ES2615281T3 - Suplementación con cinc para aumentar la capacidad de respuesta al tratamiento con metaloproteasa - Google Patents

Abstract

Al menos un suplemento que comprende una combinación de cinc y fitasa que asegura la disponibilidad del ion cinc que se requiere para la actividad de la neurotoxina botulínica, para su uso en un método de preparación de un sujeto para la administración de la neurotoxina botulínica, que comprende: instruir sobre la administración del al menos un suplemento, en donde la administración indicada del suplemento proporciona una disponibilidad del ion de cinc requerido a un nivel suficiente durante un período de carga del suplemento para eliminar una deficiencia funcional del ion cinc como causa de una capacidad de respuesta pobre o limitada a la neurotoxina botulínica administrada, en donde el suplemento se administra durante el período de carga antes de la administración de la neurotoxina botulínica.

Description

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DESCRIPCION

Suplementacion con cinc para aumentar la capacidad de respuesta al tratamiento con metaloproteasa Referencia a solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica prioridad sobre la solicitud de Estados Unidos numero 12/821.370, presentada el 23 de junio de 2010, y sobre la solicitud provisional de Estados Unidos numero 61/219 .932, presentada el 24 de junio de 2009, cada una de las cuales se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad.

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere en general a composiciones y metodos utilizados conjuntamente con el ensayo y la administracion de ciertos productos farmaceuticos, en particular, toxinas dependientes de cofactores, tales como las neurotoxinas clostridiales.

Antecedentes de la invencion

Sin limitar el alcance de la invencion, sus antecedentes se describen en relacion con el desarrollo de toxinas letales, tales como la toxina botulinica, en farmacos utiles. El termino de la enfermedad "botulismo" procede de la palabra en latin para salchicha, botulus, sobre la base de un brote mortal en Alemania en la decada de 1800 causado por salchichas parcialmente cocidas. Posteriormente, se determino que el botulismo se debia a toxinas producidas por el organismo Clostridium botulinum, originalmente aislado en 1895. C. botulinum es un bacilo anaerobico grampositivo formador de esporas que habitualmente se encuentra en las plantas, en el suelo, en el agua y en los tractos intestinales de animales. La toxina botulinica se purifico por primera vez en 1928 y esta entre las sustancias mas toxicas conocidas. Las toxinas botulinicas actuan produciendo paralisis en cuatro sitios diferentes del cuerpo: la union neuromuscular, los ganglios autonomos, las terminaciones nerviosas parasimpaticas posganglionares y las terminaciones nerviosas simpaticas posganglionares que liberan acetilcolina (Ach).

Se han identificado varias cepas diferentes de Clostridium, incluidas C. butyricum, C. baratii y C. argentinense, que producen formas antigenicamente distintas de neurotoxinas botulinicas farmacologicamente similares (abreviadas como BTX o BoNT). En la actualidad se conocen ocho serotipos principales de neurotoxinas botulinicas elaboradas por bacterias del genero Clostridium: A, B, C (C1 and C2), D, E, F y G. Los subtipos de los serotipos pueden estar estrechamente relacionados o mas distantes. Por ejemplo, BoNT-A1 y A2 son homologos al 95 % mientras que BoNT-A3 y A4 son, respectivamente, 81 % y 88 % homologos de BoNT-A1. La toxina botulinica de tipo A (BoNT-A) es la toxina mas potente, seguida por los tipos de toxina B y F. Estos tipos son los que se han explotado comercialmente hasta la fecha.

La FDA aprobo BoNT-A (Oculinum, ahora marca BOTOX®, Allergan, Inc.) en 1989 para el tratamiento medico del blefaroespasmo (parpadeo incontrolado), el estrabismo (ojos bizcos), sindrome de Meige (blefaroespasmo bilateral con distoma concurrente de la cara inferior) y espasmo hemifacial. En diciembre de 2000 se recibio la aprobacion para tratar la distoma cervical, un trastorno del movimiento neurologico causante de contracciones intensas del cuello y el hombro. BOTOX® se aprobo en el Reino Unido para la hiperhidrosis axilar (sudoracion excesiva) en 2001 y, el mismo ano, BOTOX® se aprobo en Canada para la hiperhidrosis axilar, la espasticidad muscular focal y el tratamiento cosmetico de las arrugas en la linea de la ceja. En 2002, la FDA de Estados Unidos anuncio la aprobacion de BOTOX® Cosmetic para mejorar temporalmente la aparicion de lineas de expresion en el ceno moderadas e intensas entre las cejas (lineas glabelares). En julio de 2004, la FDA aprobo BOTOX® para tratar la hiperhidrosis axilar primaria.

BoNT-B tambien se ha desarrollado para su uso clinico y actualmente hay varios productos disponibles comercialmente (por ejemplo, MyoBloc® en Estados Unidos y NeuroBloc® en Europa, Solstice Neurosciences). La FDA aprobo MyoBloc® en 2000 para el tratamiento de la distoma cervical. Se considera que BOTOX® BoNT-A es 50-100 veces mas potente que Myobloc® BoNT-B para cualquier tratamiento especifico dado.

Actualmente, una serie de fabricantes diferentes de todo el mundo estan produciendo BoNT-A purificado como varias marcas comerciales, incluyendo Xeomin® (Merz Pharma, Germana), Prosigne® (Lanzhou Inst. For Biol. Prod., China) y Neuronox® (Meditoxin® en Corea, Medy-Tox, Inc., Corea). Como con otros productos biologicos, debe determinarse la actividad biologica para nuevos lotes. Esto es particularmente crucial para farmacos, tales como la toxina botulinica, que tienen una toxicidad considerable y para los que se prolonga la restauracion de la actividad neuromuscular normal. La toxina botulinica administrada por via intramuscular actua en la union neuromuscular y produce paralisis muscular mediante la inhibicion de la liberacion de Ach a partir de las neuronas motoras presinapticas. El pico del efecto paralitico se produce 4-7 dias despues de la inyeccion. Aproximadamente 2 meses despues de la administracion de la toxina botulinica, el axon comienza a expandirse y emergen nuevos brotes de terminales nerviosos y se extienden hacia la superficie del musculo. Estos nuevos brotes nerviosos restablecen la unidad motora del nervio y la paralisis muscular se invierte normalmente en un plazo de 2-4 meses. La sobredosis es lo suficientemente critica y la recuperacion suficientemente prolongada que se dispone de un antidoto en caso de

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sobredosis accidental.

Las dosis de todas las toxinas botulmicas disponibles comercialmente se expresan en terminos de unidades de actividad biologica. Una unidad de toxina botulinica corresponde a la mediana de la dosis letal intraperitoneal calculada (DL50) en ratones. Vease Hoffman R O, Helveston E M. "Botulinum in the treatment of adult motility disorders" Int Opthalmol Clin 26 (1986) 241-50. Aunque ciertamente no es ideal, el ensayo de la DL50 se ha mantenido debido a su alta sensibilidad. La definicion de unidad se aplica a todas las formas de toxinas comercialmente disponibles, a pesar del hecho de que no se ha adoptado un enfoque estandarizado de la prueba de potencia y las diferencias entre fabricantes en los protocolos de ensayo de DL50 de raton han conducido a una considerable variabilidad en la actividad por unidad de diferentes productos. Por ejemplo, mediante diversos estudios en pacientes con blefaroespasmo y espasmo hemifacial se ha sugerido que la relacion de bioequivalencia de la marca Dysport® de BoNT-A (Ipsen Pharmaceuticals, Francia) y Botox® esta entre 2,5:1 y 4:1. Como consecuencia, cuando se comunica la dosis de toxina botulinica recomendada en indicaciones concretas, se ha considerado importante especificar la marca particular de toxina que se utiliza porque las unidades utilizadas en el etiquetado son especificas del producto y no intercambiables. Surgen otras complicaciones debido al hecho de que el BoNT es una molecula grande y relativamente labil. La reconstitucion adecuada del producto es importante y la vida util es bastante limitada.

El documento US 2003/118598 A1 se refiere a composiciones farmaceuticas de toxina botulinica adecuadas para la administracion terapeutica a un paciente y metodos para tratar pacientes con la formulacion.

T. Ao et. al., British Poultry Science 2007, 690-695 se refiere a los efectos de un suplemento de proteato de cinc quelado y fitasa en una dieta de harina de maiz-soja sobre el rendimiento y el contenido de cinc tisular de pollos de engorde.

El documento WO 1999049740 A1 se refiere a la aplicacion de la enzima fitasa en alimentos que tienen un bajo contenido de fitato y se divulgan metodos para administrar una dieta con bajo contenido de fitato suplementada con una fitasa.

Ashraf, A. S. et al, Journal of Protein Chemistry 2004, 445-451 divulgan un estudio sobre los efectos del cloruro de cinc sobre la fragmentacion catalitica de la toxina botulinica.

La toxina botulinica es capaz de inducir la formation de anticuerpos en seres humanos que conducen a un efecto disminuido de la toxina con el tiempo. Vease, Frueh B R, et al.

"Treatment of Bepharospasm with Botulinum Toxin. A preliminary report" Arch Ophthalmol 102 (1984) 1464. Se piensa que la production de anticuerpos es una funcion de la dosis acumulada, la carga antigenica por dosis y el intervalo de tiempo entre las inyecciones. Por lo tanto, se ha sugerido que la dosis terapeutica mas pequena debe administrarse con un intervalo de tiempo maximo entre las inyecciones secuenciales. Dada la importancia del uso de BoNT en el tratamiento de ciertas enfermedades, el uso de BoNT-F esta en investigation en pacientes que se han convertido en inmunologicamente resistentes a los serotipos A y B.

