WO2008012028A1 - Vektorkonstrukte und verfahren zur expression und sekretion von polypeptiden in filamentösen pilzen unter verwendung einer selbstprozessierenden 2a-spaltstelle - Google Patents

Vektorkonstrukte und verfahren zur expression und sekretion von polypeptiden in filamentösen pilzen unter verwendung einer selbstprozessierenden 2a-spaltstelle Download PDF

Info

Publication number
WO2008012028A1
WO2008012028A1 PCT/EP2007/006448 EP2007006448W WO2008012028A1 WO 2008012028 A1 WO2008012028 A1 WO 2008012028A1 EP 2007006448 W EP2007006448 W EP 2007006448W WO 2008012028 A1 WO2008012028 A1 WO 2008012028A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cleavage site
sequence
promoter
dna sequence
polypeptide
Prior art date
Application number
PCT/EP2007/006448
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Khanh Q Nguyen
Bruno Winter
Original Assignee
Ab Enzymes Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE200610052204 external-priority patent/DE102006052204A1/de
Application filed by Ab Enzymes Gmbh filed Critical Ab Enzymes Gmbh
Priority to US12/309,365 priority Critical patent/US20100178671A1/en
Priority to EP07765236A priority patent/EP2049659A1/de
Publication of WO2008012028A1 publication Critical patent/WO2008012028A1/de

