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Die
Erfindung betrifft die Verwendung einer DNA-Sequenz, die eine 2A-Spaltstelle
oder eine davon abgeleitete Sequenz codiert, zur Herstellung eines
Expressionssystems zur Expression und Sekretion von Polypeptiden
in filamentösen
Pilzen. Insbesondere betrifft die Erfindung Vektorkonstrukte, die
eine Sequenz, die eine selbstprozessierende 2A-Spaltstelle oder
eine davon abgeleitete Sequenz codiert, umfassen, sowie die Verwendung
dieser Vektorkonstrukte zur Transformation von Wirtszellen und zur
Produktion von Polypeptiden in filamentösen Pilzen.
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Zur
industriellen Produktion von Enzymen aber auch von anderen Proteinen
werden Stämme
mit hohen Sekretionsleistungen benötigt. Die Sekretionshöhe korreliert
dabei meist direkt mit der Kopienzahl des zu exprimierenden Gens.
Um die Sekretionsleistung von derartigen Stämmen zu erhöhen, wurden Verfahren entwickelt,
die die Gene unter die Kontrolle starker Promotoren stellen (zum
Beispiel TAKA-α-Amylase-Promotor aus
A. oryzae oder A. niger, A. niger-Glucoamylase-Promotor, vgl.
EP 0 489 719 ) oder Loci gut sekretierter Proteine
wurden verwendet (vgl.
EP 0 357
127 ). Ferner wurden Fusionsproteine konstruiert, bei denen
zur Trennung der zwei oder mehreren Proteine proteolytisch spaltbare
Stellen, wie zum Beispiel KexII, verwendet wurden (vgl. zum Beispiel
WO 1990/015860 ).
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Filamentöse Pilze
werden häufig
zur Herstellung von Enzymen aber auch von anderen Proteinen verwendet.
Zur Erhöhung
der Sekretionsleistung dieser Pilze wurden bereits starke Promotoren
oder Loci gut sekretierter Proteine verwendet. Die Nutzung selbstprozessierender
Stellen wurde für
filamentöse
Pilze nicht be schrieben. Im Gegensatz dazu ist die Nutzung von proteolytisch
spaltbaren Stellen auf die Nutzung von sekretierten Proteinen als
Fusionspartner beschränkt.
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Generell
ist es schwierig, die Expressions- und Sekretionsleistung filamentöser Pilze
zu erhöhen.
Besondere Schwierigkeiten ergeben sich hierbei durch folgende Eigenschaften
filamentöser
Pilze. Die Expressionshöhe
von Proteinen ist bei filamentösen
Pilzen über
weite Bereiche proportional zur Anzahl der Genkopien für das zu
exprimierende Protein. Bei den bisherigen Verfahren, z.B. mit einer
proteolytischen Schnittstelle wie KexII, muß sich das gesamte Protein,
bestehend aus n Kopien, falten und wird erst nach der Faltung proteolytisch
in n Einzelproteine gespalten. Hierbei gibt es mehrere Probleme.
Zum einen lässt
sich das Gesamtprotein nicht immer falten, zum anderen ist die proteolytische
Schnittstelle nicht immer für
die Protease erreichbar, so dass es nicht zu der Spaltung in n Einzelenzyme
kommt. Weiterhin ist auch die Anzahl der Loci mit guten Ableseeigenschaften
in einem Stamm begrenzt, so dass eine random Integration von weiteren
Genkopien nicht effizient ist. Heterologe Proteine, insbesondere
prokaryontische Proteine, werden in filamentösen Pilzen häufig nur
in geringen Mengen sezerniert. Zu der Eignung von viralen Proteinen
bzgl. der Sezernierung in filamentösen Pilzen liegen keine Angaben
zu industriell genutzten Pilzen vor. In der Literatur zitierte Beispiele
zur Nutzung von selbstprozessierenden Spaltstellen zeigten deren
Nutzung meist nur in „in-vitro" Systemen, wobei der
Nachweis der Produkte mittels hochsensitiver Methoden erfolgte.
Auch eine Fehllenkung des C-terminal an die selbstprozessierende
Spaltstelle angehängten
Proteins mit einer Signalsequenz wird berichtet. Auch ist die berichtete
funktionelle Wahrscheinlichkeit, dass die Spaltung an der selbstprozessierenden
Spaltstelle auftritt (76–88%)
für einen
industriellen Prozess zu gering. Eine erfolgreiche Nutzung zur Produktion
großer
Proteinmengen in industriellen Pilzen war daher nicht absehbar.
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Bei
der Nutzung der KexII oder ähnlicher
proteolytischer Spaltstellen (KexB aus Aspergillus niger) kommt
es immer auch zur Sekretion des Volllängen-Fusionsproteins (Spencer et
al., Eur J Biochem 1998, 258, 107–112). Dieses hat
dann nicht unbedingt die gewünschte
Aktivität,
oder ist sogar inaktiv. Zur Spal tung der KexII Stelle muss der Stamm
eine Protease besitzen, die diese Stelle spalten kann (Jalving
et al., Appl. Environ. Microbiol. 2000, 66 (1), 363–368).
Eine solche ist nicht bei allen filamentösen Pilzen vorhanden. Weiterhin spalten
die KexII oder ähnliche
Proteasen das Protein nicht immer an der korrekten Stelle, so dass
auch intramolekulare Spaltungen auftreten können. Diese Spaltungen führen auch
zu inaktiven Proteinen. Die 2A-Konstruktion kommt ohne Proteasen
aus und ermöglicht
so die Nutzung von proteasearmen Wirtsstämmen für die Expression und Sekretion
wodurch die Stabilität
des gewünschten
Zielproteins verbessert wird.
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Es
besteht somit ein Bedarf nach Verfahren, mit denen die Expression-
und Sekretionsleistung filamentöser
Pilze effizient erhöht
werden kann.
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Der
vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, Systeme
und Verfahren bereitzustellen, mit denen die Expressions- und Sekretionsleistung
filamentöser
Pilze, bezogen auf homologe und heterologe Proteine, erhöht werden
kann. Ferner soll erfindungsgemäß die Expression
und Sekretion homologer und heterologer Proteine durch filamentöse Pilze
in hoher Ausbeute und hoher Reinheit bereitgestellt werden. Ferner soll
die für
eine hohe Expression in filamentösen
Pilzen notwendige Genkopienzahl durch wenige Schritte einfach und
kostengünstig
in den Wirtsorganismus zu etablieren sein. Das erfindungsgemäße Verfahren
bzw. die erfindungsgemäßen Systeme
sollen universell in filamentösen
Pilzen verwendbar sein und sollen sich leicht der jeweiligen Problemstellung
bezüglich
Art, Umfang und Verhältnis
der Proteinproduktion anpassen lassen. Ferner sollen sich die erfindungsgemäßen Verfahren
und Systeme auch zur effizienten Transformation von proteasearmen
Wirtsstämmen
eignen.
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Überraschenderweise
wurde nun gefunden, dass durch die Verwendung einer Sequenz, die
eine 2A-Spaltstelle oder eine davon abgeleitete Sequenz codiert,
gegebenenfalls zusammen mit einer eine proteolytische Spaltstelle
codierenden Sequenz, Vektorkonstrukte bzw. Expressionssysteme erhalten
werden können,
die sich vorteilhaft zur Expression und Sekretion homologer und
heterologer Poly peptide in filamentösen Pilzen eignen. Überraschenderweise
wurde bei der Anwendung der 2A-Spaltstelle in filamentösen Pilzen
gefunden, dass nur das C- und das N-terminale Protein zur 2A-Stelle
sekretiert werden, sofern beide zugehörigen Gene eine Signalsequenz
tragen, jedoch kein Polypeptid, das dem Volllängen-Fusionsprotein entspricht.
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Die
Erfindung betrifft somit Vektorkonstrukte zur Expression und Sekretion
von Polypeptiden in filamentösen
Pilzen, umfassend in 5'3'-Richtung in funktioneller
Verknüpfung
- – gegebenenfalls
einen Promotor, dem ein Enhancer vorangestellt sein kann,
- – mindestens
eine ein erstes Polypeptid codierende DNA-Sequenz, die eine Signalsequenz
enthalten kann oder nicht,
- – gegebenenfalls
eine DNA-Sequenz, die eine 2A-Spaltstelle oder eine davon abgeleitete
Sequenz codiert, gegebenenfalls zusammen mit einer vorangestellten
eine proteolytische Spaltstelle codierenden DNA-Sequenz oder gegebenenfalls
eine DNA-Sequenz, die eine proteolytische Spaltstelle codiert,
- – eine
ein zweites Polypeptid mit Signalsequenz codierende DNA-Sequenz,
- – gegebenenfalls
eine weitere DNA-Sequenz, die eine 2A-Spaltstelle oder eine davon
abgeleitete Sequenz codiert, gegebenenfalls zusammen mit einer vorangestellten
eine proteolytische Spaltstelle codierenden DNA-Sequenz oder gegebenenfalls
eine DNA-Sequenz, die eine proteolytische Spaltstelle codiert,
- – gegebenenfalls
eine ein drittes Polypeptid mit Signalsequenz codierende DNA-Sequenz,
- – gegebenenfalls
eine weitere DNA-Sequenz, die eine 2A-Spaltstelle oder eine davon
abgeleitete Sequenz codiert, gegebenenfalls zusammen mit einer vorangestellten
eine proteolytische Spaltstelle codierenden DNA-Sequenz oder gegebenenfalls
eine DNA-Sequenz, die eine proteolytische Spaltstelle codiert,
- – gegebenenfalls
eine ein viertes Polypeptid mit Signalsequenz codierende DNA-Sequenz,
- – einen
Terminator,
wobei in dem Konstrukt mindestens eine 2A-Spaltstelle
oder eine davon abgeleitete Sequenz vorhanden ist.
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Ferner
betrifft die Erfindung mit diesen Vektorkonstrukten transformierte
Wirtszellen, damit produzierte rekombinante Polypeptide sowie ein
Verfahren zur Produktion eines oder mehrerer Polypeptide in einem
filamentösen
Pilz, umfassend die Stufen i) Transformation einer Wirtszelle mit
einem entsprechenden vorstehend genannten Vektorkonstrukt, ii) Kultivieren
der transformierten Wirtszelle von i) und der für die Expression und Sekretion
des bzw. der Polypeptids/Polypeptide geeigneten Bedingungen, iii)
Isolieren des/der so exprimierten Polypeptids/Polypeptide.
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Die
Erfindung betrifft ferner die Verwendung einer DNA-Sequenz, die
eine 2A-Spaltstelle
oder eine davon abgeleitete Sequenz codiert, gegebenenfalls zusammen
mit einer vorangestellten, eine proteolytische Spaltstelle codierenden
DNA-Sequenz, zur
Herstellung eines Expressionssystems zur Expression und Sekretion
von Polypeptiden in filamentösen
Pilzen.
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Bevorzugt
umfasst die DNA-Sequenz, die eine 2A-Spaltstelle codiert, die Sequenz
der 2A-Spaltstelle des Maul- und Klauenseuchevirus (FMDV) mit einem
abschließenden
Prolin am 3'-Ende.