Aunque las toxinas botulmicas son eficaces para la mayoria de los pacientes, el efecto terapeutico puede variar Ampliamente con independencia de la formacion de anticuerpos detectables, no solo de un individuo a otro, sino tambien para un individuo de un tratamiento a otro. Ademas, se ha identificado que algunas poblaciones son mas propensas a mostrar una mala o nula capacidad de respuesta a las toxinas. Por ejemplo, hasta el 30 % de los pacientes mayores de 65 anos de edad pueden demostrar una disminucion de la eficacia de la toxina botulinica. La base del fracaso de un paciente para responder al tratamiento puede ser dificil de discernir, dado que las explicaciones posibles incluyen las diferencias originales en la potencia del fabricante, la posibilidad de que el paciente haya desarrollado anticuerpos especificos frente a la toxina, asi como la posibilidad de que el producto se haya degradado o agitado durante la reconstitucion. Sin embargo, el efecto disminuido dentro de una poblacion de pacientes en concreto sugiere la posibilidad de otro factor tambien.

En los ultimos han ano han aparecido informes de fallecimientos de pacientes por la supuesta diseminacion distante dependiente de la dosis de cantidades muy grandes de administracion de toxina botulinica, por lo que cualquier metodo que pueda disminuir la dosis de toxina necesaria para lograr un resultado terapeutico deseado seria beneficioso.

De lo anterior, es evidente que cualquier capacidad para asegurar la maxima capacidad de respuesta del paciente en el tratamiento y proporcionar una estandarizacion mas estrecha de la potencia representaria un importante avance terapeutico y de seguridad.

Breve sumario de la invencion

El presente inventor ha encontrado, sorprendentemente, que la administracion de cantidades relativamente altas de formas de cinc bien absorbidas antes, simultaneamente o poco despues de la administracion terapeutica de la toxina

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botulinica, permitira capacidad de respuesta a la toxina en individuos que anteriormente eran poco respondedores y, aparentemente, mejorara la potencia funcional de las toxinas botulinicas en otros individuos tambien. Aun mas notable, el presente inventor ha descubierto que la carga de cinc antes de la administration de la toxina botulinica aumentaba la capacidad de respuesta en casi cada individuo analizado. Por lo tanto, parece claro que los individuos analizados eran previamente relativamente funcionalmente deficientes en cinc disponible para la union y activacion de la endopeptidasa dependiente de cinc de la cadena ligera (CL) de la toxina botulinica. Debido a que el grupo de individuos que tienen un mayor riesgo de insuficiencia de cinc en relation con la capacidad de respuesta maxima a los efectos de la toxina botulinica incluye potencialmente un gran porcentaje de la poblacion de pacientes (vease la Tabla 1), el presente hallazgo proporciona varios medios para una posible capacidad de respuesta maxima a la toxina botulinica dependiente de cinc.

Tabla 1. Factores de riesgo para la deficiencia de cinc

1. Dieta

a. Complementos vitaminicos

Formas de cinc inorganico mal absorbidas (baratas)

ii. Hierro

iii. Vitamina A

iv. Calcio

v. Cobre

b. Ingesta elevada de fitato

i. Fibra y panes de harina integral

ii. Productos de harina integral

iii. Cereales

iv. Soja

v. Avenas

vi. Legumbres (incluidos cacahuetes, manteca de cacahuete, guisantes)

vii. Judias

viii. Maiz

ix. Arroz

x. Muchos alimentos preparados (conservantes)

xi. La mayoria de las bebidas (incluidos casi todos los refrescos carbonatados)

1. Compuestos que contienen fosfato

2. Conservante E391

c. Consumo de alcohol

i. Disminuye la absorcion de cinc

ii. Aumenta la excretion urinaria

iii. Muchos vinos contienen fitatos

d. Productos lacteos que contienen caseina y calcio

e. Muchos alimentos y suplementos “enriquecidos en fibra"

f. Vegetarianismo (dietas con niveles bajos de carnes rojas, pollo y pescado, pero ricas en soja)

g. Alimentos que contienen el conservante EDTA

2. Afecciones medicas

a. Infecciones (viricas, bacterianas, fungicas)

b. Quemaduras

c. La mayoria de las enfermedades cronicas

d. Malabsorcion

i. Diarrea frecuente

ii. Espru, etc.

iii. Estrenimiento con uso frecuente de fibra y/o laxante

3. Embarazo

4. Edad < 25 o > 65 anos

5. Uso de diureticos

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En ciertos aspectos divulgados en el presente documento, el hallazgo se extiende a maximizar la efectividad del tratamiento con cualquier compuesto que depende de la actividad sobre la disponibilidad de iones metalicos en el tejido que se esta tratando. En una realizacion, el compuesto es una proteasa terapeutica. En una realization, la proteasa terapeutica es una endopeptidasa de cinc, ejemplos de la cual incluyen la toxina botulinica (BoNT), la neurotoxina tetanica (TeNT) y la toxina de la enfermedad de Lyme (LDT), entre otras.

En un aspecto, se proporciona un metodo para preparar un sujeto para la administration de un compuesto que incluye instruir sobre la administracion (mediante consumo oral o cualquier otro metodo deseado) de un suplemento de iones metalicos para un periodo de carga anterior, y, en algunos casos de forma concurrente, a la administracion del compuesto, en los que la administracion indicada del suplemento de iones metalicos se encuentra a un nivel suficiente para eliminar una deficiencia funcional relativa del ion metalico como causa de una mala respuesta al compuesto administrado. En un aspecto, el compuesto es una endopeptidasa de cinc, tal como una toxina botulinica. El ion metalico puede estar en una forma inorganica u organica pero se selecciona idealmente sobre la base de una biodisponibilidad suficiente de acuerdo con las medidas de biodisponibilidad conocidas en la tecnica.

En un aspecto, se proporciona un suplemento de zinc que incluye una forma de cinc organico seleccionada de uno o mas de un proteinato de cinc, un quelato de cinc y/o una sal con una molecula organica, y un complejo de aminoacidos de cinc. El suplemento de cinc esta disenado para administrar de 10 a 400 mg diarios de cinc elemental. En otras realizaciones, el suplemento de cinc proporciona de 30 a 50 mg diarios de cinc elemental.

En aspectos adicionales, la absorcion de iones metalicos se estimula instruyendo al paciente para limitar el consumo de fitatos durante el periodo de carga. En una realizacion particular, el sujeto es instruido ademas para administrar, por ejemplo, para consumir por via oral, al menos una fitasa junto con el suplemento de iones metalicos.

En una realizacion para maximizar la capacidad de respuesta al botulinum terapeutico, la neurotoxina tetanica o la toxina de Lyme y toxinas quimericas o sinteticas relacionadas, la carga de reservas de cinc antes, simultaneamente o poco despues del tratamiento con la toxina dependiente de iones metalicos terapeuticos se facilita proporcionando un envase de preparation previo al procedimiento que incluye una cantidad de suplementos de cinc en forma de capsula, polvo, liquido, liquido-gel, suspension liposomal o comprimido, en los que los suplementos de cinc son suficientes para suministrar de 10 a 400 mg de cinc elemental al dia para un periodo de carga previo al tratamiento de un paciente con una toxina junto con instrucciones que dirigen al paciente a tomar los suplementos de cinc y reducir la ingesta de fitatos. En otros aspectos de esta realizacion, el envase de preparacion previo al procedimiento incluye ademas una cantidad de suplementos de fitasa en forma de capsula, polvo, liquido, liquido-gel, suspension liposomal o comprimido y en cantidad suficiente para la administracion junto con los suplementos de cinc a traves del periodo de carga.

En otra realizacion de la invention, se proporcionan metodos de ensayo de potencia de toxinas que incluyen toxinas botulinicas que permiten una medida de estandarizacion en toda la industria. Para estas realizaciones, los suplementos de cinc por via oral o parenteral se administran a los animales de ensayo durante un periodo de carga antes o simultaneamente con el ensayo de potencia de la toxina, en los que se ha determinado que el suplemento de cinc proporciona suficiente cinc para maximizar la capacidad de respuesta a la toxina administrada. La capacidad de respuesta maxima se determina empiricamente mediante pruebas de dietas o suplementos de cinc para una capacidad de respuesta maxima, incluyendo la modulation del nivel de suplementos de cinc junto con la maximizacion de la absorcion de cinc. La absorcion de cinc puede modularse controlando los niveles de fitato en la dieta, asi como mediante la adicion de fitasa a la dieta.

En otra realizacion de la invencion, el cinc se suministra al tejido mediante crema topica, o inyeccion local o sistemica. En otros aspectos, se proporciona reconstitution de toxinas terapeuticas en una solution que contiene cinc para asegurar la presencia adecuada de cinc para la actividad maxima de la toxina en los tejidos diana.

En otra realizacion de la invencion, se usan cinc y fitasa combinadas para aumentar de forma segura y eficaz rapidamente los niveles de cinc en todo el cuerpo en tiempos de necesidad medica, incluyendo, pero sin limitaciones, afecciones tales como cicatrization de heridas, recuperation de quemaduras, compromiso inmunitario e Impotencia masculina.

Los metodos y composiciones de la presente divulgation proporcionan un remedio para la resistencia relativa de la toxina botulinica y la variabilidad terapeutica en muchos individuos con el resultado de un desenlace terapeutico considerablemente mejorado, margen de seguridad y fiabilidad del efecto terapeutico de un tratamiento a otro. La maximization de la eficacia potencial de las metalopeptidasas terapeuticas administradas permite la administracion de dosis mas bajas y tiempos mas largos entre la readministracion en algunos pacientes con un posible riesgo menor de desarrollo de resistencia mediada por anticuerpos y una disminucion potencial de la diseminacion distante de la toxina con efectos no deseados. Los metodos para la normalization de los ensayos de potencia de la toxina botulinica proporcionados en el presente documento resuelven un problema de larga duration en la industria y proporcionan una mayor certeza y margenes de seguridad en el uso de productos de diferentes fabricantes.