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site

Definitions

  • Vector constructs and methods for expression and secretion of polypeptides in filamentous fungi using a self-processing 2A cleavage site are provided.
  • the invention relates to the use of a DNA sequence encoding a 2A cleavage site or a sequence derived therefrom for the production of an expression system for the expression and secretion of polypeptides in filamentous fungi.
  • the invention relates to vector constructs comprising a sequence encoding a self-processing 2A cleavage site or a sequence derived therefrom, as well as the use of these vector constructs for transforming host cells and producing polypeptides in filamentous fungi.
  • Filamentous fungi are often used for the production of enzymes but also of other proteins. To increase the secretion performance of these fungi, strong promoters or loci of well-secreted proteins have already been used. The use of self-processing sites was not recommended for filamentous fungi. wrote. In contrast, the use of proteolytically cleavable sites is limited to the use of secreted proteins as fusion partners.
  • filamentous fungi In general, it is difficult to increase the expression and secretion performance of filamentous fungi. Particular difficulties arise in this case by the following properties of filamentous fungi.
  • the expression level of proteins in filamentous fungi is broadly proportional to the number of gene copies for the protein to be expressed.
  • a proteolytic cleavage site such as KexII
  • the entire protein, consisting of n copies must fold and be proteolytically cleaved into single proteins only after folding.
  • problems here On the one hand, the total protein can not always be folded, on the other hand, the proteolytic cleavage site is not always accessible to the protease, so that cleavage into n single enzymes does not occur.
  • Heterologous proteins in particular prokaryotic proteins, are often secreted in filamentous fungi only in small amounts. There is no information on the suitability of viral proteins for secretion in filamentous fungi for industrially used fungi.
  • Kexll or similar proteolytic cleavage sites KexB from Aspergillus niger
  • secretion of the full-length fusion protein always occurs (Spencer et al., Eur J Biochem 1998, 258, 107-112). This then does not necessarily have the desired activity, or is even inactive.
  • the strain must have a protease that can cleave this site (Jalving et al., Appl. Environ., Microbiol., 2000, 66 (1), 363-368). Such is not present in all filamentous fungi.
  • the KexII or similar proteases do not always cleave the protein at the correct site, so that intramolecular cleavages can also occur. These cleavages also lead to inactive proteins.
  • the 2A construction does not require proteases, allowing the use of low-protease host strains for expression and secretion, thereby improving the stability of the desired target protein.
  • the method according to the invention or the systems according to the invention should be usable universally in filamentous fungi and should be easy to adapt to the respective problem with regard to the type, extent and ratio of protein production. Furthermore, the methods and systems according to the invention should also be suitable for the efficient transformation of protease-poor host strains.
  • the invention thus relates to vector constructs for the expression and secretion of polypeptides in filamentous fungi, comprising in functional 5'3 'direction - optionally a promoter, which may be preceded by an enhancer,
  • At least one DNA sequence coding for a first polypeptide which may or may not contain a signal sequence
  • DNA sequence encoding a 2A cleavage site or a sequence derived therefrom optionally together with a preceding DNA sequence encoding a proteolytic cleavage site or optionally a DNA sequence encoding a proteolytic cleavage site,
  • DNA sequence which encodes a third polypeptide with signal sequence optionally a further DNA sequence which codes for a 2A cleavage site or a sequence derived therefrom, optionally together with a prepositioned DNA sequence coding for a proteolytic cleavage site or optionally Sequence encoding a proteolytic cleavage site, optionally a DNA sequence encoding a fourth polypeptide having signal sequence, a terminator, wherein there is at least one 2A cleavage site or sequence derived therefrom in the construct.
  • the invention relates to host cells transformed with these vector constructs, to recombinant polypeptides produced therewith, and to a method for producing one or more polypeptides in a filamentous fungus, comprising the steps of i) transforming a host cell with a corresponding vector construct mentioned above, ii) cultivating the transformed Host cell of i) and the conditions suitable for the expression and secretion of the polypeptide (s), iii) isolating the polypeptide (s) thus expressed.
  • the invention further relates to the use of a DNA sequence encoding a 2A cleavage site or a sequence derived therefrom, optionally together with a prefixed DNA sequence encoding a proteolytic cleavage site, for the production of an expression system for the expression and secretion of polypeptides in filamentous fungi ,
  • the DNA sequence encoding a 2A cleavage site comprises the sequence of the 2A cleavage site of the foot and mouth disease virus (FMDV) with a terminal proline at the 3 'end.
  • FMDV foot and mouth disease virus
  • both homologous and heterologous as well as mixed homologous and heterologous polypeptides can be brought to expression and secretion.
  • the copy number of the gene (s) necessary for expression can be established by a few steps in the host organism.
  • the properties of loci of non-secreted proteins can be exploited to achieve controlled expression of the desired target protein.
  • a further advantage of the invention is that the naturally occurring gene in the host does not have to be switched off by the expression cassette according to the invention and that the use of protease-poor hosts is also possible.
  • Self-processing cleavage sites such as the 2A cleavage sites, or related sequences are known in the literature, for example, in Michelle LL Donnely et al., "Analysis of the aphthovirus 2A / 2B polyprotein .cleavage" mechanism does not indicate a proteolytic reaction, but a novel translational effect: a putative ribosomal skip ", Journal of General Virology (2001) 82, 1013-1025 It is known from this reference that the 2A region of the foot-and-mouth disease virus is very short and comprises about 19 amino acid residues It represents an autonomous element that catalyzes the "cleavage" at its own C-terminal end.
  • Sequence engineered expression systems can also be used to express normally non-secreted polypeptides.
  • the use of the 2A cleavage site in expression and secretion in filamentous fungi does not lead to the secretion of the full-length fusion protein consisting of the first polypeptide, the amino acid sequence of FIGS. Site, and the second polypeptide. Only the first and second polypeptides (and third polypeptide using two self-processing cleavage sites) with the correct N-terminal end of the mature protein in the culture fluid outside the filamentous fungal cell occur.
  • the desired proteins are self-contained units and, after isolation and purification from the culture fluid, can be delivered directly to a desired use or application.
  • proteins or polypeptides can be expressed and secreted in filamentous fungi, wherein the coding sequences for two or more proteins or polypeptides under the transcriptional control of the same promoter of a single vector in defined ratios, for example in the same Ratios to each other, wherein the cleavage of the proteins or polypeptides is mediated by the self-processing cleavage site.
  • the invention relates to vector constructs for the expression and secretion of two or more recombinant proteins or polypeptides in filamentous fungi which possess the same coding sequences or open reading frames (ORFs).
  • various polypeptides are expressed from a vector, the vector containing different open reading frames.
  • two coding sequences are expressed, the vector comprising in the 5'3 'direction: a promoter and optionally an enhancer in functional linkage to the signal sequence of the first coding sequence.
  • sequence for a first protein or polypeptide ORF a sequence encoding the self-processing 2A cleavage site, optionally in combination with a proteolytic cleavage site preceded by, followed by the coding sequence of the signal peptide of the second protein or polypeptide and the coding sequence for a second protein or polypeptide ORF followed by a terminator, wherein the sequence encoding the self-processing 2A cleavage site is inserted between the coding sequence of the first protein or polypeptide and the coding sequence of the signal peptide of the second protein or polypeptide.
  • the invention relates to a vector construct for the expression and secretion of one or more recombinant proteins or polypeptides, wherein the first protein or polypeptide is an intracellular protein - and thus has no signal peptide - and the second (and all subsequent) Protein or proteins or polypeptide or polypeptides secreted proteins, each bringing their own homologous or heterologous signal peptide.
  • the vector in the 5'3 'direction comprises: a promoter and optionally an enhancer in functional linkage to the first coding sequence of a first protein or polypeptide ORF ( intracellular protein), a sequence encoding a self-processing 2A cleavage site, the coding sequence of the signal peptide for the second protein or polypeptide, and the coding sequence for a second protein or polypeptide ORF followed by a terminator, the sequence comprising a self-processing 2A cleavage site, inserted between the coding sequence of the first protein or polypeptide and the coding sequence of the signal peptide of the second protein or polypeptide, and further inserted at equivalent sites in constructions with other polypeptides to be secreted, optionally with the self-processing 2A cleavage site with a lead combined proteolytic cleavage site.
  • a self-processing 2A cleavage site or a sequence derived therefrom is used.
  • examples include viral 2A sequences that may be derived from picornaviruses such as enteric, rhino, cardio, aphthous or foot and mouth viruses.
  • the self-processing cleavage site i. the 2A cleavage site is the expression product of a DNA sequence which encodes a self-processing cleavage site and which, in translation, permits intramolecular "(ice) cleavage" of the protein or polypeptide containing the cleavage site, so that two distinct independent ones Proteins or polypeptides are obtained.
  • the self-processing 2A cleavage site used in the vector construct according to the invention is particularly preferably the sequence coding for the self-processing 2A cleavage site from foot-and-mouth disease virus (FMDV).
  • FMDV2A is a polyprotein region which is typically 18 amino acids in length and additionally contains a proline at the C-terminal end and, for example, the sequence LLNFDLLKLAGDVESNPGP or the sequence
  • TLNFDLLKLAGDVESNPGP owns.
  • oligopeptides of proline length as low as 14 amino acid residues such as LLKLAGDVESNPGP, may also be used, as these also function to mediate the self-processing cleavage at the 2A-C terminus.
  • the invention preferably also includes a sequence derived from the self-processing 2A cleavage site. Any variants of the sequence can be used as long as they possess the self-processing properties of the 2A cleavage site. Exemplary variants are given in the above-mentioned reference Donnelly M. L. L. et al., 2001. Exemplary sequences which are preferably used according to the invention are given below: QCTNYALLKLAGDVESNPGP, EARHKQKIVAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP, APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP, TLNFDLLKLAGDVESNPGP,
  • the invention also encompasses variants of the 2A sequence of FMDV 1 obtained by addition, deletion and mutation of this sequence while retaining the self-processing property of this sequence.
  • the invention thus also relates to the use of nucleic acid sequence variants encoding a self-processing 2A cleavage site, as well as nucleic acid sequences encoding sequences that differ in one or more codons with respect to the native 2A nucleotide sequence.
  • 2A-like domains from picornaviruses, insect viruses, type C rotaviruses, trypanosomes, repeat sequences or the bacterium Thermatoga maritima can also be used.
  • sequences which have an identity of 80-99% to the self-processing 2A sequence from FMDV with the motif -DxExNPGP or -GxExNPGP, or to the sequence LLNFDLLKLAGDDVE / QS / J / FN / H / E / QPGP / A (x may be any amino acid).
  • sequence identity refers to amino acid sequence identity between two or more sequences compared using a sequence alignment program
  • % homology and “% identity” are used interchangeably herein to denote the degree of amino acid sequence identity between two or more compared sequences.
  • a sequence alignment for comparison may be performed using the local homology algorithm of Smith and Watherman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981) using the homology algorithm of Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1981). 1970), by the program of Pearson & Lipman, Proc Natl Acad., USA 85: 2444 (1988), using computerized implementations of these algorithms (GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Gene - Tics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.).
  • any DNA sequences which encode the abovementioned 2A sequences or variants thereof are used.
  • at least one further sequence which codes for a proteolytic cleavage site is used. Any proteolytic cleavage sites known in the art may be used herein. Preferred examples of this are the furin cleavage site with the consensus sequence RXK (R) R or LXK (R) R, which can be cleaved by endogenous subtilisin-like proteases, such as furin and other serine proteases.
  • FaktoMOa cleavage site the signal peptidase-1 cleavage site, the thrombin cleavage site or the KexII cleavage site. It is also possible to use sequences derived therefrom as described above in connection with the 2A cleavage site. Preferably, the KexII cleavage site is used.
  • a DNA sequence encoding a proteolytic cleavage site is used, it will be preceded by the DNA sequence encoding a 2A cleavage site or a sequence derived therefrom. "Precedent” here means that the DNA sequence encoding a proteolytic cleavage site precedes the 5 'end of the DNA sequence encoding a 2A cleavage site or a sequence derived therefrom.
  • the vector comprises a sequence containing the KexII cleavage site between the coding sequence for a first protein or polypeptide and the coding sequence for the 2A cleavage site with the following second protein or polypeptide.
  • the additional use of the proteolytic cleavage site is particularly useful if the C-terminal end of a protein is responsible for its function, and therefore the cleavage of the 2A sequence is necessary for the maintenance of the function.
  • both the sequence encoding the 2A cleavage site and the sequence encoding a proteolytic cleavage site may be in multiple copy.
  • Preferred constructs for this are: Enhancer-promoter-protein1-2A-Sig2-protein2 terminator
  • Enhancer-promoter-protein1-Kexll-2A-Sig2-protein2 terminator Enhancer-promoter-protein1-2A-Sig2-protein2-2A-Sig3-protein3-terminator
  • preferred constructs are those in which the parts enhancer-promoter (Sig1) -Protein1 are only partially present, so that even a targeted integration into a locus, preferably the locus of the proteini, can be done.
  • the length of the DNA of the enhancer-promoter (Sig1) protein part 1, measured from its C-terminal end, should be long enough for targeted in-frame integration into the locus of proteini.
  • the length of the DNA required for this can be 100 bp to several kbp, preferably still 0.3-3 kbp, more preferably 0.5-2 kbp, most preferably 0.7-1.5 kbp.
  • the genome completes the above listed constructs in vivo and results in the expression and secretion according to the invention the target proteins through the so transformed filamentous fungi.
  • the parts missing in the integration cassette, which are required for expression are supplemented in vivo.
  • the invention also relates to constructs in which in the abovementioned constructions protein 1 and the following proteins 2, etc. can be composed fusion proteins, as used, for example, for increasing the secretion efficiency of prokaryotic or animal proteins when expressed in filamentous fungi.
  • These fusion proteins may contain proteolytic cleavage sites to cleave off the portion of highly secreted host protein associated with the prokaryotic or animal protein after secretion or secretion.
  • the invention also relates to expression cassettes which can be used for introducing the open reading frame into a host cell. They preferably comprise a transcription initiation region operably linked to the open reading frame. Such an expression cassette may have a plurality of restriction sites for insertion of the open reading frame and / or other DNAs, e.g. A transcriptional regulatory region and / or selectable marker genes.
  • the transcriptional cassette in the 5 ' ⁇ 3' direction of transcription comprises a transcriptional and translational initiation region, the DNA sequence of interest, and a transcriptional and translational stop region that is functional in a microbial cell.
  • the termination region may be native to the transcription initiation region, may be native to the DNA sequence of interest, or may be derived from any other source.
  • transcriptional regulatory region encompasses core proteins that bind to a DNA response element and thereby transcriptionally regulate the expression of an associated gene or genes.Transcriptional regulatory proteins generally bind directly to DNA response elements. In some cases, binding to DNA may be indirectly affected by binding to another protein, which in turn binds to or is bound by a DNA response element
  • the vector constructs of the invention may comprise such regulatory elements.
  • ORF open reading frame
  • “Functional linkage” in the context of a nucleic acid refers to a compound as part of the same nucleic acid molecule in proper position and orientation for the transcription initiation of the promoter DNA in operable linkage to a promoter is under the transcriptional initiation regulation of the promoter may be operably linked to the regulatory sequence in sense or antisense orientation.
  • functional linkage means the compound as part of the same polypeptide, ie via peptidyl bonds.
  • Promoter usually refers to the nucleotide sequence upstream (5 ') with respect to the co-promoter. coding sequence and controls expression of the coding sequence by providing recognition for the RNA polymerase and other factors required for proper transcription.
  • the promoter used according to the invention may comprise a minimal promoter, ie a short DNA sequence from a TATA box and other sequences specifying the transcription start site, are added to the regulatory elements for controlling the expression.
  • the promoter optionally used according to the invention may also comprise a nucleotide sequence which comprises a minimal promoter and regulatory elements which can control the expression of a coding sequence or functional RNA.
  • This type of promoter sequence consists of proximal and distal upstream elements, the latter elements often being referred to as enhancers.
  • an enhancer is a DNA sequence that can stimulate promoter activity and may be an element inherent in the promoter or an inserted heterologous element to enhance the level of expression or cell specificity of a promoter. It can function in both orientations and can function even on upstream and downstream placement of the promoter. Both enhancers and other upstream promoter elements sequence-specifically bind DNA-binding proteins that mediate their effects.
  • Promoters may be derived in their entirety from a native gene, or may be composed of various elements derived from various naturally occurring promoters, or may even be composed of synthetic DNA segments.
  • a promoter may also contain DNA sequences that are involved in the binding of protein factors that control the efficiency of transcription initiation in response to physiological or developmental conditions.
  • TATA elements which are inactive or have greatly reduced promoter activity in the absence of upstream activation are termed minima-promoters or core promoters.
  • minima-promoters or core promoters In the presence of a suitable transcription factor or suitable transcription factors, the function of the minimal promoter is to enable transcription.
  • a minimal or core promoter thus consists only of all basic elements necessary for transcription initiation, e.g. As a TATA box and / or an initiator.
  • promoters which can be used according to the invention are promoters which are known to control expression in the eukaryotic cells. Any promoters capable of expression in filamentous fungi can be used. Examples are a promoter which is strongly induced by starch or cellulose, e.g. For example, a promoter for glucoamylase or ⁇ -amylase from the genus Aspergillus or cellulase (cellobiohydrolase) from the genus Trichoderma, a promoter for enzymes in the glycolytic pathway, such as phosphoglycerate kinase (PGK) and Glycerinalde- hyd-3-phosphate dehydrogenase (GPD ), etc.
  • Preferred is the cellobiohydrolase I, the cellobiohydrolase II, the amylase, the glucoamylase, the xylanase or the enolase promoter.
  • introns have been shown to have the potential to enhance transgene expression.
  • the expression cassette may include other elements, for example, those that may be regulated by endogenous or exogenous elements, such as zinc finger proteins, including naturally occurring zinc finger proteins or chimeric zinc finger proteins.
  • the invention also relates to the DNA-containing vectors according to the invention.
  • vectors include any plasmids, cosmids, phages and other vectors in double-stranded or single-stranded, linear or circular form, which may optionally be self-transmissable or mobilisable and which either prokaryotic or eukaryotic host can be transformed either by integration into the cellular genome or extrachromosomally present (eg, autonomously replicating plasmids with a replication origin).
  • Vectors, plasmids, cosmids, bacterial artificial chromosomes (BACs), and DNA segments for use in transforming cells generally include the expression cassettes of the invention to be introduced into the cells. These DNA constructs may further comprise structures such as promoters, enhancers, polylinkers or regulatory genes, as necessary.
  • One of the DNA segments or genes selected for cellular delivery suitably encodes / encodes a protein that is expressed in the transformed (recombinant) cells thus obtained, resulting in a screenable or selectable trait and / or conferring an improved phenotype to the transformed cell.
  • the construction of the vectors or vector constructs according to the invention is known to a person skilled in the art in light of the above disclosure and general knowledge (cf., for example, Sambrook et al., Molecular Congoing: A Laboratory Manual (2nd ed., Coldspring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY (1989).)
  • the expression cassette of the present invention may contain one or more restriction sites to place the polypeptide-encoding nucleotides under the regulation of a regulatory sequence
  • the expression cassette may be chimeric, ie, at least one of its components is heterologous with respect to at least one of the other components
  • the expression of the polynucleotides in the expression cassette may be performed under the control a constitutive promoter, an inducible promoter, a regulated promoter, a viral promoter or a synthetic promoter.
  • the vectors may already contain regulatory elements, e.g. Promoters, or the DNA sequences of the invention can be manipulated to contain such elements.
  • Suitable promoter elements that can be used are known in the art and are, for example, for trichoderma reesei the cbh 1 or the cbh-2 promoter, for Aspergillus oryzae the amy promoter, for Aspergillus n / gerder xyl-, glaA , alcA, aphA, tpiA, gpdA, sucl and pkiA promoters.
  • DNA which is suitable for introduction into cells can, in addition to the DNA according to the invention, also comprise DNA which has been derived from or isolated from any desired source.
  • An example of a deduced DNA is a DNA sequence which has been identified as a useful fragment in a given organism and which has then been chemically synthesized in substantially pure form.
  • An example of such a DNA is a suitable DNA sequence which has been obtained, for example, using restriction endonucleases, so that it can be further manipulated according to the invention, for example amplified.
  • DNA is commonly referred to as recombinant DNA.
  • a suitable DNA comprises fully synthetic DNA, semisynthetic DNA, DNA isolated from biological sources, and DNA derived from secreted RNA.
  • the introduced DNA is not an original part of the genotype of the recipient DNA, but according to the invention a gene from a given genotype can also be isolated and eventually altered and subsequently multiple copies of the gene can be introduced into the same genotype, e.g. For example, to increase the production of a given gene product.
  • the introduced DNA includes, without limitation, DNA from genes such as bacteria, yeasts, fungi or viruses.
  • the introduced DNA may comprise modified or synthetic genes, parts of genes or chimeric genes, including genes from the same or a different genotype.
  • the DNA used for the transformation according to the invention may be circular or linear, double-stranded or single-stranded.
  • the DNA is in the form of a chimeric DNA, such as plasmid DNA, which also contains coding regions flanked by regulatory sequences that aid in the expression of the recombinant DNA present in the transformed cell.
  • the DNA may itself contain or consist of a promoter that is active in a cell derived from a source other than the cell, or a promoter that is already in the cell, ie the target transformation cell , is available.
  • Fungal expression vectors may include a replication origin, a suitable promoter and enhancer, and also include any necessary ribosome binding sites, polyadenylation sites, splice donor and acceptor sites, transcription termination sequences, and non-transcribed 5 'flanking sequences.
  • Suitable host cells are: fungal cells of the genus Aspergillus, Rhizopus, Trichoderma, Neurospora, Mucor, Penicillium, etc.
  • Suitable host systems are, for example, fungi such as Aspergilli, z. Aspergillus niger (ATCC 9142) or Aspergillus ficuum (NRLL 3135) or Trichoderma (eg Trichoderma re see / QM6a).
  • Such microorganisms are well known and may be used by recognized depositories, e.g. For example, the American Type Culture Collection (ATCC), the Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) or the German Collection for Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) or any other depositories.
  • ATCC American Type Culture Collection
  • CBS Centraalbureau voor Schimmelcultures
  • DSMZ German Collection for Microorganisms and Cell Cultures GmbH
  • the expression cassette may contain, in the 5'-3 'direction of transcription, a transcriptional and translational initiation region of the polynucleotide of the present invention and a transcription and termination region that is functional in vivo or in vitro.
  • the termination region may be native to the transcription initiation region, or may be native or related to the polynucleotide. of their origin.
  • the regulatory sequences may be located upstream (5 'non-coding sequences), within (intron) or downstream (3' non-coding sequences) of a coding sequence, and associated with transcription, RNA processing or stability and / or translation influence the coding sequence.
  • Regulator sequences may include, without limitation, enhancers, promoters, repressor binding sites, translational leader sequences, introns, or polyadenylation signal sequences. They may include natural and synthetic sequences as well as sequences that are a combination of synthetic and natural sequences. 0
  • the vector construct of the invention may also comprise suitable sequences for amplification of expression.
  • the expression cassette of the invention may further contain enhancer elements or upstream promoter elements.
  • Vectors of the invention can be engineered to contain an enhancer element.
  • the constructs of the invention thus comprise the gene of interest together with a 3 'DNA sequence which acts as a signal to terminate transcription and allow polyadenylation of the mRNA thus obtained.
  • the preferred signal sequence is the signal gene of interest to the gene to be expressed, but it may also include the signal sequences of phytase or glucoamylase from Aspergillus niger, cellobiohydrolase Aspergillus oryzae or Trichoderma reesei xylanase, or fila-derived signal sequences derived therefrom - Mentösen mushrooms are used.
  • the signal sequence in the sequence coding for a first polypeptide may also be absent. This causes this polypeptide to remain intracellular.
  • the presence of the Signal sequence essential to secrete the corresponding polypeptide according to the invention is present when, for example, the locus of an intracellular protein is chosen as the target locus or when the first polypeptide serves to improve intracellular metabolic pathways.
  • the signal sequence may also be absent in another polypeptide, for example to produce a polypeptide which activates the promoter used and thus to further increase the expression and secretion of the desired polypeptide (s).
  • leader sequences can also be used since the DNA sequence between the transcription start site and the start of the coding sequence, i. the untranslated leader sequence can influence gene expression.
  • Preferred leader sequences include sequences that direct the optimal expression of the attached gene, i. they include a preferred consensus leader sequence that enhances or maintains mRNA stability and prevents inappropriate translation initiation. The choice of such sequences is well known to one skilled in the art.
  • a selectable or screenable marker gene can be incorporated into the expression cassette.
  • marker genes are well known to one skilled in the art.
  • the expression cassette or a vector construct containing the expression cassette is introduced into a host cell.
  • a variety of techniques are available and well known to those skilled in the art for introducing constructs into a host cell.
  • the transformation of fungi can be performed according to Penttila et al., Gene 61: 155-164, 1987.
  • the expression cassette or DNA sequence of the present invention can be inserted into vectors by methods known per se in order to overexpress the encoded polypeptide in suitable host systems.
  • DNA sequences may also be used as such to transform suitable host systems of the invention to achieve overexpression of the encoded polypeptide.
  • protein and polypeptide as used herein can be used interchangeably and typically refer to proteins and polypeptides of interest expressed using the vector constructs of the invention. Such proteins or peptides may be any protein or peptide useful for research, diagnostic, therapeutic, nutritional or technical applications.
  • proteins expressed and secreted according to the invention are food enzymes, such as, for example, polygalacturonidase, pectin methyl esterase, xylogalacturonoidase, rhamnogalacturonidase, arabinofuranosidase, arabanase, amylase, phytase, xylanase, cellulase, protease, mannanase, transglutaminase etc., animal feed enzymes such as for example, phytase, xylanase, endoglucanase, mannase and protease, as well as technical enzymes such as, for example, cellularases, proteases, amylases, laccases, oxidoreductases etc.
  • food enzymes such as, for example, polygalacturonidase, pectin methyl esterase, xylogalacturonoidase, rhamnogalacturonidase,
  • the transformed filamentous fungi are grown under standard conditions for the expression and secretion of proteins.
  • the fungi are cultivated on agar plates, and a spore suspension or a mycelium suspension is used as inoculum for a submerged or surface fermentation.
  • the fermentation is carried out on media containing the necessary C and N sources as well as trace elements and mineral salts.
  • the medium should contain the inducers or their precursors.
  • the fermentation is carried out under the control of temperature and pH and other fermentation conditions such as redox potential, partial oxygen content, etc. Also, a controlled management of other C and N sources, and other media components can be done (fed-batch method).
  • constructs according to the invention improved expression and secretion levels of heterologous polypeptides can be achieved. Furthermore, several polypeptides can be produced simultaneously in defined proportions to each other.
  • the constructs according to the invention allow the use of loci of highly expressed intracellular as well as extracellular proteins for the secretion of the target protein, without disturbing the production of the intracellular or extracellular protein. This is not possible with the use of proteolytic cleavage sites in conjunction with intracellular proteins.
  • the self-processing 2A cleavage site unlike expressions with proteolytic cleavage sites, expression of the full-length fusion protein does not occur and the two or more polypeptides always have the correct N-terminal sequence.
  • Fig. 1 SDS gel electrophoresis of pPgpd-Pyr-APG1 transformants depicting the SDS-PAGE of culture supernatants from the plasmid pPgpd-Pyr-APG1 (see Fig. 3) transformed strains: Transformant RH31480 (Gel 1), RH31481 (Gel 2 ), RH31483 (gel 3), marker protein SDS-7, sigma (gel 4), A. foetidus RH31337 (gel 5) Fig.
  • Fig. 3 Plasmid map of pPgpd-Pyr-APG1
  • Fig. 4 Plasmid map of pPXT-APG1-KexPG1
  • Fig. 5 Plasmid map of pX-1APEsyn
  • Fig. 6 Plasmid map of pX-1APEnate
  • Fig. 7 Plasmid map of pX-2APEsyn
  • Fig. 8 Plasmid map of pX-2APEnate
  • the polygalacturonidase activity is defined as the release of 1 ⁇ mol of galactose reduction equivalents per minute under standard conditions and is determined by a two-step procedure. First, incubate the enzyme (100 ⁇ l) for 10 min at 40 ° C. mixed with 250 ⁇ l potassium pectate solution (0.7%) at pH 3.9. The enzyme solution is diluted before use with 0.1 M Na acetate buffer, pH 3.9.
  • the released reducing ends are determined photometrically.
  • 650 .mu.l PAHBAH reagent solution (0.5% p-hydroxybenzoic acid hydrazide [PAHBAH] and 0.475% Titriplex IN) are added and the mixture incubated for 15 min at 80 0 C.
  • the color development is determined by chilled in an ice bath and the color measured at 412 nm against a blank value. At the blank value, the enzyme solution and the dye solution are added in reverse order, since the dye solution inhibits the enzyme reaction.
  • the calibration of the measuring method is done with galactose.
  • PE g '1 is defined as the amount of enzyme per minute 1 ⁇ val acid under the stated conditions (30 0 C, 0.49% citrus pectin [Co hagen pectin X-2955], pH 4.5) releases.
  • the construction of the expression plasmid pPgpd-Pyr-APG1 is carried out by the following steps:
  • the chromosomal DNA was isolated from A. foetidus RH3911 according to a protocol of Hynes et al (1983, Mol. Cell. Biol. 3: 1430-1439).
  • the pyrA gene was amplified by PCR.
  • the following primers were derived from the sequence information of the A. niger pyrA gene (van den Hombergh et al., 1996, unpublished, Accession X96734):
  • the PCR product was cut with EcoRI and SmaI and cloned into the plasmid pUC18.
  • the resulting plasmid was called pPyrA.
  • Amplification of the Tpyr terminator sequence was performed by PCR with the following primers:
  • TpyrXbaSma GCTCTAGATAATCCCCCGGGTAGGTACTATAAAAGGAGGATCGAAG Seq. ID NO: 4 TpyrNotNde: GGAATTCCATATGGCGGCCGCCTATTTACCGGATGGCAATGGCGCCAG
  • the PCR product was cut with XbaI and Ndel and cloned into the XbaI and Ndel-cut plasmid pPyrA.
  • the resulting plasmid was named pPyrAT.
  • the stop-codon pyrA gene contains the XbaI site immediately downstream of the pyrA sequence.
  • the 2A DNA sequence (Donnelly et al., 2001, J. Gen. Virology 82, 1027-1041) was synthesized using the codon usage of Aspergillus (http://www.kazusa.or.jp/codon).
  • the chromosomal polygalacturonidase (pgl) gene was isolated from A. niger RH3544 and cloned into pUC18. The resulting plasmid was named p27 / 1.
  • the sequence comparison of the pgl gene from A. niger RH3544 with the pgal gene Gene from A. niger N400 (Bussink et al., 1991, Curr. Genet 20 (4), 301-307, Accession No. X58892) showed 92% nucleotide sequence identity and 98% amino acid sequence, respectively.
  • the fusion 2A-pgl DNA sequence was synthesized, in which the pgl DNA is fused with its signal sequence in-frame at the 3 ' end of the 2A sequence.
  • This fused DNA fragment contains the open reading frame of 2A-pgl DNA and additionally the XbaI site immediately upstream of the 2A sequence.
  • the synthetic fragment was cloned into pUC18 and the resulting plasmid was named p2APGImodif.
  • the construction of the plasmid p2APGInativ was carried out by inserting the Stul-Tth 1111 fragment of the native pgrl DNA sequence into the plasmid p2APGImodif cleaved with Stul-Tth111 l.
  • the 1APGI sequence was amplified by PCR from the plasmid p2APGInativ. The amplification was carried out with the following primers:
  • Seq. ID NO: 7 ppla GTGCTGCAAGGCGATTAAGTTG
  • Seq. ID NO: 8 PGI-SmaINhel TCCCCCGGGTTAGCAGCTAGCACCGGAAGGAACGTTCTCGCAGTC
  • the PCR product was cut with HindIII and SmaI and cloned into the HindIII and SmaI cut plasmid pUC18.
  • plAPGI contains the pgl DNA with its signal sequence in-frame at the 3 ' end of the 2A sequence.
  • This fused DNA fragment contains the open reading frame of 2A-pgl DNA and additionally the XbaI site immediately upstream of the 2A sequence and the SmaI site downstream of the pgl gene.
  • pPyr-APGI pPyr-APGI
  • the plasmid pILAPI was cut with XbaI and SmaI and the resulting fragment APGI was inserted into the XbaI and SmaI cleavage sites in the plasmid pPyrAT. This resulted in an open reading frame from the pyrA and APGI sequence.
  • the Pyr-APG1 sequence was isolated from the plasmid pPy ⁇ -APG1 with the primers
  • the PCR product was cut with BspHI and the resulting fragment cloned into the NcoI-cut plasmid pAN52-1 (Punte et al., 1987, Gene 56, 117-124, Accession No. Z32697).
  • the resulting plasmid is named pPgpd-Pyr-APGI and contains the fusion of pyrA and APGI sequence under the control of the A. ⁇ / du / ans gpd promoter.
  • the plasmid was mapped by restriction endonucleases and confirmed by sequencing.
  • the plasmid is shown in Fig. 3 and has been deposited under the accession number DSM 18363 on 14.06.2006.
  • the KexPGI sequence containing the KexII sequence (LysArg) immediately upstream of the mature pgrl gene was amplified by PCR from the plasmid pKR-1APGI. The amplification was carried out with the following primers:
  • Seq. ID NO: 11 Spel-PGI GACTAGTTGCAAGCGCTCCCGCTCCTTCTCGCGTCTCTGAG Seq. ID NO: 12: NcoI PGI ACAGCGCCGTCGGCCATGGTGACAGTCAG
  • the PCR product was cut with Spei and Ncol and cloned into the Spei and Ncol cut plasmid pKR-1APGI.
  • the plasmid pKR-1APGI was previously prepared from the plasmid pIAPGI by PCR and contains the KexII sequence (LysArg) immediately upstream of the APGI gene.
  • the amplification was carried out with the following primers:
  • Seq. ID NO: 14 HindSpel CCCAAGCTTACTAGTTGCAAGCCAGTGCACCAACTACGCCCTGCTCA
  • the PCR product was cut with HindIII and SmaI and the HindIII and SmaI cut plasmid pUC18 was cloned.
  • the plasmid pKexPGI was cut with Spei and EcoRI and the Kex PGI cloned as Spel-EcoRI DNA fragment into the Nhel and EcoRI cut plasmid plAPGI.
  • pAPG1-KexPGI contains an open reading frame from the APG1 sequence and the mature PG1 sequence fused by a KexII site.
  • the chromosomal DNA was prepared from A. foetidus RH3911 according to a protocol of Hynes et al. (1983, Mol. Cell. Biol. 3, 1430-1439).
  • the xylanase (xy /) gene was isolated as a 4.5 kb EcoRI fragment and cloned into pUC18.
  • the resulting plasmid was named pXyl8 / 1.
  • the DNA sequence and deduced amino acid sequence shows 98% identity with the A./cawacM-xylanase gene sequences (Ito et al., 1992, Biosci Biotechnol. Biochem. 56 (8), 1338-1340, Accession-No D14848).
  • the plasmid pPXT is derived from the plasmid pXyl8 / 1 by inserting additional NotI interfaces into the two EcoRI sites as well as a multicloning site containing the SpeI and Pmel interfaces immediately upstream of the xylanase stop codon.
  • the acetamidase (amdS) gene was amplified by PCR Method isolated as BsiWI fragment and inserted into the BsiWI-cut plasmid pPXT.
  • the following primers were derived from the sequence information of the A. nidulans acetamidase gene:
  • the resulting plasmid has the name pPXT-amdS.
  • the plasmid pAPGI-KexPGI was cut with XbaI and SmaI and the fusion APGI-KexPGI as XbaI-SmaI fragment inserted into the SpeI and Pmel cut plasmid pPXT-amdS.
  • the resulting plasmid p PXT-APG 1-KexPG1 contains an open reading frame from the xylanase sequence and the fusion APG1-KexPG1.
  • the plasmid was mapped by restriction endonucleases and confirmed by sequencing.
  • the plasmid is shown in Fig. 4 and has been deposited under the accession number DSM 18364 on 14.06.2006.
  • the construction of the expression plasmid pX-1APEsyn is carried out by the following steps:
  • the plasmid pXylTxyl contains the 1, 1.kb xylanase gene (xyl) and the 2.6 kb terminator fragment of the xylanase gene.
  • the PCR product was cut with HindIII and XbaI and the HindIII and XbaI cut plasmid pUC18 was cloned.
  • the resulting plasmid has the name pNXyl.
  • the C-terminal xylanase gene was amplified by PCR. The following primers were used:
  • the PCR product was cut with Nael and XbaI and the Nael and XbaI cut plasmid pNXyl was incorporated.
  • the resulting plasmid has the name pXylA ⁇ .
  • the xylanase gene has no stop codon and the XbaI site is immediately downstream of the xylanase DNA sequence.
  • the XbaI site was then changed to the Spel site by the PCR method analogous to the principle described in Nucleic Acids Research 1989, 17 (2), 723-733 and Nucleic Acids Research 1990, 18 (6), 1656, and the resulting plasmid receives the name pXylA6-Spe.
  • the plasmid pXylTxyl was prepared by inserting the 2.6 kb SmaI-EcoRI terminator fragment into the Smal and EcoRI-cut plasmid pXylA6-Spe.
  • Seq. ID NO: 22 TXyI Smal TAGCCCGGGATAAGTGCCTTGGTAGTC
  • the fusion construction from the 2A DNA sequence (Example 1, b) and the synthetic A. niger pectin methyl esterase (PEsyn) gene was performed using the codon usage of Aspergillus (http://www.kazusa.or.jp/codon ) was synthesized at Entelechon (Germany) and cloned into the plasmid pUC18.
  • the sequence comparison of the synthetic PEsyn gene with the native A. niger PE gene shows an identity of the nucleotide sequence of 90% and the amino acid sequence of 100, respectively %.
  • the PEsyn gene with its signal sequence is fused immediately at the 3 ' end of the 2A DNA sequence into an open reading frame.
  • the fusion contains an XbaI site immediately upstream of the 2A DNA sequence and a SmaI site immediately downstream of the PEsyn stop codon.
  • the PEsyn gene is thus extended at the 3 'end by four amino acids (KRAS).
  • KRAS four amino acids
  • the plasmid pAPEsyn was cut with XbaI and SmaI and the fusion A-PEsyn as XbaI-SmaI fragment inserted into the Spei and SmaI cut plasmid pXylTxyl.
  • the resulting plasmid pX-1APEsyn contains an open reading frame from the xylanase and the APEsyn sequence.
  • the plasmid was confirmed by sequencing.
  • the plasmid is shown in Fig. 5 and has been deposited under the accession number DSM 18365 on 14.06.2006.
  • Example 4 Construction of the expression plasmid pX-1APEnat
  • the plasmid pAPEnat carries the fusion of the 2A DNA sequence (Example 1, b) and the native A. niger pectin methyl esterase (PEnat) gene. Construction was performed by inserting the AccIII-PpuMI fragment from the plasmid containing the native gene into the Acclll and PpuMI-digested plasmid plAPEsyn. The construction was confirmed by mapping and sequencing.
  • the plasmid pX-1APEnat was confirmed by mapping and sequencing and is shown in Figure 6 and has been deposited under the accession number DSM 18366 on June 14, 2006.
  • the plasmid pX-2APEsyn contains the fusion xyl-2A-PEsyn-Kexll-2A-PEnat.
  • the XbaI-SmaI fragment from the plasmid pAPEnat was inserted into the plasmid pX-lAPEsyn cut with Nhel and SmaI.
  • the plasmid pX-2APEsyn contains the fusion xyl-2A-PEnat-Kexll-2A-PEsyn.
  • the XbaI-SmaI fragment from the plasmid plAPEsyn was inserted into the plasmid pX-ILAPEnate cleaved with NheI and SmaI.
  • n / aD mutants (A. foetidus RH31260) from strain A. foetidus RH3911 was carried out according to the method described by Cove (1976, Heredity 36, 191-203).
  • Transformants carrying the expression vectors were isolated by the qualitative determination of pectin methyl esterase or polygalacturonidase activity in the A diff diffusion method (Khanh et al., 1991, Gene 106, 71-77 and Ruttkowski et al., 1991, Mol Microbiol 5 (6), 1353-1361)
  • Example 8 Secretion of pectin methylesterase or polyglacturonidase in shake flasks
  • the transformants were grown in the shake flask on inducing medium of the following composition:
  • Glucidex 1 7%, glucose 1, 15%, corn steep liquor 1, 4%, (NhU) 2 SO 4 0.56%, KH 2 PO 4 3%, tap water remainder, adjustment of pH before sterilization to pH 4 ; 5.
  • the culture filtrates obtained after culturing for 5 days were used for SDS-PAGE analysis and determination of pectinase activity (polygalacturonidase and pectin methyl esterase, respectively, refer to Reference Examples 1 and 2). The result is shown in Table 1.
  • the expression cassettes with the polygalacturonidase genes are integrated randomly in the genome, so that the results also reflect the number of gene copies. reflect as seen in the example of the transformants with pPXT-APG1 KexPG1.
  • the two examples show that a protein to be secreted via a 2A self-processing site is secreted as an independent protein, both in the case of binding to an intracellular protein (PYR) and when bound to a secreted protein (xylanase). The differences in the level of expression are also due to the promoters used (Pgpd and Pxyl).
  • the next example demonstrates that both proteins are secreted via self-processing 2A-linked proteins.
  • a transformant can only show pectin methylesterase activity if the expression cassette integrates into the locus in-frame. This gives the transformants a constant number of copies and the level of pectin methylesterase activity is directly related to the copy number of the pme genes.
  • Cassettes that integrate elsewhere in the genome or do not integrate into frame can not form mRNA for the construct because they contain no promoter or because of frame shifts the open reading frame for the cassette is not under the control of a promoter.
  • the culture media of the transformants prepared in Example 7 were investigated.
  • the polygalacturonidase (PGI) in the culture medium was characterized by SDS-PAGE under reducing conditions according to Laemmli (1970, Nature 227, 680-685).
  • N-terminal amino acid determination the proteins were transferred to a PVDF membrane after SDS-PAGE, the protein band was isolated and used for amino acid determination.
  • the N-terminal amino acid determination was carried out at ChromaTec GmbH (Germany).
  • FIG. 1 shows the SDS-PAGE of culture supernatants from strains transformed with the plasmid pPgpd-Pyr-APG1.
  • Host strain (gel 5), marker proteins SDS-7, sigma (gel 4), strains RH31480, RH 31481 and RH31483 (gels 1 to 3).
  • Figure 2 shows the SDS-PAGE of culture supernatants from strains transformed with the plasmid p PXT-APG 1 KexPG1.
  • Host strain WT (gel 1), marker proteins marker proteins SDS-7, sigma (gel 2), strains RH31520 to RH31527 (gels 3 to 10).

