DE3886221T2 - VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON PROTEINPRODUKTEN IN -i(ASPERGILLUS) UND PROMOTOREN ZUR VERWENDUNG IN -i(ASPERGILLUS). - Google Patents

VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON PROTEINPRODUKTEN IN -i(ASPERGILLUS) UND PROMOTOREN ZUR VERWENDUNG IN -i(ASPERGILLUS).

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Expression von Proteinprodukten in Aspergillus, rekombinante DNA-Vektoren, einen Promotor für Aspergillus und transformierte Pilze. Die vorliegende Erfindung ist auch gerichtet aut eine neue Amylase aus A. niger.
  • In der Vergangenheit sind zahlreiche Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden oder Proteinen mit Hilfe der rekombinanten DNA-Technologie entwickelt worden. Das Hauptinteresse hat sich auf Bakterien und Hefe konzentriert, z.B. E. coli, Bacillus subtilis und Saccharomyces cerevisae, die gut charakterisierte Spezies sind, was z.B. Expressions- und Selektionssysteme betrifft.
  • Neben den oben erwähnten Mikroorganismen sind Fadenpilze, wie etwa Aspergillus niger, attraktive Kandidaten als Wirtsmikroorganismen für rekombinante DNA-Vektoren, da sie gut charakterisierte und in weitem Umfang verwendete Mikroorganismen für die kommerzielle Herstellung von Enzymen sind. Bemühungen sind insbesondere auf die Entwicklung von Transformationssystemen konzentriert worden, von denen ein Selektionsmarker verwendet wird, der Selektion von Transformanten von den nicht-transformierten Wirtsmikroorganisinen ermöglicht.
  • In den letzten paar Jahren sind verschiedene Selektionsmarker für die Transformation von Aspergillus nidulans beschrieben worden und Verfahren sind entwickelt worden für integrative Transformation des Fadenpilzes Aspergillus nidulans für den Zweck der Untersuchung der genetischen und molekularen Prozesse, die Pilzzelldifferentiation steuern.
  • Transformation von A. nidulans ist nachgewiesen worden durch Verwendung von Plasmiden, die das Neurospora crassa-pyr-4- Gen (Ballance, D.J. et al., Biochem.Biophys. Res.Commun., 112 (1983) 284-289), das A. nidulans-amds-Gen (Tilburn, J.G. et al., Gene 26 (1983) 205-221), das A. nidulans-trpC-Gen (Yelton, M.M. et al., Proc.Natl. Acad.Sci. U.S.A., 81 (1984) 1470-1474) und das A. nidulans-argB-Gen (John, M.A. und Peberdy J., Microb.Technol. 6 (1984) 386-389) enthalten. Es wurde festgestellt, daß die transformierende DNA mit recht niedrigen Häufigkeiten in das Wirtsgenom integriert wurde (typischerweise < 1000 Transformanten/ug DNA).
  • Kürzlich wurde Transformation von Aspergillus niger mit dem amdS-Gen von A. nidulans beschrieben (Kelly, J.M. und Hynes, M.J., EMBO Journal 4 (1985), 475-479) und es wurde gezeigt, daß amdS ein potentieller Selektionsmarker zur Verwendung bei der Transformation von Aspergillus niger ist, der auf Acetamid als einer einzigen Stickstoffquelle nicht stark wachsen kann. Transformation von Aspergillus niger unter Verwendung des argB-Gens von Aspergillus nidulans ist auch kürzlich beschrieben worden (Buxton, F.P. et al., Gene 37 (1985), 207-214)
  • Bisher sind Ausbeuten von heterologen Proteinen in A. niger für kommerzielle Produktion nicht befriedigend gewesen. Demgemäß ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, um konmerziell attraktive Ausbeuten fremder Proteine in Aspergillus zu erhalten. Es ist auch eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Produktion von homologen Proteinen in Aspergillus zu erhöhen.
    • KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es nunmehr gezeigt, worden, daß es möglich ist, in Aspergillus ein hohes Expressionsniveau von heterologen Proteinen zu erhalten oder die Produktion von homologen Proteinen zu erhöhen, wenn Promotoren verwendet werden, die von Amylase-Genen aus A. niger abgeleitet sind.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet der Ausdruck "heterologe Proteine" Proteine, die nicht vom Wirtsorganismus produziert werden, wohingegen "homologe Proteine" Proteine bedeutet, die vom Wirtsorganismus produziert werden.
  • Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Promotor- und Flußaufwärts-Aktivator-Sequenzen zur Verfügung gestellt, die für Aspergillus verwendbar, insbesondere A. niger-Expression, und von einem Gen für neutrale &alpha;-Amylase aus A. niger abgeleitet sind.
  • Gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Promotor- und Flußaufwärts-Aktivator-Sequenzen zur Verfügung gestellt, abgeleitet von einem Gen für säurestabile &alpha;- Amylase aus A. niger.
  • Gemäß einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Promotor- und Flußaufwärts-Aktivator-Sequenzen zur Verfügung gestellt, abgeleitet von einer zuvor nicht beschriebenen Amylase aus A. niger (A. niger-XA-Amylase).
  • Die neutralen und säurestabilen &alpha;-Amylasen aus A. niger sind beschrieben von Minoda et al., Agr.Biol.Chem. 33 (4), 572- 578 (1969)
  • Gemäß einem vierten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Expression eines Proteinproduktes in Aspergillus zur Verfügung gestellt, welches die Schritte umfaßt:
  • (a) Bereitstellen eines rekombinanten DNA- Klonierungsvektorsystems, das zur Integration in das Genom eines Aspergillus-Wirts in einer oder mehreren Kopien in der Lage ist und: Promotor- und Flußaufwärts-Aktivator- Sequenzen, abgeleitet von einem A. niger-Amylase-Gen; einen geeigneten Marker zur Selektion von Transformanten; und eine DNA-Sequenz, die das gewünschte Proteinprodukt kodiert, umfaßt;
  • (b) Transformieren des Aspergillus-Wirts, der kein funktionelles Gen für den ausgewählten Selektionsmarker enthält, mit dem rekombinanten DNA-Klonierungsvektorsystem aus Schritt a; und
  • (c) Kultivieren des transformierten Aspergillus-Wirts in einem geeigneten Kulturmedium.
  • Der Wirtsstamm ist vorzugsweise ein Aspergillus niger-Stamm, obgleich andere Aspergillus-Stämme verwendet werden können.
  • Gemäß einem fünften Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines Proteinproduktes in Aspergillus niger zur Verfügung gestellt, durch welches Verfahren ein Aspergillus niger-Stamm, der mit einem rekombinanten DNA-Klonierungsvektorsystem, wie oben beschrieben, transformiert worden ist, in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert wird und das Produkt aus dem Kulturmedium gewonnen wird.
  • Gemäß einem sechsten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine zuvor nicht beschriebene Amylase aus A. niger zur Verfügung gestellt.
    • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN:
  • Die vorliegende Erfindung wird weiter veranschaulicht durch Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen, in denen:
  • Fig. 1 eine Endonuklease-Restriktionskarte der Plasmide pNA1 und pNA2 zeigt,
  • Fig. 2 die DNA-Sequenz der Promotor-NA1- und Flußaufwärts-Aktivator-Regionen von neutraler &alpha;- Amylase aus A. niger, die Vorregion und den 5q Teil des Strukturgens für die neutrale &alpha;-Amylase aus A. niger zeigt,
  • Fig. 3 die DNA-Sequenz der Promotor-NA2- und Flußaufwärts-Aktivator-Sequenzen der neutralen &alpha;- Amylase aus A. niger, die Vorregion und den 5'- Teil des Strukturgens für die neutrale &alpha;-Amylase aus A. niger zeigt,
  • Fig. 4 die Konstruktion von Plasmid pXA zeigt,
  • Fig. 5 die DNA-Sequenz der Promotor- und Flußaufwärts- Aktivator-Sequenzen der XA-niger-Amylase zusammen mit der Vorregion und dem 5'-Teil des Strukturgens zeigt,
  • Fig. 6 Plasmid pAA zeigt,
  • Fig. 7a und b die DNA-Sequenz der Promotor- und Flußaufwärts- Aktivator-Sequenzen der säurestabilen &alpha;- Amylase zusammen mit der Vorregion und dem 5'-Teil des Strukturgens zeigen,
  • Fig. 8 die Konstruktion von Plasmid pNA2-RMP zeigt,
  • Fig. 9 die Konstruktion von Plasmid pPAA-RMP und
  • Fig. 10 die Konstruktion der Plasmide pPXA-RMP und pPXA- RMP' zeigt.
    • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die verwendete Transformationstechnik war ein Verfahren, das adaptiert ist von den Verfahren zur Transformation aus A. nidulans (Ballance et al., Biochem.Biophys.Res.Commun., 112 (1983), 284-289; Tilburn et al., Gene 26 (1983), 205-221, Yelton et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 81 (1984), 1470- 1474) und ähnlich der Methode von Buxton et al. (Gene 37 (1985) 207-214) für die Transformation von A. niger. Im Verfahren der vorliegenden Erfindung wird der ausgewählte Aspergillus-Stamm mit einem Vektorsystem transformiert, das einen Selektionsmarker enthält, der in das Genom des Wirtsstammes eingebaut werden kann, aber der vor der Transformation nicht im Wirtsstamm enthalten ist. Transformanten können dann von Nicht-Transformanten auf der Grundlage des eingebauten Selektionsmarkers selektiert und isoliert werden.