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Breve descripcion de los dibujos

Para una comprension mas completa de la presente invention, incluyendo caracteristicas y ventajas, se hace ahora referencia a la descripcion detallada de la invencion junto con las figuras adjuntas

La figura 1 representa los datos brutos de un ensayo de suplementacion de cinc y cinc mas fitasa durante cuatro dias antes de la administration de toxina botulinica terapeutica.

La figura 2 representa los resultados graficos del ensayo de suplementacion de cinc y cinc mas fitasa durante cuatro dias antes de la administracion de toxinas botulinicas terapeuticas con respecto a la duration del efecto de la toxina en el paciente.

La figura 3 representa los resultados graficos del ensayo de suplementacion de cinc y cinc mas fitasa durante cuatro dias antes de la administracion de toxinas botulinicas terapeuticas con respecto al cambio subjetivo percibido por el paciente en la eficacia de los tratamientos con la toxina.

Descripcion detallada de la invencion

Aunque la puesta en practica y el uso de varias realizaciones de la presente invencion se tratan con detalle mas adelante, debe apreciarse que la presente invencion proporciona muchos conceptos de la invencion aplicables que se pueden utilizar dentro de una amplia variedad de contextos especificos. Las realizaciones especificas tratadas en el presente documento son meramente ilustrativas de modos especificos de poner en practica y usar la invencion y no limitan el alcance de la invencion.

La variabilidad de la action de la toxina botulinica en ciertos individuos se ha atribuido hasta ahora a diferentes fuentes o lotes de la toxina, reconstitution o almacenamiento incorrectos, variaciones en la tecnica de inyeccion, el uso de anestesicos topicos y/o agentes de enfriamiento y la resistencia mediada por anticuerpos. El presente inventor considero que la resistencia a la toxina botulinica podria tener una base en una insuficiencia de cinc disponible y ha demostrado esta hipotesis notable. Este hallazgo proporciona un remedio para la resistencia a la toxina botulinica en muchos individuos con un desenlace terapeutico y un margen de seguridad muy mejorados. El hallazgo es extensible a la mejora de la capacidad de respuesta de los individuos a otros compuestos administrados que son activos in vivo sobre la base de la disponibilidad de iones metalicos, incluyendo otras enzimas tales como toxinas de tetanos y de Lyme, asi como otras afecciones en las que un paciente puede beneficiarse de niveles de cinc en todo el cuerpo, tales como cicatrization de heridas, recuperation de quemaduras, compromiso inmunologico e impotencia masculina. Tambien se proporcionan metodos para la normalization de ensayos de potencia de toxina que proporcionan mayor certeza y margenes de seguridad en el uso de productos de diferentes fabricantes.

La expresion "metalopeptidasa terapeutica" como se usa en el presente documento se refiere a una peptidasa administrada con fines terapeuticos que requiere un ion metalico para la actividad parcial o completa. Entre los ejemplos se incluyen las neurotoxinas dependientes de cinc toxina botulinica y toxina del tetanos, en las que ambas inhiben la liberation del neurotransmisor.

Como se usa en el presente documento, la expresion "toxina clostridial" se refiere a neurotoxinas aisladas de metaloproteasa de cinc producidas de forma nativa por especies de Clostridium, incluyendo, sin limitaciones, Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Clostridium butyricum y Clostridium beratti, asi como neurotoxinas clostridiales fabricadas de forma recombinante incluidas en otros generos y especies microbianas. La expresion "toxina botulinica" se refiere a los serotipos de la toxina botulinica A, B, C, E, F y G y subtipos de las mismas, producidos de forma nativa por especies de Clostridium o fabricadas de forma recombinante. Tambien se incluyen como “toxinas botulinicas” las cadenas aisladas de toxina botulinica (cadenas pesadas o ligeras), ya sea aisladas de especies de Clostridium o generadas de forma recombinante. La expresion "toxina botulmica" tambien incluye nuevas quimeras recombinantes. Por ejemplo, se han generado nuevas quimeras recombinantes entre BoNT-A y E y algunas de estas formas tienen actividad mejorada sobre formas nativas. Vease, por ejemplo, Wang, J. et al. "Novel chimeras of botulinum neurotoxins A and E unveil contributions from the binding, translocation, and protease domains to their functional characteristics" J. Biol. Chem. 283 (2008) 16993-17002.

Como se usa en el presente documento, la expresion "inyeccion de toxina" se refiere a la introduction de una toxina en un sitio en el que se desea un efecto terapeutico y deberia abarcar tambien los conceptos de otros sistemas de administracion de toxinas, incluyendo, pero sin limitaciones a los mismos, la aplicacion topica de la toxina, la liberacion dirigida al sitio de la toxina administrada por via sistemica o vehiculos de liberacion de nanosistemas.

Las toxinas botulinicas se producen de forma nativa en bacterias de Clostridium como cadenas de polipeptidos simples relativamente inactivas de aproximadamente 150 kDa de peso con un alto grado de homologia de secuencia de aminoacidos entre los tipos de toxinas. El unico polipeptido se divide posteriormente en una cadena pesada (CP) de aproximadamente 100 kDa y una cadena ligera (CL) de 50 kDa. Las cadenas CP y CL estan unidas finamente entre si por enlaces disulfuro para formar un heterodimero. La CP de la toxina botulinica es responsable de la union y la translocation de la toxina a las neuronas implicadas en la actividad neuromuscular. Una vez dentro de la

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neurona, el resto de la CL de la toxina inhibe la liberacion del neurotransmisor escindiendo proteolfiicamente diversas protemas SNARE (receptor de la proteina de union al factor sensible a N-etilmaleimida soluble) implicadas en la liberacion de acetilcolina en la union neuromuscular, de modo que se inhibe la contraccion muscular en respuesta a la estimulacion neuronal. La actividad proteolitica de la CL se localiza en el extremo N de la CL y funciona como endopeptidasa dependiente de cinc.

En la union neuromuscular, el mecanismo de accion de BoNT implica tres etapas, la union, la internalizacion y la inhibition de la liberacion de neurotransmisores a traves de la inactivation de diversos fragmentos de las proteinas SNARE. Tres proteinas SNARE, sintaxina 1, SNAP-25 y sinaptobrevina (tambien conocida como proteina de membrana asociada a vesiculas o VAMP) forman conjuntamente los complejos SNARE "trans" metaestables que actuan anclando la vesicula sinaptica a la membrana presinaptica.

Los objetivos de la proteina SNARE de la endopeptidasa de la CL difieren entre algunos de los serotipos de BoNT. SNAP-25 es una proteina de membrana presinaptica asociada a sinaptosomas necesaria para la fusion de vesiculas que contienen neurotransmisores y es la diana para BoNT-A y E. VAMP es la diana de las BoNT B, D, F y G. La diana proteolitica para BoNT-C1 es la proteina de membrana sintaxina.

La neurotoxina tetanica (TeNT) tambien es producida por bacterias del genero Clostridium y, al igual que con BoNT, es una proteina de 150 kDa que consisten en tres dominios. Sin embargo, tras su union a la membrana presinaptica de la motoneurona, TeNT se internaliza y se transporta retroaxonalmente a la medula espinal. A continuation, es transportada fuera de los cuerpos celulares de las neuronas motoras e internalizada por los terminales nerviosos pre-sinapticas, donde actua escindiendo VAMP/sinaptobrevina impidiendo de este modo la liberacion de la glicina del transmisor inhibidor. La transmision sinaptica sobre las neuronas motoras es predominantemente inhibitoria. Como tal, la prevention de esta inhibicion da lugar a la hiperactividad de las neuronas motoras afectadas y, por tanto, da como resultado una paralisis espastica por la contraccion no regulada (tetania) de los musculos inervados. Aunque no esta todavia disponible clinicamente, la TeNT se ha propuesto como potencialmente util para el tratamiento de afecciones neurologicas del SNC.

Como se ha mencionado anteriormente, las neurotoxinas clostridiales son metaloproteasas dependientes de cinc. Cuando esta activa, la BoNT contiene un Zn2+ (cation divalente de cinc) por molecula. El cinc puede unirse a la CL de la toxina botulinica antes o despues de la entrada en las celulas, pero es crucial para la actividad de la endopeptidasa. En estudios in vitro se ha demostrado que la perdida espontanea de cinc de los sitios de la toxina es relativamente lenta, pero puede aumentarse con un tiempo mas largo en la solution. Si la endopeptidasa se vuelve inactiva por la perdida del cinc unido, la adicion de cinc exogeno puede reactivar la toxina.

Suplementacion dietetica para proporcionar niveles adecuados de iones metalicos requeridos para la actividad de las metaloproteasas Hasta principios de la decada de 1960, se creia que la deficiencia de cinc en los seres humanos no se producia. Desde entonces, se ha determinado que el cinc es un oligoelemento esencial y que la deficiencia de cinc es frecuente. Hace relativamente poco tiempo se ha descubierto que el cinc es necesario para la actividad catalitica de cientos de enzimas y que las celulas tienen un aparato regulador estrecho para la disponibilidad de Zn2+, lo que es indicativo de su importancia en el metabolismo celular. El cinc intracelular (Zn2+) esta en homeostasis con las proteinas de union al cinc, tales como la familia de las metalotioneinas 1 (MT-1), que actuan controlando la concentration de Zn2+ libre secuestrando y liberando Zn2+ cuando sea necesario. Sin embargo, la dinamica de union y liberacion de Zn2+, la distribution celular de Zn2+ y el control homeostatico de Zn2+, no se conocen bien.

