MXPA98010632A

MXPA98010632A - Secuencias de adn que codifican fitasas de microorganismos ruminales o del estomago

Info

Publication number: MXPA98010632A
Application number: MXPA/A/1998/010632A
Authority: MX
Inventors: Joan Cheng Kuo; Brent Selinger Leonard; Jay Yanke Lindsey; Dong Bae Hee; Zhou Luming; Wallace Forsberg Cecil
Original assignee: Her Majesty The Queen In Right Of Canada As Represented By The Dept Of Agriculture & Agrifood Canada
Priority date: 1996-06-14
Filing date: 1998-12-14
Publication date: 1999-09-01

Abstract

Se proporcionan fitasas derivadas de microorganismos ruminales. Las fitasas son capaces de catalizar la liberación del fósforo inorgánico delácido fítico. Las fuentes preferidas de fitasas incluyen Selenomonas, Prevotella, Treponema y Megasphaera. Se proporciona un ADN purificado y aislado que codifica una fitasa de Selenomonas rumiantium JY35 (ATCC 55785). También se proporcionan vectores de expresión recombinantes que contienen ADNïs que codifican las fitasas y las células huésped transformadas con los ADNïs que codifican las fitasas. Las fitasas sonútiles en una amplia gama de aplicaciones que involucran la desfosforilación del fitato, incluyendo, entre otras cosas, el uso en los suplementos de alimentación animal.

Description

SECUENCIAS DE ADN QUE CODIFICAN FITASAS DE MICROORGANISMOS ROMINALES O DEL ESTOMAGO Campo de la Invención Esta invención se refiere a fitasas derivadas de microorganismos ruminales o del estómago.

Antecedentes de la Invención Aunque los constituyentes vegetales de los productos alimenticios para el ganado son ricos en fósforo, se requiere un suplemento de fósforo inorgánico para obtener un buen funcionamiento del crecimiento de los animales monogástricos. El ácido fitico (ácido mioinositol hexafosfórico) está presente generalmente como un complejo de sales de calcio, magnesio y potasio y/o proteínas, y es la forma predominante del fósforo en los cereales, las semillas oleaginosas, y legumbres, y se cuantifica en 1 al 3 % del peso seco de la semilla y del 60 al 90 % del fósforo total presente en las semillas (Graf, 1986) . Sin embargo, los animales monogástricos (por ejemplo, el cerdo, las aves de corral y los peces) utilizan el fitato pobremente o no lo usan debido a que carecen de enzimas en el tracto gastrointestinal capaces Ref.029089 de hidrolizar el fitato. El fitato pasa ampliamente intacto a través del tracto gastrointestinal superior, en donde el mismo puede reducir la biodisponibilidad de los nutrientes quelando los minerales (por ejemplo, el calcio y el zinc) , uniendo o aglutinando los aminoácidos y las proteínas (Graf, 1986) e inhibiendo las enzimas. El fósforo del fitato en el abono posee un serie problemas de contaminación, contribuyendo a la autroficación de las aguas superficiales en las áreas del mundo en donde la producción de ganado monogástrico es intensa. Las ineficiencias de la producción y la contaminación del fósforo provocada por el fitato pueden ser resueltas de manera efectiva por el suplemento de fitasa en las dietas de los animales monogástricos. Las fitasas catalizan la hidrólisis del fitato al mioinositol y al fosfato inorgánico, los cuales son absorbidos entonces en el intestino delgado. Además de reducir los requerimientos del suplemento y de reducir la cantidad de los contaminantes de fitato liberados, las fitasas también disminuyen los efectos antinutritivos del fitato. Las fitasas son producidas en tejidos animales y plantas (predominantemente semillas) y por una variedad de microorganismos (patente U.S. No. 3,297,548; Shieh y Ware, 1968; Ware y Shie, 1967) . A pesar del arreglo de las fuentes de fitasa potenciales, solamente el hongo del suelo (Aspergillus niger o Aspergillus ficuum) es utilizado habitualmente para la producción comercial de la fitasa. La fitasa producida por el A. ficuum posee la actividad especifica más grande (100 unidades/mg de proteina (en donde las unidades están definidas como µmoles de fosfato liberadas por minuto) ) y a una termoestabilidad mayor comparada con aquellas fitasas que han sido caracterizadas a partir de otros microorganismos (Solicitud de Patente Europea No. 0,420,358 (van Gorcum et al., 1991) y Patente U.S. No. 5,436,156 (van Gorcum et al., expedida el 25 de julio de 1995)). La fitasa de A. ficuum es una fitasa acida y exhibe una actividad pequeña arriba de pH 5.5 (Howson y David, 1983; van Gorcum et al., 1991). En consecuencia, la actividad está limitada a una región relativamente pequeña del tracto digestivo monogástrico, en el cual el pH varia desde 2-3 (en el estómago) hasta 4-7 (en el intestino delgado) . Aunque la idea del suplemento de fitasa de las dietas monogástricas fue propuesta desde hace más de 25 años (Patente U.S. No. 3,297,548, Ware y Shieh, 1967), el alto costo de la producción de enzimas ha restringido el uso de la fitasa en la industria de la ganadería. En América del Norte, la eficacia suplemental es generalmente más costosa que los suplementos de fósforo.

En algunas circunstancias, el costo de la utilización de fitasa puede ser amortiguado parcialmente si el uso de esta enzima también reduce la necesidad del suplemento de un segundo nitriente tal como el calcio. El uso de la fitasa en América del Norte es probable que se incremente cuando se incrementen las poblaciones de cerdos y aves de corral y las presiones del público forcen una reducción de la contaminación asociada con la producción de ganado. Los costos más altos de los suplementos del fósforo y la legislación que requiere el uso de la fitasa, han hecho el uso de este suplemento más común en Europa y parte del Oriente que en América del Norte. Los gobiernos de Holanda, Alemania, Corea y Taiwan han promulgado y están promulgando una legislación para reducir la contaminación del fósforo creada por la producción de ganado monogástrico. Un medio más efectivo de incrementar la utilización de la fitasa es a través de la reducción del costo. El costo de la fitasa puede ser reducido por la disminución de los costos de la producción y/o produciendo una enzima con actividad superior. Los avances recientes en la biotecnología pueden revolucionar la industria de las enzimas comerciales ofreciendo métodos efectivos en cuanto al costo, alternativos, de producción de enzimas. La aplicación de la tecnología de ADN recombinante ha hecho posible que los fabricantes incrementen los rendimientos y la eficiencia de la producción de enzimas, y puedan crear nuevos productos. La necesidad de un organismo fuente original ya no limita la producción de las enzimas comerciales. Los genes que codifican las enzimas superiores pueden ser transferidos desde organismos tales como bacterias y hongos anaeróbicos, típicamente no prácticos para la producción comercial, en huéspedes de producción microbiana industrial (por ejemplo, Aspergillus y Bacillus spp.). También estos genes pueden ser transferidos a sistemas de expresión animal y vegetal novedosos. A diferencia de los animales monogástricos, los rumiantes (por ejemplo el ganado vacuno, las ovejas) utilizan fácilmente el fósforo en el ácido fitico. Se ha demostrado que las fitasas están presentes en el estómago, y se ha propuesto que los rumiantes sean criados con dietas elevadas de granos (ricas en fitato) de modo que no requieran un suplemento de fósforo de la dieta debido a estas fitasas ruminales. Un reporte único ha atribuido esta producción de la fitasa a los microorganismos ruminales (Raun et al., 1956), pero sobre todo, la capacidad única de los rumiantes para utilizar el fitato han sido ampliamente ignorada. Raun et al. (1956) preparon suspensiones microbianas por sedimentación centrifuga (Cheng et al., 1955). Estas suspensiones microbianas estuvieron casi siempre contaminadas con partículas microscópicas de material vegetal. Puesto que las plantas producen fitasas, el estudio fue no conclusivo en cuanto a si las fitasas vegetales o fitasas microbianas produjeron la actividad observada. Aunque Raun et al., han elevado la posibilidad de que la producción de la fitasa ru inal pueda ser atribuible a los microorganismos ruminales, esta posibilidad no ha sido explorada. En vista de lo anterior, todavía subsiste una necesidad de fitasas de bajo costo que tengan características muy adecuadas para su uso en suplementos de alimentación de animales.

Breve Descripción de la Invención Los inventores han descubierto que el estómago es una fuente rica de microorganismos los cuales producen fitasas que tienen características bioquímicas (tales como estabilidad con respecto a la temperatura y al pH, sensibilidad baja a los iones metálicos y actividad específica elevada) deseables para aplicaciones industriales tales como suplemento de alimentación animal y producción de inositol. Los microorganismos ruminales toleran las condiciones anaeróbicas y pueden ser anaerobios ya sea facultativos u obligatorios. Los microorganismos ruminales pueden ser procariotas (es decir bacterias) o eucariotas (es decir hongos, protozoarios) . Cuando se utilice aquí, el término "microorganismos ruminales" incluye microorganismos aislados de la digestión o de las heces de un animal rumiante . Las especies bacterianas ruminales las cuales han sido identificadas como las que proporcionan fitasas particularmente activas incluyen Selenomonas ruminantium, Prevotella sp, Treponema Bryantii y Megaphaera elsdenii. Las Prevotella y Selemonas son bastoncitos o vastagos anaeróbicos Gram negativos de la familia Bacteriodácea. De acuerdo con la presente invención, se proporcionan secuencias de ADN que codifican fitasas novedosas y útiles derivadas de los microorganismos ruminales. Un gen de fitasa (phyA) de la cepa JY35 de Selenomonas ruminantium ha sido clonado y secuenciado, y se proporciona la secuencia de nucleótidos del gen phyA. La invención se extiende a las secuencias de ADN las cuales codifican las fitasas y las cuales son capaces de hibridación baje condiciones estrictas con la secuencia del gen de phyA. Cuando se utilice aquí, "capaz de hibridación bajo condiciones estrictas" significa el templado hasta una secuencia de nucleótidos objeto, o su cepa complementaria, bajo condiciones estándares (es decir temperatura elevada y/o con un contenido bajo de la sal) las cuales tienden a desfavorecer el templado de las secuencias no relacionadas. Cuando se utilice aquí, "condiciones poco estrictas" significan hibridación y condiciones de lavado de 40 - 50 °C, 6 X SSC y 0.1 % SDS (indicando aproximadamente 50 - 80 % de homología). Cuando se utilicen aquí, "condiciones estrictas intermedias" significan hibridación y condiciones de lavado de 50 - 65 °C, 1 X SSC y 0.1 % SDS (indicando aproximadamente 80-95 % de homología) . Cuando se utilice aquí, "condiciones estrictas altas" significan hibridación y condiciones de lavado de 65 - 68 °C, 0.1 X SSC y 0.1 % de SDS (indicando aproximadamente 95-100% de homología) . Cuando se utilice aquí, el término "fitasa" significa una enzima capaz de catalizar la remoción del fósforo inorgánico a partir de un fosfato de mioinositol . Cuando se utilice aquí, el término "fosfato de mio-inositol" incluye, sin limitación, hexafosfato de mioinositol, pentafosfato de mioinositol, tetrafosfato de mio-inositol, trifosfato de mio-inositol, difosfato de mio-inositol y monofosfato de mio-inositol. Cuando se utilice aquí, "fitato" significa la sal del ácido mio-inositol hexafosfórico. La invención se extiende al propio organismo de S. ruminantium JY35 (ATCC 55785), y a los métodos para identificar y aislar este y otros microorganismos ruminales que exhiben la actividad de la fitasa así como a métodos para aislar, clonar y expresar los genes de fitasa de los microorganismos ruminales que exhiben la actividad de la fitasa utilizando una parte o la totalidad de la secuencia del gen phyA como una sonda. La invención se extiende además a métodos para evaluar la producción de fitasa por un microoorganismo, por lo cual los resultados positivos falsos provocados por la producción del ácido microbiano son eliminados. Las colonias de los microorganismos se hacen crecer sobre un medio de crecimiento que contiene el fitato. El medio se pone en contacto con una solución acuosa de cloruro de cobalto y el medio es examinado entonces para detectar zonas de aclaramiento. Preferentemente, en lugar de examinar el medio inmediatamente, la solución de cloruro de cobalto es removida y el medio se pone en contacto con soluciones acuosas de molibdato de amonio y vanadato de amonio y luego es examinada para detectar zonas de aclaramiento. Los resultados positivos falsos que ocurren cuando los microbios formadores de ácido producen zonas de aclaramiento, son evitados. La invención se extiende a construcciones de expresión que constituyen un ADN que codifica una fitasa de la presente invención unida o enlazada operativamente a las secuencias de control capaces de dirigir la expresión de la fitasa en una célula huésped adecuada. La invención se extiende además a células huésped las cuales han sido transformadas con, y expresan, el ADN que codifica una fitasa de la presente invención, y a métodos de producción de tales células huéspedes transformadas. Cuando se utilice aquí, "célula huésped" incluye células huésped animales, vegetales, de levadura, de hongos, de protozoarios y procarióticas. La invención se extiende además a plantas transfénicas las cuales han sido transformadas con un ADN que codifica una fitasa de la presente invención de modo que la planta transformada es capaz de expresar la fitasa y a los métodos de producción de tales plantas transformadas. Cuando se utilice aquí, "planta transgénica" incluye plantas, tejidos y células transgénicas . Las fitasas de la presente invención son útiles en una amplia variedad de aplicaciones que involucran la desfosforilación del fitato. Tales aplicaciones incluyen el uso en suplementos de alimentación animal, el acondicionamiento de productos alimenticios, la nutrición humana, y la producción de inositol a partir del ácido fítico. Las fitasas de la presente invención también pueden ser utilizadas para minimizar los efectos adversos de la quelación del metal-fitato. El alto contenido de fitato de ciertos productos alimenticios tales como la harina de soya disminuye su valor como fuentes proteínicas para peces, animales monogástricos, rumiantes jóvenes e infantes a causa de que el fitato reduce la biodisponibilidad de los nutrientes quelando los minerales, y uniendo o aglutinando los aminoácidos y las proteínas. El tratamiento de tales productos alimenticios con las fitasas de la presente invención reducirá su contenido de fitato por la desfosforilación mediada por la fitasa, haciendo a los productos alimenticios más adecuados para su uso como fuentes proteínícas. En consecuencia, la invención se extiende a nuevas composiciones alimenticias que comprenden los productos alimenticios tratados con una fitasa de la presente invención, y aditivos alimenticios que contienen una fitasa de la presente invención. Tales composiciones y aditivos alimenticios también pueden contener otras enzimas, tales como, proteasas, celulasas, xilanasas y fosfatasas acidas. La fitasa puede ser agregada directamente a una producto alimenticio no tratado, convertido en microesferas, o procesado de otra manera, o puede ser provisto separadamente del producto alimenticio, por ejemplo, en un bloque mineral, una pildora, una formulación de gel, una formulación líquida, o en el agua para beber. La invención se extiende a preparaciones inoculantes alimenticias que comprenden microorganismos liofilizados los cuales expresan las fitasas de la presente invención bajo condiciones de crecimiento normales. Con respecto a estas preparaciones inoculantes alimenticias, las "condiciones de crecimiento normales" significan condiciones del cultivo previo a la recolección y liofilización de los microorganismos. Los microorganismos expresan las fitasas durante el crecimiento de los cultivos microbianos en fermentadores a gran escala. La actividad de las fitasas en los microorganismos es preservada por la liofilización de los concentrados microbianos recolectados que contienen la fitasa. La invención se extiende además a un método para mejorar la utilización del fosfato de la dieta de los animales alimentando al animal una cantidad efectiva de una fitasa de la presente invención. Cuando se utilice aquí "una cantidad efectiva" de una fitasa significa una cantidad la cual conduce a una mejora estadísticamente significativa en la utilización del fósforo por el animal. La utilización del fósforo del fitato puede ser evidenciada, por ejemplo, por el crecimiento mejorado del animal y los niveles reducidos del fitato en el estiércol del animal.

Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 es una fotografía que muestra el efecto de contrateñir el medio de agar que contiene el fitato sobre las zonas de aclaramiento producidas por la producción del ácido o la actividad de la fitasa. El agar de fitato se inoculó con S. Bovis (parte de arriba de la caja de petri izquierda) y S. Ruminantium JY35 (parte inferior de la caja de petri izquierda) y se incuba durante 5 días a 37 °C. Las colonias fueron retiradas por raspado y el medio se contratiñó con soluciones de cloruro de cobalto y de molibdato de amonio/vanadato de amonio (caja de petri derecha) . La Figura 2 es una gráfica que ilustra el crecimiento (proteína) y la producción de fitasa de S. Ruminantium JY35 en un caldo de Scott y Dehority (1965) modificado.

Las Figuras 3A, 3B y C muestran las micrografías electrónicas de transmisión de las células de un cultivo de fase semiexponencial del S. ruminantium JY35 incubado para la deposición del producto de la reacción por la fitasa utilizando fitato de sodio como el substrato. Las células de control no tratadas son mostradas para comparación en las Figuras 3D, 3E y 3F. La Figura 4 es una gráfica que ilustra el perfil del pH de la fitasa para las células de S. ruminantium JY35 lavadas en cinco soluciones amortiguadoras diferentes. La Figura 5 es una gráfica que ilustra el perfil del pH del extracto celular de MgCl2 del S. ruminantium JY35 en cinco soluciones amortiguadoras diferentes. La Figura 6 es una gráfica que ilustra el perfil de temperatura del extracto celular de MgCl2 de S. ruminantium JY35. La Figura 7 es una gráfica que ilustra el efecto de los iones (10 mM) sobre la actividad de la fitasa del S. ruminantium JY35 (Ctr = control) . La Figura 8 es una gráfica que ilustra el efecto de la concentración del fitato de sodio sobre la actividad de la fitasa del S. ruminantium JY35.

La Figura 9 es un zimograma desarrollado para la confirmación de la actividad de la fitasa. Los concentrados (10 x) del extracto de MgCl2 del S. ruminantium JY35 (bandas B - E) , marcadores de peso molecular bajo (banda F, BioRad Laboratories Canadá Ltd, Mississauga, Ontario) y la fitasa de A. ficuum (Sigma, 1.6 U, banda A) fueron resueltas por SDS-PAGE en un gel de poliacrilamida al 10%. Las bandas A a E fueron teñidas para verificar la actividad de la fitasa y la banda F se tiñó con el azul brillante de Coomassie. La Figura 10 es una fotografía de un ensayo de placa de hidrólisis del fitato para verificar las actividades de la fitasa del E. coli DH5a transformado con pSrP.2 (parte de arriba), pSrP.2?SphI (parte inferior izquierda) , y pSrPf6 (parte inferior derecha) . Las zonas de aclaramiento fueron visibles después de incubar las placas a 37 °C durante 48 horas. La Figura 11 es un análisis de manchado de Southern utilizando el fragmento de 2.7- b del pSrP.2 como una sonda contra el ADN de pSrP.2 digerido con Sphl (banda B) y el ADN digerido con HindIII aislado del S. ruminantium JY35 (banda C) . El ADN Lambda digerido con HindIII etiquetado con digoxigenina se hizo funcionar como un estándar de peso molecular en la banda A.

La Figura 12 es un mapa físico del pSrP.2. Un fragmento de 2.7-kb, de una digestión parcial de Sau3A del ADN genómico de S. ruminatium JY35, se clonó en el sitio BamHI de pUC18. Este fragmento contiene el gen completo que codifica la fitasa del S. ruminatium JY35. La localización del sitio BamHI perdido como un resultado de la ligación o unión, está indicada en corchetes cuadrados . La Figura 13 es una representación esquemática del análisis de deleción del gen de fitasa de S. ruminatium. La posición de phyA está indicada por la flecha horizontal. Los recuadros sombreados o con rayas indican los segmentos del fragmento de Sau3A de 2.7-kb llevados por diferentes derivados del plásmido. La actividad de la fitasa está indicada en el panel a la derecha. La Figura 14 es un zimograma desarrollado para la actividad de la fitasa. Las células DH5a de E. coli (pSrP.2) (banda A), las células DH5a de E. coli (pSrP.2?SphI) (banda B) , y los marcadores de peso molecular bajo (banda C, BioRad laboratoríes) fueron resueltos por SDA-PAGE en un gel de poliacrilamida al 10%. Las bandas A y B fueron teñidas para la actividad de la fitasa y la banda C se tiñó con el azul brillante de Coomassie.

La Figura 15 es la secuencia de nucleótidos del gen de la fitasa de S. Ruminantium JY35 (phyA) (SEQ ID No. 1) y su secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID No. 2) . El nucleótido 1 corresponde a nt 1232 del inserto de 2.7-kb de pSrP.2. El sitio de unión del ribosoma putativo está subrayado y se muestra arriba de la secuencia como R.B.S. El sitio de escisión de la peptidasa de la señal, predicho por el método de von Heijne (1986) está indicado por la ¡ . La secuencia de aminoácidos N-terminal de la fitasa secretada por el E. coli (pSrPf6) está subrayada.

Descripción Detallada de la Modalidad Preferida El estómago es un ecosistema complejo habitado por más de 300 especies de bacterias, hongos y protozoarios. La selección de estos organismos para la actividad de la fitasa requiere la capacidad de discriminar la actividad de la fitasa de las substancias aisladas individuales. Esto puede ser efectuado a través de la evaluación de los cultivos puros de una colección de cultivo en almacenamiento o la separación y el cultivo de células individuales a través de técnicas de cultivo (por ejemplo, placa de marcado con rayas, dilución y micromanipulación) . Las técnicas anaeróbicas, asépticas, estándares, descritas para las bacterias, los hongos y los protozoarios pueden ser utilizadas para llevar a cabo este objetivo. Los ensayos de enzimas adecuados son necesarios para seleccionar substancias aisladas microbianas en las muestras de fluido ruminal y a partir de las colecciones del cultivo, y para clonar los genes de la fitasa. Los ensayos para medir la actividad de la fitasa en las soluciones han sido descritos en la literatura. Las soluciones de las muestras son evaluadas típicamente para verificar la actividad de la fitasa midiendo la liberación del fósforo inorgánico (Pi) del ácido fítico (Raun et al., 1956; van Hartgsveldt, 1993). La actividad de la fitasa también puede ser detectada sobre un medio sólido. Los microorganismos que expresan la fitasa producen zonas de aclaramiento sobre el medio de agar que contiene el fitato de sodio o de calcio (Shie y Ware, 1968; Howson y Davis, 1983) . Sin embargo, los ensayos del medio sólido descritos en la literatura se encontró que no van a ser satisfactorios para la selección de bacterias ruminales para verificar la actividad de la fitasa a causa de las reacciones positivas falsas de las bacterias que producen ácido tales como el Streptococcus bovis. Para superar este problema, se desarrolló un procedimiento de contrateñido de dos pasos en el cual las cajas de petri que contienen el medio sólido son inundadas primero con una solución de cloruro de cobalto acuosa y en segundo lugar con una solución de vanadato de amonio/molibdato de amonio acuosa. Siguiendo este tratamiento solamente son evidentes las zonas de aclaramiento producidas por la actividad de la enzima (Figura 1) . Utilizando las soluciones anteriores y los ensayos del medio sólido, 345 substancias aisladas de la colección de cultivos de Lethbridge Research Centre (Lethbridge, Alberta, Canadá) fueron aisladas para verificar la actividad de la fitasa (Tabla 1) . Un total de 29 cultivos con una actividad de fitasa substancial fueron identificados, incluyendo 24 del género Selemonas y 5 del género Prevotella. Doce de estos cultivos (11 substancias aisladas de Selenomonas y 1 substancia aislada de Prevotella) tuvieron actividades de fitasa substancialmente más elevadas que los otros cultivos positivos (Tabla 2) . La fitasa de S. ruminantium JY35 (depositada el 24 de mayo de 1996 en el American Type Culture Collection, 12301 Parkla n Drive, Rockville, Maryland, 20852-1776, como ATCC 55785) se seleccionó para examen adicional y se comparó con una fitasa comercial (Gist-brocades nv, Delft, Holanda) a partir de Aspergillus ficuum NRRL 3135 (van Gorcum et al., 1991 y 1995). La fitasa del S. ruminantium JY35 (ATCC 55785) está expresada constitutivamente, exportada desde la célula y asociada con la superficie celular. Los perfiles del pH (Figura 5) y de la temperatura (Figura 6) de la fitasa del S. ruminantium JY35 (ATCC 55785) fueron comparables, si no es que más adecuadas para la producción industrial, de lo que lo son aquellas de la fitasa de A. ficuum NRRL 3135 comercial. Estos resultados demostraron el potencial de los microbios ruminales y anaeróbicos como fuentes de fitasas con características superiores a las fitasas que son producidas comúnmente por la industria. Los genes microbianos que codifican las enzimas seleccionadas pueden ser clonados por una variedad de métodos. Las bibliotecas del gen (ADN genómico y/o ADNc) son construidas por métodos estándares (Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1990) y seleccionadas para el gen deseado. La metodología de selección puede utilizar sondas heterólogas, la actividad de la enzima o los resultados generados durante la purificación del producto de gen, tales como los datos de la secuencia de aminoácidos N-terminal e interna y anticuerpos. Utilizando el ensayo de fitasa de medio sólido desarrollado para detectar la actividad de la fitasa producida por microbios ruminales, se seleccionó una biblioteca del gen de S. ruminantium JY35 (ATCC 55785) para los clones positivos. De 6000 colonias examinadas, una sola colonia fue identificada como un clon positivo de la fitasa por una zona grande de aclaramiento alrededor de la colonia. Este clon llevó un plásmido de 5.5-kb que comprende el fragmento de ADN de Sau3A de 2.7-kb insertado en el vector de clonación pUC18. El fragmento de ADN de Sau3A de 2.7-kb aislado recientemente se utilizó como una sonda en las hibridaciones de manchado de Southern. Bajo condiciones estrictas elevadas, una banda discreta podría ser detectada para la substancia aislada de S. ruminantium JY35 (ATCC 55785), pero no para Prevotella sp. 46/52, E. coli DH5a o A. ficuum NRRL 3135. El ADN del plásmido aislado del clon aislado recientemente e introducido en las células de E. coli por transformación produjo CFUs positivos a la fitasa, resistentes a la ampicilina. El análisis del zimograma de los extractos celulares de las células de E. coli DH5a que llevan el fragmento de ADN de Sau3A de 2.7-kb del de S. ruminantium JY35 (ATCC 55785) revelaron una banda de actividad única con una masa molecular estimada de 37 kDa. Los análisis de deleción y de la secuencia de ADN fueron utilizados para identificar el gen (phyA) el cual codificó la fitasa responsable de la actividad observada en los clones de E. coli recombinantes. La secuencia de aminoácidos N-terminal de la fitasa de 37-kDa purificada expresada en las células de E. coli que llevan phyA correspondieron con la secuencia de aminoácidos N-terminal de la fitasa madura predicha a partir de la secuencia de phyA clonada. Esto indicó conclusivamente que la secuencia de nucleótidos que codifica la fitasa ha sido aislada. La secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos deducida son mostradas en la Figura 15. Como con otros genes, es posible utilizar la secuencia de codificación de la fitasa caracterizada en una variedad de sistemas de expresión para la producción de enzimas comerciales. La aplicación de la tecnología del ADN recombinante ha hecho posible que los fabricantes de las enzimas incrementen el volumen y la eficiencia de la producción de las enzimas, y creen nuevos productos. La necesidad del organismo fuente original ya no limita la producción de enzimas comerciales. Los genes que codifican las enzimas superiores pueden ser transferidos desde organismos tales como bacterias y hongos anaeróbicos, típicamente imprácticos para la producción comercial, en huéspedes de producción microbiana industriales bien caracterizados (por ejemplo, Aspergillus, Pichia, Trichoderma, Bacillus spp.). También, estos genes pueden ser transferidos a sistemas de expresión de plantas y de animales, novedosos.

Las cepas industriales de microorganismos (por ejemplo, Aspergillus niger, Aspergillus ficuum, Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Mucor miehie, Kluyveromyces lactis, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli, Bacillus subtilis o Bacillus licheniformis) o huéspedes vegetales (por ejemplo, cañóla, soya, maíz, papa) pueden ser utilizados para producir la fitasa. Todos los sistemas emplean un enfoque similar para la expresión del gen. Una construcción de la expresión es conjuntada para incluir la secuencia de codificación de la proteína de interés y para controlar las secuencias tales como promotores, mejoradores y terminadores. Otras secuencias tales como las secuencias de la señal y los marcadores seleccionables también pueden ser incluidas. Para lograr la expresión extracelular de la fitasa, la construcción de la expresión de la presente invención utiliza una secuencia de la señal secretoria. La secuencia de la señal no está incluida en la construcción de la expresión si se desea la expresión citoplásmica. La secuencia de la señal y el promotor son funcionales en la célula huésped y proveen la expresión y secreción del producto de la secuencia de codificación. Los terminadores transcripcionales son incluidos para asegurar una transcripción eficiente. Las secuencias antiguas o primitivas que mejoran la expresión o purificación de la proteína también pueden ser incluidas en la construcción de la expresión. Las secuencias que codifican la proteína para verificar la actividad de la fitasa son obtenidas de las fuentes microbianas ruminales . Este \DN puede ser homólogo o heterólogo para el huésped de la expresión. El ADN homólogo está definido aquí como el ADN que se origina de las mismas especies. Por ejemplo, el de S. ruminantium puede ser transformado con el ADN del S. ruminantium para mejorar las propiedades existentes sin introducir propiedades que no existen previamente en las especies. El ADN heterólogo está definido como el ADN que se origina de una especie diferente. Por ejemplo, el S. ruminantium phyA puede ser clonado y expresado en E. coli. Se sabe bien en las técnicas biológicas que ciertas substituciones de aminoácidos se pueden hacer en secuencias de proteína sin afectar la función de la proteína. En general, las substituciones de aminoácidos conservativos son toleradas sin afectar la función de la proteína. Los aminoácidos similares pueden ser aquellos que son similares en el tamaño y/o las propiedades de la carga, por ejemplo, el aspartato y el glutamato y la isoleucina y la valina son ambos pares de aminoácidos similares. La similaridad entre los pares de aminoácidos ha sido evaluada en la técnica de varias maneras. Por ejemplo, Dayhoff et al. (1978) en Atlas of protein Sequence and Structure, Volumen 5, Suplemento 3, Capítulo 22, páginas 345-352, el cual es incorporado para referencia aquí, proporciona tablas de frecuencia para las substituciones de aminoácidos las cuales pueden ser empleadas como una medida de similaridad de los aminoácidos. Las tablas de frecuencia de Dayoff et al., están basadas en comparaciones de las secuencias de aminoácidos con las proteínas que tienen la misma función, a partir de una variedad de diferentes fuentes evolucionarías . También se sabe bien que frecuentemente menos de una proteína de longitud total tiene la función de la proteína completa, por ejemplo, una proteína truncada que carece de una proteína interna, N-terminal, o una proteína C-terminal frecuentemente tiene la actividad biológica y/o enzimática de la proteína natural completa. Los experimentos de corte del gen que incolucran el phyA han confirmado que la proteína truncada puede retener la función de la proteína intacta. Los clones de Escherichia coli que expresan los aminoácidos 1-37 o 1058 N-terminales que omitan la PhyA (SEQ ID No. 2) mostraron fenotipos positivos de fitasa. En contraste, no se pudo detectar ninguna actividad de fitasa para un clon que expresa los aminoácidos 307-346 que omiten PhyA (SEQ ID No. 2) . Aquellas personas con experiencia ordinaria en la técnica saben como hacer la proteína truncada y las proteínas con deleciones internas. En la presente invención, la función de una proteína de fitasa truncada o una proteína de fitasa delecionada internamente puede ser probada fácilmente utilizando el ensayo descrito aquí posteriormente y un punto de vista de lo que es conocido generalmente en la técnica. Los derivados de fitasa ruminales truncados y delecionados internamente, substituidos, los cuales retienen substancialmente la misma actividad enzimática como una fitasa descrita específicamente aquí, se consideran equivalentes de la fitasa ejemplificada y están dentro del alcance de la presente invención, particularmente en donde la actividad específica del derivado de fitasa truncada o delecionada internamente, substituida, sea de al menos aproximadamente 10% de la fitasa ejemplificada específicamente. El artesano experto puede medir fácilmente la actividad de una fitasa ruminal, la fitasa truncada, la fitasa delecionada internamente o la fitasa substituida utilizando los procedimientos de evaluación enseñados aquí y en vista de aquellos que es conocido generalmente en la técnica.

