KR20120107915A - 메탈로프로테아제 치료에 대한 반응성을 증대시키기 위한 아연 보충 방법 - Google Patents

메탈로프로테아제 치료에 대한 반응성을 증대시키기 위한 아연 보충 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 반응성을 증가시키고/시키거나 최대화시키는 것을 포함하여 치료학적 메탈로프로테아제에 대한 반응성을 증가시키고, 아연의 기능적 결핍에 기인한 보툴리눔 및 파상풍 독소 저항성을 예방하는 방법 및 조성물을 제공한다. 또한, 로딩 기간 동안에 아연 보충물을 투여하고/하거나 아연 보충물과 함께 피타제 보충물을 투여하는 것을 포함하여 결여성 개체에서 아연을 대체 또는 보충하는 방법이 제공된다. 또한, 상이한 제조업자로부터의 제품의 사용시의 더 큰 확실성 및 안전역을 제공하는 보툴리눔 독소 효력검정의 표준화 방법이 제공된다.

Description

메탈로프로테아제 치료에 대한 반응성을 증대시키기 위한 아연 보충 방법 {ZINC SUPPLEMENTATION TO INCREASE RESPONSIVENESS TO METALLOPROTEASE THERAPY}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 각각 온전히 본 발명에 참고로 포함된 것으로, 2010년 6월 23일에 출원된 미국 특허출원 제12/821,370호 및 2009년 6월 24일에 출원된 미국 임시출원 제61/219,932호를 우선권으로 주장한다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로, 특정의 약제, 특히 클로스트리디움 신경독 (Clostridial neurotoxins)과 같은 보조인자 의존성 독소의 검정 및 투여와 함께 사용되는 조성물 및 방법에 관한 것이다.
본 발명의 범위를 제한하지 않으면서, 그의 배경은 보툴리눔 독소와 같은 치사성 독소의 유용한 약제로의 개발과 관련하여 기술된다. 질병 용어 "보툴리즘 (botulism)"은 1800년대의 독일에서 부분적으로 요리한 소시지에 의해서 야기된 치명적인 사건을 근거로 하여 소시지, 보툴루스에 대한 라틴어로부터 유래되었다. 보툴리즘은 후에, 1895 년에 최초로 분리된 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium botulinum) 유기체에 의해서 만들어지는 독소에 기인하는 것으로 결정되었다. 클로스트리디움 보툴리눔은 식물 상에서, 토양, 물 및 동물의 장관 내에서 발견되는 통상적으로 발견되는 그람-양성의 포자-형성성 혐기성 간균이다. 보툴리눔 독소는 1928 년에 최초로 정제되었으며, 공지된 가장 독성인 물질 중의 하나이다. 보툴리눔 독소는 신체 내의 4 가지 상이한 부위에서 마비를 야기하는 작용을 한다: 아세틸콜린 (Ach)을 방출하는 신경근 접합부, 자율신경절, 신경절후 부교감신경 말단부, 및 신경절후 교감신경 말단부.
약리학적으로 유사한 보툴리눔 신경독 (BTX 또는 BoNT로 약칭함)의 항원적으로 상이한 형태를 생산하는 것으로, 클로스트리디움 부티리쿰 (C. butyricum), 클로스트리디움 바라티 (C. baratii) 및 클로스트리디움 아르젠티넨스 (C. argentinense)를 포함하는 클로스트리디움의 몇 가지 상이한 균주가 확인되었다. 현재는 클로스트리디움 속의 박테리아에 의해서 만들어진 보툴리눔 신경독의 8 가지 주요 혈청형이 공지되어 있다: A, B, C (C1 및 C2), D, E, F, 및 G. 상기 혈청형의 서브타입은 밀접하게 관련되거나 더 관계가 멀 수 있다. 예를 들어, BoNT-A1 및 A2는 95% 상동성인 반면에 BoNT-A3 및 A4는 BoNT-Al에 대해서 각각 81% 및 88% 상동성이다. 보툴리눔 독소 타입 A (BoNT-A)가 가장 강력한 독소이고, 다음이 B 및 F 독소 타입이다. 이들 타입이 현재까지 상업적으로 이용되었다.
BoNT-A (Oculinum, 현재는 BOTOX® 상표, Allergan, Inc.)는 안검 경련 (조절되지 않는 깜빡임), 사시 (교차된 눈), 메이그스 증후군 (Meige's syndrome) (양측성 안검경련과 병발하는 안면 하부의 근긴장이상), 및 반안면 경련의 의학적 치료를 위해서 1989 년에 FDA 승인되었다. 심한 목과 어깨의 수축을 야기하는 신경적 운동장애인 경부 근긴장이상의 치료에 대한 승인은 2000년 12월에 승인되었다. 보톡스 (BOTOX®)는 2001년에 액와 다한증 (과도한 발한)에 대해 영국에서 승인되었으며, 같은 해에 보톡스는 캐나다에서 액화 다한증, 초점 근육경직, 및 이마 주름에서 주름의 화장적 치료에 대해 승인되었다. 2002년에 미국 FDA는 보톡스 화장품이 눈썹 사이에서의 중등도 내지 심각한 찌푸린 주름 (미간 주름)의 외관을 일시적으로 개선시키는데 승인되었음을 공표하였다. 2004년 7월에 FDA는 일차 액와 다한증을 치료하도록 보톡스를 승인하였다.
BoNT-B가 또한 임상적 사용을 위해서 개발되었으며, 몇 가지 제품을 현재 상업적으로 입수할 수 있다 (예를 들어, 미국에서는 MyoBloc® 및 유럽에서는 NeuroBloc®, Solstice Neurosciences). 마이아블록 (MyoBloc®)은 2000년에 경부 근긴장이상의 치료를 위해서 FDA 승인되었다. 보톡스 (BOTOX®) BoNT-A는 어떤 소정의 특정한 치료에 대해서는 마이아블록 BoNT-B보다 50-100 배 더 강력한 것으로 생각된다.
세계적으로 다수의 상이한 제조업자가 현재 제오민 (Xeomin®) (Merz Pharma, Germany), 프로사인 (Prosigne®) (Lanzhou Inst. For Biol. Prod., China), 및 뉴로녹스 (Neuronox®) (한국에서는 Meditoxin®, Medy-Tox, Inc., Korea)를 포함한 다양한 상품명으로 정제된 BoNT-A를 생산하고 있다. 다른 생물학적 제품과 마찬가지로, 새로운 배취에 대한 생물학적 활성은 반드시 측정되어야 한다. 이것은 상당한 독성을 가지며, 그에 대한 정상적인 신경근육 활성의 회복이 연장되는, 보툴리눔 독소와 같은 약물에 대해서 특히 중요하다. 근육내로 전달된 보툴리눔 독소는 신경근 접합부에서 작용하여 전시냅스성 운동 뉴론으로부터 Ach의 방출을 억제함으로써 근육 마비를 야기한다. 마비효과의 피크는 주사한 후 4-7일에 나타난다. 보툴리눔 독소의 투여 후 약 2 개월에, 액손은 팽창하기 시작하며, 새로운 신경 말단 스프라우트 (sprouts)가 출현하고, 근육 표면 쪽으로 확장한다. 이들 새로운 신경 스프라우트는 운동 신경 유니트를 재-정착시키고, 근육 마비는 전형적으로 2-4 개월 이내에 반전된다. 과잉 복용은 충분히 위험하며, 우발적인 과잉 복용의 경우에 안티베닌을 이용할 수 있는 회복을 충분하게 연장시켰다.
상업적으로 이용할 수 있는 모든 보툴리눔 독소의 용량은 생물학적 활성의 유니트로 표현된다. 보툴리눔 독소의 1 유니트는 마우스에서 계산된 중앙 복강내 치사량 (LD50)에 해당한다 [참조: Hoffman RO, Helveston EM. "Botulinum in the treatment of adult motility disorders" Int Ophthalmol Clin 26 (1986) 241-50]. 비록 확실히 이상적이지는 않지만, LD50 검정은 그의 높은 민감성으로 인하여 존속되어 왔다. 효력 검정에 대한 표준화된 접근방법이 채택되지 않고, 마우스 LD50 검정 프로토콜에 있어서의 제조업자-간 차이가 상이한 제품에 대해 유니트당 활성이 상당한 가변성을 초래하였다는 사실에도 불구하고, 유니트의 정의는 상업적으로 이용할 수 있는 독소의 모든 형태에 적용된다. 예를 들어, 보톡스에 대한 디스포트 (Dysport®) 상표의 BoNT-A (Ipsen Pharmaceuticals, France)의 생물학적-동등성 비 (bio-equivalence ratio)는 안검 경련 및 반안면 경련이 있는 환자에게서의 다양한 검정에 의해 2.5:1 내지 4:1인 것으로 제시되었다. 그 결과, 특정한 적응증에서 추천된 보툴리눔 독소 투약량을 통지하는 경우에, 라벨에 사용된 유니트는 제품 특이적이고 상호교환될 수 없는 것이기 때문에 사용된 독소의 특정 상표를 명시하는 것은 중요한 것으로 생각되었다. BoNT가 크고 비교적 불안정한 분자라는 사실이 더 복잡하게 만든다. 제품의 적절한 재구성이 중요하며, 저장 수명은 매우 제한된다.
보툴리눔 독소는 인간에게서 항체의 형성을 유도하여 시간의 경과에 따라 독소의 감소된 효과를 초래할 수 있다 [참조: Frueh BR, et al. "Treatment of Bepharospasm with Botulinum Toxin. A preliminary report" Arch Ophthalmol l02 (1984) 1464]. 항체 생산은 누적 용량, 용량당 항원 로딩량 (antigenic load), 및 주사 사이의 시간 간격의 함수인 것으로 생각된다. 따라서, 최소의 치료학적 용량을 순차적 주사 사이에 최대 시간 간격을 두고 제공하는 것이 제안된다. 특정의 질병을 치료하는데 있어서 BoNT를 사용하는 것의 중요성을 고려하면, BoNT-F의 사용은 혈청형 A 및 B에 대해서 면역학적으로 저항성이 된 환자에게서 조사 중에 있다.
보툴리눔 독소는 대부분의 환자에 대해 효과적이지만, 치료학적 효과는 검출가능한 항체 형성과는 무관하게, 개체에 따라서뿐만 아니라 개체에 대한 치료에 따라서 광범하게 변할 수 있다. 또한, 일부의 집단은 독소에 대해서 열등하게 반응성이거나 무반응성일 확률이 더 큰 것으로 확인되었다. 예를 들어, 65 세 이상의 환자의 30%까지는 감소된 보툴리눔 독소 효능을 나타낼 수 있다. 가능한 설명이 효력에 있어서의 원래의 제조업자 차이, 환자가 독소 특이적 항체를 발생하는 가능성뿐만 아니라 제품이 재구성 중에 분해하거나 교반될 가능성을 포함한다는 점을 감안할 때, 치료에 대해 환자가 응답하는데 실패한 것의 기준은 인지하기가 어려울 수 있다. 그러나, 특정한 환자 집단 내에서의 감소된 효과는 마찬가지로 또 다른 인자의 가능성을 시사한다.
매우 대량의 보툴리눔 독소 투여의 추정적인 용량-의존적 원격 확산으로 인한 환자 사망의 보고는 지난 몇 년 동안에 표면화되었으며, 따라서 원하는 치료학적 결과를 달성하는데 필요한 독소의 용량을 감소시킬 수 있는 어떤 방법이라도 유익할 수 있다.
전술한 바로부터, 치료에서 환자의 최대 반응성을 보장하고 효력의 더 충실한 표준화를 제공하는 능력은 중요한 치료학적 및 안전성 진보를 나타낼 수 있음이 명백하다.
