 상이한 두 주형을 사용하였다: 상기의 피타아제 유전자 전체를 포함하는 pAF2-2S 및 pUC19의 13-15kb HindIII 단편을 함유하는, A. niger 플라스미드 라이브러리로부터 단리된 A. niger의 전체 AG-좌를 함유하는 플라스미드 pAB6-1.
단리과정에서는 AG-특이 올리고를 사용하였다:
AG-1 : 5'-GACAATGGCTACACCAGCACCGCAACGGACATTGTTTGGCCC-3'
AG-2 : 5'-AAGCAGCCATTGCCCGAAGCCGAT-3'
이들은 A. niger에 대해 제시된 뉴클레오티드 서열에 근거하였다(Boel 외 다수(1984), EMBO J. 3, 1097-1102: Boel 외 다수(1984), Mol. 및 Cell. Biol. 4, 2306-2315). 올리고뉴클레오티드 프로브는 인트론 2 주위의 서열로부터 유래한다; 올리고 AG-1은 인트론의 3'에 위치하고 AG mRNA와 동일한 극성을 가지며 올리고 AG-2는 인트론 2의 상류에서 위치하고 AG mRNA와 역평행으로 선택된다. 플라스미드 pAB6-1은 14.5kb HindIII 단편상에 AG 유전자를 포함한다(제12도 참조).
PCR증폭을 위한 프라이머로서 다음 서열을 가지는 4개의 합성 올리고뉴클레오티드를 디자인 하였다:
올리고 1 : 5'-CTCTGCAGGAATTCAAGCTAG-3' (ATG 개시코돈의 대략 250bp 상류 EcoRI 부위 주위의 AG-특이서열)
올리고 18-2 : 5'-CGAGGCGGGGACTGCCAGTGCCAACCCTGTGCAGAC-3'
성숙피타아제 ┴ 18 AA AG-리이더
올리고 18-3 : 5'-GTCTGCACAGGGTTGGCACTGGCAGTCCCCGCCTCG-3'
18 aa AG-리이더 ┴ 성숙피타아제
올리고 4 : 5'-GGCACGAGGATCCTTCAGCTT-3' (위치 861의 BamHI 부위에 위치한 피타아제 특이 서열)
PCR은 Salki 외 다수((1988), Science 239, 487-491)에 의해 기술된 방법에 약간의 변형을 가하여 실시하였다(실시예 8 참조).
피타아제 코딩 서열에 AG 서열을 융합하기 위항, 별도의 두 PCR을 실시하였다. 피타아제 유전자의 뉴클레오티드를 3'- 경계에 측근한 18aa AG-리이더 서열 및 AG 프로모터의 3'- 부분을 포함하는 700bp DNA 단편을 증폭하는 pAB6-1를 주형으로 하여 올리고 1 및 올리고 18-2를 프라이머로 사용한 제1반응 및 AG 시그날 펩티드의 18 뉴클레오티드를 5' 경계에 측근한 피타아제 유전자의 5' 부분을 함유하는 600bp DNA 단편을 증폭하는, pAF2-2S를 주형으로 하고 올리고 18-3 및 올리고 4를 프라이머로 사용한 제2 반응. 이들 증폭과정의 전체적인 도식은 제13도에 도시되어 있다.
생성된 두 DNA 단편을 전기영동 및 에탄올 침전으로 정제하고 올리고 1 및 올리고 4를 프라이머로 사용한 제3 PCR 반응에서 주형으로 사용하여 AG-피타아제 융합체를 생성하였다. 얻어진 DNA 단편을 EcoRI 및 BamHI로 절단하고 pTZ18R에 서브클로닝하였다. 얻어진 융합체를 서열화하고 p18FYT1으로 명명하였다.