  • Bevorzugte Selektionsmarker sind die argB(A. nidulans oder A. niger)-, trpC(A. nidulans)-, amdS(A. nidulans)- oder pyr4(Neurospora crassa)-Gene, oder das DHFR(Dihydrofolat- Reduktase oder Mutanten hiervon)-Gen. Bevorzugtere Selektionsmarker sind das argB- oder amdS-Gen.
  • Neben Promotor- und Flußaufwärts-Aktivator-Sequenzen werden die Vektoren normalerweise weitere DNA-Sequenzen enthalten, die Funktionen kodieren, die die Genexpression erleichtern, wie etwa Transkriptionsterminatoren und Polyadenylierungssignale.
  • Wie im weiteren Detail in Beispiel 1 beschrieben, wurden DNA-Sequenzen, die neutrale &alpha;-Amylase aus A. niger, einschließlich der Vorregion und Promotor- und Flußaufwärts- Aktivator-Sequenzen, kodieren, aus einem A. niger-Mycel gewonnen und in mit HindIII verdauten pUC8 inseriert, um die Plasmide pNA1 und pNA2 zu ergeben (siehe Fig. 1). In pNA1 ist die von A. niger abgeleitete DNA als ein 8,0 kb HindIII- HindIII-Fragment dargestellt. Die ermittelte DNA-Sequenz der Promotor- und Flußaufwärts-Aktivator-Sequenzen ist in Fig. 2 dargestellt. Der Promotor endet an Nukleotid-1, das dem Met(1)-Codon der Vorsequenz der neutralen &alpha;-Amylase vorangeht. Die Nukleotidsequenz, die die Vorsequenz kodiert, besteht aus 63 Nukleotiden und die reife &alpha;-Amylase beginnt an einer Position, die Nukleotid 64 entspricht. In pNA2 ist die von A. niger abgeleitete DNA als ein 4,0 kb HindIII- HindIII-Fragment dargestellt. Die ermittelte DNA-Sequenz des Promotors und der Flußaufwärts-Aktivator-Sequenzen ist in Fig. 3 dargestellt. Der Promotor endet an Nukleotid-1, das dem Met(1)-Codon der &alpha;-Amlyse-Vorsequenz vorangeht. Die Nukleotidsequenz, die die Vorsequenz kodiert, besteht aus 63 Nukleotiden und die reife neutrale &alpha;-Amylase beginnt an einer Position, die Nukleotid 64 entspricht.
  • Von pNA1 und pNA2 kann die vollständige Promotorsequenz, einschließlich Sequenzen flußaufwärts des Promotors oder funktionelle Teile derselben, mit Mitteln, die den Fachleuten auf diesem Gebiet klar sind, abgeleitet werden. Die Promotorsequenz kann versehen werden mit Linkern mit dem Zweck der Einführung spezifischer Restriktionsstellen, die die Ligation der Promotorsequenz mit weiterer DNA, z.B. den Gen, das das gewünschte Proteinprodukt kodiert, oder verschiedenen Vorregionen (Signalpeptide), erleichtern.
  • Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung haben die NA1-Promotor- und die Flußaufwärts-Aktivator-Sequenzen die folgende Sequenz oder eine funktionell äquivalente Nukleotidsequenz:
  • die die Sequenz von Nukleotid -1456 bis -1 in Fig. 2 repräsentiert.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform haben die NA2-Promotor- und Flußaufwärts-Aktivator-Sequenzen die folgende Sequenz oder eine funktionell äquivalente Nukleotidsequenz:
  • die die Sequenz von Nukleotid -927 bis -1 in Fig. 3 repräsentiert,
  • Wenn man die NA1-Sequenz mit der NA2-Sequenz vergleicht, wird deutlich, daß sie nahezu identische Sequenzen in einem Teil der Flußaufwärts-Aktivator-Region besitzen. Diese Sequenzen erstrecken sich bis zu Nukleotid -725 und weiter von Nukleotid -1129 bis -1099 in Fig. 2 und von Nukleotid -755 bis -725 in Fig. 3.
  • Gemäß einer noch weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung haben die von A. niger XA abgeleiteten Promotor- und Flußaufwärts-Aktivator-Sequenzen die folgende Nukleotidsequenz
  • oder eine funktionell äquivalente Sequenz. Diese Sequenz repräsentiert die Sequenz von Nukleotid -1 bis -1276 in Fig. 5.