발명의 요약
본 발명자는 놀랍게도, 보툴리눔 독소의 치료학적 투여 전에, 그와 동시에, 또는 잠시 후에 아연의 잘 흡수된 형태를 비교적 큰 양으로 투여하는 것이 이전에 열등하게 반응성이었던 개체에게서 독소에 대한 반응성을 가능하게 하고, 마찬가지로 다른 개체에서 보툴리눔 독소의 기능적 효력을 명백하게 증진시킬 수 있다는 것을 발견하였다. 더욱 주목할 만한 것으로, 본 발명자는 보툴리눔 독소의 투여 전의 아연 로딩이 실질적으로 검정한 모든 개체에게서 반응성을 증가시켰음을 발견하였다. 따라서, 검정한 개체가 이전에 보툴리눔 독소의 경쇄 (LC) 아연 의존성 엔도펩티다제의 결합 및 활성화에 이용할 수 있는 아연이 비교적 기능적으로 결핍되었음은 명백한 것으로 보인다. 아연 부족이 보툴리눔 독소의 효과에 대한 최대 반응성과 결부됨에 따라서 그에 대한 위험이 증가한 개체의 그룹은 큰 백분율의 환자 집단을 포함하기 때문에 (참조: 표 1), 본 발견은 보툴리눔 독소에 대한 최대의 가능한 아연-의존적 반응성을 위한 몇 가지 수단을 제공한다.
[표 1]
아연 결핍에 대한 위험 인자
1. 식이
a. 비타민 보충제
i. 열등하게 흡수된 (값싼) 무기 아연 형태
ii. 철
iii. 비타민 A
iv. 칼슘
v. 구리
b. 고 피테이트 섭취
i. 전곡 빵 및 섬유
ii. 통밀 제품
iii. 시리얼
iv. 대두
v. 귀리
vi. 콩과 식물 (땅콩, 땅콩 버터, 완두콩 포함)
vii. 콩
viii. 옥수수
ix. 쌀
x. 다수의 전-제조된 식품 (보존제)
xi. 대부분의 음료 (실질적으로 모든 탄산 청량음료 포함)
1. 포스페이트 함유 화합물
2. 보존제 E391
c. 알콜 소비
i. 아연 흡수의 감소
ii. 뇨 배설 증가
iii. 피테이트를 함유하는 다수의 와인
d. 카제인 및 칼슘을 함유하는 우유계 제품
e. 다수의 "섬유 풍부화" 식품 및 보충제
f. 채식주의 (붉은 육류, 가금류 및 어류가 적고, 대두는 많은 식이)
g. EDTA 보존제를 함유하는 식품
2. 의학적 조건
a. 감염 (바이러스, 박테리아, 진균성)
b. 화상
c. 대부분의 만성 질병
d. 흡수 불량
i. 빈번한 설사
ii. 스프루 (sprue) 등
iii. 빈번한 섬유 및/또는 완화제 사용이 있는 변비
3. 임신
4. 연령 < 25 또는 > 65
5. 이뇨제 사용
본 발명에 기술된 특정의 관점에서, 상기 발견은 치료되는 조직에서 금속 이온의 이용가능성에 대한 활성에 대해 의존적인 어떤 화합물에 의한 치료의 유효성을 최대화시키는 것으로 연장된다. 한가지 구체예에서, 상기 화합물은 치료학적 프로테아제이다. 한가지 구체예에서, 치료학적 프로테아제는 아연 엔도펩티다제이며, 그의 예로는 특히 보툴리눔 독소 (BoNT), 파상풍 신경독 (TeNT), 및 라임병 독소 (LDT)가 포함된다.
하나의 측면에 있어서, 치료학적 화합물의 투여 전에 - 및 일부의 경우에는 그와 동시에 또는 잠시 후에 - 로딩 기간 (loading period) 동안 금속 이온 보충물의 투여를 (경구적 소비 또는 그 밖의 다른 바람직한 방법에 의해서) 지시하는 것을 포함하여 치료학적 화합물 투여를 위해서 피험자를 준비시키는 방법이 제공되며, 여기에서 금속 이온 보충물의 지시된 투여는 투여된 화합물에 대한 열등한 반응성에 대한 원인으로서의 금속 이온의 상대적인 기능적 결핍을 제거하는데 충분한 레벨로 이루어진다. 한가지 관점에서, 상기 화합물은 보툴리눔 독소와 같은 아연 엔도펩티다제이다. 상기 금속 이온은 무기 또는 유기 형태일 수 있지만 이상적으로는 본 기술분야에서 공지된 생체이용율 측정에 따라 충분한 생체이용율을 기준으로 하여 선택된다.
하나의 측면에 있어서, 아연 프로테이네이트, 아연 킬레이트 및/또는 유기 분자와의 염, 및 아연 아미노산 컴플렉스 중의 하나 또는 그 이상으로부터 선택된 유기 아연 형태를 포함하는 아연 보충물이 제공된다. 아연 보충물은 1일에 10 내지 400 ㎎의 원소 아연을 전달하도록 디자인된다.
추가의 측면에 있어서, 금속 이온 흡수는 환자에게 로딩 기간 중에 피테이트의 소비를 제한하도록 지시함으로써 촉진된다. 한가지 특별한 구체예에서, 피험자는 금속 이온 보충물과 함께 적어도 하나의 피테이트를 투여하도록, 예를 들어, 경구적으로 소비하도록 지시된다.
치료학적 보툴리눔, 파상풍 신경독 또는 라임 독소 및 관련된 키메릭 또는 합성 독소에 대한 반응성을 최대화시키기 위한 한가지 구체예에서, 치료학적 금속 이온 의존성 독소에 의한 치료 전에, 그와 동시에, 또는 잠시 후에 아연 저장물 (stores)의 로딩은 아연 보충물은 섭취하고, 피테이트의 섭취는 감소시키도록 지시하는 설명서와 함께 캅셀제, 분말, 액체, 액체-겔, 리포좀 현탁액 또는 정제 형태의 아연 보충물의 일정량을 포함하는 전-절차용 프리팩 (pre-procedure prep pack)을 제공함으로써 용이하게 되며, 여기에서 아연 보충물은 독소에 의한 환자의 치료 전의 로딩 기간 중에 1일에 10 내지 400 ㎎을 제공하는데 충분하다. 이 구체예의 다른 관점에서, 전-절차용 프리팩은 추가로 캅셀제, 분말, 액체, 액체-겔, 리포좀 현탁액 또는 정제 형태로 및 로딩 기간을 통해서 아연 보충물과 함께 투여하기에 충분한 양으로 피타제 (phytase) 보충물의 일정량을 추가로 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서는, 산업분야에 걸친 표준화의 측정을 가능하게 하는, 보툴리눔 독소를 포함하는 독소의 효력을 검정하는 방법이 제공된다. 이들 구체예를 위해서 경구 또는 비경구용 아연 보충물은 독소 효력검정 전에 또는 그와 동시에 로딩 기간 중에 검정 동물에게 투여되며, 여기에서 아연 보충물은 투여된 독소에 대한 반응성을 최대화하는데 충분한 아연을 제공하도록 결정된다. 최대 반응성은 아연 흡수를 최대화시키는 것과 함께 아연 보충의 레벨을 변조시키는 것을 포함하여, 최대 반응성을 위한 식이 또는 아연 보충을 검정함으로써 경험적으로 결정된다. 아연 흡수는 식이성 피테이트 레벨을 조절할 뿐만 아니라 식이에 피타제를 첨가함으로써 변조될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 아연은 국소용 크림, 또는 국소 또는 전신적 주사에 의해서 조직에 공급된다. 다른 관점에서는, 표적 조직에서 독소의 최대 활성에 적절한 아연의 존재를 보장할 목적으로 아연 함유 용액 중에서의 치료학적 독소의 재구성이 제공된다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 조합물 중의 아연 및 피타제는 창상 치유, 화상 회복, 면역 손상 및 남성 발기부전과 같은 상태를 포함하는 (단, 이들로 제한되지 않는다) 의학적 필요의 시기에 전신 아연 레벨을 안전하게 효과적으로 빠르게 증가시키기 위해서 사용된다.
본 발명의 방법 및 조성물은 제공된 크게 개선된 치료학적 결과, 안전역, 및 치료에 따른 치료학적 효과의 신뢰성을 가지고 다수의 개체에서 보툴리눔 독소 상대적 저항성 및 치료학적 가변성을 위한 치료약을 제공한다. 투여된 치료학적 메탈로펩티다제의 잠재적 유효성의 최대화는 항체 매개된 저항성 발생의 추정적으로 부수적인 더 작은 위험 및 원치 않는 효과를 갖는 독소의 원격 확산의 잠재적인 감소에 의해 일부의 환자에게서 더 작은 용량의 투여 및 재투여 사이의 더 긴 시간이 가능하도록 한다. 본 발명에서 제공된 보툴리눔 독소 효력검정의 표준화 방법은 산업분야에서 오랫동안 지속되는 문제를 해결하고, 다양한 제조업자로부터의 제품을 사용할 때에 더 큰 확실성 및 안전역을 제공한다.
특징 및 이점을 포함한 본 발명의 더욱 완전한 이해를 위해서, 첨부된 도면과 함께 본 발명의 상세한 설명을 참고로 한다:
도 1은 치료학적 보툴리눔 독소의 투여 전에 4일 동안 아연, 및 아연과 피타제를 보충한 실험의 원 데이터를 나타낸다.
도 2는 환자에게서 독소 효과의 지속기간에 관한, 치료학적 보툴리눔 독소의 투여 전에 4일 동안 아연, 및 아연과 피타제를 보충한 실험의 그래프에 의한 결과를 나타낸다.
도 3은 독소 치료의 효능의 주관적으로 인지된 환자의 변화에 관한, 치료학적 보툴리눔 독소의 투여 전에 4일 동안 아연, 및 아연과 피타제를 보충한 실험의 그래프에 의한 결과를 나타낸다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 다양한 구체예를 만들고 사용하는 것은 이하에 상세하게 검토되지만, 본 발명은 광범한 종류의 특정한 상황에서 사용될 수 있는 다수의 적용가능한 발명 개념을 제공하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명에서 검토된 특정의 구체예는 단순히 본 발명을 만들고 사용하는 특정의 방법을 설명하는 것이며, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
특정의 개체에서 보툴리눔 독소 작용의 가변성은 지금까지 독소의 상이한 공급원 또는 로트 (lot), 부적절한 재구성 또는 저장, 주사 기술의 변화, 국소마취제 및/또는 냉각제의 사용, 및 항체 매개된 저항성에 기인하는 것으로 여겨졌다. 본 발명자는 보툴리눔 독소 저항성이 이용가능한 아연의 부족을 근거로 할 수 있는 것으로 생각하였으며, 이 주목할 만한 가설을 입증하였다. 이러한 발견은 제공된 크게 개선된 치료학적 결과 및 안전역을 갖는 것으로, 다수의 개체에서 보툴리눔 독소 저항성을 위한 치료약을 제공한다. 상기의 발견은 파상풍 및 라임 독소와 같은 다른 효소를 포함한, 금속 이온 생체이용율을 기준으로 하여 생체내에서 활성인 투여된 다른 화합물뿐만 아니라 창상 치유, 화상 회복, 면역 손상 및 남성 발기부전과 같이 증가된 전신 아연 레벨로 인한 효과를 볼 수 있는 다른 상태에 대한 개체의 반응성을 증진시키는 것까지 연장될 수 있다. 또한, 다양한 제조업자로부터의 제품을 사용할 때에 더 큰 확실성 및 안전역을 제공하는 독소 효능 검정의 표준화 방법이 제공된다.