pAB6-1을 Kpn1 및 EcoRI 부분절단으로 절단하여 AG-프로모터의 잔류(3.5kb) 상류 영역을 얻었으며 p18FYT1의 1.1kb EcoRI/BamHI 단편에 연결하고, 계속해서 pTZ18R의 KpnI/BamHI 부위에 클로닝하였다. 얻어진 플라스미드 p18FYT2 는 제15도에 도시되어 있다. pAF2-2S의 EcoRI 부위(amds-유전자)에 다음의 합성 단편을 삽입함으로써 부가적인 HindIII 제한부위를 도입하였다:
5' AATTCAAGCTTG 3'
3' GTTCGAACTTAA 5'
생성된 플라스미드를 pAF2-2SH(제14도)라 명명하고 PCR AG-피타아제 융합 DNA 단편으로 피타아제 프로모터 서열을 교환하기 귀한 출발 플라스미드로 사용하였다.
최종 구성체를 위하여 p18FYT2 및 pAF2-2SH를 KpnI으로 절단하고 BamHI으롤 부분절단하였다. p18FYT2의 4.6kb DNA 단편 및 pAF2-2SH 11kb DNA 단편을 단리하고 겔 전기영동으로 정제하고 계속해서 E. coli에 연결시켰다. 생성된 발현 카셋트를 p18FYT3로 명명하였다 (제15도).
p18FYT3의 제조
성숙 피타아제 코딩 서열에 AG-프로모터 및 24 aa AG 리이더 서열의 융합은 사용된 프라이머만 다르고 상기 p18FYT3의 제조에서 기술된 PCR-증폭에 의하여 실시하였다.
다음 서열을 가지는 새로운 두 프라이머를 합성하였다.
올리고 24-2; 5'-CGAGCCGGGGACTGCCAGGCGCTTGGAAATCACATT-3'
성숙피타아제 ┴ 18 AA AG-리이더
올리고 24-3; 5'-AATGTGATTTCCAAGCGCCTGGCAGTCCCCGCCTCG-3'
24 aa AG-리이더 ┴ 성숙피타아제
별도의 두 PCR 반응을 실시하였다: 피타아제 유전자의 18 뉴클레오티드가 3' 경계에 플랭크된 24 aa AG 리이더 서열 및 3 AG-프로모터의 3'- 부분을 포함하는 318bp DNA 단편을 증폭하는, 올리고 1 및 올리고 24-2를 프라이머로 하고 pAB6-1를 주형으로 사용한 제1반응 및 24 aa AG 라이더의 18 뉴클레오티드 5'- 경계에 플랭크된 피타아제 유전자의 5'- 부분을 포함하는 DNA 단편을 증폭하는, 올리고 24-3 및 올리고 4를 프라이머로 사용하고 pAF2-2S를 주형으로 사용한 제2반응, 이들 증폭반응의 전체적인 도식은 제13도에 도시되어 있다.
중간 플라스미드 p24FYT1 및 p24FYT2 를 통한 최종 발현 카셋트 p24FYT3의 제조를 위하여, p18FYT1 및 p18FYT2에 기술된 동일한 클로닝 방법/공정을 이용하여 발현 카셋트 p18FYT3(제15도)를 얻었다.
pFYT3의 제조
피타아제 유전자 서열(피타아제 리이더 포함)에 AG 프로모터의 융합은 사용된 프라이머만 다르고 상기 p18FYT3 제조에서 기술된 PCR-증폭에 따라 실시하였다. 다음 서열을 가지는 부가적인 두 프라이머를 생성하였다.
별도의 두 PCR를 실시하였다: 피타아제 유전자의 18 뉴클레오티드가 3' 경계에 플랭크된 3 AG-프로모터의 3'-부분을 포함하는 282bp DNA 단편을 증폭하는, 올리고 1 및 올리고 fyt-2를 프라이머로 하고 pAB6-1를 주형으로 사용한 제1반응 및 AG 프로모터의 18뉴클레오티드 5'-경계에 플랭크된 피타아제 유전자(피타아제 리이더 포함)의 5'-부분을 포함하는 DNA 단편을 증폭하는, 올리고 fyt-3 및 올리고 4를 프라이머로 사용하고 pAF2-2S를 주형으로 사용한 제2반응. 이들 증폭반응의 전체적인 도식은 제13도에 도시되어 있다.