  • Der Promotor der säurestabilen &alpha;-Amylase aus A. niger kann abgeleitet werden von Plasmid pAA (Fig. 6 und Beispiel 3). Die Promotor- und Flußaufwärts-Aktivator-Sequenzen sind eingeschlossen in dem SalI-BstEII-Fragment von pAA. Die DNA- Sequenz des Promotors, einschließlich der stromaufwärtigen aktivierenden Sequenzen, zusammen mit den 5'-Teil des Gens der reifen säurestabilen &alpha;-Amylase ist in Fig. 7 a und b dargestellt.
  • Die vorliegende Erfindung wird so angesehen, daß sie die Verwendung der oben angegebenen Sequenzen oder funktionellen Teile oder Fragmente derselben einschließt.
  • Die Terminatoren und Polyadenylierungssequenzen können aus denselben Quellen wie die Promotoren abgeleitet werden. Verstärker-Sequenzen können ebenfalls in die Konstruktion inseriert werden.
  • Das exprimierte Produkt kann innerhalb der Zellen akkumuliert werden, was Aufbrechen der Zellen erforderlich macht, um das Produkt zu isolieren. Um diesen Verfahrens schritt zu vermeiden und auch um die Menge an möglichem Abbau des exprimierten Produktes innerhalb der Zellen zu minimieren, ist es bevorzugt, daß das Produkt aus den Zellen sekretiert wird. Zu diesem Zweck wird das im Gen für das gewünschte Produkt mit einer Vorregion versehen, die effektive Lenkung des exprimierten Produktes in den sekretorischen Weg der Zelle sicherstellt. Diese Vorregion, die ein natürlich auftretendes Signal- oder Leader-Peptid oder funktionelle Teile desselben oder eine synthetische Sequenz, die für Sekretion sorgt, sein kann, wird üblicherweise vom gewünschten Produkt während der Sekretion abgespalten, was das reife Produkt fertig zur Isolation aus der Kulturbrühe zurückläßt.
  • Die Vorregion kann von Genen für sekretierte Proteine aus jeder Organismenquelle abgeleitet werden.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Vorregion von einem Glukoamylase- oder einen Amylase-Gen aus einer Aspergillus-Spezies, einem Amylase-Gen aus einer Bacillus- Spezies, einen Lipase- oder Proteinase-Gen aus Rhizomucor miehei, dem Gen für den &alpha;-Faktor aus S. cerevisiae, dem Kalbs-Prochymosin-Gen oder von dem Gen für das vom transformierten Stamm zu produzierende Proteinprodukt abgeleitet werden. Bevorzugter wird die Vorregion von dem Gen für A. oryzae-TAKA-Amylase, neutrale &alpha;-Amylase aus A. niger, säurestabile &alpha;-Amylase aus A. niger, Vorregion aus XA-Amylase, &alpha;-Amylase aus B. licheniformis, die maltogene Amylase aus Bacillus NCIB 11837, &alpha;-Amylase aus B. stearothermophilus oder B. licheniformis subtilisin abgeleitet.
  • Das TAKA-Amylase-Signal und das A. niger-Neutral-&alpha;-Amylase- Signal haben die folgende Sequenz
  • Das Gen für das gewünschte Produkt, das funktionell mit den Promotor- und Terminatorsequenzen verknüpft ist, kann in einen Vektor eingebaut werden, der den Selektionsmarker enthält, oder kann plaziert werden auf einem separaten Vektor oder einem Plasmid, das in das Genom des Wirtsstammes integriert werden kann. Wie hierin verwendet, schließt der Ausdruck "Vektorsystem" einen einzelnen Vektor oder ein einzelnes Plasmid oder zwei oder mehr Vektoren oder Plasmide ein, die zusammen die gesamte DNA-Information, die in das Wirtsgenom integriert werden soll, enthalten. Vektoren oder Plasmide können lineare oder geschlossene zirkuläre Moleküle sein. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird A. niger mit zwei Vektoren cotransformiert, wobei einer den Selektionsmarker einschließt und der andere die restliche fremde DNA, die in den Wirtsstamm eingeführt werden soll, umfaßt, einschließlich Promotor, dem Gen für das gewünschte Produkt und Transkriptionsterminator- und Polyadenylierungs-Sequenzen.
