JPH04506007A - 細菌性フィターゼをコードする配列、及びフィターゼ活性を有するタンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ２５、フィツーゼ活性を有するペプチドまたはたんばく質の産生方法で、該フィ ツーゼ活性を有するペプチドまたはたんばく質の産生に適した条件下、請求の範 囲２１乃至２４のいずれか１項記載の形質転換宿主細胞を培養することを特徴と する方法。

２６、請求の範囲２５記載の方法で生産されるフィツーゼ活性を有するペプチド またはたんばく質。

２５、以下に示す特性： ａ）アスベルギラス宿主において発現した場合にＳ　Ｄ　Ｓ　−ＰＡＧＥで８５ ｋＤａの単一バンドを与える、 ｂ）脱グリコジル化後約４８〜５６．５　ｋＤａの範囲の見かけの分子量を有す る、 Ｃ）約１００ＬＩ／■たんばく質の比活性を存する、を示すことを特徴とするフ ィツーゼ。

２８、請求の範囲２６および２７のいずれか１項記載のフィツーゼ活性を存する ペプチドまたはたんばく質を含むことを特徴とする動物用飼料。

２９、フィチン酸塩をイノシトールおよび無機リン酸へ変換するための請求の範 囲２６および２７のいずれか１項記載のフィツーゼ活性を有するペプチドまたは たんばく賞の使用。

３０、請求の範囲２６および２７のいずれか１項記載のフィツーゼを補った飼料 原料を含む飼料を動物に与えることを特徴とする動物の成長の促進方法。

３１、飼料原料中に含まれるフィチン酸塩をイノシトールおよび無機リン酸に変 換させるのに有効な量の請求の範囲２６および２７のいずれか１項記載のフィツ ーゼを補った飼料原料を含む飼料を動物に与えることを特徴とする動物排他物中 のフィチン酸塩レベルの減少方法。

浄書（内容に変更なし） 明　細　書 フィ　−ゼの　ローニングよび　ローニング本発明はフィツーゼの細菌による生 産に関する。

（関連技術） リンは全ての生物の生育に必須の元素である。家畜生産では単胃動物（たとえば ブタ、家禽類および魚類）をうまく生育させるため飼料で無機リンを補給しなけ ればならない。

一方反舞動物の飼料には無機リンを添加する必要がない、こぶ胃に存在する微生 物がフィチン酸塩（ミオ−イノシトールヘキサキス−ホスフェート）をイノシト ールと無機リン酸塩に変換する酵素を生産する。

フィチン酸は植物に由来する全ての飼料中に貯蔵物質として存在する（レヴユー 参照、フィチン酸、化学と応用、Ｅ、グラフ（Ｇｒａｆ）　（Ｗ）　、ビラタス プレス版；ミネアポリス、ＭＮ、アメリカ（１９８６））、フィチン酸は全ての ナツツ、穀物、豆類、油種、胞子および花粉に１〜３％含まれる。フィチン酸の 複合塩はフィチンと呼ばれる。フィチン酸はカルシウム、亜鉛、マグネシウム、 鉄などのミネラルをキレートし、またたんばく質と反応することによりたんばく 質や栄養的に重要なミネラルの生育用性を減らすので抗栄養因子と考えられてい る。

フィチン酸リンは単胃動物の胃腸を通過し、排泄物中に排出されてしまう、結腸 ではフィチン酸塩がいくらか加水分解されるが、無機リンは小腸でしか吸収され ないのでここで発生した無機リンは栄養価をもたない、結局、栄養的に重要なリ ンは飼料中に存在するにもかかわらす単胃動物によって有意に使用されることは ない。フィチン酸リンの排泄物中への排出にはさらに問題がある。

家畜生産はこの１０年間に著しく増大した。これに従がい生成する排泄物量が増 加し、世界中で環境問題を引き起こした０部分的にこれは排泄物由来のリン酸が 地表水に蓄積し富栄養化を起こすことによる。

フィチン酸塩をイノシトールと無機リンに変換する微生物由来の酵素はフィツー ゼとして広く知られている。フィツーゼ産生微生物には枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕ ｓ　５ｎｂｔｉｌｉｓ）　（Ｖ、に、ペーパー（Ｐａｖｅｒ）およびＶ、Ｊ、ジ ャガナサン（Ｊａｇａｎｎａｔｈａｎ）　（１９８２）　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉ ｏｌ＋エエ上、１１０２−１１０８）およびシュードモナス（Ｐｓｅｎｄｏｍｏ ｎａｓ）　（Ｄ、Ｊ。

コスグローブ（Ｃｏｓｇｒｏｖｅ）　（１９７０）　Ａｕ５ｔｒａｌ、　Ｊ、　 Ｂｉｏｌ、　Ｓｃｉ、ｌ工、１２０７−１２２０）などのバクテリア；サツカロ ミセス　セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　 （Ｎ、Ｒ，ナイニ（Ｎａｙｉｎｉ）およびＰ、マーカキス（Ｍａｒｋａｋｉｓ） 　（１９８４）　ＬｅｂｅｎｓｍｉｔｔｅｌＷｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔ　ａｎｄ 　Ｔｅｃｈｎｏ１ｏｇｉｅ土王、２４−２６）などのイースト：およびアスベル ギラス　チリウム（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｔｅｒｒｅｕｓ）などのｍｌ（（ Ｋ、ヤマダ（Ｙａｍａｄａ）　、Ｙ、ミノダ（Ｍｉｎｏｄａ）およびＳ、ヤマモ ト（Ｙａ＋＊ａＩｌｏｔｏ）　（１９８６）　Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ ｅ＋ｗ、　３２．１２７５−１２８２）が含まれる。他のアスペルギラス（Ａｓ ｐｅｒｇｉ　１ｌｕｓ）種もフィツーゼを生産することが知られている。そのう ちアスペルギラスフィカム（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｉｃｕｕｍ）により生 産されるフィツーゼは最も高い比活性を有し、かつ他の微生物によって生産され るフィツーゼよりも高い熱安定性を有していることが分った（未発表の観測）。

単胃動物飼料への微生物フィツーゼ添加の考え方は以前から報告されている（ウ ェア（Ｗａｒｓ）　％　Ｊ、Ｈ８＋　ブラソフ（Ｂｌｕｆｆ）、Ｌ、およびシー （Ｓｈｉｅｈ）、Ｔ、Ｒ，（１９６７）米国特許第３，２９７，５４８号；ネル リン（Ｎｅｌｓｏｎ）　、Ｊ、Ｓ、、　シー（Ｓｈ　１ｅｈ）、Ｔ、Ｒ，、ウオ ドジンスキス−（Ｗｏｄｚｉｎｓｋｉ）、Ｒ，Ｊ、およびウェア（Ｗａｒｅ）　 、Ｊ、Ｈ，（１９７１）　Ｊ。

Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ土立土、１２８９−１２９４）　、　Ｌかし今日まで微生物 酵素生産のコストが高いためこの考え方の応用は商業的に容易ではなかった（Ｙ 、Ｗ、ハン（Ｈａｎ）　（１９８９）　＾ｎ１Ｉｌａｌ　Ｆｅｅｄ　Ｓｃｉ、　 ＆↑ｅｃｈｎｏｌ。

１生、３４５−３５０）、経済的理由で無機リンが単胃動物飼料に添加されてい る。

微生物フィツーゼの他の工業的用途も出てきた。その例としてはとうもろこしや 小麦などの穀物からデンプンを生産する工業プロセスへの応用がある。たとえば 湿潤製粉プロセスからのコーングルテン飼料などを含む排塵物は動物飼料として 売られている。

ステイーピング工程の際にフィツーゼが添加される。菌類フィツーゼについては Ｔ２５０℃およびｐＨ−５，５の条件が理想的である（アルコ社のヨーロッパ特 許出Ｉｎ　０３２１００４参照）、そうすることによりこの工程を経た排塵物か らの動物飼料にはフィチン酸塩の代りにリン酸が含まれることになる。

またフィツーゼは大豆加工にも使用し得ると考えられてきた（アルコ社フィター ゼ酵素、アルコ社発行の製品情報ペンブレッド、ラシャマキ、フィンランド）、 大豆ミールには高レベルの抗栄養因子フィチン酸塩が含まれており、これがこの たんばく賞源をベビーフードや魚子牛および他の非反栃動物の飼料に通さないも のにしている。この価値の高いタンパク質源を酵素的にグレードアップできれば この原料の栄養的かつ商業的価値が上がる。

他の研究者も種々のフィツーゼを研究しこの生産および使用法に興味をもってき ている。ウラ−（Ｕｌｌａｈ）は野生型アスペルギラスフイカム（Ａｓｐｅｒｇ ｉｌｌｕｓ　ｆｉｃｕｕｍ）からのフィツーゼ精製操作を公表すると同時にこの 精製操作で得た産物の生化学的パラメーターのいくつかを測定した（ウラ−（Ｕ ｌｌａｈ）、Ａ、（１９８８ａ）　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ　Ｂｉｏｃｈｅ＋ａ 、エエ、４４３−４５８）、ウラ−（Ｕｌｌａｈ）によって得られた適切なデー タを以下の第１表に示す。

Ａ、フィカム（ｆｉｃｕｕｍ）フィツーゼたんばく賞のＮ−末端アミノ酸配列が ウラ−（Ｕｌｌａｈ）により二度報告された：ウラー（Ｌｌｌｌａｈ）、Ａ、（ １９８７）　Ｅｎｚ）＋ｍｅ　ａｎｄ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｃｏｎｆｅｒ ｅｎｃｅ　ＩＸ　。

１０月４−８　１９８７、サンタバーバラ、カリホルニア（ポスター発表）、お よびウラ−（Ｉｆ　ｌ　１ａｈ）、Ａ、　（１９８８ｂ）　Ｐｒｅｑ、　Ｂｉｏ ｃｈｅｍ。

±１．４５９−４７１．ウラ−（Ｕｌｌａｈ）によって得られたアミノ酸配列は 第１Ａ図配列Ｅに示す。

ウラ−（Ｕｌ　１ａｈ）の報告にはいくつかの興味ある事項が含まれている。第 １にウラ−（Ｌｌｌｌａｈ）　（１９８８ａおよび１９８８ｂ）によって報告さ れている“精製″調製物は５ＤＳ−ＰＡＧＥで２つのたんばく賞バンドを与える 。我々はＡ、フィカム（ｆｉｃｕｕｍ）から精製したフィツーゼには不純物が含 まれており、またウラ−（Ｕｌｌａｈ）がフィツーゼと同定した５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅに見られるバンドの１つはこの不純物に由来するものであることを発見した。

この差はウラ−（Ｕｌｌａｈ＞によって公表されたアミノ酸シーケンシングデー タからも明らかである（１９８７．１９８８ｂ　、第１Ａ図配列Ａおよび配列Ｂ を配列Ｃと比較せよ）、実際にウラ−（Ｕｌｌａｈ）によって報告されたフィツ ーゼの内部ペプチドのアミノ酸配列の１つは（第１Ｂ図、配列Ｅ）はウラ−（Ｕ ｌｌａｈ）の操作で得られる調製物中に存在し、５ＤＳ−ＰＡＧＥの２つのバン ドのうちの１つと見られる１００ｋＤａの混入たんぽ（質に属すると結論した（ ウラ−（Ｕｌｌａｈ）、１９８８ａおよび１９８８ｂ）　、ウラ−（Ｕｌｌａｈ ）はこのような混入たんばく賞の存在を認めず、その代りにそれを別のタイプの フィツーゼであると同定した。このような混入はフィツーゼ活性をコードする実 際のヌクレオチド配列の選択および単離を困難なものにする。さらにこのムラニ ー（Ｍｕｌｌａｎｅｙ）等（繊維状菌類会議、４月、１９Ｂ？、パシフィックグ ローブ、カルホルニア（ポスター発表））もＡ、フィカム（ｆｉｃｕｕｍ）のフ ィツーゼの特性を報告している。しかし、この報告にも、。精製”たんばく質請 製物中の５ＤＳ−ＰＡＧＥにおける２つのたんばく質バンド（１つは８５ｋＤａ 、もう１つは１ｏｏｋＤａ）について述べている。

彼等もこれらのたんばく賞バンドをフィツーゼとして同定した。

微生物宿主をトランスホームする方法も提案されたが報告はされなかった。フィ ツーゼをコードするＤＮＡ配列のクローニングおよび単離についての記述もなか った。

フィツーゼ生産に関する経済的方法はとりわけ動物飼料工業において大きな貢献 をするであろう。より経済的なフィツーゼの生産法の１つは高レベルのペプチド またはたんばく賞を発現させることで知られている種々の微生物において酵素発 現レベルを高める組換えＤＮＡ技術の使用である。しかし今日までフィツーゼ活 性をコードするＤＮＡ配列の単離およびクローニングは報告されていない。

（本発明の概要） 混入はテストするたんばく賞の比活性も低下させることになる。

ウラ−（Ｕｌｌａｈ）が発表した配列に関してさらに述べると、彼は部位１２の アミノ酸残基はグリシンであるとした。しかし、たんばく賞およびＤＮＡシーケ ンシングを用いて我々が調べたところによると一貫してこの残基はグリシンでは なくシスティンであることが分った（第６図および第８図参照）。

最後にウラ−（Ｕｌｌａｈ）はフィツーゼが８５ｋＤａのたんばく賞であり、脱 グリコジル化の後は６１．７ｋＤａの分子量を持つことを公表した（ウラ−（Ｕ ｌｌａｈ）、１９８８ｂ）。初期に報告された７６ｋＤａよりも（ウラ−（Ｕｌ ｌａｈ）、Ａおよびギブリン（Ｇｉｂｓｏｎ）　、Ｄ、（１９８８）Ｐｒｅｐ、 旧ｏｃｈｅｍ、工ＪＩＩＬ、６３−９１）かなり低いこの数字は加水分解により 放出される炭水化物の相対量と５ＯＳ−ＰＡＧＥによる本来のたんばく質の見か けの分子量に基づくものであった。

しかし我々はグリコジル化フィターゼは３５ｋＤａの単一の見かけ上の分子量を 有しているが、一方脱グリコシル化たんばく賞は脱グリコジル化の程度に応じて ４８〜５６．５　ｋＤａの範囲の見かけの分子量を有していることを発見した。

本発明は精製および単離したフィツーゼをコードするＤＮＡ配列を提供する。こ のフィツーゼコードＤＮＡ配列の単離およびクローニングは本発明のために特に 開発した特異的オリゴヌクレオチドプローブを使用して行なわれる。フィツーゼ をコードするＤＮＡ配列はＨｌｌｌｌ、特にアスペルギラス属の繊維状Ｗ類から 得ることが望ましい。

本発明のもう１つの目的は適当な発現宿主中フィツーゼ活性を有するペプチドま たはたんばく質を高度に発現させ得る適当な調節領域に機能的に結合した、少な くとも１つの、好ましくは相同的なフィツーゼコードＤＮＡ配列を少なくともｌ コピー有する発現構築物を含むベクターを提供することである。

本発明により提供される発現構築物を微生物宿主細胞にトランスホームするかゲ ノムに組込み得るベクター、好ましくはプラスミドに挿入される。

さらに本発明の目的は先のバラグラフで述べたベクターでトランスホームしたト ランスホーマント、好ましくは微生物宿主を提供することである。本発明で提供 されるトランスホーメーション用宿主にはアスペルギラス属（Ａｓｐｏｒｇｉｌ ｌｕｓ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ムコール属（Ｍｕｃｏ ｒ）およびペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉ　ｌｌｉｕｍ）などの繊維状菌類、ク ルイベロミセス属（ＫｌｕｙｖｅｒｏＩｌｙｃｅｓ）およびサツカロミセス属（ ＳａｃｃｈａｒｏＩｌｙｃｅｓ）などのイーストまた番よバチルス属（Ｂａｃｉ 　ｌ　Ｉｕｓ）などのバクテリアがある０発現宿主としては特にアスペルギラス 属（Ａｓｐｏｒｇｉ　１ｌｕｓ）の繊維状菌類が好ましい、トランスホームした 宿主は経済的で工業的スケールの高レベル組換えフィツーゼを生産し得る。

もう１つの特徴として本発明はグリコジル化または非グリコジル化型のフィツー ゼ活性を有する組換えペプチドおよびたんばく質、該非グリコジル化ペプチドお よびたんばく賞の生産方法、不純物を含まないフィツーゼ活性を有するペプチド およびたんばく賞、およびこれらのＭ換え、または精製たんばく質と反応するモ ノクローナル抗体に関する。

本発明で得た精製野生型Ａ、フィカム（ｆｉｃｕｕｍ）フィツーゼと、ウラ−（ ＵＩ　Ｉａｈ）の方法で得た精製野生型Ａ、フィカム（ｆｉｃｕｕ＋ｓ）フィツ ーゼの生化学的パラメーターの比較を以下の第１表に示す。

特に比活性のデータが注目されるが、そこには我々が得た精製たんばく質はウラ −（Ｕｌｌａｈ）のたんばく質の２倍の比活性を有することが示されている。

さらに本発明はフィツーゼ活性を有するたんばく賞をコードするヌクレオチド配 列を同たんばく賞のアミノ酸配列とともに提供する。この配列は他の種、特に微 生物種からフィツーゼ遺伝子を同定し、単離およびクローニングを行うハイブリ ダイゼーションスクリーニング実験に用いるオリゴヌクレオチドプローブの設計 に使用し得る。

