DE60024596T2

DE60024596T2 - Sequenzen zur verbesserung der sekretionseffizienz von nicht-sekretierten proteinen in säugetier- und insektenzellen

Info

Publication number: DE60024596T2
Application number: DE60024596T
Authority: DE
Inventors: Kostas Attkis IATROU; Patrick J. Calgary FARRELL; A. Leo BEHIE
Original assignee: University Technologies International Inc
Current assignee: University Technologies International Inc
Priority date: 1999-02-24
Filing date: 2000-02-23
Publication date: 2006-09-07
Anticipated expiration: 2020-02-24
Also published as: WO2000050616A3; CA2360847A1; AU2789000A; EP1157120B1; WO2000050616A2; ATE312185T1; DE60024596D1; EP1157120A2

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Konstruktion von heterologen Genkonstrukten durch DNA-Rekombinationstechniken für eine effizientere Prozessierung und Sekretion von heterologen Genen in Säuger- und Insektenzellen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines zur Sekretion befähigten Polypeptids, das mit einem nicht zur Sekretion befähigten Polypeptid im Leseraster verbunden ist, um die Sekretion des nicht zur Sekretion befähigten Polypeptids zu beeinflussen, wobei das zur Sekretion befähigte Polypeptid die vollständige Aminosäuresequenz der Juvenilhormon-Esterase (JHE) von Insekten oder einen Teil davon umfaßt, wobei dieser Teil fähig ist, die Sekretion eines nicht zur Sekretion befähigten heterologen Proteins in einer höheren Rate als das bloße Signalpeptid der JHE zu veranlassen.
Beschreibung des verwandten Fachgebiets
Rekombinante Polypeptide für Anwendungen in der Medizin, Forschung und Tiermedizin werden mit Hilfe einer großen Vielfalt von genetisch veränderten Organismen hergestellt, welche transgene Tiere (z.B. Kühe oder Ziegen), transgene Pflanzen (z.B. Raps), rekombinante Viren (z.B. Baculoviren) sowie transformierte Prokaryontenzellen (z.B. Bakterien) und Eukaryontenzellen (z.B. Hefe und tierische Zellen) in Kultur einschließen.
Da die meisten der Proteine Glycoproteine sind, die eine komplexe posttranslationale Modifikation erfordern, sind Expressionssysteme unter Verwendung von Hefe und Bakterien ungeeignet. Aus diesem Grund wurden andere Proteinexpressionssysteme unter Verwendung höherer Eukaryonten einschließlich auf Viren wie Baculoviren und Adenoviren basierende Expressionssysteme sowie die Expression durch transformierte Säugerzellen (CHO, BHK, NsO, etc. sowie die Erzeugung in der Milch von transgenen Nutztieren) entwickelt. Jedoch sind selbst diese besonders fortschrittlichen Vehikel zur Proteinherstellung wegen Schwierigkeiten bei der Gewinnung und Reinigung der rekombinanten Proteine unzulänglich.
Virale Expressionssysteme können außerordentlich hohe Mengen von rekombinanten Proteinen in sowohl Insekten- (Maiorella et al., 1988) als auch Mauszelllinien (Garnier et al., 1994) herstellen, weisen aber ernsthafte biologische und konstruktionelle Nachteile auf. Erstens, da die Wirtszellen am Ende jedes Infektionszyklus abgetötet werden, ist die Proteinexpression nur vorübergehend. Das bedeutet auch, daß die Proteinexpression nicht für die Perfusion-Bioreaktoren gemäß dem Stand der Technik geeignet sind. Zweitens ist die biologische Authentizität des exprimierten Proteins nicht gewährleistet, da der für posttranslationale Modifikationen notwendige Zellapparat in den letzten Stadien der Infektion inaktiviert wird. Es wird häufig über ungeeignete N-gebundene Glycosylierungsmuster für Proteine nach einer Infektion mit rekombinanten Viren berichtet, was die normalen Glycosylierungseigenschaften der Zellwirte verändert (Jarvis und Summers, 1989). Es ist jedoch bekannt, daß die Lepidoptera-Insektenzellwirte in der Lage sind, die komplexe Oligosaccharid-Prozessierung durchführen, welche für die in vivo-Verwendung von Proteinen in Menschen erforderlich ist (Davis und Wood, 1995). Drittens, obwohl native Gene, welche alle oder einen Teil ihrer Introns enthalten, im Allgemeinen in einer höheren Rate als die entsprechenden cDNAs exprimiert werden (Brinster et al., 1988), können virusinfizierte Insektenzellen die Introns aus einer exprimierten genomischen DNA nicht effizient ausschneiden, wodurch die Expression eines fremden Proteins durch cDNAs allein begrenzt ist (O'Reilly et al., 1991). Viertens ist die Reinigung von rekombinanten Proteinen aus virusinfizierten Systemen kompliziert. Da Proteine in viralen Systemen wegen der Inaktivierung des Sekretionsweges bei der Infektion nicht effizient sezerniert werden können (Janris und Summers, 1989), müssen sie nach der Zelllyse aus Zelllysaten gewonnen werden. Die Anwesenheit von Proteasen in solchen Zelllysaten hat auch einen Abbau des überexprimierten Produkts zur Folge.
Ein Hauptproblem der Biotechnologie ist die Herstellung und Gewinnung von nicht zur Sekretion befähigten, rekombinanten Polypeptiden wie intrazellulären Proteinen oder Proteinuntereinheiten aus genetisch veränderten Organismen. Diese intrazellulären Proteine oder Proteinuntereinheiten können oft nur in mäßigen Raten innerhalb einer Zelle exprimiert werden, und die Reinigung davon muß Schritte beinhalten, um die Zellen zuerst zu lysieren, gefolgt durch komplizierte Verfahren, um die gewünschten Polypeptide aus vielen anderen intrazellulären Proteinen zu isolieren.
Alle sezernierten Proteine besitzen ein Konsensus-Signalpeptid von 10 bis 50 Aminosäuren an ihrem N-Terminus, welches das Protein zu dem Sekretionsweg von Eukaryontenzellen oder zu der Cytoplasmamembran von Prokaryontenzellen hinleitet. Daher haben einige Forschungsgruppen mit Hilfe der Gentechnik versucht, intrazelluläre Proteine durch die Fusion der Gensequenzen von Konsensus-Signalpeptiden im Leseraster mit dem 5'-Ende des Gens, welches das nicht zur Sekretion befähigte Polypeptid codiert, zu sezernieren. Wenn diese heterologen Gene exprimiert wurden, wurde jedoch festgestellt, daß die bloße Anwesenheit eines Konsensus-Signalpeptids für die effiziente Sekretion von nicht zur Sekretion befähigten Polypeptiden durch eine bestimmte biologische Membran nicht ausreichend ist, ein Problem, das auf dem Gebiet der Biotechnologie häufig auftritt. Zum Beispiel verknüpften Martens et al. (1995) die Signalsequenz des Gens der Juvenilhormon-Esterase mit dem 5'-Ende des Gens des insektiziden CrylA(b)-Kristallproteins, um eine Sekretion herbeizuführen, aber stellten fest, daß die Sekretion von den Insektenzellen in das Medium unzureichend war.
Ein Verfahren zur effizienten Sekretion von nicht zur Sekretion befähigten Polypeptiden wie Cytoplasmaproteinen, Kernfaktoren und Proteinuntereinheiten wäre wünschenswert. Dies würde ermöglichen, daß das rekombinante Protein in einer höheren Menge exprimiert werden kann. Zweitens, da das rekombinante Protein in den extrazellulären Raum sezerniert werden würde, würde die Reinigung des Peptids oder Proteins durch die Anwesenheit anderer intrazellulärer Proteine nicht erschwert werden und keine Schädigung der produzierenden Zellen beinhalten.
Die Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung der Erfindung unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen ersichtlich.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Expressionskassette, welche nützlich ist für die Sekretion eines heterologen Proteins als ein Fusionsprotein, umfassend ein Polynucleotid, codierend in 5'- zu 3'-Richtung: a) einen Promotor; b) ein Signalpeptid; c) ein zur Zellsekretion befähigtes Polypeptid, das die vollständige Aminosäuresequenz der Juvenilhormon-Esterase (JHE) von Insekten oder einen Teil davon umfaßt, wobei dieser Teil fähig ist, die Sekretion eines nicht zur Sekretion befähigten heterologen Proteins in einer höheren Rate als das bloße Signalpeptid von JHE zu veranlassen; und d) ein heterologes Protein, wobei die (b), (c) und (d) codierenden Polynucleotidsequenzen im Leseraster miteinander verbunden sind.