중간 플라스미드 pFYT1 및 pFYT2를 통한 최종 발현 카셋트 pFYT3의 제조를 위하여, p18FYT1 및 p18FYT2에 기술된 동일한 클로닝 방법/공정을 이용하여 발현 카셋트 p18FYT3(제15도)를 얻었다.
A. niger에서의 AG 프로모터의 제어하에서 피타아제 유전자의 발현
HindIII 절단에 의하여 상기의 피타아제 발현 카셋트로부터 E. coli 서열을 제거하였다. 그 다음, 실시예 9에 기술된 방법에 따라 10㎍ DNA 단편으로 A. niger 균주 CBS 513.88(1988.10.10에 기탁됨)을 형질전환하였다. 각각의 발현 카셋트로부터 단일 A. niger 형질전환체를 단리하고 선택 아세트아미드-아가 플레이트에 포자를 도말하였다. 0.4% 감자-덱스트로오스(Oxoid, England) 아가 프레이트상에서 37℃ 3일간 성장시킨 세포로부터 각형질전환체의 포자를 수집하였다. 다음의 성장 조건하에서의 진동 플라스크에서 피타아제 생성을 테스트하였다:
1g KH2PH4, 30g 말토오스, 5g 효모-추출물, 10g 카제인-가수분해물, 0.5g MgSO4·7H2O 및 3g Tween 80을 함유하는 (리터당) 예비-배양배지 100㎖에 대략 1×108포자를 접종하였다. pH는 5.5에 조정하였다.
로터리 진동기에서 34℃에서 하룻밤동안 성장시킨 후, 2g KH2PH4, 70g 말토텍스트린(Malolex MDO3, Amylum), 12.5g 효모추출물, 25g 카제인-가수분해물, 2g K2SO4, 0.5g MgSO4·7H2O, 0.03g ZnCl2, 0.02g CaCl2, 0.05g MnSO4·4H2O 및 FeSO4를 함유하는(리터당) 주-배양배지 100㎖에 성장배양물 1㎖를 접종하였다.
균사체는 적어도 140시간 성장하였다. 실시예 2에서와 같이 피타아제 생성을 테스트하였다. 각 발현 카셋트에서 얻어진 몇몇 임의 형질전환체의 생성 결과는 표 6에 도시되어 있다.
피타아제 유전자를 함유하는 A. niger 형질전환체에서 A. niger AG 프로모터의 제어하에서의 높은 피타아제 발현수준을 데이터로부터 잘 알수 잇다. 또한 데이터는 피타아제 리이더 서열을 포함하는 pFYT3 발현 벡터로 가장 높은 피타아제 생산이 이루어짐을 보여준다. A. niger에 형질전환후 인트론없는 피타아제 유전자를 포함하는 유사한 발현 벡터는 A. niger의 pFYT3 형질전환체와 비교할 만한 피타아제 발현수준을 초래한다.
또한, 형질전환체 pFYT3 #205 및 #282의 배양 상등액을 4.5 내지 6의 pH 범위에서 IEF-PAGE 겔상에서 전기영동하였다. 동일한 조건에서 성장시킨 A. niger 모균주 및 두 형질전환체의 배양 상등액 동등량을 겔에 적용시키고 러닝시킨 후 계속해서 실시예 9와 같이 염색하였다. A. niger 모균주는 본 실험에서 검출할 수 없는 정도의 아주 적은 양의 피타아제를 생산한다. pFYT3 #205 및 #282 균주는 대략 250 및 1400배의 피타아제를 생산하며 (표 4 및 5에서 피타아제의 수준을 비교), 이러한 차이는 제11도에서 분명히 할 수 있다.
피타아제 효소의 일부 동위형태가 검출된다(별도로 도시). 일반적인 단백질 염색 결과로부터 피타아제 단백질 띠의 강도가 급격히 증가하는 반면 다른 주요 단백질 띠는 나타나지 않음을 알 수 있다.