また本発明で提供される配列は“第２世代”フィツーゼの構築の原料にも使用さ れる。“第２世代゛フィターゼとは突然変異誘発技術（たとえば部位特異的突然 変異誘発など）で変化を受け、本発明の方法で生産した野生型または組換えフィ ツーゼとは性質が異なるフィツーゼである。たとえば至適温度やｐＨ，比活性ま たは基質親和性などをある工程で使用するのに適するよう変化させることができ る。

本発明において、フィツーゼという語には種々のミオイノシトールホスフェート からの無機リンの除去に関する反応を触媒する酵素群が含まれる。

フィツーゼ活性は多くの検定法で測定し得るが本発明にはその選択は重要な意味 をもたない、説明を目的としてフィツーゼ活性は３７℃、ｐＨ５，５０において １μｌ１ｏ１／ｌｌ１ｉｎの速度で１．５　ａ＋Ｍフィチン酸ナトリウムから無 機リンを放出する酵素量を測定して決定する。

本明細書全体を通して使用されている“フィツーゼ”という語はフィツーゼ活性 を存するペプチドおよびたんばく賞金てを含めて使われている。この点は配列Ａ およびＢ（本研究を通して得られた配列）と配列Ｃ（ウラ−（Ｕｌｌａｈ）、１ ９８８ｂで報告されている）を比較した第１Ａ図に示されている。この図は成Ｐ Ａ、フィヵム（ｆｉｃｕｕａ＋）フィツーゼたんばく質の最初の４個のアミノ酸 を欠くたんぽ（質が本発明で得られたこと（配列Ａのたんばく賞は最初の７個の アミノ酸を欠く）を示している。しかし、これらのたんばく賞はフィツーゼ活性 を維持している。フィツーゼたんばく質の完全なアミノ酸配列は、相当するヌク レオチド配列から誘導され第８図に示しである 本発明で生産したフィツーゼはフィチン酸塩をイノシトールと無機リン酸に変換 するのに必要な種々の工程に応用し得る・たとえば本発明のフィツーゼの生産は 微生物フィツーゼの生産コストを減じ、無機リン酸と競合するまでのインビボ価 格／性能比を可能にする動物飼料の経済的応用を実現させる。さらに別の利点と して、排泄物中のリン含量をかなり減少させることがあげられる。

無機リン酸と競争し得る価格で使用可能なフィツーゼの適用は調合飼料工業の自 由度を増し高品質の飼料を生産すると考えられる。たとえば飼料にフィツーゼを 添加した場合は無機リン酸塩の添加を省くことができ、かつフィチン酸塩を含む 種々の原料の含有量も増やすことができる。

先に述べた動物飼料および大豆加工で使用するのに加えて、本発明で得られるフ ィツーゼは以下に示す多様な工業的用途に使用し得る； 一ブタおよび家禽の液体飼料、飼料を与える前に数時間その飼料を浸漬しておく ことは一般に行なわれている。この時点で酵素がフィチン酸塩をイノシトールと 無機リン酸に変換できるであろう。

一フィチン酸塩からイノシトールまたはイノシートルーリン酸塩を生産する工業 的プロセス； 一デンプン工業や醸造工業などの発酵工業などのようにフィチン酸塩を含む基質 を用いる他の工業的プロセス。

フィチン酸による金属イオンのキレート化はこれらのミネラルを生産微生物が使 用できなくしてしまう、フィチン酸の酵素的加水分解はこれらの問題を解消する 。

本発明の目的および利点は以下の詳細な説明でより明確となろう。

図面の簡単な説明 第１Ａ図；精製フィターゼについて決定されたＮ−末端アミノ酸、ＡおよびＢと 印されたアミノ酸配列は本発明で提供されたものであり、各々等電点５．２およ び５．４をもつフィツーゼ亜型に由来する。配列Ｃはウラ−（Ｕｌｌａｈ）　（ １９８７，１９８８ｂ　、上述）によって示されたものである。配列ＡおよびＢ の部位１２にあるアミノ酸残基は本発明によりグリシン残基ではないことが決定 された〔＊は明確な同定ができなかったことを示し、＊＊は残基が検出されなか ったことを示す〕 第１Ｂ図；ＣＮＢｒ切断によるアミラーゼ内部フラグメントのＮ−末端アミノ酸 配列。ＡおよびＢと印されたアミノ酸配列（各々見かけの分子量は約２．５　ｋ Ｄａおよび３６ｋＤａである）は本発明で提供されたものである。配列ＣからＦ はウラ−（Ｕｌｌａｈ）　（１９８８ｂ、上述）により報告されたものである） 。

第１Ｃ図；本発明により粗フィターゼ試料中に存在することが分った１００ｋＤ ａのたんばく質のＮ−末端アミノ酸配列。

第２Ａ図；第１Ａ図、ペプチドＡからＥのデータに基づいて設計したオリゴヌク レオチドプローブ。

第２Ｂ図；第１Ｂ図、ペプチドＡおよびＢのデータに基づいて設計したオリゴヌ クレオチドプローブ。

第３図；酸ホスファターゼをコードする遺伝子の単離に用いたオリゴヌクレオチ ドプローブ。

第４図ｉＡ、フィカム（ｆｉｃｕｕｍ）のアミラーゼ部位を含むバクテリオファ ージラムダＡＦ２０１の制限地図。矢印はアミラーゼ遺伝子の位置と転写の方向 を示している。クローン＃はｐＡＮ８−１　（ｐＡＦ２８−１について）および ｐＵｃ１９（他の全てのサブクローンについて）においてファージＡＦ２０１か ら指示されている制限酵素を用いて誘導されたサブクローンを示している。

第５図；ｐＡＦｌ−１の物理地理。ｐＵｃ１９に挿入されている１　０ｋｂ　Ｂ ａＩＩＩＨＩフラグメントはＡ、ライカム（ｆ　ｉｃｕｕｍ）由来の酸ホスファ ターゼをコードする遺伝子全体を含んでいる。

第６図；染色体アミラーゼ遺伝子部位を含むプラスミドｐＡＦ２−３、ｐＡＦ２ −６およびｐＡＦ２−７のヌクレオチド配列の編集、アミラーゼコード領域はヌ クレオチド２１０番から１７１３番の間にある。染色体遺伝子のヌクレオチド２ ５４番と３５５番の間はイントロンである。制限部位、アミラーゼ開始および終 止コドンおよびインドロンの位置などの関連する特性も示しである。

第７図；シーケンスしたアミラーゼ染色体部位の詳細な物理地図；矢印はアミラ ーゼコード領域の２つのエクソンの位置を示している。

第８図；フィターゼｃＤＮＡフラグメントの翻訳領域のヌクレオチド配列および それから誘導されるアミラーゼたんばく質のアミノ酸配列；成熟フィターゼたん ばく賞の開始コドンは＋１の位置で示されている。３６ｋＤａの内部たんばく賞 フラグメントのアミノ末端はアミノ酸２４１番に位置し、一方、２．５　ｋＤａ たんばく質フラグメントはアミノ酸３９０番から開始する。

第９図；アミラーゼ発現カセットｐＡＦ２−２３の物理地図。

矢印は遺伝子の転写方向を示している。

第１０図；Ａ、ライカム（ｆｉｃｕｕｍ）　ＮＲＲＬ３１３５　）ランスホーマ ントにおけるアミラーゼ過剰発現を示すＩＥＦ−ＰＡＧＥ。

同一条件下で生育させた等容量のＡ、ライカム（ｆｉｃｕｕｍ）　（レーン１） およびトランスホーマントｐＡＦ２−２３　ＳＰ？　（レーン２）の培養上清を ｐＨ範囲４．５〜６のファスト−システム（ファルマシア）ＩＥＦ−ＰＡＧＥゲ ルで分析した。比較のため、均一にまで精製したＡ、ライカム（ｆｉｃｕｕｍ） アミラーゼ試料も別個に（レーン４）、もしくは上滑と混ぜて（レーン３）分析 した。このゲルはテキストで述べたホスファターゼ染色法（Ａ）もしくは−ｉ的 たんばく賞染色法（コマージブリリアントブルー、８）で染色した。アミラーゼ のバンドはアステリスクで示しである。

第１１図；Ａ、ニガー（ｎｉｇｅｒ）　ＣＢ　Ｓ　５１３．８８　）ランスホー マントにおけるアミラーゼの過剰発現を示すＩＥＦ−ＰＡＧＥ、Ａ。

ニガー（ｎｉｇｅｒ）親株（レーン１）またはトランスホーマントｐＡＦ２−２ Ｓ＃８　（レーン２）　、ｐＦＹＴ３＃２０５　（レーン３）および＃２８２（ レーン４）の各培養上清等容量を第１０図の脚注に示したようにＩＥＦ−ＰＡＧ Ｅで分析した。ゲルは一般的ホスファターゼ活性染色法（Ａ）または一般的たん ばく賞染色法ＣＢ）で染色した。アミラーゼのバンドはアステリスクで示しであ る。

第１２図；ｐＡＢ６−１の物理地図、ｐＵｃ１９中の１４．５ｋｂＨｉｎｄ　Ｉ ［［ＤＮＡ挿入物にはＡ、ニガー（ｎｉｇｅｒ）由来の全グルコアミラーゼ（Ａ Ｃ）部位が含まれている。

第１３図；ボリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）によるＡＣプロモータ ー／フィターゼ遺伝子融合物生成を示す模式図。

使用するすべてのオリゴヌクレオチドの配列はテキスト中に示した。

第１４図；フィターゼ発現力セッ）ｐＡＦ２−２３Ｈの物理地図。

第１５図；中間構築物ｐＸＸＦＹＴ１、ｐＸＸＦＹＴ２およびアミラーゼ発現カ セットｐＸＸＦＹＴ３　（名称中のＸＸはリーダー配列（Ｌ）を示している）の 物理地図、ｐ１８ＦＹＴ＃およびｐ２４ＦＹＴ＃では各々１８ａａおよび２４ａ ａＡＧリーダー配列が挿入されているがｐＦＹＴ＃の場合はアミラーゼのリーダ ー配列が使用されている。

第１６図；プラスミドｐＦＹＴ３Δａｎ＋ｄ　Ｓの物理地図。

第１７図；プラスミドｐＦＹＴ３１ＮＴの物理地図。

第１８図；フィターゼ／ＡＧ置換ブタターｐＲＥＰＦＹＴ３の物理地図。

第１９図；ＰｖｕＩＩ（Ａ＞およびＢａｍＨＩ　（Ｂ）で消化し、かつプローブ として３１ｐＨｌ化Ａ、ライカム（ｆｉｃｕｕｍ）アミラーゼｃ　ＤＮＡはハイ ブリダイズした微生物Ｓ、セレビシェ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（レーン２）、 Ｂ、サプチラス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）　（レーン３）１．ラクチス（Ｉａｃｔｉ ｓ）　（レーン４）、Ｐ、クリソゲナム（ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）　（レーン５ ）、Ｐ、エルギノーザ（ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）　（レーン６）、Ｓ、リビダン ス（ｌ１ｖｉｄａｎｓ）　（レーン７）、ｌ、ニガー（ｎｉｇｅｒ）　Ｉ　Ｉ　 ｇ　（レーン８）、Ａ、ニガー（ｎｉｇｅｒ）　５　、ｃｒ　ｇ　（レーン９） 、ブランク（レーン１０）、Ｃ，サーモセラム（ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）　 （レーン１１）の染色体ＤＮＡのオートラジオグラム。レーンｌはマーカーＤＮ Ａ。

（発明の詳細な説明） 微生物において生産される選択されたたんばく質をコードする遺伝子のクローニ ングは様々な方法で行われる。１つの方法には目的たんばく賞の精製、そのＮ− 末端アミノ酸配列の決定、および該Ｎ−末端アミノ酸配列に基づ＜ＤＮＡオリゴ ヌクレオチドプローブを用いた該微生物のゲノムライブリーのスクリーニングが ある。この方法の成功例にはセファロスポリウム　アクレモニウム（Ｃｅｐｈａ ｌｏｓｐｏｒｉｕｍ　ａｃｒｅｍｏｎｉｕｓ）からのインペニシリンＮ−シンセ ターゼ遺伝子のクローニング（Ｓ、？１．サムソン（Ｓａｍｓｏｎ）等（１９８ ５）　Ｎａｔｕｒｅ、　３１８．１９１−１９４）およびアスペルギラス　オリ ゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）のＴＡＫＡアミラーゼをコードす る遺伝子の単１１！（ボール（Ｂｏｅｌ）等（１９８６）　Ｅ　Ｐ　−Ａ−０２ ３８０２３）がある。

この方法を用いアミラーゼをコードするアスペルギラス　ライカム（Ａｓｐｅｒ ｇｉｌｌｕｓ　ｆｉｃｕｕｓ＋）の遺伝子を単離してみた。このたんばく賞を十 分精製し、いくつかの生化学的パラメーターを測定した。

このデータをウラ−（Ｕｌｌａｈ）　（１９８８ａ）、これらのデータを以下の 第１表に示す。

第　１　表 精製野生型Ａ、フライム（ｆｉｃｕｕｍ）フィツーゼの生化学的パラメータパラ メータ　本発明　ウラ−（Ｕｌｌａｈ）比活性”　１００１１／ｍｇたんば＜１ 　５００／ａ＋ｇたんばく質純度：５ＤＳ−ＰＡＧＥ　８５　ｋＤａ　８５　ｋ Ｄａ／１００ｋＤａ：ＩＥＦ−ＰＡＧＥ　３または４バンド　測定せずＫＩｌ（ アフィニティ　定数）　２５０　μＭ　４０　μｉ特異性 イノシトールー１−Ｐ　活性なし　活性なしイノシトール−２−Ｐ　Ｋｍ＝３． ３ｍＭ　５　％活性至適ｐＨ２，５および５．５　２．５および５．５至適塩度 （ｔ）　５０　５８ ＭＷ　（ｋＤａ）”″　８５　８５および１００ＭＷ（非グリコシル　化）”　 ５６．５　６１．７等電点””　５．０〜５．４　４．５ ＊　ウラ−（Ｉｌｌｌａｈ）はフィツーゼ活性を３７℃ではなく５８℃で測定し ている。ライターゼ活性１ユニットは３７℃およびｐＨ５，５０において１．５ 　ｍＭフライン酸ナトリウムから１μｍｏｌ　／ｗｉｎの速度で無機リンを放出 する酵素量と定義する０発酵収率および比活性を比較するために、ウラ−（Ｕｌ ｌａｈ）によって発表された活性は温度補正した。この補正はウラ−（Ｕｌｌａ ｈ）　（１９８８ｂ）の第１表に示されている３７℃および５８℃で測定したフ ィツーゼ活性の差に基づいている。

＊＊　５ＤＳ−ＰＡＣ，Ｅで測定した見かけ上の分子量。

＊＊＊　ＩＥＦ−ＰＡＧＥで測定したもの。

ライターゼをコードする遺伝子と単離するため、上述の方法に従って第１組のオ リゴヌクレオチドプローブを設計した（第２Ａ図）。これらのプローブの設計は アミノ酸配列データに基づいている。全操作のコントロールとして、ウラ−（０ １１ａｈ）およびカミンス（Ｃｕｍｎ＋１ｎｓ）　（（１９Ｂ？）　Ｐｒｅｐ、 　Ｂｉｏｃｈｅｍ、土工、３９７−４２２）によって発表されたたんばく質デー タを用い酸ホスファターゼをコードする遺伝子を単離するため同一の操作を行っ た。酸ホスファターゼの場合、相当する遺伝子は困難なく単離された。しかし、 フィツーゼの場合、状況は少し異なっていた。Ｎ−末端アミノ酸配列から誘導し たプローブを用いる実験を多数行ったにもかかわらずフィツーゼをコードする遺 伝子を含むと同定されるゲノムＤＮＡフラグメントまたはクローンはゲノムライ ブラリーから単離することができなかった。

この問題を解決するため精製フィツーゼをＣＮＢｒ処理で切断し、生じたたんば く質フラグメントを単離した。これらのフラグメントのＮ−末端アミノ酸配列を 決定しく第１Ｂ図）、新しいこれらのデータに基づきオリゴヌクレオチドプロー ブを設計した（第２Ｂ図）、′ｊｌｔりべきことに新しいオリゴヌクレオチドプ ローブは特異的ＤＮＡフラグメントを同定し、したがってゲノムライブラリーか らのクローンを明確に同定するのに適していた。新しいクローンまたはそれらか ら単離されたＤＮＡフラグメントおよび第１組のオリゴヌクレオチドプローブま たはこれらの第１組のプローブを用いて単離したクローン間にクロスハイブリダ イゼーションは見られなかった。

第２組のプローブも関連フィツーゼのコード配列を同定するのに使用し得ると考 えられる。

新しく単離したクローンをノーザンブロソトハイブリダイゼーションのプローブ として用いた。フィツーゼ生産菌糸体からｍＲＮＡを単離すれば個々のｍＲＮＡ を検出することができる。非うイターゼ生産菌糸体からのＲＮＡを試した場合、 ハイブリダイゼーションシグナルは見られなかった。このｍＲＮＡは約１８００ ｂの大きさを有しており、理論的には最高分子量約６０ｋＤａのたんばく賞を生 ずる。この値は非グリコシル化たんばく質に対して測定された分子量およびＤＮ Ａ配列から誘導されるたんばく質の分子量に相当する。