La deficiencia de cinc clinicamente relevante produce retraso del crecimiento, perdida del apetito y deterioro de la funcion inmunologica, asi como perdida de peso, retraso de la cicatrization de heridas, alteraciones del gusto y letargo mental. En los casos graves, que se encuentran en gran medida en los paises subdesarrollados, la deficiencia de cinc causa perdida de cabello, diarrea, retraso de la maduracion sexual, impotencia, hipogonadismo en varones y lesiones oculares y cutaneas. Aunque la deficiencia manifiesta de cinc es rara en los paises desarrollados, la deficiencia de cinc es comun en los paises en desarrollo, donde los cereales constituyen una parte muy importante de la dieta.

Basandose en estudios de pacientes con sintomas manifiestos en paises en desarrollo, se encontro que los fitatos en los cereales inhiben marcadamente la absorcion de cinc, hierro y otros cationes divalentes. Los fitatos, en su mayor parte hexafosfatos de inositol y pentafosfatos, se encuentran en abundancia en los panes y fibra de grano entero, productos de trigo integral, cereales, soya, avena, legumbres (incluyendo cacahuetes y guisantes), maiz, arroz y muchos productos alimenticios que se consideran ricos en fibra. Los grupos fosfato de estos polioles carbociclicos forman complejos fuertes e insolubles con cinc e inhiben su absorcion.

La deficiencia subclinica de cinc es dificil de detectar. La medicion en laboratorio del estado nutricional del cinc es dificil debido a su distribucion en todo el cuerpo como un componente de varias metaloproteinas y otras proteinas de union a cinc, asi como acidos nucleicos. La medicion de los niveles de cinc en el cuerpo es dificil y los niveles sericos o plasmaticos de cinc y las tasas de excretion urinaria no se correlacionan bien con los niveles de cinc intracelular o tisular. Vease Maret W, Sandstead HH. "Zinc requirements and the risks and benefits of zinc supplementation." J Trance Elem Med Biol 20 (2006) 3-18. Ademas, los efectos clinicos de la deficiencia de cinc

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pueden estar presentes en ausencia de hallazgos anormales de laboratorio. Por lo tanto, para la evaluacion clmica de la deficiencia de cinc, a la hora de determinar la necesidad de suplementos de cinc se consideran factores de riesgo, tales como una ingesta calorica inadecuada, el alcoholismo y las enfermedades digestivas (Tabla 1), junto con sintomas de deficiencia de cinc.

Es necesaria una ingesta oral diaria de cinc para mantener un nivel de equilibrio debido a la falta de un sistema especializado de almacenamiento de cinc. El cinc dietetico se absorbe principalmente a traves del intestino delgado. El aumento del consumo de alimentos con un alto contenido de cinc absorbible puede remediar la deficiencia evidente de cinc. Se han calculado perdidas diarias de cinc del orden de 0,63 mg/dia para varones adultos sanos y de 0,44 mg/dia para mujeres adultas sanas. Las investigaciones en Estados Unidos indican que la ingesta promedio de cinc en Estados Unidos es de 14 mg/dia en varones adultos y 9 mg/dia en mujeres adultas. La cantidad diaria recomendada de cinc oral es de 8 mg/dia para mujeres adultas (no embarazadas ni lactantes) y de 11 mg/dia en varones adultos. Por el contrario, el valor diario (VD) para el cinc es de 15 mg al dia. Los VD fueron desarrollados por la Food and Drug Administration de Estados Unidos para ayudar a los consumidores a comparar los contenidos de nutrientes de los productos en el contexto de una dieta total. El VD para el cinc es de 15 mg para adultos y ninos de 4 anos o mas. La USDA ha fijado el nivel superior de ingesta tolerable (LS) para el cinc en 40 mg/dia. Se ha notificado malestar gastrointestinal a dosis de 50 a 150 mg/dia durante periodos prolongados. Se estima que una dosis emetica de cinc es de 225 a 450 mg de cinc. Es importante destacar que solo 0,26 gramos de fitato pueden inhibir la absorcion de hasta 50 mg de cinc oral y, bajo supervision medica, los pacientes pueden recibir mas de 200 mg/dia de suplementos de cinc.

El cinc esta altamente correlacionado con el contenido de proteinas de los alimentos, pero esta mas disponible en las proteinas animales que en los alimentos ricos en proteinas. Por ejemplo, aunque el pavo (140 gramos contiene 4,34 mg de zinc) y pollo (140 gramos contienen 2,88 mg de cinc) son fuentes razonablemente buenas de cinc, una pieza de 120 gramos de tofu contiene solo 0,77 mg de cinc. El contenido de cinc en las proteinas animales varia ampliamente. Por ejemplo, 6 ostras de tamano medio proporcionan 77 mg de cinc o mas del 500 % de la CDR. En cambio, 3 onzas de carne de vaca proporcionan 8,9 mg de cinc.

Muchas personas presentan riesgo de sufrir una deficiencia subclinica de cinc, incluidas aquellas que toman suplementos de cinc, pero con formas inorganicas peor absorbidas o en combinacion con fitatos que hacen que el cinc no este disponible. El presente inventor ha encontrado, sorprendentemente, que la administracion previa de cantidades relativamente altas de formas de cinc bien absorbidas permitira capacidad de respuesta a la toxina botulinica en individuos que anteriormente eran poco respondedores. Por tanto, claramente, tales individuos eran, probablemente, previamente deficientes funcionalmente en cinc disponible para la union y activacion de la endopeptidasa dependiente de cinc de la CL de la toxina botulinica. Sin embargo, ninguno de estos individuos exhibio signos manifiestos de insuficiencia de cinc.

Las personas que tienen un mayor riesgo de insuficiencia de cinc en lo que se refiere a la maxima capacidad de respuesta a los efectos de la toxina botulinica incluyen potencialmente un gran porcentaje de la poblacion de pacientes (vease la Tabla 1). Las personas con un riesgo potencialmente aumentado de insuficiencia de cinc en el presente contexto incluyen aquellos que tienen dietas ricas en fitatos (sales de acido fitico) que se encuentran en panes y fibra de grano entero, productos de trigo integral, cereales, soja, avenas, legumbres (incluyendo cacahuetes y guisantes), judias, maiz y arroz. Tambien estan en riesgo las personas que tienen dietas bajas en carne, pavo, pollo u ostras (es decir, vegetarianos) o individuos que consumen estos alimentos ricos en cinc junto con alimentos y compuestos que hacen que el cinc no este disponible, incluyendo alimentos y otros compuestos ricos en acido fitico o fosfatos.

Muchos alimentos y bebidas contienen fosfatos o acido fitico como conservante. El acido fitico (mioinositol- 1,2,3,4,5,6-hexakisfosfato, que tiene la formula C6H6(OPO(OH)2)6) es la forma de almacenamiento primario de fosforo en muchos tejidos vegetales, incluyendo salvado y semillas. Los acidos fiticos son altamente reactivos y forman facilmente complejos con minerales tales como Ca2+, Fe2+/3+, Mg2+, Mn2+, Cu2+ y Zn2+, asi como con hidratos de carbono y proteinas. Debido a la capacidad para quelar cationes divalentes, los acidos fiticos se encuentran entre los compuestos utilizados para tratar el agua dura, eliminar el hierro y el cobre de los vinos e inactivar los contaminantes de trazas metalicas en los aceites animales y vegetales. El conservante E391 es acido fitico.

Como se usa en el presente documento, un "suplemento de cinc" significa una o mas formas de cinc inorganico u organico o combinaciones de los mismos para administracion oral, incluyendo en las formas solida, gel, liposomica y liquida. La expresion cinc inorganico se refiere al cation divalente Zn2+ y sales inorganicas de cinc. Entre los ejemplos no limitantes se incluyen cloruro de cinc (ZnCh), cloruro de cinc tetrabasico (Zn5Cl2(OH)8), oxido de cinc (ZnO), sulfato de cinc (ZnSO4 y cloruro de cinc tetrabasico (Zn5Ch(OH)8). El porcentaje de cinc elemental varia en estas formas. Por ejemplo, aproximadamente el 23 % de sulfato de cinc esta constituido por cinc elemental. Por tanto, 220 mg de sulfato de cinc contienen 50 mg de cinc elemental.

Como se usa en el presente documento, la expresion "cinc organico" se refiere a complejos de cinc organico, asi como proteinatos de cinc, quelatos de cinc y sales con moleculas y compuestos organicos, y complejos de aminoacidos de cinc, incluyendo los complejos cinc histidina, cinc metionina (ZnMet), cinc lisina (ZnLys) etc.

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Ademas, entre los ejemplos no limitantes se incluyen acetato de cinc (Zn(O2CCH3)2), ascorbato de cinc (Ci2Hi4ZnOi2), aspartato de cinc (C8HioN2O8Zn2H), butirato de cinc (Zn(C4HzO2)), carbonato de cinc (ZnCO3), citrato de cinc (Zn3(C6H5O7)2), gluconato de cinc (Zn(Ci2H22Oi4)), glicinato de cinc (C4H8N2O4Zn), histidinato de cinc (Ci2Hi6N6O4Zn), cetoglutarato de cinc (C5HaO5Zn), lactato de cinc (Zn(C3H5O3)2), malato de cinc (C4H4O5Zn), picolinato de cinc (Ci2H8N2O4Zn), propanoato de cinc (C6HioO4Zn), estearato de cinc (C36H7oO4Zn) y succinato de cinc (C4H4O4Zn). Al igual que con las sales inorganicas de cinc, el porcentaje de cinc elemental varia en estas formas. Por ejemplo, con el arginato de cinc, 300 mg suministran 30 mg de cinc elemental.

