BR112015032918B1 - Métodos para preparação de células encapsuladas para liofilização, composição e seus usos - Google Patents

Métodos para preparação de células encapsuladas para liofilização, composição e seus usos Download PDF

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Abstract

células encapsuladas liofilizadas, métodos para sua liofilização e para sua preparação, seus usos, e composições. a invenção refere-se a um método de liofilização de células encapsuladas, o método compreendendo pelo menos duas etapas de incubação consecutivas, em que as células encapsuladas são incubadas em cada etapa de incubação em uma solução de incubação que contém um crio-protetor durante um período de tempo adequado, em que a concentração de crio-protetor na solução de incubação está aumentada com cada etapa de incubação subsequente. a invenção também refere-se a células liofilizadas que são obtidas por esse método assim como vários usos dessas células como farmacêuticos, aditivos alimentícios ou aditivos em cosméticos. a invenção também refere-se a uma composição que contém leite desnatado, glicerol e um carboidrato.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] O presente pedido reivindica o direito de prioridade do pedido de patente europeia 13 174 681.0, depositado no European Patent Office em 2 de julho de 2013, cujo conteúdo completo está incorporado aqui para todos os propósitos.
CAMPO DA INVENÇÃO
[002] A presente invenção refere-se de modo geral a um método de liofilizar células encapsuladas. A presente invenção também fornece células liofilizadas que são obtidas por esse método, assim como composições que contêm as células encapsuladas liofilizadas e vários usos dessas células, por exemplo, como farmacêuticos, como nutracêu- ticos, como aditivos alimentícios ou como aditivos em cosméticos. A invenção também fornece uma nova composição que contém leite desnatado, glicerol e um carboidrato e que pode ser usada, por exemplo, para liofilizar as células.
ANTECEDENTES DA DESCRIÇÃO
[003] Probióticos são micro-organismos vivos que, de acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS) quando administrados em quantidades adequadas, conferem benefícios à saúde do hospedeiro. Particularmente, as bactérias Lactobacillus acidophilus promovem a saúde intestinal que é o aspecto principal do bem-estar geral do hospedeiro. Produtos probióticos requerem algumas etapas de um processo que assegure sua estabilidade e viabilidade. Eles podem ser negativamente influenciados pelo armazenamento e durante sua passagem através do trato gastrointestinal depois do consumo.
[004] Vários produtos probióticos são liofilizados para conservá-los até que eles sejam usados. Isso significa que eles são primeiramente congelados e depois desidratados a vácuo. O processo de liofilização é crucial para a manutenção da estabilidade e da viabilidade de bactérias probióticas como aditivos alimentício, suplemento alimentício ou nutracêutico.
[005] Tecnicamente, a secagem por congelamento, também conhecida como liofilização ou crio-dessecação, pode ser definida como o resfriamento de uma amostra de líquido, resultando na conversão de uma solução congelável em gelo, cristalização de solutos cristalizáveis e a formação de uma matriz amorfa que compreende solutos não cristalizáveis associados com uma mistura não congelada, seguida pela evaporação (sublimação) da água da matriz amorfa. A evaporação (sublimação) da água congelada no material é realizada comumente pela redução da pressão circundante para permitir que a água congelada no material sublime diretamente da fase sólida para a fase gasosa. A grande vantagem da liofilização é estabilizar os materiais para o armazenamento.
[006] Adicionalmente, a liofilização tem a vantagem de não ter risco de descongelamento das células encapsuladas (Santivarangkna, C., Kulozik, U. and Foerst, P. (2007) Alterative drying processes for the industrial preservation of lactic acid starter cultures. Biotechnology Progress, 23(2), 302-315). A mortalidade significativa de células bacterianas tem sido relatada depois da liofilização devido à perda de integridade da membrana e desnaturação de macromoléculas. Veja, Franks, F. (1995) "Protein destabilization at low temperatures". Advances in Protein Chemistry, 46, 105-139; Thammavongs, et al (1996) "Physiological response of Enterococcus faecalis JH2-2 to cold shock: Growth at low temperatures and freezing/thawing challenge" Letter in Applied Microbiology, 23 (6), 398-402; De Angelis, M. e Gobbetti, M. (2004) "Environmental stress responses in Lactobacillus: A review "Proteomics, 4(1), 106-122.
[007] Foi mostrado que a encapsulação de bactérias em sulfato de celulose é capaz de exercer um efeito protetor sobre as bactérias durante a liofilização. Um estudo conduzido com alginato-quitosana como material de encapsulação mencionou que as cápsulas se tornam inchadas quando elas são incubadas em fluido intestinal simulado (Paulraj Kanmani, R. Satish Kumar, N. Yuvaraj, K.A. Paari, V. Pattukumar and Venkatesan Arul (2011) Cryopreservation and Microencapsulation of a Probiotic in Alginate-chitosan Capsules Improves Survival in Simulated Gastrointestinal Conditions. Biotechnology and Bioprecess Engineering, (16) 1106-1114. Kanmani et al. também descreveram nesse estudo que microcápsulas revestidas com alginato de sódio-quitosana encolheram em 10% quando em contato com fluido gástrico simulado.