さらに、トランスホーメーションで菌類細胞に導入されたとき、フィツーゼ活性 の増加が示された。結果的にこのことはフィツーゼをコードするヌクレオチド配 列が実際に単離されたことを意味している。精製したフィツーゼ酵素およびそこ から得られた（ＮＢｒフラグメントについて決定されたアミノ酸配列はクローン 化した遺伝子について決定された配列から誘導されるアミノ酸配列と一致した。

このヌクレオチド配列および誘導されるアミノ酸配列を第６図および第８図に示 した。これらはフィツーゼをコードするクローン化した配列を示している。

フィツーゼをコードするヌクレオチド配列の単離により、遺伝子項中、たとえば プロモーター、分泌シグナルなどの調節要素の交換、もしくはこれらの組合せな どの組換えＤＮＡ技術を応用して工業的スケールでフィツーゼを経済的に生産で きる。

従って本発明にはフィツーゼ活性を有するペプチドまたはたんばく賞を高レベル に効率よく発現し得、かつ望ましい場合には同様に酸ホスファターゼも効率よく 発現し得るトランスホームした発現宿主も含まれる。目的とする発現宿主はアス ペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉ　１１ｕｓ）、トリコブル？　（Ｔｒｉｃｈｏｄｅ ｒ糟ａ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）およびペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕ ｍ）　＊から選ばれる繊維状菌類クルイベロミセス（Ｋ　ｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃ ｅｓ）およびサツカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）から選ばれるイー ストおよびバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）などのバクテリアである０発現宿主に は内在たんばく質を効率的に分泌し得るものを選択することが望ましい。

工業的株としてはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）特にニガー（ｎｉ ｇｅｒ）　、、ライカム（［ｉｃｕｕｍ）　、アワモリ　（ａｗａｍｏｒｉ）ま たはオリゼ（ｏｒｙｚａｅ）が興味深い、別にトリコンデルマ　リーセイ（τｒ ｉｃｈｏｎｄｅｒ＋ｗａ　ｒｅｅｓｅｉ）、ムコール　ミーヘイ　（Ｍｕｃｏｒ 　ｍ１ｅｈｅｉ）、クルイベロミセス　ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ 　１ａｃｔｉｓ）　％サツカロミセス　セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ ｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　、バチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕ ｂｔｉｌｉｓ）またはバチルス　リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃ ｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）　も使われる。

発現構築物には発現すべき望ましい酵素産物をコードするヌクレオチド配列を含 み、かつ通常、宿主中で機能しその産物ペプチドまたはたんばく賞の分泌を起こ すシグナルペプチドを有する。

本発明に従かい種々のシグナル配列が用いられる０発現されるクローン化ヌクレ オチド配列と同種のシグナル配列が使用される。

一方、別に宿主のターゲット部位にある遺伝子のシグナル配列と実質的に同種の シグナル配列を用いると相同組換えが容易に起こる。さらに、選択した宿主から の分泌を改善するよう設計したシグナル配列も使用される。たとえばヴオン　ヘ イン（Ｖｏｎ　Ｈｅｙｎｅ）（１９８３）　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、 上ｎ、１７−２１；およびパールマン（Ｐｅｒｌｍａｎ）およびハルバーマン（ Ｈａｌ　Ｖｅｒｓｏｎ）　（１９８３）　Ｊ、　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、上立工、３９１−４０９参照、シグナル配列をコードするＤＮＡ配列 をプロセシングシグナルをコードする配列を介しく切断認識部位）目的たんばく 賞をコードする配列に直接接合する場合と、短かい橋架、通常１０個以下のコド ンを介して結合する場合がある。

本発明の範囲で使用する分泌シグナル配列は発現させるクローン化したヌクレオ チド配列と同種のシグナル配列、１８個のアミノ酸からなるグルコアミラーゼ（ ＡＧ）シグナル配列および２４個のアミノ酸からなるグルコアミラーゼ（ＡＣ） シグナル配列（後者の２つは発現するヌクレオチド配列と同種の場合と異種の場 合がある）が望ましい。

目的の発現産物、またはヌクレオチド配列が発現宿主と同種の場合も異種の場合 もある。

１同種”ＤＮＡとは同じ属に由来するＤＮＡと定義する。たとえばアスペルギラ ス（Ａｓｐｅｒｇｉ　１１ｕｓ）をアスベルギラス（八ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ） のＤＮＡでトランスホームする場合である。このようにすることで以前にその属 に存在しなかった新しい性質を導入することなしにその菌類の属の既存の性質を 改善することができる。

“異種”ＤＮＡとは１つ以上の属に由来するＤＮＡで、すなわち前のバラグラフ で述べた例から分るようにアスペルギラス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）以外の属 に由来するＤＮＡでアスペルギラスで発現される場合のＤＮＡと定義される。

フィツーゼ活性をコードするヌクレオチド配列は菌類を起源とすることが望まし い。さらにこのフィツーゼコードヌクレオチド配列はアスペルギラス（Ａｓｐｅ ｒｇｉｌｌｕｓ）属に由来することがより好ましい。またその配列はアスペルギ ラス　ライカム（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｉｃｕｕｍ）またはアスペルギラス 　ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）種に由来することが最も好ま しい。

問題のヌクレオチド配列の読み枠の５′側領域には転写開始調節領域（またはプ ロモーター）が含まれる。宿主中でｍ能する領域なら、発現すべきフィツーゼコ ードヌクレオチド配列と同種のプロモーターも含めてあらゆる領域を使用し得る 。しかし、はとんどの場合、使用する領域は標的部位の領域と同種のものとなる 。

これには標的部位の発現産物を問題とする発現産物で置換する効果がある。標的 部位にコードされているたんばく賞の発現および分泌のレベルが十分なものであ ればこの転写開始調節領域は一般に満足すべきものであることが分る。しかし、 場合によっては標的部位遺伝子よりもより高い転写が望まれることもあるし、ま た特定の誘導剤を用いた誘導可能な発現を行うこともある。このような場合、標 的部位遺伝子の領域とは異なる転写開始調節領が使用される。繊維状菌類内で機 能する多くの転写開始調節領域が知られている。これらの領域にはグルコアミラ ーゼ（ＡＣ）、菌類アミラーゼ、酸ホスファターゼ、ＧＡＰＤＨ、ＴｒｐＣ，Ａ ｍｄＳ、、Ａ　ｌｃＡ　％ＡｌｄＡ、ヒストンＨ２Ａ　、、ｐｙｒ４、ＰｙｒＧ 、イソペニシリンＮシンセターゼ、ＰＧＫ　、酸プロテアーゼ、アシルトランス フェラーゼなどをコードする遺伝子由来のものが含まれる。

その標的部位は高発現たんばく質遺伝子、すなわち発酵工程の終りにその発現産 物が少な（とも約０．１ｇ／ｆの濃度にまで発現される遺伝子をコードしている ことが望ましい、このプロセスでとり扱われる目的たんばく質は様々である。こ のような遺伝子の例としてはグルコアミラーゼ（ＡＣ）をコードする遺伝子が挙 げられる。目的遺伝子としてはその他に菌類α−アミラーゼ、酸ホスファターゼ 、プロテアーゼ、酸プロテアーゼ、リパーゼ、フィツーゼ、およびセロビオヒド ラーゼがある。特に好ましい標的部位にはＡ、ニガー（Ａ、　ｎｉｇｅｒ）のグ ルコアミラーゼ遺伝子、Ａ。

オリゼ（ｏｒｙｚａｅ）の［１アミラーゼ遺伝子、Ｔ、リーセイ（ｒｅｅｓｅｉ ）のセロビオヒドラーゼ遺伝子、ムコール　ミニヘイ　（Ｍｕｒｏｒｍｉｅｈｅ ｉ）の酸プロテアーゼ遺伝子、クルイベロミセス　ラクチス（Ｈｕｙｖｅｒｏ票 ｙｃｅｓ　１ａｃｔｉｓ）のラクターゼ遺伝子またはサンカロミセス　セレビシ ェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のインバーターゼ遺 伝子がある。

転写開始調節領域には目的遺伝子、標的部位、またはその他の簡便な配列に由来 する。構築物が目的の遺伝子の下流に（転写の方向で）さらに目的配列を含む場 合、転写終止調節領域はこれが標的部位と同種であるならその同種隣接領域より も実質的に小さくなければならない。

通常、発現構築物の１部としてか、または発現構築物とは別に存在し、結果的に 目的遺伝子とは異なる部位に組込まれた選択可能マーカーを用いる。本発明の組 換え分子は工業生産に適した宿主株へトランスホームすることが望ましいので、 トランスホーマンヨンをモニターする選択マーカーは優性選択マーカー、すなわ ち宿主株に変異を導入せずに使用できる選択マーカーであることが望ましい、こ れらの例にはトランスホーマントを決った栄養培地で生育させ得るマーカー（た とえばＡ、ニズランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）　ａＩＩＩｄ　Ｓ遺伝子はＡ、ニガ ー（ｎｉｇｅｒ）　）ランスホーマントの単一窒素源としてアセトアミドを用い た生育を可能とする）または抗生物質に対する耐性を付与するマーカー（たとえ ばｂｌｅ遺伝子はフレオマイシンに対する耐性、ｈｐｈ遺伝子はハイグロマイシ ンＢに対する耐性を付与する。）がある。

選択マーカーはそれ自身転写および翻訳開始および停止調節領域を有し、そのマ ーカーの独立した発現が可能である。先に述べたように非常に多くの転写開始調 節領域が知られており、これらのマーカー遺伝子と組合せて用いられている。抗 生物質耐性が採用された場合、選択用抗生物質の濃度はその種類に応じて約３０ 〜３００μｇ／−の範囲で使用される。

制限処理、相補的制限部位の結合とライゲーション、突出末端の平滑化と平滑末 端のライゲーション、Ｂａ１３１再結合、プライマー修復、インビトロ突然変異 誘発などの従来技術を用いて様々な配列を連結し得る。適当な場合はアダプター やポリリンカーを用い従来法で導入あるいは除去を行なって発現構築物の構築を 容易に行うことができる。構築物合成の各段階で、フラグメントのクローン化、 制限酵素、シーケンシングやハイブリダイゼーシヨンによる解析が行ない得る。

クローニングには多くのベクターが使用可能でありその選択は本発明にとって本 質的なものではない。

通常クローニングには大腸菌を用いる。

隣接領域には標的部位の読み枠の少なくとも一部、特に標的部位遺伝子の５′側 および３′側調節領域を含むか、もしくはその調節領域を越えて伸びている。そ の隣接領域は少なくとも１００ｂｐであり普通は少なくともｚｏｏｂｐであるが 、５００ｂｐ以上のこともある。この隣接領域は標的遺伝子を破壊し、その発現 を妨害するように選択される。このことは発現カセット（発現すべき配列と場合 によっては、シグナル配列、転写開始調節領域配列および、または転写停止調節 領域配列などの付加的要素を含む）をその５′領域に隣接する読み枠に挿入する こと、標的遺伝子の全てまたは一部を発現構築物で置換すること、または標的部 位の転写開始調節領域とその読み枠の間に発現構築物を介在させることにより行 ない得る。すでに述べたように低下調節領域が標的部位の領域と同種の場合、そ の３′隣接領域は実質的に構築物中に存在する停止調節領域より大きくなければ ならない。

また本発明は“第２世代”フィツーゼ、すなわちここで単離した酵素とは異なる 性質を有するフィツーゼを構築するための原料を提供する。第２世代フィツーゼ は至適温度や至適ｐＨ１比活性や基ｔａ和性、または所定の工程に応用する場合 の種々の適合性が変化したものといえる。大腸菌はこのような突然変異誘発（す なわち部位指定突然変異誘発）にもっとも適した宿主である。大腸菌はフィラー ゼ遺伝子中に存在するイントロンを除去するスプライシング機構を欠いているた め、ライターゼのｃＤＮＡクローンは大腸菌中で発現するよう選択された配列で ある。このｃ　ＤＮＡ配列は従来法を用いて容易に変異させることができ、その 後この変異遺伝子を望ましい発現構築物中に導入する。

この構築物は一本鎖または二本鎖のクローニングベクターとして宿主にトランス ホームすることもできるし、また望まれるならクローニングベクターから除くこ ともできる。このクローニングベクターはプラスミドであることが好ましい０通 常プラスミドは目的の遺伝子の約１　ｋｂｐ以内で線状化される０本発明のライ ターゼ生産のための発現構築物は選択された発現ホストのゲノム中に導入される ことが望ましい。

繊維状菌類のトランスホーメーションには多くの方法がある。

この方法にはプロトプラスト融合またはトランスホーメーション、エレクトロボ レーシラン、および微粒子衝突法がある。プロトブラストトランスホーメーショ ン法はうまく行き都合が良い。

までＫＣｌまたはソルビトールなどの浸透圧安定剤の存在下、目的の菌類の菌糸 体を細胞膜の酵素消化によりプロトプラストに変換する。このプロトプラストに よるＤＮＡの取り込みはＣａＣ１□やポリエチレングリコール濃厚溶液により促 進される。後者の物質はプロトプラストの凝集を起こす、この過程でトランスホ ームＤＮＡが凝集体の中に包含され、このプロトプラストに取り込まれる。つづ いてこのプロトプラストは浸透圧安定剤および適当な場合はトランスホームＤＮ Ａ上に耐性をコードしである選択試薬を含む固形培地上で再生させる。

トランスホーマントの選択後、目的遺伝子の存在は種々の方法で測定できる。発 現産物が宿主と異種である場合抗体を使用することにより、目的遺伝子の発現を 検出し得る。それとは別にサウザンまたはノーザンブロノトを用いて組込み遺伝 子または転写産物の存在を検出できる。

目的のヌクレオチド配列又は発現構築物の増巾は、トランスホームベクターへの 多数の構築物コピーの導入または選択マーカーとしてのａｎｄ　Ｓ遺伝子の使用 など標準的方法で行うことができる（たとえばウエイナンス（Ｗｅｉｎａｎｓ） 等（１９８５）　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｇｅｎｅｔｊｃｓ。

工、３６１−３６８）、増巾するＤＮＡ配列には上述どおり発現宿主と同種また は異種のＤＮＡが含まれる。

それからこの細胞を筒便な栄養培地で生育させる。低濃度のプロテアーゼインヒ ビター、たとえばフェニルメチルスルホニルフルオライド、α２−マクログロブ リン、ペプスタチンなどが使われる。通常この濃度は約１μｇ／−から１■／− の範囲である。

目的たんばく賞の変性を回避または減少させるためプロテアーゼ遺伝子を不活性 化することもできる。

このトランスホーマットをバッチあるいは連続発酵器で生育させ、栄養培地を単 離して目的たんばく賞を抽出する。

この産物を精製する必要がある場合は、種々の方法、たとえばクロマトグラフィ ー（たとえばＨＰＬＣ）、溶媒−溶媒抽出、電気泳動、これらを組合せた方法な どを行う。

また本発明は発酵培地（場合によっては精製したもの）を濾過し、ついで２回目 の無菌濾過を行なって濾液を濃縮する処理法も提供する。このようにして得た濃 縮液は以下のように使用する。

ａ）　攪拌しながらこの濃縮液にアセトンを最終濃度６０％（ν／Ｖ）となるよ うに添加しフィツーゼおよびその他のたんばく賞を沈澱させる。この沈澱は３５ ℃、減圧下で乾燥させる。乾燥粉末をグラインディングした後、適用実験に用い るようにこの酵素産物を使用する。回収率は約９０％である。

ｂ）　この濃縮液を従来の噴霧乾燥法を用いて噴霧乾燥する。回収率は８０〜９ ９％である。

Ｃ）　この濃縮液を小麦もみがらなどのキャリヤー物質と混ぜる。

この混合物を噴霧塔または流動床中で乾燥させる。

ｄ）　この濃縮液にたとえばゾルビトールを添加して浸透圧を安定化させる。安 息香酸などの防腐剤を加えて微生物の混入を防ぐ。

これら４種の加工物は調合製造業、合成飼料業、その他の配給業者および農家に 販売される。

ここに示す例は本発明を説明するものでこれを制限するものではない０本発明の フィツーゼ遺伝子は他の微生物由来のライターゼコード遺伝子の単離を目的とし た異種ハイブリダイゼーシヲン実験で使用し得ることは当業者にとって明白であ ろう。

（例１）Ａ、ライカム（ｆｉｃｕｕｍ）　ＮＲＲＬ３１３５の発酵アスペルギラ ス　ライカム（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｉｃｕｕｍ）　Ｎ　ＲＲＬ３１３５ 株はノーザンリージョンリサーチラボラトリー、ＵＳ口Ａ、１８１５ノースユニ バーシティ−ストリート、ペオリア、イリノイ州、ＵＳＡから入手した。菌類胞 子調製は標準法に従って行った。

胞子のその細胞は三角フラスコ中での一連のバッチ発酵を介して１０１の発酵槽 に移した。バッチ培養後、この発酵槽の中味を最終的な５００す、トルバッチ発 酵用の接種物として用いた。

使用した培地には９１　ｇ／ｌのコーンスターチ（ＢＤＨケミカルズ社）；３８ ｇ／ｌゲルコール・ｕｚｏ　ｉ　Ｏ，６ｇ　／　ｌ１Ｍｇ５Ｏａ・７ＨＪ　：０ ．６ｇ／ｌ　ＫＣｌ；０．２ｇ／Ｉ　Ｆｅ５Ｏａ・７ＨｚＯおよび１２ｇ／ｌＫ ＮＯ３が含まれている。このｐＨは４Ｎ　ＮａＯＨまたは４ＮＨｚＳＯ４を用い た自動滴定により４．６±０．３に維持した。

細胞は２５％空気飽和の溶存酸素濃度に自動制御しながら２８℃で増殖させた。

発酵１０日後でフィツーゼ生産は５〜ＩＯＵ／−の最高レベルに達した。

（例２） Ａ、ライカム（ｆｉｃｕｕｏ＋）フィツーゼの精製と特性Ａ、フライーゼ活性検 定 培地濾液（必要ならば希釈）または上清１００μ！または参照として水１００μ βに以下の組成のインキュベーシッン混合物を加える。

−０，２５Ｍ酢酸ナトリウムバッファ　Ｐ）１５．５、または−グリシンーＨＣ Ｉｔバッファ、ｐＨ２，５−１ｍＭフィチン酸ナトリウム塩、 −水９００μｌとなるまで。

この混合物を３７℃で３０分間インキュベートする０反応は１０％ＴＣＡ（トリ クロロ酢酸）１−を加えて停止する０反応停止後・２−の試薬（５０１Ｒ１のモ リブデン酸アンモニウム溶液（２，５ｇ（ＮＨ４）　ｂＭＯｑｏｔａ　・４）１ １０および３　ｍｌ　１（ｚｓＯａを水で２５（ｌＮ１まで希釈したもの）中３ ．６６　ｇ　ＦｅＳＯ４・７８ｚＯ溶液）を添加する。

７５０ｎｗの青色強度を分光測定する。この測定値は０〜ＩＩＩＩＩｌｏ１／ｌ の範囲のリン酸校正曲線により放出されたリン酸量を指定する。

（ホスファターゼ） ホスファターゼ活性を存する成分は一般のホスファターゼを用いた等電点フォー カシングにより検出する。このゲルをα−ナフチルホスフェートとファーストガ ーネットＧＢＣ塩（シグマ、各々０．１％および０．２％（ｗ／ｖ）の０．６　 Ｍ酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ５，５）溶液とインキュベートする。黒色沈澱 が出現するこの反応はメタノール：酢ａ（３０：１０％、ｖ／ｖ）で停止するが 、さもなければ蒸留水ですすぐことにより必要とされるフィツーゼ活性たんばく 賞を回収する。

Ｂ、　Ａ、ライカム（ｆｉｃｕｕｍ）フィツーゼの精製フィツーゼはＡ、ライカ ム（ｆｉｃｕｕｏ＋）　ＮＲＲＬ　３１３５の培養培地から均一になるまで精製 した。まずこの培地を濾過で無菌状態にした。この培養濾液はつづいて３０ｋＤ カツトオフフイルターを用いたフィルトロン限外濾過ユニットでさらに濃縮する 。この試料のｐＨおよびイオン強度は試料を１０ｍＭ酢酸バッファ　（ｐＨ４， ５）で洗うことにより調整した。この限外濾過操作による最終濃縮率は約２０倍 であった。

この試料をウォーターズ分取用６５０アドバーンスプロテイン精製システムでカ チオン交換カラムにチャージする（ＨＲ１６／１０　２（１Ｍ１カラム中Ｓ−セ ファロースファーストフロー、いずれもファルマシアから入手可能）、結合した たんばく賞は酢酸バッファ中０〜ＩＭの塩化ナトリウム勾配で溶出する。フィツ ーゼは約２５０ｍＭ　ＮａＣ１で溶出する。ライターゼ活性含有フラクションを 採取し、４縮後限外濾過で脱塩する。この溶液をアニオン交換カラムにチャージ しくファルマシア、ＨＲ１６／１０　２０ｄカラム中Ｑ−セファロースファース トフロー）、再び先に述べたように酢酸バッファ中Ｏ〜ＩＭの塩化ナトリウム勾 配で溶出する。

フィツーゼは約２０　Ｏｎ＋Ｍ　Ｎａ１ｌで溶出する。

この精製ステップは約４０〜５０Ｕ／■たんばく賞の比活性を示す部分精製フィ ツーゼ調製物を与え、これは２５倍の精製に相当する。

部分精製フィツーゼの純度分析は分子量約１００ｋＤａの主要不純物の存在を示 している（第１Ｂ図、配列Ｅ）０等電点フォーカシングは３〜４個のフィツーゼ 亜型を含むいくつかのライターゼ活性含有酵素の存在を示している（５．０〜５ ．４の間の等電点）（第１Ａ図、配列ＡおよびＢ）。

均一なフィツーゼ調製物を得るため、アンホリンＰＡＧプレート（ｐＨ範囲４〜 ６．５）上ＬＫＢマルチフォーシステムでの等電点フォーカシングにより部分精 製フィツーゼ成分の分離でさらに２倍の精製を行った。フィツーゼ活性を有する たんば←質（フィツーゼを含む）は先に述べた一般的ホスファターゼ染色法で検 出した。つづいて目的バンドをゲルから切り出し、そのゲル片を１０ＩＩＭ酢酸 ナトリウムバッファ　（ｐＨ５，５）中１６時間インキュベーションすることに より活性たんばく賞を溶出させる。このたんばく賞フラクシシンを例２で述べた ライターゼ比活性検定で分析し、フィツーゼフラクションと他の酸ホスファター ゼとを区別する。

フィツーゼの最終精製度は約６０倍であった（最終精製物の比活性は約１００Ｕ ／ｗたんば（質である）、この最終精製ステップでも異なるフィツーゼ亜型を単 離し得る（第１Ａ図、配列ＡおよびＢ）。

Ａ、ライカム（ｆｉｃｕｕｍ）フィツーゼに対するモノクローナル抗体を調製し た。これは有効な精製手段を提供する。この抗体を臭化シアン活性化セファロー ス４Ｂに結合させる（４■／−ゲル）。

このマトリクスを免疫アフィニティーカラムに用いる。このマトリクスは１１Ｍ １当り約１■のフィツーゼを結合することが示された。

フィツーゼはこのアフィニティーカラムから活性のロスなしにｐＨ２，５バフフ ｙ（１００ｍＭグリシン−〇（Ｊ、５００ｍＭ　ＮａＣｊりで溶出する。この操 作を用いて単一ステップで粗培養濾液から８０％の回収および６０倍の精製度で 均一のフィツーゼを単離し得る６Ｃ，フィツーゼの脱グリコジル化 Ａ、ライカム（ｆ　１ｃｕｕ＋ｍ）フィツーゼ（７０μｇたんばく賞）を総容積 ３０μｌで０．２Ｍリン酸ナトリウムバフファＰＨ８，６および１．１０−フェ ナントロリン中２．５ＵのＮ−グリカナーゼ（ゼンザイム）とインキュベートし た。３７℃、１６時間後、脱グリコジル化度を電気泳動でチェックした（ファー ストシステム、ファルマシア社）。フィツーゼの見かけの分子量は８５ｋＤａか ら約５６．５ｋＤａに減少していることが分った。糖たんばく質として本来のフ ィツーゼを同定し得る過ヨウ素酸シフフ（ＰＡＳ）塘染色ではこのたんばく賞に 結合した炭水化物は検出されなかった。さらに炭水化物の完全な除去は感度の高 いレクチン−プロンティング法で実証した０本来のおよび脱グリコジル化したフ ィツーゼ（いずれも１．５μｇ）を標準的５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動し、つい で３０Ｖ、１６時間かけて２５ｍＭ）リス−グリシンバッファｐ）１８．３．２ ０％（Ｖ／Ｖ）メタノール中ＰＶＤＦメンブレン（イムノピロン、ミリボア社） に電気泳動的に移行させた。

つづいてこのメンブレンをリン酸緩衝液中１％（Ｗ／Ｖ）ウシ血清アルブミンと インキュベートし、さらにコンカナバリンＡ−パーオキシダーゼ（シグマ、リン 酸緩衝液中１０μｇ／ｄ）とインキュベートした。このパーオキシダーゼを４− クロロ−１−ナフトール（シグマ）で染色した。

この高怒度法でも脱グリコジル化うイターゼに結合する炭化水素は検出されなか った。

脱グリコジル化後うイターゼは活性を完全に失っており、これはおそらく酵素の 凝集によるものであろう。

（例３） フィツーゼのアミノ酸配列の決定およびオリゴヌクレオチドプローブの設計 Ａ、Ｎ末端アミノ酸配列の決定 フィツーゼを５ＤＳ−ＰＡＧＥまたはＩＥＦ−ＰＡＧＥからＰＶＤＦブロフティ ングメンブレン（イムノピロン、ミリポア社）へ電気泳動的に移す、エレクトロ プロッティングは１０％（ｖ／ν）メタノールを含む１０＋ＩＩＭ　ＣＡＰＳ　 （３−シクロへキシルアミノ−プロパンスルホン酸）バッファ　（ｐＨ１１，０ ）　中３０　Ｖ、　４℃で１６時間かけて行った。たんばく賞の位置はコマージ ブリリアントブル染色で検出した。目的のハンドを切り出し、メタノールで脱色 してから気相シーケンシングを行った。この操作は数個の調製物を用い数回繰り 返した。この結果を第１Ａ図に示す（配列ＡおよびＢ）。

また粗調製物中に存在する１００ｋＤａのたんばく賞についてもアミノ酸配列を 決定した。このたんばく賞のデータを第１Ｃ図に示す、この配列はアスペルギラ ス　ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）から単離した酸ホスファタ ーゼと（マクレ−（ＭａｃＲａｅ）等、（１９８８）Ｇｅｎｅ　７土、３３９− ３４８）かなりのホモロジーを示している。

Ｂ、内部のアミノ酸配列の決定 （臭化シアンによるたんばく賞の断片化）均一に精製したフィツーゼを限外濾過 （マイクロコンセントレータ−セントリコン３０、アミコン社）を用いて１００ ｍＭ　ＮａＨＣＯｓに移す、つづいてこのたんばく賞を凍結乾燥後７０％（ν／ ｖ）トリフルオロ酢酸に溶かし約３００倍モル過剰量のＣＮＢｒと６時間インキ ュベートする。反応は混合物を水で希釈することにより停止させる。生成したフ ラグメントを再び凍結乾燥する。ついでこの試料をＤＴＴ　（ジチオスレイトー ル）を含む５ＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバフファにとかし、断片化の度合いをＰＡ ＧＥで測定した０分析ＰＡＧＥは２０％５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いファルマシ アファーストーシステムユニットで行った。ゲルは予備運転して連続的バッファ システムを作り、小さいペプチドの分離を良くした（マニュアル参照）。コマー ジブリリアントプルーでは小さいペプチドは検出できないのでペプチドの染色に は銀染色を用いた。この操作の結果はフィツーゼの２．５ｋＤａ　、３６ｋＤａ 　、５７ｋＤａおよび８０ｋＤａの分子量をもつペプチドへの完全な分解を示し た。このペプチドを気相シーケンシングするためシガール（Ｓｃｈａｇｇｅｒ） およびジャゴー（Ｊａｇｏｗ）　（１９８７、Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

上ｉｔ、３６８−３７９）によって報告されている５ＤＳ−トリシン−ＰＡＧＥ とそれにつづく上述のエレクトロブロッティングにより単離した。

５７ｋＤａフラグメントのＮ末端は最初の４個のアミノ酸が欠けていること以外 ウラ−（Ｕｌｌａｈ）　（１９８８ｂ　、上述）によって決定されたフィツーゼ のＮ−末端と同じであった（第１Ａ図、配列Ｂ）。

２、５　ｋＤａおよび３６ｋＤａペプチドのＮ末端配列を第１Ｂ図配列Ａおよび Ｂに示す。

Ｃ，オリゴヌクレオチドプローブ 第１Ａ図および第１Ｂ図に示したアミノ酸配列に基づいてオリゴヌクレオチドプ ローブを設計し、アプライドバイオシステムズＡＢＩ・３８０Ｂ　ＤＮＡ合成機 を用いて合成した。これらのオリゴヌクレオチドを第２Ａ図および第２Ｂ図に示 す。

（例４） （ゲノムプロットおよびゲノムライブリーの第１組オリゴヌクレオチドプローブ によるハイブリダイゼーション）標準法（たとえばイニルトン（Ｙｅｌｔｏｎ） 等、（１９８４）　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　［１，Ｓ、Ａ、　、１４７０−１４７４） を用い液体窒素中面糸体をグラインドすることによりＡ、ライカム（ｆｉｃｕｕ ｍ）のゲノムＤＮＡを単離した。ゲノムライブリーは標準法（たとえばマニアチ ス（Ｍａｎｉａｒｉｓ）等（１９８２）モレキュラークローニング、ラボラトリ −マニュアル、コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−、ニューヨーク）に従 がいＡ、ライカム（ｆｉｃｕｕｍ）　Ｎ　ＲＲＬ　３１３５染色体ＤＮＡを５ａ ｕ３　Ａで部分消化したものを用いてバクテリオファージラムダＥＭＢＬ　３に 構築した。このようにして作成したゲノムライブラリーには６０〜７０倍のＡ、 ライカム（ｆｉｃｕｕｍ）ゲノムを含んでいる。このライブラリーをラムダＥＭ ＢＬ３スタッファフラグメントとのハイブリダイゼーションにより挿入のないプ ラークの出現をチェックした。このラムダＥＭＢＬ３プローブにハイブリダイズ するのはプラークの１％以下であった。挿入物の大きさは１３〜１７ｋｂであっ た。

ゲノムライブラリーのスクリーニングに適した条件やプローブを見つけるためゲ ノムＤＮＡをいくつかの制限酵素で切断し、アガロースゲルで分離後、業者の説 明に従かいジェネスクリーンプラス上にブロンティングした。このプロットに全 てのオリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーシ ョンは種々のストリンジエンシー条件で行った（ハイブリダイゼーションは６Ｘ ＳＳＣ１４０〜６０℃、洗浄は０．２　Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃまで、６５℃）。プロー ブ１０６８および１０２４　（第２Ａ図）をゲノムライブラリーのスクリーニン グ用に選んだ。もっともこの２つのプローブを特異的にハイブリダイズする共通 のＤＮＡフラグメントは同定されなかった。酸ホスファターゼプローブ１０２５ （第３図）は特異的かつ分離のよいハイブリダイゼーションシグナルを与える。

したがって酸ホスファターゼのゲノムライブラリーのスクリーニングにはこのプ ローブを選択した。

これら３つ全てのプローブを用いてゲノムライブラリー中のハイブリダイジング プラークを同定し得た。プローブ１０２５（ａホスファターゼ）に対応するハイ ブリダイゼーションシグナルは強くかつ再現性に秀れていた。プローブ１０２４ および１０６８（フィツーゼ）を用いて得られるハイブリダイゼーションシグナ ルの強度は様々であった。２つのシリーズ間にクロスハイブリダイゼーションは 見られなかった。３つの全てのシリーズのプラークを再スクリーニングし、８個 の単一のハイブリダイゼーションポジイティブプラークからＤＮＡを単離した（ マニアチス（Ｍａｎｉａｒｉｓ）等、上述）。各シリーズにおいて、同一のハイ ブリダイジングフラグメントを含むクローンが同定された。このことはこのクロ ーンの挿入物が関連しており、おそらく、同しゲノムＤ　Ｎ　Ａ　領域に重複し ていることを示している。ここでも２つのフィツーゼ特異的シリーズ（プローブ １０２４および１０６８）を用いたときクロスハイブリダイゼーションは見られ なかった。このことは２つのシリーズのクローンの単離に用いた両プローブがこ のたんばく質のＮ−末端アミノ酸配列から得たものであるにもかかわらず異なる ゲノムＤＮＡフラグメントが同定され、かつクローン化されたことを示している 。

これら３つのシリーズ全てのクローンを誘導および非誘導菌糸体から単離したｍ ＲＮＡを含むノーザンプロットとハイブリダイズさせた（例６）、酸ホスファタ ーゼ特異的クローン、並びにこのクローン由来の３．１ｋｂ　５ａｉｌ内部フラ グメントはｍ　”Ｊ　ｍ　ＲＮ　Ａサンプルに優先的にハイブリダイズした。酸 ホスファターゼ特異的プローブによって同定されたｍＲＮＡは約１８００ｂ長で あり、これはこのたんばく質の大きさと一致している（６８ｋＤａ、ウラ−（ｌ ｌｌｌａｈ）およびカミンス（Ｃｕ＋ａｍｉｎｓ）　（１９８７）　Ｐｒｅｐ、 　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

１７．３９７−４２２＞、フィツーゼ特異的クローンに対する特異的ｍＲＮＡの ハイブリダイゼーションは示されなかった。したがって我々は上述の方法がフィ ツーゼをコードする遺伝子のクローニングには適さないと結論した。さらにこの 方法が酸ホスファターゼをコードする遺伝子の同定にはうまく使用できることか らこの失敗がこの方法を行うに当っての失敗によるものではないと結論できる。