[실시예 11]
산업적 규모에서 성장시킨 A. ficuum 및 A. niger에서의 피타아제의 과발현
A. A. ficuum
A. ficuum pAF2-2S ALC #4 A. ficuum NRRL 3135 균주를 실시예 1에서와 같이 성장시켰다. 형질전환체는 야생균주에 비하여 대략 50배 이상의 피타아제를 생산하였다.
B. A. niger
A. niger pAF2-2S #8 균주, A. niger CBS 513.88 균주의 형질전환체 및 A. niger 모균주를 실시예 1에서와 같이 성장시켰다. 형질전환체는 원래의 A. niger 모균주에 비하여 대략 1000배 이사의 피타아제를 생산하였다(표 8).
피타아제 발현 및 AG 유전자 교체를 동시에 달성하는 벡터 pREPFYT3를 제조하기 위하여, pFYT3를 KpnI으로 절단하였다. 얻어진 KpnI DNA 단편으로 별도의 두 연결과정을 실시하였다. KpnI-HindIII 어뎁터와의 연결 1;
KpnI-HindIII 어뎁터와의 연결 2; 연결후 HindIII 제한부위는 복구되지 않음.
계속해서, 연결 1을 HindIII로 부분절단하였다. 겔 전기영동으로 단편을 포함하는 amdS를 제거한 후, 잔류 DNA 단편을 연결하여 재환형화하고 E. coli로 전이시켰다. 얻어진 플라스미드를 pFYT3 △amds(제16도)로 명명하였다.
또한 연결 2를 HindIII로 절단하고 amdS를 포함하는 4kb DNA HindIII/HindIII*를 겔 전기 영동으로 단리하고 계속해서 pFYT3 △amdS의 HindIII 부분 절단체에 연결하여 E. coli로 전이시켰다. 피타아제 유전자의 3' 말단에 amdS 유전자를 포함하는 플라스미드를 pFYT3INT(제17도)로 명명하였다.
3'- 플랭킹 AG 서열을 포함하는, pAB6-1의 약 6kb SalI/HindIII DNA 단편을 도입하기 위하여 pFYT3INT 를 HindIII로 부분 절단하고 어뎁터;
에 먼저 연겨랗고(연결후 HindIII*제한부위는 복구되지 않음) 계속해서 pAB6-1의 SalI/HindIII 단편에 연결한다. E. coli 에 형질전환 후, 올바른 위치에 3'AG 플랭킹 서열을 포함하는 소정의 플라스미드 pREPFYT3을 얻었다(제18도).
AG 유전자 대체에 의한 A. niger에서의 피타아제의 발현
pREPFYT3로 A. niger의 형질전환전에, 플라스미드의 E. coli 서열을 HindIII 절단 및 겔전기영동에 의하여 제거하였다. 실시예 9에서와 같은 방법으로 10㎍ DNA 단편으로 A. niger CBS 513.88 균주를 형질전환하였다 실시예 9에서와 같이 형질전환체를 성장시키고 및 선택하였다. 선택된 형질전환체의 소수만이(대략 20%) AG 활성을 상실했다. 염색체 DNA 의 서던 분석을 AG 네가티브 및 피타아제 포지티브 형질전환체에 실시하여 AG 유전자가 정말로 피타아제 유전자로 대체되었음을 입증하였다.
[실시예 13]
다른 종에서 피타아제 유전자의 보존
피타아제 유전자가 미생물종안에서 매우 보존적인지를 결정하기 위하여 10개의 다른 생물종으로부터 염색체 DNA의 서던 분석을 A. ficuum 사상균, 이스트 및 박테리아 종에서 이들 염색체 DNA 분석을 실시하였다. 예컨대, 각 군으로부터의 한정된 수만을 선택하였다: 사상균에은 Penicillium chrysogenum과 Aspergillus niger, 효모에는 Saccharomyces cerevisiae와 Kluyveromyces lactis, 및 원핵생물로서 그람-양성군에는, Bacillus subtilis, Clostridum thermocellum 및 Streptomyces lividans, 그람-음성 박테리아에는 Pseudomonas aeruginosa.