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Vektorkonstrukt zur Expression und Sekretion von Polypeptiden in filamentösen Pilzen, umfassend in 5'3'-Richtung in funktioneller Verknüpfung - gegebenenfalls einen Promotor, dem ein Enhancer vorangestellt sein kann, mindestens eine ein erstes Polypeptid codierende DNA-Sequenz, die eine Signalsequenz enthalten kann oder nicht, - gegebenenfalls eine DNA-Sequenz, die eine 2A-Spaltstelle oder eine davon abgeleitete Sequenz codiert, gegebenenfalls zusammen mit einer vorangestellten eine proteolytische Spaltstelle codierenden DNA- Sequenz oder gegebenenfalls eine DNA-Sequenz, die eine proteolytische Spaltstelle codiert, - eine ein zweites Polypeptid mit Signalsequenz codierende DNA- Sequenz, gegebenenfalls eine weitere DNA-Sequenz, die eine 2A-Spaltstelle oder eine davon abgeleitete Sequenz codiert, gegebenenfalls zusammen mit einer vorangestellten eine proteolytische Spaltstelle codierenden DNA-Sequenz oder gegebenenfalls eine DNA-Sequenz, die eine proteolytische Spaltstelle codiert, - gegebenenfalls eine ein drittes Polypeptid mit Signalsequenz codierende DNA-Sequenz, gegebenenfalls eine weitere DNA-Sequenz, die eine 2A-Spaltstelle oder eine davon abgeleitete Sequenz codiert, gegebenenfalls zusammen mit einer vorangestellten eine proteolytische Spaltstelle codierenden DNA-Sequenz oder gegebenenfalls eine DNA-Sequenz, die eine proteolytische Spaltstelle codiert, gegebenenfalls eine ein viertes Polypeptid mit Signalsequenz codierende DNA-Sequenz, einen Terminator, wobei in dem Konstrukt mindestens eine 2A-Spaltstelle oder eine davon abgeleitete Sequenz vorhanden ist.