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Mit
den erfindungsgemäßen Vektorkonstrukten
bzw. dem erfindungsgemäßen Verfahren
können
sowohl homologe als auch heterologe sowie gemischthomologe und -heterologe
Polypeptide zur Expression und Sekretion gebracht werden.
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Mit
den erfindungsgemäßen Vektorkonstrukten
bzw. dem erfindungsgemäßen Verfahren
kann die für eine
Expression notwendige Kopienzahl des bzw. der Gens/Gene durch wenige
Schritte in den Wirtsorganismus etabliert werden. Ferner können erfindungsgemäß auch Produktionsstämme erzeugt
werden, die verschiedene Enzyme in definierten Verhältnissen
zueinander produzieren. Dies lässt
sich bereits in einem einzigen Transformationsschritt erzielen.
Ferner können auch
die Eigenschaften von Loci nicht-sekretierter Proteine genutzt werden,
um eine gesteuerte Expression des gewünschten Zielproteins zu erreichen.
Ein weiterer Vorteil der Erfindung besteht darin, dass das in dem
Wirt natürlich
vorkommende Gen durch die erfindungsgemäße Expressionskassette nicht
ausgeschaltet werden muss und dass auch die Nutzung von proteasearmen Wirten
möglich
ist.
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Selbstprozessierende
Spaltstellen, wie die 2A-Spaltstellen, oder damit verwandte Sequenzen
sind in der Literatur bekannt, zum Beispiel in
Michelle
L. L. Donnely et al., „Analysis
of the aphthovirus 2A/2B polyprotein ,cleavage' mechanism indicates not a proteolytic
reaction, but a novel translational effect: a putative ribosomal
,skip'", Journal of General
Virology (2001), 82, 1013–1025.
Aus dieser Druckschrift ist bekannt, dass die 2A-Region des Maul-
und Klauenseuchevirus sehr kurz ist und etwa 19 Aminosäurereste
umfasst. Sie stellt ein autonomes Element dar, dass die „Spaltung" an ihrem eigenen
C-terminalen Ende katalysiert. Verfahren zur Verwendung der 2A-Spaltstelle
in eukaryontischen Expressionssystemen sind ebenfalls in der Literatur
bekannt, zum Beispiel aus
Pablo de Felipe et al. „Targeting
of Proteins Derived from Self-Processing Polyproteins Containing
Multiple Signal Sequences",
Traffic 2004; 5: 616–626.
Ferner beschreibt die
WO 2005/017149 Zusammensetzungen
und Verfahren zur erhöhten
Expression von rekombinanten Polypeptiden aus einem einzelnen Vektor
unter Verwendung einer Peptidspaltstelle.
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Im
Stand der Technik ist jedoch kein Hinweis dahingehend enthalten,
dass die 2A-Spaltstelle
oder eine davon abgeleitete Sequenz in filamentösen Pilzen funktionell ist.
Ferner ist im Stand der Technik nicht beschrieben, dass die so zur
Expression gebrachten Zielpolypeptide im industriell nutzbaren Maßstab sezerniert werden
sowie dass unter Verwendung der 2A-Spaltstelle oder einer davon
abgeleiteten Sequenz konstruierte Expressionssysteme auch zur Expression
normalerweise nicht-sekretierter Polypeptide verwendet werden können.
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Im
Gegensatz zu dem im Stand der Technik beschrieben Verhalten von
eukaryontischen Zellen, kommt es unter Verwendung der 2A-Spaltstelle
bei der Expression und Sekretion in filamentösen Pilzen nicht zur Sekretion
des Volllängen-Fusionsproteins bestehend
aus dem ersten Polypeptid, der Aminosäuresequenz der 2A-Stelle, und
dem zweiten Polypeptid. Es treten nur das erste und das zweite Polypeptid
(und dritte Polypeptid bei Verwendung von zwei selbstprozessierenden
Spaltstellen) mit korrektem N-terminalen Ende des reifen Proteins
in der Kulturflüssigkeit
außerhalb
der filamentösen
Pilzzelle auf. Somit liegen die gewünschten Proteine als selbstständige Einheiten
vor und können
nach Isolierung und Reinigung aus der Kulturflüssigkeit direkt einer gewünschten
Verwendung oder Anwendung zugeführt
werden.
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Es
war somit nicht naheliegend, eine 2A-Spaltstelle oder eine davon
abgeleitete Sequenz in einem Vektorkonstrukt zur Expression und
Sekretion homologer oder heterologer Polypeptide in filamentösen Pilzen mit
den oben genannten Merkmalen zu verwenden. Mit den erfindungsgemäßen Vektorkonstrukten
bzw. Expressionssystemen können
Proteine oder Polypeptide in filamentösen Pilzen exprimiert und sekretiert
werden, wobei die codierenden Sequenzen für zwei oder mehrere Proteine
oder Polypeptide unter der Transkriptionskontrolle des gleichen
Promotors von einem einzelnen Vektor in definierten Verhältnissen,
zum Beispiel in gleichen Verhältnissen
zueinander, exprimiert werden, wobei die Spaltung der Proteine oder
Polypeptide durch die selbstprozessierende Spaltstelle vermittelt
wird.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
betrifft die Erfindung Vektorkonstrukte zur Expression und Sekretion
von zwei oder mehreren rekombinanten Proteinen oder Polypeptiden
in filamentösen
Pilzen, die die gleichen codierenden Sequenzen oder offene Leseraster
(ORFs) besitzen. Gemäß einer
weiteren bevorzugten Ausführungsform
werden verschiedene Polypeptide von einem Vektor exprimiert, wobei
der Vektor verschiedene offene Leseraster enthält. In einem beispielhaften
Konstrukt werden zwei codierende Sequenzen exprimiert, wobei der
Vektor in 5'3'-Richtung umfasst:
einen Promotor und gegebenenfalls einen Enhancer in funktioneller
Verknüpfung
an die Signalsequenz der ersten codieren den Sequenz für einen
ersten Protein- oder Polypeptid-ORF, eine Sequenz, die die selbstprozessierende
2A-Spaltstelle codiert, gegebenenfalls in Kombination mit einer
vorangestellten proteolytischen Spaltstelle, gefolgt von der codierenden
Sequenz des Signalpeptids des zweiten Proteins oder Polypeptids
und der codierenden Sequenz für
einen zweiten Protein- oder Polypeptid-ORF gefolgt von einem Terminator,
wobei die Sequenz, die die selbstprozessierende 2A-Spaltstelle codiert,
zwischen der codierenden Sequenz des ersten Proteins oder Polypeptids
und der codierenden Sequenz des Signalpeptids des zweiten Proteins
oder Polypeptids inseriert ist.
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Gemäß einer
weiteren bevorzugten Ausführungsform
betrifft die Erfindung ein Vektorkonstrukt zur Expression und Sekretion
von ein oder mehreren rekombinanten Proteinen oder Polypeptiden,
wobei das erste Protein oder Polypeptid ein intrazelluläres Protein
ist – und
damit kein Signalpeptid besitzt – und das zweite (und alle
folgenden) Protein bzw. Proteine oder Polypeptid bzw. Polypeptide
sezernierte Proteine sind, die jeweils ihr eigenes homologes oder
heterologes Signalpeptid mitbringen. In einem beispielhaften Konstrukt,
bei dem zwei codierende Sequenzen exprimiert werden, umfasst der
Vektor in der 5'3'-Richtung: einen
Promotor und gegebenenfalls einen Enhancer in funktioneller Verknüpfung an
die erste codierende Sequenz eines ersten Protein- oder Polypeptid-ORFs
(intrazelluläres
Protein), eine Sequenz, die eine selbstprozessierende 2A-Spaltstelle
codiert, die codierende Sequenz des Signalpeptids für das zweite
Protein oder Polypeptid und die codierende Sequenz für einen
zweiten Protein- oder Polypeptid-ORF gefolgt von einem Terminator,
wobei die Sequenz, die eine selbstprozessierende 2A-Spaltstelle codiert,
zwischen der codierenden Sequenz des ersten Proteins oder Polypeptids
und der codierenden Sequenz des Signalpeptids des zweiten Proteins
oder Polypeptids inseriert ist und weiter an gleichwertigen Stellen
bei Konstruktionen mit weiteren zu sekretierenden Polypeptiden inseriert
ist, wobei die selbstprozessierende 2A-Spaltstelle gegebenenfalls
mit einer vorangestellten proteolytischen Spaltstelle kombiniert
ist.
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Erfindungsgemäß wird eine
selbstprozessierende 2A-Spaltstelle oder eine davon abgeleitete
Sequenz verwendet. Beispiele hierfür sind virale 2A-Sequenzen,
die von Picornaviren, wie zum Beispiel Entero-, Rhino-, Cardio-,
Aphtho- oder Maul- und
Klauenseucheviren abgeleitet sein können.
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Die
selbstprozessierende Spaltstelle, d.h. die 2A-Spaltstelle, ist das
Expressionsprodukt einer DNA-Sequenz die eine selbstprozessierende
Spaltstelle kodiert und die im Zuge der Translation eine intramolekulare „(cis)
Spaltung" des Proteins
oder Polypeptids, das die Spaltstelle beinhaltet, ermöglicht,
so dass zwei definierte eigenständige
Proteine oder Polypeptide erhalten werden.
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Besonders
bevorzugt ist die in dem erfindungsgemäßen Vektorkonstrukt verwendete
selbstprozessierende 2A-Spaltstelle die für die selbstprozessierende
2A-Spaltstelle codierende
Sequenz aus dem Maul- und Klauenseuchevirus (FMDV). FMDV2A ist eine
Polyproteinregion, die typischerweise 18 Aminosäuren lang ist und zusätzlich ein
Prolin am C-terminalen Ende enthält
und beispielsweise die Sequenz LLNFDLLKLAGDVESNPGP oder die Sequenz
TLNFDLLKLAGDVESNPGP besitzt. Jedoch können auch Oligopeptide von
einer Länge
von einschließlich
Prolin von nur 14 Aminosäureresten,
wie zum Beispiel LLKLAGDVESNPGP verwendet werden, da diese ebenfalls
die Funktion besitzen, die selbstprozessierende Spaltung am 2A-C-Terminus
zu vermitteln.
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Die
Erfindung umfasst bevorzugt auch eine von der selbstprozessierenden
2A-Spaltstelle abgeleitete Sequenz.
Dabei können
beliebige Varianten der Sequenz verwendet werden, solange sie die
selbstprozessierenden Eigenschaften der 2A-Spaltstelle besitzen. Beispielhafte
Varianten sind in der oben genannten Literaturstelle Donnelly
M. L. L. et al., 2001, angegeben. Beispielhafte Sequenzen,
die bevorzugt erfindungsgemäß verwendet
werden, sind nachstehend angegeben: QCTNYALLKLAGDVESNPGP, EARHKQKIVAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP,
APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP, TLNFDLLKLAGDVESNPGP, LLKLAGDVESNPGP.