Ciertas formas de cinc, tales como oxido de cinc y carbonato de cinc, son esencialmente insolubles en solucion acuosa y generalmente se ha considerado que se absorben mal. La administracion de una dosis unica de 50 mg de cinc en las formas facilmente absorbidas de sulfato de cinc y acetato de cinc induce nauseas y vomitos en adultos humanos, mientras que la misma dosis de oxido de cinc causa estos sintomas solo en un pequeno porcentaje de individuos, posiblemente segun las diferencias en la absorcion. Vease Allen LH. "Zinc and Micronutrient Supplements For Children" Am J CLin Nutr 68 (Supl.) (1998) 4955. Por lo tanto, la consideracion de las dosificaciones adecuadas de cinc dietetico para los fines de la presente invencion incluye consideraciones de velocidades relativas de absorcion.

Tal como se usa en el presente documento, el termino “fitasa” hace referencia a las enzimas hidrolasas, que son capaces de catalizar la liberacion de fosforo a partir de acido fitico y sales del mismo (fitatos). Las fitasas estan disponibles a partir de muchas fuentes, incluyendo fuentes de plantas, generalmente de semillas en germinacion, y microbios. Se han descrito fitasas derivadas de bacterias tales como especies de Bacillus subtilis y especies de Pseudomonas, asi como de levaduras y hongos filamentosos. Se ha descrito la clonacion y la expresion del gen de fitasa de Aspergillus niger, entre otros. Vease el documento EP0420358. Hay diferentes tipos de fitasas dependiendo de la especificidad de la posicion de sus moleculas de acido fitico de accion. Por tanto, por ejemplo, una 3-fitasa (mioinositol hexafosfato 3-fosfohidrolasa, EC 3, 1, 3,8) primero hidroliza el enlace ester en la posicion 3. Una 6-fitasa (mioinositol hexafosfato 3-fosfohidrolasa, EC 3,1.3,26) hidroliza primero el enlace ester en la posicion 6. Aunque hay excepciones, las fitasas vegetales son, generalmente, 6-fitasas. Las fitasas microbianas son, principalmente, 3-fitasas.

El consumo frecuente de alcohol a largo plazo se asocia con la alteracion de la absorcion de cinc y el aumento de la excrecion urinaria. Otros potenciales factores de riesgo para la deficiencia funcional de cinc incluyen las personas que toman suplementos que interfieren con la absorcion de cinc, incluyendo suplementos de hierro, vitamina A, cobre y calcio; con frecuencia consumen productos lacteos que contienen caseina; tienen infecciones, quemaduras o han sufrido recientemente una cirugia; tienen alguna enfermedad cronica; tienen diarrea frecuente o algun sindrome de malabsorcion; estan embarazadas y/o tienen menos de 25 anos de edad o mas de 70 anos.

Dado que los factores de riesgo para una deficiencia funcional de cinc en el contexto actual son tan frecuentes, uno de los metodos mas convenientes para asegurar que habra cinc suficiente para la union y la activacion de la toxina botulinica es aumentar las reservas de cinc mediante administracion de suplementos orales antes, simultaneamente o poco despues de la administracion de la toxina botulinica. En un aspecto de la invencion, se proporcionan suplementos orales e instrucciones para su uso. En una realizacion, los suplementos orales incluyen suficiente cinc para proporcionar de 10 a 400 mg diarios de cinc elemental. La cantidad de cinc administrada varia con la absorcion relativa de la forma de cinc seleccionada y las formas bien absorbidas se administran a dosis mas bajas para evitar efectos emeticos. El cinc a un nivel de 10 mg es esencialmente un nivel de CDR de cinc. Particularmente, en el extremo inferior del intervalo de 10 a 400 mg de cinc elemental, se proporciona, preferentemente, la administracion conjunta de una fitasa a un nivel de 0,8 a 10.000 unidades para la ingestion en el momento (es decir, en un par de horas) de ingestion de cinc con el fin de prevenir la quelacion de acido fitico del cinc ingerido. En una realizacion, se proporciona fitasa para su ingestion junto con cada ingestion de cinc, asi como suplementos de fitasa adicionales que se deben tomar con cada comida con el fin de maximizar la disponibilidad de cinc de todas las fuentes dieteticas. En una realizacion, se proporciona una dosis de carga alta de cinc, que suministra de 30-100 mg de cinc elemental diariamente junto con 0,8-10.000 unidades de fitasa.

Otros metodos de copreparacion para aumentar los efectos de las metaloproteasas administradas: El presente inventor ha demostrado que la capacidad de respuesta a la toxina botulinica puede mejorarse espectacularmente mediante un periodo de carga de cinc antes de la administracion de la toxina. Este hallazgo indica que incluso en personas que tienen una dieta occidental normal y sin evidencia evidente de insuficiencia de cinc, el cinc disponible esta limitado por lo menos en lo que respecta a la actividad de metaloproteasas anadidas exogenamente cuya actividad depende del cinc. En una realizacion, el cinc se administra localmente en el tejido que se va a tratar con una neurotoxina clostridial. En un aspecto, se inyecta una solucion de cinc en los sitios para la inyeccion de toxina en torno al tiempo de la inyeccion de la toxina, es decir, antes, durante y/o despues de la inyeccion de toxina o la administracion topica de toxina. En otros aspectos, el cinc se administra en una crema penetrante que se aplica topicamente en sitios para la inyeccion de toxina en aproximadamente el momento de la inyeccion de la toxina, es decir, antes, durante y/o despues de la inyeccion de la toxina. En otros aspectos, el cinc se administra mediante el uso de sistemas de nanoliberacion. En otros aspectos, el cinc se administra mediante administracion sublingual, pulverizacion nasal, gotas para los ojos, enemas, “aire forzado”, por via transdermica o rectal de cualquier forma, incluyendo una suspension liposomal o un sistema de nanoliberacion. En aspectos adicionales, se puede usar una

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solucion de cinc para reconstituir las toxinas terapeuticas. Cuando se van a tratar areas mayores o areas inaccesibles o para dosificar con mayor precision la terapia de cinc, como alternativa se puede emplear carga de cinc por inyeccion intravenosa o intramuscular.

Soluciones de reconstitucion de neurotoxinas de clostridiales: La eliminacion de Zn2+ de la cadena ligera (CL) mediante desplazamiento in vitro con quelantes solubles, tales como etilendiaminotetraacetato (EDTA), anula completamente la actividad enzimatica en preparaciones de celulas libres o rotas. Sin embargo, la toxina desprovista de su cinc unido puede retener la actividad contra las uniones neuromusculares intactas, posiblemente porque la toxina internalizada es capaz de unirse al Zn2+ citosolico disponible. Vease Simpson LL, et al. "The Role of Zinc Binding in the Biological Activity of Botulinum Toxin" J Biol Chem 276 (29) (2001) 27034-41. Aunque el tejido que se ha pretratado con quelantes pierde su capacidad para restaurar la actividad a la toxina que ha sido desprovista de cinc, la adicion de un exceso molar de Zn2+ (20 uM) al tejido restaurara rapidamente la actividad de la toxina sin cinc. Id.

En los estudios se ha demostrado que el cinc no proporciona un crioprotector o un efecto criopermisivo en la liofilizacion de la toxina botulinica. Veanse las solicitudes de patente de Allergan 10/976.529, publicadas como US 2005/0214326 y PCT/US2006/038913, publicada como WO 2007/041664. En la solicitud de patente de Estados Unidos de Allergan U.10/976.529, publicada como US 2005/0214326, se ha afirmado que la adicion de cinc a soluciones de liofilizacion proporciona una cierta potencia incrementada y una actividad antimicrobiana potenciada. Sin embargo, en otros estudios independientes se ha demostrado que la CL de BoNT-A experimenta una fragmentacion autocatalitica durante la purificacion y el almacenamiento y que esta fragmentacion se ve potenciada por el cloruro de cinc, asi como por otros cloruros de metales divalentes. Sobre esta base, algunos han recomendado que la toxina se almacene congelada a una concentracion baja de pH neutro o mas alto que esta desprovista de cualquier metal. Ahmed SA, et al. "Factors Affecting Autocatalysis of Botulinum A Neurotoxin Light Chain" Protein J. 23 (7) (2004) 445-51.

En cualquier caso, las composiciones farmaceuticas de BoNT disponibles comercialmente en la actualidad carecen de Zn2+ anadido ya sea antes de la liofilizacion o como aditivo a una solucion de reconstitucion. Por ejemplo, la marca BOTOX® de BoNT-A disponible en Allergan, Inc. (Irvine, CA) consiste en BoNT-A purificada que se ha purificado del cultivo mediante una serie de precipitaciones de acido en un complejo cristalino que consiste en la toxina proteica activa de alto peso molecular y una proteina hemaglutinina asociada. El complejo cristalino se redisuelve en una solucion que contiene solucion salina y seroalbumina humana (HSA) y se esteriliza mediante filtracion (0,2 micrometros) antes del secado al vacio. BOtOx® se reconstituye con cloruro sodico (solucion salina) al 0,9 % esteril, sin conservantes, antes de la inyeccion intramuscular. Otras composiciones farmaceuticas de BoNT disponibles comercialmente incluyen el complejo de hemaglutinina BoNT-A de marca Dysport® (Ipsen Ltd., Berkshire, Reino Unido), que se seca en un polvo con HSA y lactosa, para su reconstitucion con solucion salina antes de su uso. La marca MyoBloc® de BoNT-B se proporciona en viales de un solo uso de una solucion inyectable de 5.000 U de toxina botulinica de tipo B en complejo con las proteinas hemaglutinina y no hemaglutininas en HSA al 0,05 %, succinato de sodio 0,01M y cloruro de sodio 0,1M a un pH de aproximadamente 5,6. Por lo tanto, la actividad de la BoNT debe basarse en el cinc que permanece unido a la molecula a lo largo de la purificacion y el almacenamiento, asi como Zn2+ en los tejidos del huesped para su actividad.