Description

Vektorkonstrukte und Verfahren zur Expression und Sekretion von Polypeptiden in filamentösen Pilzen unter Verwendung einer selbstprozessierenden 2A-Spaltstelle
Die Erfindung betrifft die Verwendung einer DNA-Sequenz, die eine 2A-Spaltstelle oder eine davon abgeleitete Sequenz codiert, zur Herstellung eines Expressionssystems zur Expression und Sekretion von Polypeptiden in filamentösen Pilzen. Insbesondere betrifft die Erfindung Vektorkonstrukte, die eine Sequenz, die eine selbstprozessierende 2A-Spaltstelle oder eine davon abgeleitete Sequenz codiert, umfassen, sowie die Verwendung dieser Vektorkonstrukte zur Transformation von Wirtszellen und zur Produktion von Polypeptiden in filamentösen Pilzen.
Zur industriellen Produktion von Enzymen aber auch von anderen Proteinen werden Stämme mit hohen Sekretionsleistungen benötigt. Die Sekretionshöhe korreliert dabei meist direkt mit der Kopienzahl des zu exprimierenden Gens. Um die Sekretionsleistung von derartigen Stämmen zu erhöhen, wurden Verfahren entwickelt, die die Gene unter die Kontrolle starker Promotoren stellen (zum Beispiel TAKA-α-Amylase-Promotor aus A. oryzae oder A. niger, A. n/ger-Glucoamylase- Promotor, vgl. EP 0 489 719) oder Loci gut sekretierter Proteine wurden verwendet (vgl. EP 0 357 127). Ferner wurden Fusionsproteine konstruiert, bei denen zur Trennung der zwei oder mehreren Proteine proteolytisch spaltbare Stellen, wie zum Beispiel Kexll, verwendet wurden (vgl. zum Beispiel WO 1990/015860).
Filamentöse Pilze werden häufig zur Herstellung von Enzymen aber auch von anderen Proteinen verwendet. Zur Erhöhung der Sekretionsleistung dieser Pilze wurden bereits starke Promotoren oder Loci gut sekretierter Proteine verwendet. Die Nutzung selbstprozessierender Stellen wurde für filamentöse Pilze nicht be- schrieben. Im Gegensatz dazu ist die Nutzung von proteolytisch spaltbaren Stellen auf die Nutzung von sekretierten Proteinen als Fusionspartner beschränkt.
Generell ist es schwierig, die Expressions- und Sekretionsleistung filamentöser Pilze zu erhöhen. Besondere Schwierigkeiten ergeben sich hierbei durch folgende Eigenschaften filamentöser Pilze. Die Expressionshöhe von Proteinen ist bei filamentösen Pilzen über weite Bereiche proportional zur Anzahl der Genkopien für das zu exprimierende Protein. Bei den bisherigen Verfahren, z.B. mit einer proteolytischen Schnittstelle wie Kexll, muß sich das gesamte Protein, bestehend aus n Kopien, falten und wird erst nach der Faltung proteolytisch in n Einzelproteine gespalten. Hierbei gibt es mehrere Probleme. Zum einen lässt sich das Gesamtprotein nicht immer falten, zum anderen ist die proteolytische Schnittstelle nicht immer für die Protease erreichbar, so dass es nicht zu der Spaltung in n Einzelenzyme kommt. Weiterhin ist auch die Anzahl der Loci mit guten Ableseeigenschaf- ten in einem Stamm begrenzt, so dass eine random Integration von weiteren Genkopien nicht effizient ist. Heterologe Proteine, insbesondere prokaryontische Proteine, werden in filamentösen Pilzen häufig nur in geringen Mengen sezerniert. Zu der Eignung von viralen Proteinen bzgl. der Sezernierung in filamentösen Pilzen liegen keine Angaben zu industriell genutzten Pilzen vor. In der Literatur zi- tierte Beispiele zur Nutzung von selbstprozessierenden Spaltstellen zeigten deren Nutzung meist nur in „in-vitro" Systemen, wobei der Nachweis der Produkte mittels hochsensitiver Methoden erfolgte. Auch eine Fehllenkung des C-terminal an die selbstprozessierende Spaltstelle angehängten Proteins mit einer Signalsequenz wird berichtet. Auch ist die berichtete funktionelle Wahrscheinlichkeit, dass die Spaltung an der selbstprozessierenden Spaltstelle auftritt (76-88%) für einen industriellen Prozess zu gering. Eine erfolgreiche Nutzung zur Produktion großer Proteinmengen in industriellen Pilzen war daher nicht absehbar.
Bei der Nutzung der Kexll oder ähnlicher proteolytischer Spaltstellen (KexB aus Aspergillus niger) kommt es immer auch zur Sekretion des Volllängen- Fusionsproteins (Spencer et al., Eur J Biochem 1998, 258, 107-112). Dieses hat dann nicht unbedingt die gewünschte Aktivität, oder ist sogar inaktiv. Zur Spal- tung der Kexll Stelle muss der Stamm eine Protease besitzen, die diese Stelle spalten kann (Jalving et al., Appl. Environ. Microbiol. 2000, 66 (1), 363-368). Eine solche ist nicht bei allen filamentösen Pilzen vorhanden. Weiterhin spalten die Kexll oder ähnliche Proteasen das Protein nicht immer an der korrekten Stelle, so dass auch intramolekulare Spaltungen auftreten können. Diese Spaltungen führen auch zu inaktiven Proteinen. Die 2A-Konstruktion kommt ohne Proteasen aus und ermöglicht so die Nutzung von proteasearmen Wirtsstämmen für die Expression und Sekretion wodurch die Stabilität des gewünschten Zielproteins verbessert wird.
Es besteht somit ein Bedarf nach Verfahren, mit denen die Expression- und Sekretionsleistung filamentöser Pilze effizient erhöht werden kann.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, Systeme und Ver- fahren bereitzustellen, mit denen die Expressions- und Sekretionsleistung filamentöser Pilze, bezogen auf homologe und heterologe Proteine, erhöht werden kann. Ferner soll erfindungsgemäß die Expression und Sekretion homologer und hetero- loger Proteine durch filamentöse Pilze in hoher Ausbeute und hoher Reinheit bereitgestellt werden. Ferner soll die für eine hohe Expression in filamentösen Pilzen notwendige Genkopienzahl durch wenige Schritte einfach und kostengünstig in den Wirtsorganismus zu etablieren sein. Das erfindungsgemäße Verfahren bzw. die erfindungsgemäßen Systeme sollen universell in filamentösen Pilzen verwendbar sein und sollen sich leicht der jeweiligen Problemstellung bezüglich Art, Umfang und Verhältnis der Proteinproduktion anpassen lassen. Ferner sollen sich die erfindungsgemäßen Verfahren und Systeme auch zur effizienten Transformation von proteasearmen Wirtsstämmen eignen.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass durch die Verwendung einer Sequenz, die eine 2A-Spaltstelle oder eine davon abgeleitete Sequenz codiert, gegebenenfalls zusammen mit einer eine proteolytische Spaltstelle codierenden Sequenz, Vektorkonstrukte bzw. Expressionssysteme erhalten werden können, die sich vorteilhaft zur Expression und Sekretion homologer und heterologer PoIy- peptide in filamentösen Pilzen eignen. Überraschenderweise wurde bei der Anwendung der 2A-Spaltstelle in filamentösen Pilzen gefunden, dass nur das C- und das N-terminale Protein zur 2A-Stelle sekretiert werden, sofern beide zugehörigen Gene eine Signalsequenz tragen, jedoch kein Polypeptid, das dem Volllängen- Fusionsprotein entspricht.
Die Erfindung betrifft somit Vektorkonstrukte zur Expression und Sekretion von Polypeptiden in filamentösen Pilzen, umfassend in 5'3'-Richtung in funktioneller Verknüpfung - gegebenenfalls einen Promotor, dem ein Enhancer vorangestellt sein kann,
- mindestens eine ein erstes Polypeptid codierende DNA-Sequenz, die eine Signalsequenz enthalten kann oder nicht,
- gegebenenfalls eine DNA-Sequenz, die eine 2A-Spaltstelle oder eine davon abgeleitete Sequenz codiert, gegebenenfalls zusammen mit einer vorange- stellten eine proteolytische Spaltstelle codierenden DNA-Sequenz oder gegebenenfalls eine DNA-Sequenz, die eine proteolytische Spaltstelle codiert,
- eine ein zweites Polypeptid mit Signalsequenz codierende DNA-Sequenz,
- gegebenenfalls eine weitere DNA-Sequenz, die eine 2A-Spaltstelle oder eine davon abgeleitete Sequenz codiert, gegebenenfalls zusammen mit einer vorangestellten eine proteolytische Spaltstelle codierenden DNA-Sequenz oder gegebenenfalls eine DNA-Sequenz, die eine proteolytische Spaltstelle codiert,
- gegebenenfalls eine ein drittes Polypeptid mit Signalsequenz codierende DNA-Sequenz, - gegebenenfalls eine weitere DNA-Sequenz, die eine 2A-Spaltstelle oder eine davon abgeleitete Sequenz codiert, gegebenenfalls zusammen mit einer vorangestellten eine proteolytische Spaltstelle codierenden DNA-Sequenz oder gegebenenfalls eine DNA-Sequenz, die eine proteolytische Spaltstelle codiert, - gegebenenfalls eine ein viertes Polypeptid mit Signalsequenz codierende DNA-Sequenz, einen Terminator, wobei in dem Konstrukt mindestens eine 2A-Spaltstelle oder eine davon abgeleitete Sequenz vorhanden ist.
Ferner betrifft die Erfindung mit diesen Vektorkonstrukten transformierte Wirtszel- len, damit produzierte rekombinante Polypeptide sowie ein Verfahren zur Produktion eines oder mehrerer Polypeptide in einem filamentösen Pilz, umfassend die Stufen i) Transformation einer Wirtszelle mit einem entsprechenden vorstehend genannten Vektorkonstrukt, ii) Kultivieren der transformierten Wirtszelle von i) und der für die Expression und Sekretion des bzw. der Polypeptids/Polypeptide geeig- neten Bedingungen, iii) Isolieren des/der so exprimierten Polypeptids/Polypeptide.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung einer DNA-Sequenz, die eine 2A- Spaltstelle oder eine davon abgeleitete Sequenz codiert, gegebenenfalls zusammen mit einer vorangestellten, eine proteolytische Spaltstelle codierenden DNA- Sequenz, zur Herstellung eines Expressionssystems zur Expression und Sekretion von Polypeptiden in filamentösen Pilzen.
Bevorzugt umfasst die DNA-Sequenz, die eine 2A-Spaltstelle codiert, die Sequenz der 2A-Spaltstelle des Maul- und Klauenseuchevirus (FMDV) mit einem abschlie- ßenden Prolin am 3'-Ende.
Mit den erfindungsgemäßen Vektorkonstrukten bzw. dem erfindungsgemäßen Verfahren können sowohl homologe als auch heterologe sowie gemischthomologe und -heterologe Polypeptide zur Expression und Sekretion gebracht werden.
Mit den erfindungsgemäßen Vektorkonstrukten bzw. dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die für eine Expression notwendige Kopienzahl des bzw. der Gens/Gene durch wenige Schritte in den Wirtsorganismus etabliert werden. Fer- ner können erfindungsgemäß auch Produktionsstämme erzeugt werden, die verschiedene Enzyme in definierten Verhältnissen zueinander produzieren. Dies lässt sich bereits in einem einzigen Transformationsschritt erzielen. Ferner können auch die Eigenschaften von Loci nicht-sekretierter Proteine genutzt werden, um eine gesteuerte Expression des gewünschten Zielproteins zu erreichen. Ein weiterer Vorteil der Erfindung besteht darin, dass das in dem Wirt natürlich vorkommende Gen durch die erfindungsgemäße Expressionskassette nicht ausgeschal- tet werden muss und dass auch die Nutzung von proteasearmen Wirten möglich ist.
Selbstprozessierende Spaltstellen, wie die 2A-Spaltstellen, oder damit verwandte Sequenzen sind in der Literatur bekannt, zum Beispiel in Michelle L. L. Donnely et al., „Analysis of the aphthovirus 2A/2B polyprotein .cleavage' mechanism indicates not a proteolytic reaction, but a novel translational effect: a putative ribosomal ,skip'", Journal of General Virology (2001), 82, 1013-1025. Aus dieser Druckschrift ist bekannt, dass die 2A-Region des Maul- und Klauenseuchevirus sehr kurz ist und etwa 19 Aminosäurereste umfasst. Sie stellt ein autonomes Element dar, dass die „Spaltung" an ihrem eigenen C-terminalen Ende katalysiert. Verfahren zur Verwendung der 2A-Spaltstelle in eukaryontischen Expressionssystemen sind ebenfalls in der Literatur bekannt, zum Beispiel aus Pablo de Felipe et al. „Targeting of Proteins Derived from Self-Processing Polyproteins Containing Multiple Signal Sequences", Traffic 2004; 5: 616-626. Ferner beschreibt die WO 2005/017149 Zusammensetzungen und Verfahren zur erhöhten Expression von rekombinanten Polypeptiden aus einem einzelnen Vektor unter Verwendung einer Peptidspaltstel- Ie.
Im Stand der Technik ist jedoch kein Hinweis dahingehend enthalten, dass die 2A- Spaltstelle oder eine davon abgeleitete Sequenz in filamentösen Pilzen funktionell ist. Ferner ist im Stand der Technik nicht beschrieben, dass die so zur Expression gebrachten Zielpolypeptide im industriell nutzbaren Maßstab sezerniert werden sowie dass unter Verwendung der 2A-Spaltstelle oder einer davon abgeleiteten
Sequenz konstruierte Expressionssysteme auch zur Expression normalerweise nicht-sekretierter Polypeptide verwendet werden können. Im Gegensatz zu dem im Stand der Technik beschrieben Verhalten von eukaryon- tischen Zellen, kommt es unter Verwendung der 2A-Spaltstelle bei der Expression und Sekretion in filamentösen Pilzen nicht zur Sekretion des Volllängen- Fusionsproteins bestehend aus dem ersten Polypeptid, der Aminosäuresequenz der 2A-Stelle, und dem zweiten Polypeptid. Es treten nur das erste und das zweite Polypeptid (und dritte Polypeptid bei Verwendung von zwei selbstprozessierenden Spaltstellen) mit korrektem N-terminalen Ende des reifen Proteins in der KuI- turflüssigkeit außerhalb der filamentösen Pilzzelle auf. Somit liegen die gewünschten Proteine als selbstständige Einheiten vor und können nach Isolierung und Reinigung aus der Kulturflüssigkeit direkt einer gewünschten Verwendung oder Anwendung zugeführt werden.
Es war somit nicht naheliegend, eine 2A-Spaltstelle oder eine davon abgeleitete Sequenz in einem Vektorkonstrukt zur Expression und Sekretion homologer oder heterologer Polypeptide in filamentösen Pilzen mit den oben genannten Merkmalen zu verwenden. Mit den erfindungsgemäßen Vektorkonstrukten bzw. Expressionssystemen können Proteine oder Polypeptide in filamentösen Pilzen exprimiert und sekretiert werden, wobei die codierenden Sequenzen für zwei oder mehrere Proteine oder Polypeptide unter der Transkriptionskontrolle des gleichen Promo- tors von einem einzelnen Vektor in definierten Verhältnissen, zum Beispiel in gleichen Verhältnissen zueinander, exprimiert werden, wobei die Spaltung der Proteine oder Polypeptide durch die selbstprozessierende Spaltstelle vermittelt wird.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung Vektorkonstruk- te zur Expression und Sekretion von zwei oder mehreren rekombinanten Proteinen oder Polypeptiden in filamentösen Pilzen, die die gleichen codierenden Sequenzen oder offene Leseraster (ORFs) besitzen. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden verschiedene Polypeptide von einem Vektor exprimiert, wobei der Vektor verschiedene offene Leseraster enthält. In einem beispielhaften Konstrukt werden zwei codierende Sequenzen exprimiert, wobei der Vektor in 5'3'-Richtung umfasst: einen Promotor und gegebenenfalls einen Enhancer in funktioneller Verknüpfung an die Signalsequenz der ersten codieren- den Sequenz für einen ersten Protein- oder Polypeptid-ORF, eine Sequenz, die die selbstprozessierende 2A-Spaltstelle codiert, gegebenenfalls in Kombination mit einer vorangestellten proteolytischen Spaltstelle, gefolgt von der codierenden Sequenz des Signalpeptids des zweiten Proteins oder Polypeptids und der codie- renden Sequenz für einen zweiten Protein- oder Polypeptid-ORF gefolgt von einem Terminator, wobei die Sequenz, die die selbstprozessierende 2A-Spaltstelle codiert, zwischen der codierenden Sequenz des ersten Proteins oder Polypeptids und der codierenden Sequenz des Signalpeptids des zweiten Proteins oder Polypeptids inseriert ist.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Vektorkonstrukt zur Expression und Sekretion von ein oder mehreren rekombinan- ten Proteinen oder Polypeptiden, wobei das erste Protein oder Polypeptid ein intrazelluläres Protein ist - und damit kein Signalpeptid besitzt - und das zweite (und alle folgenden) Protein bzw. Proteine oder Polypeptid bzw. Polypeptide sezernier- te Proteine sind, die jeweils ihr eigenes homologes oder heterologes Signalpeptid mitbringen. In einem beispielhaften Konstrukt, bei dem zwei codierende Sequenzen exprimiert werden, umfasst der Vektor in der 5'3'-Richtung: einen Promotor und gegebenenfalls einen Enhancer in funktioneller Verknüpfung an die erste co- dierende Sequenz eines ersten Protein- oder Polypeptid-ORFs (intrazelluläres Protein), eine Sequenz, die eine selbstprozessierende 2A-Spaltstelle codiert, die codierende Sequenz des Signalpeptids für das zweite Protein oder Polypeptid und die codierende Sequenz für einen zweiten Protein- oder Polypeptid-ORF gefolgt von einem Terminator, wobei die Sequenz, die eine selbstprozessierende 2A- Spaltstelle codiert, zwischen der codierenden Sequenz des ersten Proteins oder Polypeptids und der codierenden Sequenz des Signalpeptids des zweiten Proteins oder Polypeptids inseriert ist und weiter an gleichwertigen Stellen bei Konstruktionen mit weiteren zu sekretierenden Polypeptiden inseriert ist, wobei die selbstprozessierende 2A-Spaltstelle gegebenenfalls mit einer vorangestellten pro- teolytischen Spaltstelle kombiniert ist. Erfindungsgemäß wird eine selbstprozessierende 2A-Spaltstelle oder eine davon abgeleitete Sequenz verwendet. Beispiele hierfür sind virale 2A-Sequenzen, die von Picornaviren, wie zum Beispiel Entero-, Rhino-, Cardio-, Aphtho- oder Maul- und Klauenseucheviren abgeleitet sein können.
Die selbstprozessierende Spaltstelle, d.h. die 2A-Spaltstelle, ist das Expressionsprodukt einer DNA-Sequenz die eine selbstprozessierende Spaltstelle kodiert und die im Zuge der Translation eine intramolekulare „(eis) Spaltung" des Proteins o- der Polypeptids, das die Spaltstelle beinhaltet, ermöglicht, so dass zwei definierte eigenständige Proteine oder Polypeptide erhalten werden.
Besonders bevorzugt ist die in dem erfindungsgemäßen Vektorkonstrukt verwendete selbstprozessierende 2A-Spaltstelle die für die selbstprozessierende 2A- Spaltstelle codierende Sequenz aus dem Maul- und Klauenseuchevirus (FMDV). FMDV2A ist eine Polyproteinregion, die typischerweise 18 Aminosäuren lang ist und zusätzlich ein Prolin am C-terminalen Ende enthält und beispielsweise die Sequenz LLNFDLLKLAGDVESNPGP oder die Sequenz