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Die
Erfindung umfasst auch Varianten der 2A-Sequenz des FMDV, die durch
Addition, Deletion und Mutation dieser Sequenz erhalten wurden,
wobei die selbstprozessierende Eigenschaft dieser Sequenz beibehalten
wurde. Die Erfindung betrifft somit auch die Verwendung von Nucleinsäuresequenzvarianten,
die eine selbstprozessierende 2A-Spaltstelle codieren, sowie Nucleinsäuresequenzen,
die Sequenzen codieren, die sich in einem oder mehreren Codons bezüglich der
nativen 2A-Nucleotidsequenz unterscheiden. Ferner können auch
2A-artige Domänen
aus Picornaviren, Insektenviren, Typ-C-Rotaviren, Trypanosomen,
Repeat-Sequenzen
oder dem Bakterium Thermatoga maritima verwendet werden.
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Ferner
betrifft die Erfindung bevorzugt auch die Verwendung von Sequenzen,
die eine Identität
von 80–99%
zu der selbstprozessierenden 2A-Sequenz aus FMDV mit dem Motiv -DxExNPGP
oder -GxExNPGP, oder zu der Sequenz L L N F D L L K L A G D D V
E/Q S/J/F N/H/E/Q P G P/A (x kann eine beliebige Aminosäure sein)
besitzen. Dabei bezeichnet der Begriff „Sequenzidentität" Aminosäuresequenzidentität zwischen zwei
oder mehreren miteinander verglichenen Sequenzen unter Verwendung
eines Sequenzalignmentprogrammes. Die Ausdrücke „% Homologie" und „% Identität" werden hier austauschbar
verwendet und bezeichnen den Grad der Aminosäuresequenzidentität zwischen
zwei oder mehreren verglichenen Sequenzen. Ein Sequenzalignment
für Vergleichszwecke
kann beispielsweise unter Verwendung des lokalen Homologiealgorithmus
von Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981),
durch Verwendung des Homologiealgorithmus von Needleman & Wunsch, J. Mol.
Biol. 48:443 (1970), durch das Programm nach Pearson & Lipman, Proc.
Nat'I. Acad. Sci.
USA 85: 2444 (1988), durch Verwendung computerisierter
Implementationen dieser Algorithmen (GAP, BESTFIT, FASTA
und TFASTA im Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer
Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.) durchgeführt werden.
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In
den erfindungsgemäßen Vektorkonstrukten
können
beliebige, die vorstehend genannten 2A-Sequenzen bzw. deren Varianten
codierende DNA-Sequenzen verwendet werden.
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Ferner
wird erfindungsgemäß gegebenenfalls
mindestens eine weitere Sequenz verwendet, die eine proteolytische
Spaltstelle codiert. Hierbei können
beliebige auf dem Fachgebiet bekannte proteolytische Spaltstellen
verwendet werden. Bevorzugte Beispiele hierfür sind die Furinspaltstelle
mit der Consensussequenz RXK (R)R oder LXK (R)R, die durch endogene
subtilisinartige Proteasen wie Furin und andere Serinproteasen gespalten
werden kann. Weitere Beispiele sind die Faktor-10a-Spaltstelle,
die Signalpeptidase-1-Spaltstelle, die Thrombinspaltstelle oder
die KexII-Spaltstelle. Es können
auch davon abgeleitete Sequenzen gemäß den vorstehenden Ausführungen
im Zusammenhang mit der 2A-Spaltstelle verwendet werden. Bevorzugt
wird die KexII-Spaltstelle verwendet.
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Sofern
eine eine proteolytische Spaltstelle codierende DNA-Sequenz verwendet
wird, ist diese der DNA-Sequenz, die eine 2A-Spaltstelle oder eine
davon abgeleitete Sequenz codiert, vorangestellt. „Vorangestellt" bedeutet hierbei,
dass die DNA-Sequenz, die eine proteolytische Spaltstelle codiert,
am 5'-Ende der DNA-Sequenz, die eine
2A-Spaltstelle oder eine davon abgeleitete Sequenz codiert, vorausgeht.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst der Vektor eine Sequenz, die die KexII-Spaltstelle zwischen
der codierenden Sequenz für
ein erstes Protein oder Polypeptid und der codierenden Sequenz für die 2A-Spaltstelle
mit dem folgenden zweiten Protein oder Polypeptid enthält. Die
zusätzliche
Nutzung der proteolytischen Spaltstelle ist insbesondere sinnvoll,
wenn das C-terminale Ende eines Proteins für dessen Funktion mit verantwortlich
ist, und daher die Abspaltung der 2A-Sequenz für die Aufrechterhaltung der
Funktion notwendig ist.
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In
weiteren Ausführungsformen
kann sowohl die Sequenz, die die 2A-Spaltstelle codiert, als auch
die Sequenz, die eine proteolytische Spaltstelle codiert, in mehrfacher
Kopie vorliegen. Bevorzugte Konstrukte hierfür sind:
- – Enhancer-Promotor-Protein1-2A-Sig2-Protein2-Terminator
- – Enhancer-Promotor-Protein1-KexII-2A-Sig2-Protein2-Terminator
- – Enhancer-Promotor-Protein1-2A-Sig2-Protein2-2A-Sig3-Protein3-Terminator
- – Enhancer-Promotor-Protein1-KexII-2A-Sig2-Protein2-2A-Sig3-Protein3-Terminator
- – Enhancer-Promotor-Proteinl-KexII-2A-Sig2-Protein2-KexII-2A-Sig3-Protein3-Terminator
- – Enhancer-Promotor-Sig1-Protein1-2A-Sig2-Protein2-Terminator
- – Enhancer-Promotor-Sig1-Protein1-KexII-2A-Sig2-Protein2-Terminator
- – Enhancer-Promotor-Sig1-Protein1-2A-Sig2-Protein2-2A-Sig3-Protein3-Terminator
- – Enhancer-Promotor-Sig1-Protein1-KexII-2A-Sig2-Protein2-KexII-2A-Sig3-Protein3-Terminator
- – Enhancer-Promotor-Sig1-Protein1-KexII-2A-Sig2-Protein2-KexII-2A-Sig3-Protein3-Terminator
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Weiterhin
sind bevorzugte Konstrukte solche, bei denen die Teile Enhancer-Promotor-(Sig1)-Protein1 nur
partiell vorhanden sind, so dass noch eine zielgerichtete Integration
in einen Locus, bevorzugt den Locus des Protein1, erfolgen kann.
Die Länge
der DNA des Teils Enhancer-Promotor-(Sig1)-Protein1, von dessen C-terminalen
Ende aus gemessen, sollte so lang sein, dass es zu einer gezielten
in-frame Integration in den Locus von Protein1 kommt. Die Länge der
dazu notwendigen DNA kann 100 bp bis mehrere kbp betragen, bevorzugt
noch 0,3–3
kbp, noch bevorzugter 0,5–2
kbp, am bevorzugtesten 0,7–1,5
kbp. Bei der In-Frame Integration in einen durch die noch in der
Kassette vorhandenen Teile von Enhancer-Promotor-(Sig1)-Protein1 vordefinierten
Locus erfolgt dort im Genom die Vervollständigung der oben aufgezählten Konstrukte
in-vivo und es kommt zu der erfindungsgemäßen Expression und Sekretion
der Zielproteine durch die so transformierten filamentösen Pilze.
Durch die in-frame Integration in den Locus des Proteins1 werden
die in der Integrationskassette fehlenden Teile, die zur Expression
benötigt
werden, in-vivo ergänzt.
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Die
Erfindung betrifft auch Konstrukte, bei denen in den oben genannten
Konstruktionen Protein1 und folgende Proteine2 etc. zusammengesetzte
Fusionsproteine sein können,
wie sie z.B. zur Erhöhung
der Sekretionseffizienz von prokaryontischen oder tierischen Proteinen
bei der Expression in filamentösen
Pilzen verwendet werden. Diese Fusionsproteine können proteolytische Spaltstellen
enthalten, um den Anteil an hochsekretiertem Wirtsprotein, der mit
dem prokaryontischen oder tierischen Protein verbunden wurde, nach
der Sekretion oder während
der Sekretion wieder abzuspalten.
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Die
Erfindung betrifft auch Expressionskassetten, die zur Einschleusung
des offenen Leserasters in eine Wirtszelle verwendet werden können. Sie
umfassen bevorzugt eine Transkriptionsstartregion, die mit dem offenen
Leseraster funktionell verknüpft
ist. Eine derartige Expressionskassette kann eine Vielzahl von Restriktionsspaltstellen
zur Insertion des offenen Leserasters und/oder anderer DNAs, z.B.
einer Transkriptions-Regulator-Region und/oder selektierbare Markergene
enthalten. Die Transkriptionskassette umfasst in der 5'→3'-Richtung der Transkription eine Transkriptions-
und Translationsstartregion, die DNA-Sequenz von Interesse und eine
Transkriptions- und Translationsstopregion, die in einer mikrobiellen
Zelle funktionell ist. Die Terminationsregion kann bezüglich der
Transkriptioninitiationsregion nativ sein, kann bezüglich der
DNA-Sequenz von Interesse nativ sein oder kann von einer beliebigen
anderen Quelle abgeleitet sein.
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Bei
den Proteinen1 und weiteren kann es sich um das gleiche Polypeptid
handeln oder jedes Gen kodiert für
ein anderes Polypeptid oder jede beliebige Zwischenmischform. Wenn
das gleiche Polypeptid von den die Polypeptide 1 bis n (n = Anzahl
der kodierten Polypeptide, bevorzugt 4) kodierenen Genen in der
Expressionskassette exprimiert werden soll, so können zur Verbesserung der Stabilität der Expressionskassette
und zur Vermeidung von intrazellulären Rekombinationsschritten,
bei denen Teile der Gene ausgeschnitten werden, synthetische Gene
zum Einsatz kommen, bei denen durch Ausnutzung der Codonusage eine
Hybridisierung zwischen den einzelnen Kopien vermindert wird. Expressionskas setten,
die nur das gleiche Polypeptid kodieren, haben in der Regel bis
zu 4 Kopien des für
das gleiche Polypeptid kodierenden Gens. Wenn unterschiedliche Polypeptide
durch die Gene kodiert werden, so kann die Gesamtzahl der Gene höher sein,
jedoch für
das einzelne Polypeptid meist nicht höher als 4.
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Der
Ausdruck „Transkriptions-Regulator-Region" umfasst Kernproteine,
die an ein DNA-Responseelement binden und dadurch die Expression
eines assoziierten Gens oder assoziierter Gene transkriptionell
regulieren. Transkriptionsregulatorproteine binden im Allgemeinen
direkt an DNA-Responseelemente. In einigen Fällen kann die Bindung an DNA
indirekt durch die Bindung an ein anderes Protein beeinflusst werden,
das seinerseits an ein DNA-Responseelement bindet oder davon gebunden
wird. Die erfindungsgemäßen Vektorkonstrukte
können
solche regulatorischen Elemente umfassen.
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Der
Ausdruck „offenes
Leseraster" (ORF)
bezeichnet die Aminosäure-Sequenz,
die zwischen den Translationsstart- und -Stop-Codons einer codierenden
Sequenz codiert wird. Die Ausdrücke „Start-Codon" und „Stop-Codon" bezeichnen eine
Einheit aus drei benachbarten Nucleotiden (Codons) in einer codierenden Sequenz,
die den Kettenstart und -stop der Proteinsynthese (mRNA-Translation)
spezifizieren.
