DE420358T1 - Klonierung und Expression mikrobieller Phytase. - Google Patents

Klonierung und Expression mikrobieller Phytase.

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DE420358T1
DE420358T1 DE0420358T DE90202565T DE420358T1 DE 420358 T1 DE420358 T1 DE 420358T1 DE 0420358 T DE0420358 T DE 0420358T DE 90202565 T DE90202565 T DE 90202565T DE 420358 T1 DE420358 T1 DE 420358T1
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phytase
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phytase activity
sequence
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DE0420358T
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Gerardus Cornelis Maria Selten
Gorcom Robert Franciscus M Van
Hartingsveldt Willem Van
Paridon Peter Andreas Van
Annemarie Eveline Veenstra
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Gist Brocades NV
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    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14Hydrolases (3)
    • C12N9/16Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A23FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23KFODDER
    • A23K20/00Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10Organic substances
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Claims (31)

O42Ü Patentanspruchs
1. Gereinigte und isolierte DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz für ein Peptid oder Protein mit Phytaseaktivität codiert.
2. Gereinigte und isolierte DNA-Sequenz nach Anspruch 1, weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz von einer mikrobiellen Quelle abgeleitet ist.
3. Gereinigte und isolierte DNA-Sequenz nach Anspruch 1, weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz von einer Pilzquelle abgeleitet ist.
4. Gereinigte und isolierte DNA-Sequenz nach Anspruch 1, weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz von einer Aspergillus-Quelle abgeleitet wird.
5. Gereinigte und isolierte DNA-Sequenz nach Anspruch 1, weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz von einer Aspergillus ficuum- oder einer Aspergillus niger-Quelle abgeleitet wird.
6. Gereinigte und isolierte DNA-Sequenz nach Anspruch 1, weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß die für eine Phytase codierende Sequenz die folgenden Charakteristika aufweist:
a) Eine einzelne Bande bei 85 kDa auf SDS-PAGE, wenn sie in einem Aspergillus-Wirt exprimiert wird;
b) ein scheinbares Molekulargewicht nach Declycosylierung im Bereich von etwa 48 bis 56,5 kDa;
c) eine spezifische Aktivität von etwa 100 U/mg Protein.
P:\TEXT\PATENT\45727PA-DOC
0420 35S
7. Gereinigte und isolierte DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz mindestens eins der folgenden Charakteristika umfaßt:
a) Hybridisierung zu einer Oligonucleotidsonde, die von der in Figur 6 offenbarten DNA-Sequenz abgeleitet ist;
b) Hybridisierung zu einer Oligonucleotidsonde, die von der in Figur 8 offenbarten cDNA-Sequenz abgeleitet ist.
8. Expressionskonstrukt, dadurch gekennzeichnet, daß eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 7 operabel mit
einem Regulationsbereich verbunden ist, der in der Lage ist, die Expression eines Proteins oder Peptids mit Phytaseaktivität in einen geeigneten Expressionswirt zu lenken.
20
9. Expressionskonstrukt nach Anspruch 8, weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß der Regulationsbereich auch eine sekretorische Leader-Sequenz enthält, die für die Sekretion des exprimierten Proteins oder Peptids mit Phytaseaktivität sorgt.
10. Expressionskonstrukt nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der AG-Promotor zur Lenkung der Expression des Proteins oder Peptids mit Phytaseaktivität verwendet wird.
11. Expressionskonstrukt nach Anspruch 10, weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß eine homologe Phytase-Leader-Sequenz verwendet wird, um für die Sekretion des exprimierten Proteins oder Peptids mit Phytaseaktivität zu sorgen.
P:\TEXT\PATENT\45727PA.DOC
0420 35a
12. Expressionskonstrukt nach Anspruch 10, weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß die 18 Aminosäure-AG-Leader-Sequenz verwendet wird, um für die Sekretion des exprimierten Proteins oder Peptids mit Phytaseaktivität zu sorgen.
13. Expressionskonstrukt nach Anspruch 10, weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß die 24 Aminosäure-AG-Leader-Sequenz verwendet wird, um für die Sekretion des exprimierten Proteins oder Peptids mit Phytaseaktivität zu sorgen.