TLNFDLLKLAGDVESNPGP besitzt. Jedoch können auch Oligopeptide von einer Länge von einschließlich Prolin von nur 14 Aminosäureresten, wie zum Beispiel LLKLAGDVESNPGP verwendet werden, da diese ebenfalls die Funktion besitzen, die selbstprozessierende Spaltung am 2A-C-Terminus zu vermitteln.
Die Erfindung umfasst bevorzugt auch eine von der selbstprozessierenden 2A- Spaltstelle abgeleitete Sequenz. Dabei können beliebige Varianten der Sequenz verwendet werden, solange sie die selbstprozessierenden Eigenschaften der 2A- Spaltstelle besitzen. Beispielhafte Varianten sind in der oben genannten Literaturstelle Donnelly M. L. L. et al., 2001 , angegeben. Beispielhafte Sequenzen, die bevorzugt erfindungsgemäß verwendet werden, sind nachstehend angegeben: QCTNYALLKLAGDVESNPGP, EARHKQKIVAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP, APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP, TLNFDLLKLAGDVESNPGP,
LLKLAGDVESNPGP. Die Erfindung umfasst auch Varianten der 2A-Sequenz des FMDV1 die durch Addition, Deletion und Mutation dieser Sequenz erhalten wurden, wobei die selbstprozessierende Eigenschaft dieser Sequenz beibehalten wurde. Die Erfindung betrifft somit auch die Verwendung von Nucleinsäuresequenzvarianten, die eine selbstprozessierende 2A-Spaltstelle codieren, sowie Nucleinsäuresequenzen, die Sequenzen codieren, die sich in einem oder mehreren Codons bezüglich der nati- ven 2A-Nucleotidsequenz unterscheiden. Ferner können auch 2A-artige Domänen aus Picornaviren, Insektenviren, Typ-C-Rotaviren, Trypanosomen, Repeat- Sequenzen oder dem Bakterium Thermatoga maritima verwendet werden.
Ferner betrifft die Erfindung bevorzugt auch die Verwendung von Sequenzen, die eine Identität von 80-99% zu der selbstprozessierenden 2A-Sequenz aus FMDV mit dem Motiv -DxExNPGP oder - GxExNPGP, oder zu der Sequenz L L N F D L L K L A G D D V E/Q S/J/F N/H/E/Q P G P/A (x kann eine beliebige Aminosäure sein) besitzen. Dabei bezeichnet der Begriff „Sequenzidentität" Aminosäuresequenzidentität zwischen zwei oder mehreren miteinander verglichenen Sequenzen unter Verwendung eines Sequenzalignmentprogrammes. Die Ausdrücke „% Homologie" und „% Identität" werden hier austauschbar verwendet und bezeichnen den Grad der Aminosäuresequenzidentität zwischen zwei oder mehreren vergli- chenen Sequenzen. Ein Sequenzalignment für Vergleichszwecke kann beispielsweise unter Verwendung des lokalen Homologiealgorithmus von Smith and Wa- terman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), durch Verwendung des Homologiealgorithmus von Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), durch das Programm nach Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sei. USA 85: 2444 (1988), durch Verwendung computerisierter Implementationen dieser Algorithmen (GAP, BESTFIT, FASTA und TFASTA im Wisconsin Genetics Software Package, Gene- tics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.) durchgeführt werden.
In den erfindungsgemäßen Vektorkonstrukten können beliebige, die vorstehend genannten 2A-Sequenzen bzw. deren Varianten codierende DNA-Sequenzen verwendet werden. Ferner wird erfindungsgemäß gegebenenfalls mindestens eine weitere Sequenz verwendet, die eine proteolytische Spaltstelle codiert. Hierbei können beliebige auf dem Fachgebiet bekannte proteolytische Spaltstellen verwendet werden. Bevorzugte Beispiele hierfür sind die Furinspaltstelle mit der Consensussequenz RXK (R)R oder LXK (R)R, die durch endogene subtilisinartige Proteasen wie Furin und andere Serinproteasen gespalten werden kann. Weitere Beispiele sind die FaktoMOa-Spaltstelle, die Signalpeptidase-1 -Spaltstelle, die Thrombinspaltstelle oder die Kexll-Spaltstelle. Es können auch davon abgeleitete Sequenzen gemäß den vorstehenden Ausführungen im Zusammenhang mit der 2A-Spaltstelle ver- wendet werden. Bevorzugt wird die Kexll-Spaltstelle verwendet.
Sofern eine eine proteolytische Spaltstelle codierende DNA-Sequenz verwendet wird, ist diese der DNA-Sequenz, die eine 2A-Spaltstelle oder eine davon abgeleitete Sequenz codiert, vorangestellt. „Vorangestellt" bedeutet hierbei, dass die DNA-Sequenz, die eine proteolytische Spaltstelle codiert, am 5'-Ende der DNA- Sequenz, die eine 2A-Spaltstelle oder eine davon abgeleitete Sequenz codiert, vorausgeht.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Vektor eine Sequenz, die die Kexll-Spaltstelle zwischen der codierenden Sequenz für ein erstes Protein oder Polypeptid und der codierenden Sequenz für die 2A-Spaltstelle mit dem folgenden zweiten Protein oder Polypeptid enthält. Die zusätzliche Nutzung der proteolytischen Spaltstelle ist insbesondere sinnvoll, wenn das C-terminale Ende eines Proteins für dessen Funktion mit verantwortlich ist, und daher die Abspaltung der 2A- Sequenz für die Aufrechterhaltung der Funktion notwendig ist.
In weiteren Ausführungsformen kann sowohl die Sequenz, die die 2A-Spaltstelle codiert, als auch die Sequenz, die eine proteolytische Spaltstelle codiert, in mehrfacher Kopie vorliegen. Bevorzugte Konstrukte hierfür sind: - Enhancer-Promotor-Protein1-2A-Sig2-Protein2-Terminator
- Enhancer-Promotor-Protein1-Kexll-2A-Sig2-Protein2-Terminator - Enhancer-Promotor-Protein1-2A-Sig2-Protein2-2A-Sig3-Protein3- Terminator
- Enhancer-Promotor-Protein1-Kexll-2A-Sig2-Protein2-2A-Sig3-Protein3- Terminator - Enhancer-Promotor-Protein1-Kexll-2A-Sig2-Protein2-Kexll-2A-Sig3-
Protein3-Terminator Enhancer-Promotor-Sig1 -Protein 1-2A-Sig2-Protein2-Terminator
- Enhancer-Promotor-Sig1-Protein1-Kexll-2A-Sig2-Protein2-Terminator
- Enhancer-Promotor-Sig1-Protein1-2A-Sig2-Protein2-2A-Sig3-Protein3- Terminator
- Enhancer-Promotor-Sig 1 -Protein 1 -Kexl I-2A-Sig2-Protein2-Kexl I-2A-Sig3- Protein3-Terminator
- Enhancer-Promotor-Sig1-Protein1-Kexll-2A-Sig2-Protein2-Kexll-2A-Sig3- Protein3-Terminator
Weiterhin sind bevorzugte Konstrukte solche, bei denen die Teile Enhancer- Promotor-(Sig1)-Protein1 nur partiell vorhanden sind, so dass noch eine zielgerichtete Integration in einen Locus, bevorzugt den Locus des Proteini , erfolgen kann. Die Länge der DNA des Teils Enhancer-Promotor-(Sig1)-Protein1 , von dessen C-terminalen Ende aus gemessen, sollte so lang sein, dass es zu einer gezielten in-frame Integration in den Locus von Proteini kommt. Die Länge der dazu notwendigen DNA kann 100 bp bis mehrere kbp betragen, bevorzugt noch 0,3 - 3 kbp, noch bevorzugter 0,5 - 2 kbp, am bevorzugtesten 0,7 - 1 ,5 kbp. Bei der In-Frame Integration in einen durch die noch in der Kassette vorhandenen Teile von Enhancer-Promotor-(Sig1)-Protein1 vordefinierten Locus erfolgt dort im Genom die Vervollständigung der oben aufgezählten Konstrukte in-vivo und es kommt zu der erfindungsgemäßen Expression und Sekretion der Zielproteine durch die so transformierten filamentösen Pilze. Durch die in-frame Integration in den Locus des Proteinsi werden die in der Integrationskassette fehlenden Teile, die zur Expression benötigt werden, in-vivo ergänzt. Die Erfindung betrifft auch Konstrukte, bei denen in den oben genannten Konstruktionen Protein 1 und folgende Proteine2 etc. zusammengesetzte Fusionsproteine sein können, wie sie z.B. zur Erhöhung der Sekretionseffizienz von prokary- ontischen oder tierischen Proteinen bei der Expression in filamentösen Pilzen verwendet werden. Diese Fusionsproteine können proteolytische Spaltstellen enthalten, um den Anteil an hochsekretiertem Wirtsprotein, der mit dem prokaryonti- schen oder tierischen Protein verbunden wurde, nach der Sekretion oder während der Sekretion wieder abzuspalten.
Die Erfindung betrifft auch Expressionskassetten, die zur Einschleusung des offenen Leserasters in eine Wirtszelle verwendet werden können. Sie umfassen bevorzugt eine Transkriptionsstartregion, die mit dem offenen Leseraster funktionell verknüpft ist. Eine derartige Expressionskassette kann eine Vielzahl von Restriktionsspaltstellen zur Insertion des offenen Leserasters und/oder anderer DNAs, z. B. einer Transkriptions-Regulator-Region und/oder selektierbare Markergene enthalten. Die Transkriptionskassette umfasst in der 5'→3'-Richtung der Transkription eine Transkriptions- und Translationsstartregion, die DNA-Sequenz von Interesse und eine Transkriptions- und Translationsstopregion, die in einer mikrobiellen Zelle funktionell ist. Die Terminationsregion kann bezüglich der Transkriptioninitiationsregion nativ sein, kann bezüglich der DNA-Sequenz von Interesse nativ sein oder kann von einer beliebigen anderen Quelle abgeleitet sein.
Bei den Proteineni und weiteren kann es sich um das gleiche Polypeptid handeln oder jedes Gen kodiert für ein anderes Polypeptid oder jede beliebige Zwischen- mischform. Wenn das gleiche Polypeptid von den die Polypeptide 1 bis n (n = Anzahl der kodierten Polypeptide, bevorzugt 4) kodierenen Genen in der Expressionskassette exprimiert werden soll, so können zur Verbesserung der Stabilität der Expressionskassette und zur Vermeidung von intrazellulären Rekombinati- onsschritten, bei denen Teile der Gene ausgeschnitten werden, synthetische Gene zum Einsatz kommen, bei denen durch Ausnutzung der Codonusage eine Hybridisierung zwischen den einzelnen Kopien vermindert wird. Expressionskas- setten, die nur das gleiche Polypeptid kodieren, haben in der Regel bis zu 4 Kopien des für das gleiche Polypeptid kodierenden Gens. Wenn unterschiedliche Polypeptide durch die Gene kodiert werden, so kann die Gesamtzahl der Gene höher sein, jedoch für das einzelne Polypeptid meist nicht höher als 4.
Der Ausdruck „Transkriptions-Regulator-Region" umfasst Kernproteine, die an ein DNA-Responseelement binden und dadurch die Expression eines assoziierten Gens oder assoziierter Gene transkriptioneil regulieren. Transkriptionsregulatorproteine binden im Allgemeinen direkt an DNA-Responseelemente. In einigen Fällen kann die Bindung an DNA indirekt durch die Bindung an ein anderes Protein beeinflusst werden, das seinerseits an ein DNA-Responseelement bindet oder davon gebunden wird. Die erfindungsgemäßen Vektorkonstrukte können solche regulatorischen Elemente umfassen.
Der Ausdruck „offenes Leseraster" (ORF) bezeichnet die Aminosäure-Sequenz, die zwischen den Translationsstart- und -Stop-Codons einer codierenden Sequenz codiert wird. Die Ausdrücke „Start-Codon" und „Stop-Codon" bezeichnen eine Einheit aus drei benachbarten Nucleotiden (Codons) in einer codierenden Sequenz, die den Kettenstart und -stop der Proteinsynthese (mRNA-Translation) spezifizieren.
„Funktionelle Verknüpfung" bezeichnet im Zusammenhang mit einer Nucleinsäure eine Verbindung als Teil des gleichen Nucleinsäuremoleküls in geeigneter Positionierung und Orientierung zum Transkriptionsstart des Promotors. DNA in funkti- oneller Verknüpfung an einen Promotor befindet sich unter der Transkriptions- Initiations-Regulation des Promotors. Codierende Sequenzen können funktionell mit der Regulatorsequenz in Sense- oder Antisense-Orientierung verknüpft sein. Bei Bezugnahme auf Polypeptide bedeutet funktionelle Verknüpfung die Verbindung als Teil desselben Polypeptids, d.h. über Peptidylbindungen.
Erfindungsgemäß können beliebige Promotoren verwendet werden. Promotor bezeichnet die Nucleotidsequenz üblicherweise stromaufwärts (5') bezüglich der co- dierenden Sequenz und kontrolliert die Expression der codierenden Sequenz, indem die Erkennung für die RNA-Polymerase und anderer Faktoren, die für die richtige Transkription erforderlich sind, bereitgestellt wird. Der erfindungsgemäß verwendete Promotor kann einen Minimalpromotor umfassen, d.h. eine kurze DNA-Sequenz aus einer TATA-Box und anderen Sequenzen, die die Transkriptionsstartstelle spezifizieren, an die Regulatorelemente zur Kontrolle der Expression angefügt sind.
Der erfindungsgemäß gegebenenfalls verwendete Promotor kann auch eine Nuc- leotidsequenz umfassen, die einen Minimalpromotor und Regulatorelemente um- fasst, der die Expression einer codierenden Sequenz oder funktionellen RNA kontrollieren kann. Dieser Typ von Promotorsequenz besteht aus proximalen und distalen stromaufwärts gelegenen Elementen, wobei die zuletzt genannten Elemente oft als Enhancer bezeichnet werden. Folglich ist ein Enhancer eine DNA- Sequenz, die die Promotor-Aktivität stimulieren kann und kann ein dem Promotor innewohnendes Element oder ein insertiertes heterologes Element sein, um die Expressionshöhe oder Zellspezifität eines Promotors zu verstärken. Er kann in beiden Orientierungen funktionieren und kann selbst bei stromaufwärtiger und stromabwärtiger Platzierung von dem Promotor funktionieren. Sowohl Enhancer als auch andere stromaufwärts gelegene Promotor-Elemente binden sequenzspezifisch DNA-bindende Proteine, die ihre Wirkungen vermitteln. Promotoren können in ihrer Gesamtheit von einem nativen Gen abgeleitet sein oder können aus verschiedenen Elementen zusammengesetzt sein, die von verschiedenen natürlich vorkommenden Promotoren abgeleitet sind oder können sogar aus syntheti- sehen DNA-Segmenten zusammengesetzt sein. Ein Promotor kann auch DNA- Sequenzen enthalten, die an der Bindung von Proteinfaktoren beteiligt sind, die die Effizienz der Transkriptionsinitiation als Antwort auf physiologische oder entwicklungsbedingte Bedingungen kontrollieren.
Promotorelemente, insbesondere TATA-Elemente, die inaktiv sind oder eine stark verminderte Promotor-Aktivität in Abwesenheit einer stromaufwärtigen Aktivierung besitzen, werden als Minimaipromotoren oder Kernpromotoren bezeichnet. In Ge- genwart eines geeigneten Transkriptionfaktors bzw. geeigneter Transkriptionsfaktoren liegt die Funktion des Minimalpromotors in der Ermöglichung der Transkription. Ein Minimal- oder Kernpromotor besteht somit nur aus allen Grundelementen, die für die Transkriptionsinitiation notwendig sind, z. B. einer TATA-Box und/oder einem Initiator.
Beispiele für Promotoren, die erfindungsgemäß verwendet werden können, sind Promotoren, von denen bekannt ist, dass sie die Expression in den eukaryoti- schen Zellen kontrollieren. Beliebige Promotoren mit der Fähigkeit zur Expression in Fadenpilzen können verwendet werden. Beispiele sind ein Promotor, der stark durch Stärke oder Zellulose induziert wird, z. B. ein Promotor für Glucoamylase oder α-Amylase aus der Gattung Aspergillus oder Cellulase (Cellobiohydrolase) aus der Gattung Trichoderma, ein Promotor für Enzyme im glykolytischen Stoffwechselweg, wie beispielsweise Phosphoglyceratkinase (PGK) und Glycerinalde- hyd-3-phosphat-dehydrogenase (GPD), etc. Bevorzugt ist der Cellobiohydrolase- I-, der Cellobiohydrolase-Il-, der Amylase-, der Glucoamylase-, der Xylanase- oder der Enolase-Promotor.
Zusätzlich zur Verwendung eines speziellen Promotors können andere Typen von Elementen die Expression von Transgenen beeinflussen. Insbesondere wurde gezeigt, dass Introns das Potenzial zur Verstärkung der Transgenexpression besitzen.
Die Expressionskassette kann noch weitere Elemente umfassen, beispielsweise solche, die durch endogene oder exogene Elemente wie Zinkfinger-Proteine, einschließlich natürlich vorkommender Zinkfinger-Proteine oder chimerer Zinkfinger- Proteine, reguliert werden können.
Die Erfindung betrifft auch die erfindungsgemäße DNA-enthaltende Vektoren. Diese Vektoren umfassen beliebige Plasmide, Cosmide, Phagen und andere Vektoren in doppelsträngiger oder einzelsträngiger, linearer oder zirkulärer Form, die gegebenenfalls selbst transmittierbar oder mobilisierbar sein können und die ei- nen prokaryotischen oder eukaryotischen Wirt entweder durch Integration in das zelluläre Genom transformieren können oder die extrachromosomal vorliegen (z. B. autonom replizierende Plasmide mit einem Replikationsorigin).
Vektoren, Plasmide, Cosmide, künstliche Bakterienchromosomen (BACs) und DNA-Segmente zur Verwendung zur Transformation von Zellen umfassen allgemein die erfindungsgemäße Expressionskassetten die in die Zellen eingeschleust werden sollen. Diese DNA-Konstrukte können weiter Strukturen wie Promotoren, Enhancer, Polylinker oder auch Regulatorgene, so weit erforderlich, umfassen. Eines der DNA-Segmente oder Gene, das bzw. die für die zelluläre Einschleusung ausgewählt wurde bzw. wurden, codiert/codieren zweckdienlicherweise ein Protein, das in den so erhaltenen transformierten (rekombinanten Zellen) exprimiert wird, was zu einem screenbaren oder selektierbaren Merkmal führt und/oder der transformierten Zelle einen verbesserten Phenotyp verleiht.
Die Konstruktion der erfindungsgemäßen Vektoren bzw. Vektorkonstrukte ist einem Fachmann auf dem Gebiet angesichts der vorstehenden Offenbarung und des allgemeinen Fachwissens bekannt (vgl. z. B. Sambrook et al., Molecular CIo- ning: A Laboratory Manual (2. Aufl., Coldspring Harbor Laboratory Press, Plain- view, N.Y. (1989)). Die erfindungsgemäße Expressionskassette kann ein oder mehrere Restriktionsschnittstellen enthalten, um die die Polypeptide-codierenden Nucleotide unter die Regulation einer Regulatorsequenz zu stellen. Die Expressionskassette kann auch ein Terminationssignal in funktioneller Verknüpfung mit dem letzten Polynucleotid sowie Regulatorsequenzen, die für die ordnungsgemä- ße Translation der Polynucleotide benötigt werden, enthalten. Die Expressionskassette kann chimer sein, d.h. mindestens eine ihrer Komponenten ist bezogen auf mindestens eine der anderen Komponenten heterolog. Die Expression der Polynucleotide in der Expressionskassette kann unter der Kontrolle eines konstitu- tiven Promotors, eines induzierbaren Promotors, eines regulierten Promotors, ei- nes viralen Promotors oder eines synthetischen Promotors stehen. Die Vektoren können bereits Regulatorelemente enthalten, z. B. Promotoren, oder die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen können so manipuliert werden, dass sie solche Elemente enthalten. Geeignete Promotorelemente, die verwendet werden können, sind auf dem Fachgebiet bekannt und sind beispielsweise für Trichoder- ma reesei der cbh 1 - oder der cbh-2-Promotor, für Aspergillus oryzae der amy- Promotor, für Aspergillus n/gerder xyl-, glaA-, alcA-, aphA-, tpiA-, gpdA-, sucl- und der pkiA-Promotor.