이들 종으로부터 분자량이 큰 염색체 DNA를 PvuII 및 BamHI로 별도로 절단하고 계속해서 0.7% 아가로스 겔에서 전기영동하였다.
니트로셀룰로오스 필터로 전이시킨 후,32P-표지된 5'- 피타아제 cDNA 단편으로 낮은 스트린전지(stringency)의 (6×SSC; 50℃) 조건하에서 하룻밤동안 혼성화를 실시하였다(실시예 8에 기술) 상온, 6×SSC 에서 블로트를 세정하고 18시간 X-선 노출시켰다.
제19a 및 b도에서 알 수 있는 바와 같이, 거의 모든 라인에서 분리된 띠가 관찰되었으며 이는 미생물종 사이에 피타아제 유전자의 상당한 상동성이 있음을 예상케한다.
Claims (13)
- 미오이노시톨 헥사키스-포스페이트로부터 무기 인의 유리를 촉매화하는 곰팡이 Aspergillus 속의 피타아제를 코드화하고; 그리고 (b) 낮은 스트린전시(6×SSC; 50℃, 밤새)의 조건하에 제6도에 도시된 뉴클레오티드 210-1129 부분을 포함하는 프로브와 혼성화하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코드화되는 피타아제를 코드화 하는 것을 특징으로 하는 정제되고 단리된 DNA 분자.
- 제1항에 있어서, 상기 Aspergillus는 Aspergillus ficuum 또는 Aspergillus niger 종인 것을 특징으로 하는 상기 DNA 분자.
- 숙주세포에 함유되었을 때, 낮은 엄격성(6×SSC; 50℃, 밤새)의 조건하에 제6도에 도시된 뉴클레오티드 210-1129 부분을 포함하는 프로브와 혼성화하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코드화되는, 미오이노시톨 헥사키스-포스페이트로부터 무기 인의 유리를 촉매화 하는 곰팡이 Aspergillus 속으로부터 유래하는 피타아제를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 발현시키는데 유용하고, 상기 피타아제를 코드화하는 뉴클레오티드 서열이 상기 숙주세포와 양립할 수 있는 제어서열에 작동가능하게 연결된 것을특징으로 하는 재조합 발현 구성체.
- 제3항에 있어서, 상기 단백질을 코드화하는 상기 뉴클레오티드 서열이 상기 단백질에 작동가능하게 연결된 분비 리더 서열을 코드화하는 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현 구성체.
- 제3항에 있어서, 상기 제어서열이 AG 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현 구성체.
- 제4항에 있어서, 상기 리더 서열이 18-아미노산 AG 리더 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현 구성체.
- 제3항의 발현 구성체를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
- 제3항의 발현 구성체를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물 숙주세포.
- 제8항에 있어서, 상기 숙주세포는 박테리아, 효모 또는 곰팡이 세포인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물 숙주세포.
- 제9항에 있어서, 상기 숙주세포는 Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Mucor, Bacillus, Kluyveromyces 및 Saccharomyces로 이루어지는 군으로부터 선택되는 속인 것을 특징으로 하는 재조합 숙주세포.
- 제10항에 있어서, 상기 숙주세포는 Aspergillus neger, Aspergillus ficuum, Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae, Thrichoderma reesei, Mucor miehei, Kluyvermyces lactis, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis 및 Bacillus licheniformis로 구성되는 군으로부터 선택되는 종인 것을 특징으로 하는 재조합 숙주세포.
- 미오이노시톨 헥사키스-포스페이트로부터 무기 인의 유리를 촉매화하는 곰팡이 Aspergillus 속으로부터 유래하는 피타아제를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 발현시키는 방법으로서, (a) 상기 피타아제를 코드화하는 뉴클레오티드 서열이 상기 피타아제를 생산하도록 발현되는 조건하에서 제8항에 따른 세포를 배양하고, 그리고 (b) 배양물로부터 생성된 피타아제를 회수하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 Aspergillus는 Aspergillus ficuum 또는 Aspergillus niger 종인 것을 특징으로 하는 재조합 발현 구성체.
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