  • Normalerweise sind die A. niger-Transformanten stabil und können in der Abwesenheit eines Selektionsdrucks kultiviert werden. Wenn die Transformanten sich als instabil erweisen, kann der Selektionsmarker zur Selektion während der Kultivierung verwendet werden. Die transformierten Zellen werden dann unter einem Selektionsdruck, der dem fraglichen Marker entspricht, kultiviert.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Produktion hoher Ausbeuten vieler verschiedener Polypeptid- oder Proteinprodukte in Aspergillus, insbesondere A. niger. A. niger-Stämme sind seit Jahren in kommerziellem Maßstab für die Produktion von z.B. Amyloglukosidase und anderen extracellulären Enzymen verwendet worden und demgemäß ist die Fermentationstechnologie für diese Mikroorganismen gut entwickelt und die Mikroorganismen sind zur Verwendung in der Nahrungsmittelindustrie zugelassen. Die vorliegende Erfindung bietet die Möglichkeit, A. niger in der industriellen Produktion großer Mengen von im Prinzip jedem Polypeptid- oder Proteinprodukt zu verwenden. Beispiele für solche Produkte sind Chymosin oder Prochymosin oder andere Rennine, Proteasen, Amyloglukosidasen, säurestabile Amylasen aus Aspergillus, Pilzlipasen oder prokaryontische Lipasen und thermostabile bakterielle und Pilzamylasen.
  • Die Gene für diese Enzyme wurden erhalten aus cDNA- Bibliotheken oder Genom-Bibliotheken, wie im weiteren Detail im folgenden beschrieben.
  • Die vorliegende Erfindung ist auch gerichtet auf eine neuartige Amylase aus A niger. Die Klonierung des Gens für diese zuvor beschriebene Amylase ist im folgenden Beispiel 2 beschrieben. Aus der DNA-Sequenz für das Gen für die reife Amylase (XA) wurde die folgende Aminosäuresequenz für die neuartige Amylase hergeleitet:
  • Die obige Aminosäuresequenz zeigt 74% Homologie zum TAKA- Amylase-Enzym.
  • Die vorliegende Erfindung wird so angesehen, daß sie ein Amylase-Enzyin mit der obigen Aminosäuresequenz oder einer damit nahe verwandten Sequenz einschließt, solange die Variationen in der Aminosäuresequenz keine wesentliche Auswirkung auf die Enzymcharakteristika der neuartigen Amylase haben. Die neuartige Amylase kann in einer zu den bekannten Amylasen analogen Weise verwendet werden, z.B. Stärkeabbau.
    • Beispiel 1 Klonierung der Gene der neutralen &alpha;-Amylase aus A. niger
  • Mycel von A. niger DSM 2761 wurde geerntet und zur Herstellung von DNA gemäß dem von Boel et al., EMBO Journal 3, 1581-85 (1984), beschriebenen Verfahren verarbeitet. Die chromosomale DNA wurde mit BamHI, EcoRI, SalI und HindIII geschnitten und mit Southern-Blotting analysiert, im wesentlichen gemäß Southern, J.Mol.Biol. 98, 503-18 (1975). Ein partieller cDNA-Klon für TAKA-Amylase wurde als Hybridisierungssonde verwendet, die die ersten 300 Aminosäuren des Strukturgens abdeckt. Der TAKA-Amylase-cDNA- Klon wurde hergestellt, wie beschrieben in der veröffentlichten EP-Patentanmeldung Nr. 0 238 023. Die Wahl der Sonde beruht auf der Ahnlichkeit zwischen TAKA-Amylase aus A. oryzae und der neutralen &alpha;-Amylase aus A. niger (Minoda et al., Agr.Biol.Chem. 33 (4), 572-78 (1969)). Die Southern-Analyse zeigt, daß A. niger 2 Gene für neutrale &alpha;- Amylase besitzt. Zur Klonierung wählten wir HindIII- Verdauung, wo die 2 Gene repräsentiert sind durch Fragmente von etwa 8,0 kb bzw. 4,0 kb, die in mit HindIII verdauten, dephosphorylierten pUC8 inseriert wurden (Vieira et al., Gene 19, 259-68 (1982)). Aus 5.000 Klonen jeder Art fanden wir 1 HindIII-Klon mit 8,0 kb und 4 HindIII-Klone mit 4,0 kb, die mit TAKA-Amylase-cDNA hybridisierten. Restriktionskarten der Plasmide pNA1 und pNA2, die die zwei Amylase-Gene tragen, sind in Fig. 1 dargestellt. Beide Plasmide enthalten Vollängen-Amylase-Gene mit Promotoren und Flußaufwärts-Aktivator-Sequenzen.