Los resultados presentados en el presente documento muestran que, en la mayoria de los individuos analizados, la carga de cinc antes del tratamiento dio como resultado efectos mejorados, en ocasiones mejorados espectacularmente, y la duracion de los efectos del tratamiento. Esto demuestra que no hay suficiente Zn2+ unido a las moleculas de toxina para la actividad maxima y muestra ademas que los tejidos de los individuos normales carecen de suficiente Zn2+ disponible para compensar la falta de suficiente Zn2+ unido a las moleculas. Por tanto, en una realizacion presentada en el presente documento, se proporciona una solucion de reconstitucion de BoNT que incluye suficiente Zn2+ para permitir la maxima capacidad de respuesta de la toxina inyectada superando cualquier deficiencia en el cinc unido a la toxina o en el cinc disponible residente en el tejido. Dados los hallazgos divulgados en el presente documento se puede determinar empiricamente un nivel ideal de Zn2+ para proporcionar en soluciones de reconstitucion para su liberacion. En una realizacion, se usan ensayos de potencia de neurotoxina de raton para determinar niveles y formas de cinc a anadir a las soluciones de liberacion. En una realizacion, se administra a los ratones una dieta deficiente en cinc durante un periodo de limpieza antes de analizar los niveles deseados de Zn2+ para suministrarse en formulaciones de liberacion. Colocando a los ratones en un estado de deficiencia relativa de cinc antes de la prueba, se puede aislar la contribucion de Zn2+ presente en la solucion de administracion. En una realizacion de la invencion, la BoNT se liofiliza sin Zn2+ anadido y se proporciona una solucion de reconstitucion que contiene suficiente Zn2+ anadido para su actividad maxima. En una realizacion, el Zn2+ esta presente en la solucion de reconstitucion a una concentracion de 10 - 400 |jM.

En una realizacion, se proporciona una solucion de reconstitucion que incluye solucion salina isotonica, es decir, aproximadamente 0,9 % o NaCl 0,155M en solucion acuosa esteril (conservada o no conservada) e incluye ademas Zn2+ elemental a una concentracion de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 |jM o aproximadamente 0,000065 g a aproximadamente 0,00032 g/100 ml de cinc elemental. Esta cantidad de cinc elemental puede proporcionarse, por ejemplo, con ZnCb a aproximadamente 0,000136 g a aproximadamente 0,00068 g/100 ml.

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Ensayos de potencia de la neurotoxina clostridial: El ensayo actualmente aceptado de potencia por vial para la toxina botulinica es un ensayo de dosis letal intraperitoneal en ratones (DLR50). Potencia puede hacer referencia a la potencia recuperada de la toxina botulinica despues de la reconstitucion o a la potencia de la toxina botulinica antes de la liofilizacion. Una unidad (U) de una toxina botulinica se define como la cantidad de toxina botulinica que, tras la inyeccion intraperitoneal, mata al 50 % de un grupo de ratones hembra Weber que pesan 17-22 gramos cada uno al comienzo del ensayo. En el documento PCT/US2006/038913, publicado como WO 2007/041664 e incorporado en el presente documento como referencia se proporcionan mas caracteristicas del ensayo.

La monografia de la Farmacopea Europea (Ph Eur) sobre la toxina botulinica de tipo A (BoNT/A) para la inyeccion (01/15) ha avalado el uso de metodos no letales y ex vivo alternativos para reemplazar el ensayo de la DL50 en ratones, sujeto a su validacion. (Secardia, D. y Das, R.G. "Alternatives to the LD50 assay for botulinum toxin potency testing: Strategies and progress towards refinement, reduction and replacement" AATEX 14, numero especial, 581585. Proc. 6° Congreso mundial sobre usos alternativos y de animales en ciencias de la vida. 21-25 de agosto de 2007, Japon). Los ensayos alternativos de potencia propuestos incluyen el ensayo de paralisis flaccida de raton (tambien conocido como ensayo de ptosis abdominal de raton), que relaciona la actividad de BoNT/A con el grado de abombamiento abdominal observado despues de que inyectar la toxina por via subcutanea en la region inguinocrural izquierda de un raton. La magnitud de la paralisis es dependiente de la dosis. Como solo se inyecta una dosis subletal de BoNT, se considera que el ensayo es 10 veces mas sensible que el ensayo de DL50. El criterio de valoracion de la paralisis es mas similar al uso clinico de la toxina porque evalua los efectos musculares localizados, en lugar de la toxicidad sistemica. El ensayo de paralisis flacida es mas rapido que el ensayo de letalidad y proporciona resultados en 24 a 48 horas, en comparacion con 72 a 96 horas para un ensayo de DL50 tipico.

Tambien se ha propuesto un ensayo ex vivo alternativo y mide la amplitud de una respuesta de contraccion a la estimulacion electrica de una preparacion nerviosa/muscular escindida. La potencia de la toxina determina la disminucion de la amplitud de la respuesta de contraccion. El criterio de valoracion habitual del ensayo es el tiempo hasta que se observa una disminucion del 50 % en la amplitud. El modelo ex vivo puede proporcionar resultados en un plazo de dos horas.

Aunque el ensayo de DL50 se ha mantenido debido a su alta sensibilidad, el ensayo no esta normalizado y las unidades usadas en el etiquetado son especificas del producto y no intercambiables. La ausencia de pruebas normalizadas es una cuestion de seguridad dada la extrema toxicidad y la lenta recuperacion de la sobredosis. El presente inventor ha determinado que la administracion oral de cinc da lugar a una mejora considerable de la capacidad de respuesta botulinica en muchos pacientes que, de otro modo, no exhiben indicios de deficiencia de cinc. Este notable hallazgo se ha extendido a ensayos de potencia botulinica y proporciona una capacidad de respuesta maxima en el sistema de prueba. En un aspecto, se proporciona una dieta normalizada a los ratones durante un periodo de tiempo previo a la realization de un ensayo de DL50 intraperitoneal, un ensayo de paralisis flacida de raton o un ensayo de respuesta de contraccion ex vivo.

Una dieta tipica de roedores de calidad de investigation incluye del 14-20 % de proteina y de 50 a mas de 70 % de hidratos de carbono. El porcentaje mas alto de ingredientes en la dieta es alto en fitatos o, de lo contrario, inhibe la absorcion de cinc. Estos incluyen caseina, almidon de maiz, harina de soja, celulosa y pueden incluir ademas aceites de maiz y/o soja. Las mezclas de minerales se anaden a la dieta, pero no estan normalizadas y pueden variar 10 veces en diferentes dietas estandar.

En varios estudios publicados, las dietas que contienen 25-55 mg de cinc por kg de pienso se consideraron adecuados, mientras que las dietas que contienen < 1-5 mg de cinc por kg se consideraron deficientes. En otros informes, los valores de cinc se han dado en partes por millon (ppm) y las dietas deficientes en cinc y adecuadas contenian 1,5 y 70-75 ppm de cinc, respectivamente. Se ha observado que una dieta que contiene 10 mg/kg de cinc puede ser adecuada en la que la fuente primaria de proteina es clara de huevo o caseina, pero que se necesitarian al menos 20 mg/kg cuando se usa una fuente de proteina rica en fitato, tal como soja. Los ratones son relativamente resistentes a la toxicidad del cinc y se ha indicado que no muestran efectos significativos de 500 mg de Zn/l de agua durante hasta 14 meses.

En una realizacion de un metodo para normalizar la prueba de potencia de neurotoxina clostridial en animales y utilizar tejidos animales, a los animales que se van a usar para las pruebas de potencia se administra una dieta definida disenada para maximizar el cinc disponible durante al menos una semana antes de la prueba. En una realizacion, la dieta es baja en fitatos y rica en cinc. En una realizacion en la que se da una dieta baja en fitato, el nivel de cinc es al menos dos veces superior a los niveles de cinc recomendados. En una realizacion, se anade una fitasa a la dieta ademas de un nivel de cinc al menos dos veces superior a los niveles recomendados. En una realizacion, la dieta definida se selecciona por comparacion de la potencia del mismo lote de neurotoxina clostridial en grupos de animales alimentados con dietas diferentes durante al menos una semana antes del analisis de potencia. La dieta que proporciona la mayor sensibilidad a los efectos de la toxina se selecciona y normaliza como la dieta definida requerida para todas las pruebas de potencia futuras.

Los siguientes ejemplos se incluyen con el proposito de completar la divulgation e ilustrar los metodos y

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composiciones de la presente invention, as^ como presentar determinadas caractensticas de las composiciones. De ningun modo estos ejemplos estan destinados a limitar el alcance o las ensenanzas de esta divulgation.

Ejemplo 1: Inversion de la resistencia a la toxina botulinica mediante suplementacion con cinc dietetico

El presente inventor razono que las diferencias en las reservas intracelulares de cinc disponibles en individuos podrian explicar la falta de capacidad de respuesta a la toxina botulinica en algunos pacientes. En una exploration inicial de la hipotesis, se proporciono suplementacion con cinc a partir de fuentes alimenticias. Se selecciono el pavo como fuente dietetica de Zn2+ biodisponible basandose en la seguridad, los bajos costes, el facil acceso y la aceptacion general. Se calculo la cantidad de pavo a la que se dirigio a los pacientes a consumir para proporcionar una dosis diaria de 40 mg, o aproximadamente 2,5 veces el valor diario recomendado. Se considero que algunos de estos pacientes eran poco respondedores a las toxinas botulinicas, de tal manera que historicamente habia sido dificil lograr el control de sus sintomas de blefaroespasmo. Los resultados mostraron que la suplementacion con cinc daba lugar a un tratamiento notablemente eficaz del blefaroespasmo utilizando la misma fuente de toxina botulinica y la dosis que era ineficaz en el mismo paciente en ausencia de suplementacion.