酸ホスファターゼ遺伝子を含むラムダクローンは１９８０年４月２４日、オラン ダ、バーン、セントラル　プリュー　ボア・シメルカルチャー　（ｔｈｅ　Ｃｅ ｎｔｒａａｌ　Ｂｕｒｅａｎ　ｖｏｏｒＳｃｈｉｍｍｅｌｃｎｌｔｕｒｅｓ）に 、受理番号ＣＢＳ　−２１４，８９で寄託した。　１０ｋｂＢａｍＨＩフラグメ ントをファージＺ１から単離しｐｃＵ１９にサブクローンした。このサブクロー ンには酸ホスファターゼをコードする全遺伝子が含まれている。このサブクロー ン、ｐＡＦｌ−１（第５図）は１９８９年４月２４日、ＣＢＳ　２１３．８９と して寄託された。

（例５） 第２組のオリゴヌクレオチドプローブを用いたフィツーゼコード遺伝子の単離 ＣＮＢｒで生成したフラグメントのＮ−末端アミノ酸配列を用いてプローブを設 計しく第２Ｂ図、プローブ１２９５．１２９６および１２９７）、これらを上述 のゲノムＤＮＡにハイブリダイズした。フィツーゼ遺伝子の単離へのこれらのプ ローブの使用可能性を試すためにこれらのプローブを用いたゲノムプロ、トのサ ウザーンハイブリダイゼーションを行った。これらのプローブは非重複領域に由 来するにもかかわらず、これら３つ全てのブローブを用いて対応する長さのハイ ブリダイジングフラグメントを同定できた。新しい組のプローブと、第１組のプ ローブを用いて単離したクローンとの間にはハイブリダイゼーションは起こらな かった（例４）、それゆえ、別個の実験で３つ全てのプローブを用いてゲノムラ イブラリーを再スクリーニングした。また各プローブで単離したクローン群（ラ ムダＡＦ２０１．２１９．２４１および２４３）も両方の別のプローブにハイブ リダイズした。このことは３種類のプローブを用いた場合単一のゲノム領域から クローンが単離されたことを示している。新しく単離したクローンをプローブ１ ０２４および１０６８とハイブリダイズする計画を立てた。両方の場合、これら のプローブを用いて単離したクローンに両プローブがうまくハイプリダイスする 条件では新しく単離したクローンへのハイブリダイゼーションは起こらなかった （例４参照）、このことは新しく単離したクローンは精製フィツーゼのＮ末端か ら誘導したプローブとホモロジーを有していないことを示している。

３つの全てのプローブ（１２９５〜１２９７）はハイブリダイズするラムダＥＭ ＢＬ３−クローンはラムダＡＦ２０１（第４図）と命名し、１９８９年３月９日 ＣＢ　Ｓ　１５５．８９として寄託した。

３つの全てのオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズするラムダＡＦ２０ １の５．１　ｋｂ　ＢａｗＨ！フラグメント（ｐＵｃ１９にサブクローンし、ｐ ＡＦ２−３と命名した。第４図参照）をノーザンブロントの検出に用いた。この 場合、１８００塩基長のｍＲＮＡが同定された。このｍＲＮＡは誘導菌糸体での み発見された。このオリゴヌクレオチドをプローブとして用いたとき同じ結果が 得られた。それゆえ、新しい組のプローブを用い誘導されたｍＲＮＡに特異的に ハイブリダイズする共通のＤＮＡフラグメントが同定された。このｍＲＮＡの長 さく１８００ｂ）はおよそ非グリコジル化たんばく質の大きさで約約６０ｋＤａ のたんばく質をコードするのに十分である。この単離されたフラグメントがフィ ツーゼ遺伝子の少な（とも一部を含むことは明白である。

（例６） ″誘導”および“非誘導”ｍＲＮＡの単離Ａ、フライム（ｆｉｃｕｕｍ）による フィツーゼの合成はストリンジェントなリン酸依存調節によることが文献で知ら れている（ハン（Ｈａｎ）およびキャラガー（Ｃａ　ｌ　ｌａｇｈｅｒ）、（１ ９８７）　Ｊ、　Ｉｎｄｕｓｔ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１．　２９５−３０１）　、それゆえ、単離した遺伝子が 同様の調節を受けていることは目的の遺伝子がクローン化されているという証拠 を支持していると考え得る。

産生および非産生条件下で合成されるｍＲＮＡを単離するため、以下のようにＡ 、ライカム（ｆｉｃｕｕｓ）　ＮＲＲＬ３１３５を増殖した。まず非誘導培地で 一晩胞子を培養した０次の日、その菌糸体を収穫し、滅菌水で洗浄して誘導また は非誘導培地に接種した。

用いた培地には１リットル当り２０ｇのコーンスターチ：１．５ｇのグルコース 、０．５　ｇ　Ｍｇ５Ｏ，−７ＨｚＯ，０，２ｇ　Ｆｅ５０＃・７８ｚＯおよび ７．２　ｇ　ＫＮＯｘが含まれる。フィツーゼの誘導には、２ｇ／ｌまでのコー ンスタープリカーを培地に加え、一方非誘導培地には２ｇ／ｌのに！ＨＰＯ，を 含める。この菌糸体をさらに少なくとも１００時間生育させる。これから一定間 隔でサンプルを採取する。

フィツーゼ生産は例２Ａで説明したライターゼ検定で追跡した。

変性したｍＲＮＡを電気泳動で分離し、ついでジェネスクリーンプラスにブロッ ティングした。このプロットに３２Ｐ−標識ｐＡＦ２−３または例４のｐＦＡｌ −１（酸ホスファターゼ）由来の３、１　ｋｂ　Ｓａｌ　ｌフラグメント単離物 をハイブリダイズした。この結果を第２表に示す。細胞をフィツーゼおよび酸ホ スファターゼの合成を誘導すると知られている条件下で生育したときだけフィツ ーゼ特異的５．１　ｋｂ　ＢａｍＨ＋フラグメントおよび酸ホスファターゼ特異 的３．１ｋｂ　５ａｌｌフラグメントとｍＲＮＡ単離物のハイブリダイゼーショ ンが見られる。この結果から単離した遺伝子は、フィツーゼおよび酸ホスファタ ーゼに期待されるように調節されると結論される。

第２表 フィツーゼ特異的５．１　ｋｂ　Ｂａ＋ｍＨＩフラグメント（Ａ）または酸ホス ファターゼ特異的３．１ｋｂ　５ａｉｌフラグメント（Ｂ）をプローブとして用 いたノーザンプロットのハイブリダイゼーション；＋は１８８０ｂフイタ一ゼｍ ＲＮＡまたは１８００ｂ酸ホスフアターゼｎ＋ＲＮＡの存在を示す、２４時間相 対的フライーゼ活性を測定した。誘導培養物は非Ｆｊ：導培養物よりも１０倍の フィツーゼ活性を有している。

一一一一一」ｊＥＪ遷し′　の　日　祿　七ｋＡ　２４時間　＋　− ８２４時間　＋　− （例７） フィツーゼ遺伝子のクローニングの証明フィツーゼ遺伝子の単離が成功したこと を示すために、およびクローン化した遺伝子発現の増加を研究するために、この ライターゼ遺伝子を適当なベクターにサブクローン化し、ついでＡ、ニガー（ｎ ｉｇｅｒ）４０２　（ＡＴＣＣ９０９２）にトランスホームした。

終りに、ラムダクローンＡＦ２０１から１０ｋｂ　Ｎｒｕｌフラグメントとして フィツーゼ遺伝子を単離し、ベクターｐＡＮ８−１（マターン（Ｍａｔｔｅｒｎ ）、１．　Ｅ、およびパント（Ｐｕｎｔ）　、Ｐ、　Ｊ。

（１９８８）　Ｆｕｎｇａｌ　Ｇｅｖｅｔｉｃｓ　Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ　３５ ．２５）の５ｔｕ１部位にクローン化した。このベクターには選択マーカーとし てｂｌｅ遺伝子（フレオマイシン耐性を与える）を含んでいる。この構築物をｐ ＡＦ２８−１と命名しく第４図）、プロトプラストを３０ｇｇフレオマイシン／ −を補ない、０．７５％、寒天で固形化したアスペルギラス最小培地にブレーテ ィングすること以外は例９に示した操作に従がいＡ、ニガー（ｎｉｇｅｒ）　４ ０２にこれをトランスホームした。単一のトランスホーマントを精製単離し、例 １および２で述べた方法で振とうフラスコ内の産生を調べた。コントロールとし て、ベクターのみを含むトランスホーマントおよび非トランスホーム宿主をテス トしたく第３表）、ｐＡＦ２８−１を含むＡ、ニガー（ｎｉｇｅｒ）　４０２の みがＡ、ライカム（ｆｉｃｕｕｍ）フィツーゼに対する特異的モノクローナル抗 体と反応するフィツーゼを産生じていると思われる。このモノクローナル抗体と 反応するフィツーゼはｐＨ２，５でイムノアライニティカラムから溶出でき、分 子量、グリコジル化度、等電点および比活性がＡ、ライカム（ｆｉｃｕｕａ＋） フィツーゼと同じであることが示された。この知見はｐＡＦ２８−１でトランス ホームしたＡ、ニガー（ｎｉｇｅｒ）　４０２細胞が事実上、Ａ、ライカム（ｆ ｉｃｕｕｍ）フィツーゼと同一のフィツーゼを発現している明瞭な証拠を提供す る。コントロール細胞では同様の発現は見られなかった。

第３表 Ａ、ニガー４０２　０．５　０ Ａ、ニガー４０２　ｐＡＮ２Ｂ−１０，７１０Ａ、ニガー４０２　ｐＡＮ８−１ 　０．５　０株は誘導条件で増殖させた（例６）、サンプルは９６時間の増殖後 採取した。

（例８） フィツーゼ遺伝子の特性 フィツーゼ遺伝子を有するラムダベクターを種々の制限酵素による消化で解析し た。フィツーゼ遺伝子を含むゲノム領域の地図を第４図に示す、第４図に示した ように特定の制限断片をクローニングベクターｐＵｃ］、９にサブクローンした 。

先にｐＡＦ２−３中に存在する５、　１　ｋｂ　ＢａｍＨＩフラグメントにはフ ィツーゼ遺伝子の少なくとも一部が含まれることが示されている（例５）、さら にオリゴヌクレオチドプローブ１２９５および１２９７　（第２Ｂ図）はｐＡＦ ２−７由来の５ａｌｌ挿入物（ｐＡＦ２クローンの位置は第４図に示されている ）にハイブリダイズすることが示されたが、一方プローブ１２９６はおそらくｐ ＡＦ２−６およびｐＡＦ２−７中のフラグメント間のＳａｌ　１部位を含んでい るのであろう、この実験結果はフィツーゼコード配列はｐＡＦ２−３のＢａａ＋ ＨＴ挿入物の左側部分に位置することを示している。

つづいてプラスミドｐＡＦ２−３、ｐＡＦ２−６、およびｐＡＦ２−７の挿入物 のヌクレオチド配列をグイデオキシチェーンターミネーション法（サンガー（Ｓ ａｎｇｅｒ）等（１９７７）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓａｉ、　ＬＩＳＡ、７土、５４６３−５４６７）およびメリック（Ｍｅｓｓｉ ｎｇ）等により報告されたショットガン法（１９８１、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ 　Ｒｅｓ、ｉ、３０９−３２１）を用いて完全に決定した。さらにシーケンシン グ操作で得た情報に基づき特異的オリゴヌクレオチドを合成した。

染色体フィツーゼ遺伝子を含むクローンｐＡＦ２−３、ｐＡＦ２−６およびｐＡ Ｆ２−７の完全なヌクレオチド配列を第６図で編集し、第７図にグラフで示した 。

この完全な配列のたんばく賞コード容量分析で、その成熟たんばく質のＮ−末端 アミノ酸配列のコードはヌクレオチド３８１番から開始していることが明らかに なった（ウラ−（口１１ａｈ）により報告されたＮ末端は３６９番である）。さ らに３６ｋＤａおよび２、５　ｋＤａ内部ペプチドフラグメントのＮ末端アミノ 酸配列は（第１Ｂ図、配列ＢおよびＡ参照）、各々ヌクレオチド１１０１番およ び１５４８番にコードされていることが分った。この読み枠はヌクレオチド１７ １３番で終っている。

これらの知見でフィラーゼコードＤＮＡ配列を含むことを特徴とする染色体部位 が明らかになった。

この成熟フィツーゼたんばく譬をコードする染色体配列のすぐ上流に成熟たんぽ （質読み枠に連続する読み枠でＡＴＧ開始コドンは存在しない、しかし、イント ロン−エクソン境界特性を用いて、ヌクレオチド２５４および３５５の間に成熟 ライターゼコード読み枠と同じ読み枠でヌクレオチド２１０にＡＴＧコドンを持 つイントロンの存在が推定される。このＮ末端伸長のアミノ酸配列はヴオンハイ ン（１９８３、Ｅｕｒ、Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、工ｎ、１７−２１）によって発 表された分泌シグナル配列の規則とうまく一致している。

この仮説を確認するために以下に述べる操作法に従かい特異的フィツーゼプライ マーおよびテンプレートとして全ｍ　ＲＮ　Ａ　／ｃＤＮＡ集団を用いたＰＣＲ 増巾によりフィツーゼｃＤＮＡを単離した。

（アスベルギラス　ライカム（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｉｃｕｕｍ）からの ボＵ　Ａ″ＲＮＡの単離）例６で示した誘導条件下で生育したＡ、ライカム（ｆ ｉｃｕｕｍ）　ＮＲＲＬ　３１３５から全ＲＮＡを単離した。液体窒素を用いて 乾燥菌糸体を凍らせグラインディングした。つづいてこの粉を０℃で３Ｍ　Ｌｉ Ｃ１，６Ｍ尿素中ウつトラータラフクス（１分間フルスピード）をもちいて均一 とし４℃で一晩放置した（オーフリー（Ａｕｆｆｒｅｙ）およびロージャン（Ｒ ｏｕｇｅｏｎ）、Ｅｕｒ、　Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、上０７．３０３−３１４．１９８０）　、１６０００　ｇ　３ ０分間の遠心と２回のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（５０ ：４８：２）での抽出により全細胞ＲＮＡが得られた。このＲＮＡをエタノール 沈澱後１−の１０１トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７，４）、０．５％ＳＤＳ溶液に添加 した。ポリＡ゛選択のためこの全ＲＮＡサンプルを６０℃で５分間加熱し、０． ５　Ｍ　ＮａＣｌに調整した後オリゴ（ｄＴ）−セルロースカラムにかけた。１ ０１１Ｍトリス−ＩＣＪ　ｐ）Ｉ７．４．０．５％ＳＤＳおよび０．１　Ｍ　Ｎ ａＣｊ！を含む溶液で数回洗浄後、１０ｍＭトリス−ＨＣ１ｐＨ７，４，０，５ ％ＳＤＳによる溶出でポリＡ０ＲＮＡを採取した。

（ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ複合体の調製） 第１ｃＤＮＡ鎖合成のため、ポリＡ″ＲＮＡ５μｇを１６．５μｌの水に溶かし 、つづいて以下の成分を加えた；２．５μ１ＲＮａｓｉｎ（３０Ｕ／μｊり　； １０μｊ！のバッフ７（５０１１Ｍ）リス−〇（１ｐＨ７，６、ＳａｌＭ　門ｇ ｃ１．および４０ｍＭ　ＫＣｊり　；　２μＩｔ１ＭＫｆｌ；５μｊｏ、ＩＭ　 ＤＴＴ；０．５μｌオリゴ（ｄＴ）　＋□−，，（２，５■／ｘｔｌ）　：　５ １１１　８ｒｍＭ　ｄＮＴＰ−ミックス；　５．ｕＡＢｓＡ　（１■／ｄ）およ び２．５μ！モロニ−ＭＬＶ逆転写酵素（２００Ｕ／−）。この混合物を３７℃ で３０分間インキュベートした後、ｌＯμｆｆ１０．２Ｍ　ＥＤＴＡおよび５０ μｇ水を添加することで反応を停止した。クロロホルムで抽出を行ない、遠心後 上清に１１０μｍ２５　Ｍ　Ｎｌ（、Ａｃおよび４４０μｌエタノールをつづけ て添加した。ドライアイス／エタノール溶液中、３０分間かけてｍＲＮＡ／　ｃ 　Ｄ　Ｎ　Ａ複合体の沈澱を形成させた。遠心でこのｍＲＮＡ／ｃＤＮＡを集め 、７０％水冷エタノールで洗浄してから２０μｌの水にとかした。

（フィツーゼｃＤＮＡフラグメントのクローニング）フィツーゼ配列を含むｃＤ ＮＡＯ単離は２つのフラグメントを用いたポリメラーゼチェーンリアクシラン（ ＰＣＲ）を用いて行った。４つの合成オリゴヌクレオチドプライマーは、第６図 に示したゲノムフィツーゼ配列に基づき設計した。