본 명세서에서 사용된 것으로 용어 "치료학적 메탈로펩티다제"는 부분적이거나 완전한 활성을 위해서 금속 이온을 필요로 하는, 치료학적 목적을 위해서 투여된 펩티다제를 나타낸다. 예로는 아연 의존적 메탈로프로테아제 신경독인 보툴리눔 독소 및 파상풍 독소가 포함되며, 이들은 둘 다 신경전달물질 방출을 억제한다.
본 명세서에서 사용된 것으로 용어 "클로스트리디움 독소"는 클로스트리디움 테타니 (Clostridium tetani), 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium botulinum), 클로스트리디움 부티리쿰 (Clostridium butyricum) 및 클로스트리디움 베라티 (Clostridium beratti)를 포함하는 (단, 이들로 제한되지 않는다)클로스트리디움 종에 의해서 천연적으로 생산된 아연 메탈로프로테아제 신경독뿐만 아니라 그 밖의 다른 미생물 속 및 종에서 재조합적으로 만들어진 클로스트리디움 신경독을 나타낸다. 용어 "보툴리눔 독소"는 클로스트리디움 종에 의해서 천연적으로 생산된 것이든지 재조합적으로 생산된 것이든지 보툴리눔 독소 혈청형 A, B, C, E, F 및 G, 및 이들의 서브타입을 나타낸다. 또한 "보툴리눔 독소"로는 클로스트리디움 종으로부터 분리된 것이든지 재조합적으로 생성된 것이든지 분리된 보툴리눔 독소 쇄 (증쇄 또는 경쇄)가 포함된다. 용어 "보툴리눔 독소"는 또한, 신규의 재조합 키메라 (recombinant chimeras)를 포함한다. 예를 들어, 신규의 재조합 키메라는 BoNT-A와 E 사이에서 생성되었으며, 이들 형태 중의 특정한 것은 천연 형태에 비해 증진된 활성을 갖는다 [참조: 예를 들어, Wang, J. et al. "Novel chimeras of botulinum neurotoxins A and E unveil contributions from the binding, translocation, and protease domains to their functional characteristics" J. Biol . Chem . 283 (2008) 16993-17002].
본 명세서에서 사용된 것으로 용어 "독소 주사"는 치료학적 효과가 바람직한 부위에서 독소를 도입시키는 것을 나타내며, 또한 국소적인 독소 적용, 전신적으로 투여된 독소의 부위-지시된 방출, 또는 나노시스템 (nanosystem) 전달 비히클을 포함한 (단, 이들로 제한되지 않는다) 그 밖의 다른 독소 전달 시스템의 개념을 포함하여야 한다.
보툴리눔 독소는 독소 타입들 사이에서 높은 정도의 아미노산 서열 상동성을 갖는 약 150 kDa 중량의 비교적 불활성인 단일 폴리펩타이드 쇄로서 클로스트리디움 박테리아에서 천연적으로 생산된다. 단일 폴리펩타이드는 이어서 대략 100 kDa 중쇄 (HC) 및 50 kDa 경쇄 (LC)로 분해된다. HC 및 LC 쇄는 마지막으로 디설파이드 결합에 의해서 함께 결합되어 헤테로다이머를 형성한다. 보툴리눔 독소 HC는 신경근 활성에 포함된 뉴론에 대한 독소 결합 및 그 뉴론 내로의 전좌에 책임이 있다. 일단 뉴론 내에서 독소 LC 부위는 신경근 접합부에서 아세틸콜린의 방출에 연루되는 다양한 SNARE (가용성 N-에틸말레이미드-민감성 인자 부착 단백질 수용체) 단백질을 단백분해적으로 분해시킴으로써 신경전달물질 방출을 억제하여 뉴론 자극에 대한 반응으로 근육 수축을 억제한다. LC 단백분해적 활성은 LC의 N-말단에 위치하며, 아연-의존적 엔도펩티다제로 작용한다.
신경근 접합부에서, BoNT 작용의 기전은 3 개의 단계, 즉 결합, 내재화 (internalization), 및 다양한 SNARE 단백질의 불활성화를 통한 신경전달물질 방출의 억제를 포함한다. 3 개의 SNARE 단백질인 신택신 (syntaxin) 1, SNAP-25 및 시냅토브레빈 (synaptobrevin) (소포-결합된 막단백질 또는 VAMP로도 알려짐)은 함께 시냅스 소포를 전시냅스 막에 도킹시키는 작용을 하는 준안정성 (metastable) "트랜스" SNARE 컴플렉스를 형성한다.
LC 엔도펩티다제의 SNARE 단백질 표적은 특정의 BoNT 혈청형들 사이에서 상이하다. SNAP-25는 신경전달물질 함유 소포의 융합에 필요한 시냅토좀-결합된 전시냅스 막단백질이며, BoNT-A 및 E에 대한 표적이다. VAMP는 BoNTs B, D, F 및 G에 대한 표적이다. BoNT-Cl에 대한 단백분해적 표적은 신택신 막단백질이다.
파상풍 신경독 (TeNT)은 또한, 클로스트리디움 속의 박테리아에 의해서 생산되며, BoNT와 마찬가지로 3 개의 영역으로 구성된 150 kDa 단백질이다. 그러나, 운동 뉴론 전시냅스 막에 결합한 후에 TeNT는 내재화되고 척수 쪽으로 액손후방 (retroaxonally)으로 수송된다. 그 후, 이것은 운동 뉴론 세포체 밖으로 배출되고, 전-시냅스 신경 말단에 의해서 내재화되고, 여기에서 이것은 VAMP/시냅토브레빈을 분해시킴으로써 억제성 전달물질 글리신의 방출을 방지하는 작용을 한다. 운동 뉴론 상으로의 시냅스 전달은 주로 억제성이다. 그에 의해서, 이 억제의 방지는 영향을 받은 운동 뉴론의 활동항진을 야기하며, 따라서 자극된 근육의 통제되지 않는 수축 (테타니 (tetany))에 의해 경련성 마비를 야기한다. 아직 임상적으로 이용할 수는 없지만, TeNT는 CNS의 신경학적 상태의 치료에 잠재적으로 유용한 것으로 제안되었다.
이전에 언급한 바와 같이, 클로스트리디움 신경독은 아연 의존성 메탈로프로테아제이다. 활성인 경우에, BoNT는 분자당 1 개의 Zn2 + (2가 양이온 아연)를 함유한다. 아연은 세포 내로 들어가기 전 또는 후에 보툴리눔 독소 LC에 결합할 수 있지만, 엔도펩티다제 활성에 결정적이다. 검정관내 검정은 독소 부위로부터 아연의 자연적인 상실이 비교적 느리지만 용액 중에서 더 긴 시간에 의해서 증가될 수 있음을 나타내었다. 결합된 아연의 상실에 의해서 엔도펩티다제가 불활성으로 되면, 외인성 아연의 첨가가 독소를 재활성화시킬 수 있다.
메탈로프로테아제 신경독의 활성에 필요한 금속 이온의 적절한 레벨을 제공하기 위한 식이성 보충. 1960년대 초까지, 인간에게서 아연 결핍은 일어나지 않았다고 믿어졌다. 그 이후에 아연은 필수 미량원소이며, 아연 결핍이 흔한 것으로 결정되었다. 아연은 비교적 최근에, 수백 개의 효소의 촉매적 활성에 필요한 것으로 확인되었으며, 세포는 Zn2 + 이용가능성을 위한 치밀한 조절기구를 가지며, 이것은 세포 대사에서의 그의 중요성을 시사한다. 세포내 아연 (Zn2 +)은 필요한 경우에 Zn2 +을 격리하고 방출함으로써 유리 Zn2 +의 농도를 조절하는 작용을 하는 단백질의 메탈로티오네인-1 (MT-1) 패밀리과 같은 아연 결합 단백질과 항상성을 유지한다. 그러나, Zn2 +의 결합 및 방출의 동력학, Zn2+의 세포 분포, 및 Zn2 +의 항상성 조절은 잘 이해되지 않는다.
임상적으로 관련된 아연 결핍은 성장 지연, 식욕의 상실, 및 손상된 면역기능뿐만 아니라 체중 감소, 창상 치유의 지연, 미각 이상 및 정신적 기면 (mental lethargy)을 야기한다. 저개발국에서 주로 발견되는 심한 경우에, 아연 결핍은 두발 상실, 설사, 성적 성숙의 지연, 발기부전, 남성에서의 성기능저하, 및 눈 및 피부 병변을 야기한다. 공공연한 아연 결핍은 개발국에서는 드물지만, 아연 결핍은 시리얼이 식이의 거의 대부분을 차지하는 개발도상국에서는 흔하다.
개발도상국에서 공공연한 증상을 갖는 환자의 연구를 기초로 하여, 시리얼 내의 피테이트는 아연, 철 및 그 밖의 다른 2가 양이온의 흡수를 현저하게 억제하는 것으로 밝혀졌다. 대부분 이노시톨 헥사포스페이트 및 펜타포스페이트인 피테이트는 전곡 빵 및 섬유, 통밀 제품, 시리얼, 대두, 귀리, 콩과 식물 (땅콩 및 완두콩을 포함), 옥수수, 쌀, 및 섬유질이 풍부한 것으로 제시된 다수의 식품 제품에서 풍로딩게 발견된다. 이들 카보사이클릭 폴리올의 포스페이트 그룹은 아연과 강력하고 불용성인 컴플렉스를 형성하며, 그의 흡수를 억제한다.
준임상적 아연 결핍은 검출하기가 어렵다. 아연 영양적 상태의 실험실 측정은 다양한 메탈로단백질 및 그 밖의 다른 아연 결합 단백질뿐만 아니라 핵산의 성분으로서의 신체 전체에 걸친 그의 분포로 인하여 어렵다. 신체 내의 아연의 레벨의 측정은 어려우며, 아연의 혈청 또는 혈장 레벨 및 뇨배설의 속도는 세포내 또는 조직 아연 레벨과 잘 연관되지 않는다 [참조: Maret W, Sandstead HH. "Zinc requirements and the risks and benefits of zinc supplementation." J Trace Elem Med Biol 20 (2006) 3-18]. 더구나, 아연 결핍의 임상적 효과는 비정상적인 실험실 소견의 부재 하에서 나타날 수 있다. 따라서, 아연 결핍의 임상적 평가를 위해서는 부적절한 칼로리 섭취, 알콜 중독 및 소화성 질병과 같은 위험 인자 (표 1)가 아연 보충에 대한 필요성을 측정하는 경우의 아연 결핍의 증상과 함께 고려된다.