Sorprendentemente, los resultados sugirieron que la deficiencia de cinc suficiente para reducir la eficacia de la toxina botulinica administrada se produce en un numero significativo de pacientes. Incluso en los pacientes sin resistencia evidente, se espera que los niveles crecientes de cinc para administration oral durante un periodo de tiempo previo a una inyeccion planificada proporcionen una ventaja normal en todos los pacientes. En particular, mediante la administracion de suplementos de cinc para proporcionar cinc intracelular disponible para la union y activation de la endopeptidasa de la CL de la toxina botulinica se puede obtener la respuesta dependiente de Zn2+mas alta posible. En muchos pacientes que han sido previamente resistentes a la toxina botulinica administrada, se pueden administrar dosis mas bajas con respuestas fiables. Si bien comer cantidades copiosas de proteina animal que contiene niveles altos de cinc durante un periodo de tiempo previo a un tratamiento con toxina botulinica puede ser eficaz para normalizar y aumentar la capacidad de respuesta a la toxina botulinica, esta solution es inconveniente, carece de normalization y, a largo plazo, es Incompatible con las preferencias dieteticas de la mayoria de los individuos.

De este modo, en un aspecto del avance proporcionado en el presente documento, se administran suplementos orales de cinc que proporcionan la normalizacion y el aumento deseados de las reservas de cinc. En un aspecto de la invencion, se formulan una o mas formas de cinc inorganico y/o organico en forma de comprimido o capsula. En un aspecto, la dosificacion de cinc para consumo oral esta en un intervalo de aproximadamente 10 a 400 mg de cinc elemental diariamente. En otras realizaciones, la dosificacion de cinc esta en el intervalo de aproximadamente 30 a 50 mg de cinc elemental diariamente. En una realization, la dosificacion de cinc es de aproximadamente 50 mg de cinc elemental diariamente. En una realizacion de la invencion, se proporciona un envase de dosis a un paciente antes de un procedimiento planificado que incluye un suplemento de cinc e instrucciones para tomar el suplemento. Como se proporciona en las instrucciones, se indica al paciente que comience la administracion de suplementos de cinc varios dias antes de la administracion de la toxina botulinica. En una realizacion, se indica al paciente que aumente la administracion de suplementos de cinc durante de 3 a 4 dias antes del tratamiento con toxinas, asi como el dia del tratamiento. En un aspecto, las instrucciones dirigen la evitacion de alimentos ricos en fitatos durante el periodo de carga de cinc.

Ejemplo 2: Suplementacion de cinc que incluye absorcion aumentada de cinc mediante administracion de fitasa

Dado el papel de los fitatos en la inhibition de la absorcion de cinc, en un aspecto de la invencion, la absorcion de cinc se incrementa mediante la administracion oral de fitasas que hidrolizan acidos fiticos (hexakisfosfato de inositol) y mejoran la absorcion oral de cinc. En la actualidad, las fitasas estan disponibles en el mercado nutraceutico como suplementos dieteticos disenados para aumentar la absorcion de cationes divalentes, tales como calcio, magnesio, hierro y cinc. Estos cationes divalentes forman complejos insolubles con acidos fiticos vegetales presentes en alimentos vegetales tales como maiz, subproductos de maiz, legumbres, soja y granos de cereales, haciendo que no esten disponibles. Las fitasas se usan como aditivos en piensos para animales con el fin de obtener fosfatos disponibles a partir de acido fitico (hexakisfosfato de inositol). Se ha divulgado que la adicion de fitasa a piensos para animales es una ventaja, incluso en dietas pobres en fitato. Vease, por ejemplo, el documento WO9949740, en el que se divulga una composition de alimentos pobres en fitato que contiene fitasa de Aspergillus. En el documento WO9830681 titulada "Combinaciones de fitasa" se divulga que una combination de al menos dos fitasas que tienen diferente especificidad de position es mas eficaz en la liberation de fosforo de fitato.

Actualmente estan disponibles dos tipos de fitasas dieteticas, las de cereales y las de fuentes microbianas. Las fuentes microbianas incluyen la fermentation de hongos tales como Aspergillus niger (Finase®, Alko Ltd., Finlandia), asi como la fermentacion bacteriana. La actividad fitasa se puede determinar mediante una serie de ensayos diferentes que miden la cantidad de enzima requerida para liberar una cantidad determinada de fosfato inorganico a partir de acido fitico por minuto a temperaturas y pH definidos. Las fitasas microbianas tienen una gama mas amplia de actividad de pH y se ha demostrado que proporcionan una mayor absorcion de hierro en estudios humanos en comparacion con la fitasa de trigo. En un estudio de este tipo, la administracion de 20.000 unidades de fitasa (UF) aumento la absorcion de hierro en un 14-26 %. Vease, Sandberg A-S, et al. "Dietary Aspergillus niger Phytase

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Increase Iron Absorption in Humans" The Journal of Nutrition 126 (1996) 476. Por tanto, en un aspecto se proporciona un suplemento dietetico que incluye una o mas formas de cinc y al menos una fitasa microbiana. La administracion del cinc y la fitasa preparan al paciente para una capacidad de respuesta maxima a la toxina botulinica administrada posteriormente.

Como se ha mencionado anteriormente, se pueden usar cinc y fitasa combinadas para aumentar rapida y eficazmente de forma segura los niveles de cinc en el cuerpo entero para aplicaciones distintas de la union y activacion mejoradas de la endopeptidasa de la CL de la toxina botulinica. Por ejemplo, puede ser deseable aumentar los niveles de cinc de cuerpo entero en tiempos de necesidad medica, incluyendo, pero sin limitaciones, afecciones tales como: cicatrizacion de heridas, recuperacion de quemaduras, compromiso inmunologico e impotencia masculina.

Con el fin de analizar adicionalmente los resultados aparentemente positivos de la suplementacion dietetica de cinc proporcionada por la ingestion de un alimento de alto contenido de cinc, asi como para analizar si la adicion de fitasa conferiria un beneficio en la absorcion de cinc, se inicio otro ensayo de comparacion de la reactividad a la toxina botulinica en pacientes despues de un periodo de cuatro dias de analisis de la suplementacion con dos suplementos diferentes en comparacion con un placebo. Cada una de las sustancias de ensayo y el placebo se proporcionaron de manera variada a los sujetos de ensayo sin identificacion. Por lo tanto, los pacientes estaban enmascarados con respecto a la naturaleza del suplemento. El placebo (P) era una forma de capsula de lactulosa. Las dos preparaciones de ensayo fueron Z10, que era una dosis de CDR normal de 10 mg de cinc en forma de gluconato de cinc, y Z50P, que era una dosis de carga de cinc relativamente alta que proporcionaba 50 mg de cinc en forma de citrato de cinc junto con 3.000 UFI de fitasa (derivada del hongo Aspergillus niger). Se registraron dos parametros diferentes de sensibilidad a la toxina botulinica, duracion (D) y efecto (E). La duracion se expreso como un porcentaje de aumento o disminucion de la duracion "habitual" del efecto en el paciente debido a que la experiencia demuestra que diferentes pacientes normalmente experimentan diferentes duraciones del efecto. Para algunos pacientes, los tratamientos con toxinas suelen durar un mes, para otros tres meses, etc. Por lo tanto, un paciente cuya toxina suele durar 90 dias y para los que no se observo ningun cambio en la duracion se puntuo como 0, es decir, no cambia con respecto a la duracion habitual. Se calcula que un paciente que experimenta un efecto de la toxina de 4 semanas adicionales (28 dias) tiene una mayor duracion de 28/90, cuya relacion es igual a +0,31 y representa un efecto que es 31 % mas largo de lo usual. Por el contrario, una puntuacion negativa, tal como -0,25, es igual a un efecto que es 25 % mas corto de lo habitual. El efecto (E) se expreso como la desviacion de la percepcion habitual del paciente individual de comodidad y efecto deseado. Por ejemplo, 0 = ningun cambio con respecto al efecto habitual, -1 = ligeramente menos eficaz que lo habitual, - 2 significativamente menos eficaz que lo habitual, +1 ligeramente mas eficaz que lo habitual, +2 = significativamente mas eficaz que lo habitual, +3 = mejor efecto nunca logrado para ese paciente. Para asegurar la exactitud, los pacientes mantuvieron registros regulares de la eficacia percibida del tratamiento.

Los resultados de un ensayo de 44 pacientes se presentan en forma de tabla en la Figura 1. Todos estos pacientes habian sido tratados previamente y tenian un historial previo registrado de capacidad de respuesta a la toxina botulinica. Veintitres de los pacientes se consideraron pacientes con blefaroespasmo dificil de tratar (BD), lo que significa que: a.) requerian de forma rutinaria > 50 unidades/sesion de la BoNT-A de marca of Botox® u otra equivalencia de la toxina botulinica; b.) tenian de forma rutinaria resultados suboptimos notificados por el paciente, a pesar de la respuesta maximizada de una dosis y patron de inyeccion adaptada; y c.) notificaban un grado de variabilidad del efecto de la toxina de un tratamiento a otro a pesar de la dosis y patron de la inyeccion no variable. Otros siete pacientes eran pacientes con blefaroespasmo que respondieron de forma consistente al tratamiento con BoNT-A (BC). Cuatro pacientes eran pacientes con espasmo hemifacial (H), mientras que diez pacientes recibieron tratamiento cosmetico para las arrugas (C). Los tres tipos de BoNT administrados se muestran en la Figura 1 en las columnas "T" como ("B") BoNT-A (Botox®), ("M") BoNT-B (Myobloc®) y ("D") BoNT -A (Dysport®). Se trato a los pacientes en un estudio piloto aleatorizado, doble ciego, controlado con placebo y con grupos cruzados.