Esta invención incluye fitasas variantes estructuralmente derivadas de una fitasa de microorganismos ruminales, particularmente aquellos derivados de una fitasa descrita específicamente aquí, que son substancialmente equivalentes funcionalmente a aquella fitasa que se evaluó, como se describió aquí en vista de lo que es conocido generalmente en la técnica. Los equivalentes funcionales, variantes estructuralmente de las fitasas de esta invención, incluyen aquellas fitasas de los microorganismos ruminales que tienen una secuencia de aminoácidos contigua como en la secuencia de aminoácidos de la fitasa descrita aquí (SEQ ID No. 2), particularmente aquellas fitasas variantes las cuales tienen una secuencia de aminoácidos contigua de una fitasa de un microorganismo ruminal que es una secuencia contigua de al menos aproximadamente 25 aminoácidos de longitud. La presente invención también proporciona el material de partida para la construcción de fitasas con propiedades que difieren de aquellas de las enzimas aisladas aquí. Los genes pueden ser mutados fácilmente por procedimientos conocidos (por ejemplo, mutagénesis química, dirigida al sitio, la mutagénesis de la reacción en cadena de la polimerasa al azar) por lo cual se crean productos del gen con propiedades alteradas (por ejemplo, actividad específica o especificidad del substrato óptimas en cuanto a la temperatura y el pH) . Varios promotores (región reguladora de la iniciación transcripcional) pueden ser utilizados de acuerdo con la presente invención. La selección del promotor apropiado depende del huésped de expresión propuesto. Las selecciones de los promotores pueden incluir el promotor asociado con la secuencia de codificación de la proteína clonada o los promotores de las fuentes heterólogas ya que los mismos son funcionales en el huésped elegido. Los ejemplos de los promotores heterólogos son los promotores de tac y tre del E. coli (Brosius et al., 1985), el promotor sacB de Bacillus subtilis y la secuencia de la señal (Wong, 1989), aoxl y aox2 de Pichia pastoris (Ellis et al., 1985), y el promotor específico de la semilla de oleosina de Brassica napus o Arabidopsis thaliana (van Rooijen y Moloney, 1994) . La selección del promotor también depende de la eficiencia y del nivel deseado de producción del péptido o de la proteína. Los promotores inducibles tales como tac y aoxl son empleados frecuentemente para incrementar notablemente el nivel de expresión de la proteína. La sobre-expresión de las proteínas puede ser perjudicial para las células huésped. En consecuencia, el crecimiento de las células huésped puede ser limitado. El uso de sistemas promotores inducibles permite que las células huésped sean cultivadas a densidades aceptables previo a la inducción de la expresión del gen, por lo cual facilitan rendimientos más elevados del producto. Si la secuencia que codifica la proteína va a ser integrada a través de un evento de reemplazo del gen (inserción omega) en un sitio de blanco u objetivo, entonces la selección del promotor también puede estar influida por el grado de homología con respecto al promotor del sitio de blanco u objetivo. Varias secuencias de la señal pueden ser utilizadas de acuerdo con la presente invención. Una secuencia de la señal la cual es homologa con respecto a la secuencia de codificación de la proteína que va a ser expresada, puede ser utilizada. Alternativamente, una secuencia de la señal la cual ha sido seleccionada o diseñada para una secreción mejorada en el huésped de la expresión, también puede ser utilizada. Por ejemplo, la secuencia de la señal de sacB de B. subtilis para la secreción en B. subtilis, el factor de correspondencia a de Saccharomyces cerevisiae o las secuencias de la señal phol de la fosfatasa acida de P. pastoris para la secreción de P. pastoris, pueden ser utilizadas. Una secuencia de la señal con un grado elevado de homología con respecto al sitio de blanco u objetivo puede ser requerida si la secuencia que codifica la proteína va a ser integrada a través de un evento de inserción omega. La secuencia de la señal puede ser unida directamente a través de la secuencia que codifica el sitio de desdoblamiento de la peptidasa de la señal con respecto a la secuencia de codificación de la proteína, o a través de un puente de nucleótido breve que consiste usualmente de poco menos de diez codones. Los elementos para mejorar la transcripción de la expresión (actividad del promotor) y la translación, han sido identificados para los sistemas de expresión de la proteína eucariótica. Por ejemplo, la colocación del promotor del virus de mosaico de coliflor (CaMV) de 1000 pb sobre cualquier lado de un promotor heterólogo puede elevar los niveles transcripcionales en 10 a 400 veces. La construcción de la expresión también debe incluir las secuencias de iniciación translacionales apropiadas. La modificación de la construcción de la expresión para incluir la secuencia del consenso de Kozak para la iniciación de la tranlación apropiada puede incrementar el nivel de la translación en 10 veces. Los elementos para mejorar la purificación de la proteína también pueden ser incluidos en la construcción de la expresión. El producto de las fusiones del gen de oleosina es una proteína híbrida que contiene el gen de oleosina unido al producto del gen de interés. La proteína de fusión retiene las propiedades lipofílicas de las oleosinas y es incorporada en las membranas del cuerpo aceitoso (van Rooijen y Moloney, 1994) . La asociación con los cuerpos aceitosos puede ser explotada para facilitar la purificación de las proteínas de fusión de oleosina recombinantes (van Rooijen y Moloney, 1994) . Un marcador de la selección es empleado usualmente, el cual puede ser parte de la construcción de la expresión o separado de él (por ejemplo, llevado por el vector de la expresión) , de modo que el marcador puede integrarse en un sitio diferente del gen de interés. La transformación de las células huésped con las moléculas de ADN recombinantes de la invención es verificada por medio del uso de marcadores seleccionables. Los ejemplos de estos marcadores que confieren resistencia a los antibióticos (por ejemplo, bla confiere resistencia a la ampicilina para las células huésped del E. coli, nptll confiere resistencia a la kanamicina a las células de B. napus) o que permiten al huésped crecer sobre un medio mínimo (por ejemplo, HIS4 hace posible que P. pastoris GS115 His crezca en la ausencia de histidina) . El marcador seleccionable tendrá sus propias regiones reguladoras de iniciación y de terminación transcripcionales y translacionales para permitir la expresión independiente del marcador. En donde la resistencia antibiótica es empleada como un marcador, la concentración del antibiótico para la selección variará dependiendo del antibiótico, variando generalmente desde 10 hasta 600 µg del antibiótico/ml del medio. La construcción de la expresión es conjuntada empleando técnicas de ADN recombinantes conocidas. La digestión y ligación o unión de la enzima de restricción son los pasos básicos empleados para unir dos fragmentos de ADN. Los extremos del fragmento de ADN pueden requerir a modificación previo a la ligación o unión y esto puede ser efectuado por llenado en colgaduras, por deleción de las porciones terminales de los fragmentos con nucleasas (por ejemplo, ExoIII), mutagénesis dirigida al sitio, y adición de nuevos pares base por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) . Los polienlazadores y los adaptadores pueden ser empleados para facilitar la unión de los fragmentos seleccionados. La construcción de la expresión es conjuntada o ensamblada típicamente en etapas que emplean rondas de restricción, ligación y transformación del E. coli. Existen numerosos vectores de clonación disponibles para la construcción de la construcción de la expresión y la elección particular no es crítica para esta invención. La selección del vector de clonación estará influida por el sistema de transferencia del gen seleccionado para la introducción de la construcción de la expresión en la célula huésped. Al final de cada etapa, la construcción resultante puede ser analizada por análisis de restricción, de la secuencia de ADN, de hibridación y de PCR. La construcción de la expresión puede ser transformada en el huésped como la construcción del vector de clonación, ya sea lineal o circular, o puede ser removido del vector de clonación y utilizado como es o introducido sobre un vector de suministro. El vector de suministro facilita la introducción y el mantenimiento de la construcción de la expresión en el tipo de célula huésped seleccionada. La construcción de la expresión es introducida en las células huésped empleando cualquiera de varios de los sistemas de transferencia del gen (por ejemplo, competencia natural, transformación mediada químicamente, transformación de los protoplastos, electroporación, transformación biolística, transfección, o conjugación) . El sistema de transferencia del gen seleccionado depende de las células huésped y de los sistemas del vector utilizados. Por ejemplo, la construcción de la expresión puede ser introducida en las células de P. pastoris por la transformación de los protoplastos o electroporación. La electroporación de P. pastoris es efectuada fácilmente y da eficiencias de transformación comparables con la transformación de los esferoplastos. Las células de P. pastoris son lavadas con agua estéril y resuspendidas en una solución de conductividad baja (por ejemplo, una solución de sorbitol 1M) . Un choque de alto voltaje aplicado a la suspensión celular crea poros temporales en la membrana celular a través de los cuales el ADN transformante (por ejemplo, la construcción de la expresión) se introduce a las células. La construcción de la expresión es mantenida establemente por integración, a través de la recombinación homologa, en el sitio aoxl (alcohol oxidasa) . Alternativamente, una construcción de la expresión, que comprende el promotor de sacB y la secuencia de la señal enlazada operativamente con la secuencia de codificación de la proteína, es llevada sobre pUBllO, un plásmido capaz de replicarse autónomamente en las células de B. subtilis. La construcción del plásmido resultante es introducida en las células de B. subtilis por transformación. Las células de Bacillus subtilis desarrollan una competencia natural cuando crecen bajo condiciones de nutrientes pobres. En un tercer ejemplo, las células de Brassica napus son transformadas por la transformación mediada por Agrobacterium. La construcción de la expresión es insertada sobre un vector binario capaz de replicación en A. tumefaciens y la movilización en las células de la planta. La construcción resultante es transformada en las células de A. tumefaciens que llevan un Ti atenuado o "plásmido auxiliador". Cuando los discos de las hojas son infectados con las células de A. tumefaciens, la construcción de la expresión es transferida hacia las células de las hojas de B. napus por la movilización conjugal del vector binario: : construcción de la expresión. La construcción de la expresión se integra al azar en el genoma de la célula vegetal. Las células huésped que llevan la construcción de la expresión (es decir, las células transformadas), son identificadas por medio del uso del marcador seleccionable llevado por la construcción o el vector de la expresión y la presencia del gen de interés confirmado por una variedad de técnicas que incluyen la hibridación, PCR, y anticuerpos. Las células microbianas transformantes se pueden hacer crecer por una variedad de técnicas que incluyen la fermentación continua y por lotes sobre un medio líquido o semisólido. Las células transformadas son propagadas bajo condiciones optimizadas para relaciones máximas del producto en cuanto al costo. Los rendimientos del producto pueden ser incrementados dramáticamente por la manipulación de los parámetros de cultivo tales como la temperatura, el pH, la ventilación, y la composición del medio. La manipulación cuidadosa y la verificación de las condiciones de crecimiento para las células de E. coli de hiper-expresión recombinante puede conducir a rendimientos de la proteína y la biomasa del cultivo de 150 g (peso húmedo) de las células/1 y 5 g de la proteína insoluble/1, respectivamente. Las concentraciones bajas de un inhibidor de proteasa (por ejemplo, fluoruro de fenilmetilsulfonilo o pepstatina) pueden ser empladas pe *a reducir la proteólisis del péptido o proteína sobre-expresada. Alternativamente, las células huésped deficientes en proteasa pueden ser empleadas para reducir o eliminar la degradación de la proteína deseada. Después del examen y selección, las células vegetales transformadas pueden ser regeneradas en las plantas completas y las líneas de distinta variedad de las plantas transgénicas son desarrolladas y cultivadas utilizando métodos conocidos. Cuando se utilice aquí, "planta transgénica" incluye plantas transgénicas, tejidos vegetales y células vegetales. A continuación de la fermentación, las células microbianas pueden ser removidas del medio a través de procesos corriente abajo tales como la centrifugación y la filtración. Si el producto deseado es secretado, el mismo puede ser extraído del medio nutriente. En el caso de la producción intracelular, las células son colectadas y el producto liberado por la ruptura de las células a través de la aplicación de fuerzas mecánicas, ultrasonido, enzimas, substancias químicas y/o presión elevada. La producción de un producto insoluble, tal como ocurre en la hiper-expresión de sistemas de E. coli, puede ser utilizada para facilitar la purificación del producto. Las inclusiones de productos pueden ser extraídas de las células dañadas por centrifugación y las proteínas contaminantes pueden ser removidas por lavado con una solución amortiguadora que contiene concentraciones bajas de un desnaturalizante (por ejemplo, urea 0.5 a 6 M, dodecil sulfato de sodio de 0.1 a 1 % o guanidina-HCl 0.5 a 4.0 M) . Las inclusiones lavadas pueden ser solubilizadas en soluciones que contienen urea 6 a 8 M, dodecil sulfato de sodio del 1 al 2 % o guanidina-HCl de 4 a 6 M. El producto solubilizado puede ser renaturalizado removiendo lentamente los agentes desnaturalizantes durante la diálisis. La fitasa puede ser extraída de las porciones colectadas o las plantas completas por molienda, homogeneización, y/o tratamiento químico. El uso de fusiones de oleosina lipofílicas específicas de la semilla puede facilitar la purificación por la partición de la proteína de fusión de la oleosina en la fracción del aceite de las semillas de cañóla trituradas, aparte de las proteínas acuosas (van Rooijen y Moloney, 1994) . Si es necesario, se pueden emplear varios métodos de purificación del producto, a partir de extractos microbianos, de fermentación y vegetales. Estos incluyen la precipitación (por ejemplo, la precipitación con sulfato de amonio), la cromatografía (filtración de gel, intercambio iónico, la cromatografía líquida de afinidad) , la ultrafiltración, la electrofóresis, la extracción de solvente-solvente (por ejemplo, precipitación con acetona) , las combinaciones de las mismas, o semejantes. La totalidad o una porción de los cultivos microbianos y las plantas puede ser utilizado directamente en aplicaciones que requieren la acción de la fitasa. Varias formulaciones de las preparaciones de fitasa crudas o purificadas también pueden ser preparadas. Las enzimas pueden ser estabilizadas por medio de la adición de otras proteínas (por ejemplo, gelatina, polvo de leche desnatada) y agentes químicos (por ejemplo, glicerol, polietilenglicol, agentes reductores y aldehidos) . Las suspensiones de la enzima pueden ser concentradas (por ejemplo, la filtración de flujo tangencial) o secadas (por rociado y por secado en un tambor, liofilización) y formuladas como líquidos, polvos, granulos, pildoras, bloques minerales y geles por medio de procesos conocidos. Los agentes de gelificación tales como la gelatina, el alginato, el colágeno, el agar, la pectina y carragahen pueden ser utilizados. Además, la desfosforilación completa del fitato no puede ser lograda por la fitasa sola. Las fitasas no pueden desfosforilar los fosfatos de mio-inositol inferiores. Por ejemplo, una fitasa de A. ficuum descrita en la Patente U.S. No. 5,536,156 (van Gorcum et al., expedida el 25 de julio de 1995) exhibe una actividad baja de la fosfatasa o niguna actividad contra el difosfato de mio-inositol o el monofosfato de mio-inositol. La adición de otra fosfatasa, tal como una fostasa acida, a un aditivo alimenticio de la presente invención que contiene la fitasa, ayudará a desfosforilar el difosfato de mio-inositol y el monofosfato de mioinositol. Las formulaciones del producto deseado pueden ser utilizadas directamente en aplicaciones que requieren la acción de una fitasa. Los concentrados líquidos, los polvos y los granulos pueden ser agregados directamente a las mezclas de la reacción, las fermentaciones, los granos remojados, y los desechos de la molienda. La fitasa formulada puede ser administrada a los animales en el agua para beber, en un bloque mineral, como una sal, o como un suplemento pulverizado que va a ser rociado sobre o convertido en microesferas con otros productos alimenticios a través de procesos conocidos. Alternativamente, un gen de fitasa con una secuencia mejoradora del promotor, adecuada, puede ser integrada en un genoma animal y expresado selectivamente en un órgano o tejido (por ejemplo, las glándulas salivales, el páncreas o las células epiteliales) las cuales secretan la enzima de fitasa en el tracto gastrointestinal, por lo cual se elimina la necesidad de la adición de la fitasa suplementaria . En una formulación preferida, las fitasas de la presente invención pueden tomar la forma de inoculantes de alimentación microbiana. Los cultivos de los microorganismos que expresan una fitasa natural, tal como de S. ruminantium JY35 (ATCC 55785), o microorganismos recombiantes que expresan una fitasa codificada por un gen de fitasa heteróloga, se hacen crecer a concentraciones elevadas en fermentadores y luego se colectan y se concentran por centrifugación. El suero de grado alimenticio y/u otros agentes citoprotectores son mezclados -ntonces con el concentrado de las células. La mezcla resultante es congelada entonces criogénicamente y secada por congelamiento para preservar la actividad de la fitasa por procedimientos de liofilización estándares. El cultivo secado por congelamiento puede ser procesado adicionalmente para formar un producto terminado por tales pasos adicionales como el mezclado del cultivo con un portador inerte para ajustar la fuerza o resistencia del producto. Todo o una porción de los cultivos microbianos y las plantas como son producidos por la presente invención, pueden ser utilizados en una variedad de procesos industriales que requieren la acción de una fitasa. Tales aplicaciones incluyen, sin limitación, la fabricación de productos finales tales como el fosfato de inositol y el inositol, la producción de ingredientes alimenticios y aditivos alimenticios para no rumiantes (por ejemplo, los cerdos, las aves de corral, los peces, los alimentos para mascotas), en la nutrición humana, y en otras industrias (el procesamiento del maíz y la soya, la fécula, y la fermentación) que involucran materias primas que contienen fitato. La degradación del fitato hace que el fosfato inorgánico y los metales quelados estén disponibles para los animales y los microorganismos. La acción de la fitasa incrementa la calidad, el valor y la utilidad de los ingredientes alimenticios y los substratos de fermentación que son de valor elevado del fitato. La acción de las fitasas también puede acelerar el proceso de remojado y los procesos de separación involucrados en la molienda en fase húmeda del maíz. Los genes de la fitasa de la presente invención pueden ser utilizados en la hibridación heteróloga y los experimentos de reacción en cadena de la polimerasa, dirigida al aislamiento de los genes que codifican la fitasa de otros microorganismos. Los ejemplos de aquí son dados a manera de ilustración y de ninguna manera limitan el alcance de la presente invención. Se han hecho esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a los números utilizados (por ejemplo, la temperatura, el pH, las cantidades) pero la posibilidad de algunas variantes y desviaciones experimentales debe ser reconocida.