Gemäß einem zweiten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung auch einen Vektor, welcher nützlich ist für die Sekretion eines heterologen Proteins als ein Fusionsprotein, umfassend ein Polynucleotid, codierend in 5'- zu 3'-Richtung: a) einen Promotor; b) ein Signalpeptid; c) ein zur Zellsekretion befähigtes Polypeptid, welches die vollständige Aminosäuresequenz der JHE von Insekten oder einen Teil davon, wie vorstehend definiert, umfaßt; und d) ein heterologes Protein, wobei die (b), (c) und (d) codierenden Polynucleotidsequenzen im Leseraster miteinander verbunden sind.
Gemäß einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein in vitro-Verfahren zur Sekretion eines heterologen Proteins, umfassend das Einbringen einer Expressionskassette, die ein Polynucleotid umfaßt, welches in 5'- zu 3'-Richtung codiert: a) einen Promotor; b) ein Signalpeptid; c) ein zur Zellsekretion befähigtes Polypeptid, welches die JHE von Insekten ist; und d) ein heterologes Protein, wobei die (b), (c) und (d) codierenden Polynucleotidsequenzen im Leseraster miteinander verbunden sind, in eine Zelle unter Bedingungen, bei denen das heterologe Protein exprimiert und von der Zelle sezerniert wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein in vitro-Verfahren zur Sekretion eines heterologen Proteins durch Säugerzellen, umfassend das Einbringen einer Expressionskassette, die ein Polynucleotid umfaßt, welches in 5'- zu 3'-Richtung codiert: a) einen Promotor; b) ein Signalpeptid; c) ein zur Sekretion befähigtes Polypeptid, welches die Juvenilhormon-Esterase (JHE) von Insekten ist; und d) ein heterologes Protein, wobei die (b), (c) und (d) codierenden Polynucleotidsequenzen im Leseraster miteinander verbunden sind, in eine Säugerzelle unter Bedingungen, bei denen das heterologe Protein exprimiert und von der Säugerzelle sezerniert wird.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine schematische Darstellung der allgemeinen Konstruktion eines DNA-Moleküls für die Sekretion eines intrazellulären Proteins und/oder einer Proteinuntereinheit.
2A [SEQ ID NO: 12] ist eine schematische Darstellung der Konstruktion des DNA-Moduls unter Verwendung einer cDNA der Juvenilhormon-Esterase (JHE) als ein Beispiel für ein zur Sekretion befähigtes Polypeptid, um das bakterielle Cytoplasmaprotein CAT zu sezernieren.
2B ist eine Fotografie eines Western-Blots, welche die Sekretion des JHE-CAT-Fusionsproteins unter Verwendung des in 2A beschriebenen Sekretionsmoduls zeigt.
2C zeigt die Freisetzung des CAT-Proteins aus dem Fusionsprotein bei der Inkubation mit einer Enteropeptidase.
3A [SEQ ID NO: 12] ist eine schematische Darstellung der Konstruktion des DNA-Moleküls unter Verwendung einer cDNA der Juvenilhormon-Esterase (JHE) als ein Beispiel für ein zur Sekretion befähigtes Polypeptid, um das Kernprotein BmCF1 von Insekten zu sezernieren.
3B ist eine Fotografie eines Western-Blots, welche die Sekretion des JHE-BmCF1-Fusionsproteins unter Verwendung des in 3A beschriebenen Sekretionsmoduls zeigt.
4 [SEQ ID NO: 13] zeigt die DNA-Sequenz des Gens der Juvenilhormon-Esterase (JHE) aus Heliothis virescens, Genbank-Hinterlegungsnummer J04955 (Hanzlik et al., 1989). Das erste Translationsstartcodon, Methionin, ist fett gedruckt.
5 [SEQ ID NO: 12] ist für Vergleichszwecke eine schematische Darstellung der Konstruktion des DNA-Moleküls unter Verwendung einer cDNA des menschlichen Granulocyten-Makrophagenkoloniestimulierenden Faktors (GMCSF) als ein Beispiel für ein zur Sekretion befähigtes Polypeptid, um das CAT-Protein zu sezernieren.
6 [SEQ ID NO: 14] zeigt für Vergleichszwecke die DNA-Sequenz der cDNA des menschlichen Granulocyten-Makrophagenkoloniestimulierenden Faktors. Das erste Translationsstartcodon, Methionin, und das Translationsstoppcodon sind fett gedruckt.
7A ist eine Fotografie eines Western-Blots, welcher für Vergleichszwecke die Menge des CAT-Proteins und des GMCSF-CAT-Fusionsproteins innerhalb der Zelle zeigt. 7B ist eine Fotografie eines Western-Blots, welcher die Menge des CAT-Proteins oder des GMCSF-CAT-Fusionsproteins im Überstand zeigt. In beiden Figuren bedeuten: Bahn 1 = mit pIE1/153A transfizierte Zellen; Bahn 2 = mit pIE1/153A.CAT transfizierte Zellen; und Bahn 3 = mit pIE1/153A.GMCSF.HisEP.CAT transfizierte Zellen.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Expressionskassette, welche nützlich ist für die Sekretion eines heterologen Proteins, umfassend ein Polynucleotid, das in 5'- zu 3'-Richtung codiert: a) einen Promotor; b) ein Signalpeptid; c) ein zur Zellsekretion befähigtes Polypeptid, welches die vollständige Aminosäuresequenz der Juvenilhormon-Esterase (JHE) von Insekten oder einen Teil davon umfaßt, wobei dieser Teil befähigt ist, die Sekretion eines nicht zur Sekretion befähigten heterologen Proteins in einer höheren Rate als das bloße Signalpeptid von JHE zu veranlassen; und d) ein heterologes Protein, wobei die (b), (c) und (d) codierenden Polynucleotidsequenzen im Leseraster miteinander verbunden sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein in vitro-Verfahren zur Sekretion eines heterologen Proteins, umfassend das Transformieren einer Zelle mit einer Expressionskassette, die ein Polynucleotid umfaßt, das in 5'- zu 3'-Richtung codiert: a) einen Promotor; b) ein Signalpeptid; c) ein zur Zellsekretion befähigtes Polypeptid, welches die JHE von Insekten ist; und d) ein heterologes Protein, wobei die (b), (c) und (d) codierenden Polynucleotidsequenzen im Leseraster miteinander verbunden sind, unter Bedingungen, bei denen das heterologe Protein exprimiert und von der Zelle sezerniert wird.
Vor der ausführlicheren Besprechung dieser Erfindung werden jedoch zunächst die folgenden Begriffe definiert.
Definitionen
Der Begriff "Baculovirus" wird hierin alternativ zu dem Begriff "Kernpolyedervirus" oder "NPV" verwendet. Er umfaßt Viren, welche zur Untergruppe A der Familie der Baculoviridae gehören. Er schließt vorzugsweise die Viren ein, welche für die folgenden Insekten spezifisch sind: Bombyx sp., Autographica sp., Spodoptera sp. und andere Lepidoptera-Spezies.
Der Begriff "Expressionskassette" bedeutet ein Polynucleotid, das in 5'- zu 3'-Richtung codiert: a) einen Promotor; b) ein Signalpeptid; c) ein zur Zellsekretion befähigtes Polypeptid, welches die vollständige Aminosäuresequenz der JHE von Insekten oder einen Teil davon umfaßt, wobei dieser Teil befähigt ist, die Sekretion eines nicht zur Sekretion befähigten heterologen Proteins in einer höheren Rate als das bloße Signalpeptid von JHE zu veranlassen; und d) ein heterologes Protein, wobei die (b), (c) und (d) codierenden Polynucleotidsequenzen im Leseraster miteinander verbunden sind. Die Expressionskassette kann zusätzlich eine Sequenz umfassen, welche mRNA-Terminations- und Polyadenylierungssignale codiert. Die Expressionskassette ist befähigt, die Expression und Sekretion des heterologen Proteins als ein zur Sekretion befähigtes Polypeptid-heterologes Protein-Fusionsprotein zu veranlassen, wenn die Expressionskassette, welche das heterologe Protein enthält, in eine Zelle wie eine Insektenzellen eingebracht wird.
Der Begriff "Vektor" bedeutet eine Nucleinsäure, umfassend: (1) die Expressionskassette, und (2) DNA-Sequenzen, welche die Replikation und Selektion in Bakterien, zum Beispiel E. coli, erlauben. Der Vektor kann ein Plasmid, ein anderes Virus oder einfach ein lineares DNA-Fragment sein. Es wird erwogen, daß der Vektor ein künstliches Baculovirus-Chromosom (BVAC) sein kann, so wie es in der US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 09/136,419 mit dem Titel Baculovirus Artificial Chromosomes and Methods of Use, Aktenzeichen 028722-171, hiermit gleichzeitig eingereicht, welche die Priorität der Vorläufigen US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 60/056,807, eingereicht am 21. August 1997, beansprucht, wobei beide unter Bezugnahme hierin in ihrer Gesamtheit eingeschlossen sind, besprochen wird.