[008] Portanto, a ação prejudicial do processo de liofilização sobre células tais como células bacterianas pode ser compensada pela microencapsulação com sulfato de sódio e celulose já que tal material de encapsulação pode resultar em uma estabilidade aperfeiçoada das cápsulas e maior viabilidade das bactérias encapsuladas. Entretanto, ainda há uma necessidade de superar a ação prejudicial do processo de liofilização sobre células tais como as células bacterianas.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[009] A presente invenção se dirige a essa necessidade pelo fornecimento de novos métodos de liofilizar células encapsuladas, células encapsuladas obtidas por tais métodos e vários usos dessas células encapsuladas e composições que contêm essas células encapsuladas.
[0010] Em um primeiro aspecto, a descrição fornece um método de liofilizar células encapsuladas, o método compreendendo pelo menos duas etapas de incubação consecutivas, em que as células encapsuladas são incubadas em cada etapa de incubação em uma solução de incubação que contém um crio-protetor durante um período de tempo adequado, em que a concentração do crio-protetor na solução de incubação é aumentada com cada etapa de incubação subsequente.
[0011] Em um segundo aspecto, a descrição fornece uma célula encapsulada liofilizada que é obtida por um método de liofilizar células encapsuladas como aqui descrito.
[0012] Em um terceiro aspecto, a descrição fornece uma composição que compreende um veículo adequado e uma célula encapsulada que é obtida por um método de liofilizar células encapsuladas como aqui descrito. Em modalidades exemplificadoras, a composição pode, por exemplo, ser um suplemento alimentar para humanos ou animais, uma formulação para sopa, uma composição cosmética ou uma composição farmacêutica.
[0013] Em um quarto aspecto, a descrição fornece um método de tratamento ou prevenção de diarreia, diarreia causada por antibiótico, artrite, obesidade, síndrome do intestino irritável, azia, síndrome da fadiga crônica, câncer gastrointestinal e outras formas de sofrimento de uma população bacteriana desequilibrada no intestino, o método compreendendo administrar a um indivíduo uma célula encapsulada liofilizada ou uma composição que contém uma célula encapsulada liofilizada como aqui descrita.
[0014] Em um quinto aspecto, a descrição fornece o uso de uma célula encapsulada liofilizada ou uma composição que contém uma célula encapsulada liofilizada como aqui descrita para o tratamento ou prevenção de diarreia, diarreia causada por antibiótico, artrite, obesidade, síndrome do intestino irritável, azia, síndrome da fadiga crônica, câncer gastrointestinal e outras formas de sofrimento de uma população bacteriana desequilibrada no intestino.
[0015] Em um sexto aspecto, a descrição fornece o uso de uma célula encapsulada liofilizada ou uma composição que contém uma célula encapsulada liofilizada como aqui descrita como um fármaco, um aditivo alimentício ou um aditivo em um cosmético. Em modalidades exemplificadoras da invenção, quando usado como aditivo alimentício, o alimento pode ser um produto a base de leite tal como um iogurte, queijo cottage ou coalhada. Em outras modalidades exemplificadoras da invenção, quando usada como aditivo alimentício, a célula encapsulada liofilizada ou uma composição que contém uma célula encapsulada liofilizada como aqui descrita é armazenada em um compartimento separado de uma embalagem que contém o alimento.
[0016] Em um sétimo aspecto, a descrição fornece um método de preparação de células encapsuladas por liofilização, o método compreendendo pelo menos duas etapas consecutivas de incubação, em que as células encapsuladas são incubadas em cada etapa de incubação em uma solução de incubação que contém um crio-protetor durante um período de tempo adequado, em que a concentração do crio-protetor na solução de incubação é aumentada com cada etapa de incubação subsequente.
[0017] Em um oitavo aspecto, a descrição fornece uma célula procariótica encapsulada liofilizada ou uma célula de levedura encapsulada liofilizada.
[0018] Em um nono aspecto, a descrição fornece uma composição que é adequada para o congelamento de células, a composição compreendendo leite desnatado, glicerol e um carboidrato.
[0019] Em um décimo aspecto, a descrição fornece um método de preparação de células encapsuladas por liofilização, o método compreendendo incubar as células encapsuladas em uma composição que compreende leite desnatado, glicerol e um carboidrato.
[0020] Em um décimo-primeiro aspecto, a descrição fornece o uso de uma composição que compreende leite desnatado, glicerol e um carboidrato para a preparação de células encapsuladas para a liofilização.
[0021] Em um décimo-segundo aspecto, a descrição fornece o uso de uma composição que compreende leite desnatado, glicerol e um carboidrato para o congelamento de células encapsuladas.
DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0022] A invenção será melhor compreendida com referência à descrição detalhada quando considerada em conjunto com os exemplos não limitantes e as figuras em anexo, nas quais:
[0023] Figura 1 mostra imagens microscópicas de campo claro de células encapsuladas de Lactobacillus acidophilus na forma liofilizada depois de serem tratadas com o método da invenção que usa leite em pó desnatado 5% e glicerol 1% como crio-protetores, em que as células foram incubadas em cada etapa de incubação em uma solução de incubação que contém uma concentração crescente do crio-protetor. As concentrações crescentes do crio-protetor são obtidas pela diluição seriada em cada etapa de incubação da solução de crescimento bacteriano de 100% para 50% para 25% para 12,5% para 6,25% para 3,125% para 0% com a solução crio-protetora (leite em pó desnatado 5% e glicerol 1%);
[0024] Figura 2 mostra o efeito protetor das cápsulas sobre as bactérias Lactobacillus acidophilus durante a liofilização, usando uma solução de incubação que contém leite desnatado e glicerol (leite em pó desnatado 5% e glicerol 1% em água) como crio-protetores. O efeito de proteção foi examinado pelo teste de viabilidade depois da reidratação das bactérias liofilizadas. A viabilidade foi comparada com células bacterianas encapsuladas recentemente como referência e é expressa em % de viabilidade.
[0025] Figura 3 mostra a comparação de duas soluções diferentes de meio de congelamento/incubação (solução de incubação 1: meio de Man, Rogosa e Sharpe (MRS) contendo DMSO como crio-protetor, solução de incubação 2: leite desnatado 5% e glicerol 1% em água) com relação à sobrevida das bactérias Lactobacillus acidophilus durante a liofilização;
[0026] Figura 4 mostra imagens de microscopia de campo claro de uma cápsula vazia que foi reidratada depois da liofilização. O meio de congelamento usou leite desnatado com glicerol 1%. A etapa de congelamento antes da liofilização foi realizada em nitrogênio líquido.
[0027] Figura 5 mostra imagens de microscopia de campo claro de uma cápsula vazia que foi reidratada depois da liofilização. O meio de congelamento usou leite desnatado com glicerol 1%. A etapa de congelamento antes da liofilização foi realizada em um banho de etanol/gelo seco.
[0028] Figura 6 mostra imagens de microscopia de campo claro de uma cápsula liofilizada em salina tamponada com fosfato (PBS) sem crio-protetor com a etapa de pré-congelamento sendo realizada em um banho de etanol/gelo seco;
[0029] Figura 7 mostra imagens de microscopia de campo claro de uma cápsula vazia liofilizada em PBS com DMSO 10%, com a etapa de pré-congelamento sendo realizada em um banho de etanol/gelo seco;
[0030] Figura 8 mostra imagens de microscopia de campo claro de uma cápsula vazia liofilizada em MRS sem crio-protetor, com a etapa de pré-congelamento sendo realizada em nitrogênio líquido;
[0031] Figura 9 mostra imagens de microscopia de campo claro de uma cápsula vazia liofilizada em MRS sem crio-protetor, com a etapa de pré-congelamento sendo realizada em um banho de etanol/gelo seco;
[0032] Figura 10 mostra os resultados de uma modalidade do método de congelamento da invenção que usa uma combinação de leite desnatado 5%, glicerol 1% e trealose 10% como crio-protetores, ambos como solução de incubação para a incubação sequencial com concentrações crescentes do crio-protetor e como uma solução de liofilização. As amostras a seguir foram empregadas nesse experimento: 1) Amostras de Lactobacillus livres (não encapsulados) liofilizadas com leite em pó/glicerol/trealose (losangos preenchidos), 2) amostras de Lactobacillus livres liofilizadas sem leite em pó/glicerol/trealose (quadrados preenchidos), 3) amostras de bactérias Lactobacillus encapsuladas liofilizadas usando o método da invenção com uma concentração de leite em pó, glicerol e trealose como crio- protetores na solução de incubação (cruzes) (as concentrações crescentes do crio-protetor foram obtidas pela diluição seriada em cada etapa de incubação, da solução de crescimento bacteriano de 100% para 50% para 25% para 12,5% para 6,25% para 3,125% para 0% com a solução crio-protetora (leite em pó desnatado 5%, glicerol 1% e trealose 10%), 4) amostras de bactérias Lactobacillus liofilizadas sem trealose (triângulos cheios). Os pontos de tempo nos quais as amostras foram reidratadas foram de 1, 2, 3, 4, 6, 7 e 8 semanas depois da liofilização para avaliar a viabilidade das bactérias depois da criopreservação com ou sem trealose em temperatura ambiente durante um período de 2 meses depois da liofilização. Cada ponto de dados na Figura 10 representa a média de amostras liofilizadas em duplicata (cada amostra testada em quadruplicata) com duas exceções: bactérias livres com trealose na semana 6 e bactérias encapsuladas com trealose 10% na semana 8. RFU = Unidades Relativas de Fluorescência.
[0033] Figura 11 mostra cápsulas de Lactobacillus casei em diferentes pontos depois da encapsulação e liofilização, com a Figura 11A mostrando cápsulas de Lactobacillus casei imediatamente depois da encapsulação, Figura 11B que mostra cápsulas de Lactobacillus casei um dia depois da encapsulação antes da liofilização e a Figura 11C que mostra cápsulas de Lactobacillus casei liofilizadas reidratadas.