14. Expressionskonstrukt nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß ein homologer Phytasepromotor verwendet wird, um die Expression des Proteins oder Peptids mit Phytaseaktivität zu lenken.
15. Expressionskonstrukt nach Anspruch 14, weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß eine homologe Phytase-Leader-Sequenz verwendet wird, um für die Sekretion des exprimierten Proteins oder Peptids mit Phytaseaktivität zu sorgen.
16. Expressionskonstrukt nach Anspruch 14, weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß die 18 Aminosäure-AG-Leader-Sequenz verwendet wird, um für die Sekretion des exprimierten Proteins oder Peptids mit Phytaseaktivität zu sorgen.
17. Expressionskonstrukt nach Anspruch 14, weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß die 24 Aminosäure-AG-Leader-Sequenz verwendet wird, um für die Sekretion des exprimierten Proteins oder Peptids mit Phytaseaktivität zu sorgen.
18. Vektor, der in der Lage ist, eine Wirtszelle zu transformieren, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor ein Expressionskonstrukt nach einem der Ansprüche 8 bis 17 enthält.
P:\TEXT\PATENT\45727P A.DOC
19. Vektor nach Anspruch 18, weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor ein Plasmid ist.
20. Vektor nach Anspruch 18, weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor ein aus der aus pAF 28-1, pAF 2-2S, pAF 2-2, pAF 2-3, pAF 2-4, pAF 2-6, pAF 2-7, pl8FYT3, p24FYT3 und pFYT3 bestehenden Gruppe ausgewähltes Plasmid ist.
21. Transformierte Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszelle mit einem Vektor gemäß einem der Ansprüche 18 bis 20 transformiert ist.
22. Transformierte Wirtszelle nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einer aus Bakterien, Hefen und Pilzen bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
23. Transformierte Wirtszelle nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus der aus Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Mucor, Bacillus, Kluyveromyces und Saccharomyces bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
24. Transformierte Wirtszelle nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus der aus Aspergillus niger, Aspergillus ficuum, Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Mucor miehei, Kluyveromyces lactis, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis und Bacillus licheniformis bestehenden Gruppe ausgewählt wird.
25. Verfahren zur Herstellung eines Peptids oder Proteins mit Phytaseaktivität, dadurch gekennzeichnet, daß eine transformierte Wirtszelle nach einem der Ansprüche 21 bis 24 unter Bedingungen kultiviert wird, die für die Herstellung des Peptids oder Proteins mit Phytaseaktivität förderlich sind.
P:\TEXTiPATENTi45727PA.DOC
0420 3S8
26. Peptid oder Protein mit Phytaseaktivität, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid oder Protein mit Phytaseaktivität durch ein Verfahren nach Anspruch 25 hergestellt wird.
27. Phytase, dadurch gekennzeichnet, daß die Phytase die folgenden Charakteristika aufweist:
a) Eine einzelne Bande bei 85 kDa auf SDS-PAGE, wenn sie in einem Aspergillus-Wirt exprimiert wird;
b) ein scheinbares Molekulargewicht nach Deg,lycolysierung im Bereich von etwa 48 bis 56,5 kDa;
c) eine spezifische Aktivität von etwa 100 U/mg Protein.
28. Futtermittel für Tiere, dadurch gekennzeichnet, daß das Futtermittel ein Peptid oder Protein mit Phytaseaktivität nach einem der Ansprüche 26 und 27 enthält.
29. Verwendung eines Peptids oder Proteins mit Phytaseaktivität nach einem der Ansprüche 26 und 27 für die Umwandlung von Phytat in Inositol und anorganisches Phosphat.
30. Verfahren zur Förderung des Wachstums von Tieren, dadurch gekennzeichnet, daß ein Tier mit einem Nahrungsmittel gefüttert wird, das ein mit einer Phytase nach einem der Ansprüche 2 6 und 27 ergänztes Futtermittel umfaßt.
31. Verfahren zur Reduzierung der Phytaseteile in Tierdung, dadurch gekennzeichnet, daß ein Tier mit einem Nahrungsmittel gefüttert wird, das ein mit einer Phytase nach
&Rgr;:\&Tgr;&Egr;&KHgr;&Tgr;&Lgr;&Rgr;&Agr;&Tgr;&Egr;&Ngr;1&Lgr;45727&Rgr;&Agr;.&Ogr;&Ogr;&Ogr;
0420 35$
einem der Ansprüche 26 und 27 ergänztes Futtermittel in einer Menge umfaßt, die bei der Umwandlung des in dem Futtermittel enthaltenen Phytats in Inositol und anorganisches Phosphat wirksam ist.
&Rgr;&Lgr;&Tgr;&Egr;&KHgr;&Tgr;&Lgr;&Rgr;&Agr;&Tgr;&Egr;&Ngr;&Tgr;&lgr;45727&Rgr;&Agr;.&udigr;&Ogr;&Ogr;
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