Der Begriff "Baculovirus-Chromosom" verweist auf das Genom des Baculovirus, wobei das Genom ringförmig ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das künstliche Baculovirus-Chromosom von dem Kernpolyedervirus von B. mori abge leitet. In einer anderen Ausführungsform ist das Chromosom von dem Kernpolyedervirus von A. californica oder einem anderen Kernpolyedervirus, das ein lef-8-Gen oder ein lef-8-ähnliches Gen enthält, abgeleitet.
Nachweisbare Marker sind Gene, welche den Nachweis von Zellen ermöglichen, die mit dem Gen transfiziert oder infiziert worden sind. Nachweisbare Marker schließen Reportergene und Selektionsgene ein. Reportergene sind Gene, die eine Eigenschaft auf die Zelle übertragen, welche nachweisbar ist. Geeignete Reportergene schließen das Gen, welches das grün fluoreszierende Protein codiert, das β-Galactosidase-Gen und das Chloramphenicol-Acetyltransferase-Gen ein. Selektionsgene sind Wildtyp-Allele von Genen, die Enzyme codieren, welche ermöglichen, daß die Zelle auf bestimmten Medien wie Antibiotika enthaltenden Medien wächst. Diese Gene schließen zum Beispiel die prokaryontischen Hygromycin-Resistenz- und Neomycin-Resistenz-Gene ein.
Das zur Sekretion befähigte Polypeptid oder SC-Polypeptid oder SCP ist ein Polypeptid, das ein vollständiges Juvenilhormon-Esterase-Protein von Insekten oder ein Teil dieses Proteins ist, welcher nicht nur ein Konsensus-Signalpeptid ist, das den vollständigen Durchgang des Polypeptids durch den Sekretionsweg der Zelle und durch die Cytoplasmamembran ermöglicht, wobei die Sekretion durch den Teil in einer höheren Rate stattfindet, als sie durch das bloße Signalpeptid des Proteins veranlaßt wird.
Der Begriff "SCP-Gen" verweist auf den Teil eines Gens, welcher ein zur Sekretion befähigtes Polypeptid codiert. Das Gen schließt nicht das Stoppcodon davon ein.
Der Begriff "Juvenilhormon-Esterase-Gen" oder "JHE-Gen" verweist zusätzlich zu der Signalsequenz davon auf den Teil des Juvenilhormon-Esterase-Gens, der ein Polypeptid codiert, das die Sekretion eines nicht zur Sekretion befähigten heterologen Proteins in einer höheren Rate als das bloße Signalpeptid des JHE-Gens veranlaßt, wenn das JHE-Gen an seinem 3'-Ende mit dem heterologen Gen im Leseraster funktionell verbunden ist. Das Juvenilhormon-Esterase-Gen schließt nicht das Stoppcodon davon ein. Der Begriff "JHE-Gen" verweist auf eine DNA-Sequenz von mindestens etwa 100 bp, stärker bevorzugt mindestens etwa 500 bp und am meisten bevorzugt ein vollständiges Gen, das mit der in 4 angegebenen DNA-Sequenz im Wesentlichen identisch ist. Das Juvenilhormon-Esterase-Gen ist von Heliothis virescens abgeleitet. Das JHE-Peptid ist der Teil des JHE-Proteins, welcher die Sekretion eines nicht zur Sekretion befähigten heterologen Proteins in einer höheren Rate als das bloße Signalpeptid des JHE-Gens veranlaßt, wenn das JHE-Peptid mit dem N-Terminus des heterologen Proteins verbunden ist.
Die Begriffe "Herstellung eines heterologen Proteins" oder "Expression eines heterologen Proteins" bedeuten, daß das Strukturgen, welches das heterologe Protein codiert, in eine mRNA transkribiert wird und daß die mRNA weiterhin in ein Protein translatiert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das heterologe Protein durch die Eukaryontenzelle ordnungsgemäß prozessiert, obwohl eine solche Prozessierung in einer gewebespezifischen Art und Weise erfolgen kann.
Der Begriff "Sezernieren" oder "Sekretion" bezieht sich auf den aktiven Export eines Proteins aus einer Zelle in den extrazellulären Raum. Im Allgemeinen erfolgt die Sekretion über einen Sekretionsweg in der Zelle, wobei zum Beispiel in Eukaryontenzellen das endoplasmatische Retikulum und der Golgi-Apparat daran beteiligt sind.
Der Begriff "Strukturgen" verweist auf solche DNA-Sequenzen, welche, wenn sie mit einem zellulären oder viralen Promotor funktionell verknüpft und im Leseraster mit dem Gen des zur Sekretion befähigten Polypeptids (SCP) verbunden sind, transkribiert werden und ein SCP-heterologes Protein-Fusionsprotein herstellen, das von den Zellen sezerniert wird.
Der Begriff "heterologes Strukturgen" oder "heterologes Gen" bezieht sich auf ein Strukturgen, das transkribiert wird und ein heterologes Protein herstellt, wenn es mit einem Promotor, welcher in der Wirtszelle wirksam sein kann, oder mit einem Enhancer und einem Promotor funktionell verknüpft ist, wobei das Strukturgen entweder durch die Infektion oder Transfektion von Zellen in Eukaryontenzellen eingebracht wird.
Der Begriff "heterologes Protein" verweist auf ein Protein, das durch ein heterologes Strukturgen codiert wird. Beispiele für heterologe Proteine sind Chloramphenicol-Acetyltransferase; menschliches alpha-Interferon (IFN-α); der Insulinähnliche Wachstumsfaktor-II (IGH-II); menschliches Interleukin 3; Maus-Interleukin 3; menschliches und Maus-Interleukin 4; p40^x des menschlichen T-lymphotropen Virus (HTLV-1); HTLV-1-env; gag, pol, sor, gp41 und gp120 des menschlichen Immunschwächevirus (HIV-1); Adenovirus-E1a; env (N) des Japanischen Encepha litisvirus; Rinderpapillomvirus-1 (BPV1)-E2, HPV6b-E2 und BPV1-E6; sowie die menschlichen Apolipoproteine A und B; β-Galactosidase; das Hepatitis-B-Oberflächenantigen; HIV-1-env; HIV-1-gag; HTLV-1-p40^x; menschliches IFN-β, menschliches Interleukin 2; c-myc; das Krüppel-Genprodukt von D. melanogaster, Blauzungenvirus-VP2 und -VP3; menschliches Parainfluenzavirus-Hämagglutinin (HA); die Influenza-Polymerasen PA, PB1 und PB2; Influenzavirus-HA; die GPC- und N-Proteine des lymphocytären Choriomeningitis-Virus (LCMV); das Aktivatorprotein von Neurospora crassa; das Polyomavirus-T-Antigen; das kleine t-Antigen des Affenvirus-40 (SV40); das große SV40-T-Antigen; die N- und Ns-Proteine des Punta Toro-Phlebovirus; Affen-Rotavirus-VP6; CD4 (T4); menschliches Erythropoietin; das Hantaan-Virus-Strukturprotein; der menschliche epidermale Wachstumsfaktor (EGF)-Rezeptor; der menschliche Insulinrezeptor; das 130 kD-Protein des menschlichen B-lymphotropen Virus; Hepatitis-A-Virus-VP1; menschliche Tyrosinhydroxylase; menschliche Glucocerebrosidase; das p53-Protein; Topoisomerasen; der Ecdyson-Rezeptor; DNA-Polymerase-Untereinheiten; die Untereinheiten I, II und III der RNA-Polymerase; sowie cytoplasmatische und nukleäre Faktoren.
Der Begriff "nicht zur Sekretion befähigte heterologe Proteine" verweist auf Proteine, welche natürlicherweise nicht von der Zelle in den extrazellulären Raum sezerniert werden. Beispiele für nicht zur Sekretion befähigte heterologe Proteine sind Chloramphenicol-Acetyltransferase; gag, pol und sor des menschlichen Immunschwächevirus (HIV-1); β-Galactosidase; c-myc; die Influenza-Polymerasen PA, PB1 und PB2; das Aktivatorprotein von Neurospora crassa; das p53-Protein; Topoisomerasen; der Ecdyson-Rezeptor; DNA-Polymerase-Untereinheiten; die Untereinheiten I, II und III der RNA-Polymerase; cytoplasmatische und nukleäre Faktoren; sowie nicht zur Sekretion befähigte Untereinheiten von sezernierten und nicht sezernierten Proteinen.