전문화된 아연 저장 시스템의 결여로 인하여 아연을 매일 경구적 섭취하는 것이 정상 상태 레벨을 유지하는데 필요하다. 식이성 아연은 대부분 소장을 통해서 흡수된다. 높은 함량의 흡수가능한 아연을 갖는 식품의 증가된 소비가 공공연한 아연 결핍에 대한 치료약일 수 있다. 1일 아연 상실은 건강한 성인 남성의 경우에 대략 0.63 ㎎/일이고 건강한 성인 여성의 경우에 0.44 ㎎/일 정도인 것으로 계산되었다. 미국에서의 조사는 미국에서 아연의 평균 섭취가 성인 남성에게서 14 ㎎/일이고 성인 여성에게서 9 ㎎/일인 것을 나타내었다. 경구적 아연을 위한 1일 권장량은 성인 (임신 또는 수유 상태가 아닌) 여성의 경우에 8 ㎎/일이고, 성인 남성의 경우에는 11 ㎎/일이다. 대조적으로, 아연에 대한 1일 값 (Daily Value; DV)은 1일에 15 ㎎이다. DVs는 소비자가 총 식이의 맥락에서 제품의 영양소 함량을 비교하는 것을 돕기 위해서 미국 식품의약국에 의해서 개발되었다. 아연에 대한 DV는 성인 및 4 세 또는 그 이상의 소아의 경우에 15 ㎎이다. 아연에 대한 상한섭취량 (UL)은 USDA에 의해서 40 ㎎/일로 설정되었다. 위장 장애가 연장된 기간에 걸친 50 내지 150 ㎎/일의 용량에서 보고되었다. 아연의 구토 용량은 225 내지 450 ㎎인 것으로 추정되었다. 중요하게는, 단지 0.26 그램의 피테이트가 50 ㎎까지의 경구적 아연의 흡수를 억제할 수 있으며, 의학적 감독하에서 환자에게 200 ㎎/일의 과량으로 아연 보충물을 제공할 수 있다.
아연은 식품의 단백질 함량과 상당히 상관관계가 있지만, 단백질 풍부 식물 식품보다 동물 단백질에서 더 이용될 수 있다. 예를 들어, 비록 칠면조 (140 그램이 4.34 ㎎의 아연을 함유한다) 및 닭 (140 그램이 2.88 ㎎의 아연을 함유한다)이 아연의 합리적으로 우수한 공급원이지만, 120 그램 조각의 두부는 단지 0.77 ㎎의 아연을 함유한다. 동물 단백질에서 아연의 함량은 광범하게 변한다. 예를 들어, 6 개의 중간 굴은 77 ㎎의 아연 또는 RDA의 500% 이상을 제공한다. 대조적으로, 3 온스의 소고기 사태 (shank)는 8.9 ㎎의 아연을 제공한다.
덜 잘 흡수된 무기 형태를 갖거나 아연을 이용불가능하게 만드는 피테이트와 함께 조합한 아연 보충물을 복용하는 사람을 포함하는 다수의 개체는 준임상적 아연 결핍에 대한 위험이 있다. 본 발명자는 놀랍게도, 비교적 많은 양의 잘 흡수된 형태의 아연의 선행 투여가 이전에는 열등하게 반응성이었던 개체에서 보툴리눔 독소에 대한 반응성이 이루어지도록 할 수 있음을 발견하였다. 따라서 명백하게, 이러한 개체는 이전에 보툴리눔 독소 LC 아연 의존성 엔도펩티다제의 결합 및 활성화에 이용할 수 있는 아연이 기능적으로 결핍되었을 것 같았다. 그러나, 이들 개체 중의 누구도 아연 부족의 명백한 징후를 나타내지 않았다.
아연 부족은 보툴리눔 독소의 효과에 대한 최대 반응성과 연관되기 때문에 아연 부족에 대한 위험이 증가된 개체는 잠재적으로 큰 백분율의 환자 집단을 포함한다 (참조 표 1). 본 발명과 관련하여 아연 부족에 대한 잠재적으로 증가된 위험을 갖는 사람은 전곡 빵 및 섬유, 통밀 제품, 시리얼, 대두, 귀리, 콩과 식물 (땅콩 및 완두콩을 포함), 콩, 옥수수 및 쌀에서 발견되는 피테이트 (피트산의 염)가 풍부한 식이를 먹는 사람을 포함한다. 또한, 소고기, 칠면조, 닭 또는 굴이 적은 식이를 먹는 사람 (즉, 채식주의자), 또는 이들 고 아연 식품을 피트산 또는 포스페이트가 많은 식품 및 다른 화합물을 포함하여 아연을 이용할 수 없도록 만드는 식품 및 화합물과 함께 소비하는 개체이다.
다수의 식품 및 음료는 포스페이트 또는 피트산을 보존제로서 함유한다. 피트산 (C6H6(OPO(OH)2)6의 화학식을 갖는 미오-이노시톨-1,2,3,4,5,6-헥사키스포스페이트)은 겨 및 종자를 포함한 다수의 식물 조직에서 인의 주된 저장 형태이다. 피트산은 매우 반응성이며, Ca2 +, Fe2 +, Mg2 +, Mn2 +, Cu2 + 및 Zn2 +과 같은 광물뿐만 아니라 탄수화물 및 단백질과 컴플렉스를 쉽게 형성한다. 2가 양이온을 킬레이트화하는 능력으로 인하여 피트산은 화합물들 중에서 경수를 처리하고, 와인으로부터 철 및 구리를 제거하고, 동물 및 식물 오일 중의 미량-금속 오염물을 불활성화시키기 위해서 사용된다. 보존제 E391이 피트산이다.
본 명세서에서 사용된 것으로 용어 "아연 보충물"은 고체, 겔, 리포좀 및 액체 형태를 포함하는 경구 투여를 위한 무기 또는 유기 아연의 하나 또는 그 이상의 형태 또는 이들의 조합물을 의미한다. 용어 무기 아연은 2가 양이온 Zn2 + 및 아연이 무기 염류를 의미한다. 그의 비제한적 예로는 염화아연 (ZnCl2), 4염기성 염화아연 (Zn5Cl2(OH)8), 산화아연 (ZnO), 황산아연 (ZnS04), 및 4염기성 염화아연 (Zn5Cl2(OH)8)이 포함된다. 원소 아연의 백분율은 이들 형태에서 다양하다. 예를 들어, 황산아연의 약 23%는 원소 아연으로 구성된다. 따라서, 220 ㎎의 황산아연은 50 ㎎의 원소 아연을 함유한다.
본 명세서에서 사용된 것으로 용어 "유기 아연"은 유기 아연 컴플렉스뿐만 아니라 아연 프로테이네이트, 아연 킬레이트 및 유기 분자 및 화합물과의 염, 및 아연 히스티딘, 아연 메티오닌 (ZnMet), 아연 리신 (ZnLys) 컴플렉스 등을 포함한 아연 아미노산 컴플렉스를 나타낸다. 추가의 비제한적 예로는 아연 아세테이트 (Zn(02CCH3)2), 아연 아스코르베이트 (C12H14Zn012), 아연 아스파르테이트 (C8H10N208Zn2H), 아연 부티레이트 (Zn(C4H702)), 탄산아연 (ZnC03), 아연 시트레이트 (Zn3(C6H5O7)2), 아연 글루코네이트 (Zn(C12H22014)), 아연 글리시네이트 (C4H8N204Zn), 아연 히스티디네이트 (C12H16N604Zn), 아연 케토글루타레이트 (C5H405Zn), 아연 락테이트 (Zn(C3H503)2), 아연 말레이트 (C4H405Zn), 아연 피콜리네이트 (C12H8N204Zn), 아연 프로파노에이트 (C6H1004Zn), 아연 스테아레이트 (C36H7004Zn), 및 아연 석시네이트 (C4H404Zn)가 포함된다. 무기 아연염과 마찬가지로, 이들 형태에서 원소 아연의 백분율은 다양하다. 예를 들어, 아연 아르기네이트의 경우에 300 ㎎은 30 ㎎의 원소 아연을 공급한다.
산화아연 및 탄산아연과 같은 아연의 특정한 형태는 본질적으로 수용액 중에서 불용성이며, 일반적으로 열등하게 흡수되는 것으로 생각되었다. 황산아연 및 아연 아세테이트의 쉽게 흡수된 형태로 50 ㎎의 아연을 단일 용량 투여하는 것은 성인에게서 오심 및 구토를 유도하는 반면에, 동일 용량의 산화아연은 아마도 흡수에 있어서의 차이에 근거하여 단지 작은 백분율의 개체에서 이러한 증상을 야기한다 [참조: Allen LH. "Zinc and Micronutrient Supplements For Children" Am J Clin Nutr 68(Suppl) (1998) 4955]. 따라서, 본 발명의 목적에 따른 식이성 아연의 적절한 투약량을 고려하는 것은 흡수의 상대적 비율을 고려하는 것을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 것으로 용어 "피타제"는 피트산 및 그의 염 (피테이트)로부터 인의 방출을 촉진시킬 수 있는 하이드롤라제 효소를 나타낸다. 피타제는 식물 공급원, 일반적으로 발아 종자, 및 미생물을 포함하는 다수의 공급원으로부터 이용할 수 있다. 피타제는 바실루스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 및 슈도모나스 (Pseudomonas) 종과 같은 박테리아뿐만 아니라 효모 및 사상 진균으로부터 유도되는 것으로 기술되었다. 그 중에서도 특히 아스퍼질러스 니게르 (Aspergillus niger)로부터 피타제 유전자의 클로닝 및 발현이 기술되었다 [참조: EP0420358]. 피타제는 이들의 작용의 위치 특이성에 따라 상이한 타입의 피트산 분자로 분류된다. 따라서, 예를 들어, 3-피타제 (미오-이노시톨 헥사포스페이트 3-포스포하이드롤라제, EC 3.1.3.8)는 우선 3-위치에서 에스테르 결합을 가수분해시킨다. 6-피타제 (미오이노시톨 헥사포스페이트 6-포스포하이드롤라제, EC 3.1.3.26)은 우선 6-위치에서 에스테르 결합을 가수분해시킨다. 비록 예외는 있지만, 식물 피타제는 일반적으로 6-피타제이다. 미생물 피타제는 주로 3-피타제이다.
빈번한 장기간의 알콜 소비는 손상된 아연 흡수 및 증가된 뇨배설과 연관된다. 기능적 아연 결핍에 대한 그 밖의 다른 잠재적 위험 인자에는 철, 비타민 A, 구리 및 칼슘 보충물을 포함하는 아연 흡수를 저해하는 보충물을 복용하고; 카제인을 함유하는 유제품을 빈번하게 소비하며; 감염, 화상이 있거나, 또는 최근에 수술을 받았고; 어떤 만성 질병이 있으며; 빈번한 설사 또는 어떤 흡수불량 증후군이 있고/있거나 25 세 이하 또는 70 세 이상인 사람이 포함된다.
본 상황에서 기능적 아연 결핍에 대한 위험 인자가 너무 통상적이라는 점을 감안하면, 충분한 아연이 보툴리눔 독소에 대한 결합 및 그의 활성화에 이용될 수 있도록 보장하는 가장 편리한 방법 중의 하나는 보툴리눔 독소의 투여의 전에, 그와 동시에, 또는 잠시 후에 경구용 보충물을 투여함으로써 아연 비축물을 증가시키는 것이다. 본 발명의 한가지 관점에서는, 경구용 보충물 및 이들의 사용 설명서가 제공된다. 한가지 구체예에서, 경구용 보충물은 매일 10 내지 400 ㎎의 원소 아연을 제공하는데 충분한 아연을 포함한다. 투여된 아연의 양은 선택된 아연의 형태의 상대적 흡수에 따라 변화하며, 잘 흡수되는 형태는 구토 효과를 피하기 위해서 더 작은 양으로 제공된다. 10 ㎎의 레벨의 아연이 본질적으로 아연의 RDA 레벨이다. 특히, 10 내지 400 ㎎의 원소 아연의 하한에서, 섭취된 아연의 피트산 킬레이트화를 방지하기 위해서 바람직하게는 0.8 내지 10,000 유니트의 레벨의 피타제의 공동투여를 아연 섭취의 시점에 (즉, 몇 시간 이내에) 제공한다. 한가지 구체예에서, 피타제는 각각의 아연 섭취와 함께 섭취하도록 제공될 뿐만 아니라 모든 식이성 공급원으로부터 아연의 이용가능성을 최대화하도록 추가의 피타제 보충물이 매 식사와 함께 섭취된다. 한가지 구체예에서는, 0.8-10,000 유니트의 피타제와 함께 매일 30-100 ㎎의 원소 아연을 공급하는 높은 아연 로딩 용량이 제공된다.