０１℃ｇｏ　１：　５’−ＧＧＧ、ＴＡＧ、ＡＡＴ、ＴＣＡ、ＡＡＡ、ＡＴＧ、 ＧＧＣ，ＧＴＣ，ＴＣＴ、ＧＣＴ、ＧＴＴ、ＣＴＡ−３″ ０１℃ｇｏ　２：　５’−ＡＧＴ、ＧＡＣ，ＧＡＡ、ＴＴＣ，ＧＴＧ、ＣＴＧ、 ＧＴＧ、ＧＡＧ、ＡＴＧ、ＧＴＧ、ＴＣＧ−３’０１ｉｇｏ　３：　５’−ＧＡ Ｇ、ＣＡＣ，ＣＡＡ、ＧＣＴ、ＧＡＡ、ＧＧＡ、ＴＣＣ−３゜０１３ｇｏ　４： 　５’−ＡＡＡ、ＣＴＧ、ＣＡＧ、ＧＣＧ、ＴＴＧ、ＡＣＴ、ＧＴＧ、ＡＴＴ、 ＧＴＴ、ＴＡＡ、＾ＧＧ、Ｇ−３′ オリゴ１はＥｃｏＲＩ部位の５′側境界に隣接するライターゼＡＴＧ開始コドン （２１０〜２３１番）の下流のヌクレオチド配列を含んでいる；オリゴ２は付加 的ＥｃｏＲ１部位に隣接する５ａｌＩ部位のすぐ上流にあるヌクレオチド配列を 含んでいる；オリゴ３はＢａ＋ａＨＩ部位付近のヌクレオチド配列を含んでいる （８４５〜８６５番）；オリゴ４は付加的Ｐｓｔ１部位に隣接するフィツーゼ終 止コドンの下流に位置するヌクレオチド配列を含んでいる（１８９０〜１８６７ 番）。

ポリメラーゼチェーンリアクシランはＴａｑポリメラーゼ（シータス）の説明書 に従がい行った。テンプレートとしてｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッド（上述） を含む溶液（１，５μりを使用し、ライターゼｃＤＮＡのＮ末端部分の増巾には プライマーとしてそれぞれ０．３μｇのオリゴ１および２を用い、またフイター ゼｃＤＮＡＣ末端部分の増巾にはオリゴ３およびオリゴ４を用いた（第８図参照 ）。変性（１００℃７分間）およびＴａｑポリメラーゼ２Ｕの添加後この反応液 をパーキンエルマー／シータスのＤＮＡ増巾器で２５サイクル増巾した（各サイ クル；５５℃、２分、７２℃、３分、９４℃、（分）、最後のサイクルの変性ス テップは省い、た。

消化後（ｃＤＮＡ　Ｎ末端部分についてはＥｃｏＲＴ、ｃＤＮＡＣ末端部分はＢ ａｍＨＩとｐｓｔｌ）両方のｃＤＮＡフラグメントをｐＴＺ１８Ｒ（プロメガ） の適当な部位にクローニングした。

得られた２つのＰＣＲフラグメントのヌクレオチド配列はプライマーとして染色 体フィツーゼ遺伝子配列の後に設計した合成オリゴヌクレオチドおよびテンプレ ートとして全増巾ＤＮＡおよびクローン化ｃＮＤＡフラグメントを用いたダイデ オキシチェーンターミネーション法（サンガー（Ｓａｎｇｏｒ）　、上述）で決 定した。

フィツーゼたんばく賞をコードするｃＤＮＡｓＩ域の配列およびこのフィツーゼ たんばく質の誘導されたアミノ酸配列を第８図に示す。

このｃＤＮＡ配列は先に推定したイントロンの位置を確認すると同時に、染色体 遺伝子配列内には他のイントロンが存在しないことを示した。

フィツーゼ遺伝子は４６７個のアミノ酸（ＭＷ５１０９１）からなる−次翻訳産 物をコードしている。シグナルペプチドの切除による一次翻訳産物のプロセシン グで４４４個（ＭＷ４８８５１）または４４８個（ウラ−（Ｌｌｌｌａｈ）によ って報告されているように最初の４個のＮ末端アミノ酸を含む、ＭＷ４９２３２ ）のアミノ酸からなる成熟フィツーゼたんばく賞が生成する。

（例９） 付加的フィツーゼゲノムＤＮＡコピーの導入によるアスベルギラスにおけるフィ ツーゼの過剰発現 （発現ベクターりＡＦ２−２３の構築）全ての構築物はマニアチス（門ａｎｉａ ｔｉｓ）等（（１９８２）　、モレキュラークローニング、ラボラトリ−マニュ アル、コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−１Ｎ、Ｙ、　）によって報告さ れている標準的分子生物学的手法で作成した。

発現ベクターｐＡＦ２−２ＳはフィツーゼゲノムクローンラムダＡＦ２０１の６ ｋｂ　ＰｖｕＩ［ＤＮＡフラグメントをｐＵｃ１９の５Ｌ１ａｒ部位にサブクロ ーニングすることにより作成した。このプラスミドをｐＡＦ２−２と命名した（ 第４図）、アスペルギラス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）のトランスホーメーショ ンの選択マーカーとして異種アスペルギラス　ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌ ｕｓ　ｎ１ｄｕｌａｎｓ）　ａｖａｄｓ遺伝子を含むプラスミドｐＧＷ３２５（ ワーナース（Ｗｅｒｎａｒｓ）Ｋ。

（１９８６）　、Ｔｈｅｓｉｓ、　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　ｕｎｉｖｅｒｓｉ ｔｙ＋　ワゲニンゲン、オランダ）のＥｃｏＲＩ／Ｋｐｎｌ　ＤＮＡフラグメン トをｐＡＦ２−２のＥｃｏＲＩ　／　Ｋｐｎ　１部位に挿入した。この発現ベク ターをｐＡＦ２−２５と命名し、第９図に示した。

Ａ、Ａ、ライカム（ｆｉｃｕｕ＋Ｉｌ）　Ｎ　ＲＲＬ　３１３５におけるフィツ ーゼの過剰発現 以下に示す修正を加えたチルバーン（Ｔｉｌｂｕｒｎ）、Ｊ９等（（１９８３） Ｇｅｎｅ　ｕ、２０５−２２１）およびケリー（Ｋｅｌｌｙ）、Ｊ、およびハイ ネス（Ｈｙｒｅｓ）、Ｍ、　（（１９８５）　ＥＭＢＯＪ、土、４７５−４７９ ）のトランスホーメーシジン操作に従かいプラスミドｐＡＦ２−２８をＡ、ライ カム（ｆｉｃｕｕｍ）　ＮＲＲＬ３１３５に導入した。

−菌糸体は３００　ｒｐｍのロータリー振とう基中３０℃で１６時間１０ａ＋Ｍ アルギニンと１０ｍＭプロリンを補ったアスペルギラス最小培地（コープ（Ｃｏ ｖｅ）　、Ｄ、　（１９６６）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｂｙｓ、　Ａｃｔ ａ。

上上主、５ｌ−５６）で増殖した。

−プロトプラスト形成にはノボザイム２３４　（ノボインダストリー製）だけを 用いへりカーゼは使わなかった。

−プロトプラスト形成から９０分後このプロトプラスト懸濁液に等容量のＳＴＣ バッファ　（１，２Ｍソルビトール、１０ＩＩＩＭトリスーＨ（Ｊ　ｐＨ１，５ ，１０ｍＭ　ＣａＣｊ！　ｚ）を加え、スウィングローター中２５００ｇ、４℃ で１０分間遠心した。このプロトプラストを洗浄し、ＳＴＣバッファで１０−細 胞／−の濃度となるように懸濁した。

−１０ｐｌのＴＥバフ７７　（１０ｍＭト’ＪスーＨＣ１ｐＨ１，５，０，１ｍ ＭＥＤＴＡ）中のプラスミドＤＮＡを１００μＰのプロトプラストサスペンショ ンに加えた。

−このＤＮＡ−プロトプラストサスペンションを０℃で２５分間インキュベーシ ョンした後、２００μｌのＰＥＧ溶液（２５％ＰＥＧ４０００　（メルク）、１ ０＋Ｍ）リス−１１（Ｊ　ｐＨ７，５，５０ｍＭ　ＣａＣ１ｚ）を滴下した。つ づいて、容器を振り混ぜながら１−のＰＥＧ？容液（６０％ＰＥＧ４０００．１ ０ＩＩＩＭトリスーＨＣ１ｐＨ７，５，５０ｍＭ　ＣａＣＩｇ）をゆっくり加え た。室温放置後、このサスペンシランをＳＴＣバッファで希釈し、逆さにして混 ぜた＃Ｌ２０００ｇ、４℃で１０分間の遠心を行った。このプロトプラストを緩 やかに２００μ℃のＳＴＣバッファに懸濁し、単一窒素源として１０ＩＩＭアセ トアミド、１５ｍＭ　ＣｓＣ１、Ｉ　Ｍスクロース、０．７５％細菌学用寒天＃ １　（オクソイド製）を含むアスペルギラス最小培地にブレーティングした。増 殖は３３℃で６〜１０日間行つた。

ＳＦ３、ＳＦ３およびＳＦ３と命名した単一トランスホーマントを単離し、精製 後側１および２で述べた方法を用し）振とうフラスコ内でフィツーゼ産生をテス トした。コントロールとしてベクターのみ（ｐＵｃ１９中ａｍｄｓ遺伝子のみ） を有するトランスホーマントおよび非トランスホーム宿主をテストした。

誘導条件下（例６参照）で株を増殖させ９６時間にサンプルを採取した０分析は ライターゼ活性測定（第４表）および等電点フォーカシングポリアクリルアミド ゲル電気泳動（Ｔ　Ｅ　Ｆ　−ＰＡＧＥ）で行った。

同様の条件下で増殖したＡ、ライカム（ｆｉｃｕｕｍ）およびＡ、ライカム（ｆ ｉｃｕｕａ＋）　ｐＡ　Ｆ　２−２　Ｓ　Ｓ　Ｐ　７の発酵物から等容量のサン プルを採取し、ＩＥＦ−ＰＡＧゲルで分析した（ｐＨ範囲４．５〜６、ファース トシステム、ファルマシア）、電気泳動は業者の指示に従って行った。つづいて たのゲルを一般的たんばく質染色色素コマージブリリアントブルー（第１０Ｂ図 ）または例２で述べた一般的ホスファターゼ活性染色法（第１０Ａ図）で染色し た。

均一にまで精製したＡ、ライカム（ｆｉｃｕｕｍ）フィツーゼのサンプル（例７ で述べたイノムアフイニテイークロマトグラフイーによる）は単独または培養上 清と混ぜて分析した。

本発明で述べられているようにフィツーゼは種々のサンプルにおいて多くのイソ 型（アステリスクで示す）として存在してし）る。

２つの主要なイソ酵素は両染色法によりレーン３および４の精製ライターゼ中に 明確に確認される。Ａ、ライカム親株ではこのフィツーゼバンドはほとんど見え ず、一方、ｐＡＦ２−２８　ＳＰ７トランスホーマント株では存意に増加してい る。

第４表 Ａ、ライカム（ｆｉｃｕｕｍ）　ＮＲＲＬ　３１３５のトランスホーメーション によるフィツーゼ産生の増加 Ａ、ライカム＋コントロールプラスミド　０．６Ａ、ライカムｐＡＦ　２−２５ 　ＳＦ３　７．６Ａ、ライカムｐＡＦ　２−２５　ＳＦ３　６．７Ａ、ライカム ｐＡＦ　２−２Ｓ　ＳＦ３　４．３Ｂ、Ａ、　ニガー（ｎｉｇｅｒ）　ＣＢ　Ｓ 　５１３．８８におけるフィツーゼの過剰発現 Ａ、ライカム（ｆｉｃｕｕ＋ｓ）について述べたトランスホーメーシツン操作に より発現ベクターｐＡＦ２−２３をＡ、ニガー（ｎｉｇｅｒ）ＣＢ　Ｓ　５１３ ．８８にｍ人した。単一のトランスホーマントを単離精製し、例６で述べた誘導 増殖条件下振とうフラスコ中でフィツーゼ産生をテストした。

あるトランスホーマント（Ａ、　ニガー（ｎｉｇｅｒ）　ｐ　Ａ　Ｆ　２−２　 Ｓ＃８、＃２０および＃３３と命名した）およびコントロール株のフィツーゼ発 現検定は例９Ａに示した方法で行ない第５表に示した。

Ａ、ニガー（ｎｉｇｅｒ）　）ランスホーマントのフィツーゼ発現レベルはＡ、 ライカム（ｆｉｃｕｕａ＋）　トランスホーマントと同じレベルであった。さら にこの結果はＡ、ライカム（ｆｉｃｕｕｍ）フィツーゼプロモーターがＡ、ニガ ー（ｎｉｇｅｒ）中でも活性であることを示している。

さらに先に述べたファーストシステム（ファルマシア）を用いたｐ８４．５〜６ の範囲のＩＥＦ−ＰＡＧＥゲル電気泳動でトランスホーマン）ｐＡＦ２−２Ｓ＃ ８の培養培地の分析を行った。同条件下で培養したＡ、ニガー（ｎｉｇｅｒ）親 株およびトランスホーマントｐＡＦ２−２Ｓ＃８の培養上清を等容量づつゲルに ロードし、泳動後上述のように染色した。

Ａ、ニガー（ｎｉｇｅｒ）親株は非常に微量のフィツーゼしか産生ぜずゲル電気 泳動では検出できなかった。ｐＡＦ２−２Ｓ＃８株は約９０倍のフィツーゼを生 産し、この差は第１１図で明白に見ることができる。

フィツーゼ酵素のいくつかのイソ型が検出された（アステリスクで示す）、一般 的たんばく賞染色ではフィツーゼたんばく賞のハンド強度は著しく大きいが、他 の主要たんばく賞のバンドは見えない。

第５表 Ａ、ニガーＣＢＳ　５１３．８８のｐＡＦ　２−２Ｓでのトランスホーメーショ ンによるフィツーゼ生産 Ａ、ニガー＋コントロールプラスミド　０．２Ａ、ニガーｐＡＦ　２−２Ｓ　１ １８　１４Ａ、ニガーｐＡＦ　２−２Ｓ　１３３　５Ａ、ニガーｐＡＦ　２−２ Ｓ　１２０　４（例１０） Ａ、ニガーアミログルコシダーゼ（Ａ　Ｇ’）遺伝子のプロモーターおよび、ま たはシグナル配列に融合したＡ、ライカムフイターゼ遺伝子を含む発現ベクター でトランスホームしたＡ、ニガーにおけるフィツーゼ発現 （発現ベクターの構築） Ａ、ニガー（ｎｉｇｅｒ）においてフィツーゼを過剰発現させるためにＡ、ライ カム（ｆｉｃｕｕｎ＋）フィツーゼ遺伝子が種々のシグナル配列と組合せたＡ、 ニガー（ｎｉｇｅｒ）アミログルコシダーゼ（ＡＧ）プロモーターのコントロー ル下にある発現力セントを誘導−した。

ｐ１８ＦＹＴ３およびｐ２４ＦＹＴ３において、Ａ、ニガー（ｎｉｇｅｒ）由来 のＡＣ遺伝子の各々１８および２４個のアミノ酸（ａａ）からなるリーダー配列 を成熟たんばく質をコードするフィツーゼ遺伝子フラグメントに融合する。発現 カセットｐＦＹＴ３においてはＡＧプロモーター配列がフィツーゼリーダー配列 を含むフィツーゼコード配列に融合している。（ｐ１８ＦＹＴ３の構築） ＡＧプロモーターおよび１８ａａＡＧリーダー配列の成熟たんばく質をコードす るフィツーゼ配列への融合はポリメレースチェーンリアクションを用いて行った 。ＰＣＲ反応においては２つの異なるテンプレート、上述の全うイターゼ遺伝子 を含むｐＡＦ２−２Ｓ、およびｐＬＩＣ１９中の１３〜１５ｋｂ　Ｈｉｎｄ　ｍ フラグメントを含むＡ、ニガー（ｎｉｇｅｒ）プラスミドライブラリーから単離 したＡ、ニガー（ｎｉｇｅｒ）由来の全ＡＣ一部位を含むプラスミドｐＡＢ６− １を使用した。単離のために２つのＡＧ特異的オリゴマーＡＧ−１：　５’−Ｇ ＡＣＡＡＴＧＧＣＴＡＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＧＣＡＡＣＧＧＡＣＡＴＴＧＴＴＴ ＧＧＣＣＣ−３’ＡＧ−２：　５’−ＡＡＧＣＡＧＣＣＡＴＴＧＣＣＣＧＡＡＧ ＣＣＧＡＴ−３’を使用した。これらの配列はいずれもＡ、ニガー（ｎｉｇｅｒ ）に関して発表されたヌクレオチド配列に基づいている（ボール（Ｂｏｅｌ）等 、（１９８４）、ＥＭＢＯＪ、ｉ、１０９７−１１０２　；ボール（、Ｂｏｅｌ ）等、（１９８４）、Ｍｏｌ、　ａｎｄ　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、ｉ、２３０６ −２３１５）　、オリゴヌクレオチドプローブはイントロン２の周りの配列から 導びいた。オリゴＡＧ−１はこのイントロンの３′側に位置し、ＡＣ；　ｍＲＮ Ａと同じ方向を有している。オリゴＡＧ−２はイントロン２の上流に位置し、Ａ Ｃ＋＊ＲＮＡと逆平行のものを選んだ。プラスミドｐＡＢ６−１は１４．５ｋｂ 　１（ｉｎｄ　ｎ［フラグメント上にＡＣ遺伝子を含んでいる（第１２図参照） 。