Der Begriff "Promotor" verweist auf eine DNA-Sequenz, welche die Transkription eines heterologen Gens in ein RNA-Transkript in Zellen initiiert und steuert. Der Promotor kann ein Baculovirus-Promotor sein, welcher aus irgendeinem von über 500 Baculoviren abgeleitet ist, die im Allgemeinen Insekten infizieren, wie zum Beispiel die Ordnungen Lepidoptera, Diptera, Orthoptera, Coleoptera und Hymenoptera, einschließlich zum Beispiel, aber nicht begrenzt auf, die viralen DNAs von Autographa californica MNPV, Bombyx mori NPV, Tricoplusia ni MNPV, Rachiplusia ou MNPV oder Galleria mellonella MNPV, wobei der Baculovirus-Promotor ein Baculovirus-Promotor des sehr frühen Gens IE1 oder IEN; eine Promotor-Region eines verzögert-frühen Gens wie der 39 K-Gen-Promotor oder ein Baculovirus-Promotor eines späten Gens wie der Polyhedrin-Gen-Promotor ist. Der Promotor kann auch ein zellulärer Promotor von Insekten wie der Aktin-Gen-Promotor, der ribosomale Genpromotor, der Histon-Gen-Promotor oder der Tubulin-Gen-Promotor sein. Der Promotor kann auch ein Säuger-Promotor wie der sehr frühe Cytomegalievirus-Promotor, der Promotor des großen SV40-T-Antigens oder der LTR-Promotor des Rous-Sarkom-Virus (RSV) sein.
Der Begriff "Enhancer" verweist auf eine cis-wirkende Nucleinsäuresequenz, welche die Transkription des Strukturgens erhöht und in einer orientierungs- und positionsunabhängigen Weise wirksam ist. Der Enhancer kann an jeder Stelle entweder stromaufwärts oder stromabwärts relativ zu dem Promotor wirksam sein. Der Enhancer kann irgendeine DNA-Sequenz sein, welche fähig ist, die Transkriptionsrate ausgehend von dem Promotor zu erhöhen, wenn der Enhancer mit dem Promotor funktionell verbunden ist, zum Beispiel der RSV-LTR-Enhancer, die Baculovirus-Enhancer HR1, HR2 oder HR3 oder der Enhancer des sehr frühen Genprodukts von CMV. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Enhancer das 1,2 kb große BmNPV-Enhancer-Fragment, das in der US-Patentanmeldung Nr. 08/608,617, welche unter Bezugnahme hierin eingeschlossen ist, besprochen wird.
Der Begriff "Signalsequenz" oder "Leadersequenz" verweist auf ein Polynucleotid, das eine Aminosäuresequenz codiert, d.h. ein "Signalpeptid" oder "Leaderpeptid", das den Transport eines Proteins über die Membran des endoplasmatischen Retikulums veranlaßt. Signalsequenzen sind auf dem Fachgebiet hinreichend charakterisiert worden und enthalten bekanntermaßen typischerweise 16–30 Aminosäurereste, aber können mehr oder weniger Aminosäurereste enthalten. Ein Konsensus-Signalpeptid besteht aus drei Regionen: einer basischen N-terminalen Region, einer zentralen hydrophoben Region und einer mehr polaren C-terminalen Region. Die zentrale hydrophobe Region enthält 4 bis 12 hydrophobe Reste, welche das Signalpeptid über die Membranlipiddoppelschicht während des Transports des wachsenden Polypeptids verankert. Das Signalpeptid wird üblicherweise innerhalb des Lumens des endoplasmatischen Retikulums durch als Signalpeptidasen bekannte zelluläre Enzyme abgespalten. So kann der Teil der DNA, welcher die Signalsequenz codiert, von dem Aminoterminus des SCP-heterologen Protein-Fusionsproteins während der Sekretion abgespalten werden. Dies hat die Herstellung des SCP-heterologen Protein-Fusionsproteins zur Folge, das aus dem SC-Polypeptid fusioniert mit dem heterologen Protein besteht.
Geeignete Signalpeptide oder Signalsequenzen schließen, aber sind nicht begrenzt auf, das JHE-Signalpeptid, das GMCSF-Signalpeptid, das Gewebeplasminogen-Aktivator-Signalpeptid, das Chorionprotein-Signalpeptid von Bombyx mori und das Mellitin-Signalpeptid der Honigbiene ein. Es wird auch erwogen, daß, wenn ein vollständiges JHE-Protein als das zur Sekretion befähigte Polypeptid verwendet wird, das vollständige Protein sein eigenes Signalpeptid einschließen kann. Daher ist es möglich, daß andere Signalpeptidsequenzen nicht notwendig sein müssen, um die Expression und Sekretion des heterologen Proteins zu bewirken.
Es wird auch erwogen, daß die Expression des heterologen Gens durch die Expression von anderen Faktoren, zum Beispiel des IE-1-Proteins von Kernpolyederviren oder des Herpes simplex-Virus-VP16-Transkriptionsaktivators, erhöht werden kann.
Der Begriff "funktionell verbunden" oder "funktionell verknüpft" bei der Beschreibung der Beziehung zwischen zwei DNA-Regionen bedeutet einfach, daß sie funktionell miteinander verbunden sind und daß sie auf dem gleichen Nucleinsäurefragment vorliegen. Ein Promotor ist mit einem Strukturgen funktionell verknüpft, wenn er die Transkription des Gens kontrolliert und er auf dem gleichen Nucleinsäurefragment wie das Gen vorliegt. Ein Enhancer ist mit einem Strukturgen funktionell verknüpft, wenn er die Transkription dieses Gens erhöht und er funktionell auf dem gleichen Nucleinsäurefragment wie das Gen vorliegt.
Der Begriff "verbunden im Leseraster" bedeutet, daß ein Gen an seinem 3'-Ende mit dem 5'-Ende eines zweiten Gens verbunden ist, so daß nach der Transkription und Translation der Gene ein einziges Fusionsprotein, umfassend die zwei Proteine, welche von den Genen codiert werden, hergestellt wird. Die zwei Gene können über eine Aminosäuren codierende Spacer-Nucleinsäuresequenz miteinander verbunden sein.
Der Begriff "Einbringen" verweist auf entweder eine Infektion oder Transfektion von Insektenzellen.
Der Begriff "Infektion" verweist auf die Invasion durch pathogene, virale Agentien von Zellen, worin die Bedingungen für ihre Replikation günstig sind. Eine solche Invasion kann durch das Aufbringen der Viruspartikel direkt auf die Insektenzellkultur oder durch Injektion des rekombinanten Virus in die Insektenlarven oder durch orale Aufnahme der Viruspartikel durch die Insekten erfolgen. Die Menge des in die Larven injizierten rekombinanten Virus reicht von 10² bis 10⁵ PBE des nicht eingeschlossenen Virus/Larve. Alternativ können die Larven über den oralen Weg unter Verwendung von Einschlußkörpern, welche die rekombinanten Viren tragen, infiziert werden. Im Allgemeinen entspricht die Menge der Einschlußkörper, welche an die Larven verfüttert wird, derjenigen Menge, welche für Wildtyp-Viren dem LD₅₀-Wert für diese Baculovirus-Spezies und diesen Insektenwirt entspricht. Der LD₅₀-Wert variiert mit jeder Baculovirus-Spezies und dem Alter der Larven. Ein Fachmann ist ohne weiteres in der Lage, die Menge der zu verabreichenden Einschlußkörper zu bestimmen. Typischerweise variiert die Menge von 10 bis 10⁶ Einschlußkörpern/Insekt.
Der Begriff "Transfektion" verweist auf eine Technik für das Einbringen einer gereinigten Nucleinsäure in Zellen durch eine Reihe von Methoden, die den Fachleuten bekannt sind. Diese schließen, aber sind nicht darauf begrenzt, Elektroporation, Calciumphosphat-Fällung, Lipofektion, DEAE-Dextran, Liposomen, rezeptorvermittelte Endocytose und Partikelübertragung ein. Das Polynucleotid kann auch verwendet werden, um Eier, Embryonen oder ex vivo- oder in vitro-Zellen mittels Mikroinjektion zu transfizieren. Zellen können mit dem hierin beschriebenen Polynucleotid mittels einer geeigneten, den Fachleuten bekannten Technik für das Einbringen wie zum Beispiel Liposomen transfiziert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Polynucleotid durch Mischen der DNA-Lösung mit Lipofectin^TM (Gibco-BRL Canada, Burlington, Ontario) und Zugeben des Gemisches zu den Zellen in die Insektenzellen eingebracht.
Der Begriff "Insektenzellen" verweist auf Insektenzellen von den Insektenarten, welche das Ziel einer Baculovirus-Infektion sind. Beispielsweise, ohne Einschränkung: Autographa californica, Bombyx mori, Spodoptera frugiperda, Choristoneura fumiferana, Heliothis virescens, Heliothis zea, Helicoverpa zea, Helicoverpa virescens, Orgyia pseudotsugata, Lymantria dispar, Plutella xylostella, Malacostoma disstria, Trichoplusia ni, Pieris rapae, Mamestra configurata, Mamestra brassica und Hyalophora cecropia.
Methodik
Signalpeptidsequenzen sind für die effiziente Sekretion von bestimmten Peptiden oder Proteinen wie einem Kernfaktor aus Eukaryontenzellen oft nicht ausreichend. Solche Peptide oder Proteine werden als nicht zur Sekretion befähigte Proteine bezeichnet.