    • Beispiel 2 Klonierung des Gens. das für eine bisher nicht beschriebene Amylase in A. niger kodiert
  • Auf dem Southern-Blot, der in Beispiel 1 beschrieben ist, hybridisierten die Gene der neutralen &alpha;-Amylase stark an die TAKA-Amylase-cDNA-Sonde. Auf demselben Blot konnte man sehen, daß die cDNA-Sonde schwach an andere Gene hybridisierte, was auf eine strukturelle Verwandtschaft zur Amylase hindeuten würde. So klonierten wir auf der Basis schwacher Hybridisierung aus A. niger DSM 2761 ein 1,8 kb BamHI-Fragment in mit BamHI verdauten, dephosphorylierten pUC8, und aus SalI-Verdauung klonierten wir Fragmente mit 3,0-3,5 kb in mit SalI verdauten, dephosphorylierten pUC19 (Messing, Meth. in Enzymology 101, 20-27 (1983)). Es gab zwei Arten von SalI-Klonen, von denen sich herausstellte, daß sie jeweils etwa die Hälfte des Strukturgens abdeckten. Die Klone, die den N-Terminus abdeckten, haben etwa 2,0 kb flußaufwärts der Signalsequenz. Es wurde festgestellt, daß die BamHI-Klone Teile beider Arten von SalI-Klonen mit der verbindenden SalI-Stelle nahezu in der Mitte abdecken. Fig. 4 zeigt die drei Plasmide, pBamM, pSalU und pSalD und das konstruierte Plasmid pXA mit dem vollständigen Gen, einschließlich Promotor- und Flußaufwärts-Aktivator- Sequenzen. Analyse der Aminosäuresequenz zeigt 74% Homologie zur TAKA-Amylase, was keinen Zweifel daran lassen sollte, daß das klonierte Gen in der Tat für eine Amylase kodiert. Die Bezeichnung dafür wird XA sein.
  • Die DNA-Sequenz der Promotor- und Flußaufwärts-Aktivator- Sequenzen der XA-Amylase, der Vorregion und des 5'-Teils des Strukturgens ist in Fig. 5 dargestellt.
    • Beispiel 3 Klonierung des Gens der sauren &alpha;-Amylase aus A. niger
  • Der in Beispiel 1 beschriebene Southern-Blot wurde an eine Oligonukleotid-Sonde
  • hybridisiert, die die N-terminalen Aminosäuren 3-7 in der säurestabilen &alpha;-Amylase abdeckt. Eines der Hybridisierungsfragmente war ein SalI-Fragment mit etwa 3,0 kb, das in mit SalI verdauten, dephosphorylierten pUC19 kloniert wurde. Aus 20.000 Klonen wurden 10 gefunden, die an NOR-525+527 hybridisierten. Sie hatten alle dasselbe 3,0 kb SalI-Insert, wie in Fig. 6 dargestellt. Sequenzanalyse zeigt, daß etwa die Hälfte des Strukturgens für die säurestabile &alpha;-Amylase vorhanden ist, während Promotor- und Flußaufwärts-Sequenzen etwa 2,0 kb abdecken.
    • Beispiel 4 Expression von neutraler &alpha;-Amvlase aus A. niger in A. oryzae
  • A. oryzae wurde als Wirt verwendet, um das Potential der Promotoren der neutralen &alpha;-Amylase aus A. niger zu analysieren, da das Genprodukt in A. oryzae stabiler ist als in A. niger. Außerdem wird angenommen, daß die Promotoren wenigstens genauso gut in ihrem inhärenten Wirt A. niger wie in A. oryzae funktionieren.
  • A. oryzae IFO 4177 wurde transformiert mit pNA1 bzw. pNA2, unter Verwendung von Selektion auf Acetamid, durch Co- Transformation mit p3SR2, der das amdS-Gen aus A. nidulans enthält (Tilbum, J.G. et al., Gene 26, 205-221 (1913)). Transformation wurde durchgeführt wie in der veröffentlichten EP-Patentanmeldung Nr. 0 238 023 beschrieben.
  • Die zwei Arten von Transformanten wurden bei 30ºC in YPD- Medium gezüchtet (Sherman et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1981)). Nach 3-6 Tagen Wachstum wurden die Kulturüberstände analysiert mit SDS- PAGE, gefolgt von Coomassie-Anfärbung oder ELISA auf Western-Blot. Das Expressionsniveau neutraler &alpha;-Amylase aus beiden Arten von Transformanten war bis zu 10mal höher als im nicht-transformierten IFO 4177, der seine eigene neutrale &alpha;-Amylase enthält, genannt TAKA-Amylase. In den Transformanten war die Amylaseausbeute etwa 1 g/l Überstand, was die Effizienz des Promotors und der Flußaufwärts- Aktivator-Sequenzen aus diesen zwei Genen beweist.
    • Beispiel 5 Expressionsvektoren, die Promotor- und Flußaufwärts- Aktivator-Sequenzen aus A. niger-Amylase-Genen enthalten, gefolgt von der Präpro-Sequenz von Rhizomucor miehei- Aspartat-Protease
  • Aspartat-Protease aus Rhizomucor miehei (im folgenden RMP genannt) wird ausgewählt, um die Produktion und Sekretion eines heterologen Proteins in A. niger und A. oryzae unter Verwendung von Flußaufwärts-Sequenzen aus A. niger-Amylase- Genen zur Beschleunigung der Synthese nachzuweisen.
  • Die drei Konstruktionen, die unten dargestellt werden sollen, haben einige gemeinsame Merkmale. Eines ist die Verwendung von pRMP-AMG-Term, dem Plasmid, welches das RMP- Gen liefert. Dieses Plasmid ist im Detail in der veröffentlichten EP-Patentanmeldung Nr. 0 238 023 beschrieben. Es hat eine BamHI-Stelle 9 bp flußaufwärts des ATG, das die Vorregion einleitet, und in Anschluß an das Strukturgen von RMP hat es eine Terminatorsequenz aus dem A. niger-Glucoamylase-Gen. Ein anderes Merkmal ist die Verwendung von Exonuklease III -> S1-Nuklease -> Klenow- Fragment, gemäß Henikoff, S. Gene 28, 351-59 (1984), um von einer Stelle flußaufwärts des einleitenden ATG in den Amylase-Genen zurück (100 - 200 bp) zu schneiden, um ein stumpfes Ende unmittelbar stromaufwärts des ATG zu erhalten und somit in der Lage zu sein, eine BamHI-Stelle (aus pUC19) aufzunehmen, um sich mit der BamHI-Stelle in pRMP AMG Term zu verbinden.
  • Fig. 8 veranschaulicht die Konstruktion des RMP-Gens unter der Kontrolle des Promotors und der Flußaufwärts-Aktivator- Sequenzen aus dem Gen der neutralen &alpha;-Amylase in pNA2 (Fig. 1). Ungefähr 145 bp werden von der SalI-Stelle zurück geschnitten, wie durch späteres Sequenzieren verifiziert, um ein EcoRI-Stumpfenden-Fragment von etwa 610 bp zu liefern. Dieses Fragment wird in pUC19 inseriert, geschnitten mit SmaI und EcoRI, und als ein 620 bp EcoRI-BamHI-Fragment wieder herausgeschnitten. Dieses Fragment wird ligiert an ein 310 bp EcoRI-HindIII-Fragment aus flußaufwärts pNA2 und pUC19, geschnitten mit BamHI und HindIII, um pPNA2 zu liefern. Aus diesem Plasmid werden ein BamHI-NarI-Fragment von 3,4 kb und ein NarI-EcoRI-Fragment von 170 bp an ein BamHI-EcoRI 2,0 kb aus pRMP AMG Term ligiert, um den Expressionsvektor pPNA2-RMP zu ergeben.
  • Fig. 9 zeigt die Konstruktion des RMP-Gens unter der Kontrolle des Promotors und der Flußaufwärts-Aktivator- Sequenzen aus dem Gen der sauren Amylase in pAA', wo das Gen in pUC19 in der umgekehrten Orientierung von pAA (Fig. 6) inseriert ist. Etwa 170 bp werden von der BstEII-Stelle zurück geschnitten, um ein Fragment von 1,9 kb zu liefern, wenn mit SacI geschnitten. Dieses SacI-Stumpfenden-Fragment wird in pUC19 inseriert, geschnitten mit SmaI und SacI, und als zwei Fragmente BamHI-NcoI 1,4 kb und NcoI-SacI 0,5 kb wieder herausgeschnitten. Diese Fragmente werden an Fragment BamHI-EcoRI 2,0 kb aus pRMP AMG Term und zwei Fragmente aus pUC19, SacI-NarI 2,5 kb und NarI-EcoRI 170 bp, ligiert, um das Expressionsplasmid pPAA-RMP zu ergeben.
  • Fig. 10 gibt die Konstruktion des RMP-Gens unter der Kontrolle des Promotors und der Flußaufwärts-Aktivator Sequenzen aus dem neuen Amylase-Gen in pSalU (Fig. 4) an. Etwa 210 bp werden von der BgIII-Stelle abgeschnitten, um ein Fragment von 1,3 kb zu liefern, wenn geschnitten mit EcoRI. Dieses Fragment wird in pUC19 EcoRI-SmaI 2,7 kb inseriert, um die BamHI-Stelle nahe dem stumpfen Ende aufzunehmen. Die abschließende Ligation von 2,0 kb EcoRI- BamHI aus pRMP AMG Term, 1,3 kb EcoRI-BamHI aus pPXA und pUC19 2,7 kb EcoRI dephosphoryliertem Fragment liefert zwei korrekte Expressionsplasmide pPXA-RMP und pPXA-RMP' mit dem Gen in der jeweiligen Orientierung. Die unrichtigen Plasmide mit 2 EcoRI-BamHI-Fragmenten derselben Art werden leicht durch Restriktionsanalyse unterschieden.
  • Die Expressionsplasmide werden in A. niger (Kelly, J.M. und Hynes, M.J., EMBO Journal 4, 475-479 (1985) und Buxton, F.P., et al., Gene 37, 207-214 (1985)) unter Verwendung von argB als Selektionsmarker und in A. oryzae, wie oben angegeben, transformiert. In YPD gezüchtete Transformanten werden auf SDS-PAGE wie oben analysiert und die Aktivität der Protease RMP wird gemessen.

Claims (15)

1. Promotor- und Flußaufwärts-Aktivator-Sequenzen, abgeleitet von einem Aspergillus niger-&alpha;-Amylase-Gen und mit der folgenden Sequenz
oder funktionelle Fragmente derselben, oder mit der folgenden Sequenz
oder funktionelle Fragmente derselben, oder mit der folgenden Sequenz
oder funktionelle Fragmente derselben.
2. Promotor- und Flußwärts-Aktivator-Sequenzen, abgeleitet von einer A. niger-Amylase und mit der Sequenz von Nukleotid 1 bis Nukleotid 1651 in Fig. 7a und b oder ein funktionelles Fragment derselben.
3. Verfahren zur Expression eines Proteinproduktes in Aspergillus, welches die Schritte umfaßt:
(a) Bereitstellen eines rekombinanten DNA- Klonierungsvektorsystems, das zur Integration in das Genom eines Aspergillus-Wirts in einer oder mehreren Kopien in der Lage ist und welches: DNA-Sequenzen, die einen Aspergillus niger-Amylase-Promotor und -Flußaufwärts-Aktivator-Sequenzen gemäß Anspruch 1 oder 2 kodieren; einen geeigneten Marker zur Selektion von Transformanten; und eine DNA-Sequenz, die das gewünschte Protein im Produkt kodiert, umfaßt;
(b) Transformieren des Aspergillus-Wirtes, der kein funktionelles Gen für den ausgewählten Selektionsmarker enthält, mit dem rekombinanten DNA-Klonierungsvektorsystem aus Schritt a;
(c) Kultivieren des transformierten Aspergillus-Wirts in einem geeigneten Kulturmedium.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Wirt ein Aspergillus niger-Stamm ist.
5. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Selektionsmarker abgeleitet ist von dem Gen für A. nidulans- oder A. niger- argB, A. nidulans-trpC, A. nidulans-amdS, Neurospora crassae-Pyr4 oder DHFR.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Selektionsmarker das argB-Gen, abgeleitet von A. nidulans oder A. niger, oder das amdS-Gen, abgeleitet von A. nidulans, ist.
7. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Vektorsysten außerdem eine Vorregion umfaßt, die für Sekretion des exprimierten Produktes in das Kulturmedium sorgt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Vorregion abgeleitet ist von einem Glucoamylase- oder einem Amylase-Gen aus einer Aspergillus-Spezies, einem Amylase-Gen aus einer Bacillus- Spezies, einem Lipase- oder Proteinase-Gen aus Rhizomucor miehei, dem Gen für den &alpha;-Faktor aus S. cerevisiae, dem Kalbs-Prochynosin-Gen oder dem Gen für das gewünschte Produkt.
9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Vorregion abgeleitet ist von dem Gen für A. oryzae-TAKA-Amylase, neutrale &alpha;- Amylase aus A. niger, säurestabile &alpha;-Amylase aus A. niger, B. licheniformis-&alpha;-Amylase, die Vorregion aus der A. niger- XA-Amylase, wie beschrieben in Beispiel 2 der Beschreibung, die maltogene Amylase aus Bacillus NCIB 11837, B. stearothermophilus-&alpha;-Amylase oder B. licheniformis subtilisin.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Vorregion die TAKA- Amylase-Vorregion oder die Vorregion der neutralen &alpha;-Amylase aus A. niger ist mit der folgenden Sequenz:
11. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Vorregion die Vorregion der säurestabilen &alpha;-Amylase aus A. niger ist mit der folgenden Sequenz:
12. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Vorregion die XA- niger-Amylase-Vorregion ist mit der Sequenz:
13. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Vektorsystem zwei Vektoren umfaßt, wobei einer den Selektionsmarker enthält und der andere DNA-Sequenzen enthält, die Funktionen kodieren, die Genexpression erleichtert, und eine DNA- Sequenz, die das gewünschte Proteinprodukt kodiert.
14. Verfahren zur Herstellung eines Proteinproduktes in Aspergillus, wobei ein Aspergillus-Stamm, der mit einem rekombinanten DNA-Klonierungsvektorsystem, wie in Anspruch 3 beschrieben, transformiert worden ist, in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert wird und das Produkt aus den Kulturmedium gewonnen wird.
15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei der Aspergillus-Stamm ein Aspergillus niger-Stamm ist.
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