ＰＣＲ用ブラプライマーて４つの合成オリゴヌクレオチドを設計した。

オリゴ１　：　５’−ＣＴＣＴＧＣＡＧ旦紅ＴＣＡＡＧＣＴＡＧ−３’（ＡＴＣ ；開始コドンの約２５０ｂｐ上流にあるＥＣｏＲｌ部位付近にあるＡＣ特異的配 列） オリゴ１Ｂ−２：　５　’　−ＣＧＡＧＧＣＧＧＧＧＡＣＴＧＣＣＡＧＴＧＣＣ ＡＡＣＣＣＴＧＴＧＣＡＧＡＣ−３’成熟フィツーゼ＜　＞１８ａａＡＧ−リー ダーオリゴ１Ｂ−３：　５　’　−ＧＴＣＴＧＣＡＣＡＧＧＧＴＴＧＧＣＡＣＴ ＧＧＣＡＧＴＣＣＣＣＧＣＣＴＣＧ−３’１８ａａＡＧ−リーダー＜−〉成熟フ ィツーゼオリゴ４　：　５’　−ＧＧＣＡＣＧＡ匹紅匹ＴＴＣＡＧＣＴＴ−３’ （８６１番のＢａ＋ｉＨ１部位に存在するフィツーゼ特異的配列） ＰＣＲはサイキ（Ｓａｉｋｉ）等（（１９８８）　、５ｃｉｅｎｃｅ、１工主、 ４８７−４９１）の方法を若干修正して行った（例８参照）。

ＡＧ配列をフィツーゼコード配列に融合するため、２回のＰＣＲを行った。第１ の反応はテンプレートとしてｐＡＢ６−１およびプライマーとしてオリゴ１およ び１８−２を用いてＡＧプロモーターの３′側部分および３″側境界でフィツー ゼ遺伝子のヌクレオチドに隣接する１８ａａＡＧ−リーダー配列を含む３００ｂ ＰのＤＮＡフラグメントを増巾し、また第２の反応はテンプレートとしてｐＡＦ ２−２３およびプライマーとしてオリゴ１８−３および４を用いて５′側境界で ＡＧシグナルペプチドの１８個のヌクレオチドに隣接するライターゼ遺伝子の５ ′側部分を含む６００ｈｐのＤＮＡフラグメントを増巾する。これらの増巾につ いては第１３図に示した。

生成する２つのＤＮＡフラグメントをゲル電気泳動とエタノール沈澱で情製し、 これをテンプレートとし、オリゴ１および４をプライマーとした第３のＰＣＲを 行ってＡＧ−ライターゼ融合物を生成した。生じたＤＮＡフラグメントをＥｃｏ ＲＩおよびＢａｍＨで消化し、ｐＴＺ１８Ｈにサブクローンした。この融合物を シーケンシングし、ｐ１８ＦＹＴ１と命名した。

このＡＧ−プロモーターの残りの上流領域（３，５ｋｂ）はｐＡＢ６−１のＫｐ ｎｌによる消化およびＥｃｏＲｒによる部分消化により作りｐ１８ＦＹＴ１の１ ．１　ｋｂ　ＥｃｏＲＩ　／　ＢａｍＨＴフラグメントにライゲーションしてｐ ＴＺ１８ＲのＫｐｎ　１　／　ＢａｍＨＩ部位にクローン化した。

このようにして得られるプラスミドｐ１８ＦＹＴ２を第１５図に示す、付加的Ｈ ｉｎｄｌ［［制限部位は合成フラグメント５’ＡＡＴＴＣＡＡＧＣＴＴＧ　３’ ３’　ＧＴＴＣＧＡＡＣＴＴＡＡ　５’のｐＡＦ−２−２３のＥｃｏＲＩ部位（ ａｍｄｓ−遺伝子に隣接する）への挿入により導入した。このプラスミドはｐＡ Ｆ２−２ＳＨと命名しく第１４図）、ライターゼプロモーター配列をＰＣＲＡＧ フイターライ合Ｄ　Ｎ　Ａフラグメントと交換するための原料プラスミドとして 使用する。

最終的構築としてｐ１８ＦＹＴ２およびｐＡＦ２−２ＳＨをＫｐｎｌで消化し、 ついでＢａｍＨＩで部分消化する。ｐ１８ＦＹＴ２の４．６ｋｂ　ＤＮＡフラグ メントおよびｐＡＦ２−２ＳＨの１１ｋｂ　ＤＮＡフラグメントを単離し、ゲル 電気泳動で精製後ライゲーションしてから大腸菌に導入した。この誘導された発 現カセットをｐ１８ＦＹＴ３と命名した（第１５図）。

（ｐ２４ＦＹＴ３の構築） ＡＣプロモーターおよび２４ａａＡＧリーダー配列の成熟ライターゼコード配列 の融合は用いたプライマー以外のｐ１８ＦＹＴ３の構築に関して上述した方法と 同様にしてＰＣＲ−増巾で行った。

２つの新しいプライマーを合成した。

オリゴ２４−２　：　５　’　−ＣＧＡＧＣＣＧＧＧＧＡＣＴＧＣＣＡＧＧＣＧ ＴＴＧＧＡＡＩＩＴＣＡＣＡＴＴ−３’成熟ライターゼ＜　−＞　２４ａａＡ　 Ｇ−リーダーオリゴ２４−３　：　５　’　−ＡＡＴＧＴＧＡＴＴＴＣＣＡＡＧ ＣＧＣＣＴＧＧＣＡＧＴＣＣＣＣＧＣＣＴＣＧ−３’２４ａａＡＣ；−リーダー ＜−〉成熟ライターゼ２つの別個のＰＣＲを行った。第１の反応はテンプレート としてｐＡＢ−ｂ−１、およびプライマーとしてオリゴ１および２４−２を用い てＡＣプロモーターの３′側部分および３′側境界でライターゼ遺伝子の１８個 のヌクレオチドに隣接する２４ａａＡＧリーダー配列を含む３１８ｂＰのＤＮＡ フラグメントを増巾し、また第２の反応は、テンプレートとしてｐＡＦ２−２Ｓ およびプライマーとしてオリゴ２４−３および４を用いて５′側境界で２４ａａ ＡＧリーダーの１８ヌクレオチドに隣接するライターゼ遺伝子の５′側部分を含 むＤＮＡフラグメントを増巾する。これらの増巾の説明を第１３図に示す。

中間体プラスミドｐ２４ＦＹＴ１およびｐ２４ＦＹＴ２を介する最終的発現カセ ソ１−ｐ２４ＦＹＴ３の構築のためｐ１８ＦＹＴ１およびｐ１８ＦＹＴ２につい て述べたものと同様のクローニング経由／操作を用いて発現力セフ）ｐ１８ＦＹ Ｔ３を誘発した（第１５図）。

（ｐＦＹＴ３の構築） ライターゼ遺伝子（ライターゼリーダーも含む）配列へのＡＧ−プロモーターの 融合は、用いたプライマー以外、ｐ１８ＦＹＴ３の構築について述べたようにＰ ＣＲ増中により行った。以下の配列を有するプライマーを作った。

オリゴｆｙｔ−２：　５　’　−ＡＡＣＡＧＣＡＧＡＧＡＣＧＣＣＣＡＴＴＧＣ ＴＧＡＧＧＴＧＴＡＡＴＧＡＴＧ−３′ライクーゼリーダー＜−＞ＡＧ−プロモ ーターオリゴｆｙｔ−３：　５　’　−ＣＡＴＣＡＴＴＡＣＡＣＣＴＣＡＧＣＡ ＡＴＧＧＧＣＧＴＣＴＣＴＧＣＴＧＴＴ−３’ＡＧ−プロモーター＜−〉ライタ ーゼリーダー２回のＰＣＲを行った。最初の反応はテンプレートとしてｐＡＢ６ −１およびプライマーとしてオリゴ１およびｆｙｔ−２を用いて３′側境界でラ イターゼリーダーの１８個のヌクレオチドに隣接するＡＧ−プロモーターの３′ 側部分を含む２８２ｂｐのＤＮＡフラグメントを増巾し、また第２の反応はテン プレートとしてｐＡＦ２−２３およびプライマーとしてオリゴｆｙｔ−３および ４を用いて５′側境界でＡＧ−プロモーターの１８ヌクレオチドる隣接するライ ターゼ遺伝子（ライターゼリーダーも含む）の５′側部分を含むＤＮＡフラグメ ントを増巾する。これらの増巾については第１３図に図で示しである。

中間体プラスミドｐＦＹＴ１およびｐＦＹＴ２を介する最終発現カセットｐＦＹ Ｔ３の構築のためｐ１８ＦＹＴ１およびｐ１８ＦＹＴ２について述べたものと同 じクローニング経路／操作を用いて発現カセットｐ　１８　ＦＹＴ３を誘導した （第１５図）。

（ｉニガー（ｎ　ｉ　ｇｅｒ）におけるＡＣプロモーター制御下のライターゼ遺 伝子の発現） ＋！１ｎｄｌ消化により大腸菌の配列を上述のライターゼ発現カセットから除去 した。その後側９で述べた操作を用い１０μｇのＤＮＡでＡ、ニガー（ｎｉｇｅ ｒ）　ＣＢ　Ｓ　５１３．８８株（１９８８年１０月１０日寄託）にトランスホ ームした。各発現カセットから１個のＡ。

ニガー（ｎｉｇｅｒ）　）ランスホーマントを単離し、その胞子を選択的アセト アミド寒天培地にストリークする。各トランスホーマントの胞子を０．４％ポテ トデキストロース（オクソイド、イギリス）寒天プレート上３７℃、３日間生育 させた細胞から回収した。ライターゼ生産は以下の生育条件下振とうフラスコ中 でテストした。

１リツトル中、１　ｇ　Ｋ）ＩｚＰＯｎ　；　３０　ｇマルトース、５ｇイース ト抽出物、１０ｇカゼイン−加水分解物、０．５　ｇ　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０お よび３ｇ！−ウィーン８０を含む１０（１Ｍ１の前培養培地に約１×１０８個の 胞子を接種する。ロータリーシェーカー中３４℃で一晩増殖させた後、その培養 培地１ｄを、１００１１ｉの培養培地（１リツトル中、２ｇ　ＫＨ２ＰＯ４，７ ０ｇマルトデキストリン（マルデックスＭＤＯ３、アミラム）、１２．５ｇイー スト抽出物、２５ｇカゼイン加水分解物、２　ｇ　ＫｚＳＯ，，０，５ｇ　Ｍｇ ５Ｏａ・７ＨｚＯ，０，０３ｇ　ＺｎＣ１ｚ、０．０２　ｇ　ＣａＣ１ｚ、０． ０５　ｇ　Ｍｎ５Ｏ，・４１４２０およびＦｅ５Ｏａを含む、ｐＨは５．６に調 整）に接種した。

少なくとも１４０時間菌糸体を増殖させた。ライターゼ生産は例２に示した方法 で行った。各発現カセ−／　）から得たいくつかのランダムなトランスホーマン トの産生結果を第６表に示す。

第６表 種々のリーダー配列と組合せたＡ、ニガーＡＧプロモーターのコントロール下、 Ａ、ライカムのフィツーゼ遺伝子を含むプラスミドでトランスホームしたＡ、ニ ガーＣＢ　Ｓ　５１３．８８株のフィツーこれらのデータはＡ、ニガー（ｎｉｇ ｅｒ）　Ａ　Ｃプロモーターの制御Ｂ下のフィツーゼ遺伝子を含むＡ、ニガー（ ｎｉｇｅｒ）　）ランスホーマントにおける高い発現レベルを示している。また 、もっとも高いフィツーゼ生産は、フィツーゼリーダー配列を含むｐＦＹ７３発 現ベクターで得られることも示している。Ａ、ニガー（ｎｉｇｅｒ）へのトラン スホーメーション後、イントロンを含まないフィツーゼ遺伝子を含む同様の発現 ベクターはＡ、ニガー（ｎｉｇｅｒ）のｐ　ＦＹＴ３トランスホーマントと同程 度のフィツーゼ発現レベルを示した。

さらに、ｐＨ範囲４．５〜６のＩＥＦ−ＰＡＧＥゲルでの電気泳動をトランスホ ーマントｐ　ＦＹＴ３＃２０５および＃２８２の培養上清について行った。同一 条件下で培養したＡ、ニガー（ｎｉｇｅｒ）親株と両トランスホーマントの培養 上清各々等容量をゲルにロードし、泳動させた後、例９で述べた方法で染色した 。Ａ、ニガー（ｎｉｇｅｒ）親株は非常に低レベルのフィツーゼしか生産せずこ の実験では検出されなかった。ｐＦＹＴ３＃２０５および＃２８２株は各々約２ ５０および１４００倍のフィツーゼを生産した（第４表および第５表のフィツー ゼレベルと比較して）。この差は第１１図からも明らかである。いくつかのフィ ツーゼイソ酵素が検出された（アステリスクで印されている。一般的たんばく賞 染色でフィツーゼたんばく賞バンドの強度が著しく増加している一方、他の主要 たんばく賞バンドは出現していないことを示している。

例１１ Ａ、ライカムおよびＡ、ニガーにおけるフィツーゼの工業的規模の過剰生産 Ａ、ライカム（ｆｉｃｕｕｍ） 例１で述べた方法でＡ、ライカム（ｆｉｃｕｕｍ）　ｐ　ＡＦ　２−２　Ｓ＃４ およびＡ、ライカム（ｆｉｃｕｕ＋ｍ）　ＮＲＲＬ　３１３５株を培養した。

これらのトランスホーマントは野生株に比べ約５０倍のフィツーゼを生産した。

第７表 フィツーゼ遺伝子を多数含むＡ、ライカム（ｆｉｃｕｕｍ）　）ランスホーマン トによるフィツーゼの過剰生産。細胞は例１の方法に従って培養した。

接種後の時間　フィツーゼ活性（ｕ／＋ｌｉ発酵培地）Ａ、　ライカム　ＮＲＲ Ｌ３１３５　Ａ、ｙイカム　ＡＦ　２−２５　９４Ｂ、Ａ、ニガー（ｎｉｇｅｒ ） Ａ、ニガー（ｎｉｇｅｒ）　ｐ　Ａ　Ｆ　２−２　Ｓ　＃　８、Ａ、ニガー（ｎ ｉｇｅｒ）ＣＢ　Ｓ　５１３．８８株およびＡ、ニガー（ｎｉｇｅｒ）親株を例 １の方法に従って培養した。このトランスホーマントは元のＡ、ニガー（ｎｉｇ ｅｒ）１１株と比較して約１０００倍のフィツーゼを生産した（第８表）。

第８表 フィツーゼ遺伝子を多数含むＡ、ニガー（ｎｉｇｅｔ）のトランスホーマントに よるフィツーゼの過剰発現、細胞は例１の方法に従がい培養した。

接種後の時間　フィツーゼ活性（Ｕ／ｍ！発酵培地）Ａ、　ニガー　ＣＢＳ、５ １３．８８　Ａ、ニガー　ＡＦ２．２１８９２　０、１　６５ １４　．１ 例１２ フィツーゼ発現とＡＣ遺伝子置換を同時に起こすベクターｐＲＥＰＦＴＴ３を構 築するため、ｐＦＹＴ３をＫｐｎＩで消化する。生成したＫｐｎｌ　ＤＮＡフラ グメントを用いて２つのライゲーションを行った。

Ｋｐｎ　Ｉ　−Ｈｉｎｄ　ｍアダプターとのライゲーション１５’−ＣＧＧＧＧ Ａ　−３’ ３′−皿且旦ＣＣＣＣＴＴ匡人−５′ に肚Ｉ　旦ｉｎｄ　ｍ Ｋｐｎ　Ｉ　−Ｈｉｎｄ　ｍ’″アダプターとのライゲーション２、このライゲ ーションではＨｉｎｄｍ制御部位は保存されない。

５’−ＣＧＧＧＧＧ　−３’ ３　’　−ＣＴＡＧＧＣＣＣＣＣＴＣＧＡ　−５’ＫＬＩ　Ｈｉｎｄ　ｍ” つづいて、ライゲーション１をＨｉｎｄＩ［で部分消化する。ａｍｄｓ含有フラ グメントを電気泳動で除去後、残りのＤＮＡフラグメントをライゲーションで閉 環し、大腸菌に導入した。このプラスミドはｐＦＹＴ３Δａｎｄ　Ｓと命名した （第１６図）。

またライゲージラン２もＨｉｎｄｌ［［で消化し、ａ…ｄｓ遺伝子を含む４ｋｂ のＨｉｎｄ　Ｉ［Ｉ／Ｈｉｎｄ　Ｉ”　ＤＮＡフラグメントをゲル電気泳動で単 離し、つづいてｐＦＹＴ３Δａｍｄ　Ｓ　（７）　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ部分消化物 にライゲーションして大腸菌に導入した。フィツーゼ遺伝子の３′末端にａｎｄ 　Ｓ遺伝子を含むこのプラスミドをｐＦＹＴ３ＩＮＴと命名した（第１７図）。