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„Funktionelle
Verknüpfung" bezeichnet im Zusammenhang
mit einer Nucleinsäure
eine Verbindung als Teil des gleichen Nucleinsäuremoleküls in geeigneter Positionierung
und Orientierung zum Transkriptionsstart des Promotors. DNA in funktioneller
Verknüpfung
an einen Promotor befindet sich unter der Transkriptions-Initiations-Regulation
des Promotors. Codierende Sequenzen können funktionell mit der Regulatorsequenz
in Sense- oder Antisense-Orientierung verknüpft sein. Bei Bezugnahme auf
Polypeptide bedeutet funktionelle Verknüpfung die Verbindung als Teil
desselben Polypeptids, d.h. über
Peptidylbindungen.
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Erfindungsgemäß können beliebige
Promotoren verwendet werden. Promotor bezeichnet die Nucleotidsequenz üblicherweise
stromaufwärts
(5') bezüglich der
co dierenden Sequenz und kontrolliert die Expression der codierenden
Sequenz, indem die Erkennung für
die RNA-Polymerase und anderer Faktoren, die für die richtige Transkription
erforderlich sind, bereitgestellt wird. Der erfindungsgemäß verwendete
Promotor kann einen Minimalpromotor umfassen, d.h. eine kurze DNA-Sequenz
aus einer TATA-Box und anderen Sequenzen, die die Transkriptionsstartstelle
spezifizieren, an die Regulatorelemente zur Kontrolle der Expression
angefügt sind.
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Der
erfindungsgemäß gegebenenfalls
verwendete Promotor kann auch eine Nucleotidsequenz umfassen, die
einen Minimalpromotor und Regulatorelemente umfasst, der die Expression
einer codierenden Sequenz oder funktionellen RNA kontrollieren kann.
Dieser Typ von Promotorsequenz besteht aus proximalen und distalen
stromaufwärts
gelegenen Elementen, wobei die zuletzt genannten Elemente oft als
Enhancer bezeichnet werden. Folglich ist ein Enhancer eine DNA-Sequenz, die die
Promotor-Aktivität
stimulieren kann und kann ein dem Promotor innewohnendes Element
oder ein insertiertes heterologes Element sein, um die Expressionshöhe oder
Zellspezifität
eines Promotors zu verstärken.
Er kann in beiden Orientierungen funktionieren und kann selbst bei
stromaufwärtiger
und stromabwärtiger
Platzierung von dem Promotor funktionieren. Sowohl Enhancer als
auch andere stromaufwärts
gelegene Promotor-Elemente binden sequenzspezifisch DNA-bindende
Proteine, die ihre Wirkungen vermitteln. Promotoren können in
ihrer Gesamtheit von einem nativen Gen abgeleitet sein oder können aus
verschiedenen Elementen zusammengesetzt sein, die von verschiedenen
natürlich
vorkommenden Promotoren abgeleitet sind oder können sogar aus synthetischen DNA-Segmenten
zusammengesetzt sein. Ein Promotor kann auch DNA-Sequenzen enthalten, die an der Bindung
von Proteinfaktoren beteiligt sind, die die Effizienz der Transkriptionsinitiation
als Antwort auf physiologische oder entwicklungsbedingte Bedingungen
kontrollieren.
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Promotorelemente,
insbesondere TATA-Elemente, die inaktiv sind oder eine stark verminderte
Promotor-Aktivität
in Abwesenheit einer stromaufwärtigen
Aktivierung besitzen, werden als Minimalpromotoren oder Kernpromotoren
bezeichnet. In Ge genwart eines geeigneten Transkriptionfaktors bzw.
geeigneter Transkriptionsfaktoren liegt die Funktion des Minimalpromotors
in der Ermöglichung
der Transkription. Ein Minimal- oder Kernpromotor besteht somit
nur aus allen Grundelementen, die für die Transkriptionsinitiation
notwendig sind, z.B. einer TATA-Box und/oder einem Initiator.
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Beispiele
für Promotoren,
die erfindungsgemäß verwendet
werden können,
sind Promotoren, von denen bekannt ist, dass sie die Expression
in den eukaryotischen Zellen kontrollieren. Beliebige Promotoren
mit der Fähigkeit
zur Expression in Fadenpilzen können
verwendet werden. Beispiele sind ein Promotor, der stark durch Stärke oder
Zellulose induziert wird, z.B. ein Promotor für Glucoamylase oder α-Amylase
aus der Gattung Aspergillus oder Cellulase (Cellobiohydrolase) aus
der Gattung Trichoderma, ein Promotor für Enzyme im glykolytischen
Stoffwechselweg, wie beispielsweise Phosphoglyceratkinase (PGK)
und Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GPD), etc. Bevorzugt
ist der Cellobiohydrolase-I-,
der Cellobiohydrolase-II-, der Amylase-, der Glucoamylase-, der
Xylanase- oder der Enolase-Promotor.
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Zusätzlich zur
Verwendung eines speziellen Promotors können andere Typen von Elementen
die Expression von Transgenen beeinflussen. Insbesondere wurde gezeigt,
dass Introns das Potenzial zur Verstärkung der Transgenexpression
besitzen.
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Die
Expressionskassette kann noch weitere Elemente umfassen, beispielsweise
solche, die durch endogene oder exogene Elemente wie Zinkfinger-Proteine,
einschließlich
natürlich
vorkommender Zinkfinger-Proteine oder chimerer Zinkfinger-Proteine, reguliert
werden können.
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Die
Erfindung betrifft auch die erfindungsgemäße DNA-enthaltende Vektoren.
Diese Vektoren umfassen beliebige Plasmide, Cosmide, Phagen und
andere Vektoren in doppelsträngiger
oder einzelsträngiger,
linearer oder zirkulärer
Form, die gegebenenfalls selbst transmittierbar oder mobilisierbar
sein können
und die ei nen prokaryotischen oder eukaryotischen Wirt entweder
durch Integration in das zelluläre
Genom transformieren können
oder die extrachromosomal vorliegen (z.B. autonom replizierende
Plasmide mit einem Replikationsorigin).
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Vektoren,
Plasmide, Cosmide, künstliche
Bakterienchromosomen (BACs) und DNA-Segmente zur Verwendung zur
Transformation von Zellen umfassen allgemein die erfindungsgemäße Expressionskassetten die
in die Zellen eingeschleust werden sollen. Diese DNA-Konstrukte
können
weiter Strukturen wie Promotoren, Enhancer, Polylinker oder auch
Regulatorgene, so weit erforderlich, umfassen. Eines der DNA-Segmente oder
Gene, das bzw. die für
die zelluläre
Einschleusung ausgewählt
wurde bzw. wurden, codiert/codieren zweckdienlicherweise ein Protein,
das in den so erhaltenen transformierten (rekombinanten Zellen)
exprimiert wird, was zu einem screenbaren oder selektierbaren Merkmal
führt und/oder
der transformierten Zelle einen verbesserten Phenotyp verleiht.
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Die
Konstruktion der erfindungsgemäßen Vektoren
bzw. Vektorkonstrukte ist einem Fachmann auf dem Gebiet angesichts
der vorstehenden Offenbarung und des allgemeinen Fachwissens bekannt
(vgl. z.B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laborstory
Manual (2. Aufl., Coldspring Harbor Laborstory Press, Plainview,
N.Y. (1989)). Die erfindungsgemäße Expressionskassette kann
ein oder mehrere Restriktionsschnittstellen enthalten, um die die
Polypeptide-codierenden Nucleotide unter die Regulation einer Regulatorsequenz
zu stellen. Die Expressionskassette kann auch ein Terminationssignal
in funktioneller Verknüpfung
mit dem letzten Polynucleotid sowie Regulatorsequenzen, die für die ordnungsgemäße Translation
der Polynucleotide benötigt
werden, enthalten. Die Expressionskassette kann chimer sein, d.h.
mindestens eine ihrer Komponenten ist bezogen auf mindestens eine
der anderen Komponenten heterolog. Die Expression der Polynucleotide
in der Expressionskassette kann unter der Kontrolle eines konstitutiven
Promotors, eines induzierbaren Promotors, eines regulierten Promotors,
eines viralen Promotors oder eines synthetischen Promotors stehen.
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Die
Vektoren können
bereits Regulatorelemente enthalten, z.B. Promotoren, oder die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen
können
so manipuliert werden, dass sie solche Elemente enthalten. Geeignete
Promotorelemente, die verwendet werden können, sind auf dem Fachgebiet
bekannt und sind beispielsweise für Trichoderma reesei der cbh
1- oder der cbh-2-Promotor, für
Aspergillus oryzae der amy-Promotor,
für Aspergillus
niger der xyl-, glaA-, alcA-, aphA-, tpiA-, gpdA-, sucI- und der
pkiA-Promotor.
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DNA,
die zur Einschleusung in Zellen geeignet ist, kann neben der erfindungsgemäßen DNA
auch DNA, die aus einer beliebigen Quelle abgeleitet wurde oder
daraus isoliert ist, umfassen. Ein Beispiel für eine abgeleitete DNA ist
eine DNA-Sequenz,
die als nützliches
Fragment in einem gegebenen Organismus identifiziert wurde und die
dann in im Wesentlichen reiner Form chemisch synthetisiert wurde.
Ein Beispiel für
eine solche DNA ist eine geeignete DNA-Sequenz, die beispielsweise
unter Verwendung von Restriktionsendonucleasen erhalten wurde, so
dass sie weiter erfindungsgemäß manipuliert
werden kann, beispielsweise amplifiziert werden kann. Eine derartige
DNA wird üblicherweise
als rekombinante DNA bezeichnet. Daher umfasst eine geeignete DNA
vollständig
synthetische DNA, semisynthetische DNA, aus biologischen Quellen
isolierte DNA und von eingeschleuster RNA abgeleitete DNA. Im Allgemeinen
ist die eingeschleuste DNA kein ursprünglicher Bestandteil des Genotyps
der Empfänger-DNA,
aber erfindungsgemäß kann auch
ein Gen aus einem gegebenen Genotyp isoliert und eventuell verändert werden
und anschließend
können
Mehrfachkopien des Gens in den gleichen Genotyp eingeschleust werden,
z.B. um die Produktion eines gegebenen Genprodukts zu verstärken.
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Die
eingeschleuste DNA umfasst ohne Beschränkung DNA aus Genen, wie beispielsweise
aus Bakterien, Hefen, Pilzen oder Viren. Die eingeschleuste DNA
kann modifizierte oder synthetische Gene, Teile von Genen oder chimäre Gene
einschließlich
Genen aus dem gleichen oder einem unterschiedlichen Genotyp umfassen.
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Die
zur Transformation erfindungsgemäß verwendete
DNA kann zirkulär
oder linear, doppelsträngig oder
einzelsträngig
sein. Im Allgemeinen liegt die DNA in Form einer chimären DNA
wie eine Plasmid-DNA vor, die auch codierende Regionen, die von
Regulatorsequenzen flankiert sind, die die Expression der in der transformierten
Zelle vorhandenen rekombinanten DNA unterstützen, enthalten. Beispielsweise
kann die DNA selbst einen Promotor enthalten oder daraus bestehen,
der in einer Zelle aktiv ist, der von einer Quelle, die sich von
der Zelle unterscheidet, abgeleitet ist oder es kann ein Promotor
verwendet werden, der bereits in der Zelle, d.h. der Transformationszielzelle,
vorhanden ist.