투여된 메탈로프로테아제의 효과를 증가시키기 위한 그 밖의 다른 공동-준비 방법: 본 발명자는 보툴리눔 독소에 대한 반응성이 독소의 투여 전의 아연 로딩의 기간에 의해서 극적으로 개선될 수 있음을 입증하였다. 이러한 발견은 정상적인 서양식 식사를 하며 아연 부족의 겉보기 증거가 없는 사람에게서조차도, 이용가능한 아연은 이것이 적어도 활성에 관해서 아연 의존적인 외인성으로 첨가된 메탈로프로테아제의 활성과 연관되기 때문에 제한됨을 시사한다. 한가지 구체예에서, 아연은 클로스트리디움 신경독으로 치료될 조직에 국소적으로 투여된다. 한가지 관점에서, 아연 용액은 대략 독소 주사 시점에, 즉 독소 주사 또는 독소 국소 투여의 전, 중 및/또는 후에 독소 주사를 위한 부위에 주사한다. 다른 관점에서, 아연은 대략 독소 주사 시점에, 즉 독소 주사의 전, 중 및/또는 후에 독소 주사를 위한 부위에 국소적으로 적용된다. 다른 관점에서, 아연은 나노전달 시스템을 사용함으로써 투여된다. 다른 관점에서, 아연은 리포좀 현탁액 또는 나노전달 시스템을 포함하는 모든 형태의 설하 투여, 비내 스프레이, 점안제, 관장제, "강제 통풍 (forced air)", 경피적, 또는 직장 투여를 통해서 투여된다. 추가의 관점에서, 아연 용액은 치료학적 독소를 재구성하기 위해서 사용될 수 있다. 더 큰 영역 또는 접근하기 어려운 영역을 치료하고자 하는 경우에, 또는 아연 요법을 더 정확하게 투약하기 위해서는 정맥내 또는 근육내 주사에 의한 아연 로딩이 대신으로 사용될 수 있다.
클로스트리디움 신경독 재구성 용액: 검정관내에서 에틸렌디아민테트라아세테이트 (EDTA)와 같은 가용성 킬레이터에 의해 치환시킴으로써 경쇄 (LC)로부터 Zn2 +을 제거하는 것은 무세포 또는 파괴된 세포 제제에서 효소적 활성을 완전히 폐지시킨다. 그러나, 그의 결합된 아연을 제거한 독소는 온전한 신경근 접합부에 대한 활성을 유지할 수 있는데, 이는 아마도 내재화된 독소가 이용가능한 사이토졸성 Zn2 +를 결합시킬 수 있기 때문이다 [참조: Simpson LL, et al. "The Role of Zinc Binding in the Biological Activity of Botulinum Toxin" J Biol Chem 276 (29) (2001) 27034-41]. 비록 킬레이터로 전처리된 조직은 아연을 제거한 독소에 대한 활성을 회복하는 그의 능력을 상실하지만, 조직에 대한 몰과량의 Zn2 + (20 μM)의 첨가는 아연 고갈된 독소의 활성을 빠르게 회복시킬 수 있다. (Id).
연구는 아연이 보툴리눔 독소의 동결건조시에 동결방지 또는 동결허용 효과를 제공하지 않음을 나타내었다 [참조: Allergan 특허출원 제10/976,529호 (US 2005/0214326으로 공개됨) 및 PCT/US2006/038913 (WO 2007/041664로 공개됨)]. US 2005/0214326으로 공개된 Allergan 미국 특허출원 제10/976,529호에서는 동결건조 용액에 대한 아연의 첨가가 약간 증가된 효력 및 증진된 항미생물 활성을 제공한다고 주장되었다. 그러나, 추가의 독립적인 연구는 BoNT-A의 LC가 정제 및 저장 중에 자가촉매적 단편화 (fragmentation)를 겪으며, 이 단편화는 염화아연뿐만 아니라 2가 금속의 다른 클로라이드에 의해서 증진되는 것을 나타내었다. 이것을 기초로 하여, 일부는 독소가 어떤 금속도 없는 중성 또는 더 높은 pH의 저농도에서 동결되어 저장될 것을 권고하였다 [Ahmed SA, et al. "Factors Affecting Autocatalysis of Botulinum A Neurotoxin Light Chain" Protein J. 23 (7) (2004) 445-51].
여하튼, 현재 상업적으로 이용할 수 있는 BoNT 약제학적 조성물은 동결건조 전에 또는 재구성 용액에 대한 첨가제로서 첨가된 Zn2 +이 없다. 예를 들어, Allergan, Inc. (Irvine, CA)로부터 입수할 수 있는 보톡스 (BOTOX®) 상표의 BoNT-A는 활성 고분자량 독소 단백질 및 결합된 헤마글루티닌 단백질로 구성된 결정성 컴플렉스로의 일련의 산 침전에 의해서 배양액으로부터 정제된 정제된 BoNT-A로 구성된다. 결정성 컴플렉스를 식염수 및 인간 혈청 알부민 (HSA)을 함유하는 용액에 재-용해시키고, 진공-건조시키기 전에 멸균 여과한다 (0.2 미크론). 보톡스는 근육내 주사하기 전에 멸균된 무-보존제 0.9% 염화나트륨 (식염수)로 재구성한다. 그 밖의 다른 상업적으로 이용할 수 있는 BoNT 약제학적 조성물에는 HSA 및 락토즈와 함께 분말로 건조되고, 사용하기 전에 식염수로 재구성되는 디스포트 (Dysport®) (Ipsen Ltd., Berkshire, U.K.) 상표의 BoNT-A 헤마글루티닌 컴플렉스가 포함된다. 마이아블록 (MyoBloc®) 상표의 BoNT-B는 약 pH 5.6에서 0.05% HSA, O.O1 M 나트륨 석시네이트, 및 O.1 M 염화나트륨 중의 헤마글루티닌 및 비헤마글루티닌 단백질과의 컴플렉스인 5,000 U의 보툴리눔 독소 타입 B의 주사용 용액의 단일 사용 바이알로 제공된다. 따라서, BoNT의 활성은 어떤 아연이라도 정제 및 저장 과정을 통해서 분자에 결합된 채로 유지되는 것뿐만 아니라 활성을 위한 숙주 조직 내의 Zn2 +에 의존하여야 한다.
여기에서 제시된 결과는 검정한 대부분의 개체에서 치료 전의 아연 로딩이 개선된 - 때때로 극적으로 개선된 - 효과 및 치료 효과의 지속기간을 제공하였음을 나타낸다. 이것은 독소 분자에 결합된 Zn2 +이 최대 활성을 위해서는 불충분하였음을 나타내며, 또한 정상 개체의 조직은 분자에 결합된 충분한 Zn2 +가 결여된 것을 보상하는 충분히 이용가능한 Zn2 +를 결여함을 나타낸다. 따라서, 여기에 제시된 한가지 구체예에서는 독소 결합된 아연 또는 조직 체류하는 이용가능한 아연에 있어서의 모든 결핍을 극복함으로써 주사한 독소의 최대 반응성이 가능하도록 충분한 Zn2 +를 포함하는 BoNT 재구성 용액이 제공된다. 본 발명에 기술된 소견을 감안하여, 전달을 위한 재구성 용액 내에 제공될 Zn2 +의 이상적인 레벨은 경험적으로 결정될 수 있다. 한가지 구체예에서는, 마우스 신경독 효력검정을 이용하여 전달 용액에 첨가될 아연의 레벨 및 형태를 결정한다. 한가지 구체예에서는, 마우스에게 전달 제제에서 제공될 Zn2 +의 바람직한 레벨을 검정하기 전에 청소기간 동안 아연 결핍성 식이를 제공한다. 마우스를 검정하기 전에 비교적 아연 결핍성인 상태로 둠으로써, 전달 용액 내에 존재하는 Zn2 +의 기여를 독립시킬 수 있다. 본 발명의 한가지 구체예에서는, BoNT를 첨가된 Zn2 +이 없이 동결건조시키고, 최대 활성을 위해서 충분한 첨가된 Zn2+를 함유하는 재구성 용액을 제공한다. 한가지 구체예에서, Zn2 +은 재구성 용액 중에 10-400 μM의 농도로 존재한다.
한가지 구체예에서는, 등장성 식염수, 즉 (보존되거나 보존되지 않은) 멸균 수용액 중의 약 0.9% 또는 0.155 M NaCl을 포함하며, 추가로 약 10 내지 약 50 μM 또는 약 0.000065 g 내지 약 0.00032 g/lOO ㎖의 원소 아연의 농도로 원소 Zn2 +을 포함하는 재구성 용액이 제공된다. 원소 아연의 이러한 양은 예를 들어, ZnCl2에 의해서 약 0.000136 g 내지 약 0.00068 g/lOO ㎖로 제공될 수 있다.
클로스트리디움 신경독 효력검정: 현재 인정된 보툴리눔 독소에 대한 바이알당 효력의 검정방법은 복강내 마우스 치사량 (MLD50) 검정이다. 효력은 재구성 후의 보툴리눔 독소의 회수된 효력 또는 동결건조 전의 보툴리눔 독소의 효력을 나타낼 수 있다. 보툴리눔 독소의 1 유니트 (U)는 복강내 주사하면 검정을 시작할 때 각각 체중이 17-22 그램인 암컷 스위스 웨버 (Swiss Weber) 마우스의 그룹의 50%를 치사시키는 보툴리눔 독소의 양으로 정의된다. 검정방법의 추가의 상세한 내용은 WO 2007/041664로 공개되고, 본 발명에 참고로 포함된 PCT/US2006/038913에 제공된다.
주사용 보툴리눔 독소 타입 A (BoNT/A) (01/2005:2113)에 대한 유럽 약전 (Ph Eur) 모노그래프 (monograph)는 타당화 (validation)를 조건으로 하여, 마우스 LD50 검정방법을 대체시키는 대체 비-치사성 및 생체외 방법의 사용을 뒷받침하였다 [Secardia, D. and Das, R.G. "Alternatives to the LD50 assay for botulinum toxin potency testing: Strategies and progress towards refinement, reduction and replacement" AATEX 14, Special Issue , 581-585. Proc . 6 th World Congress on Alternatives & Animal Use in the Life Sciences. August 21-25, 2007, Japan]. 제안된 대체 효력검정은 독소를 마우스의 좌측 서혜대퇴부에 피하 주사한 후에 나타나는 복부 융기 (abdominal bulging)를 BoNT/A의 활성과 연관시키는 마우스 이완성 (flaccid) 마비검정 (또한, 마우스 내장하수검정으로도 알려짐)을 포함한다. 마비의 크기는 용량-의존적이다. 단지 준치사량의 BoNT을 주사함으로써, 검정은 LD50 검정보다 10-배 더 민감성인 것으로 생각된다. 마비 종말점은 전신적 독성보다는 국소화된 근육 효과를 평가하기 때문에, 이것은 독소의 임상적 용도와 더 유사하다. 이완성 마비검정은 치사성 검정보다 더 빠르며, 전형적인 LD50 검정의 경우에 72 내지 96 시간인 것과 비교하여 24 내지 48 시간 이내에 결과를 제공한다.
대체 생체외 검정방법이 또한 제안되었으며, 절제된 신경/근육 제제의 전기적 자극에 대한 연축 (twitch) 반응의 크기를 측정한다. 독소의 효력은 연축 반응의 크기의 감소를 결정한다. 검정방법의 통상적인 종말점은 크기의 50% 감소가 관찰되는 시점이다. 생체외 모델은 2 시간 이내에 결과를 제공할 수 있다.