Es ist nun festgestellt worden, daß die Fusion eines zur Sekretion befähigten Polypeptids, umfassend die vollständige Aminosäuresequenz der JHE von Insekten oder einen Teil davon, wie vorstehend definiert, mit dem 5'-Ende eines nicht zur Sekretion befähigten Proteins, eine effiziente Sekretion des Fusionsproteins von der Zelle in den extrazellulären Raum ermöglicht. Um eine anhaltend hohe Sekretionsrate von heterologen Proteinen in Zellen zu erzielen, werden die Zellen mit einer Expressionskassette transformiert, welche einen Promotor umfaßt, der funktionell mit einer Signalsequenz verbunden ist, welche wiederum im Leseraster mit einer Sequenz, die das zur Sekretion befähigte Polypeptid codiert, verbunden ist, die wiederum im Leseraster mit dem Gen verbunden ist, welches das heterologe Protein codiert. Die Verknüpfung des Gens für das zur Sekretion befähigte Polypeptid mit dem heterologen Gen erfolgt vorzugsweise im Leseraster, um sicherzustellen, daß sowohl das SCP-Gen als auch das heterologe Gen transkribiert und als ein einzelnes Fusionsprotein translatiert werden.
Um eine kontinuierliche Sekretion von heterologen Proteinen zu erzielen, können in einer Ausführungsform normale Insektenzellen in Gewebekulturen mit einem Vektor transformiert werden, enthaltend eine solche Expressionskassette, welche einen Promotor, eine Signalsequenz, die im Leseraster funktionell verbunden ist mit dem SCP-Gen, wie vorstehend definiert, das wiederum im Leseraster mit dem gewünschten heterologen Gen funktionell verbunden ist, umfaßt. Es wird erwogen, daß der Vektor auch ein zusätzliches Gen enthalten kann, das einen selektiven Marker (z.B. ein Antibiotikum-Resistenzgen unter der Kontrolle eines Promotors, der in Insektenzellen konstitutiv wirksam ist) exprimiert. Die Ausübung einer relevanten Selektion sollte die Integration einer oder mehrerer multipler Kopien des Plasmids in die Chromosomen der Insektenzellen zur Folge haben, wodurch eine Insekten zelllinie erzeugt wird, welche zur kontinuierlichen Sekretion des heterologen Proteins befähigt ist.
Es wird erwogen, daß die Expressionskassette auch eine Enhancer-Sequenz einschließen kann, welche die Transkriptionsrate ausgehend von dem Promotor erhöhen würde. Die Transkriptionsrate ausgehend von dem zellulären Promotor, der funktionell mit einem Enhancer verbunden ist, im Vergleich zu der Transkriptionsrate ausgehend von dem zellulären Promotor allein, ist vorzugsweise um mindestens etwa das 10-fache und stärker bevorzugt mindestens etwa das 100-fache höher.
Die Insektenzellen können ferner andere Transkriptionsfaktoren wie das IE-1-Protein exprimieren, welche die Transkription erhöhen. In einer Ausführungsform können die Insektenzellen mit einem Vektor, enthaltend das IE-1-Gen und ein geeignetes Resistenz-/selektierbares Markergen, transformiert werden. Die Ausübung einer relevanten Selektion sollte die Integration einer oder mehrerer multipler Kopien des Vektors in die Chromosomen der Zellen zur Folge haben, wodurch eine Insektenzelllinie erzeugt wird, welche zur kontinuierlichen Expression des IE-1-Genprodukts in einer hohen Rate befähigt ist. Folglich enthält die Zelllinie das IE-1-Gen in Abwesenheit eines zugegebenen Baculovirus. Eine solche Zelllinie kann anschließend mit weiteren Vektoren, welche die Expressionskassette, enthaltend einen Promotor von Insektenzellen, der mit dem JHE-Gen funktionell verbunden ist, und ein heterologes Gen enthalten, transformiert werden. Der zweite Vektor kann auch ein zusätzliches Gen umfassen, das eine Resistenz gegen ein zweites Selektionsmittel überträgt. In einer anderen Ausführungsform kann das Gen für das IE-1-Protein in den Vektor inseriert werden, der die Expressionskassette umfaßt, so daß der Vektor sowohl die JHE-heterologen Gene als auch das IE-1-Gen enthält. In beiden Fällen ist die Synthese des fremden Proteins kontinuierlich, da integrierte Expressionskassetten nicht durch eine Replikation verloren gehen können und die Insektenzellen nie sterben, da sie nicht durch irgendwelche Viren infiziert sind. Die Produktionsrate von heterologen Proteinen in Zellen, welche das IE-1-Gen exprimieren, im Vergleich zu Zellen ohne das IE-1-Gen ist vorzugsweise um mindestens etwa das 10-fache und stärker bevorzugt um mindestens etwa das 100-fache höher.
Der Vektor kann ein künstliches Baculovirus-Chromosom sein, so wie es in der US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 60/056,807 mit dem Titel Baculo virus Artificial Chromosomes and Methods of Use, Aktenzeichen dese Anwalts 028722-153, eingereicht am 21. August 1977 und unter Bezugnahme in seiner Gesamtheit eingeschlossen, besprochen wird. Solche künstlichen Baculovirus-Chromosomen würden sich nicht in die zellulären Chromosomen integrieren, sondern eher autonom replizieren, ohne die Zellen abzutöten.
Es ist erkennbar, daß die erfindungsgemäße Expressionskassette verwendet werden könnte, um irgendein heterologes Protein zu exprimieren und zu sezernieren. Die Expressionskassette ist jedoch besonders nützlich bei der Expression und Sekretion von heterologen Proteinen, von denen vorher angenommen wurde, daß sie nicht zur Sekretion befähigt sind.
Säugerzellen könnten mit einer erfindungsgemäßen Expressionskassette, worin das SCP das zur Sekretion befähigte Peptid der Juvenilhormon-Esterase ist, transfiziert werden. Verfahren zur Transfektion von Säugerzellen sind auf dem Fachgebiet bekannt. Wenn Säugerzellen verwendet werden, wären die Promotor- und Enhancer-Sequenzen vorzugsweise solche Promotor- und Enhancer-Sequenzen, welche zur Expression eines heterologen Gens in der Säugerzelle geeignet sind. Das heterologe Protein würde von der Säugerzelle als ein Fusionsprotein, worin das heterologe Protein im Leseraster mit dem Carboxylterminus des JHE-Peptids fusioniert ist, in den extrazellulären Raum sezerniert werden.
Das heterologe Protein wird von der Insektenzelle als ein Fusionsprotein, worin das heterologe Protein direkt oder über ein verbindendes Peptid im Leseraster mit dem Carboxylterminus des SC-Polypeptids fusioniert ist, in den extrazellulären Raum sezerniert. Das heterologe Fusionsprotein kann dann behandelt werden, um das SC-Polypeptid entfernen, wodurch ein aktives heterologes Protein erhalten wird. Um die Entfernung des SC-Polypeptids zu erleichtern, wird erwogen, daß das heterologe Gen mit dem SCP-Gen über eine verbindende Sequenz, welche eine Aminosäuresequenz codiert, oder ein verbindendes Peptid, das leicht gespalten werden kann, im Leseraster verbunden sein kann. Ein Beispiel für eine geeignete Spaltstelle ist die Nucleinsäuresequenz, welche die Aminosäuresequenz DDDDK codiert, eine Spaltstelle, welche durch die Protease Enteropeptidase aus dem Schweinedarm erkannt wird.
Die verbindende Sequenz kann auch eine DNA-Sequenz enthalten, die ein Spacer-Peptid codiert, das den Zugang zu der Spaltstelle erleichtert. Die verbin dende Sequenz kann auch eine Sequenz für die effiziente Reinigung des Fusionsproteins aus dem extrazellulären Raum enthalten. Ein Beispiel für eine solche Sequenz ist eine Nucleinsäuresequenz, welche sechs Histidinreste codiert, wobei die Reste an eine Ni(II)-NTA-Chromatographie-Matrix zur Affinitätsreinigung binden.
Nutzen
Diese Technik wäre zur extrazellulären Herstellung von nicht zur Sekretion befähigten Polypeptiden durch eine Insektenzelle für Anwendungen in der Medizin, Forschung oder Tiermedizin nützlich.
Wie aus der vorstehenden Offenbarung ersichtlich ist, hat die vorliegende Erfindung eine große Vielzahl von Anwendungen. Demgemäß werden die folgenden Beispiele nur zur Veranschaulichung und nicht zur Begrenzung bereitgestellt.
Beispiele
In den nachstehenden Beispielen haben die folgenden Abkürzungen die folgenden Bedeutungen. Falls nachstehend nicht definiert, haben die Abkürzungen folglich die auf dem Fachgebiet bekannten Bedeutungen.

ORF: = offenes Leseraster
kb: = Kilobase
mg: = Milligramm
ml: = Milliliter

Die in den nachstehenden Beispielen verwendeten Chemikalien wurden von den folgenden Firmen bezogen:

Amersham Canada Ltd., Oakville, Ontario, Kanada
J.T. Baker, Phillipsburg, New Jersey
BioRad Laboratories Ltd. Canada, Mississauga, Ontario, Kanada
Boehringer Mannheim, Laval, Quebec, Kanada
5 Prime-3 Prime, Inc., Boulder, Colorado
GIBCO BRL Canada, Burlington, Ontario, Kanada
Hyclone Laboratories, Inc., Logan, Utah
ICN Biopharmaceuticals Canada Ltd., Montreal Quebec, Kanada
JRH Biosciences, Inc., Lenexa, Kansas
Life Technologies, Burlington, Ontario, Kanada
New England Biolabs, Inc., Mississauga, Ontario, Kanada
Pharmacia LKB, Baie d' Urfe', Quebec, Kanada
Promega Corporation, Madison, Wisconsin
Sigma, St. Louis, Missouri
Stratagene, La Jolla, Kalifornien
United States Biochemicals, Cleveland, Ohio

Alle zur Konstruktion und Charakterisierung der rekombinanten Plasmide und Baculoviren verwendeten Enzyme wurden von Pharmacia, LKB; New England Biolabs, Inc.; Gibco-BRL Canada; und Boehringer Mannheim bezogen und gemäß den Empfehlungen der Lieferanten verwendet.
Die in den nachstehenden Beispielen besprochenen Clonierungsverfahren sind Standardverfahren, welche bei Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989), unter Bezugnahme hierin eingeschlossen, beschrieben sind. Diese Referenz beinhaltet Verfahren für die folgenden Standardverfahren: Clonierungsverfahren mit E. coli-Plasmiden, Transformation von E. coli-Zellen; Plasmid-DNA-Reinigung, Agarosegelelektrophorese, Restriktionsendo nucleaseverdau, Ligierung von DNA-Fragmenten und andere Enzymreaktionen zur DNA-Modifikation.
Beispiel 1: Sekretion von Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT)
Das DNA-Modul für die Sekretion von Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) ist in 2A dargestellt. Am 5'-Ende enthält es die vollständige cDNA, welche das von Insekten sezernierte Protein Juvenilhormon-Esterase (JHE) codiert (Hanzlik et al.), das von tierischen Zellwirten sezerniert werden kann. Die Spacerregion enthält eine DNA, welche sechs Histidinreste codiert, die von Ni(II)-NTA-Chromatographie-Matrizen zur Affinitätsreinigung angezogen werden (Kroll, 1993). Die Spacerregion enthält auch eine Nucleinsäuresequenz, welche die Aminosäuresequenz DDDDK codiert, eine Spaltstelle, welche durch die Protease Enteropeptidase aus dem Schweinedarm erkannt wird (Kell, 1971). Die Spacerregion ist auf jeder Seite mit einem Prolinrest verbunden, welcher begünstigt, daß das Spacerpeptid eine eigene Domäne für einen besseren Zugang für sowohl die Matrix für die chromatographische Reinigung als auch die Enteropeptidase bildet. Das Modul enthält auch die DNA-Sequenz, welche CAT codiert.
Die Vektoren für Beispiel 1 wurden wie folgt konstruiert. Das Expressionsplasmid pIE1/153A enthält die cytoplasmatische Aktin-Kassette von Bombyx mori (Johnson et al., 1992; US-Patentanmeldung Nr. 08/608,617), das Enhancer-Element HR3 des Kernpolyedervirus von Bombyx mori (BmNPV) und das ie1-Gen von BmNPV und wurde wie folgt konstruiert. Ein 1,2 kb großes SspI-Fragment, welches der Karteneinheiten 51,8 bis 52,7 der BmNPV-Genomregion entspricht, die das BmNPV-HR3-Element enthalten, wurde in die SmaI-Stelle von pBluescript-SK+ (Stratagene) cloniert, um das Plasmid p153 zu erhalten. Das Plasmid pIE1/153A wurde hergestellt, indem ein 3,8 kb großes ClaI-Fragment, welches das ie1-Gen enthält, in die ClaI-Stelle von Plasmid p153 inseriert wurde, unerwünschte Restriktionsstellen in der Polylinker-Sequenz dieses Plasmids durch eine doppelte Spaltung mit SaclI und BamHI entfernt wurden, die Enden davon mit der T4-DNA-Polymerase in glatte Enden überführt wurden und das erhaltene Plasmid mit sich selbst ligiert wurde. Ein 2,2 kb großes SacI-Fragment, das die Aktin-Kassette aus dem Plasmid pBmA enthält (Johnson et al., 1992), wurde in die einmalige SacI-Stelle von Plasmid pIE1/153 ligiert, um das Expressionsplasmid pIE1/153A zu erhalten.
Der Vektor pBmA ist ein pBluescript (Stratagene)-Abkömmling von Clon pA3-5500, welcher das cytoplasmatische Aktin-Gen A3 von Bombyx mori enthält (Mounier und Prudhomme, 1986). Das Plasmid pBmA wurde konstruiert, so daß es 1,5 kb der umgebenden 5'-Sequenzen des A3-Gens und einen Teil seines ersten Exons bis Position +67 (relativ zur Transkriptionsinitiation), eine von dem Plasmid pBluescript (Stratagene) abgeleitete Polylinker-Region für die Insertion fremder Gensequenzen und weitere 1,05 kb der A3-Gensequenzen, umfassend einen Teil des dritten Exons des Gens von Position +836 und angrenzende umgebende 3'-Sequenzen, welche Signale enthalten, die für die Polyadenylierung des RNA-Transkripts erforderlich sind, enthält. Vgl. US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/608,617, welche unter Bezugnahme hierin in ihrer Gesamtheit eingeschlossen ist.
Dieser Expressionsvektor wurde konstruiert durch (1) Subclonieren eines 1,5 kb großen KpnI/AccI-Fragments von Clon pA3-5500, welches die 5'-umgebenden, 5'-untranslatierten und codierenden Sequenzen des A3-Gens bis zu Position +67 enthält, in das Plasmid pBluescript-SK+ (Stratagene), um das Plasmid pBmAp zu erzeugen; (2) Verändern des in Position +36 bis +38 der Aktin codierenden Sequenz in Plasmid pBmAp vorkommenden ATG-Translationsinitiationscodons zu AGG, AAG oder ACG durch Mutagenese nach der Methode von Kunkel (1985), um die Plasmide pBmAp.AGG, pBmAp.AAG und pBmAp.ACG zu erzeugen; (3) Subclonieren eines 1,05 kb großen XhoI/SalI-Fragments von Clon pA3-5500, enthaltend einen Teil des dritten Exons des Aktin-Gens von Position +836 und angrenzende umgebende 3'-Sequenzen, die Signale einschließen, welche für die Polyadenylierung des RNA-Transkripts erforderlich sind, in Plasmid pSP72 (Promega Corporation), um das Plasmid pBmAt zu erzeugen; (4) Umwandeln der einmaligen XhoI-Stelle von Plasmid pBmAt in eine NotI-Stelle durch Spaltung dieses Plasmids mit XhoI (Gibco-BRL) und Auffüllen der Enden mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase (Boehringer Mannheim) sowie Ligierung von NotI-Linkern (DNA Synthesis Laboratory).
Ein 0,8 kb großes BamHI-Fragment, enthaltend das offene Leseraster von CAT, wurde aus pBmA.CAT (Johnson et al., 1992; US-Patent Nr. 08/608,617) isoliert und in die einmalige BamHI-Stelle in pIE1/153A cloniert, um pIE1/153A.CAT zu erzeugen.
Ein 1,8 kb großes EcoRI-Fragment, enthaltend das offene Leseraster von JHE(kk), wurde zuerst aus pAcUW21-KK (Bonning und Hammock, 1996) isoliert, anschließend wurden NotI-Linker an die Enden davon ligiert, und dann wurde es in die einmalige NotI-Stelle von pIE1/153A cloniert, um das Plasmid pIE1/153A.JHE zu erzeugen.
Das Plasmid pIE1/153A.JHE.HisEP.CAT wurde in mehreren Schritten erzeugt.

(i) Zuerst wurde zwei Oligonucleotide [SEQ ID NO: 1 und 2] synthetisiert (5' zu 3'), welche die Region II in 2A codieren:
Diese Oligonucleotide wurden aneinandergelagert, die Enden wurden durch eine gegenseitig initiierte Synthese mit dem Klenow-Enzym aufgefüllt, und die erhaltene Sequenz wurde mit BamHI und NcoI zweimal gespalten und in pBluescript-SK+ (Stratagene) ligiert, um pHisEP(NcoI) zu erhalten.
(ii) Anschließen wurden zwei mutagene Primer [SEQ ID NO: 3 und 4] synthetisiert (5' zu 3'), um die Region III in 2A zu erzeugen:
Eine PCR-Amplifikation unter Verwendung der Pfu-Polymerase der Plasmid-DNA von pIE1/153A.CAT ergab ein 0,8 kb großes Produkt, enthaltend das offene Leseraster von CAT, das mit NcoI und XbaI zweimal gespalten und im Leseraster in die einmaligen NcoI/XbaI-Stellen von pHisEP(NcoI) ligiert wurde, um pHisEP.CAT zu erhalten.
(iii) Die folgenden zwei mutagenen Primer [SEQ ID NO: 5 und 6] wurden synthetisiert (5' zu 3'), um die Region I in 2A zu erhalten:
Eine PCR-Amplifikation unter Verwendung der Pfu-Polymerase der Plasmid-DNA von pIE1/153A.JHE(kk) ergab ein 1,6 kb großes Produkt, enthaltend das offene Leseraster von JHE (ohne Stoppcodon), das mit BamHI teilweise gespalten und im Leseraster in die einmalige BamHI-Stelle von pHisEP.CAT ligiert wurde, um pJHE.HisEP.CAT zu erhalten.
(iv) Eine teilweise Spaltung mit BamHI und eine vollständige Spaltung mit NotI von pJHE.HisEP.CAT setzte ein 2,5 kb großes Fragment, enthaltend das vollständige Sekretionsmodul (Regionen I, II und III in 2A) frei, das in die einmaligen BamHI/NotI-Stellen des Expressionsplasmids pIE1/153A ligiert wurde, um pIE1/153A.JHE.HisEP.CAT zu erhalten.