[0034] Figura 12 mostra a comparação da viabilidade de cápsulas de Lactobacillus casei um dia antes e depois da liofilização.
[0035] Figura 13 mostra cápsulas de Bifidobacterium infantis longum em diferentes pontos depois da encapsulação e liofilização, com a Figura 13A mostrando cápsulas de Bifidobacterium infantis um dia depois da encapsulação antes da liofilização e a Figura 13B mostrando cápsulas de Bifidobacterium infantis longum liofilizadas reidratadas.
[0036] Figura 14 mostra a comparação da viabilidade de cápsulas de Bifidobacterium infantis longum um dia antes e depois da liofilização. DESCRIÇÃO DETALHADA
[0037] A presente invenção fornece um método de liofilizar células encapsuladas, cujo método compreende pelo menos duas etapas de incubação consecutivas. As células encapsuladas são incubadas em cada uma das etapas de incubação em uma solução de incubação que contém um crio-protetor durante um período de tempo adequado, em que a concentração do crio-protetor na solução de incubação é aumentada em cada etapa de incubação subsequente. Os inventores descobriram que esse método fornece um efeito protetor sobre a integridade (estrutural) de cápsulas (o material de encapsulação) antes e durante o processo de liofilização. Adicionalmente, a validade das cápsulas com as células encapsuladas é prolongada e a viabilidade das células encapsuladas é significativamente aumentada (cf. na Seção de Exemplos). Do ponto de vista mecânico, embora não desejando ficar ligado à teoria, é considerado que submeter as células encapsuladas a pelo menos duas etapas de incubação consecutivas do método da invenção, evita que as cápsulas "enruguem".
[0038] O aumento da concentração do crio-protetor (é observado aqui que a expressão "crio-protetor" como usada aqui, se refere a ambos, um único crio-protetor e uma mistura/combinação de dois ou mais crio-protetores) na solução de incubação durante as etapas de incubação consecutivas pode ser obtida de várias maneiras. Por exemplo, é possível adicionar a uma suspensão das células encapsuladas, para cada etapa de incubação, uma solução concentrada do crio- protetor. Por exemplo, se um crio-protetor tal como DMSO, formamida, N-metilacetamida (MA) ou propanodiol é usado, uma solução concentrada do crio-protetor puro (solução concentrada 100%) poderá ser usada e em cada etapa de incubação, uma certa quantidade da solução concentrada é adicionada à suspensão celular para aumentar a concentração do crio-protetor (compare com o Exemplo 1 da Seção de Exemplos). Alternativamente, por exemplo, também é possível usar a solução na qual as células encapsuladas serão submetidas à liofilização (isto é, a solução de congelamento ou meio de criopreservação) como solução de partida/concentrada para obter um aumento na concentração do crio-protetor. O uso da solução de congelamento final para esse propósito tem a vantagem de que nenhuma solução concentrada extra tem que ser preparada para as etapas de incubação consecutivas. Essa abordagem simplifica o manuseio das etapas de incubação quando uma mistura de crio- protetores é usada nas etapas de incubação, a saber, por exemplo, uma mistura de leite em pó desnatado com glicerol ou uma mistura de leite em pó desnatado, glicerol e um carboidrato tal como sacarose ou trealose. Em tal caso, a solução de congelamento preparada (a saber, por exemplo, leite em pó desnatado 5% (p/v) e glicerol 1% (v/v) em água ou uma solução aquosa de leite em pó desnatado 5% (p/v), glicerol 1% (v/v) e 10% (p/v) de um carboidrato tal como sacarose ou trealose) é usada para "diluir seriadamente" em cada etapa de incubação, o meio no qual as células encapsuladas são armazenadas. Essa "diluição seriada" pode, por exemplo, ser obtida como a seguir. Metade do volume do meio celular no qual as células encapsuladas estão presentes é removida do respectivo frasco e o mesmo volume da solução de congelamento é adicionado para a primeira etapa de incubação. As células encapsuladas são então incubadas por um período de tempo desejado e depois, novamente, 50% do volume da mistura de incubação é retirado e substituído pelo mesmo volume da solução de congelamento para a segunda etapa de incubação. Esse procedimento pode ser repetido tantas vezes quanto desejado, aumentando dessa maneira a concentração do crio-protetor em cada etapa de incubação. Se desejado, a última etapa de incubação pode ser realizada na solução de congelamento.
[0039] A expressão "secagem por congelamento", que também é conhecida como liofilização ou crio-dessecação, é usada em seu significado regular como o congelamento de uma amostra líquida, o que resulta na conversão da solução capaz de ser congelada em gelo, cristalização de solutos cristalizáveis e a formação de uma matriz amorfa que compreende solutos não cristalizáveis associados com uma mistura não congelada, seguida pela evaporação (sublimação) da água da matriz amorfa. Nesse processo, a evaporação (sublimação) da água congelada no material é geralmente realizada sob redução da pressão circundante para permitir que a água congelada no material sublime diretamente da fase sólida para a fase gasosa. A liofilização inclui tipicamente as etapas de pré-tratamento, congelamento, secagem primária e secagem secundária.
[0040] O pré-tratamento inclui qualquer método de tratamento do produto desejado, isto é, aqui células encapsuladas, antes do congelamento. O pré-tratamento pode, por exemplo, incluir a lavagem das células, revisão da formulação (isto é, adição de componentes para aumentar a estabilidade e/ou aperfeiçoar o processamento) ou diminuir a quantidade de um solvente de alta pressão de vapor ou aumentar a área superficial.
[0041] A etapa de congelamento inclui qualquer método que seja adequado para o congelamento das células encapsuladas. Em pequena escala, por exemplo, em um laboratório, o congelamento pode ser feito pela colocação do material em um frasco de liofilização e girando o frasco em um banho, também conhecido como "shell freezer" que é resfriado, por exemplo, pela refrigeração mecânica, por uma mistura de gelo seco com um álcool tal como metanol ou etanol ou por nitrogênio líquido. Também é possível usar um aparelho de liofilização comercialmente disponível tal como o Thermo Scientific® Modulo Freeze-Dry System distribuído por Thermo Fisher Scientific Inc. Em uma escala maior, o congelamento é feito usando geralmente uma máquina de liofilização comercial com temperatura controlada. Quando células encapsuladas são congeladas, o congelamento é geralmente realizado rapidamente, a fim de evitar a formação de cristais de gelo. Geralmente, as temperaturas de congelamento estão entre -50°C e -80°C.
[0042] A próxima etapa é a secagem primária. Durante a fase de secagem primária, a pressão é diminuída (tipicamente para a faixa de alguns milibares) e é fornecido calor suficiente ao material para sublimar a água. A quantidade de calor necessária pode ser calculada usando o calor latente de sublimação das moléculas sublimatórias. Nessa fase de secagem primária, cerca de 95% da água no material são sublimados. Essa fase pode ser lenta (pode ser de vários dias na indústria), por que se muito calor é adicionado, a estrutura do material pode ser alterada.
[0043] A secagem secundária pode suceder como a última etapa da liofilização. A fase de secagem secundária objetiva remover, se presentes, moléculas de água não congeladas já que o gelo foi removido na fase de secagem primária. Nessa fase, a temperatura é geralmente maior do que na fase de secagem primária e pode até estar acima de 0°C, para romper quaisquer interações físico-químicas que tenham se formado entre as moléculas de água e o material congelado. Geralmente, a pressão também está diminuída nesse estágio para encorajar a desabsorção (tipicamente na faixa de microbar ou frações de um pascal). Depois que o processo de liofilização está completo, o vácuo é geralmente interrompido com um gás inerte, tal como o nitrogênio, antes que as células encapsuladas liofilizadas sejam embaladas e/ou armazenadas para uso posterior.
[0044] Como evidenciado acima, o presente método pertence ao "pré-tratamento" como compreendido pela pessoa versada na técnica e pode ser usado junto com qualquer metodologia de congelamento e secagem de material tal como células livres ou encapsuladas como aqui descritas.
[0045] Consequentemente, como as pelo menos duas etapas consecutivas de incubação podem ser realizadas com quaisquer etapas de liofilização subsequentes adequadas, a invenção também está direcionada para um método de preparação de células encapsuladas para a liofilização, em que esse método compreende pelo menos duas etapas de incubação consecutivas, em que as células encapsuladas são incubadas em cada etapa de incubação em uma solução de incubação que contém o crio-protetor durante um período de tempo adequado, em que a concentração de crio-protetor na solução de incubação é aumentada com cada etapa de incubação subsequente. Portanto, embora a invenção a seguir seja explicada em mais detalhes com referência a um método de liofilização, deve ser compreendido que todas essas modalidades se referem igualmente ao método de preparação de células encapsuladas para liofilização como definido aqui.
[0046] No método da invenção qualquer número adequado de pelo menos duas etapas consecutivas de incubação pode ser realizado desde que o número seja suficiente para fornecer um efeito desejado, por exemplo, sobre a viabilidade das células encapsuladas depois da liofilização. Em modalidades ilustrativas, o método compreende 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 etapas de incubação, em que em cada etapa de incubação a concentração do crio-protetor é aumentada. A incubação em cada uma das etapas de incubação pode ser realizada durante qualquer quantidade de tempo adequada, por exemplo, um período de tempo que é descoberto ser capaz de obter uma estabilidade em longo prazo desejada das cápsulas e/ou a viabilidade das células encapsuladas. Um tempo de incubação adequado assim como um número adequado de etapas de incubação podem ser determinados empiricamente, por exemplo, pela avaliação da viabilidade das células encapsuladas depois da liofilização seguida (depois de um certo período de tempo) pela reidratação das células (cf. na Seção de Exemplo, nesse aspecto). Em algumas modalidades, o tempo de incubação é tipicamente cerca de vários minutos a cerca de várias horas por etapa de incubação (compare também com a seção de Exemplos, na qual as células bacterianas foram incubadas em cada etapa de incubação por cerca de 25 minutos). A incubação pode ser realizada sem agitação, mas também sob agitação (tal como, por exemplo, vibração ou rotação) para aperfeiçoar a absorção do crio-protetor pelo material de encapsulação e pelas células.
[0047] Em algumas modalidades do método da invenção, o mesmo crio-protetor ou uma mistura do mesmo crio-protetor é usado em cada etapa de incubação. O crio-protetor pode ser qualquer composto que seja capaz de fornecer proteção durante a liofilização contra o dano ao uso do material de encapsulação ou a célula encapsulada. Exemplos de crio-protetores adequados incluem, mas não são limitados a leite desnatado, glicerol, dimetilsulfóxido (DMSO), formamida, uma mistura de formamida e DMSO, N-metilacetamida (MA) polivinilpirrolidona, propanodiol (1,2-propanodiol ou 1,3-propanodiol ou uma mistura de ambos), propileno glicol, albumina sérica, uma mistura de albumina sérica com metanol, um carboidrato e alginato. Exemplos de alginatos que podem ser usados como crio-protetor incluem o alginato Satialgin e/ou o alginato Algogel® que são disponibilizados pela Cargill (cf. P. Capelaa et al, "Effect of cryoprotectants, prebiotics and microencapsulation on survival of probiotic organisms in yoghurt and freeze-dried yoghurt” Food Research International Volume 39, Issue 2, March 2006, Pages 203-211).
[0048] Exemplos de carboidratos que podem ser usados como crio- protetores incluem, mas não são limitados a sacarose, glicose misturada com metanol, lactose, trealose, rafinose, dextrano, pectina (por exemplo, UnipectineTM que também é disponibilizado pela Cargill e que também tem sido discutido como crio-protetor por P. Capelaa et al, Food Research International Volume 39, supra), hidroxietil amido (HES) e sulfato de celulose.
[0049] Também é possível usar na presente invenção uma mistura de dois ou mais crio-protetores na solução de incubação, por exemplo, mas sem se limitar a uma mistura de leite desnatado com glicerol ou uma mistura de leite desnatado com um carboidrato (cf. na Seção de Exemplos). Em tais modalidades, é possível que a concentração de apenas um dos crio-protetores esteja aumentada nas etapas de incubação consecutivas, enquanto a concentração do segundo (ou qualquer outro) crio-protetor é mantida constante durante o decorrer da incubação (veja também a seção de Exemplos). Em uma de tais modalidades, o crio-protetor, cuja concentração é mantida constante, pode ser escolhido entre sacarose, glicose misturada com metanol, lactose, trealose, rafinose ou dextrano. Em uma modalidade particular, a concentração de leite desnatado está aumentada em cada uma das pelo menos duas etapas de incubação consecutivas, embora a concentração do carboidrato (por exemplo, sacarose, glicose misturada com metanol, lactose, trealose, rafinose ou dextrano) é mantida constante nas pelo menos duas etapas de incubação consecutivas.
[0050] Qualquer célula (encapsulada) adequada pode ser usada na presente invenção. A célula encapsulada pode ser uma célula eucariótica ou uma célula procariótica ou uma mistura de várias células eucarióticas ou várias células procarióticas. As células também podem ser uma mistura de células eucarióticas com células procarióticas. Exemplos de células eucarióticas incluem, mas não são limitadas a células de mamíferos, células fúngicas ou células de levedura. Um exemplo puramente ilustrativo para células de mamífero são as células epiteliais pigmentadas da retina humana (RPE) descritas por Wikstrom et al. "Viability of freeze dried microencapsulated human retinal pigment epithelial cells” Eur. J. Pharm. Sci. Volume 47, Issue 2, 29 September 2012, Pages 520-526 ou as células-tronco mesenquimais descritas por Gordon et al, 2001, "Recovery of human mesenchymal stem cells following dehydration and rehydration” Cryobiology 43, 182. Exemplos de células de levedura adequadas incluem Saccharomyces, Debaromyces, Candida, Pichia e Torulopsis, para mencionar apenas uns poucos exemplos ilustrativos. Exemplos de células fúngicas incluem, mas é claro que não são limitadas a Aspergillus, Rhizopus, Mucor ou Penicillium. As células procarióticas usadas na presente invenção podem ser células bacterianas. As células bacterianas podem ser células aeróbicas ou anaeróbicas. Em exemplos ilustrativos do método da invenção, as células bacterianas podem ser selecionadas do grupo que consiste em Bifidobacterium, Bacteroides, Clostridium, Fuso- bacterium, Melissococcus, Propionibacterium, Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus, Staphylococcus, Peptostrepococcus, Bacillus, Pediococcus, Micrococcus, Leuconostoc, Weissella, Aerococcus, Oenococcus, Geobacillus, Lactobacillus e uma mistura dessas células.
[0051] Em algumas modalidades do presente método, as células que são submetidas à incubação como aqui descrita são células probióticas. Exemplos de células probióticas adequadas incluem, mas não são limitadas a Saccharomyces cereviseae, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bifidobacterium angulatum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium longum, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casei subsp. casei, Lactobacillus casei Shirota, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus farciminus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus lacti, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus pentosaceus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus (Lactobacillus GG), Lactobacillus sake, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus termoto- lerans, Lactobacillus mucosae, Lactococcus lactis, Micrococcus varians, Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus acidilactici, Pediococcus halophilus, Streptococcus faecalis, Streptococcus thermophilus, Staphylococcus carnosus, Staphylococcus xylosus e misturas dessas células.
[0052] Em algumas modalidades da invenção, em particular quando células bacterianas ou células eucarióticas tais como leveduras são empregadas, as células estão em uma fase de crescimento exponencial quando são encapsuladas. Entretanto, é claro que também é possível encapsular e subsequentemente liofilizar células que estão em qualquer outra fase de crescimento, por exemplo, células de mamífero que estão crescendo para confluir (cf. nesse aspecto Wikstrom et al., Eur. J. Pharm. Sci. (2012) supra).
[0053] Em modalidades típicas da invenção, as células foram encapsuladas em uma microcápsula que possui uma parede da cápsula porosa. A parede porosa da cápsula (concha) pode compreender um material selecionado do grupo que consiste em um polímero de alginato, colágeno, gelatina, quitosana, agarose, um polímero de poli-lisina, um polímero de sulfato de celulose e suas combinações.
[0054] Nesse contexto, é observado que a expressão "encapsu- lação" é usada na presente invenção de acordo com seu significado convencional dentro da técnica. A encapsulação como usada aqui se refere ao processo de formação de um revestimento contínuo em volta de uma matriz interna ou célula que está totalmente contida dentro da parede da cápsula como um núcleo de material encapsulado. Encapsulação deve ser distinguida de "imobilização", que se refere à captura do material tal como células dentro ou através de uma matriz. Em contraste com a encapsulação, a imobilização é um processo aleatório que resulta em uma partícula de tamanho indefinido onde um percentual dos elementos imobilizados ficará exposto na superfície. A encapsulação ou microencapsulação (ambas as expressões são usadas aqui alternativamente) ajudam a separar o material do núcleo de seu ambiente, aperfeiçoando dessa maneira sua estabilidade e prolongando a vida útil do material do núcleo. A estrutura formada pelo agente de microencapsulação em volta da substancia do núcleo é conhecida como parede ou concha. As propriedades do sistema da parede são tipicamente planejadas para proteger o material do núcleo e para liberar potencialmente o material do núcleo sob condições específicas, enquanto permite que moléculas pequenas passem para dentro e para fora da parede porosa da cápsula (que atua como uma membrana). Qualquer cápsula e material de encapsulação podem ser submetidos ao método de liofilização como descrito aqui. As cápsulas podem, por exemplo, variar de submícron a vários milímetros de tamanho e podem ser de diferentes formas.
[0055] De acordo com a descrição acima, vários biopolímeros de grau alimentício tais como alginato, amido, goma xantana, goma guar, goma de alfarroba e goma carragena assim como proteínas do soro do leite têm sido testados como materiais para microencapsulação para proteger, por exemplo, células microbianas sensíveis ao ácido com sucesso variável. Para uma revisão recente veja Islam et al. "Microencapsulation of Live Probiotic Bacteria” J. Microbiol. Biotechnol. (2010), 20(10), 1367-1377. Todos esses materiais para encapsulação e também todas essas bactérias probióticas podem ser usados na presente invenção. Uma visão geral a cerca de todos os materiais para encapsulação e, por exemplo, células microbianas que podem ser usadas na presente invenção é dada no pedido de patente internacional WO 2012/101167, "Protection Of Microbial Cells From Acidic Degradation".
[0056] O polímero de alginato, se usado aqui como material de encapsulação desejado para células, poderá ser um polímero de alginato puro, um polímero de alginato-amido modificado, polímero de alginato-inulina-goma xantana e polímero de poli-L-lisina, um polímero de quitosana/alginato e um polímero de quitosana/xantana. Numerosos exemplos de tais materiais de encapsulação de alginato estão descritos em Wikstrom et al., supra ou no pedido de patente internacional WO 2012/101167 e nas referências citadas nesse pedido internacional.
[0057] Em outras modalidades da invenção, o material de encapsulação pode ser um polímero de sulfato de celulose. Esse polímero pode ser qualquer polímero de sulfato de celulose conhecido incluindo, mas não limitado a um polímero de sulfato de celulose que compreenda um complexo formado por sulfato de sódio e celulose (NaCS)/ cloreto de poli[dialil(dimetil)amônio] (pDADMAC). Numerosos exemplos de tais materiais de encapsulação de alginato estão descritos no pedido de patente internacional WO 2012/101167 e nas referências citadas nesse pedido internacional.
[0058] Em modalidades do presente método de liofilizar uma célula encapsulada (ou o método de preparação de uma célula encapsulada para a liofilização), as células encapsuladas são transferidas, depois de pelos menos duas etapas de incubação consecutivas, para um meio de liofilização adequado sem uma etapa de lavagem intermediária. Por "etapa de lavagem" é entendido, em particular, uma etapa na qual as células incubadas são contatadas com um tampão/meio de lavagem que é isento do crio-protetor.
[0059] Em outras modalidades, as células encapsuladas tais como as células bacterianas, são liofilizadas em um meio de liofilização adequado depois da última etapa de incubação. Nessas modalidades, o meio de liofilização também pode conter um crio-protetor. Nessas modalidades, o meio de liofilização contém o mesmo crio-protetor como a solução de incubação.
[0060] Exemplos de crio-protetores adequados que podem ser usados na etapa de congelamento (que pode ser realizada depois do método da presente invenção) incluem, mas não são imitados a leite desatado, glicerol, dimetilsulfóxido (DMSO), formamida, uma mistura de formamida e DMSO, N-metilacetamida (MA) polivinilpirrolidona, propanodiol (1,2-propanodiol ou 1,3-propanodiol ou uma mistura de ambos), propileno glicol, albumina sérica, uma mistura de albumina sérica com metanol, um carboidrato e alginato, para mencionar novamente apenas uns poucos exemplos ilustrativos.
[0061] Exemplos de crio-protetores baseados em carboidrato adequados incluem, mas não são limitados a sacarose, glicose misturada com metanol, lactose, trealose, rafinose, dextrano, pectina, hidroxietil amido (HES) e sulfato de celulose.
[0062] Em modalidades típicas dessa etapa de congelamento, o meio de liofilização é uma solução aquosa que contém o um ou mais crio-protetores que foram escolhidos para a etapa de congelamento.
[0063] De acordo com a descrição acima, a presente invenção também está direcionada a uma célula encapsulada liofilizada que é obtida por um método aqui descrito. Também é abrangida pela invenção uma composição que compreende uma célula encapsulada como aqui descrita, junto com um veículo adequado. O veículo pode ser qualquer veículo convencional que seja, por exemplo, usado em farmacêuticos, cosméticos ou alimentos. De acordo com isso, uma composição da invenção pode ser um suplemento alimentício, uma composição cosmética ou uma composição farmacêutica.
[0064] Exemplos de composições cosméticas, nas quais uma célula encapsulada da invenção pode ser incluída são composições tópicas tais como sabões (líquidos ou sólidos), loções, maquiagem, cremes, géis de banho, sais de banho ou xampus. Exemplos ilustrativos de tais composições incluem células bacterianas probióticas tais como Lactobacillus, Bifidobacterium ou Bacillus coagulans (por exemplo, a cepa GanedenBC30® (Bacillus coagulans GBI-30, 6086 de Ganeden Biotec, Cleveland, Ohio, USA. Tal composição cosmética pode, por exemplo, ser usada para melhorar a hidratação da pele, elasticidade, inchaço sob os olhos ou para reduzir linhas finas e rugas em humanos.
[0065] Se uma célula encapsulada obtida na invenção ou uma composição que contém tal célula encapsulada é usada como suplemento para um alimento, o alimento pode ser, por exemplo, um cereal ou um produto baseado em leite tal como um iogurte, coalhada, pudim, queijo cottage ou manteiga. Se usada como um aditivo para um alimento tal como iogurte ou pudim, uma célula encapsulada da invenção ou uma composição que contenha uma célula encapsulada da invenção pode ser armazenada em um compartimento separado de uma embalagem para alimento que contenha o alimento. Por exemplo, o compartimento separado pode ser flexível para permitir o esvaziamento de seu conteúdo, ou seja, as células encapsuladas da invenção ou uma respectiva composição em outro compartimento da embalagem do alimento que está cheio, por exemplo, com iogurte ou pudim. O uso de tal compartimento separado permite adicionar, por exemplo, células probióticas encapsuladas ao alimento apenas antes do consumo.
[0066] De acordo com essa descrição, a invenção também está direcionada para vários usos farmacêuticos ou nutracêuticos. Tais usos incluem, mas não são limitados a tratar ou prevenir a diarreia, diarreia causada por antibióticos, artrite, obesidade, síndrome do intestino irritável, azia, síndrome da fadiga crônica e outras formas de sofrimento de uma população bacteriana intestinal desequilibrada. Para tais usos, as células encapsuladas da invenção ou uma composição que contenha tais células encapsuladas são administradas a um indivíduo, geralmente um mamífero tal como um humano ou animal doméstico ou animal de criação tais como gatos, cães, carneiros, vacas, porcos, aves domés-ticas ou peixes, para nomear apenas alguns exemplos ilustrativos.
[0067] A invenção é direcionada adicionalmente para uma composição que é adequada para o congelamento de células, em que as células podem ser células encapsuladas ou livres (não encapsuladas). Tal composição compreende leite desnatado, glicerol e um carboidrato. Portanto, essa composição pode ser uma solução de congelamento ou solução de criopreservação) que pode ser usada em qualquer metodologia de liofilização como aqui descrita e também como conhecida na técnica. Tal composição, portanto, compreende um veículo para os crio-protetores (isto é, leite desnatado, glicerol e um carboidrato). O veículo é tipicamente água (pura) ou uma solução aquosa que contém sais, por exemplo.
[0068] