CZ466390A3 - Klonování a exprese mikrobiální fytázy - Google Patents
Klonování a exprese mikrobiální fytázy Download PDFInfo
- Publication number
- CZ466390A3 CZ466390A3 CZ19904663A CZ466390A CZ466390A3 CZ 466390 A3 CZ466390 A3 CZ 466390A3 CZ 19904663 A CZ19904663 A CZ 19904663A CZ 466390 A CZ466390 A CZ 466390A CZ 466390 A3 CZ466390 A3 CZ 466390A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- phytase
- protein
- peptide
- expression
- sequence
- Prior art date
Links
- 108010011619 6-Phytase Proteins 0.000 title claims abstract description 291
- 229940085127 phytase Drugs 0.000 title claims abstract description 233
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 67
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 title claims abstract description 13
- 238000010367 cloning Methods 0.000 title description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 64
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 29
- IMQLKJBTEOYOSI-GPIVLXJGSA-N Inositol-hexakisphosphate Chemical compound OP(O)(=O)O[C@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H]1OP(O)(O)=O IMQLKJBTEOYOSI-GPIVLXJGSA-N 0.000 claims abstract description 24
- 235000002949 phytic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 24
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 21
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 claims abstract description 10
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 229910052816 inorganic phosphate Inorganic materials 0.000 claims abstract description 9
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 144
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 90
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 64
- 241000228195 Aspergillus ficuum Species 0.000 claims description 50
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 claims description 39
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 30
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 28
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 25
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 24
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 claims description 20
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 20
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 claims description 19
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 claims description 19
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 17
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 13
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 11
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 11
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 10
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 10
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 10
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims description 9
- 230000022811 deglycosylation Effects 0.000 claims description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 7
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 6
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000010871 livestock manure Substances 0.000 claims description 6
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 claims description 4
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 3
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims description 3
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims description 3
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 claims description 3
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 claims description 3
- 241000235395 Mucor Species 0.000 claims description 3
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 claims description 3
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 claims description 3
- 241000499912 Trichoderma reesei Species 0.000 claims description 3
- 101100296182 Caenorhabditis elegans paf-2 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 241000235403 Rhizomucor miehei Species 0.000 claims description 2
- 230000037213 diet Effects 0.000 claims 2
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 claims 2
- 241001513093 Aspergillus awamori Species 0.000 claims 1
- 240000006439 Aspergillus oryzae Species 0.000 claims 1
- 235000002247 Aspergillus oryzae Nutrition 0.000 claims 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 abstract description 29
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 abstract description 29
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 17
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 abstract description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 68
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 61
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 46
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 30
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 24
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 22
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 20
- 239000000047 product Substances 0.000 description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 19
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 18
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 18
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 18
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 18
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 18
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 18
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 16
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 16
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 16
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 16
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 15
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 13
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 12
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 10
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 10
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 10
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 10
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 10
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 9
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 9
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 9
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 9
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 8
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 8
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 8
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 8
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 8
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 6
- IMQLKJBTEOYOSI-UHFFFAOYSA-N Phytic acid Natural products OP(O)(=O)OC1C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C1OP(O)(O)=O IMQLKJBTEOYOSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 5
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 5
- 235000014666 liquid concentrate Nutrition 0.000 description 5
- 229940068041 phytic acid Drugs 0.000 description 5
- 239000000467 phytic acid Substances 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 101150070093 AG gene Proteins 0.000 description 4
- DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N Acetamide Chemical compound CC(N)=O DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 101150069003 amdS gene Proteins 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 4
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 4
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 241001370055 Aspergillus niger CBS 513.88 Species 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 102100022624 Glucoamylase Human genes 0.000 description 3
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 3
- 238000002093 isoelectric focusing polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- -1 myoinositol phosphates Chemical class 0.000 description 3
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 3
- 239000011546 protein dye Substances 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 3
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 3
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 108091005508 Acid proteases Proteins 0.000 description 2
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 2
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 2
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 2
- 244000304337 Cuminum cyminum Species 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 101100042676 Mus musculus Skap2 gene Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001030 Polyethylene Glycol 4000 Polymers 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000282849 Ruminantia Species 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FENRSEGZMITUEF-ATTCVCFYSA-E [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].OP(=O)([O-])O[C@@H]1[C@@H](OP(=O)([O-])[O-])[C@H](OP(=O)(O)[O-])[C@H](OP(=O)([O-])[O-])[C@H](OP(=O)(O)[O-])[C@H]1OP(=O)([O-])[O-] Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].OP(=O)([O-])O[C@@H]1[C@@H](OP(=O)([O-])[O-])[C@H](OP(=O)(O)[O-])[C@H](OP(=O)([O-])[O-])[C@H](OP(=O)(O)[O-])[C@H]1OP(=O)([O-])[O-] FENRSEGZMITUEF-ATTCVCFYSA-E 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000000433 anti-nutritional effect Effects 0.000 description 2
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 229940083982 sodium phytate Drugs 0.000 description 2
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- QNRATNLHPGXHMA-XZHTYLCXSA-N (r)-(6-ethoxyquinolin-4-yl)-[(2s,4s,5r)-5-ethyl-1-azabicyclo[2.2.2]octan-2-yl]methanol;hydrochloride Chemical compound Cl.C([C@H]([C@H](C1)CC)C2)CN1[C@@H]2[C@H](O)C1=CC=NC2=CC=C(OCC)C=C21 QNRATNLHPGXHMA-XZHTYLCXSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGZSVBBLLGZHSF-UHFFFAOYSA-N 4,4-diethylpiperidine Chemical compound CCC1(CC)CCNCC1 DGZSVBBLLGZHSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 4-chloronaphthalen-1-ol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=C(Cl)C2=C1 LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OCKGFTQIICXDQW-ZEQRLZLVSA-N 5-[(1r)-1-hydroxy-2-[4-[(2r)-2-hydroxy-2-(4-methyl-1-oxo-3h-2-benzofuran-5-yl)ethyl]piperazin-1-yl]ethyl]-4-methyl-3h-2-benzofuran-1-one Chemical compound C1=C2C(=O)OCC2=C(C)C([C@@H](O)CN2CCN(CC2)C[C@H](O)C2=CC=C3C(=O)OCC3=C2C)=C1 OCKGFTQIICXDQW-ZEQRLZLVSA-N 0.000 description 1
- 241001019659 Acremonium <Plectosphaerellaceae> Species 0.000 description 1
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 1
- 241001136782 Alca Species 0.000 description 1
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 235000019890 Amylum Nutrition 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 description 1
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101150118197 CSN1S1 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010008885 Cellulose 1,4-beta-Cellobiosidase Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 108010068370 Glutens Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101000636168 Grapevine leafroll-associated virus 3 (isolate United States/NY1) Movement protein p5 Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 1
- 108010059881 Lactase Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002774 Maltodextrin Polymers 0.000 description 1
- 239000005913 Maltodextrin Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000480238 Nidula Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241000228150 Penicillium chrysogenum Species 0.000 description 1
- 102000000447 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Human genes 0.000 description 1
- 108010055817 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 235000001537 Ribes X gardonianum Nutrition 0.000 description 1
- 235000001535 Ribes X utile Nutrition 0.000 description 1
- 235000016919 Ribes petraeum Nutrition 0.000 description 1
- 244000281247 Ribes rubrum Species 0.000 description 1
- 235000002355 Ribes spicatum Nutrition 0.000 description 1
- 101150010882 S gene Proteins 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000187398 Streptomyces lividans Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N [1,10]phenanthroline Chemical compound C1=CN=C2C3=NC=CC=C3C=CC2=C1 DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 1
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 1
- 239000011609 ammonium molybdate Substances 0.000 description 1
- APUPEJJSWDHEBO-UHFFFAOYSA-P ammonium molybdate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-][Mo]([O-])(=O)=O APUPEJJSWDHEBO-UHFFFAOYSA-P 0.000 description 1
- 235000018660 ammonium molybdate Nutrition 0.000 description 1
- 229940010552 ammonium molybdate Drugs 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 1
- 235000008452 baby food Nutrition 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 238000010370 cell cloning Methods 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- NUGRUDUZGYQLNE-UHFFFAOYSA-N cyclohexanamine;propane-1-sulfonic acid Chemical compound CCCS(O)(=O)=O.NC1CCCCC1 NUGRUDUZGYQLNE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000012851 eutrophication Methods 0.000 description 1
- 238000010304 firing Methods 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 235000021312 gluten Nutrition 0.000 description 1
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 101150029559 hph gene Proteins 0.000 description 1
- PPTXFSQSISUDAU-UHFFFAOYSA-M hydrogen sulfate;2-methyl-4-[(2-methylphenyl)diazenyl]benzenediazonium Chemical compound OS([O-])(=O)=O.CC1=CC=CC=C1N=NC1=CC=C([N+]#N)C(C)=C1 PPTXFSQSISUDAU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 229940035034 maltodextrin Drugs 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003801 milling Methods 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 239000002366 mineral element Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- YNXICDMQCQPQEW-UHFFFAOYSA-L naphthalen-1-yl phosphate Chemical compound C1=CC=C2C(OP([O-])(=O)[O-])=CC=CC2=C1 YNXICDMQCQPQEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 238000009304 pastoral farming Methods 0.000 description 1
- 108010091748 peptide A Proteins 0.000 description 1
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 210000004767 rumen Anatomy 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 229910000275 saponite Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002000 scavenging effect Effects 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000002352 surface water Substances 0.000 description 1
- 210000004243 sweat Anatomy 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 238000001238 wet grinding Methods 0.000 description 1
- 235000015099 wheat brans Nutrition 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
- A23K20/10—Organic substances
- A23K20/189—Enzymes
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Fodder In General (AREA)
Description
Vynález se týká mikobiální produkce fytázy.
Dosavadní stav techniky
Fosfor ja esenciálním prvkem pro růst všech organismů. Při pěstování dobytka sa musí do krmivá přidávat anorganický fosfor, aby se dosáhlo dobrých přírůstků u zvířat s jednoduchým žaludkem (např. prasat, drůbeže a ryb).
Naopak žádný anorganický fosfor se nemusí přidávat do krmivá přežvýkavců. Mikroorganismy, přítomné v bachoru, produkují enzymy, které katalyzují konverzi fytátu (myoincsitolhexakis-fosfátu) na inositol a anorganický fosfát?
Fytát se vyskytuje jako zásobní zdroj fosforu v praktic ky všech krmných hmotách, které pocházejí z rostlin (viz: Kyselina fytová, její chemie a aplikace, Phytic acid, chemistry and applications. S, Graf (vyd.), Pilatuá Press; Minneapolis, MN, USA (1986Fytát je obsažen v množství 1-3% ve všech druzích ořechů, obilí, luštěninách, olejnstých semenech, sporách a v pylu. Komplexní soli kyseliny fytové se nazývají rytin. Kyselina fytovéí je pokládána za antinutri ní faktor, protože tvoří cheláty s minerály např. s vápníkem zinkem, hořčíkem, železem a může také reagovat s proteiny. Tímto způsobem kyselina fytová snižuje biologickou dostupnost proteinů a nutričně důležitých minerálních prvků.
Fosfor ve forma fytátu prochází zažívacím traktem zvířat s jednoduchým žaludkem a je vylučován do mrvy. Ačkoliv v tračníku dochází k jisté hydrolýze fytátu, takto uvol» naný anorganický fosfor nemá nutriční význam, protože anorganický fosfor se absorbuje pouze v tenkém střevě. V důsledku toho není značné množství nutričně důležitého fosforu zvířaty s jednoduchým žaludkem využito, přestože ja v krmivu přítomno.
- 2 Vylučování fosforu ve formě fytátu do mrvy má další následky. Intenzivní chov dobytka se během posledních desetiletí enormně zvýšil, V důsledku toho se odpovídajícím způsobem zvýšilo množství mrvy a to způsobilo ekologické problémy v různých částech světa. Ty jsou částečně také zaviněny hromaděním fosfátu, původem z mrvy, v povrchových vodách, což způsobuje eutrofizaci.
Enzymy, produkované mikroorganismy, které katalyzují konverzi fytátu na inositol a anorganický fosfor, jsou všeobecně známé jako fytázy. Mikroorganismy, které produkují fytázu, jsou bakterie jako např. Bacillus subtilis (V.K. Paver a V.3. Oagannathan (1982) 3, Bacteriol. 151, 1102-1108) a Pseudomonas (D.3. Cosgrove (1970) Austral. 3. Biol. Sci. 23, 1207-1220); kvasinky jako např. Saccharomyces cerevisiae (N. R. Nayhi a P. Markakis /1984/ Lebensraittel Wissenschaft und Technologie 17, 24-26); a plísně jako např. Asperqillus terreus (K. Yamada, Y.Minoda a S. Yamamoto (1986) Agric. Biol. Chem. 32, 1275-1282), 3e známo, že i různé jiné druhy rodu Aspesgillus produkuji fytázu. Bylo zjištěno, že fytáza, produkovaná druhem Aspergillus ficuum, má jednu z nejvyšších hodnot specifické aktivity a také má lepší termostabilitu než fytázy, produkované jinými mikroorganismy (nepublikované výsledky).
Přidáváni mikrobiální fytázy.do krmivá zvířat s jedno duchým žaludkem bylo již dříve popsáno (Ware, 3.H., Bluff,
L, a Shieh, T.R. (1967) U.S. Patent No. 3,297,548; Nelson, T.S., Shieh, T.R., Wodzinski, R.3. a Ware, 3.H, (1971) 3. Nutrition 101, 1289-1294). Avšak až do dnešní doby nebyla aplikace tohoto nápadu komerčně proveditelná vzhledem k vysokým nákladům na produkci mikrobiálních enzymů (Y.W, Han (1989) Animal Feed Sci. Technol. 24, 345-350), Z ekonomických důvodů se do krmivá zvířat s jednoduchým žaludkem stále přidává anorganický fosfor.
O *
Sylo zjištěno, že mikrobiální fytázy mají také jiná průmyslová použití. Příkladem takových použití je průmyslový proces výroby škrobu z obilnin např. z kukuřice a pšenice, Odpadní produkty, které obsahují např. obilný lepek z mokrého mlecího procesu, se prodávají jako krmivo pro zvířata. Během máčení se může přidat fytáza. Podmínky ( t = 5O°C a pH = 5,5) jsou pro houbové fytázy ideální (viz např. Evropská patentová přihláška č. 0 321 004 firmy Alko Ltd.) Krmivá, vytvořená z odpadních produktů tohoto procesu budou s výhodou obsahovat fosfát místo fytátu.
Také se předpokládá, že fytázy se mohou využít při z fTM) (T zpracování sóji /viz Finazak 7 enzymy firmy Alko Finase k Enzymes by Alko”, informační brožura o produktech firmy Alko Ltd., Rajamáki, Finsko). Sojová mouka obsahuje velké množství antinutričního faktoru, fytátu, který způsobuje, že tento zdroj bílkovin je nevhodný k použití v dětské výživě a v krmivech pro ryby, telata a jiná napřežvýkavca. Enzyma-tická úprava tohoto cenného zdroje bílkovin zlepšuje nutriční a komerční hodnotu tohoto materiálu.
Siní výzkumníci se zajímali o lepší charakterizaci různých fytáz a zlepšení procedur pro produkci a použití těchto fytáz. Ullah publikoval postup purifikace fytázy z divokého kmene Aspergillus ficuum a také některé biochemické parametry produktu, získaného tímto purifikačním postupem (Ullah, A. (1988a) Preparative Siochem. 18, 443-458). Zmíněné údaje, zjištěné Ullahem, jsou uvedeny v tabulce 1, níže.
Sekvence aminokyselin N-konce fytázy, produkované A, ficuum, byla dvakrát zveřejněna Ullahem; Ullah, A. (1987) Enzyme and Engineering conference IX, October 4-8p< Santa Barbara, California (uvedeno na plakátu); a Ullah, A. (1988b) Prap. Biochem. 13, 459-471. Údaje o sekvenci aminokyselin podle Ullaha jsou uvedeny na obr. IA, sekvence Ξ, níže.
hy.
Z Ullahových zjiš Především vyčištěný :ění vyplývají různé zajímavé postřepreparát, popsaný Ullahem (1988 a
- 4 1988 b) poskytuje na SDS-PAGE dva proteinové pásy. My jsme však zjistili, že vyčištěná fytáza z A. ficuum obsahuje kontaminant a že jeden z pásů, nalezený na SDS-PAGE a identifikovaný Ullahem jako ífytáza, pochází z tohoto kontaminant u.
Tento rozdíl je také zřejmý z údajů o sekvenci aminokyselin, publikovaných Ullahem (1987, 1988 bj srovnej obr. 1 A, sekvenci A a B se sekvencí C), My jsme vlastně určili, že jedna ze sekvencí aminokyselin vnitřních peptidů fytQzy, které popsal Ullah (viz obr. 1 B, sekvence E), ve skutečnosti náleží kontaminujícímu proteinu o molekulové hmotnosti ICO kDa (obr. ÍC). Tento protein je obsažen v preparátu, získaném postupem podle Ullaha a na SDS-PAGE je viditelný jako jeden ze dvou pásů (Ullah, 1988a a 1988b). Ullah nerozpoznal přítomnost zmíněného kontaminujícího proteinu a místo toho ho identifikoval jako další formu fytgzy. Následkem přítomnosti této kontaminace ‘ee zvyšuje obtížnost selekce a izolace vlastni sekvence nukleotidů, která kóduje fytgzovou aktivitu. Dále přítomnost kontaminace snižuje hodnotu specifické aktivity testovaného proteinu.
Při dalším zkoumáni sekvence, jak ji popsal Ullah, jsme určitě zjistili pomocí sekvenčních technik pro bílkoviny a DNA, že aminokyselinový zbytek v poloze 12, který Ullah určil jako glycin, je ve skutečnosti cystein (viz obr. 6 a 8).
Nakonec Ullah zveřejnil, že fytáza je protein o molekulové hmotnosti 85 kDa, po deglykosylaci 61,7 kDa (Ullah1988b). Tato hodnota, která je mnohem nižší než dříve zveřejněná hodnota 76 kDa (Ullah, A.a Gibson,D. (1988) Prep. Biochem. 17(1), 63-91), byla určena na základě relativního množství cukrů, uvolněných při hydrolýze a zdánlivé molekulové hmotnosti nativního proteinu na SDS-PAGE, My jsme však zjistili, že glykoxylovaná fytáza má jednu hodnotu zdánlivé molekulové hmotnosti} 85 kDa, kdežto deglykosylovaný protein má molekulovou hmotnost v rozmezí 48 až 56,5 kDa v závislos- 5 ti na stupni deglykosylace.
Mullaney a další (konference o vláknitých houbách, duben 1987, Pacific Grove, Kalifornie (předvedení ve formě plakátu) také zveřejnil charakterizaci fytázy z A, ficuum. Avšak tato zpráva také obsahuje zmínku o dvou proteinových pásech na SDS-PAGE, z nichž jeden má molekulovou hmotnost 85 kDa a druhý 100 kDa a které jsou přítomné ve vyčištěném proteinovém preparátu. Oba tyto proteinové pásy byíy autory identifikovány jako formy fytázy. Metoda pro transformaci mikrobiálních hostitelů byla navržena, ale její provedení nebylo oznámeno. Klonování a izolace sekvence DNA, která kóduje fytázu, nebyly popsány.
Ekonomický způsob produkce fytázy přinese významný užitek mimo jiné v krmivářském průmyslu. Oednou metodou pro produkci ekonomičtější fytázy by bylo použití techniky rekombinace DNA pro zvýšení úrovně exprese enzymu v různých mikroorganismech, které jsou známé tim, že produkují velké množství peptidů a bílkovin. Do dnešního dne však izolace a klonování sekvence DNA, která kóduje fytázu, nebylo uveřejněno.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu je purifikovaná a izolovaná sekvence DNA, která kóduje fytázu. Izolace a klonováni této sekvence DNA, kódující fytázu, byly provedeny s použitím specifických oligonukleotidových prób, které byly vyvinuty zvlášt pro tento vynález. Nejlepší sekvence DNA, kódující fytázu, se dají získat z hub, zejména z vláknitých hub rodu Aspergillus.
Dalším předmětem tohoto vynálezu je vektor, obsahující konstrukt pro expresi a dále alespoň jednu kopii přinejmervr ším jedné nejlépe homologní sekvence DNA, která kóduje fytázu. Tato sekvence je operabilně spojena s vhodnou regulátorovou oblastí, která je schopná řídit vysokou úroveň ·· 6 ·* sxprese peptidQ nebo proteinů s fytázovou aktivitou ve vhodném hostiteli.
Konstrukt pro expresi, uvedený v tomto vynálezu, může být včleněn do vektoru, nejlépe plazmidu, který je schopen transformovat hostitelskou mikrobiální buňku a integrovat se do jejího genomu.
Dalším předmětem tohoto vynálezu je transformant, nejlépe mikrobiálního hostitele, který byl transformován vektorem, popsaným v předcházejícím odstavci. Transformovanými hostiteli, uvedenými v tomto vynálezu, jsou vláknité houby rodu Aspergillus, Trichoderma, Mucor a Penicillium, kvasinky rodu Kluyveromyces a Saccharomyces nebo bakterie rodu Bacillus. Zvláště vhodnými hostiteli pro expresi jsou vláknité houby rodu Aspergillus. Transformovaní hostitelé jsou schopni produkovat velké množství rekombinantní fytázy v ekonomickém, průmyslovém měřítku.
V jiných aspektech je vynález věnován rekombinantnim peptidům a proteinům s fytázovou aktivitou v glykosylované nebo neglykosylované formě, způsobu přípravy zmíněných nsglykosylovaných peptidů a proteinů, proteinům s fytázovou aktivitou, které jsou prosté nečistot a monoklonálním pro- tilátkám, které jsou schopné reagovat s těmito rskombinantnimi nebo nečištěnými proteiny.
Srovnání biochemických parametrů vyčištěné fytázy z divokého kmene A.ficuum, kterou získal Ullah, s další vyčištěnou fytázou z divokého kmene A. ficuum, která byla získána při tomto vynálezu, je ukázáno v tabulce 1 níže. Významné jsou údaje o specifické aktivitě, z nichž je vidět, že vyčištěný protein, který jsme získali my, má dvojnásobnou specifickou aktivitu než protein, který uvádí Ullah.
Tento vynález dále poskytuje nukleotidové sekvence, které kódují bílkoviny s fytgzovou aktivitou a také aminokyselinové sekvence těchto bílkovin. Poskytnuté sekvence se mohou použít pro sestaveni oligonukleotidových prób.
— Ί Tyto próby se mohou dále používat při hybridizačních screening studiích pro identifikaci fytázových genů u jiných druhů, zejména mikrobiálních, která mcnou být následné izolovány a klonovány.
Sekvence, které poskytuje tsnto vynález, mohou být také použity jako startovací materiály, pro konstrukci fytáz druhé generace. Fytázy druhé generace jsou fytázy, které byly změněny technikou mutageneze (např, mutagenezí, cílenou na určité místo). Mají vlastnosti, které jsou odlišné od vlastností fytáz divokých typů nebo rakombinantních fytáz, které jsou produkovány postupem podle tohoto vynálezu. Například teplotní nebo pH optimum, specifická aktivita nabo substrátová specifita se dají změnit tak, aby to lépe vyhovovalo pro aplikaci v daném procesu.
V kontextu tohoto vynálezu termín fytáza zahrnuje skupinu enzymů, které katalyzují odstranění anorganického fosforu z různých myoinositol fosfátů.
Fyt^zová aktivita se může měřit pomoci různých stanovení. Volba stanovení nemá při tomto vynálezu rozhodující důležitost. Pro ilustraci, fytázová aktivita se může stanovit meřenim množství enzymu, které uvolní anorganický fosfor z 1,5 mH fytátu sodného rychlostí 1 >imol/min při teplotě 37°C a pH 5,50.
Oe třeba poznamenat, že do rozsahu termínu rytáza, jak je používán v celém textu tohoto popisu, spadají všechny peptidy a proteiny s fytázovou aktivitou. To ukazuje obr,
IA, který srovnává sekvence A a 3 (sekvence byly získány během práce na vynálezu) se sekvencí C (publikovaná Ullahem 1988b). Tento obrázek ukazuje, že proteiny, získané postupem podle tohoto vynálezu, mohou postrádat první čtyři aminokyseliny (protein se sekvenci A postrádá prvních sedm aminokyselin) za sekvence maturovaného fytszovsho proteinu z A, ficuum. Avšak tyto proteiny si zachovávají fytázovou aktivitu. Kompletní sekvenci aminokyselin fytázového proteinu, která byla odvozena z korespondující sekvence nukleotidů, ukazuje obr. 8,
Fytázy, produkované postupem podle tohoto vynálezu, se mohou aplikovat v různých procesech, které vyžadují konverzi fytátu na inositol a anorganický fosfát.
Například výroba fytáz podle tohoto vynálezu sníží výrobní náklady mikrobiálních fytáz tak, že bude možná jejich ekonomická aplikace v krmivech. To nakonec povede k tomu, že poměr ceny a výsledku dosažený s fytázami in vivo bude konkurence schopný s poměrem dosaženým anorganickým fosfátem, Dslší výhodou bude značné snížení obsahu fosforu v mrvě.
Aplikace cenově dostupných fytáz, které budou schopné konkurovat anorganickému fosfátu, zvýší míru volnosti průmyslu výroby krmivových směsí při výrobě kvalitních krmiv. Například když se do krmivá dodá fytáza, přídavek anorganic kého fosfátu se může vynechat a obsah různých materiálů, obsahujících fytát, sa může zvýšit.
Kromě použiti v krmivech a při zpracování sóji, jak bylo diskutováno výše, se může fytáza, získaná postupem podle tohoto vynálezu, taká použít v různých průmyslových aplikacích jako např:
- jako tekuté krraivo pro prasata a drůbež.
Existuje obecná praxe máčet krmivo po několik hodin před krmením. 3ěhem této doby můžs enzym konvertovat fytát na inositol a anorganický fosfát;
- v průmyslovém procssu pro výrobu inositolu nebo inositol-fosfátů z fytátu;
- v jiných průmyslových procesech, které používají subsťáty, .obsahující rytat, např. ve skrobárenském průmyslu a fermentačních průmyslech např, pivovarstvi, Fytát chelatuje kovové ionty a to může způsobovat nedostupnost těch3 to iontů pro produkční mikroorganismy, Enzymatická hydrofýza fytátu odstraní tyto problémy.
Tyto a jiné předměty a výhody tohoto vynálezu se stanou zřejmými z náslsdujícího podrobného popisu.
Přehled obrázků na výkrese
Obr. IA
Obr. 13
Obr. 1 0
Obr. 2A
Obr, 23
Sekvence M-terminálních aminokyselin, stanovené pro petrifikovanou fytázu. Sekvence aminokyselin, označené A a 3, jsou podle tohoto vvnálezu a oocházají z různých forem fytázy. A má izoelektriok bod 5/2, 3 5,4. Sekvence C je sekvence) citovaná Ullaham (1937, 1338b viz výše). Při tomto vynálezu bylo stanoveno, že aminokyselinový zbytek, umístěný v poloze 12 u sekvenci A a 3, není zbytkem glycinu,
Ok označuje najednoznačnou identifikaci.
* o značují, že žádný zbytek nebyl detegován.)
Sekvence M-terminálních aminokyselin vnitřních fragmentů fytázy po štípení CNBr. Sekvence aminokyselin, označené A a 3 (molekulová hmotnost paptidu A js přibližné 2,5 kDa, molekulová hmotnost· peptidů 3 je přibližně 36 kDa), jsou podlá vynálezu, Sekvence C až Ξ jsou citované v práci Ullaha (1933 b, viz výš
Sekvence M-terminálních aminokyselin proteinu o molekulové hmotnosti ICC kDa, přítomnost kterého byla zjištěna při práci na tomto vynálezu v surových vzorcích fytázy.
Oligonuklotidové próoy, vytvořené na základe údajů z obr. IA, oeptidy A až Ξ,
Oligonuklsotidcvé próby, vytvořené na základě údajů z obr. 13, peptidy A a 3.
0br« 3
Obr. 4
Obr. 5
Obr. 6
Obr. 7
Obr. 8
- Oligonukleotidové próby, použité pro izolaci genu, který kóduje kyselou fosfatázu.
- Restrikční mapa bakteriofága lambda AF 201, obsahující lokus fytázy z A. ficuum. šipka ukazuje umístění fytázového genu a směr transkripce. Sloupec čislojklonu ukazuje subklony, které byly odvozeny uvedenými restrikčními enzymy z fágu AF 201 v pAN 8-1 (pro pAF 28-1) a v pUC 19 (pro všechny ostatní subklony).
- Fyzická mapa pAF 1-1. Fragment 10 kb Bam HI, vložený do pUC 19, obsahuje celý gen, kódující kyselou fosfatázu z A. ficuum.
- Kompilace nukleotidových sekvencí plazmidů pAF 2-3, pAF 2-6 a pAF 2-7, zahrnující chromosomální lokus fytázového genu. Oblast, kódující fytázu, je lokalizována na nukleotidových pozicích 210 až 1713j intron je přítomen v chromosomálnim genu od pozice 254 až k pozici 355. Důležité části jako jsou restrikční místa, start a stop kodóny pro fytázu a umístění intronu jsou označené.
- Podrobná fyzická mapa sekvenovaného chromosomálního lokusu pro fytázuj šipky ukazují umístění dvou exonů části, kódující fytázu.
- Sekvence nukleotidů přeložené části fragmentu cDNA pro fytázu a odvozená sekvence aminokyselin pro fytázový protein; začátek maturovaného fytázového proteinu je označen jako pozice +1. N-konec vnitřního proteinového fragmentu o molekulové hmotnosti 36 kDa je lokalizován na aminokyselinové pozici 241, kdežto proteinový fragment o molekulové hmotnosti 2,5 kDa začíná od aminokyselinové pozice 390.
Obr. 9 - Fyzická mapa pro expresi fytázyfkazety pAF 2-2S. šipky ukazují směr přepisu genů.
Obr. 10 - Důkaz o nadprodukci fytázy v transformantu A.
ficuum NRRL 3135 na IEF - PAGE. Stejné objemy supernatantu kultury A. ficuum (pruh 1) a trans-formantu pAF 2-2S SP7 (pruh 2), narostlé za stejných podmínek, byly analyzovány ve Phast-systému (Pharmacia) s gelem IEF-PAGE v pH rozmezí 4,5 až
6. Pro srovnání, vzorek fytázy z A. ficuum, ptírifikovaný do homogenního stavu, byl analyzován buS odděleně (pruh 4) nebo smíšený se supernatantem kultury (pruh 3). Gely byly barveny bu3 fosfatázovým barvivém, uvedeným v textu (obr. 10A) nebo obvyklým barvivém pro proteiny (Coomassie Brilliant Blue, obr. 10B). Fytázové pásy jsou označené hvězdičkou.
Obr. 11 - Důkaz o nadprodukci fytázy v transformantech.
A.niger CBS 513,88 na IEF - PAGE. Stejné objemy supernl^tfi kultury rodičovského kmene A. niger (pruh 1) nebo transformantů pAF 2-2S č. 8 (pruh 2), pFYT3 č. 205 (pruh 3) a č. 282 (pruh 4) byly analyzovány na IEF-PAGE stejně, jako je popsáno v legendě k obr. 10. Gely byly barveny bu3 obvyklým barvivém pro|íátky s fosfatázovou aktivitou (obr. 11A) nebo obvyklým barvivém pro proteiny (obr. 11B). Fytázové pásy jsou označené hvězdičkou.
Obr. 12 - Fyzická mapa pAB 6-1. Inzert DNA Hind III o molekulové hmotnosti 14,5 kb v pUC 19 obsahuje celý lokus pro glukoamylázu (AG) z A. niger.
Obr. 13 - Schéma generace genových fúzí AG promotoru s fytázovýra genem řetězovou polymerační reakcí (PCR).
Sekvence všech použitých oligonukleotidových prir merů jscu udány v textu.
Obr. 14
Obr. 15
Fyzická
Fyzická mapa mapy fytázová expresn intarmediárních í kazsty pAF 2-2SH konstruktů pXXP/71 pXXrY72 a kazet pro expresi fytázy pXXFY73 v nichž XX označuje vadoucí sekvenci (L). Oo pl8Př7 ja vložena vedoucí AG sekvence ISaa a do p 24Pf7. Vadoucí AG sekvence 24aa, kdežto do pFY7 ja vložena fytázová vadoucí sekvence.
Obr. 16
Obr. 17
Obr. 18
Fyzická mapa plazmidu pPř 13 a)nd í Fyzická mapa plazmidu pP/7 3IN7.
Fyzická mapa vektoru p PEPFY73, který nahradil AG vektor.
Obr. 19 - Autoradiogramy chromosomálni ONA, štěpené Pvu zz (Obr. a) a 3am HI (obr. b) a hybridizované s cSNA. 7ato cDNA označená Ol~P, kódu^ja fytázu u A. ficuum a je próbou mikrobiálních druhů S. cersvisiaa (pruh 2); S, subtilis (pruh 3J; K, lactis (pruh 4); P. á^ysogenum (pruh 5); P. aeruginosa (pruh 6); S. lividans (pruh 7); A. niger 1 pg (pruh 8); A. niger 5 pg (pruh 9); blank (pruh 10); C. tharmocellum (pruh 11). Pruh 1: markér DNA.
Klonování genů, kódujících vybrané proteiny, která jsou produkovány mikroorganismy, se může provádět různými způsoby, Oednou metodou ja purifikace proteinu, o ktarý je zájem, dále určení sekvence jeho N-koncových aminokyselin. a potom screening genomové knihovny daného mikroorganismu za použití ONA oligonuklsotidové próby, která je založena na dané sekvenci N-koncových aminokyselin. Příklady úspěšné aplikace tohoto postupu jsou klonování genu pro iscpenicilin N-syntstasu u Caphalosporium acremonium (S,M. Samson at al. (1985) Nátuře 318, 191-194) a izolace genu, kódujícího· 7AKA amylasu u Aspergillus oryzáa (3oel at al, (1986) ΞΡ-Α0238023),
Byl proveden pokus o izolaci genu, který kóduje fytázu u Aspergillus ficuum, tímto postupem. Protein byl roz-~ sáhle čištěn a byly stanoveny některé jeho biochemické parametry. Získané údaje jsou srovnány s údaji, které publikoval Ullah (1988a). Oba soubory dat jsou předloženy v tabulce 1, níže.
Tabulka 1
Biochemické parametry purifikované fytázy divokého kmene A. ficuum
| Parametr | Tento vynález: | Ullah: |
| Specifická aktivita* | 100 U/mg proteinu | 50 U/mg proteinu |
| čistota: SDS-PAGE | 85 kDa | 85 / 100 kDa |
| : IEF-PAGE | 3 nebo 4 pásy | neprovedeno |
| Km (afinitní konstanta) 250 pM | 40 pM | |
| Specifita pro: | ||
| Inositol-l-P | neaktivní | neaktivní |
| Inositol-2-P | Km = 3,3mM | 5% aktivita |
| pH optimum | 2,5 a 5,5 | 2,5 a 5,5 |
| Tepl. optimum (°C) | 50 | 58 |
| molekulová hmotnost | ||
| (kDa) # * | 85 | 85 a 100 |
| molekulová hmotnost | ||
| (neglykosylovaná)# £ | 56,5 | 61,7 |
| iz§lektrický bod4λ* | 5,0-5,4 | 4,5 |
Aktivitu fytázy měřil Ullah spíše při 58°C než při 37°C. Jednotka aktivity fytázy je definovaná jako množství enzymu, které uvolni anorganický fosfor z 1,5 mM fytátu sodného rychlostí 1 pmol/min při 37°C a pH 5,5. Pro srovnání fermentačních výtěžků a specifických aktivit byly aktivity, zjištěné Ullahem, korigovány s ohledem na teplotní rozdíl* Korekce je založena na rozdílu v aktivitě fytázy, měřené při 37°C a při 58°C, jak ukazuje Ullah (1988b) v tabulce III.
Molekulová hmotnost určená na SDS-PAGE. & & $ S tanoveno na IcP-PAGE,
Prc izolaci genu, kočujícího fytázu byla sestavena první sada .oligonukleotidových prób výše popsanou metodou (obr, 2A). Sestavení těchto prób ja založeno na údajích o sekvenci aminokyselin. Pro kontrolu celého tohoto postupu byly podobná kroky učiněny při izolaci genu, kódujícího kyselou fosfatázu, př tomto proteinu publik Siochem. 17, 397-422) i čemž bylo využito údajů, které o ováli Ullah a Cummins (19S7) Prap, . Odpovídající gen pro kyselou rosí tážu byl izolován situace odlišná. I bez obtíží. Avšak v případe fytázy byla když bylo provedeno mnoho.pokusů, ve kte rýcn byly použity próby, odvozené sekve^,ncí M-koncových aminokyselin, nepodařilo sa izolovat žádná fragmenty gemomu DNA nabo klony z genomové knihovny, která by mohly být pozitivně identifikovány, že obsahují geny, kódující fytáPro vyřešeni tohoto problému byla purifikovaná fytáza štěpena CNBr, Vzniklé proteinové fragmenty byly izolovány.
U těchto fragmentů byla stanovena sekvence N-koncových aminokyselin (obr. 13). Na základě těchto nových údajů byly sestaveny oligonukleotidové próbv (obr. 23). Tyto nové oligonukleotidové próby se překvapivě daly ztotožnit se specifickými fragmenty DNA a byly vhodné k jednoznačné identifikaci klonů z genomové knihovny. Nebyla pozorována žádná křížová hybridizace mezi novými klony nebo fragmenty DNA, které z nich byly izolovány a první sadou oligonukleotidových prób nebo klony, která byly izolovány s použitím táto první sady prób.
Tato druhá sada prób se může také použít k identifikaci sekvencí, kódujících významné fytázy.
Nove izolované klony byly použity jako próby v hybridi zadch Northern blot. Diskrétní mRNA mohla být detagována pouze, když mRNA byla izolována z mycelía, produkt jícího fytázu. Když byla RNA získána z mycelia, neprodukujícího fytázu, nabyl zjištěn žádný hybridizační signál. Teoretickým výtěžekem mRNA, o hmotnosti 1 SGOb, js protein s maximální molekulovou hmotností okolo 50 kDa. Tato hodnota odpovídá molekulové hmotnosti, která byla stanovena pro neglykosylovaný protein a molekulové hmotnosti proteinu, která byla odvozena ze sekvence ONA.
Kromě toho, když byly tyto proby transformací zavedeny do houbové buňky, projevil se vzrůst fytázové aktivity. To__ nezvratně ukazuje, že byla skutečně izolována nuklaotidova^ ná sekvence, kódující fytázu. Sekvence aminokyselin, které byly stanoveny pro purifikovaný fytázový enzym a pro ONBr fragmenty, z něj získané, se shodují s aminokyselinovou sekvencí, která byla stanovena pro klonovaný gen. Sekvence nukleotidů a odvozená sekvence aminokyselin jsou uvedeny na obrázcích 6 a 8 a dále popisují klonovanou sekvenci, která kóduje fytázu.
Izolace nukleotidové sekvenca, která kóduje fytázu, umožňuje ekonomickou produkci fytázy v průmyslovém měřítku pomocí aplikace moderních technik rekombinace DNA jako jsou genová amplifikace, výměna regulátorových elementů jako např. promotorů, sekračních signálů nebo kombinací těchto metod.
Proto tento vynález také zahrnuje transformovaného hosiitela, který je schopný účinné exprese vysokých úrovni peptidů nebo proteinů s fytázovou aktivitou a popřípadě také účinné exprese kyselá fosfatázy, Zajímavými hostiteli, jsou buňky, selektované z vláknitých hub rodu Aspergillus, Trichoderma, Mccor a Penicillium, kvasinek rodu Kluyveromyces a Saccharomyces a bakterií rodu Sacillus. Přednostně je selektován ten hostitel, který je schopen efektivní sekrece svých endogenních proteinů.
Zvláště ména niger, f ;ajímavé jsou průmyslové kmeny Aspergillus, zejcuum, avvamori nebo oryzae. Nebo se mohou použít
Trichoderma reesei, Mucor miehei, Kluyveromyces lactis, Saccharomyces cerevisiae, 3acillus subtilis nebo Bacillus licheniformis.
Konstrukt pro expresi bude obsahovat sekvence nukleotidů, které kódují požadovaný enzymový produkt, jenž má být exprimován. Obvykla obsahuje signální sekvenci, která funguje v hostitelské buňce a umožňuje sekreci produktu, peptidu nebo proteinu.
Podle tohoto vynálezu se mohou použít různé signální sekvence. Může se použit signální sekvence, která je homolog.ní s klonovanou nuklaotidovou sekvencí, jež má být přepsá na. Nebo se může použít signální sekvence, která je homologní nebo částečné homologní se signální sekvencí genu v cílovém lokusu štěpu, aby ss usnadnila homologní rekombinace Dále se také mohou použít signální sekvence, které byly sestaveny pro umožnění lepší sekrece ze selektovaných hostitelských buněk. Například viz Von Heyne (1983) Eur. 3. Biochem. 133, 17-21; a Perlman a Halverson (1983) 3. Mol. Biol. 167, 391-409. Sekvence DNA, kódující signální sekvenci, může být připojena přímo pomocí sekvence, která kóduje proces signálu (rozštěpení rozpoznává čího místa) k sekvenci kódující požadovaný protein. Nebo může být připojena pomocí krátkého můstku, obvykla méně než 10 kodonů.
Preferované signální sekvence pro sekreci, použité podle tohoto vynálezu, jsou signální sekvence homologní s klonovanou nuklaotidovou sekvencí, která má být exprimována. Dála jsou to signální sekvence pro glukoamylazu (AG) obsahující 13 aminokyselin a signální sekvence nro glukoamyla3U (AG), obsahující 24 aminokyselin, přičemž tyto dvě sekvence jsou bud homologní nebo heterologní s nuklaotidovou sekvencí, která má být exprimována.
Produkt exprese nebo významná, sekvence nukleotidů může být DNA, která je homologní nebe heterologní e expresním hostitelem.
Homologní DMA je zde definována jako DMA, která oochází ze stejného rodu. Mapř. Aspergillus sa transformuje DMA z Aspergillus. Takto ja možná, zlepšit již existující vlastnosti houbového rodu bez zavedení nových vlastností, dříve v tomto rodu nepřítomných.
Hetarologní DMA je definována jako DMA, která pochází z více než jednoho rodu t.j. jak vyplývá z příkladu, uve daného v předchozím odstavci, DNA, pocházející z jiného rodu než Aspergillus, která se dála exprimuje v Aspergillu.
Mukleotidovými sekvencemi, kódujícími fytázovou aktivitu, jsou přednostně sekvence získané z houbového zdroje. Více ceněné jsou nuklaotidové sekvence, kódující fytázu, které byly získány z rodu Aspergillus. Nejvíce ceněná sekvence jsou získané z druhů Aspergillus ficuum nebo Aspergil lus nigar.
Oblast od 5*k počátku otevřené konstrukce pro čtsní v nuklaotidové sekvenci, která ja pro vynález významná, obs huja ragulační úsek pro iniciaci transkripce (nebo promotor Kterýkoliv funkční úsek v hostitelské buňce, včetně promoto ru, který je homologní s nukleotidovou sekvencí, kódující fytázu, jež má být exprimována, může být využit. Avšak větě nou je využitý úsek homologní s oblastí cílového lokusu. Uvedené skutečnosti mají vliv na substituci produktu express cílového lokusu, za požadovaný produkt exprase. Pokud úroveň exprese a sekrece proteinu, kódujícího cílový lokus._ bude zajišťovat sfektivní produkcí, bude obvykle regulační úsek pro iniciaci transkripce považován za uspokojivý.
Avšak v některých případech ja požadována vyšší úroveň tran kripcs než má gen cílového lokusu. Někdy také chceme mít induktivní exoresi, kterou způsobuje zvláštní indukční činí lo, 7 těchto případech sa používá regulační úsek pro inicia ci transkripce, který je odlišný od úseku v genu cílového lokusu. De znám velký počet regulačních úseků pro iniciaci transkripce, které jeou funkční ve vláknitých houbách. Tytc 'lukoamylázu íAG'. houbovou úseky js smvlázu, :-u z genu, kvselou f :ere xocuj w Otážu, 3a?DH, '·, AmdS, AlcA, AldA, η H2A, 'Π,
33ÍOU 0Γ0 zscpsniciiin N syntetasu, ns *s .«'Πr 11 s -.··? «Ίri Sn« er*' }
Cílovým lokusem je .nejlépe cen s vysekou úrovni express protsinu t.j. gen, který způsobí, Ž3 koncentrace přečtenaho produktu na konci ?arm^tacního procesu ja alespoň 0,1 g/1. Trvání tohoto procesu se múza manit mimo jiné v závislosti na požadovaném proteinovém produktu. Příkladem takového genu je gen, kódující glukoamylázu (AG)-r Jiné zajímavé geny jsou pro houbovou ot-amylázu, kyselou fosfatázu, protsazu, kyselou proteázu, lipázu, fytázu a csllobiohydrolázu. Zvláště ceněnými cílovými lokusy jsou gen pro glukoamylázu z A. nigar, gen pro houbovou amylasu z A, oryzae, geny pro cellobiohydrolasu z T. reesei, gen prc kyselou proteasu z Mucor miehsi, gen pro laktasu z Kluyveromyces lactis nebo gen pro invsrtasu z Saccharomyces carevisiae.
Regulační usek pro terminaci transkripce může být z požadovaného genu z cílového lokusu nebo z jiné vhodné sekvence. Když konstrukt obsahuje další důležité sekvence za (ve směru transkripce) požadovaným genem, tak by regulační usek pro terminaci transkripce, v případě že je horaologni s cílovým lokusam, měl být podstatně menší než homologní zdvojený úsek.
Obvykle se používá selekční markér, který může být částí konstrukce pro expresi nebo může být oddělán od tohoto konstruktu, tak aby sa mohl integrovat na odlišné místo než zaujímá požadovaný gen. Frotože rekombinantní molekuly podle vynálezu se s výhodou transformují do hostitelského kmene, kterého se může použít pro průmyslovou výrobu, selekční markéry pro sledování transformace jsou dominantní selekční markéry, což znamená, že do hostitelského kmene nesmějí být zavedeny žádné mutace, aby sa mohlo těchto selekčních markérů použit. Příkladem jsou markéry, které umožňují transforman ům růst na definovaných zdrojích živin (např. gen amdS z A nidulans umožňuje transrormantům z A. r.iger růst na aestamidu jako jediném zdroji dusíku) nebo markéry která udě19 luji razíš tencí vůči an rezistenci k plsomycinu tibiotikůra (např. gen bia nebo gen hph způsobuje raz cůsobuje istanci k hygromycinu 3).
Selekční geny mají své vlastní regulační úseky pro iniciaci a terrainaci transkripce a translace, která dovoluj nezávislou expresi markéru, Sak bylo popsáno dříve, je znám velký počet regulačních úseků pro iniciaci transkripce a ty mohou být použity va spojení s markerovýrai geny. Když selekční markéry způsobují rezistenci k antibiotikům, koncentrace antibiotika pro selekci se mění v závislosti na antibiotiku. Obvykle se pohybuje asi v rozmezí od 30 do 300
Různé sekvence mohou být připojeny známými technikami jako je restrikce, připojení komplementárních restrikčních míst a ligace, zakončeni natupo vyplněním překryvů a ligace natupo,
Sal 31 resakce, oprava primerů, mutaganeza in vitro a podob ně. Když je to vhodné, mohou sa použít polylinkery a adapte ry, které ae mohou zavést nebo odstranit známými technikami aby se usnadnilo sestavení, konstruktu pro axpresi. V každé stupni syntézy konstruktu se fragment může klonovat, analyzovat pomocí rastrikčních enzymů, sekvenovat nebo hybridizovat a podobně. Pro klonování ja použitelný velký počat vektorů, ala přesná volba nemá rozhodující význam oři prová dění tohoto vynálezu. Normálně sa klonování provádí v Ξ, coli.
ZLdvojené úseky mohou obs_ahovat alaspon část otevřené čtené konstrukce cílového lokusu, zejména signální sekvenci regulační úseky pro 5*a 3* oblasti genu cílového lokusu. Ta ké mohou být umístěny za regulační úseky. Normálně zdvojený úsek obsahuje alespoň 1QO párů bází, obvykla alespoň 2QC bp a může obsahovat 500 bp nebe více. zdvojené úseky se voli tak, aby roztrhly cílový gen a zabránily jeho expresi.
Tohoto může být dosaženo vložením kazety pro expresi /obsahující sekvenci nukleotidů, která má být přepsána a popřípadě obsahující přídavné prvky jako signální sekvenci, sekvenci regulačního úseku pro iniciaci transkripce a/nebo sekvenci regulačního úseku pro terminaci transkripce/ do otevřené čtené konstrukce blízko úseku 5*. Vložení se provádí substitucí celého cílového genu nebo jeho .části za konstrukt pro expresi nebo intervencí konstruktu pro expresi mezi regulačním úsekem pro iniciaci transkripce v cílovém lokusu a otevřenou čtenou konstrukcí. 3ak již bylo řece no, když je regulační úsek pro terminaci homologní s úsekem v cílovém lokusu, 3'zdvojený úsek by mel být podstatné větší než regulační úsek pro terminaci, přítomný v konstruktu.
Tento vynález také poskytuje startovací materiál pro konstrukci fytáz druhá generace t.j. fytáz s vlastnostmi, které se liší od vlastností enzymů, které zde byly izolovány. Fytázy druhé generace mohou mít změněné teplotní nebo oH optimum, změněnou specifickou aktivitu nebo afinitu ke · svým substrátům nebo mají změněnou jakoukoliv jinou kvalitativní vlastnost, která způsobuje, že enzym je vhodnější pro aplikaci v daném procesu. Ξ. coli je nejlepŠí hostitel pro takovou mutagerezi (např. pro mutagenezi cílenou na určité místo). Protože u E, coli chybí štěpící proces pro odstranění intronů, která by mohly být ve fytázovém genu přítomné, je klon cDNA pro fytázu zvolanou sekvencí, která se má přepsat v Ξ. coli. Tato sekvence cDNA může být snadno mutována va ný jako pomoci běžně známých postupů. Fo mutaci může být rautogen zaveden do žádaných konstruktů pro expresi.
Konstrukt může být transformaci včleněn do hostitele klonující vektor buň lineární nebo cirkulární nebo může být z klonujícího vektoru odstraněn, podle přání. Klonujícím vektorem ja nejlépe plazmid. Flazmid sa obvykle linearizuja v rozsahu asi 1 kop genu, o který jde. Přednostně sa konstrukt pro expresi při produkci fytáz oostupam podle tohoto vynálezu začleňuje do genomu hostitele vybraného pro extraO — «
- 21 Pro transformaci vláknitých hub existuje velké množství technik. Tyto tachniky zahrnují fúzi nabo transformaci protopiastů, elaktroporaci a mieroprojectile firing dc buněk, Sylo zjištěno, ža transformace protopiastů je úspěšná a může být s výhodou použita.
Myceliúm houbového kmene, se kterým pracujeme, ja nejprve převedeno na protoplasty enzymatickým štěpením buněčné stěny v přítomnosti osmotického stabilizátoru jako např. KC1 nebo sorbitolu. Zadržení ONA v protoplastach je způsobeno přídavkem CaC^ a koncentrovaného roztoku polyetbylenjglykolu. Polyathylenglykol způsobuje agregaci protopiastů, při níž dochází k transformaci DNA v agregátech a k zadržení ONA v protoplastech. Dále jsou protoplasty nechány regenerovat na tuhém médiu, které obsahuje osmotický stabilizátor a, když je to vhodné, selekční činidlo, pcoti kterému je zakódována rezistence pomocí transformující ONA.
Po.selekci transformantů může být přítomnost požadovaného genu určena různými způsoby, když je produkt exprese heterologní k hostiteli, může sa exprese požadovaného genu zjistit pomocí protilátek. Nebo sa může použít metody Southern nabo Northern blot pro určení přítomnosti integrovaného genu nebo jeho transkripčního produktu.
Amplifikace sekvence nukleotidů nabo konstruktu pro expresi může být dosaženo standartními postupy jako je zavedení mnohonásobných kopií konstruktu do transformujícího vektoru nebo použití genu amdS jako selekčního markéru např. Wsinans et al. (1335) Currant Genetics, 3S1-3S3). Sekvence ONA, ktsrá má být rozšířena, může obsahovat ONA, která je bu3 homologní nebo heterologní k hostiteli pro exoresi, jak bylo diskutováno Wše,
CT. 'J « /iC ít C LI 5 r 2 nyl ti 2 potem mohou nechat růst toužit nízké kemoenoneoe ylsulfonyl ', Obvvkls vhodném nnooo tore prcc·; sčo-makrcglcbuliny, ; ato koncentrace v rozmezí oo pg/ml cc 1 mg/ml. Gen (geny) pre proteázu mohou být : tivovány, aby 33 zabránilo degradaci nabo aby 33 sniži' dscradaca oožadovaného oroteinu.
Trans formanty ss aohou nechat růst bud ve vsádkovém nabo v kontinuálním fermantoru, přičemž ss izoluje živná prostředí a požadovaný produkt ss získává extrakcí.
Pro čištění produktu sa můža použit, je-li to nezbytná, různých metod jako js chromatografie (např. HPLC), extrakce mezi dvě rozpouštědla, elektroforáza, kombinace uvedených metod a oodobně.
Předmětem vynálezu ja také způsob dalšího zpracování fermentačního média. Při tomto způsobu se fermsntační médium (popřípadě purifikované) přefiltruje, dála následuje druhů filtrace pro odstranění mikroorganismů a potom ss přefiltrovaný roztok zahustí. Takto získaný kapalný koncentrát se může zpracovat následujícími způsoby na různé přípravky:
a) Fytáza a jiné proteiny mohou být vysráženy z kapalného koncentrátu přidáváním acetonu až na koncentraci SC T obj. za stálého míchání. Precipitát se vysuší za vakua při 35°C. enzymový produkt se může použít pro další aplikace po rozemletí na suchý prásek. Výtěžnost ja okolo 90 %.
b) Kapalný koncentrát sa může sušit rozprašováním za použití obvyklých způsobů rozprašovací ho sušení. Výtěžnost se pohybuje od SO do 99 %,
c) Kapalný koncentrát se může smísit s nosičovými materiály např. s pšeničnými otrubami. Takto získaná směs se suší v rozprašovací věžové sušárně nebo v sušárně s fluidním ložem.
d) Kapalný koncentrát sa může např. přídavkem sorbitolu, Dále sa io např. kyselina benzoová, aby se osmoticky stabilizovat přidá konzervační činíczabránilo mikrobiální kontaminaci.
Všechny čtyři pří krmivových směsí pravky se mohou prodávat výrobcům , jiným distributorům a farmářům.
remixů
Zde uvedené příklady slouží ilustraci a nejsou v žádném směru zamýšlené jako omezení rozsahu tohoto vynálezu. Odborníkům v tomto oboru bude jasné, že genu pro fytázu podle vynálezu se může použít při heterolognich hybridizačních pokusech, zaměřených na izolaci genů, které kódují fytázu, z jiných mikroorganismů.
Příklady provedení vynálezu
Přiklad 1
Fermentace A. ficuum NRRL 3135
Aspergillus ficuum kmen NRRL 3135 byl získán z Northern Region Research Lab, USDA, 1815 North University Street, Peo ria, Illinois, USA. Preparáty spor byly připraveny pomoci standardních postupů.
Spory a následně buňky byly převedeny sérií vsádkových fermentací v Erlenmeyerových baňkách do 10 1 fermentoru. Po nárůstu ve vsádkové kultivaci byl obsah tohoto fermentoru použit jako inokulum pro finální vsádkovou fermentací v obje mu 500 1.
Použité médium obsahovalo: 91 g/1 kukuřičného škrobu (BDH Chemicals Ltd.)} 38 g/1 glukóza.H20; 0,6 g/1 MgSO^. 7H20j 0,6 g/1 KClj 0,2 g/1 FeSo4.7H2O a 12 g/1 KNOj. pH bylo udržováno na hodnotě 4,6 £ 0,3 automatickou titraci bud 4N NaOH nebo 4N H2S04.
Buňky rostly při 28°C za automatické regulace koncentra — c/ ce rozpuštěného kyslíku, která byla udržována na 25 /0 nasycení vzduchem. Produkce fytázy dosáhla maximální úrovně 5 10 U/ml po 10 dnech fermentace.
Příklad 2
Purifikace a charakterizace fytázy z A. ficuum
A. Stanoveni aktivity fytázy
100 pl fitrátu média (zředěného je-li to nutné) nebo 100 ^1 supernatantu nebo 100 jul demineralizované vody při slepém pokusu se přidá k inkubačni směsi, která má následující složení:
- 0,25 M octanu sodného, pufr pH 5,5 nebo
- glycin - HCl, pufr pH 2,5
- lmM sodné soli kyseliny fytové
- demineralizovaná voda do 900 /jl
Výsledná směs se 30 min inkubuje při 37°C. Reakce se zastaví přidáním 1 ml 10% TCA (kyselina trichloroctová).
Po skončení reakce se přidá 2 ml reakčního činidla 3,66 g FeS04.7H20 v 50 ml roztoku molybdenanu amonného 1(2,5 g ^^4^6^o7O24*^2O a θ ^2θθ4* zředěné na 250 ml deraineralizovanou vodou.
Intenzita modrého zbarvení se měří spektrofotometricky při 750 nm. Naměřené hodnoty ukazují množství uvolněného fosfátu, které se odečte z kalibrační křivky pro fosfát v koncentračním rozmezí 0-1 mmol/1.
Barvivo pro fosfatázu
Komponenty s fosfatázovou aktivitou byly stanoveny pomoci izoelektrickó fokuzace s použitím obvyklého barviva pro fosfatázu. Gel byl inkubován s roztokem Jl - naftylfosfátu (Sigma, lg/1) a soli Fast Garnet GBC (Sigma, 2g/l) v pufru (0,6 M acetát sodný, pH 5,5). Reakce, jejímž výsledkem je vznik černého precipitátu, se zastaví bu3 směsí methanol:kyselina octová (30 : 10 % obj.) nebo protřepáváním s des- 25 tilovanou vodou, jestliže se dále požaduje protein s fytázovou aktivitou.
B, Purifikace fytázy z A. ficuum
Fytáza z kultivačního média kmene A. ficuum NRRL 3135 se čistí až do homogenního stavu. Nejprve se médium zbaví filtraci mikroorganismů. Výsledný filtrát se dále koncentruje v ultrafiltrační jednotce Filtron s filtry oddělujícími produkt o molekulové hmotnosti 30 kD. pH a iontová síla vzorku se upraví pro purifikační proces promytím vzorku pufrem 10 mM acetát sodný pH 4,5. V tomto ultrafiltračním procesu se vzorek přibližně 20 krát zkoncentruje.
Potom se vzorek nastříkne na měnič kationtů (S-Sepharose Fast-Flow v koloně HR 16/10 20 ml, oboji získáno od firmy Pharmacia v systému Waters Preparative 650 Advanced Protein Purification System. Navázané proteiny se eluují gradientem chloridu sodného od 0 do 1 M v pufru z octanu sodného. Fytáza se eluuje přibližně při koncentraci 250 mM NaCl. Frakce s fytázovou aktivitou se spoji, zkoncentrují a ultrafiltrací odsolí. Získaný roztok se nastříkne na měnič amiontŮ (Qy Sepharose Fast-Flow v koloně HR 16/10 20 ml, Pharmacia). Proteiny se opět eluují gradientem chloridu sodného od 0 do 1 M v pufru z octanu sodného, jak je popsáno výše. Fytáza se eluuje z této kolony přibližně při 200 mM NaCl.
Výsledkem těchto purifikačních kroků je τϊέείβδηβ vyčištěná fytáza o specifické aktivitě přibližně 40-50 U/rag proteinu. To značí 25-násobné vyčištění.
Analýza čistoty této částečně vyčištěné fytázy ukázala, ža je přítomna hlavní nečistota o molekulové hmotnosti při laLižně 100 kDa (obr. IB, sekvence E). Při izoelektrické fo-kuzaci se zjistilo, že je přítomno množství enzymů s fosfatázovou aktivitou včetně 3-4 subforem fytázy (jejich izoelektrické body se pohybují od 5,0 do 5,4) (obr. IA, sekvence A a B).
Aby se získal homogenní preparát fytázy, byla provedena další dvojnásobná purifikace a následná separace složek částečně vyčištěné fytázy pomocí izoelektrické fokuzace v systému LKB Multiphor na deskách Ampholine PAG (pH rozsah 4 - 6,5). Proteiny s fosfatázovou aktivitou (včetně fytázy) byly stanoveny pomoci obecného postupu pro barvení fosfatázy, který je popsán výše. Požadované pásy byly vyříznuty z gelu. Aktivní protein byl eluován 16 h inkubací gelových proužků v pufru tvořeném 10 mM octanem sodným, pH 5,5. Proteinové frakce byly analyzovány pomocí postupu pro stanovení specifické aktivity fytázy, který je popsán v příkladu 2. Tímto způsobem byly rozlišeny fytázové frakce od jiných kyselýchfosfatáz. Konečný faktor purifikacs pro fytázu byl přibliž--ně 60 (specifická aktivita finálního preparátu 100 U/mg proteinu). V tomto posledním purifikačnim kroku je také možné izolovat různé subformy fytázy (obr. IA, sekvence A a B).
Pro efektivní purifikační postup byly připraveny monoklonálni protilátky proti fytáze z A. ficuum. Protilátka se naváže na gel Sepharose 4B, aktivovaný bromkyanem (5 mg/ml gelu). Této matrice se použije v imunoafinitní koloně. Matrice je iSchopná navázat přibližně 1 mg fytázy na ml. Fytáza se může z afinitní kolony eluovat pufrem (100 mM gly-.....
cin-HCl, 500 mM NaCl) při pH 2,5 bez jakékoliv ztráty aktivity. Tento postup sa může použít pro izolaci homogenní fytázy ze surového filtrátu média. Izolace proběhne v jediném stupni s 80 % výtěžností a 60 násobnou purifikací.
C. Deglykosylace fytázy
Fytáza z A, ficuum (70 pg proteinu) byla inkubována s 2,5 U N-Glycanase (Genzyme) ' v pufru tvořeném 0,2 M fosforečnanem sodným pH 8,6 a 10 mM 1,10 - fenantrolinem v celkovém objemu 30 pl.
Po 16 h inkubaci při 37°C byl zkoumán rozsah deglykosylace pomocí elektroforézy (Phast System Pharmacia). Bylo zjištěno, že zdánlivá molekulová hmotnost fytázy se snížila z 85 kDa na přibližně 56,5 kDa. Při barvení cukrů podle
Schiffa kyselinou jodistou, při němž byla fytáza identifikována jako glykoprotein, se nepodařilo stanovit žádný zbytek cukru, navázaný na protein. Kompletní odstranění cukrů bylo dále dokázáno citlivou lectin-blotting metodou.
Nativní a deglykosylovaná fytáza (obě v množství 1,5 pg) byly naneseny na standardní gel SDS-PAGE a elektroforeticky převáděny po dobu 16 h při 30 V na membránu PVDF (iš&bilon, Millipore) v pufru 25mM TRIS-glycin pH 8,3 a v methanolu (20 % obj.).
Membrána byla dále inkubována s hovězím sérum albuminem (10 g/1) ve fyziologickém roztoku, pufrovaném fosforečnanovým pufrem a s konkavalin A-peroxidázou. (Sigma, 10 pg/ml ve fyziologickém roztoku, pufrovaném fosforečni^ýra pufrem). Peroxidáza byla potom obarvena 4-chloro-l-naftolem (Sigma).
Ani touto citlivou metodou se nepodařilo stanovit žádné zbytky cukrů, navázané na deglykosylovanou fytázu.
Po deglykosylaci fytáza zcela ztratila svou aktivitu, možná vzhledem k agregaci enzymu.
i
Příklad 3
Stanovení sekvence aminokyselin fytázy a sestavení oligonukleotidových prób
A. Stanovení N-koncové sekvence aminokyselin
Fytáza byla elektroforeticky převedena z SDS-PAGE nebo z IEF-PAGE na PVDF blotting membránu (Iramobilon, Millipore). Elektroblotting byl prováděn v pufru 10 mM CAPS (3-cyklohexylamin-propansulfonová kyselina) pH 11,0 s methanolem (10 % obj.) po dobu 16 h při 30 V a 4°C.
Protein byl lokalizován obarvením modři Coomassie Brilliant Blue. Obarvený pás byl vyříznut, dále odbarven v raethanolu a podroben sekvenování v plynné fázi. Postup byl prová28 děn několikrát za použiti několika jednotlivých prap Získané výsledky udává obr. 1 A (sakvanca A až.D).
radů.
3yla taká stanovena sakvanca aminokyselin rpro protsin o molekulové hmotnosti lOOkDa, který ja přítomný v surových preparátech. Údaje, získané pro tanto protsin, udává obr.
C. Tato sakvanca vykazuje značnou podobnost s kyselou fos fatázou, která byla izolována z Aspargillus nigsr (MacRae at al. (1988) Gena 71, 339-348).
3. Stanovaní vnitřních sekvencí aminokysalin
Fragmentace proteinu bromkyanem
Vyčištěná homogenní fytáza byla převedena do 100 mM NaHCO-. ultrafiltrací (Microconcantrator Centricon 30, AmiO con). Dála byl protain lyofilizován, rozpuštěn v kyselině trifluoroctové (70% opj.) a inkubová.n S h s přibližně 300 násobným molárnira přebytkem bromkyanu. Reakce byla ukončena zředěním směsi vodou. Získané fragmenty byly opět lyofilizovány. Potom byl vzorek rozpuštěn v pufru pro vzorky SDSPAGE, obsahujícím DTT (dithiothraitol). Rozsah fragmantaca byl stanoven pomoci PAGE, Analytické PAGE bylo provedeno ve Pharmacia Phast-System unit, na 20 % SDS-PAGE gelech.
Gely byly upraveny tak, aby tvořily kontinuální pufrovací systém pro zlapŠení separaca malých peptidů (podle návodu), Paptidy byly stanovaný pomocí techniky barvení stříbram, zn mé v tomto oboru. Barvením modří Coomassie 3rilliant 3lue se totiž nepodařilo stanovit nejmensí peptid. Výsledkem tohoto postupu js kompletní degradace fytázy na lekulovými hmotnostmi menšími než 2,5 kOa, 33 paptidy s mokOa, 57 kOa a 20 kOa.
sakvancvání v oivnné fázi ~ - AP ' -n popsáno v ocnagar a Oagow 372, Následoval elaktroblotPaptidy byly izolovány pro pomocí SDS-Tricina-PAGE jak ja (1987) Anal. Siochem, 153, 338ting, jak ja popsáno výše.
N-konec 57 kDa fragmentu ia stejný jako N-konec fytázy, kterou stanovil Ullah (1938 o, viz výše), s výjimkou prvních čtyř aminokyselin, které chybějí (obr. IA, sekvence 0). N-konca sekvencí 2,5 kDa a 33 kDa peptidů jsou uvedeny na obr. 13 jako sekvence A a 3,
0. Oligonukleotidové oróbv
Oligonuklstidové proby byly sestaveny na základě sekve cí aminokyselin, uvedených na obr. IA a 13. Byly připraveny za použití DNA syntetizátoru Applied Siosystems ASI 3303 □NA synthesizer. Tyto oligonukleotidy jsou uvedeny na obr. 2A a A3.
Příklad 4
Hybridizace genomových bloků a genomových knihoven s první sadou oligonukleotidových prób
Gencmová DNA z A. ficuum byla izolována mletím mycelia v kapalném dusíku za použití standardních posžupů např, Yelton e další (1984) Proč. Nati. Acad. Sci. _ U.3.A. 1470-1474), Genomová knihovna byla zkonstruována v bakterie fágovém vektoru lambda 8MBL3 za použití neúplného štěpu SauSA chromoscmální DNA z A, ficuum NRRL 3135 podle standardních technik (např, Maniatis a další, (1982) Molecuiar cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory
New York. až 70 krát skyt plaků loženým fr
Takto vytvořená genomová knihovna obsahovala SO genom A. ficuum.-Knihovna byla testována na výbez inzertu, který by vznikl hybridizaci s přiagmantam lambda 3MBL3. 3ylo pozorováno, že s prcbou lambda 3MSL5 hybriaizuje méně ne inzertu činila 13 až 17 kb.
plaků.
ílzkos
Aby se zjistili podmínky a proby, které jsou vhodné oro sereaning genomová knihovny, byla genomová DMA rozštěpe na několika restrikčními enzymy. Dále byla separována na agarosových gelech a rozdělena na bloky na Genescrean plus podle pokynů výrobce. Sloky byly hybridizovány se všemi oligonukleotidcvými próbami. Hybridizace byla prováděna př: různě ostrých podmínkách (3 x SSC, 40 až 60°C pro hybridiz; ci; více než 0,2 x SSC, 65°C pro promývání). Pro scraening genomové knihovny byly vybrány próby 1063 a 1024 (obr. 2A) přestože nebyly zjištěny žádné společné fragmenty ONA, kte· rs by specificky hybridizovely s oběma próbami. Próba 1025 (obr. 3) pro kyselou fosfatázu dává specifický a diskrétní hybridizační signál, a proto byla tato próba vybrána pro screening genomové knihovny pro gen kyselé fosfatázy.
Hybridizační plaky byly zjištěny v genomové knihovně při použití všech tří prób. Hybridizační signál, odpovídej cí próbě 1025 (kyselá fosfatáza) byl silný a raprodukovate ný. Při použití prób 1024 a 1063 (fytáza) byly pozorovány hybridizační signály různé intenzity. Mezi dvěma sadami ne byla pozorována žádná křížová hybridizace. Všechny tři série plaků byly opět podrobeny scrasningu a DNA byla izolována z osmi jednotlivých pozitivních hybridizačních plaků (Maniatis a další, viz výše). V každé sérii mohou být urče klony, které obsahují identická hybridizační fragnanty.
To znamená, že inzerty řečených klonů jsou příbuzné a prav podobně překrývají stejnou oblast genomové DNA. Opět sa na uxa křížová hvoridizai irzz tro iprocy i 'r.oy o pri pouzztz ovou specítí r 'n \ .
oioa grooy, použité pro ízc znanena, z· dvou sérií klonů, ly získány z 'i-koncovo sekvence aminokyselin daného proto nu, byly identifikovány a klonovány odlišné
Vsecnny frz sera blots, obsahujícími m klonů bvl ného a naindukovaného mvcsiia nyorioízovan· PNA, která byla izolována znaukí ny ilou fosfatáz přikla:
oecificke klosta π ne jako vnitrní j,1 kb Sáli, izolovaný z těchto klonů se nybridizovaly výhradně se vzorky s indukovanou mPNA. mRNA, stanovená pomoc
- 31 specifických prób pro kyselou fosfatázu, je dlouhá asi 1800 b, což souhlasí se známou velikostí prot&inu (68 kDa,Ullah a Cummins (1987) Prep. Biochem. 17, 397-422). Neukázala se žádná hybridizace specifických klonů pro fytázu se specifickými mRNA. 2 toho se vyvozuje, že výše popsaná metoda je neúspěšná pro klonováni genu, kódujícího fytázu. Dále z toho vyplývá, že tento neúspěch není způsoben neúspěšností použité metody, protože tato metoda byla s úspěchem použita pro identifikaci genu, který kóduje kyselou fosfatázu. Klon lambda, obsahující gen pro kyselou fosfatázu, byl uložen 24. dubna 1989 v Central Bureau voor Schiramelcultures, Baarn, The Netherlands a bylo mu přiděleno přírůstkové číslo CBS 214(89, Fragment 10 kb BamHI byl izolován z fágu a klonován do pUC19. Tento subklon obsahuje celý gen, kódující kyselou fosfatázu. Subklon pAF 1-1 (obr. 5) byl uložen 24. dubna pod číslem CBS 213,89.
P ř i k 1 a d 5
Izolace genu, kódujícího fytázu, za použití druhé sady oligonukleotidových prób
Próby byly sestaveny s použitím N-koncové sekvence aminokyselin fragmentů, které vznikly štěpením CNBr (obr. 2B, próby 1295, 1296 a 1297). Byly hybridizovány s genomovou DNA, jak je popsáno výše. Vhodnost použití těchto prób pro izolaci genu, kódujícího fytázu, byla opět studována pomocíSouthern hybridizace genomových blotů s těmito próbami. Ten- tokrát bylo možno při použití všech tři prób určit hybridizované fragmenty odpovídajících délek, a to přesto, že próby byly odvozeny z nepřekrývajících se úseků. Nebyla zjištěna žádná hybridizace mezi novou sadou prób a klony, které byly izolovány s použitím první sady prób (přiklad 4). Proto byla genomová knihovna podrobena screeningu při použití všech tří prób v oddělených experimentech. Subsada klonů (lambda AF 201, 219, 241 a 243), izolovaná z každé jednotlivé próby, také hybridizovala s oběma zbývajícími próbami. To znamená, že v tomto případě při použití tří odlišných prób byly klony izolovány z jediné genomové oblasti. Byly učiněny pokusy hybridizovat nově izolované klony s próbami 1024 a 1068. V obou případech nebyla pozorována žádná hybridizace s nově izolovanými klony za podmínek, kdy obě próby byly úspěšně hybridizovány s klony, které byly izolovány při použití těchto prób (viz přiklad 4). To ukazuje, že nově izolované klony nejsou homologní s próbami, které byly odvozeny z N-konce purifikované fytázy.
Klon lambda EMBL-3, který hybridizuje se všemi třemi próbami (1295-1297), byl pojmenován lambda AF 201 (obr. 4) a byl uložen 9. března 1989 pod číslem CBS 155,89.
5,1 kb BamHI fragment z lambda AF201 (klonovaný v pUCl9 a označený pAF 2-3, viz obr. 4), který hybridizuje se všemi třemi oligonukleotidovými próbami, byl použit pró testování Northern blotu. V tomto případě byla zjištěna diskrétní mRNA o velikosti 1800 bází. Tato mRNA byla nalezena pouze v indukovaném myceliu. Podobně výsledky byly získány, když byly jako próby použity oligonukleotidy. Proto byl při použití nové sady prób identifikován společný fragment DNA, který hybridizuje specificky s indukovanou mRNA, Délka této mRNA (1800 b) je dostatečná pro kódování proteinu o velikosti asi 60 kDa, což je asi velikost nsglykosylOvaného enzymu. 2 toho plyne, že izolované fragmenty obsahují alespoň část genu, který kóduje fytázu.
Příklad 6
Izolace indukované a neindukované mRNA
Z literatury je známo, že syntéza fytázy v A. ficuum je podrobena přísné regulaci v závislosti na fosfátu (Han a
Proto regulakloneván
Ca11aghar (1337) ukázka toho, že i ci, může být pokl kýžený gen.
□ , Dndust. Micrcbioi. 1, 235-30Ϊ). žalovaný gen sa podrobuje podobné zdána za podporu tvrzení, že je
Pro izolaci mRNA, která byla syntetizována jaií^produkčnich, tak za neprodukcních podmínek byl pěstován A. ficuum NRRL 3135 následujícím způsobem. Nejprve byly přes noc vypěstovány spory v neproaukčním médiu. Další den bylo sebráno mycelium, promyto sterilní vodou a naočkováno bua do indukčního nebo do neindukčního média. Použité médium obsahovalo (v litru): 20 g kukuřičného škrobu; 7,5 g glukózy; 0,5 g MgS04.7 H20; 0,2 g FaS04.7 H^O; a 7,2 g KM03·
Pro indukci fytázy byly do média přidány více než 2 g/1 coru steep liouor, kdežto nsindukční médium obsahovalo 2 g/1 !<£l-fPQ4. Mycelium bylo pěstováno alespoň 100 hodin. Vzorky byly odebírány ve zvolených intervalech. Produkce fytázy byla sladována stanovením fytázy, způsobem popsaným v příkladu 2A. Deraturovaná mRNA byla oddělena elaktroforézou a blafována na Genesereen plus, 31otv byly hvbridizovány s oAFi-d, který byl značen ‘32P nebo s fragmentem 3,1 kb Sáli, izolovaným z pAF 1-1 (kyselá fosfatáza) z příkladu 4. Výsledky ukazuje tabulka 2.
Pozitivní hybridizace specifického fragmentu fytázy
5.1 kb 3am Hl a specifického fragmentu kyselé fosfatázy
3.1 kb Sáli s izoiavanou mRNA se dá pozorovat pouze, když se buňky pěstují za podmínek, známých pro indukci syntézy fytázy a kyselých fosfatáz. Σ těchto výsledků vyvozujeme, že izolované geny podléhají regulaci, jak bylo očekáváno pro fytázu a kysele fosfatázy.
Tabulka
Hybridizace •gmentu fytázy kysele fosfát tra tu
Northern blotů s použitím specifického
5,1 kb 3amHZ (A) nebo specifického fragmenázy 3,1 kb 3a12 (3) jako próby; + znamená /tážu nsoo 1800 b mRNA pro ‘'fZár.R byla stanovena ve vzorcích, odebraných po 24 h: indukované kultury mají 10 krát větší aktivitu fytázy nsz naindukované kultury.
ořitomnost 1500 b mnNA or kyselou fosfatázu. Relativní aktivita '·./·*· «τ\/ κ·>
Doba po očkování (h) indukováno
Naindukováno
Příklad 7
Důkaz skutečnosti, še klonovaný gen ja genem pro fytázu
Pro získání definitivního důkazu o úspěšnosti izolace genu, kódujícího fytázu a pro studium možnosti zvyšování exprese klonovaného ganu byl gan pro fytázu klonován do vhodného vektoru. Vzniklý vektor byl transformaci přavedan do A, nigar 402 (A7CC 9092). Gan pro fytázu byl izolován z klonu AP201 jako· 10 kb NruZ fragment a klonován do místa Stul vektoru pAN 8-1 (Mgttern, Ϊ.Ξ. a Punt, P.D. (1988) Pungal Genetics Mev/slettar 35, 25). 7anto vektor obsahuja gan bia (způsobující rezistenci k pleomycinu) jako selekční markér. Výsledný konstrukt byl nazván pAP 2S-1 (obr. 4). Dála byl transformován do A. ni v příkladu 9 s výjimkou toho, z ny na minimální médium pro Aspč doplněno 30 pig pleomycinu/ml a notlivé transformanty byly vyčištěny
| r 402 | pOQ | tupém, | popsaným - |
| p ro t o | π Ί | ty byly | naooková- |
| - — T . . | < — | ||
| X X 2. J 3 | » 1 0 | to médi | um oyio - |
| X _ 21 j 0 | /7 “7 J 1 ' | 5 4 aga | rem. Sed- |
| 3Ω7 3 | Í ~0 | lovánv. | Potom b'···— |
~U 33 ...
ircouxcí xy tas no ’/
-y, *<
t -*» . . . ’/Ojií 2’ ιΠίζ'f ,103 0X03 „.3 ' 3 hubící ;A~ 23-1, oroduku^e * ·. W . w W | monoklonální protilátkou, která byla vyvinuta pro fytázu z A, ficuum. Pytázm, reagující c touto monoklonální oroti· látkou, může být eluována z imunoafinitní kolony při pH 2,5. Ukázalo se, že tato fytáza má stejnou molekulovou hmotnost, stupeň deglykosylace, izoelektrický bod a specifickou aktivitu jako fytáza z A. ficuum. Tato zjištění poskytují jasný důkaz skutečnosti, že buňky A. niger 02, transformované pAF 28-1, produkují fytázu, která je skutečně totožná s fytázou z A. ficuum. Podobná produkce nebyla pozorována v žádném jiném typu sledovaných buněk.
Tabulka 3
| Kmen | aktivita fytázy | % aktivity fytázy, |
| která se adsorbovala | ||
| .....— - - - - -.....- - | ..................... -........ ------------------- | - v imunoafinitní kolo- |
| ně | ||
| A. niger 402 | 0,5 | 0 |
| A. niger 402 | ||
| pAF 28-1 | 0,7 | 10 |
| A. niger 402 | _ | |
| - pAN 8-1 | - ........0,5 | ·· -............. 0 - -.................-...... |
Kmeny byly pěstovány za podmínek indukce (přiklad 6). Vzorky byly odebrány po 96 h růstu.
Příklad 8
Charakterizace igenu pro fytázu
Klony lambda, obsahující fytázu byly analyzovány štěpením různými restrikčními enzymy. Mapa oblasti genomu, která obsahuje gen pro fytázu, je uvadena na obr. 4. Definované restrikční fragmenty byly klonovány jako součást kj.ónovacího vektoru pVC 19, jak ukazuje obr. 4.
Oiž bylo ukázáno (přiklad 5), že 5,1 kb BamHI fragment, přítomný v pAF 2-3, obsahuje alespoň část genu pro fytázu.
JO oligonukleotidové próby 1295 a s inzertem Salž z pAF 2-7 (umísna obr. 4). Fróba 129S pravděmezi fragmenty v pAF 2-3 a pAF ukazuji, že sekvence, kódující straně části inzertu Sam HI
Kromě toho bylo ukázáno, že 1297 (obr. 23) hybridizují taní klonů pAF 2 je uvedeno podobně zaujímá místo Sáli 2-7. Výsledky těchto pokusů fytážu, je umístěna na levé v pAF 2-3,
Dále byly v celém rozsahu stanoveny nukleotidové sekv-ei ce inzertů plazmidů pAF 2-3, pAF 2-6 a pAF 2-7 pomocí terminacní řetězové dideoxymetody. (Sanger et al. (1977) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467) a postupů shotgun, ktar popsali Messing a další (1981, Nucl. Acids Ras. 2, 309-321) Dále byly syntetizovány specifické oligonukl^eotidy, Dějích syntéza ja založena na informacích, získaných při procesu sakvenování.
Kompletní sekvence nukleotidů klonů pAF 2-3, pAF 2-6 a pAF 2-7, která zahrnuje chromosomální lokus genu pro fytázu, je uvedena na obr. 6. Grafické zobrazení uvádí obr. 7
Analýza kompletní sekvence na schopnost kódovat daný protein ukázala, že N-koncová sekvence aminokyselin maturovaného proteinu je kódována, počínajíc od nukleotidové pozice 381 /podle Ullaha je kódovací pozice pro N-konec 369/. Dála bylo zjištěno, že N-kcncová sekvence aminokyselin 36 kDa vnitřního peptidového fragmentu ja zakódována na nukleo tidové pozici 1101 (viz obr. 13, sekvence 3). Pro N-koncovou sekvenci aminokyselin 2,5 kOa vnitřního peptidového fragmentu jde o pozici 1548 (viz obr, 13, sekvence A). Otevřená čtená konstrukce končí na nukleotidové pozici 1713
Tato zjištění jasně dokazují, že charakterizovaný chromosomální lokus obsahuje sekvenci DNA, která kóduje fytázu.
Destliže se postupuje směrem proti přepisu u cbromosomální sekvence, kódující maturovaný protein, nelze najít žádný startovací ATG kodón ve čtené konstrukci, která soust dí s otevřenou čtenou konstrukcí maturovaného oroteinu.
Avšak na základe intron-exor. hraničních charaktsrzstzk j;
možno předpokládat, pozicemi 254 a 355, tidové pozici 210 v že intron laži mezi nukleotidovými Potom tedy ATG kodón leží na nukleokonstrukci společně s otevřenou čtenou konstrukcí, která kóduje maturovanou fy t-ázu
Odvozená sekvence aminokyselin tohoto prodloužení N-konca je v dobrém souhlasu s pravidly pro signální sekvenci pro sekreci, která publikoval von Heyna (1933, 5ur. 0. Siochem. 133, 1721).
Pro potvrzení- těchto hypotéz byla izolována cDNA pro fytázu pomocí PCR-amplifikace sa specifickými primery pro fytázu. Také byl izolován celkový komplex mRNA/cDMA, jako matrice, podle postupů, která jsou popsány níže.
Izolace póly A' RNA z Aspergillus ficuum
Veškerá RNA byla izolována z kmene A, ficuum NRRL —tyl psišt&irítys
3135, k t e rý^za ρ o α m i n e k indukce viz příklad S. Suché mycslium bylo zmraženo kapalným dusíkem a rozamleto. Potom byl prášek homogenizován v zařízeni Ultrs-Turrax (plná rychlost po 1 minutu) v 3M LiCl, SM močovině při 0°C a homogenát byl udržován přěs noc při 4°C, jak popsal Auffrey a Rougeon (5ur. 3. Biochem,, 107, 303-314, 1930). Všechna buněčná RNA byla získána po cantrifugaci při 1S OOO g oo 30 minut a dvou následných extrakcích směsí fenol: chloroform: isoamylalkohol (50:48:2). RNA byla srážena ethanolem a rozpuštěna v 1 ml 10 mM TrisHCl (pH 7,4), 0,5 fí SOS. Pro selekci póly A+'byl vzorek s celkovým množstvím RNA zahříván 5 min při SO°C, dála byl upraven 0,5 M NaCl. Potom byl nastřiknut do kolony s oligo (dT) - cslulosou. Po několikerém promytí roztokem, který obsahoval 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,5 fí SOS a Oj 1 M NaCl, byla póly A+ RNA eluováns roztokem 10 mM Tris-HCl oH 7,4 a 0,15 fí SOS.
°říprava komplexu mRNA/cONA
Pro syntézu prvního vlákna cDNA bylo 5 pg póly A~ RNA rozpuštěno v 13,5 pl vody a dála bylo přidáno: 2,5 ul RNasin (30 U(pl); 10 pl pufru, který obsahoval 5G mM Tris-HCl, pH 7,6,' 6 mM MgCl.? a 40 mM KCl; 2 pí 1 M KCl; 5 pl 0,1 Μ OTT;
0,5 pl oligo (dT)^9_i8(2,5 mg/ml); 5 plSmM dNTR-mix; 5 pl 3SA (1 mg/ml) a 2,5 pl Moioney ML'/ reversní transkriptázy (200 U/ml). Směs byla inkubována 30 min při 37°C a reakce byla zastavena přidáním 10 pl 0,2 M EDTA a 50 pl H90. Extrakce byla provedena chloroformem a po centrifajgaci bylo k supernatantu postupně přidáno 110 pl 5 M NH^Ac a 440 pl ethanolu. Komplex mRNA/cDNA byl srážen 30 min v roztoku ledového bezvodého ethanolu. Komplex mRNA/cDNA byl odseparován centrif ugací ♦ Dále byl promyt 70 / ledovým ethanolem a rozpuštěn ve 20 pl Η,-,0.
Klonování fragmentů cDNA pro fytázu
Izolace sekvencí cDNA, kódujících fytázu byla provedena pomocí řetězové polymeracní reakce (?CR) ve dvou fragmentech. Na základě genomové sekvence pro fytázu viz obr. 3 byly sestaveny čtyři syntetické oligonukleotidové primery. Oligo 1: 5 —GGG · i AG. AA ι . f CA, AAA ·A iG«GGC.GiC, t C i ,GCi .Gi i «Ci A— o
Olzgo 2: o —AG i·GAC·GAA.i iu.GíC.CíG.GíG.GAG»A i G · G i G * i CG—3 Oligo 3: 5'-GAG.CAC.CAA.GCT.GAA.GGA.TCC-3*
Oligo 4: o —AAA. C i G. C/aG«Gv,G. i i G. Akj í « w i G ♦ A! i . G i i · i AA· AGG. G ·
Oligo 1 obsahuje sekvenci narkleotidč za ATG startkodc^em, směrem po přepisu, (pozica 210 až 231), připojenou k 5*konci pomocí EcoRI místa. Oligo 2 obsahuje bezprostředně před az i io
L 109'
Sáli místem směrem proti přepisu, (pozice 1 129 nuklaotidovou sekvenci, také připojenou pomoci přídavného EcoRI místa. Oligo 3 obsahuje sekvenci nukleotidů okolo 3am HI mista (pozice 345 až 335). Oligo 4 obsahuje sekvenc: nukleotidů, umístěnou za stopkodónem pro fytázu, směrem 3.c, vecoucz přacisu, (pozice 1390 až 1367), přitojencu pomocí přídavného Pstl místo.
Fetezcvé polymorační reakce sa provádějí podlá předpisu dodavatele ~aq-·oolymerase (Catus). Oako templátů sa používá roztoku (I, 5 jul),' obsahují čího hybridy mRhlA/oOMA (popsaná výše), V rsakci, vedoucí k rozšíření sro ři-konac fytázu, sa inko orinerv ccužívaii ol (každý v množství 0,3 ^g); vit obr. 3. 7 reakci, rozšíření části cDNA pro C-konec fytázy, sa jaks primery používají oligc 3 3 4 (každý v množství 0,3 jug); viz obr, f» ro denaturaci (7 min při 100^3) a po přídavku 2U iaq - pel' marasa se reakční směsi podrobí 25 rozšiřovacim cyklům (ka; dá: 2'při 55°C, 3'při 72‘J0, l'při 34WC) v ONA-amplzkátoru Fsrkir, - Slmer/Cetus. '·/ posledním cyklu 30 vynechá denaturační krok. Fo rozštěpení (EcoRI pro část cONA, kódující N-konsc a 3am'Hl a ?stl pro část cONA, kódující C-konec) sa oba fragmenty cDNA klonují do vhodných míst p :roma~ ia)
Nukleotidové sekvence obou fragmentů, získaných PCR reakcí, byly stanoveny pomoci termiňační řetězové dideoxyrea ca (Sangar, viz výša). Při tom byly použitty jako primery syntetické oligonukleotidy, sestavené podlá chromosomální sekvence genu pro fytázu. Oako templát byla použita celá rozšířená DMA a taká klonované fragmenty cDNA. Sekvence oblasti cDNA, která kóduje fytázu a odvozená sekvence aminokyselin pro fytázový protein jsou zobrazeny na obr. 3.
Sekvence cDNA potvrdila hypotézu o umístění intronů, uvedenou výěe. Ukázala také, že v chromosomální sekvenci genu nejsou obsaženy žádné jiné introny.
Sen oro fytázu kóduje primární translační orodukt o délce 457 aminokyselin (molekulová hmotnost 31031). Zpracováním primárního translačniho produktu, pomocí odštěpeni sig nálního peptidů se získá maturovaný protein o délce 444 aminokyselin (m.h. 48851) nebo 448 aminokyselin (obsahující první čtyři M-koncové aminokyseliny, jak publikoval Ullah,
m.h. 49232).
- 40 P ř íklad 9
Nodprodukce fytázy u rodu Aspergillus pomoci zavedení přídavných genomových kopií DNA pro fytázu
Konstrukce vektoru pro expresi pAF 2-2S
Všechny konstrukty byly vytvořeny pomocí standardních molekulárně biologických postupů, jak je popsáno v Maniatis et al., (1982) Molecular cloning, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y..
Vektor pro expresi pAF 2-2S byl vytvořen klonováním 6 kb /vu II fragmentu DNA v genomóvém klonu lambda AF 201 pro fytázu na Smál místě pUC!9. Odvozený plazmid byl nazván pAF 2-2 (obr.4). Jako selekční markér pro transformaci do Aspergilla byl na EcoRI/Knpl místa pAF 2-2 včleněn EcoRI/ Kpnl fragment DNA plazmidu pGV/325 (Wernars K. /1985/, diplomová práce na zemědělské universitě, Wageningen, Nizozemsko) obsahující homologní Aspergillus.nidula-ns amdS gen. Výsledný vektor pro expresi byl nezván pAF 2-2S a je Uveden na obr. 9.
A. Msdprodukce fytázy u kmene A. ficuum NRRL 3135
Plasmid pAF 2-2S byl zaveden použití transformačních postupů, a další (1983) Gene 26. 205-221 a do A. ficuum NRRL 313 které popsal Tilburn-,
Kelly, O. a Hyneš, M.
.<3 (1985
EMSO 3.
4, 475-479 s následujícími modifikacemi:
- mycelium bylo pěstováno na minimálním mediu pro Aspergillus (Cove,D. (1966) Biochem, Siophys. Acta 113, 51-56), doplněném 10 mM argininu s 10 mM prol nu po 16 hodin při 30°C na rotační třepačce při ot kách 300 min”\ t
i -w
- přidán pouze Novozým 234 (NOVO Industrií, helikáza nabyla použita při tvorbě protoplastůj
- po SO minutách tvorby protoplastů byl přidán 1 objem S7C pufru (1,2 M sorbitol, IC mM 7ris-HCI ph 7,5, 50 mM CaCl.-, k suspenzi protoplastů a suspenze byla odstraňována při 2 500 g, při 4°C po 10 min* v rotační kole41 bavě nádobkové oastředivce. Prctopl3sty byly promyO ty 3 resuspenaovány v 5TC-pufru aa koncentraci 10° buněk/ml plasmid DNA byl přidán v objemu 10 jul v TE pufru (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1 mM EDTA) ka 100 jul suspenze protoplastůj
- po inkubaci suspenze CNA-protoplasty při 0°C po minut bylo po kapkách přidáno '200 jal PEC roztoku (25 / PEG 4000 (Merck), 10 mM Tris-HCl pH 7,5 50 mM CaCl9), Dále byl pomalu přidán 1 ml PEG roztoku (50/ PEG 4000 v 10 mM Tris-HCl pH 7,5 50 mM CaCL·,) opakovaného míchání zkumavek. Po inkubaci při laboratorní teplotě byly suspenze zředěny STC pufrem, promíchány převrácením a odstředěny při 2000 g, 4°C, 10 min. Protoplasty byly opatrně resuspendovány ve 200 jul STO pufru a naočkovány na minimální médium pro Aspergillus, Minimální médium obsahovalc 10 mM acetamidu jako jediný zdroj dusíku, 15 mM CsCl, 1 M sacharosy a bylo ztuženo 0,75 / bakteriologickým agarem č, 1 (O:Ťid). Nárůst trval S-10 dní při 33°C,
Jednotlivé transformanty, označené SP4, SP7 a SPS byly izolovány, vyčištěny a testovány v třepaných baňkách na produkci fytázy. Přitom byl použit postup, popsaný v příkladech vr-s kontrolu byly také testovány transf ormanty, obsa<·.{ <3 t i
3UC19) a netransformované za ocdminek indukce (viz obr. 3' bující pouze vektor (amd buňky hostitele.
Kmeny byly pěstovány a vzorky byly odebrány po 95 hodinách růstu. Analýzy byly provedeny měřením aktivity fytázy (tabulka 4) a pomocí izcelektrické fokuzace na polyakrylamidovém gelu (lEF-PAGE),
Vzorky stejného objemu byly odebrány z ternentací s A. :iouum a A. ficuum oAP 2-25 3PT, cestovaných za eteínvch podmínek a byly aplikovány na ZEP--AGE gel (pH-rozsah 4,5-3, -hast-3ystem , Pharmacia). Elaktrcforéza byla prováděna ocele ockynů výrobce. Dále byly gely obarveny buo obecným barvivém pro proteiny Coomassie Briliant Blue (obr. 10B) nebo obecným barvivém pro stanoven/ aktivity fosfatázy, (obr. 1OA), které je popsáno v příkladu 2.
Vzorek fytázy z A. ficuum, vyčištěný na homogenní preparát (pomocí imunoafinitní chromatografie, jak je popsáno v příkladu 7) byl také aplikován na IEF-PAGE bu3 samotný nebo smíšený se supernatantem kultury.
□ak již bylo uvedeno, fytáza je v různých vzorcích přítomná v četných izoformách (které jsou označeny na obr. 10 hvězdičkou). Dva hlavní izoenzymy jsou v purifikované fytáze jasně viditelné v pruzích 3 a 4 při použití obou barvicích postupů (obr. 10 A a B). Fytázové pásy jsou u rodičovského kmene A. ficuum stěží viditelné, ale u transformovaného kmene pAF 2-2S SP7 jsou zřetelně mohutnější.
Tabulka 4 zvýšení produkce fytázy transformací kmene A. ficuum NRRL 3135
Kmen______________________1
| A. ficuum | 0,6 |
| A. ficuum + kontrolní plasmid | 0,6 |
| A. ficuum pAF 2-2S SP8 | 7,6 |
| A. ficuum pAF 2-2S SP7 | 6,7 |
| A. ficuum pAF 2-2S SP4 | 4,3 |
B. Nadprodukce fytázy u kmene A. higer
CBS 513.88
Vektor pro expresi pAF 2-2S byl také transformačními postupy, popsanými pro A. ficuum, zaveden do A. niger CBS 513.88. Oednotlivé transformanty byly izolovány, vyčištěny a testovány na produkci fytázy. Testováni bylo provedeno vs třepaných bankách za růstových podmínek indukce, jak je popsáno v příkladu 5.
Podle postupu z příkladu SA byla provedena stanovení úrovně exprese fytázy některých trans formantů (označených jako A. nigar pAF 2-2S č. 8, č. 20 a č. 33) a u kontrolních kmenů. Výsledky ukazuje tabulka 5.
Transformanty A. niger vykazují srovnatelnou úroveň exprese pro fytázu jako transformanty A. ficuum. To mimo jiné znamená, ža promotor pro fytázu z A. ficuum ja aktivní v A. nigar,
Oalší analýza byla provedena s kultivačním médiem transformantu pAF 2-2S č. 8 pomocí slaktroforézy na IEF-PAGE gólu v pH rozsahu 4,5-6 v Phast-System (Pharmacia) jak je popsáno výše. Stejné objemy supernatantů kultivačních médií rodicov Ského kmene A. niger a transf ormantu p.AF 2-2S č. 8, pěstovaných za stejných podmínek, byly naneseny na gal. Po proběhnutí analýzy byly gely obarveny, jak je uvedeno výše.
Rodičovský kmen A. niger produkuje velmi malá množství fytázy, která se nadalo stanovit oslovou elektroforézou. Kmen pAF 2-2S č. 3 produkuje přibližné 90 krátit ytázy. sento roždí ie jasné zřatelmv z obr. 11.
nvazozcxou na oor. x. že intenzita :γ~ϊ~ί:,ν· ee neukázaly žádné j:
< zzotorem rytaz' . Obvyklá vybarvení proteinu ukázalo,
-I i rete '<c o n ;i;.c
-ΠΖ o Ar c· •A, niger pAF 2-23 č. 20 □
.1
Exprese fytázy v kmeni A. niger, transformovaném vektory pro expresi, které obsahovaly gen pro fytázu z A. ficuum fúzovaný s promotorem a/nebo sa signálními sekvencemi genu prc amyloglukosidázu (AG) z A. niger
Konstrukce vektorů pro exoreai
Pro získání nadprodukca fytázy v A. niger byly připraveny odvozené přídavné kazety pro expresi. V těchto kazetách je gen pro fytázu z A. ficuum řízen promotorem oro amyloglukosidázu (AG) z A. niger v kombinaci s různými signálními sekvencemi: v p!8FYT3 je 13 aminokyselin (aa) a v p24FYT3 je 24 aminokyselin (aa) z vedoucích sekvencí genu AG z A. niger fúzováno s í
| gmentem genu | pro fytázu, |
| V kazetě pro | expresi pFYT |
| se sekvencí, | kódující fy |
:azu erá obsahuje vedoucí sekvenci prc fytázu.
Konstrukce p!3FYi3
Fúze AG-promotoru a 13 aa AG - vedoucí sekvence sa s vsncí pro fytázu, která kóduje maturovaný protein, se provádí oomocí řetězové polymerační reakce. V FCR reakcích byly použit-/ dva rozdílná templát'/: pAF 2-2S, obsahující celý cen oro fytázu, jak bylo popsáno výše a pA36-l, plazmid, obsahující celý AG-lokus z A. niger; tento lokus byl izolovaný z olasmidové knihovny A. niger, která obsahuje 13-15 kb HindZE fragmenty v pUC19. ?ro izolaci byly použity AG-specifické oligonukisotidy:
AG-1: 5 ' -GACAATGGCTACACCAGCACCGCAACGGACATTGTTTGGCCC-3 *
AG-2 :w 5-AAGCAGCCATTGCCCGAAGCCGAT-3 ' oba založené na nukleotidové sekvenci, publikované pro A. niger (Boel a další. (1984), EMBO O. 3, 1097-1102} Boel a dalši (1984), Mol. and Cell. Biol. 4, 2306-2315). Oligonukleo tidové proby byly odvozeny od sekvence, obklopující intron 2. Oligo AG-1 je umístěna na 3*konci intronu a má totožnou polaritu s AG mRNA. Oligo AG-2 je umístěna směrem proti přepisu intronu 2 a je antiparalelní s AG mRNA. Plasmid pAB 6-1 obsahuje gen AG v 14,5 kb Hind III fragmentu (viz obr. 12),
Oako primery pro rozšíření pomocí PCR byly sestaveny čtyři syntetické oligonukleotidy s následujícími sekvencemi:
Oligo·1: 5'-CTCTGCAGGATTCAAGCTAG~3'( AG-specifická sekvence okolo EcoRI místa přibližně 250 bp proti směru přepisu od ATG iniciačního kodonu).
Oligo 18-2 j 5 '-CGAGGCGGGGACTGCCAGTGCCAACCCTGTGCAGAC-3 ' maturovaná fytáza <—1—> 18 AA AG-leader Oligo 18-3:5*-GTCTGCACAGGGTTGGCACTGGCAGTCCCCGCCTCG-3* aa AG-leader <—‘—> maturovaná fytáza
Oligo 4: 5*-GGCACGAGGATCCTTCAGCTTt3*( specifická sekvence pro fytázu, lokalizovaná na BamHI místě na pozici 861)
PCR byla provedena, jak popsali Saiki a další /1988/,
Science 239, 487-491, s menšími modifikacemi (viz obr. 8).
Za účelem fúze AG sekvencí se sekvencemi, kódujícími fytázu, byly provedeny dvě oddělené PCR reakce. První reakce byla provedena s pAB6-l, jako teplátem, a oligo 1 a 18-2, jako primery, a vedl3 k rozšíření 300 hp fragmentu DNA.
Tento fragment obsahoval 3*- oblast AG promotoru a 18aa AG vedoucí sekvenci, která byla připojena na 3-konci pomocí nukleotidffvke genu pro fytázu. Druhá reakce byla provedena s pAF 2-2S, jako templátem, a oligo 18-3 a 4, jako primery, a vedla k rozšíření 600 bp fragmentu DNA. Tento fragment obsahoval 5*- oblast genu pro fytázu, připojenou na 5-konci pomocí 18 nukleotidů AG signálního peptidu. Schematické znázornění těchto reakcí ukazuje obr. 13.
Tyto dva vytvořené fragmenty DNA byly vyčištěny gelovou elektroforézou a ethanolovým srážením. Potom byly použity jako templáty při třetí PCR reakci s oligo 1 a 4 jako primery. Reakce vedla k fúzi AG-fytáza. Získaný fragment DNA byl rozštěpen pomocí EcoRI a BamHI, Dále byl klonován jako součást pTZl8R. Výsledek fúze byl sekvenován a byl sestaven plSFYTl.
Zbývající (3f5 kb) oblast AG-promotoru, směrem proti přepisu, byla získána štěpením 0AS6-I pomocí Kpn 1 a částečně také EcoRI. Po štěpení následovalo připojení ligaci k 1,1 kb EcoRl/Bam Hl fragmentu plSFYT 1 a dále klonování na Kpn 1/Bam Hl místech pTZl8R. Takto získaný plasmid
18FYT2 ukazuje obr. 15.
Přídavné HindlII restrikční místo bylo vytvořeno inzercí syntetického fragmentu:
5*AATTCAAGCTTG 3* i
3* GTTCGAACTTAA 5* do EcoRI místa (připojení genu amd S) pAF 2-2S. Získaný plasmid byl pojmenován jako pAF 2-2SH (obr. 14). Používá se jako počáteční plasmid pro výměnu sekvencí promotoru pro fytázu pomocí fúze DNA fragmentů AG-fytáza při PCR reakci.
Pro získání konečné konstrukce byly pJ.8FYT2 a pAF 2-2SH štěpeny KpnI a částečně také Bam Hl. 4,6 kb DNA fragment ρ18Ρ/·Τ2 a 11 kb DNA fragment pAF 2-2SH byly izolovány a čištěny gelovou elektroforézou. Bále byly podrobeny ligáci a přeneseny do E. coli. Odvozená kazeta pro expresi se nazývá pl8FYT3 (obr. 15).
Konstrukce p24FYT3
Fúze AG-promotoru a 24 aa AG vedoucí sekvence se sekvencí, kódující zralou fytázu, byla provedena pomocí PCR rozsiřovacx reaxce zoosooen, který ja nopsan výše pro Konstrukcí pI3FY73. Výjimkou jsou však použité primery. 3yly syntetizován'/ dva nové orimery s těmito sekvencemi:
Oline 24-2
Olioo 24-3
5-CGAGCCCGGGGACTGCCAGGCGC77GGAAA7CACA77-3 ‘ maturovaná fytáza <—1—7 24 AA AG-Isader 5-AA7G7GA77TCCAAGCGCC7GGCAGTCCCCGCCTCG-3 ' 24 aa AG-Ieader <_b—matcrovaná fytázo
Byly prováděny dva oddálené PCR reakca. První reakce- byla provedena s pA3 5-1, jako templátam, a oligo 1 a 24-2, jako primery, a vedla k rozšířeni 315 cp fragmentu ONA. Tento fragment obsahuje 3'oblast promotoru a 24 aa A vancx, která je doplněna na dvouvlákno na 3*18 nukleotidů genu pro fytázu, Druhá reakce b s pAP 2-2S, jako templátem, a oligo 24-3 a a vedla k rozšíření fragmentu DNA, kt-ry obsa-;·- .·,* genu pro fytázu. Tato S^oblaet je na S^kcncn .A. . dvouvlákno pomocí 15 nukleotidů 24 aa AG leaderu :ická znázornění těchto reakcí ukazuje obr. 15, vedoucí seknnci pomocí provede πιο ,
Konstrukca oFY io
Fúze AG promotoru se sekvencí genu pro fytázu (včetně leaderu pro fytázu) byla také provedena pomoci FCR rozšiřovací reakce, jak je to popsáno výše pro konstrukci pl3FY73. Výjimku tvoří ooužité primery. 3yly vytvořeny dva přídavné erimery s těmito sekvencemi:
Λΐ - Λ Ά O . X Λ Ά r* \ j'- rA \ Λ Γ* Λ ΓΑ \ ——ZA Λ /Α/α — .ά — -i Λ f -A <* — /a
U «Li QQ l '/ % *<- · O I 1 kjLz t J G? i rv~\ J 47/A - ζ?*· leader pro fytázu <—i—> AG-promotor
- - u —» Z- :’A Λ —· s- \ -—· \ /A Λ A /-*>·— f-\ P 5 % — .A <A /A A ZA — A — A— A — — * '-· J-— 70 '1 •Ξ-'-ζ/Λ i i ! ί i i κζ i υ I lU i I “·□
AG-promotor <—1—y> leader pro fytázu
Byly provedeny dvě oddělené FOR reakce, řrvní reakce pA3 -δ-l, jako templátem, a oligo I a fyt-2, jako pri vedla k rozšířeni 222 bp fragmentu DNA. Tanto fragnv huje D^sclast AG promotoru, která ja na 3···‘'kor.r* na dvouv — 5i«io pomeex —o nuKxeo tx-ofi xeaoeru ort 7 há reakce byla provedena s pAF 2-25, jako tamc t.
oligo fyt-3 a 4, jako primery, a vedla k rozšíření fragmentu DNA, který obsahoval 5'oblast genu pro fytázu (včetně leaderu pro fytázu). Tato 5*oblast byla na 5*konci doplněna na dvouvlákno pomocí 18 nukleotidů AG promotoru. Schematické znázornění těchto reakcí ukazuje obr. 13.
Pro konstrukci výsledné kazety pro expresi pFYT3 podél intermediárních plazmidů pFYTl a pFYT2 byl použit .stejný postup klonování jaký ja popsaný pro plSFYTl a plSFYTS. Tak se odvodí i kazeta pro expresi pl3FYT3 (obr. 15).
Exprese genu pro fytázu za řízení AG promotoru v A. niger
Sekvence Ξ. coli byly odstraněny z kazet pro expresi fytázy výše popsaným štěpením pomocí HindlII, Potom byl kmen A. niger CBS 513,88 (uložený 10. října, 1983) transformován 10 pg fragmentu DNA pomocí postupů, popsaných v příkladu 9. □ednotlivé transformanty z každé Iozety pro expresi byly izolovány. Spory byly načárkovány na selektivní plotny s acetamidovým agarem. Spory každého transformantu ibyly sebrány z buněk, které rostlý 3 dny při 37°0 na agarových plotnách s 0,4 % bramboro-dextrosovým médiem (O$íd, England). Produkce fytázy byla testována ve třepaných baňkách za těchto růstových podmínek:
* přibližně 1 x 10 spor bylo naočkováno do 100 ml inokulačního média, které obsahovalo/ia litr/: 1 g KH2P04; 30 g· maltózy; 5 g kvasničného extraktu; 10 g kaseinového hydrolyzátu; 0,5 g MgS0^.7H20 a 3 g Tween 80. pH bylo upraveno na
5,5.
Po 24 h rustu pres noc při 34°C na rotační třepačce, byl 1 ml rostoucí kultury zaočkován do 100 ml kultivačního média, které obsahovalo (na litr): 2 g !<HQP04; 70 g maltodextrinu (Maldex MDO^, Amylum); 12,5 kvasničného estraktu;
g kaseinového hydrolyzátu; 2 g K^SO-^j 0,5 g MgSO^.THgO; 0,03 g ZnCl2; 0,02 g CaCl2; 0,05 g MnSO^.4 H20 a FeSO^. pH bylo upraveno na 5,6,
Mycelium pěstováno alespoň 140 h. Produkce fytázy byla měřena způsobem, popsaným v příkladu 2. Výsledky produkce několika náhodných transformantů, získaných z každé kazety pro expresi, ukazuje tabulka 6.
Tabulka 6
Produkce fytázy několika kmenů A. niger CBS 513,88, které byly transformovány plasmidy, obsahujícími gen pro fytázu z A, ficuum řízený AG promotorem z A, niger a kombinovaný s různými vedoucími sekvencemi.
Kazeta pro expresi - Transformant o. Aktivita fytázy— ___________________________________________zyzsiz__________
| pl8FYT3 | 240 | 82 | |
| pl8FYT3 | pl8FYT3 | 242 | 84 |
| (AG-proraotor) | pl8FYT3 | 243 | 62 |
| 18 aa AG-leader) | pl8FYT3 | 244 | 43 |
| pl8FYT3 | 245 | 80 | |
| pl8FYT2 | 246 | 82 | |
| .. . ...... ..... .................. | J518FYT3 | 250 · | -....... 110..........,,--------- |
| p24FYT3 | p24FYT3 | 256 | 8 |
| p24P/T3 | 257 | 30 | |
| (AG-promoťor) | p24FYT3 | 258 | 13 |
| 24 aa AG-leader) | p24FYT3 | 259 | 33 |
| p24FYT3 | 260 | 17 | |
| p24FYT3 | 261 | 28 | |
| ------------------------------------------- | p24FYT3 .........p24FÝŤ3 | 262 265 | 18 12 |
| pFYŤ3 | pFYT3 | 205 | 50 |
| pFYT3 | 282 | 280 | |
| (AG-promotor/ | pFYT3 | 299 | 96 |
| leader pro fyfctzu) | pFYT3 | 302 | 220 |
| pFYT3 | 303 | 175 | |
| pFYT3 | 304 | 150 | |
| pFYT3 | 305 | 150” | |
| pFYT3 | 312 | 140 |
Tyto údaje jasně ukazují vysoké úrovně exprese fytázy v transformantech A. niger, které obsahují gen pro fytázu, řízený AG promotorem z A. niger. Dále tyto údaje ukazují, že nejvyšší produkce fytázy se získá s použitím pFYT3 vektoru pro expresi, který obsahuje vedoucí sekvenci pro fytázu.
Podobné vektory pro expresi, obsahující gen pro fytázu, bez intronu, poskytují po transformaci do A. niger srovnatelné výsledky, pokud se týče úrovní exprese fytázy, jako pPřTo transformanty A. niger.
Kromě toho byla provedena elektroforéza na IEF-PAGE gelu v pH rozmezí 4,5 až 6 se supernatanty kultury transformantů pFYT3 č. 205 a č. 282. Na gel byly nastříknuty stejné objemy supernatantů kultur rodičovského kmene A. niger a obou transformantů, které byly pěstovány za stejných podmínek. Po proběhnuti elektroforézy byly vzorky obarveny tak, jak je popsáno v příkladu 9, Rodičovský kmen A. niger produkuje velmi malé množství fytázy, které se nedá tímto pokusem stanovit. Kmen pFYT3 č, 205 produkuje přibližně 250 krát více fytázy, kmen pFYT3 č. 282 zhruba 1400 krát více fytázy (srovnej množství fytázy v tabulkách 4 a 5). Tento rozdíl je zřetelně vidět na obr. 11. Bylo také stanoveno několik izoforem enzymu fytázy (označeny hvězdičkou). Barvení obvyklým barvivém pro proteiny ukázalo, že intenzita fytázových proteinových pásů se výrazně zvýšila, přičemž se! neobjevily žádné jiné hlavní proteinové pásy.
Příklad 11
Nadppodukce fytázy u A. ficuum a A. niger, pěstovaných v průmyslovém měřítku
A.A^ficuum
Kmen A, ficuum pAF 2-2S č. 4a A. ficuum NRRL3135 byly pěstovány za podmínek, udaných v příkladu 1. Transformant produkoval ve srovnání s kmenem divokého typu 50 krát více fytázy.
Tabulka 7
Nadprodukce fytázy u transformantu A. ficuum, který
- 51 obsahoval znásobené geny pro fytázu. Buňky byly pěstovány za podmínek, popsaných v příkladu 1,
Hodiny po Aktivita fytázy (U/ml řermentačního inokuíaci média A. ficuum pAF • - ·· · ...........-.............2-2S č. 4
0 0
0 0
2 142
141 5 270
B. A. niger
Kmen A. niger pAF 2-2S 8, transformant kmene A niger CBS 513.88 a samotný rodičovský kmen A.niger byly pěstovány podle príkidu 1. Transformant produkoval zhruba 1000 krát více fytázy ve srovnání s původním rodičovským kmenem A. niger (tabulka 8).
Tabulka 8
Nadprodukce fytázy u transformantu A. niger (CBS 513.88) , který obsahoval znásobené geny pro fytázu. Buňky rostly za podmínek, popsaných v příkladu 1.
Hodiny po Aktivita fytázy (U/ml fermentačního i nekula c __________________________. 8
O 0 0
0 5
0,1 65
141 0,1 95 klad ,-ro vvtvorenx vett;
pSZF~Vi3, 3 nímř sa dosahuje současno exprese rytazy .3 na.iraoy AG prYT3 pomocí Koni. Získaný lineární Kpnl fragner. podrobí dvěma oddělaným ligacím.
Ligacs 1 s Kpr.I-HindlII adaptorem:
ganu, so ro zs t a ρ x
Si.l.i <
CGGGGA
'.«γ,-ι i i ί !κ^ςρζ-ν
Koni
Ligace 2 s !/n isp nx-Hind!
___„>
adaptorem, v němž Hindxxx restrikční místo není 00 ligaci obnoveno:
CGGGGG —3'
AGGCCCCC7CGA-5, Kpnx Hindxxx
Dále je produkt · ligace 1 částečně štěpen pomocí HindZIZ, Po odstranění fragmentu, který obsahuje amaS, pomocí gelová elektroforézy se zbývající fragment DNA recykluje pomocí ligacs a transformuje sa do Ξ, coli. Získaný plazmid se nazývá pFY73 a rado (viz obr. 1S).
Produkt ligace 2 se také stepí pomocí HindZZI. Fragment — __tF ONA 4 kb H4nclxII/Windxj.l , kusrý obsahuj3 amdSjgan, sa izoluje gelovou elektroforezou. Dá! e sa ligaci spojí s dxgestem pFYTo amdS, Štěpeným částečně pomocí HindZIZ. Nakonec se transformuje do Z, coli. Tsnto plazmid, který obsahuje amaS gen raa o koncz genu pro tytazu, se nazýva pr Λ3χ (viz obr. 17),
Cílem dalšího postupu je vvtvořit přibližně Z
M
HindZZx fragment AG sekvenci. Pna xo oaii/
NA z oA3S-l, ktsrv obsahuje S^zdvoiuTÍci ja pFYTZZNT částečně stečen pomoci HindZZI, 'isiorVQ je vsax xxgaox s co jer. s aoaotoren:
5'- AGCTAGGGG -3' _TCCCCCAGCT -5*
HindlII* Sall 'Ί* (po této ligaci není HindlIIi restrikční místo znovu obnoveno). Následuje ligace s Sall/HindlII fragmentem ρ AB6-1.
Po transformaci do E. coli se získá žádaný plazmid pREPFY73(obr. 18), který obsahuje 3*AG zdvojenou sekvenci na správném místě.
Express fytázy v A. niger nahrazením AG genu
Před transformací A. niger pREPPřT3 se sekvence plazr midu z E. coli odstraní štěpením HindlII a gelovou elektrofo rézou. Kmen A. niger CBS 513,88 se transformuje 10 )jg DNA fragmentem podle postupů z příkladu 9. Selekce a růst tran-sformantů sa provádí stejně jako v příkladu 9. Pouze menšina vybraných transformantů ztrácí AG aktivitu (přibližně 20 7). Byla provedena Southern analýza chrcmosomální DNA s AG negativními a fytáza pozitivními transformanty, aby se ověřilo, že AG gen jo skutečně nahrazen genem pro fytázu.
Příklad 13
Konzervace genu pro fytázu v různých mikrobiálních druzích
Southern analýzy deseti různých druhů byly provedeny s cDNA pro fytázu z A. ficuum jako próbou, aby se zjistilo, jak je gen pro fytázu v různých mikrobiálních druzích konzervován.
Tyto analýzy chromosomální DNA byly provedeny u mikrobiálních druhů vláknitých hub, kvasinek a bakterií. 2 každé skupiny byl vybrán pouze omezený počet zástupců jako pří Klad: pro vláknité houby: Penicillium chrysogenum a Aspergillus niger} pro kvasinky: Saccharomyces cerevisiae a Kluyveromycss lactis; a pro prokaryotní organismy Gram- positivní druhy, jako Bacillus subtilis,-Clostridum thermocallum a Streptorayces lividans a gram-negativní bakterie, jako Pseudomonas aeruginosa.
Chromosomální DNA o vysoké molekulové hmotnosti z těchto druhů byla odděleně štěpena pomocí PvuII a BamHI. Dále byla podrobena elektroforéza na 0,7 % agarózovém gelu.
Po přenesení na nitrocelulozové filtry byla provedena hybridizace s 5xfytázovým cDNA fragmentu (popsaný v příkla32 du 8), který byl značený P. Hybridizace byla prováděna 24 h za mírných podmínek (6x SSC, 50°C). Bloty byly promyty v 6x SSC roztoku při laboratorní teplotě. Dále byly po 18 h vystaveny X-záření.
□ak ukazují obr. 19a a 19b, objevily se v téměř každém pruhu diskrétní pásy, které značí vysoký stupeň homologie genu pro fytázu mezi mikrobiálními druhy.
Claims (29)
1. Vyčištěná a izolovaná sekvence DNA, kódující peptid nebo protein s fytázovou aktivitou.
2. Vyčištěná a izolovaná sekvence DNA podle nároku 1, odvozená z mikrobiálního zdroje.
3. Vyčištěná a izolovaná sekvence DNA podle nároku 1, odvozená z houbového zdroje,
4. Vyčištěná a izolovaná sekvence DNA podle nároku 1, odvozená ze zdroje z rodu Aspergillus.
5. Vyčištěná a izolovaná sekvence DNA podle nároku 1, odvozená ze zdroje Aspergillus ficuum nebo Aspergillus niger.
6. Vyčištěná a izolovaná sekvence DNA podle nároku 1, kódující fytázu, která má tyto vlastnosti:
a) je-li exprimována v hostitelské buňce rodu Aspergillus, tak poskytuje na SDS-PAGE jediný pás při 85kDaj
b) její zdánlivá molekulová hmotnost po deglýkosylaci je v rozmezí 48-56,5 kDaj
c) její specifická aktivita je okolo 100 U/mg proteinu.
7. Vyčištěná a izolovaná sekvence DNA, která má alespoň jednu z těchto vlastnosti:
a) hybridizuje s oligonuklsotidovou próbou, odvozenou od sekvence DNA uvedené na obr. 6}
b) hybridizuje s oligonukleotidovou próbou, odvozenou od sekvence cDNA uvedené na obr. 8.
8. Konstrukt pro expresi zahrnující sekvenci DNA podle kteréhokoli z nároků 1 až 7 operabilně spojenou s regulační oblastí, schopnou řídit expresi proteinu nebo peptidu s fytázovou aktivitou ve vhodném hostiteli pro expresi.
9. Konstrukt pro expresi podle nároku 8, jehož regulační
-Li , oblast také obsahuje vedoucí sekvenci pro expresi, která umožňuje sekreci produkovaného proteinu nebo peptidu s fýtázovou aktivitou,
10. Konstrukt pro expresi podle nároku 9, v němž se pro řízení exprese proteinu nebo peptidu s fytázovou aktivitou používá AG-promotor,
11. ř Konstrukt pro expresi podle nároku 10, v němž se pro sekreci sxprimovaného proteinu nebo peptidu s fytázovou aktivitou používá homologní vedoucí sekvence pro fytázu.
12. Konstrukt pro expresi podle nároku 10, v němž se pro sekreci produkovaného proteinu nebo peptidu s fytázovou aktivitou používá AG vedoucí sekvence, obsahující 13 aminokyselin,
13. Konstrukt pro expresi podle nároku 10, v němž se pro sekreci produkovaného proteinu nebo peptidu s fytázovou aktivitou používá AG vedoucí sekvence, obsahující 24 aminokyselin.
14. Konstrukt!: pro expresi podle nároku 9, v němž se pro řízení exprese proteinu nebo peptidu s fytázovou aktivitou používá homologní promotor pro fytázu.
15. Konstrukt pro expresi podle nároku 14, v němž sa dále pro sekrsci axprimovaného proteinu nebo peptidu s fytázovou aktivitou používá homologní vedoucí sekvence pro fytázu*
15. Konstrukt pro expresi podle nároku 14, v němž se dále pro sekreci axprimovaného proteinu nebo peptidu s fytázovou aktivitou používá AG vedoucí sekvence, obsahující 13 aminokyselin.
17. Konstrukt pro expresi podle nároku 14, v němž se dála pro sekreci exprimovaného proteinu nebo peptidu s fytázovou aktivitou používá AG vedoucí sekvence, obsahující 24 aminokyselin,
13. Vektor, schopný transformovat hostitelskou buňku, obsahující konstrukt pro expresi podle kteréhokoliv z nároků 3 až 17.
III
19. Vektor podle bodu 18, který je plasmidem,
20. Vektor podle bodu 18, který je flasmidem, zvoleným ze skupiny, která sestává z pAF 28-1, pAF 2-2S, pAF 2-2, pAF 2-3, pAF 2-4, pAF 2-6, pAF 2-7, pl8FYT3, p24FYT3, a pFYT3.
21. Transformovaná hostitelská buňka, která je transformována vektorem podle kteréhokoliv z<lETaž 20.
22. Transformovaná hostitelská buňka podle nároku 21, zvolená ze skupiny, která sestává z baktérií, kvasinek a hub.
23. Transformovaná hostitelská buňka podle nároku 22, zvolená ze skupiny rodů Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Mucor, Bacillus, Kluyveromyces a Saccharomyces.
24. Transformovaná hostitelská buňka podle nároku 22, zvolená ze skupiny kmenů Aspergillus niger, Aspergillus ficuum, Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Mucor miehei, Kluyveromyces lactis,Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis a Bacillus licheniformis,
25. Způsob produkce peptidu nebo proteinu s fytázovou aktivitou, vyznačující se tim, že transformovaná hostitelská buňka podle kteréhokoliv z nároků 21 až 24 je pěstována za podmínek, vedoucích k produkci zmíněného peptidu nebo proteinu s fytázovou aktivitou.
26. Peptid nebo protein s fytázovou aktivitou produkovaný způsobe® podle nároku 25.
27. Fytáza, která vykazuje tyto vlastnosti:
a) je-li exprimována v hostitelské buňce rodu Aspergillus, tak poskytuje na SDS-PAGE jediný pás při 85 kDa;
b) její zdánlivá molekulová hmotnost po deglykosylaci je v rozmezí 48-56,5 kDa;
c) její specifická aktivita je okolo 100 U/mg proteinu.
IV
28. Krmivo pro zvířata, vyznačující se tím, že obsahuje peptid nebo protein s fytázovou aktivitou podle obou nároků 26 a 27.
29. Použiti peptidu nebo proteinu s fytázovou aktivitou podle obou nároků 26 a 27, pro konverzi fytátu na inositol a anorganický fosfát.
30. Způsob podpory růstu zvířat, vyznačující se tím, že zvíře je krmeno stravou, která obsahuje krmivo, doplněné fytázou podle obou nároků 26 a 27.
31. Způsob snižováni koncentrace fytátu v mrvě, vyznačující se tím, že zvíře je krmeno stravou, která obsahuje krmiwo, doplněné fytázou podle obou nároků 26 a 27 v množství, které je účinné pro konverzi fytátu obsaženého v krmivu, na inositol a anorganický fosfát.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP89202436 | 1989-09-27 | ||
| EP90202231 | 1990-08-17 | ||
| DD344227A DD300886A5 (de) | 1989-09-27 | 1990-09-26 | Clonierung und Expression von mikrobieller Phytase |
| EP90202565A EP0420358B1 (en) | 1989-09-27 | 1990-09-27 | Cloning and expression of microbial phytase |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ466390A3 true CZ466390A3 (cs) | 2000-08-16 |
| CZ289014B6 CZ289014B6 (cs) | 2001-10-17 |
Family
ID=37728159
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19904663A CZ289014B6 (cs) | 1989-09-27 | 1990-09-25 | Vyčiątěná a izolovaná sekvence DNA kódující fungální fytázu, konstrukt pro expresi, vektory a transformované hostitelské buňky a způsob produkce fytázy |
Country Status (25)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20060063243A1 (cs) |
| EP (2) | EP0420358B1 (cs) |
| JP (1) | JP3105920B2 (cs) |
| KR (1) | KR0159782B1 (cs) |
| CN (1) | CN1053013C (cs) |
| AT (1) | ATE180014T1 (cs) |
| AU (1) | AU636673B2 (cs) |
| BG (1) | BG60108A3 (cs) |
| CA (2) | CA2042054C (cs) |
| CZ (1) | CZ289014B6 (cs) |
| DD (1) | DD300886A5 (cs) |
| DE (2) | DE69033103T2 (cs) |
| DK (1) | DK0420358T3 (cs) |
| ES (1) | ES2072834T3 (cs) |
| FI (2) | FI104380B (cs) |
| GR (1) | GR3030819T3 (cs) |
| HU (1) | HU215179B (cs) |
| IL (1) | IL95803A (cs) |
| LV (1) | LV10310B (cs) |
| NO (1) | NO303988B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ235478A (cs) |
| PT (1) | PT95447B (cs) |
| RU (1) | RU2113468C1 (cs) |
| SK (1) | SK466390A3 (cs) |
| WO (1) | WO1991005053A1 (cs) |
Families Citing this family (89)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK122686D0 (da) * | 1986-03-17 | 1986-03-17 | Novo Industri As | Fremstilling af proteiner |
| US5780292A (en) * | 1987-04-29 | 1998-07-14 | Alko Group Ltd. | Production of phytate degrading enzymes in trichoderma |
| US7705215B1 (en) | 1990-04-17 | 2010-04-27 | Dekalb Genetics Corporation | Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof |
| US6803499B1 (en) | 1989-08-09 | 2004-10-12 | Dekalb Genetics Corporation | Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof |
| US6777589B1 (en) | 1990-01-22 | 2004-08-17 | Dekalb Genetics Corporation | Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof |
| US6329574B1 (en) | 1990-01-22 | 2001-12-11 | Dekalb Genetics Corporation | High lysine fertile transgenic corn plants |
| US5543576A (en) * | 1990-03-23 | 1996-08-06 | Mogen International | Production of enzymes in seeds and their use |
| US5593963A (en) * | 1990-09-21 | 1997-01-14 | Mogen International | Expression of phytase in plants |
| US7033627B2 (en) | 1990-03-23 | 2006-04-25 | Syngenta Mogen B.V. | Production of enzymes in seeds and their use |
| KR100225087B1 (ko) * | 1990-03-23 | 1999-10-15 | 한스 발터라벤 | 피타아제의 식물내 발현 |
| US6395966B1 (en) | 1990-08-09 | 2002-05-28 | Dekalb Genetics Corp. | Fertile transgenic maize plants containing a gene encoding the pat protein |
| DE69228665T2 (de) * | 1991-12-23 | 1999-07-22 | Dsm Nv | Eukaryotisches Expressionssystem |
| AU3628493A (en) * | 1992-02-13 | 1993-09-03 | Gist-Brocades N.V. | Stabilized aqueous liquid formulations of phytase |
| JPH09505201A (ja) * | 1992-07-31 | 1997-05-27 | パンラブス インコーポレイテッド | 組換え細胞、ｄｎａ構造、ベクター及びフィチン酸塩分解酵素を任意の比率で発現する方法 |
| US6118047A (en) | 1993-08-25 | 2000-09-12 | Dekalb Genetic Corporation | Anthranilate synthase gene and method of use thereof for conferring tryptophan overproduction |
| DK1142485T3 (da) * | 1994-04-22 | 2008-06-02 | Novozymes As | Fremgangsmåde til forbedring af oplöseligheden af planteproteiner |
| US6358722B1 (en) * | 1994-04-25 | 2002-03-19 | Roche Vitamins, Inc. | Heat tolerant phytases |
| ES2268687T3 (es) * | 1994-04-25 | 2007-03-16 | Dsm Ip Assets B.V. | Polipeptidos con actividad fitasa. |
| US6699704B1 (en) | 1994-04-25 | 2004-03-02 | Roche Vitamins Inc. | Heat tolerant phytases |
| US6291221B1 (en) | 1994-04-25 | 2001-09-18 | Roche Vitamins Inc. | Heat tolerant phytases |
| US5830732A (en) * | 1994-07-05 | 1998-11-03 | Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. | Phytase |
| US6051431A (en) * | 1994-07-22 | 2000-04-18 | Dsm N.V. | Selection marker gene free recombinant strains: a method for obtaining them and the use of these strains |
| WO1997013862A1 (en) | 1995-10-13 | 1997-04-17 | Gist-Brocades B.V. | Fungal cellulases |
| AU2077197A (en) * | 1996-03-18 | 1997-10-10 | Novo Nordisk Biotech, Inc. | Polypeptides having phytase activity and nucleic acids encoding same |
| US5939303A (en) * | 1996-06-14 | 1999-08-17 | Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Dept. Of Agriculture & Agri-Food Canada | Phytases of ruminal microorganisms |
| US5985605A (en) * | 1996-06-14 | 1999-11-16 | Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Dept. Of Agriculture & Agri-Food Canada | DNA sequences encoding phytases of ruminal microorganisms |
| FR2751987B1 (fr) * | 1996-08-01 | 1998-12-31 | Biocem | Phytases de plantes et applications biotechnologiques |
| GB2316082A (en) * | 1996-08-13 | 1998-02-18 | Finnfeeds Int Ltd | Phytase |
| CN1231692A (zh) | 1996-09-25 | 1999-10-13 | 协和发酵工业株式会社 | 新型肌醇六磷酸酶及其制造方法 |
| US6039942A (en) | 1996-12-20 | 2000-03-21 | Novo Nordick A/S | Phytase polypeptides |
| EP0958353B1 (en) * | 1996-12-20 | 2009-03-04 | Novozymes A/S | Phytase polypeptides |
| US6235517B1 (en) | 1997-03-07 | 2001-05-22 | Food Industry Research & Development Institute | Phytase-producing bacteria, phytase and production method of phytase |
| CA2231948C (en) | 1997-03-25 | 2010-05-18 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Modified phytases |
| KR100206453B1 (ko) | 1997-03-27 | 1999-07-01 | 박원훈 | 신규한플라즈미드를이용하여형질전환시킨균주 이.채씨오엘아이.피와이로부터생산된피타제 |
| JP5303084B2 (ja) | 1997-04-11 | 2013-10-02 | コニンクリーケ デーエスエム ナムローゼ フェンノートシャップ | 工業的組み換え生物を溝築するための手段としての遺伝子変換 |
| TW409035B (en) | 1997-06-04 | 2000-10-21 | Gist Brocades Bv | Starch-based enzyme granulates |
| NZ501409A (en) * | 1997-06-04 | 2002-02-01 | Dsm N | High-activity phytase compositions containing a carbohydrate polymer |
| HUP0002767A3 (en) * | 1997-06-04 | 2001-01-29 | Dsm Nv | Carbohydrate-based enzyme granulates |
| NZ330940A (en) | 1997-07-24 | 2000-02-28 | F | Production of consensus phytases from fungal origin using computer programmes |
| US6720014B1 (en) * | 1997-08-13 | 2004-04-13 | Diversa Corporation | Phytase-containing foodstuffs and methods of making and using them |
| CN1062309C (zh) * | 1997-12-16 | 2001-02-21 | 中国农业科学院饲料研究所 | 植酸酶及其基因的克隆和表达 |
| CN1309699A (zh) * | 1998-03-23 | 2001-08-22 | 诺维信公司 | 植酸酶变体 |
| US6514495B1 (en) | 1998-03-23 | 2003-02-04 | Novozymes A/S | Phytase varinats |
| WO1999049740A1 (en) * | 1998-04-01 | 1999-10-07 | Dsm N.V. | Application of phytase in feed having low content of phytate |
| US6451572B1 (en) | 1998-06-25 | 2002-09-17 | Cornell Research Foundation, Inc. | Overexpression of phytase genes in yeast systems |
| US7220542B2 (en) | 2000-07-17 | 2007-05-22 | Van Den Brink Johannes Maarten | Expression cloning in filamentous fungi |
| BR0007655A (pt) * | 1999-01-22 | 2001-11-06 | Novozymes As | Fitase, sequência de dna, vetor, célula hospedeira microbiana, processo para produzir uma fitase, e, alimento, gênero alimentìcio ou composição farmacêutica |
| US6720174B1 (en) | 1999-01-28 | 2004-04-13 | Novozymes A/S | Phytases |
| DK1165806T3 (da) | 1999-03-31 | 2005-12-05 | Cornell Res Foundation Inc | Phosphataser med forbedret phytaseaktivitet |
| EP1224272B1 (en) | 1999-10-01 | 2005-12-07 | Novozymes A/S | Spray dried enzyme product |
| US6841370B1 (en) | 1999-11-18 | 2005-01-11 | Cornell Research Foundation, Inc. | Site-directed mutagenesis of Escherichia coli phytase |
| KR100377380B1 (ko) * | 2000-07-28 | 2003-03-26 | 대한제당 주식회사 | 파이테이즈 생산 재조합 효모 |
| DK1438417T3 (da) | 2001-10-26 | 2014-08-04 | Danisco Us Inc | Phytase-enzymer, nukleinsyresekvenser, der koder for fytase-enzymer ogvektorer og værtsceller, der inkorporerer disse |
| US7510831B2 (en) | 2001-10-26 | 2009-03-31 | Genencor International, Inc. | Trichoderma reesei phytase enzymes, nucleic acids encoding such phytase enzymes, vectors and host cells incorporating same and methods of making and using same |
| EP1450627B1 (en) | 2001-10-31 | 2012-09-05 | Phytex, Llc | Use of phytase containing animal food |
| EP2295553A1 (en) | 2002-02-08 | 2011-03-16 | Novozymes A/S | Phytase variants |
| US7309505B2 (en) | 2002-09-13 | 2007-12-18 | Cornell Research Foundation, Inc. | Using mutations to improve Aspergillus phytases |
| US20040063184A1 (en) | 2002-09-26 | 2004-04-01 | Novozymes North America, Inc. | Fermentation processes and compositions |
| US7442398B2 (en) | 2003-03-25 | 2008-10-28 | Republic Of National Fisheries Research And Development Institute | Phytase produced from Citrobacter braakii |
| US20040253696A1 (en) | 2003-06-10 | 2004-12-16 | Novozymes North America, Inc. | Fermentation processes and compositions |
| CN1302112C (zh) * | 2003-09-17 | 2007-02-28 | 广东肇庆星湖生物科技股份有限公司 | 利用毕赤酵母生产高比活耐高温植酸酶 |
| DK2258209T3 (da) | 2004-09-27 | 2015-08-31 | Novozymes As | Phytasegranuler i dyrefoder |
| FR2888249B1 (fr) * | 2005-07-08 | 2007-08-17 | Adisseo France Sas Soc Par Act | Effet synergique de l'association de phytases sur l'hydrolyse de l'acide phytique |
| US7919297B2 (en) | 2006-02-21 | 2011-04-05 | Cornell Research Foundation, Inc. | Mutants of Aspergillus niger PhyA phytase and Aspergillus fumigatus phytase |
| US8540984B2 (en) | 2006-08-03 | 2013-09-24 | Cornell Research Foundation, Inc. | Phytases with improved thermal stability |
| ES2577430T3 (es) | 2006-08-07 | 2016-07-14 | Novozymes A/S | Gránulos de enzima para pienso para animales |
| ES2576580T3 (es) | 2006-08-07 | 2016-07-08 | Novozymes A/S | Gránulos de enzima para pienso para animales |
| US8192734B2 (en) | 2007-07-09 | 2012-06-05 | Cornell University | Compositions and methods for bone strengthening |
| EP2116136A1 (en) | 2008-05-08 | 2009-11-11 | Nederlandse Organisatie voor toegepast- natuurwetenschappelijk onderzoek TNO | Novel phytases |
| WO2011005577A1 (en) | 2009-06-24 | 2011-01-13 | Soparkar Charles N S | Zinc supplementation to increase responsiveness to metalloprotease therapy |
| WO2011048046A2 (de) | 2009-10-22 | 2011-04-28 | Basf Se | Synthetische phytasevarianten |
| CN102102094B (zh) * | 2009-12-16 | 2013-03-27 | 福建福大百特科技发展有限公司 | 热稳定脂肪酶,其编码基因的表达及其用途 |
| PL2699674T3 (pl) | 2011-04-21 | 2016-06-30 | Basf Se | Syntetyczne warianty fitazy |
| DK2699675T3 (en) | 2011-04-21 | 2015-11-30 | Basf Se | Synthetic fytasevarianter |
| CN102583776B (zh) * | 2012-02-29 | 2013-04-24 | 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 | 一种改良养殖水体环境的复合菌酶制剂及制备方法 |
| WO2014067933A1 (en) | 2012-10-31 | 2014-05-08 | C-Lecta Gmbh | Bioactive carrier preparation for enhanced safety in care products and food |
| EP3712274A1 (en) | 2013-09-11 | 2020-09-23 | Novozymes A/S | Processes for producing fermentation products |
| MX2016016871A (es) | 2014-06-27 | 2017-04-25 | Dsm Ip Assets Bv | Metodo para mejorar el valor nutricional de pienso para animales. |
| EP3394273A1 (en) | 2015-12-22 | 2018-10-31 | Novozymes A/S | Process of extracting oil from thin stillage |
| CN111164214A (zh) | 2017-09-15 | 2020-05-15 | 诺维信公司 | 用于改进动物饲料营养质量的酶共混物和方法 |
| BR112020007814A2 (pt) | 2017-10-23 | 2020-10-20 | Novozymes A/S | processos para reduzir e/ou prevenir um aumento nos níveis de ácido lático em um sistema de fermentação de biocombustível e para produção de um produto de fermentação a partir de um material contendo amido, e, uso de um polipeptídeo, ou uma composição enzimática |
| CN111315879A (zh) | 2017-11-09 | 2020-06-19 | 巴斯夫欧洲公司 | 包含有机白色颜料的酶颗粒涂层 |
| EP3810785A2 (en) | 2018-05-31 | 2021-04-28 | Novozymes A/S | Processes for enhancing yeast growth and productivity |
| CN113302294A (zh) | 2019-01-31 | 2021-08-24 | 诺维信公司 | 具有木聚糖酶活性的多肽及其用于改善动物饲料营养质量的用途 |
| EP4009807A1 (en) | 2019-08-05 | 2022-06-15 | Novozymes A/S | Enzyme blends and processes for producing a high protein feed ingredient from a whole stillage byproduct |
| WO2021126966A1 (en) | 2019-12-16 | 2021-06-24 | Novozymes A/S | Processes for producing fermentation products |
| WO2021229093A1 (en) | 2020-05-15 | 2021-11-18 | Dsm Ip Assets B.V. | A method for improving the nutritional value of animal feed |
| CN111849858B (zh) * | 2020-07-20 | 2023-01-10 | 浙江农林大学 | 毛竹原生质体的制备及瞬时转化体系的建立 |
| CN114181952A (zh) * | 2021-11-26 | 2022-03-15 | 中农华威生物制药(湖北)有限公司 | 提高纤维素酶活的基因及在中药饲料添加剂中的应用 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3297548A (en) * | 1964-07-28 | 1967-01-10 | Int Minerals & Chem Corp | Preparation of acid phytase |
| FI881496A (fi) * | 1987-04-06 | 1988-10-07 | Gist Brocades Nv | Foerfarande foer framstaellning eller extraktion av aminosyror ur dynga. |
| UA27702C2 (uk) * | 1989-09-27 | 2000-10-16 | Гіст-Брокейдс Н.В. | Фрагмент геномної днк, що кодує фітазу aspergillus niger,фрагмент кднк, що кодує фітазу aspergillus niger, рекомбінантна плазмідна днк для експресії фітази в aspergillus (варіанти), штам aspergillus-продуцент фітази aspergillus (варіанти), спосіб одержання фітази, рекомбінанта фітаза aspergillus niger |
| US5593963A (en) * | 1990-09-21 | 1997-01-14 | Mogen International | Expression of phytase in plants |
| US6057491A (en) * | 1997-05-29 | 2000-05-02 | Borad Of Regents For University Of Oklahoma | Protein having insecticidal activities and method of use |
-
1990
- 1990-09-25 CZ CZ19904663A patent/CZ289014B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1990-09-25 SK SK4663-90A patent/SK466390A3/sk not_active IP Right Cessation
- 1990-09-26 DD DD344227A patent/DD300886A5/de unknown
- 1990-09-26 IL IL9580390A patent/IL95803A/en not_active IP Right Cessation
- 1990-09-27 WO PCT/NL1990/000140 patent/WO1991005053A1/en active IP Right Grant
- 1990-09-27 CN CN90108977A patent/CN1053013C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-27 AT AT90202565T patent/ATE180014T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-09-27 NZ NZ235478A patent/NZ235478A/xx unknown
- 1990-09-27 KR KR1019910700528A patent/KR0159782B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1990-09-27 EP EP90202565A patent/EP0420358B1/en not_active Revoked
- 1990-09-27 HU HU907465A patent/HU215179B/hu unknown
- 1990-09-27 EP EP96202943A patent/EP0779037A1/en not_active Ceased
- 1990-09-27 JP JP02513672A patent/JP3105920B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-27 CA CA002042054A patent/CA2042054C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-27 DE DE69033103T patent/DE69033103T2/de not_active Revoked
- 1990-09-27 CA CA002341081A patent/CA2341081C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-27 PT PT95447A patent/PT95447B/pt not_active IP Right Cessation
- 1990-09-27 DK DK90202565T patent/DK0420358T3/da active
- 1990-09-27 RU SU4895487A patent/RU2113468C1/ru active
- 1990-09-27 AU AU65011/90A patent/AU636673B2/en not_active Expired
- 1990-09-27 ES ES90202565T patent/ES2072834T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-27 DE DE0420358T patent/DE420358T1/de active Pending
-
1991
- 1991-05-24 NO NO912011A patent/NO303988B1/no not_active IP Right Cessation
- 1991-05-24 FI FI912530A patent/FI104380B/fi active
- 1991-05-27 BG BG94500A patent/BG60108A3/xx unknown
-
1993
- 1993-12-03 LV LVP-93-1302A patent/LV10310B/en unknown
-
1999
- 1999-07-20 GR GR990401907T patent/GR3030819T3/el unknown
- 1999-11-10 FI FI992420A patent/FI108299B/fi active
-
2005
- 2005-01-14 US US11/036,272 patent/US20060063243A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ466390A3 (cs) | Klonování a exprese mikrobiální fytázy | |
| US5863533A (en) | Cloning and expression of microbial phytase | |
| EP0655890B1 (en) | Recombinant cells, dna constructs, vectors and methods for expression phytate degrading enzymes in desired ratios | |
| KR20000016576A (ko) | 반추동물 미생물의 피타아제를 발현하는 디엔에이 서열 | |
| EP0659215A1 (en) | PRODUCTION OF PHYTATE DEGRADING ENZYMES IN $i(TRICHODERMA) | |
| CA2925807A1 (en) | Using mutations to improve aspergillus phytases | |
| EA007461B1 (ru) | Новые фитазы и способ их получения | |
| JP2005512570A6 (ja) | 新規なフィターゼおよびこれらのフィターゼを生産するための方法 | |
| US20070184521A1 (en) | Novel phytase and gene | |
| KR20150032440A (ko) | 식물에서 tev 프로테아제를 대량생산하는 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 tev 프로테아제 | |
| PL168470B1 (pl) | Sposób uwalniania nieorganicznego fosforanu z fitynianu PL | |
| US20030119163A1 (en) | Cloning and expression of microbial phytase |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20100925 |