Die DNA-Kontrollsequenz für den experimentellen Nachweis der Sekretion von CAT in 2B war das Expressionsplasmid pIE1/153A ("Schein-DNA"); das Expressionsplasmid pIE1/153A.CAT mit dem vollständigen CAT-Gen ("CAT"); das Expressionsplasmid mit der Spacersequenz plus dem CAT-Gen ("Spacer + CAT"); und das Expressionsplasmid pIE1/153A.JHE mit dem JHE-Gen ("JHE").
Die verschiedenen Expressionsplasmide wurden in Insektenwirtszellen von Bombyx mori in in vitro-Kulturen eingeschleust (Lu et al., 1996). Bm5-Zellen wurden in IPL-41 (Gibco) + 10% fötales Rinderserum aufrechterhalten. Für die Transfektion wurden Zellen in Schalen mit einem Durchmesser von 35 mm in einer Dichte von 10⁶ Zellen/Vertiefung überimpft, anhaften gelassen und mit 0,5 ml Basalmedium, enthaltend 3 μg Plasmid-DNA und 15 μg Lipofectin (Gibco), gemäß den Anweisungen der Hersteller während 5 Stunden transfiziert. Die Zellen und der Überstand wurden 2 Tage nach der Transfektion zur Analyse geerntet.
Die extrazellulär exprimierte CAT wurde durch eine Western-Blot-Analyse (Sambrook, 1989) der Kulturüberstände unter Verwendung eines Antikörpers, der CAT erkennt, nachgewiesen. Aliquots von Zellen oder Zellkulturüberständen wurden durch eine Elektrophorese in einem SDS enthaltenden 8%igen Polyacrylamidgel (SDS-PAGE) aufgetrennt und mittels Elektroblotting auf eine Hybond-ECL-Membran (Amersham) übertragen. Nach dem Transfer wurde die Membran für 1 Stunde bei Raumtemperatur in 50 ml PBS-0,1% Tween-20 (PBST), enthaltend 10% (Gew./Vol.) Magermilchpulver (PBSTM), blockiert. Der Filter wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur in 5 ml PBSTM, enthaltend einen polyclonalen Kaninchen-anti-CAT-Antikörper (5 Prime-3 Prime, Inc.; Verdünnung 1:1000), inkubiert, zweimal für 15 Minuten mit PBST gewaschen und 1 Stunde mit 5 ml PBSTM, enthaltend an Meerrettichperoxidase konjugiertes Ziege-anti-Kaninchen-IgG (Life Technologies; Verdünnung 1:1000) inkubiert. Nach zweimaligem Waschen mit PBST wurde der Filter gemäß den Anweisungen des Lieferanten mit einem ECL-Chemilumineszenzsubstrat (Amersham) inkubiert und einem Röntgenfilm ausgesetzt.
2B zeigt, daß kein CAT in entweder dem Überstand von Zellen, transfiziert mit der Schein-Plasmid-DNA, oder von Zellen, transfiziert mit einem CAT exprimierenden Plasmid, oder von Zellen, transfiziert mit einem den Spacer plus das CAT-Gen exprimierenden Plasmid, oder von Zellen, transfiziert mit einem JHE exprimierenden Plasmid, nachgewiesen wurde. CAT wurde im Überstand von Zellen nachgewiesen, die mit dem Plasmid pIE1/153A.JHE.HisEP.CAT ("Sekretionsmodul") transfiziert wurden. Folglich kann das natürlicherweise sezernierte Protein JHE verwendet werden, um ein nicht zur Sekretion befähigtes Polypeptid wie CAT in den extrazellulären Raum zu transportieren.
Beispiel 2: Freisetzung des CAT-Peptids aus dem Fusionsprotein
Um zu zeigen, daß das CAT-Protein aus dem in Kultur exprimierten Fusionsprotein freigesetzt werden konnte, wurde der Überstand der in Beispiel 1 beschriebenen Kultur gegen einen Enteropeptidase-Puffer dialysiert und mit Enteropeptidase aus dem Schweinedarm [ICN Biopharmaceuticals Canada, Ltd.] während 36 Stunden bei 37°C inkubiert (Kell, 1971). 2C ist ein Western-Blot einer mit Enteropeptidase gespaltenen Probe unter Verwendung des anti-CAT-Antikörpers (5 Prime-3 Prime, Inc.; Verdünnung 1:1000), der zeigt, daß eine geringe Menge an CAT erfolgreich aus dem Fusionsprotein freigesetzt wurde.
Beispiel 3: Sekretion von BmCF1
Der Chorionfaktor 1, ein intrazelluläres Protein von Bombyx mori (BmCF1), kommt natürlicherweise im Kern von einigen Insektenzellen von Bombyx mori vor. Das Modul für die Sekretion von BmCF1 ist in 3A dargestellt.
Ein 3,8 kb großes NotI-Fragment von pBmCF1 (Tzertziniz et al., 1994), enthaltend das offene Leseraster von BmCF1, wurde in die einmalige NotI-Stelle von pIE1/153A ligiert, um pIE1/153A.BmCF1 zu bilden.
Das Plasmid pIE1/153A.JHE.HisEP.BmCF1 wurde in mehreren Schritten erzeugt.

(i) Zuerst wurde zwei Oligonucleotide [SEQ ID NO: 1 und 7] synthetisiert (5' zu 3'), welche die Region II in 3A codieren:
Diese Oligonucleotide wurden aneinandergelagert, die Enden wurden durch eine gegenseitig initiierte Synthese mit dem Klenow-Enzym aufgefüllt, und die erhaltene Sequenz wurde mit BamHI und SphI zweimal gespalten und in pBluescript-SK+ (Stratagene) ligiert, um pHisEP (SphI) zu erhalten.
(ii) Die folgenden zwei Oligonucleotide [SEQ ID NO: 8 und 9] wurden synthetisiert (5' zu 3'), um die Region III in 3A zu erhalten:
Eine PCR-Amplifikation unter Verwendung der Pfu-Polymerase der Plasmid-DNA von pBmCF1 ergab ein 1,5 kb großes Produkt, enthaltend das offene Leseraster von BmCF1, das mit XbaI vollständig gespalten und mit SphI teilweise gespalten und im Leseraster in die einmaligen SphI/XbaI-Stellen von pHisEP (SphI) ligiert wurde, um pHisEP.BmCF1 zu erhalten.
(iii) Das in Beispiel 1 beschriebene PCR-Produkt, enthaltend das ORF von JHE (ohne Stoppcodon), wurde im Leseraster in die einmalige BamHI-Stelle von pHisEP.BmCF1 ligiert, um pJHE.HisEP.BmCF1 zu erhalten.
(iv) Eine teilweise Spaltung mit BamHI und eine vollständige Spaltung mit NotI von pJHE.HisEP.BmCF1 setzte ein 2,6 kb großes Fragment, enthaltend das vollständige Sekretionsmodul (Regionen I, II und III in 3A) frei, das in die einmaligen BamHI/NotI-Stellen von pIE1/153A ligiert wurde, um pIE1/153A.JHE.HisEP.BmCF1 zu erhalten.

Die DNA-Kontrollsequenz für den experimentellen Nachweis der Sekretion von BmCF1 in 3B war das Expressionsplasmid pIE1/153A ("Schein-DNA"); das Expressionsplasmid pIE1/153A.BmCF1 mit dem vollständigen BmCF1-Gen ("BmCF1"); und das Expressionsplasmid pIE1/153A.JHE mit dem vollständigen JHE-Gen ("JHE").
Jedes Plasmid wurde in Insektenwirtszellen von Bombyx mori in in vitro-Kulturen, wie in Beispiel 1 besprochen, eingeschleust. Intrazellulär und extrazellulär exprimiertes BmCF1 wurde durch eine Western-Blot-Analyse unter Verwendung eines monoclonalen Maus-anti-BmCF1 (bereitgestellt durch Dr. F.C. Kafatos, Harvard University, Boston, Massachusetts; Verdünnung 1:100) und eines an Meerrettichperoxidase konjugierten Ziege-anti-Maus-Antikörpers (Life Technologies; Verdünnung 1:1000) durch die in Beispiel 1 besprochenen Methoden nachgewiesen.
Aus dem in 3B gezeigten Western-Blot ist ersichtlich, daß das normalerweise intrazelluläre Protein BmCF1 nur im Überstand von Zellen nachgewiesen wurde, die mit dem in 3A beschriebenen pIE1/153A.JHE.HisEP.BmCF1 ("Sekretionsmodul") transfiziert worden waren.
Beispiel 4: Sekretion von JHE-CAT durch Säugerzellen
Um zu zeigen, daß das Sekretionsmodul verwendet werden kann, um ein nicht zur Sekretion befähigtes Polypeptid von Säugerzellen zu sezernieren, wurde ein Säuger-Expressionsvektor verwendet. Das bakterielle cytoplasmatische Protein CAT wurde als ein Beispiel für ein nicht zur Sekretion befähigtes Polypeptid verwendet.
Zwei Vektoren wurden konstruiert:

1) Der Vektor pcDNA3.1.CAT wurde durch Isolieren des 800 bp großen BamHI-Fragments aus pBmA.CAT, enthaltend das offene Leseraster von CAT, und Clonieren desselben in die einmalige BamHI-Stelle des Säuger-Expressionsplasmids pcDNA3.1+ (Invitrogen, San Diego, CA) konstruiert.
2) Der Vektor pcDNA3.1.JHE.HisEP.CAT wurde wie folgt konstruiert. Eine teilweise Spaltung mit BamHI und eine vollständige Spaltung mit NotI von pJHE.HisEP.BmCF1 setzte ein 2,5 kbp großes Fragment, enthaltend das vollständige Sekretionsmodul (Regionen I, II und III in 2A) frei, das in die einmaligen BamHI/NotI-Stellen des Säuger-Expressionsplasmids pcDNA3.1+ (Invitrogen, San Diego, CA) ligiert wurde, um pcDNA3.I.JHE.HisEP.CAT zu erhalten.