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Die
Selektion eines geeigneten Expressionsvektors hängt von den Wirtszellen ab.
Pilzexpressionsvektoren können
einen Replikationsorigin, einen geeigneten Promotor und Enhancer
umfassen, und auch beliebige notwendige Ribosomenbindungsstellen,
Polyadenylierungsstellen, Splice-Donor und -Akzeptor-Stellen, Transkriptionsterminationssequenzen
und nicht-transkribierte 5'-flankierende
Sequenzen umfassen.
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Beispiele
für geeignete
Wirtszellen sind: Pilzzellen der Gattung Aspergillus, Rhizopus,
Trichoderma, Neurospora, Mucor, Penicillium, etc. Geeignete Wirtssysteme
sind beispielsweise Pilze wie Aspergilli, z.B. Aspergillus niger
(ATCC 9142) oder Aspergillus ficuum (NRLL 3135) oder Trichoderma
(z.B. Trichoderma reseei QM6a). Derartige Mikroorganismen sind gut
bekannt und können
von anerkannten Hinterlegungsstellen, z.B. der American Type Culture
Collection (ATCC), dem Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS)
oder der Deutschen Sammlung für
Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) oder beliebigen anderen
Hinterlegungsstellen erhalten werden.
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Die
Expressionskassette kann in der 5'-3'-Transkriptionsrichtung
eine Transkriptions- und Translationstartregion des erfindungsgemäßen Polynucleotids
und eine Transkriptions- und Terminationsregion, die in vivo oder
in vitro funktionell ist, enthalten. Die Terminationsregion kann
bezüglich
der Transkriptionsinitiationsregion nativ sein oder kann bezüglich des
Polynucleotids nativ oder an derer Herkunft sein. Die Regulatorsequenzen
können
stromaufwärts
(5' nicht-codierende Sequenzen),
innerhalb (Intron) oder stromabwärts
(3' nicht-codierende
Sequenzen) einer codierenden Sequenz lokalisiert sein und die Transkription,
das RNA-Processing oder die Stabilität und/oder die Translation
der assoziierten codierenden Sequenz beeinflussen. Regulatorsequenzen
können
ohne Beschränkung
Enhancer, Promotoren, Repressorbindungsstellen, Translationsleadersequenzen,
Introns oder Polyadenylierungsignalsequenzen umfassen. Sie können natürliche und synthetische
Sequenzen sowie Sequenzen umfassen, die eine Kombination aus synthetischen
und natürlichen Sequenzen
sind.
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Das
erfindungsgemäße Vektorkonstrukt
kann auch geeignete Sequenzen zur Amplifikation der Expression umfassen.
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Die
erfindungsgemäße Expressionskassette
kann ferner Enhancer-Elemente oder stromaufwärtige Promotor-Elemente enthalten.
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Erfindungsgemäße Vektoren
können
so konstruiert werden, dass sie ein Enhancer-Element enthalten. Die
erfindungsgemäßen Konstrukte
umfassen somit das Gen von Interesse zusammen mit einer 3'-DNA-Sequenz, die
als Signal wirkt, um die Transkription zu terminieren und die Polyadenylierung
der so erhaltenen mRNA zu erlauben.
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Es
können
beliebige Signalsequenzen verwendet werden die die Sekretion aus
dem gewählten
Wirtsorganismus ermöglichen.
Bevorzugte Signalsequenz ist die dem zu exprimierenden Gen eigene
Signalsequenz, es können
jedoch auch die Signalsequenzen der Phytase oder Glucoamylase aus
Aspergillus niger, der α-Amylase aus Aspergillus
oryzae der Cellobiohydrolase oder Xylanase aus Trichoderma reesei
oder daraus abgeleitete Signalsequenzen für die Sekretion aus filamentösen Pilzen
verwendet werden. Dabei kann in den erfindungsgemäßen Vektorkonstrukten
die Signalsequenz bei der ein erstes Polypeptid codierenden Sequenz
auch fehlen. Dies führt
dazu, dass dieses Polypeptid intrazellulär verbleibt. Bei allen weiteren
Polypeptid-codierenden Sequenzen ist das Vorhandensein der Signalsequenz
wesentlich um das entsprechende Polypeptid erfindungsgemäß zu sekretieren.
Das Fehlen der Signalsequenz bei dem ersten Polypeptid liegt vor, wenn,
z.B. als Ziellocus der Locus eines intrazellulären Proteins gewählt wird,
oder wenn das erste Polypeptid zur Verbesserung von intrazellulären Stoffwechselwegen
dient. Alternativ kann die Signalsequenz auch bei einem anderen
Polypeptid fehlen um so z.B. ein für den verwendeten Promotor
aktivierendes Polypetid herzustellen und damit die Expression und
Sekretion des/der gewünschten
Polypeptid/e weiter zu erhöhen.
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Es
kann auch eine spezielle Leadersequenz verwendet werden, da die
DNA-Sequenz zwischen
der Transkriptionsstartstelle und dem Start der codierenden Sequenz,
d.h. der nicht-translatierten Leadersequenz die Genexpression beeinflussen
kann. Bevorzugte Leadersequenzen umfassen Sequenzen, die die optimale Expression
des angehefteten Gens steuern, d.h. sie umfassen eine bevorzugte
Consensus-Leader-Sequenz, die die mRNA-Stabilität erhöht oder erhält und eine ungeeignete Translationsinitiation
verhindert. Die Wahl solcher Sequenzen ist einem Fachmann auf dem
Gebiet gut bekannt.
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Um
die Möglichkeit,
die Transformanten zu identifizieren zu verbessern, kann ein selektierbares
oder screenbares Markergen in die Expressionskassette aufgenommen
werden. Derartige Markergene sind einem Fachmann auf dem Gebiet
gut bekannt.
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Die
Expressionskassette oder ein Vektorkonstrukt, das die Expressionskassette
enthält,
wird in eine Wirtszelle eingeführt.
Eine Vielzahl von Techniken ist verfügbar und einem Fachmann auf
dem Gebiet zur Einschleusung von Konstrukten in eine Wirtszelle
gut bekannt. Die Transformation von Pilzen kann nach Penttilä et al.,
Gene 61:155–164,
1987 durchgeführt
werden.
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Sobald
die erfindungsgemäße Expressionskassette
bzw. DNA-Sequenz erhalten ist, kann sie in Vektoren nach an sich
bekannten Verfahren eingefügt
werden, um das codierte Polypeptid in geeigneten Wirtssystemen zu überexprimieren.
Jedoch können
auch DNA-Sequenzen als solche verwendet werden, um geeignete Wirtssysteme
der Erfindung zu transformieren, um eine Überexpression des codierten
Polypeptids zu erzielen.
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Die
hier verwendeten Ausdrücke „Protein" und „Polypeptid" können austauschbar
verwendet werden und bezeichnen typischerweise Proteine und Polypeptide
von Interesse, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Vektorkonstrukte
exprimiert werden. Solche Proteine oder Peptide können jedes
beliebige Protein oder Peptid sein, das für Forschungszwecke, diagnostische
Zwecke, therapeutische Zwecke, Ernährungszwecke, oder technische
Anwendungen nützlich
ist. Bevorzugte Beispiele für
erfindungsgemäß exprimierte
und sezernierte Proteine sind Lebensmittelenzyme, wie zum Beispiel
Polygalacturonidase, Pektinmethylesterase, Xylogalacturonoidase,
Rhamnogalacturonidase, Arabinofuranosidase, Arabanase, Amylase,
Phytase, Xylanase, Cellulase, Protease, Mannanase, Transglutaminase
etc., Tierfutterenzyme wie zum Beispiel Phytase, Xylanase, Endoglucanase,
Mannanase und Protease, sowie technische Enzyme wie zum Beispiel
Cellulasen, Proteasen, Amylasen, Laccasen, Oxidoreductasen etc.
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Zur
Expression und Sekretion der Polypeptide werden die transformierten
filamentösen
Pilze unter üblichen
Bedingungen für
die Expression und Sekretion von Proteinen gezüchtet. Hierzu werden die Pilze
auf Agarplatten angezüchtet,
und eine Sporensuspension oder eine Mycelsuspension als Inokulum
für eine
submers oder Oberflächen-Fermentation
eingesetzt. Die Fermentation wird auf Medien durchgeführt die
die notwendigen C- und N-Quellen enthalten sowie Spurenelemente
und Mineralsalze. Des weiteren sollte das Medium bei Verwendung
von induzierbaren Promotoren die Induktoren oder deren Vorstufen
enthalten. Die Fermentation erfolgt unter Kontrolle von Temperatur
und pH-Wert sowie weiterer Fermentationsbedingungen wie Redox-Potential,
partieller Sauerstoffgehalt, etc. Auch eine kontrollierte Führung von
weiteren C- und N-Quellen, sowie anderer Medienbestandteile kann
erfolgen (Fed-Batch-Verfahren). Am Ende der Fermentation wird die
Protein- oder polypeptidhaltige Kulturflüssigkeit mit bekannten phy sikalischen
Verfahren von der Biomasse getrennt und dabei das Protein oder Polypeptid
isoliert.
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Mit
den erfindungsgemäßen Konstrukten
lassen sich verbesserte Expressions- und Sekretionshöhen heterologer Polypeptide
erzielen. Ferner können
auch mehrere Polypeptide gleichzeitig in definierten Verhältnissen
zueinander produziert werden. Die erfindungsgemäßen Konstrukte erlauben die
Nutzung von Loci hochexprimierter intrazellulärer als auch extrazellulärer Proteine
zur Sekretion des Zielproteins, ohne die Produktion des intrazellulären oder
extrazellulären
Proteins zu stören.
Dies ist bei der Verwendung von proteolytischen Spaltstellen in
Verbindung mit intrazellulären
Proteinen nicht möglich.
Durch die Verwendung von der selbstprozessierenden 2A-Spaltstelle
kommt es im Gegensatz zu Expressionen mit proteolytischen Spaltstellen
nicht zur Expression des Volllängen-Fusionsproteins und
die beiden, oder mehrere Polypeptide haben immer die korrekte N-terminale
Sequenz.
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Die
beigefügten
Figuren erläutern
die Erfindung näher.
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1:
SDS-Gelelektrophorese von pPgpd-Pyr-APG1-Transformanten Darstellung
der SDS-PAGE von Kulturüberständen aus
dem Plasmid pPgpd-Pyr-APG1 (vgl. 3) transformierten
Stämmen:
Transformant
RH31480 (Gel 1), RH31481 (Gel 2), RH31483 (Gel 3), Markerproteins
SDS-7, Sigma (Gel 4), A. foetidus RH31337 (Gel 5)
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2:
SDS-Gelelektrophorese von pPXT-APG1-KexPG1-Transformanten Darstellung
der SDS-PAGE von Kulturüberständen aus
dem Plasmid pPXT-APG1-KexPG1 (vgl. 4) transformierten
Stämmen:
WT
(Gel 1), Markerproteine (Gel 2), die Stämme RH31520 bis RH31527 (Gele
3 bis 10)
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3:
Plasmidkarte von pPgpd-Pyr-APG1
-
4:
Plasmidkarte von pPXT-APG1-KexPG1
-
5:
Plasmidkarte von pX-1APEsyn
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6:
Plasmidkarte von pX-1APEnat
-
7:
Plasmidkarte von pX-2APEsyn
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8 Plasmidkarte
von pX-2APEnat
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Das
folgende biologische Material (Plasmide) wurde am 14.06.2006 bei
der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH
(DSMZ), Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig gemäß den Bedingungen
des Budapester Vertrags hinterlegt:
| Plasmid | Hinterlegungsnummer |
| pX-2APEnat | DSM
18368 |
| pX-2APEsyn | DSM
18367 |
| pX-1APEnat | DSM
18366 |
| pX-1APEsyn | DSM
18365 |
| pPXT-APG1-KexPG1 | DSM
18364 |
| pPgpd-Pyr-APG1 | DSM
18363 |
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Die
folgenden Beispiele erläutern
die Erfindung näher:
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Beispiele
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Referenzbeispiel 1: Bestimmung der Polygalacturonidaseaktivität
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Die
Polygalacturonidaseaktivität
ist definiert als die Freisetzung von 1 μmol Galactose-Reduktionsäquivalenten
pro Minute unter Standardbedingungen und wird bestimmt durch ein
zweistufiges Verfahren. Zuerst erfolgt die Inkubation des Enzyms
(100 μl)
für 10
min bei 40°C
gemischt mit 250 μl
Kaliumpektat-Lösung (0,7%)
bei pH 3,9. Die Enzymlösung
wird vor Gebrauch mit 0,1 M Na-Acetatpuffer,
pH 3,9 verdünnt.
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In
dem zweiten Schritt werden die freigesetzten reduzierenden Enden
photometrisch bestimmt. Dazu werden 650 μl PAHBAH Reagenzlösung (0,5%
p-Hydroxybenzoesäurehydrazid
[PAHBAH] und 0,475% Titriplex III) zugegeben und die Mischung für 15 min
bei 80°C
inkubiert. Die Farbentwicklung wird durch Ab kühlen im Eisbad gestoppt und
die Farbe bei 412 nm gegen einen Blindwert gemessen. Beim Blindwert
erfolgt die Zugabe der Enzymlösung
und der Farblösung
in umgekehrter Reihenfolge, da die Farblösung die Enzymreaktion unterbindet.
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Die
Kalibrierung der Meßmethode
erfolgt mit Galactose.
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Referenzbeispiel 2: Bestimmung der Pektinmethylesteraseaktivität
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Die
Pektinmethylesteraseaktivität
(PE) wird in einem pH-Stat-Verfahren mit 0,025 M NaOH bestimmt. 1
PE g–1 ist
definiert als die Enzymmenge, die pro Minute 1 μval Säure unter den angegebenen Bedingungen (30°C, 0,49%
Citruspektin [Copenhagen-Pectin X-2955], pH 4,5) freisetzt.
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Beispiel 1: Konstruktion des Expressionsplasmids
pPgpd-Pyr-APG1
-
Die
Konstruktion des Expressionsplasmids pPgpd-Pyr-APG1 erfolgt durch
folgende Schritte:
-
a) Konstruktion von pPyrAT
-
Die
chromosomale DNA wurde aus A. foetidus RH3911 nach einer Vorschrift
von Hynes et al (1983, Mol.Cell.Biol 3: 1430–1439) isoliert.
Das pyrA-Gen wurde mittels PCR amplifiziert. Für die Amplifizierung des pyrA-Gens
wurden folgende Primer aus der Sequenzinformation des A. niger pyrA-Gens
(van den Hombergh et al., 1996, unveröffentlicht, Accession X96734)
abgeleitet:
Seq. ID NO:1 PyrAEcoNotI: GGAATTCGCGGCCGCATTAACCCCTCCATCAAC
Seq.
ID No:2 PyrAxbaSmaI: TCCCCCGGGATCCCGTCTAGAGTTTCCGCCGACACGGGCCAGGTAG
-
Das
PCR-Produkt wurde mit EcoRI und SmaI geschnitten und in das Plasmid
pUC18 kloniert. Das entstandene Plasmid wurde pPyrA genannt.
-
Die
Amplifizierung der Tpyr-Terminatorsequenz wurde mittels PCR mit
folgenden Primern durchgeführt:
Seq.
ID NO:3 TpyrXbaSma: GCTCTAGATAATCCCCCGGGTAGGTACTATAAAAGGAGGATCGAAG
Seq.
ID NO:4 TpyrNotNde: GGAATTCCATATGGCGGCCGCCTATTTACCGGATGGCAATGGCGCCAG
-
Das
PCR-Produkt wurde mit XbaI und NdeI geschnitten und in das mit XbaI
und NdeI geschnittene Plasmid pPyrA kloniert. Das entstandene Plasmid
erhielt die Bezeichnung pPyrAT. Das pyrA-Gen ohne Stopcodon enthält die XbaI-Schnittstelle unmittelbar
stromabwärts
der pyrA-Sequenz.
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Ein
Sequenzvergleich des Gens, isoliert aus A. foetidus RH3911 mit dem
Gen aus A. niger N400 (van den Hombergh) zeigte eine Identität von 99%.
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b) Konstruktion der 2A-Sequenz
-
Die
2A DNA-Sequenz (Donnelly et al., 2001, J. Gen. Virology
82, 1027–1041)
wurde unter Verwendung des Codon-Gebrauchs von Aspergillus (http://www.kazusa.or.jp/codon)
synthetisiert.
Seq. ID NO:5: 2A DNA Sequenz:
CAGTGCACCAACTACGCCCTGCTCAAGCTCGCCGGCGACGTCGAGAGCAACCCCGGCCCC
Seq.
ID NO:6: Aus 2A DNA abgeleitete Aminosäuresequenz
Gln Cys Thr
Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly
Pro
-
c) Konstruktion p1APGI
-
Das
chromosomale Polygalacturonidase (pgI)-Gen wurde aus A. niger RH3544
isoliert und in pUC18 kloniert. Das entstandene Plasmid erhielt
die Bezeichnung p27/1. Der Sequenzvergleich des pgI-Gens aus A. niger
RH3544 mit dem pgaI- Gen
aus A. niger N400 (Bussink et al., 1991, Curr. Genet 20
(4), 301–307,
Accession Nr. X58892) zeigte eine Identität der Nucleotidsequenz
von 92% bzw. der Aminosäuresequenz
von 98%.
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Aus
der Sequenzinformation wurde die Fusion 2A-pgI-DNA Sequenz synthetisiert,
in der die pgI-DNA mit ihrer Signalsequenz in-frame am 3'-Ende der 2A-Sequenz
fusioniert ist. Dieses fusionierte DNA-Fragment enthält das offene
Leseraster von 2A-pgI-DNA und zusätzlich die XbaI-Schnittstelle
unmittelbar stromaufwärts der
2A-Sequenz. Das synthetische Fragment wurde in pUC18 kloniert und
das entstandene Plasmid wurde p2APGImodif genannt.
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Die
Konstruktion des Plasmids p2APGInativ erfolgte durch Einfügen des
StuI-Tth111I Fragments
des nativen pgI-DNA Sequenz in das mit StuI-Tth111I gespalten Plasmid
p2APGImodif.
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Zur
Konstruktion des Plasmids p1APGI wurde die 1APGI-Sequenz mittels
PCR aus dem Plasmid p2APGInativ amplifiziert. Die Amplifizierung
erfolgte mit den folgenden Primern:
Seq. ID NO:7: pp1a GTGCTGCAAGGCGATTAAGTTG
Seq.
ID NO:8: PGI-SmaINheI TCCCCCGGGTTAGCAGCTAGCACCGGAAGGAACGTTCTCGCAGTC
-
Das
PCR Produkt wurde mit HindIII und SmaI geschnitten und in das mit
HindIII und SmaI geschnitten Plasmid pUC18 kloniert.
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Das
entstandenen Plasmid mit der Bezeichnung p1APGI enthält die pgI-DNA
mit ihrer Signalsequenz in-frame am 3'-Ende der 2A-Sequenz. Dieses fusionierte
DNA-Fragment enthält
das offene Leseraster von 2A-pgI-DNA und zusätzlich die XbaI-Schnittstelle
unmittelbar stromaufwärts
der 2A-Sequenz und die SmaI-Schnittstelle
stromabwärts
des pgI-Gens.
-
d) pPyr-APGI
-
Das
Plasmid p1APGI wurde mit XbaI und SmaI geschnitten und das entstandene
Fragment -APGI- in die XbaI und SmaI-Schnittstellen in dem Plasmid
pPyrAT inseriert. Dadurch entstand ein offenes Leseraster aus der
pyrA und APGI-Sequenz.
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e) Konstruktion von pPgpd-Par-APG1
-
Die
Pyr-APG1-Sequenz wurde aus dem Plasmid pPyr-APG1 mit den Primern
Seq.
ID NO:9: PyrBspHI: CGAATTCATGAGCTCCAAGTCGCCATTGACC
Seq. ID
NO:10: PG1BspHI: GGAATTCATGATTAGCAAGAAGCACCGGAAGG
mittels PCR
amplifiziert. Das PCR Produkt wurde mit BspHI geschnitten und das
entstandene Fragment in das mit NcoI geschnittene Plasmid pAN52-1
kloniert (Punte et al., 1987, Gene 56, 117–124, Accession
Nr. Z32697). Das erhaltene Plasmid hat die Bezeichnung
pPgpd-Pyr-APGI und enthält
die Fusion aus pyrA- und APGI-Sequenz
unter der Kontrolle des A. nidulans-gpd-Promotors.
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Das
Plasmid wurde durch Restriktionsendonucleasen kartiert und durch
Sequenzierung bestätigt.
Das Plasmid ist in 3 dargestellt und ist unter
der Hinterlegungsnummer DSM 18363 am 14.06.2006 hinterlegt worden.
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Beispiel 2: Konstruktion des Expressionsplasmids
pPXT-APGI-KexPG1
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Die
Konstruktion des Expressionsplasmids pPXT-APGI-KexPG1 erfolgte durch
folgende Schritte:
-
a) Konstruktion von pKexPGI
-
Die
KexPGI-Sequenz, die die KexII-Sequenz (LysArg) unmittelbar stromaufwärts des
reifen pgI-Gens enthält,
wurde mittels PCR aus dem Plasmid pKR-1APGI amplifiziert. Die Amplifizierung
erfolgte mit den folgenden Primern:
Seq. ID NO:11: SpeI-PGI
GACTAGTTGCAAGCGCGCTCCCGCTCCTTCTCGCGTCTCTGAG
Seq. ID NO:12:
NcoI-PGI ACAGCGCCGTCGGCCATGGTGACAGTCAG
-
Das
PCR-Produkt wurde mit SpeI und NcoI geschnitten und in das mit SpeI
und NcoI geschnittene Plasmid pKR-1APGI kloniert.
-
Das
Plasmid pKR-1APGI wurde zuvor aus dem Plasmid p1APGI mittels PCR
hergestellt und enthält die
KexII-Sequenz (LysArg) unmittelbar stromaufwärts des APGI-Gens enthält. Die
Amplifizierung erfolgte mit den folgenden Primern:
Seq. ID
NO:13: pp2a. TTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAG
Seq. ID NO:14: HindSpeI
CCCAAGCTTACTAGTTGCAAGCGCCAGTGCACCAACTACGCCCTGCTCA
-
Das
PCR Produkt wurde mit HindIII und SmaI geschnitten und das mit HindIII
und SmaI geschnittene Plasmid pUC18 kloniert.
-
b) Konstruktion von p1APGI-KexPGI
-
Das
Plasmid pKexPGI wurde mit SpeI und EcoRI geschnitten und die Kex-PGI
als SpeI-EcoRI-DNA Fragment in das mit NheI und EcoRI geschnittene
Plasmid p1APGI kloniert.
-
Das
entstandene Plasmid mit der Bezeichung pAPG1-KexPGI enthält ein offenes
Leseraster aus der APG1-Sequenz und der reifen PG1-Sequenz, die
mittels einer KexII-Schnittstelle fusioniert.
-
c) Konstruktion von pPXT
-
Die
chromosomale DNA wurde aus A. foetidus RH3911 nach einer Vorschrift
von Hynes et al. (1983, Mol.Cell.Biol 3, 1430–1439)
präpariert.
Das Xylanase (xyl)-Gen wurde als 4.5 kb EcoRI Fragment isoliert
und in pUC18 kloniert. Das entstandene Plasmid erhielt die Bezeichnung
pXyl8/1. Die DNA-Sequenz und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz
zeigt eine Identität
von 98% mit den Sequenzen des A. kawachii-Xylanase-Gens (Ito
et al., 1992, Biosci Biotechnol Biochem 56 (8), 1338–1340, Accession-Nr.
D14848).
-
Das
Plasmid pPXT geht aus dem Plasmid pXyl8/1 durch Einfügen weiterer
NotI-Schnittstellen
in die beiden EcoRI-Sites sowie eine Multicloning-Site, die die
Schnittstellen SpeI und PmeI enthält, unmittelbar stromaufwärts des
Xylanase-Stopcodons
hervor.
-
Die
Konstruktion des Plasmid pPXT wurde mittels der PCR-Methode analog
dem Prinzip, das in Nucleic Acids Research 1989, 17(2),
723–733 und Nucleic
Acids Research 1990, 18(6), 1656 beschrieben ist, durchgeführt.
-
d) Konstruktion von pPXT-amdS
-
Aus
dem Plasmid p3SR2 (Hynes et al., 1983, Mol. Cell. Biol.
3, 1430–1439;
Kelly and Hynes, 1985, EMBO J. 4, 475-47) wurde das Acetamidase
(amdS)-Gen mittels der PCR-Methode als BsiWI-Fragment isoliert und
in das mit BsiWI geschnittene Plasmid pPXT inseriert.
-
Für die Amplifizierung
des amdS-Gens wurden folgende Primer aus der Sequenzinformation
des A. nidulans-Acetamidase-Gens abgeleitet:
Seq. ID NO:15:
BsiWI-amdS-P: CTAGATCGTACGCCAGGACCGAGCAAGCCCAGATG
Seq. ID NO:16:
BsiWI-amdS-T: CTTACGTACGATCACATTTGAGATATAACCCATTTGGTGAG
-
Das
erhaltene Plasmid hat die Bezeichnung pPXT-amdS.
-
e) Konstruktion von pPXT-APG1-KexPGI
-
Das
Plasmid pAPGI-KexPGI wurde mit XbaI und SmaI geschnitten und die
Fusion APGI-KexPGI als XbaI-SmaI-Fragment in das mit SpeI und PmeI
geschnittene Plasmid pPXT-amdS eingefügt.
-
Das
entstandene Plasmid pPXT-APG1-KexPG1 enthält ein offenes Leseraster aus
der Xylanasesequenz und der Fusion APG1-KexPG1.
-
Das
Plasmid wurde durch Restriktionsendonucleasen kartiert und durch
Sequenzierung bestätigt.
Das Plasmid ist in 4 dargestellt und ist unter
der Hinterlegungsnummer DSM 18364 am 14.06.2006 hinterlegt worden.
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Beispiel 3: Konstruktion des Expressionsplasmids
pX-1APEsyn
-
Die
Konstruktion des Expressionsplasmids pX-1APEsyn erfolgt durch folgende
Schritte:
-
a) Konstruktion von pXylTxyI
-
Das
Plasmid pXylTxyI enthält
das 1,1.kb Xylanasegen (xyl) und das 2,6 kb Terminatorfragment des Xylanasegens.
-
Aus
dem Plasmid pXyl8/1 (Beispiel 2, b) wurde das N-terminale Xylanase
Gen mittels PCR amplifiziert. Folgende Primer wurden verwendet:
Seq.
ID NO:17 NXyl1 CCGAAGCTTGCGGCCGCACCAGCATTTAGCTTTCTTCAATCATC
Seq.
ID NO:18 Nxyl2 GCTCTAGAATGCCGGCACTTCGCGACACCAGAACAGGTTC
-
Das
PCR Produkt wurde mit HindIII und XbaI geschnitten und das mit HindIII
und XbaI geschnittene Plasmid pUC18 kloniert. Das entstandene Plasmid
hat die Bezeichnung pNXyl.
-
Aus
dem Plasmid pXyl8/1 (Beispiel 2, b) wurde das C-terminale Xylanase
Gen mittels PCR amplifiziert. Folgende Primer wurden verwendet:
Seq.
ID NO:19: CXyl1 CTAGCCGGCATTAACGCCGTGCAAAACTACAACGGCAACCTTG
Seq.
ID NO:20 Cxyl2 GCTCTAGAGGAGATCGTGACACTGGCGCTG
-
Das
PCR Produkt wurde mit NaeI und XbaI geschnitten und das mit NaeI
und XbaI geschnittene Plasmid pNXyl eingebaut. Das entstandene Plasmid
hat die Bezeichnung pXylA6. Das Xylanase Gen hat kein Stop-Codon
und die XbaI Schnittstelle ist unmittelbar stromabwärts der
Xylanase-DNA-Sequenz.
-
Die
XbaI Schnittstelle wurde danach zur SpeI-Schnittstelle mittels der
PCR Methode analog dem Prinzip, das in Nucleic Acids Research
1989, 17(2), 723–733 und Nucleic
Acids Research 1990, 18(6), 1656 beschrieben ist, geändert und
das entstandene Plasmid erhält
die Bezeichnung pXylA6-Spe.
-
Das
Plasmid pXylTxyI wurde durch Einfügen des 2.6 kb SmaI-EcoRI Terminatorfragments
in das mit SmaI und EcoRI geschnittene Plasmid pXylA6-Spe hergestellt.
-
Für die Amplifizierung
des Xylanase-Terminators wurden folgende Primer verwendet:
Seq.
ID NO:21 pp2a TTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAG
Seq. ID NO:22: TXyl
SmaI TAGCCCGGGATAAGTGCCTTGGTAGTC
-
In
dem entstandenen Plasmid pXylTxyI trägt das Xylanasegen vor dem
Startcodon und in 5'-Richtung bis
zur HindIII-NotI Schnittstelle nur noch 28 bp.
-
b) Konstruktion von pAPEsyn
-
Die
Fusion-Konstruktion aus der 2A-DNA-Sequenz (Beispiel 1, b) und dem
synthetischen A. niger Pectinmethylesterase (PEsyn)-Gen wurde unter
Verwendung des Codongebrauchs von Aspergillus (http://www.kazusa.or.jp/codon)
bei Entelechon (Germany) synthetisiert und in das Plasmid pUC18
kloniert. Der Sequenzvergleich des synthetischen PEsyn Gens mit
dem nativen A. niger PE Gen (Khanh et al., 1991, Gene 106,
71–77;
Accession Nr. X54145) zeigt eine Identität der Nucleotidsequenz
von 90% bzw. der Aminosäuresequenz
von 100%. In dieser Konstruktion ist das PEsyn-Gen mit seiner Signalsequenz
unmittelbar am 3'-Ende
der 2A-DNA-Sequenz zu einem offenem Leseraster fusioniert. Darüber hinaus
enthält
die Fusion eine XbaI-Schnittstelle unmittelbar stromaufwärts der
2A-DNA-Sequenz und
eine SmaI-Schnittstelle unmittelbar stromabwärts des PEsyn-Stopcodons. Das PEsyn
Gen ist somit am 3'-Ende
um vier Aminosäuren
(KRAS) verlängert.
Die Nucleotide Sequenz der Aminosäuren wurde so gewählt, dass
die Schnittsstelle NheI direkt nach der KR-Sequenz vorliegt.
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c) Konstruktion des Expressionsplasmids
pX-1APEsyn
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Das
Plasmid pAPEsyn wurde mit XbaI und SmaI geschnitten und die Fusion
A-PEsyn als XbaI-SmaI-Fragment
in das mit SpeI und SmaI geschnittene Plasmid pXylTxyI eingefügt.
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Das
entstandene Plasmid pX-1APEsyn enthält ein offenes Leseraster aus
der Xylanase- und der APEsyn-Sequenz.
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Das
Plasmid wurde durch Sequenzierung bestätigt. Das Plasmid ist in 5 dargestellt
und ist unter der Hinterlegungsnummer DSM 18365 am 14.06.2006 hinterlegt
worden.
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Beispiel 4: Konstruktion des Expressionsplasmids
pX-1APEnat
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Das
Plasmid p1APEnat trägt
die Fusion aus der 2A-DNA-Sequenz (Beispiel 1, b) und dem nativen
A. niger Pectinmethylesterase (PEnat)-Gen. Die Konstruktion erfolgte
durch Einfügen
des AccIII-PpuMI-Fragment aus dem Plasmid, das das native Gen enthält, in das
mit AccIII und PpuMI gespaltene Plasmid p1APEsyn. Die Konstruktion
wurde durch Kartierung und Sequenzierung bestätigt.
-
Die
Konstruktion sowie die Klonierung des Plasmids pX-1APEnat erfolgten
analog der in Beispiel 3 beschriebenen Herstellung des Plasmids
pX-1APEsyn.
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Das
Plasmid pX-1APEnat wurde durch Kartierung und Sequenzierung bestätigt und
ist in 6 dargestellt und ist unter der Hinterlegungsnummer
DSM 18366 am 14.06.2006 hinterlegt worden.
-
Beispiel 5: Konstruktion des Expressionsplasmids
pX-2APEsyn
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Das
Plasmid pX-2APEsyn enthält
die Fusion Xyl-2A-PEsyn-KexII-2A-PEnat.
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Zur
Konstruktion des Plasmids pX-2APEsyn wurde das XbaI-SmaI-Fragment
aus dem Plasmid p1APEnat in das mit NheI und SmaI geschnittene Plasmid
pX-1APEsyn eingebaut.
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Die
Konstruktion wurde durch Kartierung und Sequenzierung bestätigt und
ist in 7 dargestellt und ist unter der Hinterlegungsnummer
DSM 18367 am 14.06.2006 hinterlegt worden.
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Beispiel 6: Konstruktion des Expressionsplasmids
pX-2APEnat
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Das
Plasmid pX-2APEsyn enthält
die Fusion Xyl-2A-PEnat-KexII-2A-PEsyn.
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Zur
Konstruktion des Plasmids pX-2APEnat wurde das XbaI-SmaI-Fragment
aus dem Plasmid p1APEsyn in das mit NheI und SmaI geschnittene Plasmid
pX-1APEnat eingebaut.
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Die
Konstruktion wurde durch Kartierung und Sequenzierung bestätigt und
ist in 8 dargestellt und ist unter der Hinterlegungsnummer
DSM 18368 am 14.06.2006 hinterlegt worden
-
Beispiel 7: Transformation von Aspergillus
foetidus RH3911 und A. foetidus RH31260
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Die
Isolierung und Charakterisierung von niaD-Mutanten (A. foetidus
RH31260) aus dem Stamm A. foetidus RH3911 erfolgte nach der beschriebenen
Methode von Cove (1976, Heredity 36, 191–203)
-
Die
zur Transformation und zur Handhabung von Aspergillus verwendeten
Techniken waren die gemäß Yelton
et al (1984, PNAS 81, 1470–1474).
Die Transformation erfolgte nach folgendem Schema: Isolierung frischer
Sporen, Beimpfung eines geeigneten Mediums, Suspendierung von frischem
Myzel in geeignetem Medium und anschließende Gewinnung von Protoplasten
mittels Behandlung mit dem Enzympräparat (NovozymTM 234, β-Glucuronidase).
Die Transformation von Aspergillus-Protoplasten erfolgte mit der
DNA der Expressionskassette in Anwesenheit von CaCl2 und
Polyethylenglycol.
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Folgende
DNA Expressionkassetten wurden isoliert und zur Transformation verwendet:
- a) EcoRI-XbaI Fragment von pPgpd-Pyr-APG1
- b) NotI-Fragment von pPXT-APG1-KexPG1
- c) EcoRI-NotI Fragment von pX-1APEsyn
- d) EcoRI-NotI Fragment von pX-1APEnat
- e) EcoRI-NotI Fragment von pX-2APEsyn
- f) EcoRI-NotI Fragment von pX-2APEnat
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Die
Selektion von Aspergillus-Transformanten, die das NotI-Fragment
aus dem Plasmid pPXT-APGI-KexPGI enthalten, erfolgte auf amdS-Platten
(Tiburn et al. (1983, Gene 26, 205–221).
-
Die
Co-Transformation von DNA-Fragmenten isoliert aus den Plasmiden
pPgpd-Pyr-APGI, pX-1APEsyn,
pX-1APEnat, pX-2APEsyn und pX-2APEnat mit dem HindIII-MluI Fragment
(niaD Marker) aus dem Plasmid pSTA10 wurden auf Nitrat-Platte selektioniert
(Unkles et al, 1989, Gene 78, 157–166).
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Transformanten,
die die Expressionsvektoren tragen, wurden durch die qualitative
Bestimmung der Pektinmethylesterase bzw. Polygalakturonidase-Aktivität im Agar-Diffusionsverfahren
isoliert (Khanh et al., 1991, Gene 106, 71–77 und Ruttkowski
et al., 1991, Mol Microbiol 5 (6), 1353–1361)
-
Beispiel 8: Sekretion von Pektinmethylesterase
bzw. Polyglakturonidase in Schüttelkolben
-
Die
Transformanten wurden im Schüttelkolben
auf induzierendem Medium folgender Zusammensetzung gezüchtet:
Glucidex
1,7%, Glukose 1,15%, Maisquellpulver 1,4%, (NH4)2SO4 0,56%, KH2PO4 3%, Leitungswasser
Rest, Einstellung des pH-Werts vor der Sterilisation auf pH 4,5.
-
Die
nach 5-tägiger
Züchtung
erhaltenen Kulturfiltrate wurden für die SDS-PAGE-Analyse und zur Bestimmung
der Pektinaseaktivität
(Polygalacturonidase bzw. Pektinmethylesterase; vgl. Referenzbeispiele
1 und 2) verwendet. Das Ergebnis ist in Tabelle 1 dargestellt.
-
Die
Expressionskassetten mit den Polygalacturonidasegenen integrierten
willkürlich
im Genom, so dass die Ergebnisse auch die Anzahl der Genkopien wieder spiegeln
wie dies im Beispiel der Transformanten mit pPXT-APG1KexPG1 zu sehen
ist. Die beiden Beispiele zeigen, dass ein über eine 2A-selbstprozessierende
Stelle angebundenes zu sekretierendes Protein, sowohl im Fall der
Anbindung an ein intrazelluläres
Protein (PYR) als auch bei Anbindung an ein sekretiertes Protein
(Xylanase) als eigenständiges
Protein sekretiert wird. Die Unterschiede in der Expressionshöhe gehen
auch auf die verwendeten Promotoren (Pgpd und Pxyl) zurück. Dass
beide über
selbstprozessierende 2A-Schnittstellen angebundene Proteine sekretiert
werden belegt das nächste
Beispiel.
-
Bei
den Transformanten mit den Pektinmethylesterase-Expressionskassetten,
kann eine Transformante nur dann Pektinmethylesteraseaktivität zeigen,
wenn die Expressionskassette in-Frame in den Locus integriert. Dadurch
erhalten die Transformanten eine konstante Anzahl an Kopien und
die Höhe
der Pektinmethylesteraseaktivität
steht in direktem Zusammenhang mit der Kopienzahl der pme-Gene. Kassetten,
die an anderen Stellen im Genom integrieren oder nicht in-Frame integrieren,
können
keine mRNA für
das Konstrukt bilden, da sie keinen Promotor enthalten oder wegen
Frame-shifts das offene Leseraster für die Kassette nicht unter
der Kontrolle eines Promotors steht.
-
Der
Vergleich von pX-1APEsyn mit pX-1APEnat zeigt, dass beide Gene ca.
gleich gut exprimiert werden.
-
Der
Vergleich von pX-1APESyn, oder pX1-APEnat, mit pX-2APEsyn, oder
pX-2APEnat, zeigt,
dass im Fall der „2APE" Konstrukte beide
Gene zur Expressionshöhe
beitragen und damit, dass auch bei Expressionsvektoren mit mehreren
gekoppelten Genen („doppelte
Aktivität” im Kulturüberstand),
alle Proteine einzeln sekretiert werden. Dies ist nur möglich, wenn
im Fall der „2APE"-Konstrukte beide
2A-Stellen korrekt im Ribosom prozessiert werden. Die gefundenen
Variationen in der Aktivitätshöhe im Kulturüberstand
(Tab. 1) gehen auf Wachstumsunterschiede in den Schüttelkolben
zurück.
-
Diese
Ergebnisse zeigen auch, dass auf die Nutzung einer proteolytischen
Spaltstelle in Expressionskassetten mit mehreren Kopien einer DNA
die für
das gleiche Protein kodiert, verzichtet werden kann. Tab.: 1: Pektinmethylesterase und Polygalacturonidase-Produktion
durch Transformanten
| Transformant | Pektinaseaktivität | | |
| | [PGP
mg–1] | | |
| pPgpd-Pyr-APG1 | | | |
| RH31480 | 350 | | |
| RH31481 | 177 | | |
| RH31483 | 260 | | |
| pPXT-APG1KexPG1 | | | |
| RH31520 | 2.690 | | |
| RH31521 | 821 | | |
| RH31522 | 648 | | |
| RH31523 | 668 | | |
| RH31524 | 1.681 | | |
| RH31525 | 998 | | |
| RH31526 | 1.015 | | |
| RH31527 | 673 | | |
| pX-1APEsyn | | [PE
g–1] | |
| No.
6 | | 144 | |
| No.
11 | | 131 | |
| No.
53 | | 117 | |
| No.
66 | | 100 | |
| pX-1APEnat | | | |
| No.
51 | | 121 | |
| No.
52 | | 145 | |
| No.
163 | | 141 | |
| pX-2APEsyn | | | |
| No.
43-4 | | 302 | |
| No.
43-6 | | 334 | |
| No.
78-5 | | 349 | |
| No.
78-8 | | 359 | |
| pX-2APEnat | | | |
| No.
74-12 | | 350 | |
| No.
74-20 | | 390 | |
-
Beispiel 9: SDS-PAGE Analyse und N-terminale
Aminosäurebestimmung
-
Es
wurden die Kulturmedien der in Beispiel 7 hergestellten Transformanten
untersucht. Die Polygalacturonidase (PGI) im Kulturmedium wurde
durch SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen nach Laemmli (1970,
Nature 227, 680–685) charakterisiert.
-
Auf
dem SDS-PAGE-Gel sieht man in beiden Fällen für das PGI Protein nur je eine
Bande bei 55 kDa (1 und 2). Es erscheint
keine Bande bei dem möglichen „Fusionsprodukt" (XYL-2A-PGI mit
80 kDa). Zur Überprüfung wurden
auch N-terminale Sequenzierungen durchgeführt.
-
Im
Fall der Pektinmethylesterase (PME, 45 kDa) konnten auch keine Bande
für das „Fusionsprodukt" XYL-2A-PE mit 70
kDa gefunden werden.
-
Die
Ergebnisse der SDS-PAGE-Gel Analyse zeigen, dass entgegen der im
Stand der Technik berichteten Aussage (ca. ≥ 10% nicht prozessierte Volllängen-Proteinprodukte)
bei Verwendung der in den Beispielen genutzten 2A-Sequenz in filamentösen Pilzen,
keine nicht-prozessierten Volllängen-Proteinprodukte
auftreten. Weiterhin kann auch auf die Nutzung einer proteolytischen
Spaltstelle verzichtet werden.
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Für die N-terminale
Aminosäurebestimmung
wurden die Proteine nach der SDS-PAGE
auf eine PVDF-Membrane transferiert, die Proteinbande isoliert und
zur Aminosäurebestimmung
verwendet.
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Die
N-terminale Aminosäurebestimmung
wurde bei ChromaTec GmbH (Germany) durchgeführt.
-
Es
zeigte sich, dass sowohl das PME- als auch das PG1-Protein als korrekt
prozessierte, reife Proteine sekretiert werden (Tab.: 2). Die in
Tabelle 2 angegebenen Sequenzen entsprechen den bekannten N-Termini
der reifen Proteine von PME und PG1.
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Die 1 zeigt
die SDS-PAGE von Kulturüberständen aus
mit dem Plasmid pPgpd-Pyr-APG1 transformierten Stämmen. Wirtsstamm
(Gel 5), Markerproteine SDS-7, Sigma (Gel 4), die Stämme RH31480,
RH 31481 und RH31483 (Gele 1 bis 3).
-
Die
2 zeigt
die SDS-PAGE von Kulturüberständen aus
mit dem Plasmid pPXT-APG1KexPG1 transformierten Stämmen. Wirtsstamm
WT (Gel 1), Markerproteine Markerproteine SDS-7, Sigma (Gel 2),
die Stämme
RH31520 bis RH31527 (Gele 3 bis 10). Tab.: 2: N-terminale Aminosäurebestimmung
der Transformanten pPXT-APG1KexPG1
(RH31520) und pX-1APEsyn
| Transformant | N-terminale
Aminosäure |
| pPXT-APG1KexPG1
(RH31520) | ASTCT
FTSAS |
| pX-1APEsyn,
No. 6 | ASRMT
AP |
-
Es folgt ein
Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.
Dieses kann von der
amtlichen Veröffentlichungsplattform
des DPMA heruntergeladen werden.