DNA, die zur Einschleusung in Zellen geeignet ist, kann neben der erfindungsge- mäßen DNA auch DNA, die aus einer beliebigen Quelle abgeleitet wurde oder daraus isoliert ist, umfassen. Ein Beispiel für eine abgeleitete DNA ist eine DNA- Sequenz, die als nützliches Fragment in einem gegebenen Organismus identifiziert wurde und die dann in im Wesentlichen reiner Form chemisch synthetisiert wurde. Ein Beispiel für eine solche DNA ist eine geeignete DNA-Sequenz, die bei- spielsweise unter Verwendung von Restriktionsendonucleasen erhalten wurde, so dass sie weiter erfindungsgemäß manipuliert werden kann, beispielsweise amplifi- ziert werden kann. Eine derartige DNA wird üblicherweise als rekombinante DNA bezeichnet. Daher umfasst eine geeignete DNA vollständig synthetische DNA, semisynthetische DNA, aus biologischen Quellen isolierte DNA und von einge- schleuster RNA abgeleitete DNA. Im Allgemeinen ist die eingeschleuste DNA kein ursprünglicher Bestandteil des Genotyps der Empfänger-DNA, aber erfindungsgemäß kann auch ein Gen aus einem gegebenen Genotyp isoliert und eventuell verändert werden und anschließend können Mehrfachkopien des Gens in den gleichen Genotyp eingeschleust werden, z. B. um die Produktion eines gegebe- nen Genprodukts zu verstärken.
Die eingeschleuste DNA umfasst ohne Beschränkung DNA aus Genen, wie beispielsweise aus Bakterien, Hefen, Pilzen oder Viren. Die eingeschleuste DNA kann modifizierte oder synthetische Gene, Teile von Genen oder chimäre Gene einschließlich Genen aus dem gleichen oder einem unterschiedlichen Genotyp umfassen. Die zur Transformation erfindungsgemäß verwendete DNA kann zirkulär oder linear, doppelsträngig oder einzelsträngig sein. Im Allgemeinen liegt die DNA in Form einer Chimären DNA wie eine Plasmid-DNA vor, die auch codierende Regionen, die von Regulatorsequenzen flankiert sind, die die Expression der in der transformierten Zelle vorhandenen rekombinanten DNA unterstützen, enthalten. Beispielsweise kann die DNA selbst einen Promotor enthalten oder daraus bestehen, der in einer Zelle aktiv ist, der von einer Quelle, die sich von der Zelle unterscheidet, abgeleitet ist oder es kann ein Promotor verwendet werden, der bereits in der Zelle, d.h. der Transformationszielzelle, vorhanden ist.
Die Selektion eines geeigneten Expressionsvektors hängt von den Wirtszellen ab. Pilzexpressionsvektoren können einen Replikationsorigin, einen geeigneten Promotor und Enhancer umfassen, und auch beliebige notwendige Ribosomenbin- dungsstellen, Polyadenylierungsstellen, Splice-Donor und -Akzeptor-Stellen, Transkriptionsterminationssequenzen und nicht-transkribierte 5'-flankierende Sequenzen umfassen.
Beispiele für geeignete Wirtszellen sind: Pilzzellen der Gattung Aspergillus, Rhi- zopus, Trichoderma, Neurospora, Mucor, Penicillium, etc. Geeignete Wirtssyste- me sind beispielsweise Pilze wie Aspergilli, z. B. Aspergillus niger (ATCC 9142) oder Aspergillus ficuum (NRLL 3135) oder Trichoderma (z. B. Trichoderma re- see/ QM6a). Derartige Mikroorganismen sind gut bekannt und können von anerkannten Hinterlegungsstellen, z. B. der American Type Culture Collection (ATCC), dem Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) oder der Deutschen Samm- lung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) oder beliebigen anderen Hinterlegungsstellen erhalten werden.
Die Expressionskassette kann in der 5'-3'-Transkriptionsrichtung eine Transkriptions- und Translationstartregion des erfindungsgemäßen Polynucleotids und eine Transkriptions- und Terminationsregion, die in vivo oder in vitro funktionell ist, enthalten. Die Terminationsregion kann bezüglich der Transkriptions- initiationsregion nativ sein oder kann bezüglich des Polynucleotids nativ oder an- derer Herkunft sein. Die Regulatorsequenzen können stromaufwärts (5' nicht- codierende Sequenzen), innerhalb (Intron) oder stromabwärts (3' nicht-codierende Sequenzen) einer codierenden Sequenz lokalisiert sein und die Transkription, das RNA-Processing oder die Stabilität und/oder die Translation der assoziierten co- dierenden Sequenz beeinflussen. Regulatorsequenzen können ohne Beschränkung Enhancer, Promotoren, Repressorbindungsstellen, Translationsleaderse- quenzen, Introns oder Polyadenylierungsignalsequenzen umfassen. Sie können natürliche und synthetische Sequenzen sowie Sequenzen umfassen, die eine Kombination aus synthetischen und natürlichen Sequenzen sind. 0
Das erfindungsgemäße Vektorkonstrukt kann auch geeignete Sequenzen zur Amplifikation der Expression umfassen.
Die erfindungsgemäße Expressionskassette kann ferner Enhancer-Elemente oder5 stromaufwärtige Promotor-Elemente enthalten.
Erfindungsgemäße Vektoren können so konstruiert werden, dass sie ein Enhan- cer-Element enthalten. Die erfindungsgemäßen Konstrukte umfassen somit das Gen von Interesse zusammen mit einer 3'-DNA-Sequenz, die als Signal wirkt, umo die Transkription zu terminieren und die Polyadenylierung der so erhaltenen mRNA zu erlauben.
Es können beliebige Signalsequenzen verwendet werden die die Sekretion aus dem gewählten Wirtsorganismus ermöglichen. Bevorzugte Signalsequenz ist die5 dem zu exprimierenden Gen eigene Signalsequenz, es können jedoch auch die Signalsequenzen der Phytase oder Glucoamylase aus Aspergillus niger, der a- Amylase aus Aspergillus oryzae der Cellobiohydrolase oder Xylanase aus Tricho- derrna reesei oder daraus abgeleitete Signalsequenzen für die Sekretion aus fila- mentösen Pilzen verwendet werden. Dabei kann in den erfindungsgemäßen Vek-o torkonstrukten die Signalsequenz bei der ein erstes Polypeptid codierenden Sequenz auch fehlen. Dies führt dazu, dass dieses Polypeptid intrazellulär verbleibt. Bei allen weiteren Polypeptid-codierenden Sequenzen ist das Vorhandensein der Signalsequenz wesentlich um das entsprechende Polypeptid erfindungsgemäß zu sekretieren. Das Fehlen der Signalsequenz bei dem ersten Polypeptid liegt vor, wenn, z.B. als Ziellocus der Locus eines intrazellulären Proteins gewählt wird, o- der wenn das erste Polypeptid zur Verbesserung von intrazellulären Stoffwech- selwegen dient. Alternativ kann die Signalsequenz auch bei einem anderen Polypeptid fehlen um so z.B. ein für den verwendeten Promotor aktivierendes Polype- tid herzustellen und damit die Expression und Sekretion des/der gewünschten Polypeptid/e weiter zu erhöhen.
Es kann auch eine spezielle Leadersequenz verwendet werden, da die DNA- Sequenz zwischen der Transkriptionsstartstelle und dem Start der codierenden Sequenz, d.h. der nicht-translatierten Leadersequenz die Genexpression beeinflussen kann. Bevorzugte Leadersequenzen umfassen Sequenzen, die die optimale Expression des angehefteten Gens steuern, d.h. sie umfassen eine bevor- zugte Consensus-Leader-Sequenz, die die mRNA-Stabilität erhöht oder erhält und eine ungeeignete Translationsinitiation verhindert. Die Wahl solcher Sequenzen ist einem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt.
Um die Möglichkeit, die Transformanten zu identifizieren zu verbessern, kann ein selektierbares oder screenbares Markergen in die Expressionskassette aufgenommen werden. Derartige Markergene sind einem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt.
Die Expressionskassette oder ein Vektorkonstrukt, das die Expressionskassette enthält, wird in eine Wirtszelle eingeführt. Eine Vielzahl von Techniken ist verfügbar und einem Fachmann auf dem Gebiet zur Einschleusung von Konstrukten in eine Wirtszelle gut bekannt. Die Transformation von Pilzen kann nach Penttilä et al., Gene 61 :155-164, 1987 durchgeführt werden.
Sobald die erfindungsgemäße Expressionskassette bzw. DNA-Sequenz erhalten ist, kann sie in Vektoren nach an sich bekannten Verfahren eingefügt werden, um das codierte Polypeptid in geeigneten Wirtssystemen zu überexprimieren. Jedoch können auch DNA-Sequenzen als solche verwendet werden, um geeignete Wirtssysteme der Erfindung zu transformieren, um eine Überexpression des codierten Polypeptids zu erzielen.
Die hier verwendeten Ausdrücke „Protein" und „Polypeptid" können austauschbar verwendet werden und bezeichnen typischerweise Proteine und Polypeptide von Interesse, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Vektorkonstrukte expri- miert werden. Solche Proteine oder Peptide können jedes beliebige Protein oder Peptid sein, das für Forschungszwecke, diagnostische Zwecke, therapeutische Zwecke, Ernährungszwecke, oder technische Anwendungen nützlich ist. Bevorzugte Beispiele für erfindungsgemäß exprimierte und sezernierte Proteine sind Lebensmittelenzyme, wie zum Beispiel Polygalacturonidase, Pektinmethylestera- se, Xylogalacturonoidase, Rhamnogalacturonidase, Arabinofuranosidase, Araba- nase, Amylase, Phytase, Xylanase, Cellulase, Protease, Mannanase, Transglu- taminase etc., Tierfutterenzyme wie zum Beispiel Phytase, Xylanase, Endogluca- nase, Mannaπase und Protease, sowie technische Enzyme wie zum Beispiel CeI- lulasen, Proteasen, Amylasen, Laccasen, Oxidoreductasen etc.
Zur Expression und Sekretion der Polypeptide werden die transformierten filamen- tosen Pilze unter üblichen Bedingungen für die Expression und Sekretion von Proteinen gezüchtet. Hierzu werden die Pilze auf Agarplatten angezüchtet, und eine Sporensuspension oder eine Mycelsuspension als Inokulum für eine submers o- der Oberflächen-Fermentation eingesetzt. Die Fermentation wird auf Medien durchgeführt die die notwendigen C- und N-Quellen enthalten sowie Spurenele- mente und Mineralsalze. Des weiteren sollte das Medium bei Verwendung von induzierbaren Promotoren die Induktoren oder deren Vorstufen enthalten. Die Fermentation erfolgt unter Kontrolle von Temperatur und pH-Wert sowie weiterer Fermentationsbedingungen wie Redox-Potential, partieller Sauerstoffgehalt, etc. Auch eine kontrollierte Führung von weiteren C- und N-Quellen, sowie anderer Medienbestandteile kann erfolgen (Fed-Batch-Verfahren). Am Ende der Fermentation wird die protein- oder polypeptidhaltige Kulturflüssigkeit mit bekannten phy- sikalischen Verfahren von der Biomasse getrennt und dabei das Protein oder Polypeptid isoliert.
Mit den erfindungsgemäßen Konstrukten lassen sich verbesserte Expressions- und Sekretionshöhen heterologer Polypeptide erzielen. Ferner können auch mehrere Polypeptide gleichzeitig in definierten Verhältnissen zueinander produziert werden. Die erfindungsgemäßen Konstrukte erlauben die Nutzung von Loci hoch- exprimierter intrazellulärer als auch extrazellulärer Proteine zur Sekretion des Zielproteins, ohne die Produktion des intrazellulären oder extrazellulären Proteins zu stören. Dies ist bei der Verwendung von proteolytischen Spaltstellen in Verbindung mit intrazellulären Proteinen nicht möglich. Durch die Verwendung von der selbstprozessierenden 2A-Spaltstelle kommt es im Gegensatz zu Expressionen mit proteolytischen Spaltstellen nicht zur Expression des Volllängen- Fusionsproteins und die beiden, oder mehrere Polypeptide haben immer die kor- rekte N-terminale Sequenz.
Die beigefügten Figuren erläutern die Erfindung näher.
Fig. 1 : SDS-Gelelektrophorese von pPgpd-Pyr-APG1-Transformanten Darstellung der SDS-PAGE von Kulturüberständen aus dem Plasmid pPgpd-Pyr-APG1 (vgl. Figur 3) transformierten Stämmen: Transformant RH31480 (Gel 1), RH31481 (Gel 2), RH31483 (Gel 3), Markerproteins SDS-7, Sigma (Gel 4), A. foetidus RH31337 (Gel 5) Fig. 2: SDS-Gelelektrophorese von pPXT-APG1-KexPG1-Transformanten Darstellung der SDS-PAGE von Kulturüberständen aus dem Plasmid pPXT-APG1-KexPG1 (vgl. Figur 4) transformierten Stämmen: WT (Gel 1), Markerproteine (Gel 2), die Stämme RH31520 bis RH31527 (Gele 3 bis 10)
Fig. 3: Plasmidkarte von pPgpd-Pyr-APG1 Fig. 4: Plasmidkarte von pPXT-APG1-KexPG1 Fig. 5: Plasmidkarte von pX-1APEsyn Fig. 6: Plasmidkarte von pX-1APEnat Fig. 7: Plasmidkarte von pX-2APEsyn Fig. 8 Plasmidkarte von pX-2APEnat
Das folgende biologische Material (Plasmide) wurde am 14.06.2006 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Masche- roder Weg 1b, D-38124 Braunschweig gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrags hinterlegt:
Figure imgf000026_0001
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung näher:
Beispiele
Referenzbeispiel 1 : Bestimmung der Polygalacturonidaseaktivität
Die Polygalacturonidaseaktivität ist definiert als die Freisetzung von 1 μmol Galac- tose-Reduktionsäquivalenten pro Minute unter Standardbedingungen und wird bestimmt durch ein zweistufiges Verfahren. Zuerst erfolgt die Inkubation des Enzyms (100 μl) für 10 min bei 400C gemischt mit 250 μl Kaliumpektat-Lösung (0,7%) bei pH 3,9. Die Enzymlösung wird vor Gebrauch mit 0,1 M Na- Acetatpuffer, pH 3,9 verdünnt.
In dem zweiten Schritt werden die freigesetzten reduzierenden Enden photometrisch bestimmt. Dazu werden 650 μl PAHBAH Reagenzlösung (0,5% p- Hydroxybenzoesäurehydrazid [PAHBAH] und 0,475% Titriplex IM) zugegeben und die Mischung für 15 min bei 800C inkubiert. Die Farbentwicklung wird durch Ab- kühlen im Eisbad gestoppt und die Farbe bei 412 nm gegen einen Blindwert gemessen. Beim Blindwert erfolgt die Zugabe der Enzymlösung und der Farblösung in umgekehrter Reihenfolge, da die Farblösung die Enzymreaktion unterbindet.
Die Kalibrierung der Meßmethode erfolgt mit Galactose.
Referenzbeispiel 2: Bestimmung der Pektinmethylesteraseaktivität
Die Pektinmethylesteraseaktivität (PE) wird in einem pH-Stat-Verfahren mit 0,025 M NaOH bestimmt. 1 PE g'1 ist definiert als die Enzymmenge, die pro Minute 1 μval Säure unter den angegebenen Bedingungen (300C, 0,49% Citruspektin [Co- penhagen-Pectin X-2955], pH 4,5) freisetzt.
Beispiel 1: Konstruktion des Expressionsplasmids pPgpd-Pyr-APG1
Die Konstruktion des Expressionsplasmids pPgpd-Pyr-APG1 erfolgt durch folgende Schritte:
a) Konstruktion von pPyrAT
Die chromosomale DNA wurde aus A. foetidus RH3911 nach einer Vorschrift von Hynes et al (1983, Mol.Cell.Biol 3: 1430-1439) isoliert. Das pyrA-Gen wurde mittels PCR amplifiziert. Für die Amplifizierung des pyrA-Gens wurden folgende Primer aus der Sequenzinformation des A. niger pyrA-Gens (van den Hombergh et al., 1996, unveröffentlicht, Accession X96734) abgeleitet:
Seq. ID NO: 1 PyrAEcoNot I : GGAATTCGCGGCCGCATTAACCCCTCCATCAAC
Seq. ID NO: 2 PyrAXbaSmal: TCCCCCGGGATCCCGTCTAGAGTTTCCGCCGACACGGGCCAGGTAG
Das PCR-Produkt wurde mit EcoRI und Smal geschnitten und in das Plasmid pUC18 kloniert. Das entstandene Plasmid wurde pPyrA genannt. Die Amplifizierung der Tpyr-Terminatorsequenz wurde mittels PCR mit folgenden Primern durchgeführt:
Seq. ID NO: 3 TpyrXbaSma: GCTCTAGATAATCCCCCGGGTAGGTACTATAAAAGGAGGATCGAAG Seq. ID NO: 4 TpyrNotNde : GGAATTCCATATGGCGGCCGCCTATTTACCGGATGGCAATGGCGCCAG
Das PCR-Produkt wurde mit Xbal und Ndel geschnitten und in das mit Xbal und Ndel geschnittene Plasmid pPyrA kloniert. Das entstandene Plasmid erhielt die Bezeichnung pPyrAT. Das pyrA-Gen ohne Stopcodon enthält die Xbal- Schnittstelle unmittelbar stromabwärts der pyrA-Sequenz.
Ein Sequenzvergleich des Gens, isoliert aus A. foetidus RH3911 mit dem Gen aus A. n/grer N400 (van den Hombergh) zeigte eine Identität von 99%.
b) Konstruktion der 2A-Sequenz
Die 2A DNA-Sequenz (Donnelly et al., 2001 , J. Gen. Virology 82, 1027-1041) wurde unter Verwendung des Codon-Gebrauchs von Aspergillus (http://www.kazusa.or.jp/codon) synthetisiert.
Seq. ID NO:5: 2A DNA Sequenz:
CAGTGCACCAACTACGCCCTGCTCAAGCTCGCCGGCGACGTCGAGAGCAACCCCGGCCCC
Seq. ID NO:6: Aus 2A DNA abgeleitete Aminosäuresequenz
GIn Cys Thr Asn Tyr AIa Leu Leu Lys Leu AIa GIy Asp VaI GIu Ser Asn Pro GIy Pro
c) Konstruktion plAPGI
Das chromosomale Polygalacturonidase (pgl)-Gen wurde aus A. niger RH3544 isoliert und in pUC18 kloniert. Das entstandene Plasmid erhielt die Bezeichnung p27/1. Der Sequenzvergleich des pgl-Gens aus A. niger RH3544 mit dem pgal- Gen aus A. niger N400 (Bussink et al., 1991 , Curr. Genet 20 (4), 301-307, Accession Nr. X58892) zeigte eine Identität der Nucleotidsequenz von 92% bzw. der Aminosäuresequenz von 98%.
Aus der Sequenzinformation wurde die Fusion 2A-pgl-DNA Sequenz synthetisiert, in der die pgl-DNA mit ihrer Signalsequenz in-frame am 3'-Ende der 2A-Sequenz fusioniert ist. Dieses fusionierte DNA-Fragment enthält das offene Leseraster von 2A-pgl-DNA und zusätzlich die Xbal-Schnittstelle unmittelbar stromaufwärts der 2A-Sequenz. Das synthetische Fragment wurde in pUC18 Moniert und das ent- standene Plasmid wurde p2APGImodif genannt.
Die Konstruktion des Plasmids p2APGInativ erfolgte durch Einfügen des Stul- Tth 1111 Fragments des nativen pgrl-DNA Sequenz in das mit Stul-Tth111 l gespalten Plasmid p2APGImodif.
Zur Konstruktion des Plasmids plAPGI wurde die 1APGI-Sequenz mittels PCR aus dem Plasmid p2APGInativ amplifiziert. Die Amplifizierung erfolgte mit den folgenden Primern:
Seq. ID NO: 7: ppla GTGCTGCAAGGCGATTAAGTTG
Seq. ID NO: 8: PGI-SmaINhel TCCCCCGGGTTAGCAGCTAGCACCGGAAGGAACGTTCTCGCAGTC
Das PCR Produkt wurde mit Hindlll und Smal geschnitten und in das mit Hindlll und Smal geschnitten Plasmid pUC18 kloniert.
Das entstandenen Plasmid mit der Bezeichnung plAPGI enthält die pgl-DNA mit ihrer Signalsequenz in-frame am 3'-Ende der 2A-Sequenz. Dieses fusionierte DNA-Fragment enthält das offene Leseraster von 2A-pgl-DNA und zusätzlich die Xbal-Schnittstelle unmittelbar stromaufwärts der 2A-Sequenz und die Smal- Schnittstelle stromabwärts des pgl-Gens. d) pPyr-APGI
Das Plasmid plAPGI wurde mit Xbal und Smal geschnitten und das entstandene Fragment -APGI- in die Xbal und Smal-Schnittstellen in dem Plasmid pPyrAT in- seriert. Dadurch entstand ein offenes Leseraster aus der pyrA und APGI- Sequenz.
e) Konstruktion von pPqpd-Pyr-APG1
Die Pyr-APG1 -Sequenz wurde aus dem Plasmid pPyτ-APG1 mit den Primern
Seq. ID NO: 9: PyrBspHI : CGÄATTCATGAGCTCCAAGTCGCAATTGACC Seq. ID NO: 10: PGIBspHI : GGAATTCATGATTAGCAAGAAGCACCGGAAGG
mittels PCR amplifiziert. Das PCR Produkt wurde mit BspHI geschnitten und das entstandene Fragment in das mit Ncol geschnittene Plasmid pAN52-1 kloniert (Punte et al., 1987, Gene 56, 117-124, Accession Nr. Z32697). Das erhaltene Plasmid hat die Bezeichnung pPgpd-Pyr-APGI und enthält die Fusion aus pyrA- und APGI-Sequenz unter der Kontrolle des A. π/du/ans-gpd-Promotors.
Das Plasmid wurde durch Restriktionsendonucleasen kartiert und durch Sequenzierung bestätigt. Das Plasmid ist in Fig. 3 dargestellt und ist unter der Hinterlegungsnummer DSM 18363 am 14.06.2006 hinterlegt worden.
Beispiel 2: Konstruktion des Expressionsplasmids pPXT-APGI-KexPG1
Die Konstruktion des Expressionsplasmids pPXT-APGI-KexPG1 erfolgte durch folgende Schritte: a) Konstruktion von pKexPGI
Die KexPGI-Sequenz, die die Kexll-Sequenz (LysArg) unmittelbar stromaufwärts des reifen pgrl-Gens enthält, wurde mittels PCR aus dem Plasmid pKR-1APGI amplifiziert. Die Amplifizierung erfolgte mit den folgenden Primern:
Seq. ID NO: 11: Spel-PGI GACTAGTTGCAAGCGCGCTCCCGCTCCTTCTCGCGTCTCTGAG Seq. ID NO: 12: NcoI-PGI ACAGCGCCGTCGGCCATGGTGACAGTCAG
Das PCR-Produkt wurde mit Spei und Ncol geschnitten und in das mit Spei und Ncol geschnittene Plasmid pKR-1APGI kloniert.
Das Plasmid pKR-1APGI wurde zuvor aus dem Plasmid plAPGI mittels PCR hergestellt und enthält die Kexll-Sequenz (LysArg) unmittelbar stromaufwärts des APGI-Gens enthält. Die Amplifizierung erfolgte mit den folgenden Primern:
Seq. ID NO: 13: pp2a. TTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAG
Seq. ID NO: 14: HindSpel CCCAAGCTTACTAGTTGCAAGCGCCAGTGCACCAACTACGCCCTGCTCA
Das PCR Produkt wurde mit Hindlll und Smal geschnitten und das mit Hindill und Smal geschnittene Plasmid pUC18 kloniert.
b) Konstruktion von plAPGI-KexPGI
Das Plasmid pKexPGI wurde mit Spei und EcoRI geschnitten und die Kex-PGI als Spel-EcoRI-DNA Fragment in das mit Nhel und EcoRI geschnittene Plasmid plAPGI kloniert.
Das entstandene Plasmid mit der Bezeichung pAPG1-KexPGI enthält ein offenes Leseraster aus der APG1 -Sequenz und der reifen PG1 -Sequenz, die mittels einer Kexll-Schnittstelle fusioniert. c) Konstruktion von pPXT
Die chromosomale DNA wurde aus A. foetidus RH3911 nach einer Vorschrift von Hynes et al. (1983, Mol.Cell.Biol 3, 1430-1439) präpariert. Das Xylanase (xy/)-Gen wurde als 4.5 kb EcoRI Fragment isoliert und in pUC18 kloniert. Das entstandene Plasmid erhielt die Bezeichnung pXyl8/1. Die DNA-Sequenz und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz zeigt eine Identität von 98% mit den Sequenzen des A. /cawacM-Xylanase-Gens (Ito et al., 1992, Biosci Biotechnol Biochem 56 (8), 1338-1340, Accession-Nr. D14848).
Das Plasmid pPXT geht aus dem Plasmid pXyl8/1 durch Einfügen weiterer Notl- Schnittstellen in die beiden EcoRI-Sites sowie eine Multicloning-Site, die die Schnittstellen Spei und Pmel enthält, unmittelbar stromaufwärts des Xylanase- Stopcodons hervor.
Die Konstruktion des Plasmid pPXT wurde mittels der PCR-Methode analog dem Prinzip, das in Nucleic Acids Research 1989, 17(2), 723-733 und Nucleic Acids Research 1990, 18(6), 1656 beschrieben ist, durchgeführt.
d) Konstruktion von pPXT-amdS
Aus dem Plasmid p3SR2 (Hynes et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3, 1430-1439; Kelly and Hynes, 1985, EMBO J. 4, 475-47) wurde das Acetamidase (amdS)-Gen mittels der PCR-Methode als BsiWI-Fragment isoliert und in das mit BsiWI geschnit- tene Plasmid pPXT inseriert.
Für die Amplifizierung des amdS-Gens wurden folgende Primer aus der Sequenzinformation des A. nidulans-Acetamidase-Gens abgeleitet:
Seq. ID NO: 15: BsiWI-amdS-P: CTAGATCGTACGCCAGGACCGAGCAAGCCCAGATG
Seq. ID NO: 16: BsiWI-amdS-T : CTTACGTACGATCACATTTGAGATATAACCCATTTGGTGAG
Das erhaltene Plasmid hat die Bezeichnung pPXT-amdS. e) Konstruktion von p PXT-APG 1-KexPG I
Das Plasmid pAPGI-KexPGI wurde mit Xbal und Smal geschnitten und die Fusion APGI-KexPGI als Xbal-Smal-Fragment in das mit Spei und Pmel geschnittene Plasmid pPXT-amdS eingefügt.
Das entstandene Plasmid p PXT-APG 1-KexPG1 enthält ein offenes Leseraster aus der Xylanasesequenz und der Fusion APG1-KexPG1.
Das Plasmid wurde durch Restriktionsendonucleasen kartiert und durch Sequenzierung bestätigt. Das Plasmid ist in Fig. 4 dargestellt und ist unter der Hinterlegungsnummer DSM 18364 am 14.06.2006 hinterlegt worden.
Beispiel 3: Konstruktion des Expressionsplasmids pX-1APEsyn
Die Konstruktion des Expressionsplasmids pX-1APEsyn erfolgt durch folgende Schritte:
a) Konstruktion von pXvITxyl
Das Plasmid pXylTxyl enthält das 1 ,1.kb Xylanasegen (xyl) und das 2,6 kb Terminatorfragment des Xylanasegens.
Aus dem Plasmid pXyl8/1 (Beispiel 2, b) wurde das N-terminale Xylanase Gen mittels PCR amplifiziert. Folgende Primer wurden verwendet:
Seq. ID NO: 17 NXyIl CCGAAGCTTGCGGCCGCACCAGCATTTAGCTTTCTTCAATCATC Seq. ID NO: 18 Nxyl2 GCTCTAGAATGCCGGCACTTCGCGACACCAGAACAGGTTC
Das PCR Produkt wurde mit Hindlll und Xbal geschnitten und das mit Hindill und Xbal geschnittene Plasmid pUC18 kloniert. Das entstandene Plasmid hat die Bezeichnung pNXyl. Aus dem Plasmid pXyl8/1 (Beispiel 2, b) wurde das C-terminale Xylanase Gen mittels PCR amplifiziert. Folgende Primer wurden verwendet:
Seq. ID NO: 19: CXyIl CTAGCCGGCATTAACGCCGTGCAAAACTACAACGGCAACCTTG Seq. ID NO: 20 Cxyl2 GCTCTAGAGGAGATCGTGACACTGGCGCTG
Das PCR Produkt wurde mit Nael und Xbal geschnitten und das mit Nael und Xbal geschnittene Plasmid pNXyl eingebaut. Das entstandene Plasmid hat die Bezeichnung pXylAβ. Das Xylanase Gen hat kein Stop-Codon und die Xbal Schnittstelle ist unmittelbar stromabwärts der Xylanase-DNA-Sequenz.
Die Xbal Schnittstelle wurde danach zur Spel-Schnittstelle mittels der PCR Methode analog dem Prinzip, das in Nucleic Acids Research 1989, 17(2), 723-733 und Nucleic Acids Research 1990, 18(6), 1656 beschrieben ist, geändert und das entstandene Plasmid erhält die Bezeichnung pXylA6-Spe.
Das Plasmid pXylTxyl wurde durch Einfügen des 2.6 kb Smal-EcoRI Terminatorfragments in das mit Smal und EcoRI geschnittene Plasmid pXylA6-Spe herge- stellt.
Für die Amplifizierung des Xylanase-Terminators wurden folgende Primer verwendet:
Seq. ID NO: 21 pp2a TTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAG
Seq. ID NO: 22: TXyI Smal TAGCCCGGGATAAGTGCCTTGGTAGTC
In dem entstandenen Plasmid pXylTxyl trägt das Xylanasegen vor dem Startcodon und in 5'-Richtung bis zur Hindlll-Notl Schnittstelle nur noch 28 bp. b) Konstruktion von pAPEsyn
Die Fusion-Konstruktion aus der 2A-DNA-Sequenz (Beispiel 1 , b) und dem synthetischen A. niger Pectinmethylesterase (PEsyn)-Gen wurde unter Verwendung des Codongebrauchs von Aspergillus (http://www.kazusa.or.jp/codon) bei Entele- chon (Germany) synthetisiert und in das Plasmid pUC18 kloniert. Der Sequenzvergleich des synthetischen PEsyn Gens mit dem nativen A. niger PE Gen (Khanh et al., 1991, Gene 106, 71-77; Accession Nr. X54145) zeigt eine Identität der Nuc- leotidsequenz von 90% bzw. der Aminosäuresequenz von 100%. In dieser Kon- struktion ist das PEsyn-Gen mit seiner Signalsequenz unmittelbar am 3'-Ende der 2A-DNA-Sequenz zu einem offenem Leseraster fusioniert. Darüber hinaus enthält die Fusion eine Xbal-Schnittstelle unmittelbar stromaufwärts der 2A-DNA- Sequenz und eine Smal-Schnittstelle unmittelbar stromabwärts des PEsyn- Stopcodons. Das PEsyn Gen ist somit am 3'-Ende um vier Aminosäuren (KRAS) verlängert. Die Nucleotide Sequenz der Aminosäuren wurde so gewählt, dass die Schnittsstelle Nhel direkt nach der KR-Sequenz vorliegt.
c) Konstruktion des Expressionsplasmids pX-1APEsvn
Das Plasmid pAPEsyn wurde mit Xbal und Smal geschnitten und die Fusion A- PEsyn als Xbal-Smal-Fragment in das mit Spei und Smal geschnittene Plasmid pXylTxyl eingefügt.
Das entstandene Plasmid pX-1APEsyn enthält ein offenes Leseraster aus der Xy- lanase- und der APEsyn-Sequenz.
Das Plasmid wurde durch Sequenzierung bestätigt. Das Plasmid ist in Fig. 5 dargestellt und ist unter der Hinterlegungsnummer DSM 18365 am 14.06.2006 hinterlegt worden. Beispiel 4: Konstruktion des Expressionsplasmids pX-1APEnat
Das Plasmid plAPEnat trägt die Fusion aus der 2A-DNA-Sequenz (Beispiel 1 , b) und dem nativen A. niger Pectinmethylesterase (PEnat)-Gen. Die Konstruktion erfolgte durch Einfügen des AccIII-PpuMI-Fragment aus dem Plasmid, das das native Gen enthält, in das mit Acclll und PpuMI gespaltene Plasmid plAPEsyn. Die Konstruktion wurde durch Kartierung und Sequenzierung bestätigt.
Die Konstruktion sowie die Klonierung des Plasmids pX-1APEnat erfolgten analog der in Beispiel 3 beschriebenen Herstellung des Plasmids pX-1APEsyn.
Das Plasmid pX-1APEnat wurde durch Kartierung und Sequenzierung bestätigt und ist in Fig. 6 dargestellt und ist unter der Hinterlegungsnummer DSM 18366 am 14.06.2006 hinterlegt worden.
Beispiel 5: Konstruktion des Expressionsplasmids pX-2APEsyn
Das Plasmid pX-2APEsyn enthält die Fusion Xyl-2A-PEsyn-Kexll-2A-PEnat.
Zur Konstruktion des Plasmids pX-2APEsyn wurde das Xbal-Smal-Fragment aus dem Plasmid plAPEnat in das mit Nhel und Smal geschnittene Plasmid pX- lAPEsyn eingebaut.
Die Konstruktion wurde durch Kartierung und Sequenzierung bestätigt und ist in Figur 7 dargestellt und ist unter der Hinterlegungsnummer DSM 18367 am 14.06.2006 hinterlegt worden.
Beispiel 6: Konstruktion des Expressionsplasmids pX-2APEnat
Das Plasmid pX-2APEsyn enthält die Fusion Xyl-2A-PEnat-Kexll-2A-PEsyn. Zur Konstruktion des Plasmids pX-2APEnat wurde das Xbal-Smal-Fragment aus dem Plasmid plAPEsyn in das mit Nhel und Smal geschnittene Plasmid pX- lAPEnat eingebaut.
Die Konstruktion wurde durch Kartierung und Sequenzierung bestätigt und ist in Figur 8 dargestellt und ist unter der Hinterlegungsnummer DSM 18368 am 14.06.2006 hinterlegt worden
Beispiel 7 Transformation von Aspergillus foetidus RH3911 und A. foetidus RH31260
Die Isolierung und Charakterisierung von n/aD-Mutanten (A. foetidus RH31260) aus dem Stamm A. foetidus RH3911 erfolgte nach der beschriebenen Methode von Cove (1976, Heredity 36, 191-203)
Die zur Transformation und zur Handhabung von Aspergillus verwendeten Techniken waren die gemäß Yelton et al (1984, PNAS 81 , 1470-1474). Die Transformation erfolgte nach folgendem Schema: Isolierung frischer Sporen, Beimpfung eines geeigneten Mediums, Suspendierung von frischem Myzel in geeignetem Medium und anschließende Gewinnung von Protoplasten mittels Behandlung mit dem Enzympräparat (Novozym ™ 234, ß-Glucuronidase). Die Transformation von -4sperg///us-Protoplasten erfolgte mit der DNA der Expressionskassette in Anwesenheit von CaCb und Polyethylenglycol.
Folgende DNA Expressionkassetten wurden isoliert und zur Transformation ver- wendet:
a) EcoRI-Xbal Fragment von pPgpd-Pyr-APG1 b) Notl-Fragment von p PXT-APG 1-KexPG1 c) EcoRI-Notl Fragment von pX-1APEsyn d) EcoRI-Notl Fragment von pX-1APEnat e) EcoRI-Notl Fragment von pX-2APEsyn f) EcoRI-Notl Fragment von pX-2APEnat Die Selektion von Λsperρ;/7/t/s-Transformanten, die das Notl-Fragment aus dem Plasmid pPXT-APGI-KexPGI enthalten, erfolgte auf amdS-Platten (Tiburn et al. (1983, Gene 26, 205-221).
Die Co-Transformation von DNA-Fragmenten isoliert aus den Plasmiden pPgpd- Pyr-APGI, pX-1APEsyn, pX-1APEnat, pX-2APEsyn und pX-2APEnat mit dem Hindlll-Mlul Fragment (niaD Marker) aus dem Plasmid pSTA10 wurden auf Nitrat- Platte selektioniert (Unkles et al, 1989, Gene 78, 157-166).
Transformanten, die die Expressionsvektoren tragen, wurden durch die qualitative Bestimmung der Pektinmethylesterase bzw. Polygalakturonidase-Aktivität im A- gar-Diffusionsverfahren isoliert (Khanh et al., 1991 , Gene 106, 71-77 und Rutt- kowski et al., 1991 , Mol Microbiol 5 (6), 1353-1361)
Beispiel 8: Sekretion von Pektinmethylesterase bzw. Polyglakturonidase in Schüttelkolben
Die Transformanten wurden im Schüttelkolben auf induzierendem Medium fol- gender Zusammensetzung gezüchtet:
Glucidex 1 ,7%, Glukose 1 ,15%, Maisquellpulver 1 ,4%, (NhU)2SO4 0,56%, KH2PO4 3%, Leitungswasser Rest, Einstellung des pH-Werts vor der Sterilisation auf pH 4,5.
Die nach 5-tägiger Züchtung erhaltenen Kulturfiltrate wurden für die SDS-PAGE- Analyse und zur Bestimmung der Pektinaseaktivität (Polygalacturonidase bzw. Pektinmethylesterase; vgl. Referenzbeispiele 1 und 2) verwendet. Das Ergebnis ist in Tabelle 1 dargestellt.
Die Expressionskassetten mit den Polygalacturonidasegenen integrierten willkürlich im Genom, so dass die Ergebnisse auch die Anzahl der Genkopien wieder- spiegeln wie dies im Beispiel der Transformanten mit pPXT-APG1 KexPG1 zu sehen ist. Die beiden Beispiele zeigen, dass ein über eine 2A-selbstprozessierende Stelle angebundenes zu sekretierendes Protein, sowohl im Fall der Anbindung an ein intrazelluläres Protein (PYR) als auch bei Anbindung an ein sekretiertes Prote- in (Xylanase) als eigenständiges Protein sekretiert wird. Die Unterschiede in der Expressionshöhe gehen auch auf die verwendeten Promotoren (Pgpd und Pxyl) zurück. Dass beide über selbstprozessierende 2A-Schnittstellen angebundene Proteine sekretiert werden belegt das nächste Beispiel.
Bei den Transformanten mit den Pektinmethylesterase-Expressionskassetten, kann eine Transformante nur dann Pektinmethylesteraseaktivität zeigen, wenn die Expressionskassette in-Frame in den Locus integriert. Dadurch erhalten die Transformanten eine konstante Anzahl an Kopien und die Höhe der Pektinmethylesteraseaktivität steht in direktem Zusammenhang mit der Kopienzahl der pme- Gene. Kassetten, die an anderen Stellen im Genom integrieren oder nicht inFrame integrieren, können keine mRNA für das Konstrukt bilden, da sie keinen Promotor enthalten oder wegen Frame-shifts das offene Leseraster für die Kassette nicht unter der Kontrolle eines Promotors steht.
Der Vergleich von pX-1APEsyn mit pX-1APEnat zeigt, dass beide Gene ca. gleich gut exprimiert werden.
Der Vergleich von pX-1APESyn, oder pX1-APEnat, mit pX-2APEsyn, oder pX- 2APEnat, zeigt, dass im Fall der „2APE" Konstrukte beide Gene zur Expressions- höhe beitragen und damit, dass auch bei Expressionsvektoren mit mehreren gekoppelten Genen („doppelte Aktivität" im Kulturüberstand), alle Proteine einzeln sekretiert werden. Dies ist nur möglich, wenn im Fall der „2APE"-Konstrukte beide 2A-Stellen korrekt im Ribosom prozessiert werden. Die gefundenen Variationen in der Aktivitätshöhe im Kulturüberstand (Tab. 1) gehen auf Wachstumsunterschiede in den Schüttelkolben zurück. Diese Ergebnisse zeigen auch, dass auf die Nutzung einer proteolytischen Spaltstelle in Expressionskassetten mit mehreren Kopien einer DNA die für das gleiche Protein kodiert, verzichtet werden kann.
Tab.: 1: Pektinmethylesterase und Polygalacturonidase-Produktion durch Transformanten
Figure imgf000040_0001
Figure imgf000041_0001
Beispiel 9: SDS-PAGE Analyse und N-terminale Aminosäurebestimmung
Es wurden die Kulturmedien der in Beispiel 7 hergestellten Transformanten unter- sucht. Die Polygalacturonidase (PGI) im Kulturmedium wurde durch SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen nach Laemmli (1970, Nature 227, 680-685) charakterisiert.
Auf dem SDS-PAGE-GeI sieht man in beiden Fällen für das PGI Protein nur je eine Bande bei 55 kDa (Fig. 1 und Fig. 2). Es erscheint keine Bande bei dem möglichen „Fusionsprodukt" (XYL-2A-PGI mit 80 kDa). Zur Überprüfung wurden auch N-terminale Sequenzierungen durchgeführt.
Im Fall der Pektinmethylesterase (PME, 45 kDa) konnten auch keine Bande für das „Fusionsprodukt" XYL-2A-PE mit 70 kDa gefunden werden.
Die Ergebnisse der SDS-PAGE-GeI Analyse zeigen, dass entgegen der im Stand der Technik berichteten Aussage (ca. >10% nicht prozessierte Volllängen- Proteinprodukte) bei Verwendung der in den Beispielen genutzten 2A-Sequenz in filamentösen Pilzen, keine nicht-prozessierten Volllängen-Proteinprodukte auftreten. Weiterhin kann auch auf die Nutzung einer proteolytischen Spaltstelle verzichtet werden.
Für die N-terminale Aminosäurebestimmung wurden die Proteine nach der SDS- PAGE auf eine PVDF-Membrane transferiert, die Proteinbande isoliert und zur Aminosäurebestimmung verwendet. Die N-terminale Aminosäurebestimmung wurde bei ChromaTec GmbH (Germany) durchgeführt.
Es zeigte sich, dass sowohl das PME- als auch das PG1 -Protein als korrekt pro- zessierte, reife Proteine sekretiert werden (Tab.: 2). Die in Tabelle 2 angegebenen Sequenzen entsprechen den bekannten N-Termini der reifen Proteine von PME und PGL
Die Figur 1 zeigt die SDS-PAGE von Kulturüberständen aus mit dem Plasmid pPgpd-Pyr-APG1 transformierten Stämmen. Wirtsstamm (Gel 5), Markerproteine SDS-7, Sigma (Gel 4), die Stämme RH31480, RH 31481 und RH31483 (Gele 1 bis 3).
Die Fig. 2 zeigt die SDS-PAGE von Kulturüberständen aus mit dem Plasmid p PXT-APG 1 KexPG1 transformierten Stämmen. Wirtsstamm WT (Gel 1), Markerproteine Markerproteine SDS-7, Sigma (Gel 2), die Stämme RH31520 bis RH31527 (Gele 3 bis 10).
Tab.: 2: N-terminale Aminosäurebestimmung der Transformanten pPXT- APG1KexPG1 (RH31520) und pX-1APEsyn
Figure imgf000042_0001
Figure imgf000043_0001
Figure imgf000044_0001
Figure imgf000045_0001
Ġ
Figure imgf000046_0001
Figure imgf000047_0001
Figure imgf000048_0001
Figure imgf000049_0001
Figure imgf000050_0001
Figure imgf000051_0001
Figure imgf000052_0001
Figure imgf000053_0001
Figure imgf000054_0001
Figure imgf000054_0002

Claims

Patentansprüche
1. Vektorkonstrukt zur Expression und Sekretion von Polypeptiden in filamentö- sen Pilzen, umfassend in 5'3'-Richtung in funktioneller Verknüpfung
- gegebenenfalls einen Promotor, dem ein Enhancer vorangestellt sein kann,
- mindestens eine ein erstes Polypeptid codierende DNA-Sequenz, die eine Signalsequenz enthalten kann oder nicht, - gegebenenfalls eine DNA-Sequenz, die eine 2A-Spaltstelle oder eine davon abgeleitete Sequenz codiert, gegebenenfalls zusammen mit einer vorangestellten eine proteolytische Spaltstelle codierenden DNA- Sequenz oder gegebenenfalls eine DNA-Sequenz, die eine proteolytische Spaltstelle codiert, - eine ein zweites Polypeptid mit Signalsequenz codierende DNA-
Sequenz,
- gegebenenfalls eine weitere DNA-Sequenz, die eine 2A-Spaltstelle o- der eine davon abgeleitete Sequenz codiert, gegebenenfalls zusammen mit einer vorangestellten eine proteolytische Spaltstelle codieren- den DNA-Sequenz oder gegebenenfalls eine DNA-Sequenz, die eine proteolytische Spaltstelle codiert,
- gegebenenfalls eine ein drittes Polypeptid mit Signalsequenz codierende DNA-Sequenz, gegebenenfalls eine weitere DNA-Sequenz, die eine 2A-Spaltstelle o- der eine davon abgeleitete Sequenz codiert, gegebenenfalls zusammen mit einer vorangestellten eine proteolytische Spaltstelle codierenden DNA-Sequenz oder gegebenenfalls eine DNA-Sequenz, die eine proteolytische Spaltstelle codiert, gegebenenfalls eine ein viertes Polypeptid mit Signalsequenz codie- rende DNA-Sequenz, einen Terminator, wobei in dem Konstrukt mindestens eine 2A-Spaltstelle oder eine davon abgeleitete Sequenz vorhanden ist.
2. Vektorkonstrukt nach Anspruch 1, dadurch geke n nze i ch net, dass mindestens eines der codierten Polypeptide ein sekretiertes Polypeptid ist.
3. Vektorkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch geke n nze ich net , dass mindestens eines der codierten Polypeptide ein nicht- sekretiertes Polypeptid ist.
4. Vektorkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch geke n nze ich net, dass mindestens eines der codierten Polypeptide ein sekretiertes Polypeptid ist und mindestens eines der codierten Polypeptide ein nicht- sekretiertes Polypeptid ist.
5. Vektorkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch geke n n ze ich net, dass die Sequenz der 2A-Spaltstelle die 2A-Sequenz des Maul- und Klauenseuchevirus (FMDV) umfasst oder daraus besteht.
6. Vektorkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch geke n nzeich net, dass die Sequenz, die von der 2A-Spaltstelle abgeleitet ist, die folgenden Sequenzen umfasst oder daraus besteht: TLN F D LLKLAG DVES N PG P, LLKLAGDVESNPGP, QCTNYALLKLAGDVESNPGP,
EARHKQKIVAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP, APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP, Sequenzen mit einer Identität von 80-99% zu den Motiven -DxExNPGP-, -GxExNPGP-, L L N F D L L K LAG D DVE/Q S/J/F N/H/E/Q P G P/A, wobei x für eine beliebige Aminosäure steht.
7. Vektorkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekenn- ze ich net , dass die DNA-Sequenz, die eine proteolytische Spaltstelle codiert, ausgewählt ist aus der Furinspaltstelle, der FaktoMOa-Spaltstelle, der Signalpeptidase-1 -Spaltstelle, der Thrombinspaltstelle oder der Kexll-Spaltstelle.
8. Vektorkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch geken nze ich net, dass die das erste Polypeptid codierende DNA-Sequenz eine Sequenz ist, die Polygalacturonidase codiert.
9. Vektorkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch ge ke n nze ich net, dass die das zweite Polypeptid codierende DNA-Sequenz eine Sequenz ist, die Pektinmethylesterase codiert.
10. Vektorkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch geken nzeich net, dass ein Promotor vorhanden ist und der Promotor ausgewählt ist aus dem Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase-Promotor von Aspergillus nidulans, dem Amylase-Promotor von Aspergillus oryzae und dem Pektinmethy- lesterase-Promotor von Aspergillus niger.
11. Vektorkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 10, ausgewählt aus folgenden Konstrukten, umfassend jeweils in 5'3'-Richtung in funktioneller Verknüpfung:
- Enhancer-Promotor-Protein1-2A-Sig2-Protein2-Terminator
- Enhancer-Promotor-Protein1-Kexll-2A-Sig2-Protein2-Terminator - Enhancer-Promotor-Protein1-2A-Sig2-Protein2-2A-Sig3-Protein3-
Terminator
- Enhancer-Promotor-Protein1-Kexll-2A-Sig2-Protein2-2A-Sig3-Protein3- Terminator
- Enhancer-Promotor-Protein1-Kexll-2A-Sig2-Protein2-Kexll-2A-Sig3- Protein3-Terminator
- Enhancer-Promotor-Sig1 -Protein 1-2A-Sig2-Protein2-Terminator
- Enhancer-Promotor-Sig1-Protein1-Kexll-2A-Sig2-Protein2-Terminator
- Enhancer-Promotor-Sig1 -Protein 1-2A-Sig2-Protein2-2A-Sig3-Protein3- Terminator - Enhancer-Promotor-Sig1-Protein1-Kexll-2A-Sig2-Protein2-Kexll-2A-Sig3-
Protein3-Terminator - Enhancer-Promotor-Sig1 -Protein 1-Kexl I-2A-Sig2-Protein2-Kexll-2A-Sig3- Protein3-Terminator.
12. Rekombinantes Polypeptid produziert durch eine mit einem Vektorkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 11 transformierte Zelle.
13. Wirtszelle transformiert mit einem Vektorkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 11.
14. Wirtszelle nach Anspruch 12, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass sie von einem Aspergillus- oder Trichoderma-Stamm abstammt.
15. Verfahren zur Produktion eines oder mehrerer Polypeptide in einem filamen- tösen Pilz, umfassend die Stufen i) Transformation einer Wirtszelle mit einem Vektorkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 11 , ii) Kultivieren der transformierten Wirtszelle von i) unter für die Expression und Sekretion des bzw. der Polypeptids/Polypeptide geeigneten Bedingungen, iii) Isolieren des/der so exprimierten Polypeptids/Polypeptide.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass der filamentöse Pilz ein Aspergillus- oder TπcΛocferma-Stamm ist.
17. Verwendung einer DNA-Sequenz, die eine 2A-Spaltstelle oder eine davon abgeleitete Sequenz codiert, gegebenenfalls zusammen mit einer vorangestellten eine proteolytische Spaltstelle codierenden DNA-Sequenz zur Herstellung eines Expressionssystems zur Expression und Sekretion von Polypeptiden in filamentö- sen Pilzen.
18. Verwendung nach Anspruch 17, dadurch g eken nzeich net , dass die Sequenz der 2A-Spaltstelle die 2A-Sequenz des Maul- und Klauenseuchevirus (FMDV) umfasst oder daraus besteht.
19. Verwendung nach einem der Ansprüche 17 oder 18, dadurch ge ken n zeich net , dass die Sequenz, die von der 2A-Spaltstelle abgeleitet ist, die folgenden Sequenzen umfasst oder daraus besteht: TLNFDLLKLAGDVESNPGP,
LLKLAGDVESNPGP, QCTNYALLKLAGDVESNPGP,
EARHKQKIVAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP, APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP, Sequenzen mit einer Identität von 80-99% zu den Motiven -DxExNPGP-, -GxExNPGP-, L L N F D L L K LAG D DVE/Q S/J/F N/H/E/Q P G P/A, wobei x für eine beliebige Aminosäure steht.
20. Verwendung nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch ge ken n- zeich net, dass die DNA-Sequenz, die eine proteolytische Spaltstelle codiert, ausgewählt ist aus der Furinspaltstelle, der FaktoMOa-Spaltstelle, der Signalpeptidase-1 -Spaltstelle, der Thrombinspaltstelle oder der Kexll-Spaltstelle.
21. Verwendung nach einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch geken n- zeich net, dass das heterologe Polypeptid ausgewählt ist aus Polygalactu- ronidase oder Pektinmethylesterase.
22. Verwendung nach einem der Ansprüche 17 bis 21, dadurch geke n nzeich net, dass der filamentöse Pilz ein Aspergillus- oder Tήchoderma- Stamm ist.
23. Verwendung eines Vektorkonstrukts nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Herstellung eines Expressionssystems zur Expression und Sekretion von Polypeptiden in filamentösen Pilzen.
PCT/EP2007/006448 2006-07-24 2007-07-19 Vektorkonstrukte und verfahren zur expression und sekretion von polypeptiden in filamentösen pilzen unter verwendung einer selbstprozessierenden 2a-spaltstelle WO2008012028A1 (de)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US12/309,365 US20100178671A1 (en) 2006-07-24 2007-07-19 Vector constructs and methods for expressing and secreting polypeptides in filamentous fungi using a self-processing 2a cleavage site
EP07765236A EP2049659A1 (de) 2006-07-24 2007-07-19 Vektorkonstrukte und verfahren zur expression und sekretion von polypeptiden in filamentösen pilzen unter verwendung einer selbstprozessierenden 2a-spaltstelle

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102006034124 2006-07-24
DE102006034124.4 2006-07-24
DE200610052204 DE102006052204A1 (de) 2006-11-06 2006-11-06 Vektorkonstrukte und Verfahren zur Expression und Sekretion von Polypeptiden in filamentösen Pilzen unter Verwendung einer selbstprozessierenden 2A-Spaltstelle
DE102006052204.4 2006-11-06

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2008012028A1 true WO2008012028A1 (de) 2008-01-31

Family

ID=38544125

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2007/006448 WO2008012028A1 (de) 2006-07-24 2007-07-19 Vektorkonstrukte und verfahren zur expression und sekretion von polypeptiden in filamentösen pilzen unter verwendung einer selbstprozessierenden 2a-spaltstelle

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20100178671A1 (de)
EP (1) EP2049659A1 (de)
WO (1) WO2008012028A1 (de)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108359014A (zh) * 2018-02-08 2018-08-03 四川农业大学 含有dhav-1 2a1-p的多肽及其介导的多蛋白共表达方法

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9404101B2 (en) 2011-08-24 2016-08-02 Novozymes, Inc. Methods for obtaining positive transformants of a filamentous fungal host cell
US8945876B2 (en) 2011-11-23 2015-02-03 University Of Hawaii Auto-processing domains for polypeptide expression
CA2996797A1 (en) * 2015-09-04 2017-03-09 Tocagen Inc. Recombinant vectors comprising 2a peptide
AU2017211359A1 (en) * 2016-01-27 2018-08-02 Total Raffinage Chimie Multigene expression in microalgae
US10590444B2 (en) 2016-01-29 2020-03-17 Total Raffinage Chimie Increased triacylglycerol production in microalgae

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005017149A1 (en) * 2003-06-03 2005-02-24 Cell Genesys, Inc. Compositions and methods for enhanced expression of recombinant polypeptides from a single vector using a peptide cleavage site

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19620649A1 (de) * 1996-05-22 1997-11-27 Roehm Gmbh Rekombinant hergestellte Lysophospholipase aus Aspergillus
US6361973B1 (en) * 1999-03-22 2002-03-26 Novozymes Biotech, Inc. Promoters for expressing genes in a fungal cell

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005017149A1 (en) * 2003-06-03 2005-02-24 Cell Genesys, Inc. Compositions and methods for enhanced expression of recombinant polypeptides from a single vector using a peptide cleavage site

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DE FELIPE ET AL: "E unum pluribus: multiple proteins from a self-processing polyprotein", TRENDS IN BIOTECHNOLOGY, ELSEVIER PUBLICATIONS, CAMBRIDGE, GB, vol. 24, no. 2, February 2006 (2006-02-01), pages 68 - 75, XP005269058, ISSN: 0167-7799 *
FELIPE DE P ET AL: "Targeting of proteins derived from self-processing polyproteins containing multiple signal sequences", TRAFFIC, MUNKSGAARD,, DK, vol. 5, no. 8, August 2004 (2004-08-01), pages 616 - 626, XP002375856, ISSN: 1398-9219 *
FELIPE DE P: "POLYCISTRONIC VIRAL VECTORS", CURRENT GENE THERAPY, XX, XX, vol. 2, no. 3, 2002, pages 355 - 378, XP008045198, ISSN: 1566-5232 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108359014A (zh) * 2018-02-08 2018-08-03 四川农业大学 含有dhav-1 2a1-p的多肽及其介导的多蛋白共表达方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20100178671A1 (en) 2010-07-15
EP2049659A1 (de) 2009-04-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE3752379T2 (de) Verfahren zur Herstellung von Proteinprodukten in Aspergillus-Oryzae und in Aspergillus zu verwendender Promotor
DE69734936T2 (de) Wirtszellen und methoden für die produktion von proteinen
KR100212232B1 (ko) 진균원으로부터의 크실라나제 유전자의 클로닝 및 발현
JP3542604B2 (ja) Ｙａｐ３シグナルペプチドをコードするｄｎａ構築体
DD300886A5 (de) Clonierung und Expression von mikrobieller Phytase
DE69535181T2 (de) Öl-körper proteine als träger von hochwertigen peptiden in pflanzen
WO2008012028A1 (de) Vektorkonstrukte und verfahren zur expression und sekretion von polypeptiden in filamentösen pilzen unter verwendung einer selbstprozessierenden 2a-spaltstelle
HUT68751A (en) A method of constructing synthetic leader sequences
HU221118B1 (en) Synthetic leader peptide sequences
JPS63501331A (ja) 糸状菌類のプロモ−タ−及びその使用法
DE69636899T2 (de) Wirtszelle, die reduzierte mengen einer metalloprotease exprimiert und methoden zur verwendung dieser wirtszelle zur proteinproduktion
WO2001081597A1 (de) Verfahren zur herstellung rekombinanter proteine durch gram-negative bakterien
JP2866739B2 (ja) アスペルギルスエンドキシラナーゼ▲ｉｉ▼遺伝子に由来する発現／分泌調節領域を用い、形質転換したカビでタンパク質を産生して分泌させるための方法
JP3305781B2 (ja) 新規なるｄｎａ分子及び宿主
DD283838A5 (de) Verfahren zur herstellung eines polypeptids
JP5662363B2 (ja) 難発現性タンパク質の分泌のためのタンパク質融合因子（ｔｆｐ）を明らかにする方法、タンパク質融合因子（ｔｆｐ）ライブラリーを製造する方法、及び難発現性タンパク質の組み換え的生産方法
JP3433807B2 (ja) 新規アミノ酸配列及び該アミノ酸配列をコードするｄｎａを保有する発現ベクターを組み込んだバチルス・ブレビスを用いる有用物質の製造法
DE69837086T2 (de) Verbesserte prokariontische proteinenexpression
WO2000075344A1 (en) Pectate lyase fusion for expression and secretion of polypeptides
DE69627787T2 (de) Actinomyceten-Promotor
WO1995019441A1 (en) Exploitation of the cellulase enzyme complex of neurospora
DE102006052204A1 (de) Vektorkonstrukte und Verfahren zur Expression und Sekretion von Polypeptiden in filamentösen Pilzen unter Verwendung einer selbstprozessierenden 2A-Spaltstelle
JPH04501855A (ja) ストレプトマイシスにおけるｓａｆポリペプチド、遺伝子、プロモーターおよび発現用途
AU621277B2 (en) Shortened phosphoglycerate kinase promoter
DE60024596T2 (de) Sequenzen zur verbesserung der sekretionseffizienz von nicht-sekretierten proteinen in säugetier- und insektenzellen

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 07765236

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

DPE1 Request for preliminary examination filed after expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2007765236

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: RU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 12309365

Country of ref document: US