Un tercero asigno a los participates del estudio al azar de forma desigual a uno de cuatro grupos de tratamiento y tanto el medico que los trataba como los pacientes estaban enmascarados a los suplementos suministrados antes de la inyeccion. Veintitres (52 %, grupo A) se sometieron a una suplementacion previa a la inyeccion con Z50P solo (50 mg de citrato de cinc mas 3. 000 unidades de fitasa), seis (14 %, grupo B) ) se sometieron a una suplementacion previa a la inyeccion con P (lactulosa como placebo) y Z50P a tiempos diferentes en un diseno de grupos cruzados, cuatro (9 %, grupo C) se sometieron a una suplementacion previa a la inyeccion con Z10 (10 mg de gluconato de cinc) y Z50P a tiempos diferentes en un diseno de grupos cruzados y 11 (25 %, grupo D) sometieron a una suplementacion previa a la inyeccion del estudio con P, Z10 y Z50P a tiempos diferentes en un diseno triple de grupos cruzados.

En referencia ahora a la figura 2 se muestra un grafico 200 que ilustra los resultados graficos del ensayo de suplementacion de cinc y cinc mas fitasa durante cuatro dias antes de la administracion de toxinas botulinicas terapeuticas con respecto a la duracion (D) del efecto de la toxina en el paciente. El eje vertical 202 en la figura 2 representa el cambio porcentual en la duracion de la accion de la toxina en el paciente. El eje horizontal 204 muestra varias barras, cada una representativa de una poblacion de pacientes que recibe: un placebo (P) 206; 10 mg de gluconato de cinc (Z10) 210; o 50 mg de citrato de cinc, ademas de fitasa (Z50P) 214. Las barras de intervalo de

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confianza 208/212/216 representan intervalos de confianza del 95 % respecto a la media. Como se puede observar en las Figuras 1 y 2, no se observo ningun cambio significativo (p> 0,05) respecto a la duracion habitual del tratamiento espedfico del paciente en la duracion (D) de los tratamientos con toxina botulinica con suplementacion previa a la inyeccion para pacientes que recibieron placebo (P) 206 o 10 mg de gluconato de cinc (Z10) 210, que se aproxima a la CDR para el cinc.

En referencia ahora a la figura 3 se muestra un grafico 300 que ilustra los resultados graficos del ensayo de suplementacion de cinc y cinc mas fitasa durante cuatro dias antes de la administracion de toxinas botulinicas terapeuticas con respecto al cambio percibido subjetivo de los pacientes en la eficacia € de los tratamientos de la toxina. El eje vertical 302 en la figura 3 representa el cambio percibido en la eficacia (E) de la toxina en el paciente. El eje horizontal 304 muestra varias barras, cada una representativa de una poblacion de pacientes que recibe: un placebo (P) 306; 10 mg de gluconato de cinc (Z10) 310; o 50 mg de citrato de cinc, ademas de fitasa (Z50P) 314. Las barras de intervalo de confianza 308/312/316 representan intervalos de confianza del 95 % respecto a la media. Como se puede observar en las Figuras 1 y 3, no se observaron cambios significativos (p> 0,05) en efecto (E) de la capacidad de respuesta normal especifica del paciente en los pacientes que recibieron placebo (P) 306 o 10 mg de gluconato de cinc (Z10) 310, que se aproxima a la CDR para el cinc.

Por el contrario, en 41 de los 44 (93 %) pacientes que recibieron Z50P (50 mg de citrato de cinc mas 3 000 unidades de suplementos de fitasa) 214 durante cuatro dias antes de las inyecciones de botulinum, se observo un incremento promedio espedfico del paciente en la duracion del efecto (D) del 23,6 % (p <0,05, veanse las Figuras 1 y 2). Ademas, se comprobo que el efecto (E) del tratamiento con toxina botulinica aumento significativamente (p < 0,05, veanse las Figuras 1 y 3).en 38 de 44 pacientes (86 %) que recibieron Z50P (suplementos de 50 mg de citrato de cinc mas 3.000 unidades de fitasa) 314 durante cuatro dias antes de las inyecciones de botulinum. Practicamente todos los pacientes mostraron mejoria en la duracion (D), el efecto (E) o ambos. En la mayoria de los casos, tanto la duracion (D) como el efecto (E) habian mejorado notablemente. De hecho, en tres pacientes con blefaroespasmo que recibieron una carga alta de cinc y fitasa (Z50P) que notificaron un efecto beneficioso disminuido, se observo una sobredosis de toxina obvia, lo que les dificultaba cerrar los ojos. Asi, incluso entre estos tres pacientes, hubo un aumento del efecto de la toxina. Entre otras cosas, los resultados sugirieron (y la experiencia posterior ha demostrado) que se puede administrar dosis bajas de BoNT con una capacidad de respuesta razonable en muchos pacientes si los pacientes han recibido cargas de cinc antes del tratamiento. Mediante la carga de cinc antes de la administracion, la capacidad de respuesta maxima puede normalizarse a traves de la poblacion de pacientes y se puede eliminar una variable importante en la capacidad de respuesta individual. Las dosis eficaces mas bajas pueden reducir el desarrollo posterior de anticuerpos que interfieren con el tratamiento. Se cree que estos datos son altamente fiables, ya que los pacientes con blefaroespasmo son muy conscientes diariamente si pueden o no mantener los ojos abiertos para las funciones de leer, conducir, vestirse ellos mismos, ver television, trabajar, comprar, etc.

Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas en el presente documento se incorporan por referencia en su totalidad tal como se han expuesto. Aunque la presente invencion se ha descrito con referencia a realizaciones ilustrativas, esta descripcion no pretende interpretarse en un sentido limitante. Varias modificaciones y combinaciones de realizaciones ilustrativas, asi como otras realizaciones de la invencion, seran evidentes para los expertos en la tecnica con referencia a la descripcion. Por lo tanto, se pretende que las reivindicaciones adjuntas incluyan tales modificaciones y mejoras.

Claims (9)

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   REIVINDICACIONES

   1. Al menos un suplemento que comprende una combinacion de cinc y fitasa que asegura la disponibilidad del ion cinc que se requiere para la actividad de la neurotoxina botulmica, para su uso en un metodo de preparacion de un sujeto para la administration de la neurotoxina botulmica, que comprende:

   instruir sobre la administracion del al menos un suplemento, en donde la administracion indicada del suplemento proporciona una disponibilidad del ion de cinc requerido a un nivel suficiente durante un periodo de carga del suplemento para eliminar una deficiencia funcional del ion cinc como causa de una capacidad de respuesta pobre o limitada a la neurotoxina botulmica administrada,

   en donde el suplemento se administra durante el periodo de carga antes de la administracion de la neurotoxina botulmica.
2. 2. El suplemento de la reivindicacion 1 para su uso en el metodo de preparacion de un sujeto para la administracion de la neurotoxina botulmica de la reivindicacion 1, en donde el suplemento comprende cinc en una forma que proporciona cinc elemental en una cantidad de 10 a 400 mg diarios.
3. 3. El suplemento de la reivindicacion 1 para su uso en el metodo de preparacion de un sujeto para la administracion de la neurotoxina botulmica de la reivindicacion 1, en donde el suplemento comprende una forma de cinc organico seleccionada de uno o mas de: proteinatos de cinc, quelatos de cinc y/o sales con moleculas organicas, y complejos de aminoacidos de cinc.
4. 4. El suplemento de la reivindicacion 1 para su uso en el metodo de preparacion de un sujeto para la administracion de la neurotoxina botulmica de la reivindicacion 1, en donde se instruye al sujeto ademas para limitar el consumo de fitatos durante el periodo de carga.
5. 5. El suplemento de la reivindicacion 1 para su uso en el metodo de preparacion de un sujeto para la administracion de la neurotoxina botulmica de la reivindicacion 1, en donde se instruye sobre el consumo del suplemento mediante consumo oral a un nivel de 0,8 a 10.000 unidades diarias.
6. 6. El suplemento de las reivindicaciones 1 o 5 para su uso en el metodo de preparacion de un sujeto para la administracion de la neurotoxina botulmica de la reivindicacion 1, en donde el periodo de carga es de menos de, o al menos de 4 dias antes de la administracion de la neurotoxina botulmica.
7. 7. Un envase de preparacion de metaloproteasa terapeutica previo al procedimiento para su uso en un metodo de preparacion de un sujeto para la administracion de la neurotoxina botulmica, que comprende:

   - una cantidad de suplementos en forma de capsula o comprimido, en donde el suplemento comprende una combinacion de ion cinc y fitasa que asegura la disponibilidad del ion cinc que se ha determinado que es necesario para la actividad de una neurotoxina botulmica y los suplementos se proporcionan en una cantidad suficiente para suministrar el ion cinc diariamente durante un periodo de carga inmediatamente anterior al tratamiento de un paciente con la neurotoxina botulmica; e

   - instrucciones que instruyen al paciente para que tome los suplementos y reducir la ingesta de fitatos.
8. 8. El envase de preparacion de metaloproteasa terapeutica previo al procedimiento de la reivindicacion 7 para su uso en el metodo de preparacion de un sujeto para la administracion de la neurotoxina botulmica de acuerdo con 7, en donde el suplemento comprende una forma organica o inorganica de cinc a una dosificacion suficiente para suministrar de 10 a 400 mg de cinc elemental diariamente durante un periodo de carga inmediatamente anterior al tratamiento de un paciente con neurotoxina botulmica.
9. 9. El envase de preparacion de previo al procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8 para su uso en el metodo de preparacion de un sujeto para la administracion de la neurotoxina botulmica de acuerdo con 7, en donde el periodo de carga es de menos de, o al menos de 4 dias inmediatamente antes del tratamiento del paciente con la neurotoxina botulmica.