Ejemplo 1 Aislamiento de bacterias ruminales El fluido ruminal de una vaca Holstein canulizada se colectó en una bolsa Whirpak® estéril. El fluido también puede ser extraído del estómago por medio de un tubo orogástrico. Bajo una atmósfera anaeróbica adecuada (por ejemplo, al 90% de C02 y 10% de H2) , se prepararon y distribuyeron diluciones en serie de diez veces sobre la superficie de un medio de crecimiento sólido (por ejemplo, Scott y Dehority, 1965), y las placas fueron incubadas a 39 °C durante 18 a 72 horas. Las colonias aisladas fueron extraidas con una cinta estéril y las células fueron rociadas sobre la superficie del medio de agar fresco para producir colonias aisladas. Las células de una sola colonia fueron confirmadas por examen morfológico para presentar un cultivo puro y fueron cultivados y almacenados en la colección de cultivos de Lethbridge Research Centre ("LRC") o utilizados como una fuente de la actividad enzimática o del material genético.

Ejemplo 2 Selección de las bacterias ruminales para la actividad de la fitasa A. Ensayos de la fitasa Las soluciones de muestreo (filtrados del cultivo, suspensiones de las células, lisatos, lavados o modelos o blancos de agua destilada) fueron evaluados para verificar la actividad de la fitasa incubando 150 µl de la solución con 600 µl de una solución del substrato [0.2 % (p/v) de fitato de sodio en solución amortiguadora de acetato de sodio 0.1 M, pH 5.0] durante 30 minutos a 37 °C. La reacción se detuvo agregando 750 µl de ácido tricloroacético al 5% (p/v) . El ortofosfato liberado en la mezcla de la reacción se midió por el método de Fiske y Subbaro (1925). El reactivo a color preparado recientemente [750 µl de una solución que contiene 4 volúmenes de molibdato de amonio al 1.5 % (p/v) en una solución de ácido sulfúrico al 5.5 % (v/v) y 1 volumen de una solución de sulfato ferroso al 2.7 % (p/v)] se agrega a la mezcla de la reacción y la producción del fosfomolibdato se midió espectrofotométricamente a 700 nm. Los resultados fueron comparados con una curva estándar preparada con fosfato inorgánico. Una unidad ("Unidad") de fitasa se definió como la cantidad de enzima requerida para liberar una µmol de fosfato inorgánico (Pi) por minuto bajo las condiciones del ensayo. Un ensayo de placa de fitasa mejorado fue desarrollado el cual eliminó los resultados positivos falsos provocados por la producción del ácido microbiano. Las substancias aisladas bacterianas se hicieron crecer bajo condiciones anaeróbicas sobre un medio de agar de Scott y Dehority modificado (1965) que contiene 5% (v/v) de fluido estomacal, 1.8 % (p/v) de agar y 2.0 % (p/v) de fitato de sodio durante 5 días a 37 °C. Las colonias fueron lavadas de la superficie del agar y las cajas de petri fueron inundadas con una solución de cloruro de cobalto acuosa al 2% (p/v) . Después de una incubación de 5 minutos a temperatura ambiente, la solución de cloruro se reemplazó con una solución preparada recientemente que contiene volúmenes iguales de una solución de molibdato de amonio acuosa al 6.25 % y una solución de vanadato de amonio al 0.42 % (p/v). A continuación de una incubación de 5 minutos, la solución de molibdato de amonio/solución de vanadato de amonio se removió y las placas se examinaron para detectar zonas de aclaramiento. La efectividad de esta técnica de contrateñido se demuestra en la Figura 1. Previo al teñido, las zonas de aclaramiento fueron evidentes alrededor de las colonias del S. ruminantium JY35 (ATCC 55785) que producen la fitasa y el S. Bovis que produce el ácido láctico, que "se hicieron crecer sobre un medio de agar que contiene fitato (figura 1, caja de petri izquierda) . Las zonas positivas falsas de aclaramiento que resultan de la producción de ácido por las colonias de S. Bovis, fueron eliminadas por el contrateñido de las cajas o placas con las soluciones de cloruro de cobalto y de molibdato de a onio/vanadato de amonio (Figura 1, caja de petri izquierda) .

B. Actividad de la fitasa de las bacterias ruminales Las actividades de fitasa de 345 bacterias ruminales de la colección de cultivos del LRC fueron determinadas (Tabla 1). La técnica anaeróbica de Hungate (1950), como se modificó por Bryant y Burkey (1953), o una cámara anaeróbica con una atmósfera del 90 % de C02 y 10 % de H2 fue utilizada para cultivar los microorganismos en la colección de cultivos de LRC. La selección de la fitasa se efectuó sobre las substancias aisladas que crecen anaeróbicamente (100 % de C02) en tubos de Hungate con 5 ml del medio de Scott y Dehority modificado (1965) que contiene 5 % (v/v) del fluido ruminal, 0.2 % (p/v) de glucosa, 0.2 % (p/v) de celobiosa y 0.3 % (p/v) de fécula. Después de 18 a 24 horas de incubación a 39 °C, las células completas o los sobrenadantes del cultivo se evaluaron para verificar la actividad de la fitasa. Las selenomonas fueron los productores de fitasa predominantes (93 % de las substancias aisladas probadas tuvieron la actividad de la fitasa, Tabla 1) . La prevotella fue el único otro género a partir del cual se identificó un número significativo de cultivos positivos (11 substancias aisladas positivas de fitasa de 40 probadas) . Un total de 29 cultivos con la actividad de fitasa substancial fueron identificados. Estas incluyeron 24 del género Selenomonas y 5 del género Prevotella. Doce de estos cultivos (11 substancias aisladas de Selenomonas y 1 de Prevotella) tuvieron actividades de la fitasa substancialmente más elevadas que los otros cultivos positivos (Tabla 2) . En todos los casos, la actividad de fitasa estuvo asociada predominantemente a la célula.

Ejemplo 3 Actividad de fitasa de Selenomonas ruminantium JY35 (ATCC 55785) A. Crecimiento y producción de la fitasa La producción de fitasa durante el crecimiento de de S. ruminantium JY35 (ATCC 55785) fue examinada. El S. ruminantium JY35 (ATCC 55785) se hizo crecer a 39 °C en tuvos de Hungate con 5 ml de caldo de Scott y Dehority modificado (1965) que contiene 5 % (v/v) de fluido ruminal. El crecimiento (concentración de la proteína) y la actividad de la fitasa (asociada con la célula) fueron verificados a intervalos durante un período de tiempo de 24 horas. El crecimiento y la actividad de fitasa máximos del S. ruminantium JY35 (ATCC 55785) se lograron 8-10 h después de la inoculación (Figura 2) . El crecimiento celular fue reflejado por los incrementos en la actividad de la fitasa.

B. Localización de la actividad de la fitasa La actividad de fitasa del S. ruminantium JY35 (ATCC 55785) se determinó que va a estar asociada predominantemente con las células. La actividad pequeña de la fitasa se detectó en los sobrenadantes del cultivo y los lavados celulares. La actividad de la fitasa del S. ruminantium JY35 (ATCC 55785) se localizó por microscopía electrónica como Cheng y Costerton (1973) . Las células fueron colectadas por centrifugación, lavadas con una solución amortiguadora, sumergidas en agar al 4 % (p/v) , prefijadas en una solución de glutaraldehido al 0.5 % durante 30 minutos y se fijan durante 2 horas en una solución de glutaraldehido al 5 % (v/v) . Las muestras fueron lavadas cinco veces con una solución amortiguadora de cacodilato (0.1 M, pH 7.2) y se tratan con tetróxido de osmio al 2 % (p/v) , se lava cinco veces con solución amortiguadora de cacodilato, deshidratado en una serie de etanol graduada, y se sumerge en una resina de Spurr (J.

B. EM Services Inc.). Se cortaron secciones ultradelgadas con un ultramicrótomo Reichert modelo OM U3 y se tiñeron con acetato de uranilo al 2 % (p/v) y citrato de plomo. Los especímenes fueron observados con Hitachi H-500 TEM a un voltaje de aceleración de 75 kV. Una comparación de las células de S. ruminantium JY35 (ATCC 55785) incubadas con el substrato para la deposición del producto de la reacción con las células no tratadas, indicó claramente que la actividad de la fitasa estuvo asociada con las superficies de la membrana externa de la célula (Figura 3) . La deposición del material denso electrónico sobre las superficies de la célula externa de las células tratadas fue el resultado de la actividad de la fitasa (Figuras 3A, B y C) .

C. pH óptimo de la fitasa Las determinaciones iniciales del pH óptimo de la fitasa de S. ruminantium JY35 (ATCC 55785) fueron llevadas a cabo con células completas o enteras. La actividad de la fitasa fue óptima sobre un intervalo de pH de 4.0 a 5.5 (Figura 4) . Una segunda curva de pH fue generada con un extracto celular de MgCl2 (Figura 5) . Las células de un cultivo toda la noche de 100 ml fueron lavadas dos veces con agua destilada estéril, se volvieron a suspender en 0.3 volúmenes de una solución acuosa de MgCl20.2 M y se incubaron toda la noche a 0 °C. La solución se aclaró por centrifugación y el extracto resultante se utilizó en los ensayos de fitasa. Cuatro sistemas amortiguadores fueron utilizados para cubrir el intervalo de pH; la glicina (pH 1.5-3.0), el formiato (pH 3.0-4.0), el acetato (pH 4.0-5.5) y el succinato (pH 5.5-6.5) .

D. Temperatura óptima de la fitasa La temperatura óptima de la actividad de la fitasa del S. ruminantium JY35 (ATCC 55785) se determinó a un pH de 5.0 (solución amortiguadora de acetato de sodio 0.1 M) con el extracto celular de MgCl2. La enzima retuvo arriba del 50 % de su actividad arriba de un intervalo de temperatura de 37 a 55 °C (Figura 6) .

EX_ El efecto de los iones y la concentración del substrato sobre la actividad de la fitasa El efecto de varios iones (10 M) y la concentración del substrato sobre la actividad de la fitasa de la célula completa se determinó a un pH de 5.0 (solución amortiguadora de acetato de sodio 0.1 M) . La actividad de la fitasa se estimuló por la adición de Ca++, Na+, K+ y Mg++, inhibida por Fe++, Zn++ y Mn++ y sin afectar por Co++ y Ni++ (Figura 7) . El efecto de la concentración del substrato sobre la actividad de la fitasa en un extracto celular de MgCl2 de S. ruminantium JY35 (ATCC 55785) está presentado en la Figura 8.

F. Peso Molecular El tamaño molecular de la fitasa en el S. ruminantium JY35 (ATCC 55785) se determinó por análisis de zimograma. Un extracto liberado de MgCl2 crudo, concentrado diez veces, se mezcló con 20 µl de una solución amortiguadora de carga de la muestra (Laemmli, 1970) en un microtubo y el microtubo fue colocado en un baño de agua en ebullición durante 5 minutos. Los extractos de MgCl2 desnaturalizados fueron resueltos por SDS-PAGE sobre un gel de separación al 10 % cubierto con un gel de acumulación al 4 % (Laemmli, 1970) . A continuación de la electrofóresis, la fitasa se renaturalizó remojando el gel en Tritón X-100 al 1 % durante 1 hora a temperatura ambiente y una solución amortiguadora de acetato de sodio 0.1 M (pH 5.0) durante 1 hora a 4 °C. La actividad de la fitasa se detectó incubando el gel durante 16 h en una solución amortiguadora de fosfato de sodio 0.1 M (pH 5.0) que contiene 0.4 % de fitato de sodio. El gel se trató con el procedimiento de teñido con cloruro de cobalto y molibdato de amonio/vanadato de amonio descrito para los ensayos de la placa de fitasa en el Ejemplo 2. Un banda de actividad dominante única, que corresponde a una masa de aproximadamente 35 a 45 kDa, fue observada (Figura 9) .