비록 LD50 검정방법이 그의 높은 민감성으로 인하여 유지되었지만, 검정방법은 표준화되지 않았으며, 라벨링에 사용된 유니트는 제품 특이적이고 상호교환할 수 없다. 표준화된 검정방법이 부재하는 것은 과량투여로부터의 극단적인 독성 및 느린 회수를 감안한 안전성 문제이다. 본 발명자는 아연의 경구 투여가 다른 식으로는 아연 결핍의 어떤 징후도 나타내지 않는 다수의 환자에게서 보툴리눔 반응성의 상당한 개선을 제공하는 것을 알아내었다. 이 주목할 만한 발견은 보툴리눔 독소 검정으로 연장되었으며, 검정 시스템에서의 최대 반응성을 제공한다. 한가지 관점에서, 표준화된 식이는 복강내 LD50 검정, 마우스 이완성 마비검정 또는 생체외 연축 반응검정을 수행하기 전의 시간 동안 마우스에게 제공된다.
전형적인 연구 등급의 설치류 사료는 14-20% 단백질 및 50 내지 70% 이상의 탄수화물을 포함한다. 사료 중의 최고 백분율의 성분은 피테이트를 많이 함유하거나 다른 식으로는 아연 흡수를 억제한다. 이들에는 카제인, 옥수수 전분, 대두분, 셀룰로즈가 포함되며, 추가로 옥수수 및/대두 오일이 포함될 수 있다. 광물 혼합물이 사료에 첨가되지만, 이것은 표준화되지 않았으며, 다양한 표준 먹이에서 10 배까지 변화할 수 있다.
보고된 다양한 연구에서, 먹이 ㎏당 25-55 ㎎의 아연을 함유하는 식이가 적절한 것으로 생각되었지만, ㎏당 < 1-5 ㎎의 아연을 함유하는 식이는 결핍된 것으로 생각되었다. 다른 보고에서, 아연값은 ppm (백만부당 부)으로 제시되었으며, 아연 결핍성 및 적절한 식이는 각각 1.5 및 70-75 ppm의 아연을 함유하였다. 10 ㎎/㎏의 아연을 함유하는 식이는 1차 단백질 공급원이 난백 또는 카제인인 경우에 적절할 수 있지만, 대두와 같은 고 피테이트 단백질 공급원이 사용되는 경우에는 적어도 20 ㎎/㎏이 필요할 수 있음을 주목하여야 한다. 마우스는 아연 독성에 대해서 비교적 저항성이며, 14 개월까지 동안에 물의 L당 500 ㎎의 Zn으로부터는 상당한 효과를 나타내지 않는 것으로 보고되었다.
동물에게서 동물 조직을 이용하여 클로스트리디움 신경독 효력검정을 표준화하는 방법의 한가지 구체예에서는, 효력 검정을 위해서 사용될 동물을 검정하기 전에 적어도 1 주일 동안 이용가능한 아연을 최대화하도록 디자인된 규정된 식이 하에 둔다. 한가지 구체예에서, 식이는 피테이트가 적고 아연이 많다. 저 피테이트 식이가 제공되는 한가지 구체예에서, 아연 레벨은 권장된 아연 레벨의 적어도 2-배 과량이다. 한가지 구체예에서는, 권장된 레벨의 적어도 2-배 과량의 아연 레벨 이외에 피타제가 식이에 첨가된다. 한가지 구체예에서, 규정된 식이는 효력 분석을 하기 전에 적어도 1 주일 동안 상이한 식이를 공급한 동물의 그룹에서 동일한 로트의 클로스트리디움 신경독의 효력을 비교함으로써 선택된다. 독소의 효과에 대한 최고의 민감성을 제공하는 식이가 미래의 모든 효력 검정을 위해서 필요한 규정된 식이로 선택되고 표준화된다.
이하의 실시예는 설명의 완전성을 위해서, 및 본 발명의 방법 및 조성물을 설명할 뿐만 아니라 조성물의 특정한 특징을 제시하기 위해서 포함된다. 이들 실시예는 어떤 식으로든 본 발명의 범위 또는 교시 내용을 제한하고자 하는 것이 아니다.
실시예 1: 식이성 아연 보충물에 의한 보툴리눔 독소 저항성의 반전
본 발명자는 개체에게서 이용가능한 세포내 아연 비축물의 차이가 일부의 환자에게서 보툴리눔 반응성의 결여를 설명할 수 있다는 것을 논리적으로 설명하였다. 상기 가설의 초기 탐구에서 아연 보충물은 식품 공급원에 의해서 제공되었다. 안전성, 작은 비용, 쉬운 이용성 및 일반적인 허용성을 근거로 칠면조가 생체이용가능한 Zn2 +의 식이성 공급원으로 선택되었다. 환자가 소비하도록 지시된 칠면조의 양은 40 ㎎의 1일 용량, 또는 권장된 1일 값의 약 2.5 배를 제공하도록 계산되었다. 다수의 이들 환자는 이들의 안검 경련 증상의 조절을 달성하기가 병력학적으로 어렵도록 보툴리눔 독소에 대해서 열등하게 반응성인 것으로 생각되었다. 결과는 아연 보충물이 보충물의 부재 하에서는 동일한 환자에게서 효과가 없었든 동일한 보툴리눔 독소 공급원 및 투약량을 사용하여 안검 경련의 현저하게 효과적인 치료를 제공하였음을 나타내었다.
상기 결과는 놀랍게도, 투여된 보툴리눔 독소의 효능을 감소시키는데 충분한 아연 결핍이 상당수의 환자에게서 나타남을 시사하였다. 명백한 저항성이 없는 이들 환자에게서조차도, 계획된 주사 이전의 시기 동안 경구 투여에 의해서 아연 레벨을 증가시키는 것은 모든 환자에게서 표준적인 (normalative) 이점을 제공하는 것으로 예상된다. 특히, 보툴리눔 독소 LC 엔도펩티다제의 결합 및 활성화에 이용할 수 있는 세포내 아연을 제공하는 아연 보충물을 투여함으로써, 최고의 가능한 Zn2 + 의존성 반응이 수득될 수 있다. 투여된 보툴리눔 독소에 대해서 이전에 무반응성이었던 다수의 환자에게서, 더 작은 용량이 신뢰할 수 있는 반응으로 투여될 수 있다. 보툴리눔 독소에 의한 치료 전에 일정 기간 동안 고 아연 함유 동물 단백질을 대량으로 먹는 것이 보툴리눔 독소 반응성을 표준화하고 증대시키는데 효과적일 수 있지만, 이 해결책은 불편하고, 표준화가 없으며, 결국은 대부분의 개체의 식이 선호도와 맞지 않는다.
따라서, 본 발명에서 제공된 진보의 한가지 관점에서는 아연 비축물의 바람직한 표준화 및 증대를 제공하는 경구용 아연 보충물이 투여된다. 본 발명의 한가지 관점에서는, 무기 및/또는 유기 아연의 하나 또는 그 이상의 형태가 정제 또는 캅셀 형태로 제제화된다. 한가지 관점에서, 경구 소비를 위한 아연의 투약량은 1일에 약 10 내지 400 ㎎의 범위의 원소 아연이다. 다른 구체예에서, 아연의 투약량은 1일에 약 30 내지 50 ㎎의 범위의 원소 아연이다. 한가지 구체예에서, 아연의 투약량은 1일에 약 50 ㎎의 원소 아연이다. 본 발명의 한가지 구체예에서는, 아연 보충물 및 보충물을 복용하는 설명서를 포함하는 용량 팩 (dose pack)이 계획된 절차 전에 환자에게 제공된다. 설명서에 제공된 바와 같이, 환자는 보툴리눔 독소의 투여하기 며칠 전에 아연 보충을 시작하도록 지시된다. 한가지 구체예에서, 환자는 독소 치료 이전의 3 내지 4일 동안뿐만 아니라 치료일에도 아연 보충을 증가시키도록 지시된다. 한가지 관점에서, 설명서는 아연 로딩 기간 중에 피테이트가 많은 식품을 피하도록 지시한다.
실시예 2: 피타제 투여에 의한 아연의 증가된 흡수를 포함하는 아연 보충
아연 흡수를 억제하는데 있어서의 피테이트의 역할을 감안하여, 본 발명의 한가지 관점에서는 피트산 (이노시톨 헥사키스포스페이트)을 가수분해시키고, 아연 흡수를 개선하는 피타제의 경구 투여에 의해서 경구적 아연 흡수를 증가시킨다. 피타제는 현재 칼슘, 마그네슘, 철 및 아연과 같은 2가 양이온의 흡수를 증가시키도록 디자인된 식이성 보충물로서 기능성식품 (nutriceutical) 시장에서 이용할 수 있다. 이들 2가 양이온은 옥수수, 옥수수 부산물, 콩과 식물, 대두 및 시리얼 그레인 (cereal grains)과 같은 식물 식품에 존재하는 식물 피트산과 불용성 컴플렉스를 형성하여 이들을 이용할 수 없게 만든다. 피타제는 피트산 (이노시톨 헥사키스포스페이트)으로부터 이용할 수 있는 포스페이트를 만들 목적으로 동물 사료에 대한 첨가제로 사용된다. 동물 사료에 대한 피타제의 첨가는 저 피테이트 사료에서도 이점이 있는 것으로 기술되었다 [참조: 예를 들어, 아스퍼질러스 (Aspergillus)로부터의 피타제를 함유하는 저 피테이트 사료 조성물을 기술한 W09949740]. W09830681 (발명의 명칭: "Phytase Combinations")은 상이한 위치 특이성을 갖는 적어도 2 개의 피타제의 조합물이 피테이트 3가 인을 방출하는데 더 효율적임을 기술하였다.
시리얼로부터의 피타제 및 미생물 공급원으로부터의 피타제인 2 가지 타입의 식이성 피타제를 현재 이용할 수 있다. 미생물 공급원은 아스퍼질러스 니게르 (Aspergillus niger) (Finase®, Alko Ltd., Finland)와 같은 진균의 발효뿐만 아니라 박테리아 발효를 포함한다. 피타제 활성은 규정된 온도 및 pH에서 분당, 피트산으로부터 설정된 양의 무기 포스페이트를 유리시키는데 필요한 효소의 양을 측정하는 다수의 상이한 검정방법에 의해서 측정할 수 있다. 미생물 피타제는 더 넓은 범위의 pH 활성을 가지며, 밀 피타제에 비해 인간 검정에서 증가된 철 흡수를 제공하는 것으로 나타났다. 한가지 이러한 연구에서는, 20,000 피타제 유니트 (PU)가 철 흡수를 14 내지 26%만큼 증가시켰다 [참조: Sandberg A-S, et al. "Dietary Aspergillus niger Phytase Increase Iron Absorption in Humans" The Journal of Nutrition 126 (1996) 476]. 따라서, 한가지 관점에서는 하나 또는 그 이상의 형태의 아연 및 적어도 하나 미생물 피타제를 포함하는 식이성 보충물이 제공된다. 아연 및 피타제의 투여는 후에 투여되는 보툴리눔 독소에 대한 최대 반응성을 위해서 환자를 준비시킨다.
상기 언급한 바와 같이, 조합한 아연 및 피타제는 또한 보툴리눔 독소 LC 엔도펩티다제의 개선된 결합 및 활성화가 아니라 적용을 위한 전신 아연 레벨을 안전하고 효과적으로 빠르게 증가시키기 위해서 사용될 수 있다. 예를 들어, 창상 치유, 화상 회복, 면역 손상 및 남성 발기부전과 같은 상태를 포함하는 (단, 이들로 제한되지 않는다) 의학적 필요의 시점에 전신 아연 레벨을 증가시키는 것이 바람직할 수 있다.