Diese Vektoren wurden zur Transfektion der von Nierenzellen von Hamsterjungen abgeleiteten Säugerzelllinie BHK-21 in in vitro-Zellkulturen verwendet. Die BHK-21-Zellen wurden in DMEM (Gibco-BRL) plus 10% fötales Rinderserum aufrechterhalten. Die Vektoren wurden nach der in Beispiel 1 angegebenen Methode, außer daß die Zelldichte 0,5 × 10⁶ Zellen/ml beträgt, in die BHK-21-Zellen eingeschleust.
Nach der Transfektion mit den Plasmiden pcDNA3.1+, pcDNA3.1.CAT und pcDNA3.1.JHE.HisEP.CAT wird durch einen Western-Blot gezeigt, daß das JHE-CAT-Fusionsprotein in den Kulturüberstand sezerniert wird, während das CAT-Protein nicht sezerniert wird. Dies zeigt, daß das natürlicherweise sezernierte JHE-Protein verwendet werden kann, um nicht zur Sekretion befähigte Polypeptide wie CAT in einen extrazellulären Raum zu sezernieren.
Beispiel 5: Sekretion einer bakteriellen Chloramphenicol-Acetyltransferase unter Verwendung des menschlichen Granulocyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktors (Referenzbeispiel)
Das Gen des menschlichen Granulocyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktors (GMCSF) wurde auch für die Sekretion von CAT verwendet.
5 ist eine schematische Darstellung der DNA, die das Fusionsprotein codiert. Diese enthält am 5'-Ende die vollständige cDNA, welche den menschlichen Granulocyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor codiert, der von tierischen Zellwirten sezerniert werden kann. Sie enthält außerdem eine Spacerregion, wie in Beispiel 1 beschrieben, und die CAT codierende DNA-Sequenz, welche im Leseraster damit verbunden ist. Die Sequenz des menschlichen GMCSF ist in 6 gezeigt. Das normale Startcodon (ATG) und das Stoppcodon (TGA) sind fett gedruckt hervorgehoben.
Der Vektor pIE1/153A.GMCSF.HisEP.CAT für Beispiel 4 wurde in mehreren Schritten konstruiert.

(i) Zuerst wurde der Vektor pIE1/153A.JHE.HisEP.CAT mit BamHI gespalten, um die DNA freizusetzen, welche die Juvenilhormon-Esterase codiert, und um einen offenen Vektor pIE1/153A.HisEP.CAT (mit überhängenden BamHI-Enden) zu erhalten.
(ii) Anschließend wurden zwei mutagene Primer [SEQ ID NO: 10 und 11] synthetisiert (5' zu 3'):

Eine PCR-Amplifikation unter Verwendung der Pfu-Polymerase der Plasmid-DNA von pGMCSF (enthaltend die vollständige GMCSF-cDNA und bereitgestellt durch Dr. Chris Brown, University of Calgary) ergab ein 450 bp großes Produkt, enthaltend das offene Leseraster des vollständigen menschlichen Granulocyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktors (GMCSF) (ohne ein Stoppcodon), das mit BamHI gespalten wurde. Dieses Fragment wurde in den offenen Vektor pIE1/153A.HisEP.CAT (mit überhängenden BamHI-Enden) ligiert, um den Vektor pIE1/153A.GMCSF.HisEP.CAT zu erhalten.
Die Expressionsplasmide pIE1/153A (Kontrolle), pIE1/153A.CAT und pIE1/153A.GMCSF.HisEP.CAT wurden in Bm5-Insektenwirtszellen von Bombyx mori in in vitro-Kulturen eingeschleust, wie in Beispiel 1 besprochen wurde. Intrazelluläres und extrazelluläres CAT wurde durch eine Western-Blot-Analyse, wie in Beispiel 1 besprochen, nachgewiesen. Aus dem in 7 gezeigten Westem-Blot ist ersichtlich, daß eine wesentlich größere Menge an CAT als ein GMCSF-CAT-Fusionsprotein (mehr als das 100-fache, bestimmt mittels Densitometerabtastung) in dem Überstand von Zellen, die mit dem Plasmid pIE1/153A.GMCSF.HisEP.CAT transfiziert wurden, als in dem Überstand von Zellen, die mit dem Plasmid pIE1/153A. HisEP.CAT transfiziert wurden, nachgewiesen wurde.
Obwohl die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf als bevorzugt angesehene Beispiele beschrieben worden ist, ist selbstverständlich, daß die Erfindung nicht auf die offenbarten Beispiele begrenzt ist.
Referenzen

US-Patentanmeldung Nr. 08/608,617
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Expressionskassette, die nützlich ist für die Sekretion eines heterologen Proteins als Fusionsprotein, umfassend ein Polynucleotid, das in seiner 5'- zu 3'-Richtung codiert: (a) einen Promotor; (b) ein Signalpeptid; (c) ein zur Zellsekretion befähigtes Polypeptid, das die vollständige Aminosäuresequenz der juvenilen Hormon-Esterase von Insekten oder einen Teil davon umfaßt, wobei der Teil ein nicht zur Sekretion befähigtes heterologes Polypeptid mit einer höheren Rate als nur das Signalpeptid der juvenilen Hormon-Esterase zur Sekretion bringen kann; und (d) ein heterologes Protein, wobei die Polynucleotidsequenzen, die (b), (c) und (d) codieren, im Leserahmen verbunden sind.
Expressionskassette nach Anspruch 1, wobei die Promotorsequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer viralen Promotorsequenz, einer zellulären Promotorsequenz von Insekten und einer Promotorsequenz von Säugern.
Expressionskassette nach Anspruch 1 oder 2, die zusätzlich eine Polynucleotidsequenz umfasst, die einen Enhancer codiert, der funktionell mit dem Promotor verbunden ist.
Expressionskassette nach Anspruch 3, wobei der Enhancer ein viraler Enhancer ist.
Expressionskassette nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Sequenz, welche die zur Sekretion befähigte Polypeptidsequenz codiert, im Leserahmen mit der Sequenz, die das heterologe Protein codiert, durch eine Sequenz, die ein Linkerpeptid codiert, verbunden ist.
Vektor, der für die Sekretion eines heterologen Proteins von eukaryontischen Zellen nützlich ist, umfassend eine Expressionskassette nach einem der Ansprüche 1 bis 5.
Vektor nach Anspruch 5, weiterhin umfassend ein selektierbares Markergen.
Zelle, transformiert mit der Expressionskassette nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder mit dem Vektor nach Anspruch 6 oder 7.
Zelle nach Anspruch 8, wobei die Zelle von Bombyx mori ist.
In-vitro-Verfahren zur Sekretion eines heterologen Proteins, umfassend das Einbringen einer Expressionskassette in eine Zelle, umfassend ein Polynucleotid, das in seiner 5'- zu 3'-Richtung codiert: (a) einen Promotor; (b) ein Signalpeptid; (c) ein zur Zellsekretion befähigtes Polypeptid, das die juvenile Hormon-Esterase von Insekten ist; und (d) ein heterologes Protein, wobei die Polynucleotidsequenzen, die (b), (c) und (d) codieren, im Leserahmen verbunden sind, unter Bedingungen, bei denen das heterologe Protein exprimiert und von der Zelle sezerniert wird.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Promotor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem viralen Promotor, einem zellulären Promotor von Insekten und einem Promotor von Säugern.
Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, wobei die Expressionskassette zusätzlich eine DNA-Sequenz umfasst, die einen Enhancer codiert, der funktionell mit dem Promotor verbunden ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei der Enhancer ein viraler Enhancer ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, wobei die Sequenz, welche die zur Sekretion befähigte Polypeptidsequenz codiert, im Leserahmen mit der Sequenz, die das heterologe Protein codiert, durch eine Sequenz, die ein Linkerpeptid codiert, verbunden ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14, wobei die Zelle eine Säugerzelle ist.