Ejemplo 4 Clonación de un gen de fitasa (phyA) a partir del Selenomonas ruminantium JY35 (ATCC 55785) A^ Aislamiento del clon de Escherichia coli positivo de la fitasa Las bibliotecas del ADN genómico se prepararon para el S. ruminantium JY35 (ATCC 55785) de acuerdo con los procedimientos publicadas (Hu et al., 1991; Sambrook et al., 1989). El ADN genómico se extrajo de un cultivo toda la noche, fresco, de S. Ruminantium JY35 (ATCC 55785) utilizando una modificación del protocolo descrito por Priefer et al. (1984) . El ADN genómico del S. ruminantium JY35 (ATCC 55785) fue digerido parcialmente con Sau3A y el gel de purificó para producir los fragmentos de ADN en el intervalo de 2 a 10-kb. Una biblioteca genómica fue construida ligando el pUCld desfosforilado, digerido con BamHI con los fragmentos de ADN genómicos de Sau3A del S. ruminantium JY35 (ATCC 55785) . Las células competentes de Escherichia coli DH5a (Gibco BRL, Mississauga, ON) se transformaron con la mezcla de ligación o unión y 6,000 clones que llevan los insertos fueron seleccionados para verificar la actividad de la fitasa (zonas de aclaramiento) sobre el agar de selección de fitasa de LB [medio LB, fitato de sodio al 1.0 % (esterizado con filtro), 100 mM HEPES (pH 6.0 -6.5), y 0.2 % de CaCl2] que contiene a picilina (100 µg/ml). Un clon positivo para la fitasa SrP.2 se aisló y la actividad de la fitasa se confirmó a través de ensayos de enzima (Figura 10) . Niveles muy elevados de la actividad de la fitasa fueron encontrados en el medio así como asociados con las células de E. coli (Tabla 3) . El ADN del plásmido aislado del clon SrP.2 llevó un plásmido de 5.5-kb, designado pSrP.2, que consiste del pUC18 que contiene un inserto de Sau3A de 2.7-kb.

B. Confirmación del origen de Selenomonas ruminantium JY35 (ATCC 55785) del inserto de 2.7-kb El origen de S. ruminantium JY35 (ATCC 55785) del inserto de 2.7-kb en pSrP.2 se confirmó por la hibridación del manchado de Southern (Sambrook et al., 1989) . El ADN genómico aislado del S. ruminantium JY35 (ATCC 55785) y digerido con EcoRI o HindIII se resolvió sobre un gel de agarosa al 0.8 %. Después de la transferencia a la membrana Zeta-probe® (BioRad Laboratories), la hibridación se efectuó toda la noche a condiciones estrictas altas (2 x SCC; 65 °C) con el fragmento de 2.7-kb del pSrP.2 etiquetado con digoxigenina (juego o conjunto de etiquetación y detección del 7?DN DIG; Boehringer Mannheim Canadá Ltd., Laval, PQ) . Las manchas fueron lavadas dos veces en 2 x SSC a temperatura ambiente; 0.1 % SDS durante 5 minutos y dos veces 0.1 X SSC; 0.1% SDS durante 20 minutos a 65 °C. Las manchas fueron desarrolladas de acuerdo con el protocolo provisto con el juego o conjunto de detección y etiquetación del ADN DIG (Boehringer Mannheim Canadá Ltd) . La sonda reaccionó con un fragmento HindIII de 14-kb (Figura 11) y con un fragmento EcoRI de 23-kb (datos no mostrados) del ADN genómico y confirmaron que el fragmento de 2.7-kb fue a partir del S. ruminantium JY35 (ATCC 55785) y que existe una secuencia homologa única en el genoma. Las copias únicas de una secuencia homologa con respecto al fragmento de 2.7-kb del S. ruminantium JY35 (ATCC 55785) también existe en los genomas del S. ruminantium HD86, HD141, y HD4 (datos no mostrados) . Sin embargo los polimorfismos de la longitud del fragmento de restricción fueron señalados para el S. ruminantium HD86 (fragmentos EcoRI de 9- y 23-kb) y el S. ruminantium HD4 (fragmento EcoRI de 3-kb y un fragmento HindIII de 20-kb) . El fragmento de 2.7-kb etiquetado del pSrP.2 falló para hibridizarse con el ADN genómico aislado del Prevotella sp. 46/52, E. coli DH5a o A. ficuum NRRL 3135 (datos no mostrados) .

Ejemplo 5 Caracterización del gen de fitasa de Selenomonas ruminantium A. Evidencia para la clonación de un gen de fitasa Las células competentes de DH5a de Escherichia coli (Gibco BRL, Mississauga, ON) fueron transformadas con los plásmidos pUCld y pSrP.2. Las substancias transformantes resistentes a la ampicilina, resultantes, fueron probadas para verificar la actividad de la fitasa sobre el agar para la selección de la fitasa de LB. Solamente las células de E. coli DH5a transformadas con ?SrP.2 produjeron zonas de aclaramiento sobre el agar de selección de fitasa de LB.

B. Análisis de restricción y deleción del pSrP.2 El gen de fitasa se localizó sobre el inserto de Sau3A de 2.7-kb por los análisis de deleción y la endonucleasa de restricción (Ausubel et al., 1990; Sambrook et al., 1989). Las células que llevan el plásmido pSrP.2? Sphl, construido por la deleción del fragmento de Sphl de 1.4-kb del pSrP.2, careció de actividad de la fitasa (Figura 12 y Figura 13, Tabla 3) .

Análisis de zimograma La masa molecular de la fitasa producida por el DH5a de E. coli (pSrP.2) se determinó por análisis de zimograma. Un ml de un cultivo toda ia noche se transfirió a un microtubo de 1.5 ml. Las células fueron colectadas por centrifugación y se lavaron con solución amortiguadora de acetato de sodio 0.1 M (pH 5.5). La microesfera de células se volvió a suspender en 80 µl de una solución amortiguadora de carga de la muestra (Laemmli, 1970) y el microtubo se coloca en en un baño de agua en ebull ción durante 5 minutos. Los extractos celulares resultantes fueron resueltos por SDS-PAGE sobre un gel de separación al 10% cubierto con un gel de acumulación al 4% (Laemmli, 1970) y el gel se tiñó para verificar la actividad de la fitasa como se describió en el Ejemplo 3F. Una banda de actividad dominante única, que corresponde a una masa molecular de aproximadamente 37 kDa, fue observada (Figura 14, banda A) . Una banda de actividad correspondiente no fue observada para las células de E. coli DH5a (pSrP.2? Sphl) (Figura 14, banda B) .

D. Análisis de la secuencia de ADN de pSrP.2 La secuencia completa del inserto de 2.7-kb de pSrP.2 fue determinada. Las muestras fueron preparadas para el análisis de la secuencia de ADN sobre un sistema de secuenciamiento del ADN Modelo 373A de Applied Biosystems (Applied Biosystems, Inc., Mississauga, ON) utilizando un Juego o Conjunto de Secuenciamiento del Ciclo del Terminador Taq DyeDeoxi® (Applied Biosystems, Inc.). El ADN del molde o modelo se extrajo desde los cultivos toda la noche de E. coli DH5a con el sistema de purificación de ADN minipreps Wizards® (Promega Corp., Madison, Wl) . Las secuencias de superposición fueron generadas moviendo el cebador. Los datos de la secuencia del ADN fueron analizados utilizando el programa MacDNASIS DNA (Hitachi Software Engineering Co., Ltd., San Bruno, CA) . La secuencia del inserto de ADN de 2.7-kb fue determinada y el análisis estructural del ADN identificó un marco de lectura abierta (ORF2; pb 1493 a 2504) que se superpone sobre el sitio Sphl del inserto de Sau3A de 2.7-kb y lo suficientemente grande para codificar la fitasa de 37 kDa. La actividad de la fitasa fue eliminada delecionando pb 1518 a través del extremo del fragmento de Sau3A de 2.7-kb (pSrPr.6, Tabla 3, Figura 13). Esto se efectuó clonando el producto de PCR de pSrP.2 unido por el cebador del secuenciamiento SrPr6 (CGG GAT GCT TCT GCC AGT AT, SEQ ID NO. 3 el complemento inverso de pb 1518 a 1538) y el cebador Delantero M13 (CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC) en pGEM-T (Promega Corp.). Un subclon del producto de PCR (?SrPf6) de pSrP.2, unido por el cebador SrPf6 (pb 1232 a 1252, CGT CCA CGG AGT CAC CCT AC) SEQ ID NO. 4 y el cebador Inverso M13 (AGC GGA TAA CAÁ TTT CAC ACÁ GGA) , y que contiene ORF2 más 252 pb corriente arriba del sitio de desdoblamiento de Sphl, retuvieron la actividad de la fitasa (Tabla 3, Figura 13) . La secuencia y la translación del gen de fitasa de S. ruminantium (phyA) es mostrada en la Figura 15. La translación de 0RF2 podría conducir a la expresión de un polipéptido de 346 aminoácidos con un peso molecular predicho de 39.6 kDa (Figura 15). Los primeros 31 residuos fueron típicos de una secuencia de la señal del procariota, que abarca un N-término básico y un núcleo hidrofóbico central (von Heijne, 1986) . La aplicación del método de von Heijne (1986) predijo que el sitio de escisión de la peptidasa de la señal ocurre más probablemente antes de Ala28 o Pro31. Esto se confirmó por la determinación de la secuencia de aminoácidos N-terminal del gel purificado a partir del sobrenadante del cultivo de E. coli DH5a (pSrPf6) (Figura 15) . La proteína madura secretada tiene una masa putativa de 36.5 kDa. Una comparación de la secuencia de aminoácidos phyA con las secuencias de la proteína conocidas de la base de datos MasDNASIS SWISSPROT no reveló similaridades significativas con respecto a alguna secuencia publicada incluyendo los genes phyA y phyB de la fitasa del Aspergillus niger.

Ejemplo 6 La purificación parcial y la caracterización de los productos de phyA expresados por el E. coli.

Los sobrenadantes libres de células, preparados a partir de cultivos toda la noche del E. coli (pSrPfd) , fueron mezclados 3:1 (v/v) con Ni++-NTA agarosa pre-equilibrada en una solución amortiguadora de 0.1 M Tris (pH 7.9), 0.3 M NaCl. La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 0.5 h y se lava 3 x con solución amortiguadora de 0.1 M Tris (pH 7.9), 0.3 NaCl. La actividad de la fitasa fue eluida a partir de la resina con 1 volumen de acetato de sodio 0.1 M (pH 5.0), 0.3 M NaCl. Cuando se resuelve sobre los geles de SDS-poliacrilamida teñidos con el azul brillante de Coomassie, arriba del 70 % de la proteína eluida formó una banda de proteína de 37-kDa única. Los análisis de zimograme y de la secuencia de aminoácidos N-terminal confirmó que la banda de 37-kDa correspondió a la fitasa codificada por phyA del S. ruminantium JY35 (ATCC 55785) clonado. La actividad específica de la fitasa purificada con Ni++-NTA agarosa varió desde 200 hasta 400 µmoles de fosfato liberado/min/mg de proteína. Este es 2 a 4 veces más elevado que la actividad específica reportada para la fitasa NRRL 3135 de A. ficuum (van Gorcum et al., 1991, 1995; van Hartingsveldt et al., 1993).

Ejemplo 7 Sobre-expresión del gen phyA de Selenomonas ruminantium El aislamiento y la caracterización de phyA del S. ruminantium JY35 (ATCC 55785) hace posible la producción a gran escala de la PhyA de la proteína en cualquiera de varios sistemas de expresión procarióticos (por ejemplo, E. coli y B. subtilis) o eucarióticos (por ejemplo, de hongos - Pichia, Saccharomyces, Aspergillus, Trichoderma; de plantas - Brassica, Zea, Solanum; o de animales - aves de corral, cerdos o peces) utilizando métodos conocidos. Las enseñanzas para la construcción y la expresión de phyA en E. coli, P. pastoris, y B. napus son provistas posteriormente. Se pueden adoptar enfoques similares para la expresión de la fitasa del S. ruminantium JY35 (ATCC 55785) en otros organismos procarióticos y eucarióticos.

A. Clonación del phyA de Selenomonas ruminantium en una Escherichia coli - construcción de expresión específica Una construcción de expresión es construida en la cual la región que codifica el PhyA maduro es fusionada transcripcionalmente con el promotor tac (Brosius et al., 1985). Las secuencias promotoras pueden ser reemplazadas por aquellas de otros promotores que proporcionan una expresión eficiente en E. coli. La construcción de la expresión es introducida en las células de E. coli por transformación. i. Construcción del vector de expresión de E. coli Varios de los vectores de expresión de E. coli basados en promotores tac o promotores relacionados, están disponibles comercialmente. En este ejemplo la construcción será preparada con pKK223-3 disponible de Pharmacia Biotech Inc. (Uppsala, Suecia) . La región del phyA que codifica el PhyA maduro (el péptido secretado a continuación de la remoción del péptido de la señal) es amplificado con cebadores de oligonucléotidos MATE2 (GC GAA TTC ATG GCC -AAG GCG CCG GAG CAG AC) (SEQ ID NO. 5) Y M13 Inverso. El oligonucleótido MATE2 (SEQ ID NO. 5) se diseñó para que contenga un sitio de restricción adecuado en su terminal para permitir el montaje o unión directa del producto amplificado con pKK223-3. La región de phyA amplificada con MATE2 (SEQ ID NO. 5) y M13 Inverso es digerida con EcoRI y Smal y se ligaron o unieron en una pKK223-3 escindida similarmente. ii. Transformación del E. coli y expresión de PhyA La mezcla de unión o ligamiento pKK223-3: :phyA es utilizada para transformar las células de E. coli competentes. Las cepas adecuadas para niveles elevados de expresión de la proteína, tales como SG13009, CAG926 o CAG929 (que lleva Iacl sobre un plásmido tal como pREP4), son empleados. Las células transformadas son dispersadas sobre un agar de LB que contiene ampicilina (100 µg/ml) y se incuban toda la noche a 37 °C. Las colonias resistentes a la ampicilina son seleccionadas para verificar la presencia de la construcción de pKK223-3::phyA deseada extrayendo el ADNp y sometiendo el ADNp a electrofóresis de gel de agarosa y análisis de restricción. Los clones positivos pueden ser caracterizados adicionalmente por análisis de la secuencia de ADN y de PCR.

La expresión de la fitasa del S. ruminantium JY35 (ATCC 55785) por las células de E. coli transformadas, es probada haciendo crecer las células bajo ventilación vigorosa a 37 °C en un medio líquido adecuado (por ejemplo, LB o 2xYT) que contienen la selección de antibióticos apropiada hasta que la densidad óptica (a 600 nm) está entre 0.5 y 1.0. El promotor tac es inducido agregando la isopropil-ß-D-tiogalactosida (IPTG) a una concentración final entre 0.1 y 2 mM. Las células son cultivadas durante unas 2 a 4 horas adicionales y se colectan por centrifugación. La expresión de la proteína es verificada por SDS-PAGE, y técnicas de inmunodetección/manchado de western. El PhyA expresado puede ser extraido rompiendo (por ejemplo, por aplicación de sonido o alteración mecánica) las células de E. coli. Las inclusiones de proteína de PhyA pueden ser recolectadas por centrifugación y se solubilizan con 1 a 2 % de SDS. El SDS puede ser removido por diálisis, electroelución o ultrafiltración. La actividad de la fitasa de los extractos de las células preparadas puede ser evaluada por los métodos estándares descritos en el Ejemplo 2.

B. Clonación del phyA de Selenomonas ruminantium en una Pichia Pastoris - construcción de expresión específica Una construcción de expresión es construida, en la cual la región que codifica la PhyA madura está fusionada translacionalmente con las secuencias de la señal de excreción encontradas en los vectores de expresión de P. pastoris (Pichia Expression Kit Instruction Manual, Invitrogen Corporation, San Diego, CA) para expresar la fitasa de S. ruminantium como un producto secretado. Las secuencias de la señal de secreción y del promotor pueden ser reemplazadas por aquellas de otros promotores que proveen la expresión eficiente en Pichia. La construcción de la expresión es introducida en las células de P. pastoris por transformación. i. Construcción del vector de expresión de P. pastoris Varios de los vectores de expresión de P. pastoris basados en los promotores aoxl y el Factor a o las secuencias de la señal phol están disponibles comercialmente. En este ejemplo la construcción será preparada con el pPIC9 disponible de Invitrogen Corporation. La región de phyA que codifica la Phya madura es amplificada con los cebadores del oligonucleótido MATE (GC GAA TTC GCC AAG GCG CCG GAG CAG AC) (SEQ ID NO. 6) y M13 Inverso. El oligo MATE (SEQ ID NO. 6) fue diseñado para contener un sitio de restricción adecuado en su terminal o extremidad para permitir el montaje directo del producto amplificado con pPIC9. La región de phyA amplificada con MATE (SEQ ID NO. 6) y M13 Inverso es digerida con EcoRI y ligada o unida en el pPIC9 escindido o desdoblado de manera similar. ii. Transformación de P. pastoris y expresión de PhyA La mezcla de ligamiento o unión de pPIC9::phyA es utilizada para transformar las células de E. coli DH5a competentes. Las células transformadas son dispersadas sobre el agar de LB que contiene ampicilina (100 µg/ml) y se incuban toda la noche a 37 °C. Las colonias resistentes a la ampicilina son seleccionadas para verificar la presencia de la construcción de pPIC9::phyA deseada extrayendo el ADNp y sometiendo el ADNp a electrofóresis de gel de agarosa y a análisis de restricción del ADN. Los clones positivos se caracterizaron adicionalmente por análisis de secuencia de ADN y PCR. El ADN del plásmido es preparado a partir del cultivo de 1 litro de un clon de E. coli que lleva la construcción de pPIC9::phyA deseada. El ADNp es digerido con Bg/II y analizado por electrofóresis de gel de agarosa para confirmar la digestión completa del vector. El ADNp digerido es extraido con fenol: cloroformo, se precipita en etanol y se vuelve a suspender en H20 destilada estéril hasta una concentración final de 1 µg/ml. En la preparación para la transformación, se hicieron crecer células de P. pastoris GS115 o KM71 durante 24 horas a 30 °C en un caldo de YPD. Las células de 100 µl del cultivo son colectadas por centrifugación y se vuelven a suspender en 100 µl de la solución amortiguadora de la transformación (0.1 M LiCl, 0.1M ditiotreitol, 45% polietilenglicol 4000) que contiene 10 µg de ADN de esperma de salmón y 10 µg de pPIC9::phyA linearizado. La mezcla es incubada durante 1 hora a 37 °C, dispersada sobre un medio de agar mínimo de P. pastoris y se incuba durante 2 a 5 días. Las colonias que crecen sobre el medio de agar mínimo son marcadas o evaluadas en su pureza y analizadas para verificar la presencia de phyA integrado por PCR y la hibridación del manchado de Southern.

La expresión de la fitasa de S. ruminantium JY35 (ATCC 55785) por las células de P. pastoris transformadas es probada haciendo crecer las células a 30 °C bajo ventilación vigorosa en un medio líquido adecuado (por ejemplo un medio de glicerol complejo amortiguado tal como BMGY) hasta que se alcanza una densidad óptica del cultivo (a 600 nm) (OD6oo) de 2 a 6. Las células son colectadas y se vuelven a suspender hasta una OD6oo de 1.0 en un medio inductor (por ejemplo, un medio de metanol complejo amortiguado, BMMY) y se incuban durante unos 3 a 5 días adicionales. Las células y el sobrenadante del cultivo libre de células son colectados y la expresión de la proteína es verificada por técnicas de ensayo de la enzima, SDS-PAGE, e inmunodetección/manchado de western.

C. Clonación del phyA de Selenomonas ruminantium en una Pichia Pastoris - construcción de expresión especifica - Un Ejemplo Adicional Una construcción de expresión es construida, en la cual la región que codifica la PhyA madura es fusionada translacionalmente con las secuencias de la señal de secreción encontradas sobre los vectores de expresión de P. pastoris (por ejemplo, Pichia Expression Kit Instruction Manual, Invitrogen Corporation, San Diego, CA) para expresar la fitasa de S. ruminantium como un producto secretado. El promotor y las secuencias de la señal de secreción pueden ser reemplazados por aquellos otros promotores que proporcionen una expresión eficiente en Pichia. La construcción de la expresión es introducida en las células de P. pastoris por transformación. i. Construcción del vector de expresión de P. pastoris Varios vectores de expresión de P. pastoris basados en los promotores aoxl y el Factor a o las secuencias de la señal de phol están disponibles comercialmente. En este ejemplo la construcción fue preparada con la pPICZaA disponible de Invitrogen Corporation. La región de phyA que codifica la PhyA madura (es decir, el péptido secretado a continuación de la remoción del péptido de la señal) se amplificó con los cebadores de oligonucleótidos MATE (GC GAA TTC GCC AAG GCG CCG GAG CAG AC SEQ ID NO. 6) y M13 Inverso. El oligo MATE (SEQ ID NO. 6) se diseñó para contener un sitio de restricción EcoRI en su terminal o extremidad para permitir el montaje o ensamblaje directo del producto amplificado con pPICZaA. La región de phyA amplificada con MATE (SEQ ID NO. 6) y M13 Inversa se digerió con EcoRI y se ligó en el pPICZaA escindido o desdoblado de manera similar. ii. Transformación de P. pastoris La mezcla de ligamiento o unión de pPICZocA: :phyA se utilizó para transformar las células de E. coli DH5a. Las células transformadas fueron dispersadas sobre un agar LB que contiene Zeocina (25 mg/ml) y se incuba toda la noche a 37 °C. Las colonias resistentes a la zeocina fueron seleccionadas para verificar la presencia de la construcción de pPICZaA: :phyA deseada extrayendo el ADNp y sometiendo el ADNp a electrofóresis del gel de agarosa y a análisis de restricción. Los clones positivos estuvieron caracterizados adicionalmente por el análisis de la secuencia de ADN y de PCR. El ADN del plásmido fue preparado a partir de un cultivo de 1 litro de un clon de E. coli que lleva la construcción de pPICZocA: :phyA deseada. El ADNp es digerido con Bg/II y analizado por electrofóresis del gel de agarosa para confirmar la digestión completa del vector. El ADNp digerido se extrajo con el fenol: cloroformo, se precipitó con etanol y se volvió a suspender en H20 destilada estéril a una concentración final de 1 µg/µl.

En la preparación para la transformación, 50 ml del caldo de YPD fueron inoculados con las células de P. pastoris GS115 y se incuban a 28 °C y 250 rpm durante 1 días. Subsiguientemente, 5 ml del cultivo de 1 día se utilizaron para inocular 50 ml del caldo de YPD fresco. El cultivo fue propagado toda la noche a 28 °C y 250 RPM. La siguiente mañana, se utilizaron 5 ml de este cultivo para inocular 50 ml del caldo de YPD fresco. Este cultivo se incubó a 28 °C y 250 RPM hasta que la OD6oo del cultivo alcanzó aproximadamente 1.2 (~ 6 h) . Las células de levadura de 20 ml del cultivo fresco fueron colectadas por centrifugación, se lavan una vez con, y se vuelven a suspender en 1 ml de solución amortiguadora de 10 mM Tris, 1 M EDTA, 0.1 M LiCl, 0.1 M ditiotreitol (pH 7.4) a temperatura ambiente. Después de 1 h de incubación a 30 °C, la suspensión celular se lavó una vez con 1 ml de agua enfriada con hielo y una vez con 1 ml de sorbitol 1 M enfriado con hielo. Las células se volvieron a suspender en 160 µl de sorbitol 1M enfriado con hielo (para obtener concentraciones celulares que se aproximan a 1010 células/ml). El pPICZaA: :phyA linearizado (5 a 10 µg) se mezcló con 80 µl de células, se cargó en probetas de electroporación preenfriadas (distancia inter-electrodo de 0.2 cm) y se incubó sobre hielo durante 5 minutos. Se aplicó un impulso de alto voltaje (1.5 kV, 25 µF, 200 Ohmios) a la probeta con un Bio-Rad Gene Pulser®. Inmediatamente a continuación del impulso, se agregó 1 ml de sorbitol 1M enfriado con hielo a la probeta la cual se incubó subsiguientemente durante 2 h a 30 °C. La suspensión celular se dispersó (100 a 200 µl por placa) sobre un medio de agar YPD que contiene Zeocina (100 µg/ml) y se incubó durante 2 a 4 días a 30 °C. Las colonias que crecen sobre el medio selectivo fueron marcadas o evaluadas para verificar la presencia del phyA integrado por PCR y/o la hibridación por manchado de Southern. iii . Expresión de Pichia pastoris del gen de fitasa de S. ruminantium JY35 La expresión de la fitasa de S. ruminantium JY35 por las células de P. pastoris transformadas se probó haciendo crecer las células transformadas que se hicieron crecer toda la noche en un medio de glicerol complejo amortiguado (por ejemplo el medio de glicerol complejo amortiguado, BMGY, Pichia Expression Kit Instruction Manual) a 28 °C y 250 RPM y se les transfiere a un medio de inducción (por ejemplo, un medio de metanol complejo amortiguado, BMMY) . Las células colectadas del medio de BMGY fueron lavadas una vez con el medio BMMY, se vuelven a suspender en BMMY a una OD60o de 1.0 y se incuba durante unos 3 a 5 días adicionales a 28 °C y 250 RPM. Se agrega metanol (0.005 volúmenes) cada 24 horas. Las células y los sobrenadantes del cultivo libres de células fueron recolectados y evaluados para verificar la actividad de la fitasa. Dieciséis transformantes de P. pastoris pPICZaA: :MATE fueron probados para verificar la actividad de la fitasa a continuación de 96 horas de crecimiento en un medio de BMMY. El transformante más activo, llamado el clon 17, se seleccionó para un estudio adicional. El crecimiento y la producción de fitasa por el clon 17 de P. pastoris pPICZaA: :MATE y un clon negativo (P. pastoris pPICZaA) se verificaron durante un período de 9 días. Los cultivos de partida fueron preparados haciendo crecer las substancias aisladas toda la noche (28 °C, 250 RPM) en 10 ml de medio de BMGY (glicerol) . Las células se colectaron y se prepararon cultivos duplicados volviendo a suspender las células en 50 ml de un medio BMMY (metanol) hasta una OD6oo aproximada de 2.5. Los cultivos resultantes fueron transferidos a recipientes de 500 ml y se incubaron a 28 °C y 250 RPM. El metanol fue agregado cada 24 h a una concentración final de 0.5 %. La densidad óptica y la actividad de la fitasa se midieron durante el transcurso del tiempo del experimento. Los resultados son presentados en la Tabla 4. La actividad de la fitasa fue detectada solamente en cultivos que llevan el gen de phyA de S. ruminantium. Estos cultivos produjeron hasta 22.5 unidades de actividad de fitasa por ml después de 210.5 h de cultivo. La actividad de la fitasa en los cultivos de los recipientes en agitación se incrementó por medio del protocolo de inducción y la composición del medio. La actividad de la fitasa del clon 17 fue mejorada dramáticamente incrementando la densidad celular inicial (OD6?o = 36.0) del cultivo inducido. Después de casi 4 d de crecimiento (91.5 horas), las actividades de la fitasa mayores que 40 y 20 unidades/ml fueron observadas para el cultivo completo y las muestras del sobrenadante libres de células, respectivamente. Las densidades ópticas (ODßio) de estos cultivos fueron de entre 62 y 69. Los resultados experimentales sugieren que mientras mayor sea la biomasa del cultivo en el instante de la inducción con metanol, más grande será el rendimiento de la fitasa recombinante. Los rendimientos de biomasa tan elevados como 150 h/1 (peso seco) o las densidades ópticas de 1500 han sido reportadas para Pichia cultivada bajo condiciones de crecimiento óptimas en un sistema fermentador controlado herméticamente que opera con enriquecimiento de oxígeno.

Los rendimientos de fitasa de Pichia también fueron incrementados agregando Tween-80 al medio. Los agentes tensioactivos se ha demostrado previamente que afectan la producción de la fitasa por el Aspergillus carbonarius (Al-Asheh y Duvnjak, 1994) . El efecto de incorporar 0, 0.002, 0.1 o 0.5% de Tween-80 sobre los rendimientos de la fitasa de los cultivos de BMMY del clon 17 de pPICZoA: :MATE de P. pastoris es ilustrado en la Tabla 5. Las células de los cultivos de YPD fueron recolectados y se vuelven a suspender en BMMY (OD6?0 = 8.3). Se prepararon recipientes triplicados para cada concentración de Tween-80 y se incubaron a 28 °C y 250 RPM. El metanol (0.005 volúmenes) fue agregado en una base diaria a los recipientes. La actividad de fitasa se incrementó más rápidamente en los cultivos que contienen concentraciones más elevadas de Tween-80. Además, una proporción más grande de la actividad de la fitasa se encontró en el sobrenadante cuando se utilizan concentraciones más elevadas de Tween-80. Los rendimientos de la fitasa tan elevados como 298 unidades/ml del cultivo del recipiente en agitación han sido logrados con un cultivo de 9 días del clon 17 cultivado en un medio de BMMY enmendado con 0.5% de Tween-80.

Las proteínas celulares y del sobrenadante fueron analizadas por SDS-PAGE para confirmar la producción de PhyA por P. pastoris. La presencia de una banda de proteína de 37 kDa fue fácilmente evidente cuando una cantidad tan pequeña como 5 µl del sobrenadante se resolvió sobre un gel de SDS-PAGE al 12%. La banda de 37 kDa fue visible en la muestra de proteína celular pero representó menos de 10% de aquella encontrada en la cantidad correspondiente del sobrenadante. Además de PhyA, los sobrenadantes del clon 17 contuvieron muy pocas proteínas adicionales (una característica útil de la expresión de Pichia) . La proteína de PhyA recombinante comprendió arriba del 95% (estimado sobre los geles de SDS-PAGE) de la proteína secretada. La banda de proteína de 37 kDa no estuvo presente en el sobrenadante o las células de un cultivo de control negativo (P. pastoris pPICZaA) . Los experimentos de recipientes agitados con células de P. pastoris recombinantes que expresan la fitasa de S. ruminantium (PhyA) han demostrado el potencial de este sistema de producción de proteínas. Se obtendrán ganancias significativas en los rendimientos de la fitasa cultivando e induciendo el clon 17 en un fermentador. Las ganancias adicionales en los rendimientos de la fitasa pueden ser logrados incrementando el número de copias del gen por medio de la selección adicional de los transformantes independientes o el uso de sistemas de vectores multicopias. Los eventos de integración de plásmidos múltiples espontáneos ocurren en Pichia a una frecuencia de entre 1/10 y 1/100 de los transformantes. No es irreal esperar que una ganancia de 10 veces en el rendimiento de la fitasa (por ejemplo, de 3,000 unidades/ml) pueda ser lograda fácilmente a través de la manipulación del número de copias del gen de fitasa y el control de los parámetros de la fermentación. Esto podría conducir a la producción de niveles comparables a los sistemas de producción de la fitasa de A. ficuum comerciales. Los rendimientos para estos sistemas se cree que van a ser de alrededor de 3,000,000 unidades (µmoles Pi liberados/min. ) de actividad de fitasa por litro de cultivo. iv. La actividad del recombinante de la fitasa de S. ruminantium (PhyA) sobre los substratos de granos La liberación del fosfato a partir del maíz por la fitasa del S. ruminantium JY35 recombinante producida por Pichia pastoris fue examinada. El maíz alimentado se molió y se tamizó a través de una malla para obtener un tamaño de partícula entre 1 - 3 mm. El maíz molido (0.5 g) se pesa en tubos de Falcon de 15 ml estériles a los cuales se agregan 2 ml de una solución amortiguadora de acetato de sodio 0.1 M (pH 5.0). Después de la adición de la fitasa, las mezclas de la reacción fueron incubadas a 37 °C. La liberación de fosfato se determinó midiendo el fosfato del sobrenadante. Para medir el fosfato previo, las mezclas de la reacción fueron preparadas y terminadas inmediatamente a través de la adición de 5 % (p/v) de TCA. Todos los experimentos fueron llevados a cabo por triplicado. La incubación del maíz en una solución amortiguadora de acetato de sodio condujo a la liberación de cantidades -mecientes de fósforo durante el transcurso del tiempo (Tabla 6) . Aunque la adición de la actividad de la fitasa incrementó significativamente la cantidad del fósforo liberado, la velocidad de liberación del fósforo se redujo con el tiempo. La concentración de la fitasa agregada a la mezcla de incubación también influyó en la cantidad del fósforo liberado. Elevando las concentraciones de la fitasa desde 0.08 unidades hasta 0.48 unidades por g de maíz condujo a niveles incrementados de fósforo en el sobrenadante (Tabla 7) . Se debe señalar que incrementando la concentración de la fitasa desde 0.32 hasta 0.48 unidades produjo solamente un incremento marginal en el fósforo liberado.

D. Clonación del phyA de Selenomonas ruminantium en una siembra o semilla de Brassica napus - construcción de la expresión especifica Se han desarrollado métodos de transformación y de expresión del gen para una amplia variedad de especies de cultivos monocotiledóneos y dicotiledóneos. En este ejemplo, una construcción de expresión de fitasa de S. ruminantium JY35 (ATCC 55785) es construida, en la cual la región que codifica la PhyA madura es fusionada translacionalmente con una secuencia de codificación de oleosina para ubicar como blanco u objetivo la expresión específica del cuerpo aceitoso de la semilla de la fitasa de S. ruminantium. Las secuencias de la señal de secreción y/o del promotor pueden ser reemplazadas por aquellas de otros promotores que proporcionan una expresión eficiente en B. napus u otras especies de plantas transformables. La construcción de la expresión es introducida en las células de B. napus por la transformación mediada por Agrobacterium. i. Construcción del vector de expresión de B. napus Varios de los vectores de expresión funcionales en el B. napus son descritos en la literatura (Gelvin et al., 1993). En este ejemplo, la construcción es preparada reemplazando el CDS de ß-glucuronidasa de E. coli del pCGOBPGUS (van Rooijen y Moloney, 1994) con un fragmento que codifica el CDS maduro de phyA. Esto es efectuado sublonando el fragmento de PstI Kpnl de pCGOBPGUS, que contiene la región del promotor de oleosina: :oleosina CDS: :ß-glucuronidasa CDS::NOS, sobre el pUCBM20 digerido con PstI Kpnl (Boehringer Mannheim Canadá, Laval, PQ) . Este plásmido es llamado pBMOBPGUS. La región de phyA que codifica la PhyA madura es amplificada con cebadores de oligonucleótidos MATN (GA GGA TCC ATG GCC AAG GCG CCG GAG CAG AC) (SEQ ID NO. 7) y M13 Inverso. El oligonucleótido MATN (SEQ ID NO. 7) se diseñó para contener un sitio de restricción adecuado en su extremidad o terminal para permitir el montaje directo del producto amplificado con el pBMOBPGUS digerido. El fragmento de phyA amplificado con MATN (SEQ ID NO. 7) y M13 Inverso es digerido con Ncol SstI y se ligó en el pBMOBPGUS escindido o desdoblado de manera similar para generar el plásmido pBMOBP phyA. El vector de expresión de B. napus, pCGOBPphyA, es construido reemplazando el fragmento de PstI Kpnl del pCGOBPGUS con el fragmento de PstI Kpnl del pBMOBP phyA, que contiene el fragmento del promotor de oleosina: :oleosina CDS::phyA CDS::NOS. ii. Transformación de B. napus y expresión de PhyA estable El B. napus transgénico se preparó como se describió por van Rooijen y Moloney (1994) . La cepa de Agrobacterium tumefaciens EHA101 es transformada por electroporación con pCGOBP phyA. Los petiolos cotiledonarios de B. napus se transforman con A. tumefaciens EHAA101 (pCGOBP phyA) . Las plantas transgénicas son regeneradas a partir de explantes que hechan raíces sobre un medio de MS libre de hormonas que contiene 20 µg/ml de kanamicina. Las plantas jóvenes fueron evaluadas para verificar la actividad de NPTII, se hicieron crecen hasta la madurez y se les permite autopolinizarse y que se desarrollen por completo las semillas. Las semillas de los transformantes individuales son agrupados y parte de la muestra de semillas es evaluada para verificar la presencia de la actividad de la fitasa y se comparó con las semillas de las plantas no transformadas. Las plantas de la segunda generación (T2) son propagadas a partir de las semillas de los clones con los niveles más elevados de la actividad de la fitasa. Las semillas de los homozigotos de las plantas T2 para NPTII (aquí también para phyA) se seleccionaron y se utilizaron para la propagación de la masa de las plantas (T3) capaces de producir las cantidades más elevadas de la fitasa.

Ejemplo Identificación de los Genes de Fitasa Relacionados en Otros Microorganismos Para identificar un gen de fitasa relacionado con phyA, el análisis de hibridación puede ser utilizado para seleccionar los ácidos nucleicos de una o más substancias aisladas ruminales de interés utilizando phyA (SEQ ID NO. 1) o las porciones de los mismos como sondas por técnicas conocidas (Sambrook, 1989; Ausubel, 1990) como se describe en el ejemplo 4B. Los ácidos nucleicos relacionados pueden ser clonados empleando métodos conocidos. Los radioisótopos (es decir, 32P) pueden ser requeridos como los organismos de selección con los genomas complejos para incrementar la sensibilidad del análisis. La amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) también puede ser utilizada para identificar los genes relacionados con phyA. Las secuencias relacionadas encontradas en los cultivos puros o mezclados, son amplificados preferentemente por PCR Y y las variaciones tales como Transcripción Inversa - PCR) con cebadores de oligonucleótidos diseñados utilizando la SEQ ID NO. 1. Los productos amplificados pueden ser visualizados por electrofóresis con gel de agarosa y clonados utilizando técnicas conocidas. Una variedad de materiales, incluyendo células, colonias, placas, y ácidos nucleicos extraídos (por ejemplo, ADN, ARN) , pueden ser examinados por estas técnicas para verificar la presencia de las secuencias relacionadas. Alternativamente, se pueden utilizar las técnicas de inmunodetección conocidas que emplean anticuerpos específicos para PhyA (SEQ ID NO. 2) para seleccionar las células completas o las proteínas de interés extraídas para verificar la presencia de la(s) fitasa (s) relacionada (s) .

Tabla 1. Actividad de la fitasa entre las bacterias estomacales Actividad de la Fitasa Microorganismo Número de substancias _______^____^^_^______ Aisladas probadas Muy fuerte Prevotella sp. 1 Selenomonas ruminantium 11 Fuerte Prevotella rumipicola 4 S. ruminantium 13 Moderada Bacillus sp. 1 . Megasphaera elsdenii 7 P. ruminicola 6 S. ruminantium 37 Treponema sp. 1 Negativa Anaerovibrio lipolytica 2 Bacülus sp. 4 Butyrivibrío fibrísolvens 47 Clostridium sp. 1 Coprococcus sp. 3 Enterococcus sp. 4 Eubacterium sp. 7 Fibrobacter succinogenes 8 Fusobacterium sp. 3 Lachnospira muitiparus 4 Lactobacillus sp. 20 M. elsdenii 7 Peptostreptococcus sp. 1 P. ruminicola 41 Ruminobacter amylophllus 4 Ruminococcus albus 7 Ruminococcus flavefaciens 10 S. ruminantium 4 Streptococcus bovis 48 Streptococcus milleri 1 Staphylococcus sp. 6 Succinovibrio dextrisolvens 12 Treponema sp. 12 Unknown _8 Total de substancias aisladas seleccionadas 345 Tabla 2. Actividad de la fitasa de las substancias aisladas bacterianas estomacales seleccionadas Substancia Aislada Actividad de la fitasa (raU*/ml) Selenomonas ruminantium JY35 646 Selenomonas ruminantium KJ1 18 485 Selenomonas ruminantium BS131 460 Selenomonas ruminantium HD141 361 Selenomonas ruminantium HD86 286 Selenomonas ruminantium JY135 215 Selenomonas ruminantium D 69 Selenomonas ruminantium HD16 52 Selenomonas ruminantium BS1 14 47 Selenomonas ruminantium JY4 27 Prevotella sp. 46/52 321 Prevotella ruminicola JY97 68 Prevotella ruminicola KJ182 61 Prevotella ruminicola JY106 49 Megasphaera elsdenii J Y91 *U= µmoles, P¡ liberado/minuto Tabla 3. Sobre-expresión de la fitasa de S. ruminantium1 en E. coli DH5a recombinante Cepa Composición de UnidadesVml Actividad espeLa muestra cifica (Unida- des/mg proteina) E. coli (pSrP.2) células 0.30 (0.08)3 1 .56 (0.41 ) sobrenadante 0.308 (0.21) 2.64 (1.51 ) E. coli (pSrPf?) células 0.91 (0.41 ) 6.42 (0.64) sobrenadante 5.10 (0.58) 22.83 (1.67) E. coli (pSrP.2 Sphl) células ND4 ND sobrenadante ND ND El S. ruminantium JY35 es un bastoncillo con forma de semicírculo, un anaerobio obligado, que produce el ácido propiónico de la fermentación de la glucosa, fermenta la lactosa, no fermenta el glicerol, no fermenta el manitol (véase también Bergey' s Manual fo Systematic Bacteriology, ed. John G. Holt, Williams y Wiikins, Baltimore, 1984) 2ünidades = µmoles Pi liberado/minuto 3 Los números entre paréntesis son errores estándares 4 ND = no detectado Tabla 4. Crecimiento y actividad de la fitasa de las células de P. pastoris transformadas con pPICZocA: : MATE ( clon 17 ) . Cultivo Tiempo Densidad Actividad de la fitasa (h) Óptica (µmol/min/ml) (610 nm) Cultivo Sobrenadante P. pastoris (pP\CZ A) 0.0 2.6 0.0 0.0 20.5 10.1 0.0 0.0 42.5 17.8 0.0 0.0 68.0 17.0 0.0 0.0 91.0 28.5 0.0 0.0 138.5 39.3 0.0 0.0 210.5 46.7 0.0 0.0 P. pastoris 0.0 2.5 0.0 0.0 (pPICZaA::MATE) 20.5 1 1.3 1.9 0J 42.5 13.9 4.4 1.5 68.0 12.9 8.0 2.7 91.0 15.7 4.7 0.5 138.5 18.3 12.6 5.3 210.5 18.7 22.5 12.5 Tabla 5. El efecto de la concentración de Tween-80 sobre el crecimiento y la actividad de la fitasa de las células de P. pastoris transformadas con pPICZocA: :MATE (clon 17). Tiempo Muestra Densidad Actividad de la fitasa Actividad del (d) (% de Óptica (µ ol/min/ml) Cultivo/so- Tween-80) (610 nm) Cultivo Sobrenadante brenadante ? 0.0 24.3 4.1 2.2 0.55 0.02 24.4 4.8 2.7 0.57 0J 25.1 5.2 3.2 0.61 0.5 24.4 4.9 3.2 0.65 4 0.0 31.2 6.9 4.7 0.69 0.02 31.0 8.2 5.5 0.67 0J 31.8 10.3 6.9 0.67 0.5 29.2 10.3 9.1 0.88 R 0.0 32.8 10.6 5.9 0.55 0.02 30.4 14.8 9.8 0.67 0J 33.9 20.2 17.2 0.86 0.5 33.8 22.1 18.9 0.86 Tabla 6. El efecto del periodo de incubación y de la fitasa de S. ruminantium JY35 recombinante (2 unidades/g de maíz) sobre la liberación del fosfato del maíz. Muestra Período de Concentración Incubación del fosfato (__. (µmoles/ml) Diferente de 1 0.85 la Fitasa 2 1.72 3 2.56 4 3.77 5 4.35 Fitasa 1 4.76 2 6.83 3 7.72 4 8.41 5 8.49 Tabla 7. El efecto de la concentración de la fitasa de S. ruminantium JY35 recombinante sobre la liberación del fosfato del maíz. Actividad de la fitasa Concentración (unidades/g del maíz) del fosfato (µmoles/g de maíz) 0.08 11.8 0.16 14.8 0.24 22.5 0.32 23.0 0.40 23.2 0.48 23.8 0.56 23.8 0.64 23.6 0.72 23.8 REFERENCIAS Al-Asheh, S. And Z. Duvnjak. 1994. The effect of surfactants on the phytase production and the reduction of the phytic contení in cañóla meal by Aspergillus carboparius during a solid state fermentatiop process. Biotechnol. Lett. 16:183-188.

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Todas las publicaciones mencionadas en esta especificación son indicativas del nivel de experiencia de aquellas personas expertas en la técnica a la cual pertenece esta invención. Todas las publicaciones son incorporadas aqui para referencia al mismo grado que si cada publicación individual se hubiera indicado específicamente que va a ser incorporada para referencia.

Aunque la invención precedente ha sido descrita con algún detalle a manera de ilustración y de ejemplo para propósitos de claridad y de entendimiento, será obvio que ciertos cambios y modificaciones pueden ser practicados dentro del alcance de las reivindicaciones.

LISTADO DE SECUENCIAS INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: Cheng, Kuo-Joan Selinger, Leonard B. Yanke, Lindsey J. Bae, Hee-Dong Zhou, Lu Ming Forsberg, Cecil . (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: Secuencias de ADN que codifican las fitasas de los microorganismos ruminales o del estómago. (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 7 (iv) DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA: (A) DESTINATARIO: McKay-Carey & Company (B) CALLE: 2125, 10155-102 St. (C) CIUDAD: Edmonton (D) ESTADO: Alberta (E) PAÍS: CA (F) CÓDIGO POSTAL: T5J 4G8 (v) FORMA LEÍBLE POR LA COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Disco magnético flexible (B) COMPUTADORA: compatible con IBM PC (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA: Patentln Reléase #1.0, Versión #1.30 (vi) FECHA DE LA SOLICITUD COMÚN: (A) NUMERO DE SOLICITUD: (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 23 mayo de 1997 (C) CLASIFICACIÓN: (viii) INFORMACIÓN DEL APODERADO/MANDATARIO: (A) NOMBRE: Mary Jane McKay-Carey (B) NUMERO DE REGISTRO: (C) REFERENCIA/NUMERO DE REGISTRO: 37003WO0 (ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES: (A) TELEFONO: (403) 424-0222 (B) TELEFAX: (403) 421-0834 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID. NO:l: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1401 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: circular (Ü) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Selenomonas ruminantium (B) CEPA: JY35 (vii) FUENTE INMEDIATA: (A) BIBLIOTECA: biblioteca de ADN genómico (B) CLON: pSrP.2 (x) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACION: 231..1268 (C) MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: experimental (D) OTRA INFORMACIÓN: /codón de inicio = 231 /función = "Desfosforilación del ácido fitico" /producto = "Fitasa" /evidencia = EXPERIMENTAL /gen = "phyA" /número = 1 /nombre estándar = "fosfohidrolasa del hexafosfato de mio-inositol" /cita = ( [ 1 ] ) (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: péptido sig (B) LOCALIZACION: 231..311 (C) MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: experimental (D) OTRA INFORMACIÓN: /codón de inicio = 1 /función = "secreción de fitasa" /producto = "Péptido de la señal" /evidencia = EXPERIMENTAL /cita = ([1]) (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: péptido mat (B) LOCALIZACION: 312..1268 (C) MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: experimental (D) OTRA INFORMACIÓN: /codón de inicio = 312 /producto = "Fitasa" /evidencia = EXPERIMENTAL /número = 2 /cita = ([1]) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:l: CGTCCACGGA GTCACCCTAC TATACGACGT ATGTGAAGTT CACGTCGAAG TTCTAGGGAA 60 TCACCGATTC GTGCAGGATT TTACCACTTC CTGTTGAAGC GGATGAGAAG GGGAACCGCG 120 AAGCGGTGGA AGAGGTGCTG CACGACGGAC GATCGCGCTG AATGAATCAG TGCTTCCTAA 180 CTATTGGGAT TCCGCGCAGA CGCGCGGATG GAGTAAAGGA GTAAGTTGTT ATG AAA 236 Mee Lys - 7 TAC TGG CAG AAG CAT GCC GTT CTT TGT AGT CTC TTG GTC GGC GCA TCC 284 Tyr Trp Gln Lys His Ala Val Leu Cys Ser Leu Leu Val Gly Ala Ser -25 -20 -15 -10 CTC TGG ATA CTG CCG CAG GCC GAT GCG GCC AAG GCG CCG GAG CAG ACG 332 Leu Trp lie Leu Pro Gln Ala Asp Ala Ala Lys Ala Pro Glu Gln Thr -5 1 5 GTG ACG GAG CCC GTT GGG AGC TAC GCG CGC GCG GAG CGG CCG CAG GAC 380 Val Thr Glu Pro Val Gly Ser Tyr Ala Arg Ala Glu Arg Pro Gln Asp 10 15 20 TTC GAG GGC TTT GTC TGG CGC CTC GAC AAC GAC GGC AAG GAG GCG TTG 428 Phe Glu Gly Phe Val Trp Arg Leu Asp Asn Asp Gly Lys Glu Ala Leu 25 30 35 CCG CGT AAT TTC CGC ACG TCG GCT GAC GCG CTG CGC GCG CCG GAG AAG 476 Pro Arg Asn Phe Arg Thr Ser Ala Asp Ala Leu Arg Ala Pro Glu Lys 40 45 50 55 AAA TTC CAT CTC GAC GCC GCG TAT GTA CCG TCG CGC GAG GGC ATG GAT 524 Lys Phe His Leu Asp Ala Ala Tyr Val Pro Ser Arg Glu Giy Met Asp 60 65 70 GCA CTC CAT ATC TCG GGC AGT TCC GCA TTC ACG CCG GCG CAG CTC AAG 572 Ala Leu His He Ser Gly Ser Ser Ala Phe Thr Pro Ala Gln Leu Lys 75 80 85 AAC GTT GCC GCG AAG CTG CGG GAG AAG ACG GCT GGC CCC ATC TAC GAT 620 Asn Val Ala Ala Lys Leu Arg Glu Lys Thr Ala Gly Pro He Tyr Asp 90 95 100 GTC GAC CTA CGG CAG GAG TCG CAC GGC TAT CTC GAC GGT ATC CCC GTG 668 Val Asp Leu Arg Gln Glu Ser His Gly Tyr Leu Asp Gly He Pro Val 105 110 115 AGC TGG TAC GGC GAG CGC GAC TGG GCA AAT CTC GGC AAG AGC CAG CAT 716 Ser Trp Tyr Gly Glu Arg Asp Trp Ala Asn Leu Gly Lys Ser Gln His 120 125 130 135 GAG GCG CTC GCC GAC GAG CGG CAC CGC TTG CAC GCA GCG CTC CAT AAG 764 Glu Ala Leu Ala Asp Glu Arg His Arg Leu His Ala Ala Leu His Lys 140 145 150 ACG GTC TAC ATC GCG CCG CTC GGC AAG CAC AAG CTC CCC GAG GGC GGC 812 Thr Val Tyr He Ala Pro Leu Gly Lys His Lys Leu Pro Glu Gly Gly 155 160 165 GAA GTC CGC CGC GTA CAG AAG GTG CAG ACG GAA CAG GAA GTC GCC GAG 860 Glu Val Arg Arg Val Gln Lys Val Gln Thr Glu Gln Glu Val Ala Glu 170 175 180 GCC GCG GGG ATG CGC TAT TTC CGC ATC GCG GCG ACG GAT CAT GTC TGG 908 Ala Ala Gly Mee Arg Tyr Phe Arg He Ala Ala Thr Asp His Val Trp 185 190 195 CCA ACG CCG GAG AAC ATC GAC CGC TTC CTC GCG TTT TAC CGC ACG CTG 956 Pro Thr Pro Glu Asn He Asp Arg Phe Leu Ala Phe Tyr Arg Thr Leu 200 205 210 215 CCG CAG GAT GCG TGG CTC CAT TTC CAT TGT GAA GCC GGT GTC GGC CGC 1004 Pro Gln Asp Ala Trp Leu His Phe His Cys Glu Ala Gly Val Gly Arg 220 225 230 ACG ACG GCG TTC ATG GTC ATG ACG GAT ATG CTG AAG AAC CCG TCC GTA 1052 Thr Thr Ala Phe Mee Val Mee Thr Asp Mee Leu Lys Asn Pro Ser Val 235 240 245 TCG CTC AAG GAC ATC CTC TAT CGC CAG CAC GAG ATC GGC GGC TTT TAC 1100 Ser Leu Lys Asp He Leu Tyr Arg Gln His Glu He Gly Gly Phe Tyr 250 255 260 TAC GGG GAG TTC CCC ATC AAG ACG AAG GAT AAA GAT AGC TGG AAG ACG 1148 Tyr Gly Glu Phe Pro He Lys Thr Lys Asp Lys Asp Ser Trp Lys Thr 265 270 275 AAA TAT TAT AGG GAA AAG ATC GTG ATG ATC GAG CAG TTC TAC CGC TAT 1196 Lys Tyr Tyr Arg Glu Lys He Val Met He Glu Gln Phe Tyr Arg Tyr 280 285 290 295 GTG CAG GAG AAC CGC GCG GAT GGC TAC CAG ACG CCG TGG TCG GTC TGG 1244 Val Gln Glu Asn Arg Ala Asp Gly Tyr Gln Thr Pro Trp Ser Val Trp 300 305 310 CTC AAG AGC CAT CCG GCG AAG GCG TAAAAGCGCA GGCGGCGGCT CGGAGTCAGG 1298 Leu Lys Ser His Pro Ala Lys Ala 315 GAAATGGCGC TGCCAGCACG GGACGCGCGG CGGCGGATGC TGCGCCGGTC AGGGATGATT 1358 GACGACAGCC AGAGAAGAAA GGATGGTTTT ATGAGGTGGA TCC 1401 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID. NO.2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 346 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (xii) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2: Met Lys Tyr Trp Gln Lys His Ala Val Leu Cys Ser Leu Leu Val Gly -27 -25 -20 -15 Ala Ser Leu Trp He Leu Pro Gln Ala Asp Ala Ala Lys Ala Pro Glu -10 -5 1 5 Gln Thr Val Thr Glu Pro Val Gly Ser Tyr Ala Arg Ala Glu Arg Pro 10 15 20 Gln Asp Phe Glu Gly Phe Val Trp Arg Leu Asp Asn Asp Gly Lys Glu 25 30 35 Ala Leu Pro Arg Asn Phe Arg Thr Ser Ala Asp Ala Leu Arg Ala Pro 40 45 50 Glu Lys Lys Phe His Leu Asp Ala Ala Tyr Val Pro Ser Arg Glu Gly 55 ' 60 65 Mee Asp Ala Leu His He Ser Gly Ser Ser Ala Phe Thr Pro Ala Gln 70 75 80 85 Leu Lys Asn Val Ala Ala Lys Leu Arg Glu Lys Thr Ala Gly Pro He 90 95 100 Tyr Asp Val Asp Leu Arg Gln Glu Ser His Gly Tyr Leu Asp Gly He 105 110 115 Pro Val Ser Trp Tyr Gly Glu Arg Asp Trp Ala Asn Leu Gly Lys Ser 120 125 130 Gln His Glu Ala Leu Ala Asp Glu Arg His Arg Leu His Ala Ala Leu 135 140 145 His Lys Thr Val Tyr He Ala Pro Leu Gly Lys His Lys Leu Pro Glu 150 155 160 165 Gly Gly Glu Val Arg Arg Val Gln Lys Val Gln Thr Glu Gln Glu Val 170 175 180 Ala Glu Ala Ala Gly Met Arg Tyr Phe Arg He Ala Ala Thr Asp His 185 190 195 Val Trp Pro Thr Pro Glu Asn He Asp Arg Phe Leu Ala Phe Tyr Arg 200 205 210 Thr Leu Pro Gln Asp Ala Trp Leu His Phe His Cys Glu Ala Gly Val 215 220 225 Gly Arg Thr Thr Ala Phe Mee Val Met Thr Asp Met Leu Lys Asn Pro 230 235 240 245 Ser Val Ser Leu Lys Asp He Leu Tyr Arg Gln His Glu He Gly Gly 250 255 260 Phe Tyr Tyr Gly Glu Phe Pro He Lys Thr Lys Asp Lys Asp Ser Trp 265 270 275 Lys Thr Lys Tyr Tyr Arg Glu Lys He Val Met He Glu Gln Phe Tyr 280 285 290 Arg Tyr Val Gln Glu Asn Arg Ala Asp Gly Tyr Gln Thr Pro Trp Ser 295 300 305 Val Trp Leu Lys Ser His Pro Ala Lys Ala 310 315 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID. NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido SrPrd" (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Selenomonas ruminantium (B) CEPA: JY35 (vii) FUENTE INMEDIATA: (A) BIBLIOTECA: biblioteca de ADN genómico ( B ) CLON : pSrP . 2 ( xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 3 ; CGGGATGCTT CTGCCAGTAT 20 INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID. NO: 4 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido SrPf6" (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (C) ORGANISMO: Selenomonas ruminantium (D) CEPA: JY35 (vii) FUENTE INMEDIATA: (A) BIBLIOTECA: biblioteca de ADN genómico (B) CLON: pSrP.2 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4: CGTCCACGGA GTCACCCTAC 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID. NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 31 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido MATE2" (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Selenomonas ruminantium (B) CEPA: JY35 (vii) FUENTE INMEDIATA: (A) BIBLIOTECA: biblioteca de ADN genómico (B) CLON: pSrP.2 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5: GCGAATTCAT GGCCAAGGCO CCGGAGCAGA C ^ (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID. NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 28 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido MATE" (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Selenomonas ruminantium (B) CEPA: JY35 (vii) FUENTE INMEDIATA: (A) BIBLIOTECA: biblioteca de ADN genómico (B) CLON: pSrP.2 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6: GCGAATTCGC CAAGGCGCCG GAGCAGAC (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID. NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 31 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido MATN" (iü) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Selenomonas ruminantium (B) CEPA: JY35 (vii) FUENTE INMEDIATA: (A) BIBLIOTECA: biblioteca de ADN genómico (B) CLON: pSrP.2 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7: 31 GAGGATCCAT GGCCAAGGCG CCGGAGCAGA C Se hace constar que con relación a esta fecha, or método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un ADN aislado y purificado, caracterizado porque codifica una fitasa de un microorganismo ruminal o estomacal.

2. Un ADN aislado y purificado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el microorganismo ruminal o estomacal es un procariota.

3. Un ADN aislado y purificado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el microorganismo ruminal es del género Selenomonas , Prevotella , Treponema o Megasphaera , por ejemplo Selenomonas ruminanti um, Prevotella rumini cola , Treponema bryantii 'o Megasphaera elsdenii , y preferentemente Selenomonas ruminantium, por ejemplo Selenomonas ruminan ti?m JY35 (ATCC 55785) .

4. Un ADN aislado y purificado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ADN es capaz de hibridación bajo condiciones estrictas con una sonda que comprende al menos 25 nucleótidos continuos de la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO.l.

5. Un ADN aislado y purificado de conformidad con la reivindicación 1, la fitasa codificada está caracterizada porque comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 2 del número de aminoácido 10 hasta el número de aminoácido 319.

6. Un ADN aislado y purificado de conformidad con la reivindicación 1, la fitasa codificada está caracterizada porque comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 2 del número de aminoácido 31 hasta el número de aminoácido 319.

7. Un ADN aislado y purificado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la fitasa codificada comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 2.

8. Un ADN aislado y purificado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ADN comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO. 1.

9. Un ADN aislado y purificado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ADN comprende los nucleótidos 312-1268 de SEQ ID NO. 1.

10. Un ADN aislado y purificado de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la fitasa codificada tiene las siguientes caracteristicas: (a) una masa molecular de aproximadamente 37 kDa; (b) es activa dentro de un intervalo de pH de aproximadamente 3.0 a 6.0; y (c) es activa dentro de un intervalo de temperatura de aproximadamente 4 a 55 °C, preferentemente de manera aproximada 20 a 55 °C, y más preferentemente de manera aproximada 35 a 40 °C.

11. Un ADN aislado y purificado de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la fitasa codificada tiene las siguiente caracteristicas adicionales: d) una actividad especifica al menos dos veces más elevada que aquella del PhyA del NRRI 3135 del Aspergillus ficuum como es medida por la liberación del fosfato inorgánico.

12. Una construcción de expresión capaz de dirigir la expresión de una fitasa en una célula huésped adecuada, la construcción de la expresión está caracterizada porque comprende un ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 conectado o enlazada operativamente con secuencias de control compatibles con la célula huésped.

13. Una célula huésped transformada con un ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, de modo que la célula huésped pueda expresar una fitasa codificada por el ADN.

14. Un microorganismo ruminal, caracterizado porque expresa una fitasa codificada por un ADN de conformidad con la reivindicación 3, el microorganismo ruminal es el Selenomonas ruminantium JY35 (ATCC 55785) .

15. Una planta transgénica transformada con un ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, de modo que una fitasa codificada por el ADN puede ser expresada por la planta, la planta es preferentemente la Brassica napus.

16. Una fitasa codificada por un ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

17. Una composición de alimentación, caracterizada porque comprende un alimento para ganado con una fitasa codificada por un ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

18. Un aditivo alimenticio, caracterizado porque comprende una preparación de microorganismos liofilizados, los microorganismos expresan una fitasa codificada por un ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 bajo condiciones de crecimiento normales, el microorganismo es preferentemente un microorganismo recombinante.

19. Un aditivo alimenticio para el tratamiento de un alimento para el ganado, el aditivo alimenticio está caracterizado porque comprende una fitasa codificada por un ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

20. Un método para producir una fitasa, caracterizado porque comprende: (a) transformar al menos una célula huésped con un ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, de modo que la célula huésped pueda expresar una fitasa codificada por el ADN; y (b) hacer crecer un cultivo de las células huésped bajo condiciones que conduzcan a la expresión de la fitasa por las células huésped.

21. Un método para producir una planta transgénica, caracterizado porque comprende: (a) transformar una planta con un ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, de modo que la planta pueda expresar una fitasa codificada por el ADN; y (b) hacer crecer la planta bajo condiciones que conduzcan a la expresión de la fitasa por la planta, la planta es preferentemente la Brassica napus.

22. Un método para mejorar la utilización del fitato de la dieta por un animal, caracterizado porque comprende alimentar al animal una dieta la cual incluya una cantidad efectiva de una fitasa codificada por un ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

23. Un método para identificar un ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, el método está caracterizado porque comprende los pasos de: (a) aislar las moléculas de ácido nucleico del organismo; (b) efectuar la hibridación del ácido nucleico bajo condiciones estrictas desde moderadas hasta elevadas con las moléculas del ácido nucleico y una sonda de hibridación etiquetada que tiene una secuencia de nucleótidos que comprende al menos 25 nucleótidos continuos de la SEQ ID NO: 1.