고 아연 식품의 섭취에 의해서 제공된 식이성 아연 보충의 명백하게 양성인 결과를 더 검정할 뿐만 아니라 피타제의 첨가가 아연 흡수에 이익을 부여할지 여부를 검정하기 위해서, 위약과 비교하여 2 가지 상이한 보충물에 의한 검정 보충의 4일 기간 후에 환자에게서 보툴리눔 독소에 대한 반응성을 비교하는 추가의 실험을 개시하였다. 각각의 검정물질 및 위약은 식별이 없이 검정 피험자에게 다양하게 제공되었다. 따라서, 환자는 보충물의 성질에 대해서 알지 못하였다. 위약 (P)은 락툴로즈의 캅셀 형태였다. 2 개의 검정 제제는 아연 글루코네이트의 형태인 10 ㎎ 아연의 표준 RDA 용량인 Z10, 및 3,000 PHU의 피타제 (진균 아스퍼질러스 니게르 (Aspergillus niger )로부터 유도됨)와 함께 아연 시트레이트 형태의 아연 50 ㎎을 제공하는 비교적 고 아연 로딩 용량인 Z50p였다. 보툴리눔 독소에 대한 민감성의 2 가지 상이한 파라메터인 지속기간 (D) 및 효과 (E)를 기록하였다. 경험이 상이한 환자는 전형적으로 상이한 효과 지속기간을 경험하는 것을 나타내기 때문에, 지속기간은 환자의 "통상적인" 효과 지속기간으로부터의 증가 또는 감소율로 표현하였다. 일부의 환자의 경우에, 독소 치료는 전형적으로 1 개월, 다른 경우에는 3 개월 등을 지속한다. 따라서, 독소를 통상적으로 90일 동안 지속하고, 지속기간의 변화가 관찰되지 않은 환자를 0으로 점수를 매겼으며, 즉 통상의 지속기간으로부터의 변화가 없었다. 추가로 4 주일 (28일)의 독소 효과를 경험한 환자는 통상적인 것보다 31% 더 긴 효과를 나타내는 +0.31에 해당하는 비인 28/90의 증가된 지속기간을 갖는 것으로 계산된다. 역으로, -0.25와 같은 음성 효과는 통상적인 것보다 25% 더 짧은 효과에 해당한다. 효과 (E)는 개개 환자의 안락하며 바람직한 효과의 통상적인 지각으로부터의 일탈로 표현되었다. 예를 들어, 0 = 통상적인 효과로부터의 변화 없음, -1 = 통상적인 것보다 약간 덜 효과적임, -2 = 통상적인 것보다 상당히 덜 효과적임, +1 = 통상적인 것보다 약간 더 효과적임, +2 = 통상적인 것보다 상당히 더 효과적임, +3 = 해당 환자에 대해서 항상 달성된 최상의 효과이다. 정확성을 보장하기 위해서, 환자는 인지된 치료의 유효성의 규칙적인 로그 (logs)를 유지하였다.
44 명의 환자의 실험의 결과는 도 1에 표 형태로 제시된다. 이들 환자는 모두 이전에 치료되었으며, 보툴리눔 독소 반응성의 기록된 선행 병력을 가졌다. 환자들 중의 23 명은 치료하기 어려운 안검 경련 환자 (BH)인 것으로 생각되었으며, 즉 이것은 이들이 a) 세션 (session)당 > 50 유니트의 보톡스 상표의 BoNT-A 또는 또 다른 보툴리눔 독소 등가물을 일상적으로 필요로 하였으며; b) 맞춤화된 주사 용량 및 패턴으로부터의 최대화된 반응에도 불구하고 일상적으로 환자-보고된 최적하 결과를 가졌고; c) 주사 용량 및 패턴을 변화시키지 않았음에도 불구하고 치료에 따른 독소 효과의 어느 정도의 가변성을 보고하였음을 의미한다. 추가로 7 명의 환자는 BoNT-A 치료에 대해서 일관되게 응답한 안검 경련 환자였다 (BC). 4 명의 환자는 반안면 경련 (H) 환자였으며, 반면에 10 명의 환자는 주름살에 대한 화장적 치료를 받았다 (C). 투여된 3 가지 BoNT 타입은 도 1의 "T" 칼럼에서 ("B") BoNT-A (Botox®), ("M") BoNT-B (Myobloc®), 및 ("D") BoNT-A (Dysport®)로 나타내었다. 환자는 변형된 무작위, 이중-맹검, 위약-대조 교차 파일럿 (pilot) 검정으로 치료되었다.
치료 참가자는 제3자에 의해서 4 가지 치료 그룹 중의 하나로 불균등하게 무작위 배정되었으며, 치료 의사도 환자도 모두 제공된 전-주사 보충물에 대해서 알지 못하였다. 23 명 (52%, 그룹 A)은 Z50p 단독 (50 ㎎ 아연 시트레이트와 3,000 유니트 피타제)을 사용한 전-주사 보충을 수행하였고, 6 명 (14%, 그룹 B)은 교차 디자인으로 상이한 시간에 P (락툴로즈 위약) 및 Z50p 둘 다에 의한 전-주사 보충을 수행하였으며, 4 명 (9%, 그룹 C)은 교차 디자인으로 상이한 시간에 Z10 (10 ㎎ 아연 글루코네이트) 및 Z50p에 의한 전-주사 보충을 수행하였고, 11 명 (25%, 그룹 D)은 삼중 교차 디자인으로 별도의 시간에 P, Z10, 및 Z50p을 사용하는 의한 전-주사 보충에 의해서 연구를 수행하였다.
이제는 도 2를 참고로 하여, 환자에게서 독소의 효과의 지속기간 (D)에 관한, 치료학적 보툴리눔 독소의 투여 전에 4일 동안 아연, 및 아연과 피타제를 보충한 실험의 그래프에 의한 결과를 설명하는 그래프 (200)를 나타낸다. 도 2에서 수직축 (202)은 환자에게서 독소의 작용의 지속기간에 있어서의 변화의 백분율을 나타낸다. 수평축 (204)은 각각 다음을 투여하는 환자 집단을 나타내는 다양한 막대 (bars)를 나타낸다: 위약 (P) (206); 10 ㎎의 아연 글루코네이트 (ZlO) (210); 또는 50 ㎎의 아연 시트레이트와 함께 피타제 (Z50p) (214). 신뢰구간 막대 (208/212/216)는 평균으로부터의 95% 신뢰구간을 나타낸다. 도 1 및 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 위약 (P) (206) 또는 아연에 대한 RDA에 가까운 10 ㎎의 아연 글루코네이트 (Z10) (210)를 제공한 환자의 경우에 전-주사 보충에 의해 보툴리눔 독소 치료의 지속기간 (D)에 있어서의 통상적인 환자-특이적 치료 지속기간으로부터의 유의적인 (p > 0.05) 변화는 나타나지 않았다.
이제는 도 3을 참고로 하여, 독소 치료의 효능 (E)의 주관적으로 인지된 환자의 변화에 관한, 치료학적 보툴리눔 독소의 투여 전에 4일 동안 아연, 및 아연과 피타제를 보충한 실험의 그래프에 의한 결과를 설명하는 그래프 (300)를 나타낸다. 도 3에서 수직축 (302)은 환자에게서 독소의 효능 (E)에 있어서의 인지된 변화를 나타낸다. 수평축 (304)은 각각 다음을 투여하는 환자 집단을 나타내는 다양한 막대를 나타낸다: 위약 (P) (306); 10 ㎎의 아연 글루코네이트 (ZlO) (310); 또는 50 ㎎의 아연 시트레이트와 함께 피타제 (Z50p) (314). 신뢰구간 막대 (308/312/316)는 평균으로부터의 95% 신뢰구간을 나타낸다. 도 1 및 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 환자-특이적 표준 반응성으로부터의 효과 (E)의 유의적인 (p > 0.05) 변화는 위약 (P) (306) 또는 아연에 대한 RDA에 가까운 10 ㎎의 아연 글루코네이트 (Z10) (310)를 제공한 환자에게서 관찰되지 않았다.
대조적으로, 보툴리눔을 주사하기 전에 4일 동안 Z50p (아연 시트레이트 50 ㎎과 함께 3,000 유니트 피타제 보충물) (214)를 투여한 44 명 중의 41 명 (93%)의 환자에게서는 효과 지속기간 (D)에 있어서 23.6%의 환자-특이적 평균 증가가 관찰되었다 (p<0.05, 도 1 및 2 참조). 추가로, 보툴리눔을 주사하기 전에 4일 동안 Z50p (아연 시트레이트 50 ㎎과 함께 3,000 유니트 피타제 보충물) (314)를 투여한 44 명 중의 38 명 (86%)의 환자에게서는 보툴리눔 독소 치료의 효과 (E)가 상당히 증가된 것으로 확인되었다 (p < 0.05, 도 1 및 3 참조). 실질적으로 모든 환자는 지속기간 (D), 효과 (E), 또는 둘 다의 개선을 나타내었다. 대부분의 경우에, 지속기간 (D) 및 효과 (E)는 둘 다 현저하게 개선되었다. 실제로, 감소된 유익한 효과를 보고하였고 고 아연 로딩 및 피타제 (Z50p)를 투여한 3 명의 안검 경련 환자에게서는 명백한 독소 과잉 투여가 관찰되었으며, 이것은 이들이 그들의 눈을 감기 어렵게 만들었다. 따라서, 이들 3 명의 환자 중에서도 독소 효과의 증가가 있었다. 특히, 상기 결과는 환자가 치료 전에 아연 로딩된다면, 더 저용량의 BoNT를 다수의 환자에게서 이상적인 반응성으로 투여할 수 있음을 시사하였다 (이후의 경험도 이것을 나타내었다). 투여 전에 아연을 로딩시킴으로써, 최대 반응성이 환자 집단에 걸쳐서 표준화될 수 있으며, 개체 반응성에 있어서의 한가지 중요한 변수가 제거될 수 있다. 더 작은 유효 용량은 치료를 저해하는 항체의 후속 생성을 감소시킬 수 있다. 안검 경련 환자는 그들이 그들의 눈을 뜬 상태로 유지하여 읽고, 운전하고, 스스로 옷을 입고, TV를 보고, 일하고 장을 보는 등의 기능을 할 수 있는지 여부를 잘 알아차릴 수 있기 때문에, 이 데이터는 매우 신뢰할 수 있는 것으로 느껴진다.
본 발명에서 인용된 모든 공개자료, 특허 및 특허출원은 이에 의해서 마치 이들이 온전히 본 발명에 기술된 것처럼 참고로 포함된다. 본 발명은 예시적 구체예를 참고로 기술되었지만, 이 설명은 제한적인 개념으로 이해되지는 않아야 한다. 예시적 구체예의 다양한 변형 및 조합뿐만 아니라 본 발명의 다른 구체예도 설명을 참고로 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 명백할 것이다. 따라서, 첨부된 특허청구범위는 이러한 변형 및 강화를 포함하고자 한다.

Claims (49)

  1. 피험자를 치료학적 메탈로프로테아제 투여에 대해 준비시키는 방법으로서,
    치료학적 메탈로프로테아제의 투여 전에, 그와 동시에 또는 잠시 후에 로딩 기간 동안 치료학적 메탈로프로테아제의 활성에 필요한 금속 이온의 이용가능성을 보장하는 적어도 하나 보충물의 투여를 지시하고,
    상기 보충물의 지시된 투여는 투여된 치료학적 메탈로프로테아제에 대한 열등하거나 제한된 반응성에 대한 원인으로 금속 이온의 결핍을 제거하는데 충분한 레벨로 필요한 금속 이온의 이용가능성을 제공하는 것을 포함하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 치료학적 메탈로프로테아제가 클로스트리디움 신경독인 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 보충물이, 1일에 10 내지 400 ㎎의 양으로 원소 아연을 제공하는 형태로 아연을 포함하는 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 보충물이 아연 프로테이네이트, 아연 킬레이트 및/또는 유기 분자와의 염, 및 아연 아미노산 컴플렉스 중의 하나 또는 그 이상으로부터 선택된 유기 아연 형태를 포함하는 방법.
  5. 제 3항에 있어서, 상기 보충물이 1일에 10 내지 400 ㎎의 원소 아연을 전달하는 방법.
  6. 제 3항에 있어서, 상기 보충물이 1일에 30 내지 50 ㎎의 원소 아연을 전달하는 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 적어도 하나 보충물의 투여가 적어도 하나의 보충물의 경구적 소비를 포함하는 방법.
  8. 제 1항에 있어서, 적어도 하나의 보충물의 투여가 리포좀 현탁액 또는 나노전달 시스템을 포함하는 모든 형태의 국소 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 설하 투여, 비내 스프레이, 점안제, 관장제, "강제 통풍", 경피적, 또는 직장 투여 중의 하나 또는 그 이상을 포함하는 방법.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 피험자에게 로딩 기간 중에 피테이트의 소비를 제한하도록 추가 지시되는 방법.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 지시된 투여가 적어도 하나 피타제 함유 보충물의 경구적 소비를 포함하는 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 피타제 함유 보충물을 1일에 O.8 내지 10,000 유니트의 레벨로 소비하도록 지시되는 방법.
  12. 제 10항에 있어서, 상기 피타제 함유 보충물을 1일에 40 내지 3,000 유니트의 레벨로 소비하도록 지시되는 방법.
  13. 제 10항에 있어서, 상기 피타제 함유 보충물이 미량의 추가의 아연 보충과 함께 또는 추가의 아연 보충이 없이 소비하도록 지시되는 방법.
  14. 제 1항에 있어서, 적어도 하나의 보충물의 지시된 투여가 적어도 하나의 피타제 보충물의 경구적 소비에 대한 지시 및 적어도 하나의 아연 보충물의 투여에 대한 지시를 포함하며, 상기 적어도 하나의 보충물의 투여는 투여된 치료학적 메탈로프로테아제에 대한 열등하거나 제한된 반응성의 원인으로서의 금속 이온의 기능적 결핍을 제거하는데 충분한 레벨로 지시되는 방법.
  15. 클로스트리디움 신경독에 의한 치료 전에 아연 비축물을 로딩시키는 방법으로서,
    클로스트리디움 신경독의 투여 전에 로딩 기간 동안 아연 보충물을 투여하는 것을 포함하고, 상기의 아연 보충이 클로스트리디움 신경독에 대한 반응성을 증가시키거나 최대화하고, 투여된 클로스트리디움 신경독에 대한 열등하거나 제한된 반응성의 원인으로서의 아연의 기능적 결핍을 제거하는데 충분한 레벨로 이루어지도록 하는 것을 포함하는 방법.
  16. 제 17항에 있어서, 상기 아연 보충물이 유기 아연의 하나 또는 그 이상의 형태를 포함하며, 아연 보충물은 1일에 10 내지 400 ㎎의 원소 아연을 전달하는 방법.
  17. 제 17항에 있어서, 아연 보충물과 함께 적어도 하나의 피타제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  18. 제 1항 내지 제 17항 중의 어느 한 항에 있어서, 로딩 기간이 적어도 4일인 방법.
  19. 제 1항 내지 제 17항 중의 어느 한 항에 있어서, 로딩 기간이 4일 미만인 방법.
  20. 클로스트리디움 신경독에 의한 치료 전에 아연 비축물을 로딩시키는 방법으로서,
    클로스트리디움 신경독의 투여 전에 로딩 기간 동안에 피타제 보충물을 경구적으로 투여하는 것을 포함하고, 상기의 피타제 보충이 식이성 아연의 흡수를 증가시키거나 최대화시키고 이에 의해서 클로스트리디움 신경독에 대한 반응성을 증가시키며, 투여된 클로스트리디움 신경독에 대한 열등하거나 제한된 반응성의 원인으로서의 아연의 기능적 결핍을 제거하도록 하는 것을 포함하는 방법.
  21. 제 20항에 있어서, 상기 피타제 보충물이 1일에 0.8 내지 10,000 유니트의 레벨로 투여되는 방법.
  22. 제 20항 또는 제 21항에 있어서, 1일에 10 내지 400 ㎎의 원소 아연을 전달하는데 충분한 레벨로 유기 아연의 하나 또는 그 이상의 형태를 포함하는 아연 보충물을 경구적으로 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  23. 제 20항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 로딩 기간이 적어도 4일인 방법.
  24. 제 20항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 로딩 기간이 4일 미만인 방법.
  25. 전-절차용 치료학적 메탈로프로테아제 프리팩으로서,
    치료학적 메탈로프로테아제의 활성에 필요한 것으로 결정된 적어도 하나의 금속 이온을 함유하며, 치료학적 메탈로프로테아제로 환자를 치료하기 직전에 로딩 기간 동안 매일 금속 이온을 공급하는데 충분한 양으로 제공되는 캅셀제 또는 정제 형태의 일정량의 금속 이온 보충물; 및
    환자에게 금속 이온 보충물을 복용하고 피테이트의 섭취는 감소시키도록 지시하는 설명서를 포함하는 프로팩.
  26. 제 25항에 있어서, 로딩 기간 전체에 걸쳐서 금속 이온 보충물과 함께 투여하는데 충분한 양으로 제공된 분말, 액체, 액체-겔, 캅셀 또는 정제 형태의 일정량의 피타제 보충물을 추가로 포함하는 전-절차용 치료학적 메탈로프로테아제 프리팩.
  27. 제 25항 또는 제 26항에 있어서, 치료학적 메탈로프로테아제가 클로스트리디움 신경독인 전-절차용 치료학적 메탈로프로테아제 프리팩.
  28. 제 25항에 있어서, 상기 금속 이온 보충물이 클로스트리디움 신경독으로 환자를 치료하기 직전에 로딩 기간 동안 매일 10 내지 400 ㎎의 원소 아연을 공급하는데 충분한 투약량으로 유기 또는 무기 형태의 아연을 포함하는 전-절차용 치료학적 메탈로프로테아제 프리팩.
  29. 제 25항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, 로딩 기간이 치료학적 메탈로프로테아제로 환자를 치료하기 직전의 적어도 4일인 전-절차용 프리팩.
  30. 제 25항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, 로딩 기간이 치료학적 메탈로프로테아제로 환자를 치료하기 직전의 4일 미만인 전-절차용 프리팩.
  31. 치료학적 메탈로프로테아제의 효력을 시험하는 방법으로서,
    치료학적 메탈로프로테아제의 활성에 필수적인 금속 이온을 포함하는 경구용 보충물을 제공하는 단계; 및
    치료학적 메탈로프로테아제의 효력을 시험하기 전에 로딩 기간 동안 검정 동물에게 경구용, 국소용 또는 비경구용 보충물을 투여하는 단계를 포함하며,
    상기 보충물은 효력 검정 중에 치료학적 메탈로프로테아제에 대한 반응성을 변화시키는데 충분한 레벨로 금속 이온을 제공하도록 결정되는 방법.
  32. 제 31항에 있어서, 상기 치료학적 메탈로프로테아제가 클로스트리디움 신경독이고, 필수 금속 이온이 아연인 방법.
  33. 제 31항에 있어서, 상기 검정 동물을 적어도 로딩 기간 동안에 저 피타제 식이 하에 두는 방법.
  34. 제 31항 내지 제 33항 중 어느 한 항에 있어서, 피타제가 로딩 기간 동안에 검정 동물에게 추가로 투여되는 방법.
  35. 제 31항에 있어서, 상기 아연 보충물이 저 피테이트 마우스 먹이의 성분으로 경구적으로 투여되는 방법.
  36. 제 35항에 있어서, 상기 저 피테이트 마우스 먹이가 피타제를 추가로 포함하는 방법.
  37. 생체내에서 증진된 BoNT 활성을 위해서 충분한 Zn2 +를 공급하는 방법으로서,
    Zn2 +를 포함하는 용액 및 일정 용량의 BoNT를 조직 부위에 공동투여하는 것을 포함하는 방법.
  38. 제 37항에 있어서, Zn2 +를 포함하는 용액을 공동투여하는 행위가 BoNT의 용량을 투여하기 전 및/또는 후에 Zn2 +를 포함하는 용액을 국소적으로 적용하는 것을 포함하는 방법.
  39. 제 37항에 있어서, Zn2 +를 포함하는 용액을 공동투여하는 행위가 BoNT의 용량을 투여하기 전 및/또는 후에 BoNT 용량의 조직 부위에서 Zn2 +를 포함하는 용액을 별도의 주사로 투여하는 것을 포함하는 방법.
  40. 제 37항에 있어서, Zn2 +를 포함하는 용액이 Zn2 +의 형태를 포함하는 재구성 용액으로 BoNT 제제를 재구성함으로써 BoNT와 함께 공동투여되는 방법.
  41. 제 37항에 있어서, BoNT의 용량의 투여가 주사, 국소 치료, 전신적으로 투여된 BoNT의 부위-지시된 방출, 나노전달, 및 국소적 침투 크림 중의 적어도 하나를 포함하는 방법.
  42. 제 37항에 있어서, Zn2 +를 포함하는 용액의 투여가 주사, 국소 치료 및 국소용 침투 크림 중의 적어도 하나를 포함하는 방법.
  43. 제 40항에 있어서, BoNT 제제를 동결건조시키는 것을 추가로 포함하며, 여기에서 Zn2 +의 형태를 포함하는 재구성 용액이 BoNT를 동결건조시킨 후에 재구성된 BoNT 제제에 첨가되는 방법.
  44. 아연 비축물을 로딩시키는 방법으로서,
    아연의 기능적 결핍을 제거하는데 충분한 레벨로 아연 보충물을 로딩 기간 동안에 피험자에게 투여하고; 적어도 하나 피타제 보충물을 상기 아연 보충물과 함께 투여하는 것을 포함하는 방법.
  45. 제 44항에 있어서, 상기 아연 보충물이 유기 아연의 하나 또는 그 이상의 형태를 포함하며, 아연 보충물이 1일에 10 내지 400 ㎎의 원소 아연을 전달하는 방법.
  46. 제 44항에 있어서, 상기 피타제 보충물이 1일에 0.8 내지 10,000 유니트의 레벨로 투여되는 방법.
  47. 제 44항 내지 제 46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 로딩 기간이 적어도 4일인 방법.
  48. 제 44항 내지 제 46항 중 어느 한 항에 있어서, 성기 로딩 기간이 4일 미만인 방법.
  49. 제 44항에 있어서, 아연의 기능적 결핍을 제거하는 것이 창상 치유, 화상 회복, 면역 손상 및 남성 발기부전 중의 적어도 하나를 포함하는 의학적 필요상태를 치료하는 방법.
KR1020127001685A 2009-06-24 2010-06-23 메탈로프로테아제 치료에 대한 반응성을 증대시키기 위한 아연 보충 방법 KR101595033B1 (ko)

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