３′隣接ＡＣ配列を含むｐＡＢ６−１の６ｋｂＳａｌ　Ｉ　／　Ｈｉｎｄ　ｍＤ ＮＡフラグメントを導入するためｐＦＹＴ３ＩＮＴをＨｉｎｄｌｌｌで部分的に 消化し、まずアダプター二 ５’−ＡＧＣＴＡＧＧＧＧＧ　−３’ にライゲーション後（Ｈｉｎｄ　ｍ’制限部位は保存されない）、ｐＡＢ６−１ のＳａｌ　Ｉ　／　Ｈｉｎｄ　ｍとライゲーションさせた。大腸菌へのトランス ホーメーション後、正しい位置に３’ＡＣ隣接配列を含む目的のプラスミドｐＲ ＥＰＦＹＴ３を得る（第１８図）。

（ＡＣ遺伝子置換によるＡ、ニガーにおけるライターゼ発現）ｐＲＥＰＦＹＴ３ によるＡ、ニガー（ｎ　ｉ　ｇｅｒ）のトランスホーメーション前、このプラス ミド中の大腸菌の配列をＨｉｎｄＩ［［消化および電気泳動で除去した。Ａ、ニ ガー（ｎｉｇｅｒ）　ＣＢ　Ｓ　５１３．８８株を例９に述べた操作により１０ μｇのＤＮＡフラグメントでトランスホームした。このトランスホーマントの選 択および培養は例９で述べた方法で行った。選択したトランスホーマントの１部 はＡＣ活性を失っていた（約２０％）、染色体ＤＮＡのサウザーン分析をＡＣネ ガティブでかつ、ライターゼボジティブなトランスホーマントについて行ないＡ Ｇ遺伝子がライターゼ遺伝子と置していることを確認した。

（例１３） （種におけるライターゼ遺伝子の保存）微生物種にライターゼ遺伝子が保存され ているかどうかを知るために、１０個の種に由来する染色体ＤＮＡのサウザン分 析をプローブとしてＡ、ライカム（ｆｉｃｕｕｍ）ライターゼｃＤＮＡを用いて 行った。この染色体ＤＮＡ分析は繊維状菌類、イーストおよびバクテリアについ て行った。例として、各グループから限定数選出した。、繊維状菌類にっていは ペニシリウム　クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕ ｏ＋）およびアスベルギラス　ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ） 、イーストについてはサツカロミセス　セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ ｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびクルイゝロミセスラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒ ｏｍｙｃｅｓ　１ａｃｔｉｓ）　、および原核生物についてはダラム陽性菌：枯 草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）、クロストリジウムサーモセラム （Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｈｅｒＩｌｏ　ｃｅｌｌｕｍ）およびストレプト ミセス　リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌ１ｖｉｄａｎｓ）およびグ ラム陰性菌：シュードモナス　エルジノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕ ｇｉｎｏｓａ）を用いた。これらの種由来の高分子量染色体ＤＮＡをＰｖｕｌ［ およびＢａｍＨＩで別個に消化し、つづいて０．７％アガロースゲルで電気泳動 した。ニトロセルロースフィルターに移した後、低ストリンジエンシー（６ＸＳ ＳＣ１５０℃）で−晩、ｘｚｐ標識化５′フイターゼｃＤＮＡフラグメント（例 ８で述べたもの）を用し１てノ＼イブリダイゼーシヲンを行った。プロットを室 温で５ｘＳＳＣを用いて洗浄し、これを用いてＸ線フィルムを１８時間露光させ た。

第１９図ａおよびｂに示されているように、はとんどすべてのレーンに明確なバ ンドが観察される。このことは微生物種間でライターゼ遺伝子のホモロジーが高 いことを示している。

Ｎ末端アミノ酸配列 ０３　ＶＡＬ ０４　ＰＲＯ ０５ＡＬＡ　ＡＬＡ ０６　ＳＥＲ５ＥＲ ０７ＡＲＧ ０８　＋＋＋＊ｅ　＋　ＡＳＮ ０９　ＧＬＮ　ＧＬＮ　ＧＬＮ ｌｏ　ＳＥＲＳＥＲ５ＥＲ １１ＳＥＲＳＥＲ５ＥＲ １２−−−−ＧＬＹ １３　ＡＳＰ　ＡＳＰ　ＡＳＰ １４　ＴＨＲＴＨＲＴｌ−ｌＲ １５ＶＡＬ　ＶＡＬ　ＶＡＬ １６　ＡＳＰ　ＡＳＰ　ＡＳＰ １７　ＧＬＮ　ＧＬＮ １８　ＧＬＹ １９　ＴＹＲ ２０ＧＬＮ ２１　ＡＲＧ ２２　ＰＨＥ ２３　５ＥＰ ２４　ＧＬＵ ２５　ＴＨＲ ２６ＳＥ日 ２７　）−Ｉｔｓ ２８　ＬＥＵ ２９　ＡＲＧ ３０　（ＧＬＹ）” ３１　ＧＬＮ ３４　ＰＲＯ ３５ＰＨＥ ３６　’　ＰＨＥ ３７　（ＡＳＰ） ３８　ＬＥＵ ３９　ＡＬＡ 日ｇｕｒｅ　１ａ ペプチドアミノ酸配列 ＢＣＤＥ 位置 ０１　ＧＬＮ　（ＴＲＰ）”　ＭＥＴ　ＡＬＡ　ＶＡＬ０２　−一軸　ＳＥＲＭ ＥＴ　ＳＥＲＶＡＬ０３　ＧＬＮ　ＰＨＥ　ＧＬＮ　ＳＥＲＡＳＰ０４　ＡＬＡ 　ＡＳＰ　ＣＹＳ　ＡＬＡ　□０５　ＧＬＬＪ　ＴＨＲＧＬＮ　ＧＬＵ　ＡＲＧ ０６　ＧＬＮ　ＩＬＥ　ＡＬＡ　ＬＹＳ　ＰＨＥ０７　ＧＬＵ　ＳＥＲＧＬＵ　 ＧＬＹ　ＰＲＯ０８ＰＲＯＴＨＲＧＬＮ　ＴＹＲＴＹＲ０９ＬＥＵ　ＳＥＲＧＬ Ｕ　ＡＳＰ　ＴＨＲｌｏ　ＶＡＬ　ＴＨＲＰＲＯＬＥＵ　ＧＬＹｌｌ　（ＡＲＧ ）　ＶＡＬ　ＬＥＵ　ＶＡＬ　−−−１２ＶＡＬ　ＡＳＰ　ＶＡＬ　ＶＡＬ　Ａ ＬＡ１３　ＬＥＵ　ＴＨＲＡＲＧ １４　ＶＡＬ　ＬＹＳ　ＶＡＬ １５　ＡＳＮ　ＬＥＵ　ＬＥＵ １６　（ＡＳＰ）　ＳＥＲＶＡＬ １７　（ＡＲＧ）　ＰＲＯＡＳＮ １８　（ＶＡＬ）　ＰＨＥ　ＡＳＰ １９　ＶＡＬ　（ＣＹＳ）　ＡＲＧ ２０　ＰＲＯ（ＡＳＰ） ２１　ＬＥＬＩ ２２　ＰＨＥ ２３　ＴＨＲ Ｆｉｇｕｒｅ　１ｂ Ｎ末端１００ＫＤたんばく質 位置 ０４　ＧＬＵ ０５　ＡＲＧ ０６　ＰＨＥ Ｆｉｇｕｒｅ　Ｉｃ Ｆｉｇｕｒｅ　５ Ｆｘｑｕｒｅ　６　（１／？　） Ｆｉｇｕｒｅ　６　Ｆ　２／７　１ Ｆｉｇｕｒ＠６　（ｓｈａｅｔ　３　ｏｆ　７１Ｆｉｇｕｒｅ　６　（ｓｈａａ ｔ　４　ｏｆ　７１ｒ工ｇｕｒｅ　６　（ｓｈｅａｔ　５　ｏｆ　７１ＣＴＧＴ ＴＣＧＣＧＧＴＣＴＧＣＧＧＧＣＴＧＡＴＡＴＧＣＧＡＧＴＴＧＡにＧＴＧＣＣ ＴＣＧＣＡＧＡＣＣＧＡＣＧＡＧＡＧＡＡＡＣＡＡＣＣＡＣＴＴＴＡＡＣＴＴＣ ＡＴＧＡ入ＡＧＣＣＴＴＧ入ＡＣＴＡＣＴＣＡＡＴＧＣＧＣＧＡＣＧＡＧＣＣＣ ＴＣＴＣＣＴＣＧＧＣＧＴＧＡＴＴＣＴＧＡＡＡＴＴＣＴＧＣＡＡＴＣＡＧＧＧ ＣＡＧＧＴＧＧＣＧＧＴＣＣＡＧＡＡＧＧＧＧＧＡＧＴＴＡＣＡＴＴＡＡＡＡＧ ＣＣＴＣＡＴＡＧＡＴＧＴＣ？ＴＴＡＧＴＣＴＴＣＡＴＴｒＣＧＧＣＧＧＧＣＴ ＧＡＴＣＴＴＣＣＡＴＣＴＣＡＧＡＡＴＧＧＧＡＴＣＧＣＴＴＴＣＦ１ｇｕｒｅ 　６　（ｓｈａａｔ　６　ｏｆ　７）ＧＡＧＴＣＧＧＣＴＣＣＴ’ｒＧＧＴＣＴ ＣＴＴｒＧＧＣＣＴＣＴＴｒＣＡＣＴＴＣＡＣＣＴＧＧＡＣＣＧＴＣＴＦｉｇｕ ｒｅ　６　（ｓｈａａｔ　７　ｏｆ　７１Ｆｉｇｕｒｅ　８　（ｓｈｅｅｔ　ｌ 　ｏｆ　２）Ｆｉｇｕｒｅ　８　（ｓｈｅｅｔ　２　ｏｆ　２１ＴＬＴＤＴＥＶ ＴＹＬＭＤＭＣ８ＦＤ ’ＩＴＡＧ　１４０４ Ｆｉｇｕｒｅ　９ ＋−〇− Ｆｉｇｕｒｅ　１０ｂ ＰＣＲによるＡＧ／フイライゼ遺伝子融合Ｈｉｎｄｌｌｌ Ｆｉｇｕｒｅ　１５ａ 日ｇｕｒｅ　１５ｂ Ｈｉｎｄｌｌｌ Ｈｉｎｄｌｌｌ Ｆｉｇｕｒｅ　１７ Ｆｉｇｕｒｅ　１８ 平成　年　月　日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．フィターゼ活性を有するペプチドまたはたんぱく質をコードすることを特徴 とする精製単離したＤＮＡ配列。 ２．請求の範囲１記載の精製単離したＤＮＡ配列で、さらに該配列が微生物に宙 来することを特徴とするＤＮＡ配列。 ３．請求の範囲１記載の精製単離したＤＮＡ配列で、さらに該配列が菌類に由来 することを特徴とするＤＮＡ配列。 ４．請求の範囲１記載の精製単離したＤＮＡ配列で、さらに該配列がアスペルギ ラス由来であることを特徴とするＤＮＡ配列。 ５．請求の範囲１記載の精製単離したＤＮＡ配列で、さらに該配列がアスペルギ ラスフィカムまたはアスペルギラスニガー由来のものであることを特徴とするＤ ＮＡ配列。 ６．請求の範囲１記載の精製単離したＤＮＡ配列で、さらに該配列が以下の特性 ： ａ）アスペルギラス宿主中で発現した場合ＳＤＳ−ＰＡＧＥで８５ｋＤａの単一 バンドを与える、 ｂ）脱グリコシル化後、約４８〜５６．５ｋＤａの見かけの分子量を有する、 ｃ）約１００Ｕ／ｍｇたんぱく質の比活性を有する、を示すフィターゼをコード することを特徴とするＤＮＡ配列。 ７．精製単離したＤＮＡ配列で、以下に示す特性：ａ）第６図に示したＤＮＡ配 列に宙来するオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズする、 ｂ）第８図に示したｃＤＮＡ配列に由来するオリゴヌクレオチドプローブにハイ ブリダイズする、 の少なくとも１つを示すことを特徴とするＤＮＡ配列。 ８．請求の範囲１乃至７のいずれか１項記載のＤＮＡ配列が適当な発現ホスト中 フィターゼ活性を有するたんぱく質またはペプチドを発現させ得る調節領域に機 能的に結合していることを特徴とする発現構築物。 ９．請求の範囲８記載の発現構築物で、さらに該調節領域がフィターゼ活性を有 する発現たんぱく質またはペプチドを分泌させる分泌リーダー配列を含むことを 特徴とする発現構築物。 １０．請求の範囲９記載の発現構築物で、さらにフィターゼ活性を有するたんぱ く質またはペプチドを発現させるのにＡＧプロモーターを用いることを特徴とす る発現構築物。 １１．請求の範囲１０記載の発現構築物で、さらにフィターゼ活性を有する発現 たんぱく質またはペプチドを分泌させるのに同種のフィターゼリーダー配列を用 いることを特徴とする発現構築物。 １２．請求の範囲１０記載の発現構築物で、さらにフィターゼ活性を有する発現 たんぱく質またはペプチドを分泌させるのに１８個のアミノ酸からなるＡＧリー ダー配列を用いることを特徴とする発現構築物。 １３．請求の範囲１０記載の発現構築物で、さらにフィターゼ活性を有する発現 たんぱく質またはペプチドを分泌させるのに２４個のアミノ酸からなるＡＧリー ダー配列を用いることを特徴とする発現構築物。 １４．請求の範囲９記載の発現構築物でフィターゼ活性を有するたんぱく質また はペプチドを発現させるために同種のフィターゼプロモーターを用いることを特 徴とする発現構築物。 １５．請求の範囲１４記載の発現構築物で、さらにフィターゼ活性を有する発現 たんぱく質またはペプチドを分泌させるのに同種のフィターゼリーダー配列を用 いることを特徴とする発現構築物。 １６．請求の範囲１４記載の発現構築物で、さらにフィターゼ活性を有する発現 たんぱく質またはペプチドを分泌させるのに１８個のアミノ酸からなるＡＧリー ダー配列を用いることを特徴とする発現構築物。 １７．請求の範囲１４記載の発現構築物で、さらにフィターゼ活性を有する発現 たんぱく質またはペプチドを分泌させるのに２４個のアミノ酸からなるＡＧリー ダー配列を用いることを特徴とする発現構築物。 １８．請求の範囲８乃至１７のいずれか１項記載の発現構築物を含むことを特徴 とする宿主細胞をトランスホームし得るベクター。 １９．請求の範囲１８記載のベクターで、さらに該ベクターがプラスミドである ことを特徴とするブクター。 ２０．請求の範囲１８記載のベクターで、さらに該ベクターがｐＡＦ２８−１、 ｐＡＦ２−２Ｓ、ｐＡＦ２−２、ｐＡＦ２−３、ｐＡＦ２−４、ｐＡＦ２−６、 ｐＡＦ２−７、ｐ１８ＦＹＴ３、ｐ２４ＦＹＴ３およびｐＦＹＴ３からなる群か ら選ばれるプラスミドであることを特徴とするベクター。 ２１．請求の範囲１８乃至２０のいずれか１項記載のベクターでトランスホーム したことを特徴とする形質転換宿主細胞。 ２２．細菌、イースト類、カビ類からなる群から選ばれる請求の範囲２１記載の 形質転換宿主細胞。 ２３．アスペルギラス、トリコデルマ、ペニシリウム、ムコール、バチルス、ク ルイベロミセスおよびサッカスミセスからなる群から選ばれる請求の範囲２２記 載の形質転換宿主細胞。 ２４．アスペルギラスニガー、アスペルギラスフィカス、アスペルギラスアワモ リ、アスペルギラオリゼ、トリコデルマリーセイ、ムコールミエヘイ、クルイベ ロミセスラクチス、サッカロミセスセレジシエ、枯草菌およびバチリスリチェホ ホルミスからなる群から選ばれる請求の範囲２２記載の形質転換宿主細胞。 ２５．フィターゼ活性を有するペプチドまたはたんぱく質の産生方法で、該フィ ターゼ活性を有するペプチドまたはたんぱく質の産生に適した条件下、請求の範 囲２１乃至２４のいずれか１項記載の形質転換宿主細胞を培養することを特徴と する方法。 ２６．請求の範囲２５記載の方法で生産されるフィターゼ活性を有するペプチド またはたんぱく質。 ２５．以下に示す特性： ａ）アスペルギラス宿主において発現した場合にＳＤＳ−ＰＡＧＥで８５ｋＤａ の単一バンドを与える、 ｂ）脱グリコシル化後約４８〜５６．５ｋＤａの範囲の見かけの分子量を有する 、 ｃ）約１００Ｕ／ｍｇたんぱく質の比活性を有する、を示すことを特徴とするフ ィターゼ。 ２８．請求の範囲２６および２７のいずれか１項記載のフィターゼ活性を有する ペプチドまたはたんぱく質を含むことを特徴とする動物用飼料。 ２９．フィチン酸塩をイノシトールおよび無機リン酸へ変換するための請求の範 囲２６および２７のいずれか１項記載のフィターゼ活性を有するペプチドまたは たんぱく質の使用。 ３０．請求の範囲２６および２７のいずれか１項記載のフィターゼを補った飼料 原料を含む飼料を動物に与えることを特徴とする動物の成長の促進方法。 ３１．飼料原料中に含まれるフィチン酸塩をイノシトールおよび無機リン酸に変 換させるのに有効な量の請求の範囲２６および２７のいずれか１項記載のフィタ ーゼを捕った飼料原料を含む飼料を動物に与えることを特徴とする動物排他物中 のフィチン酸塩レベルの減少方法。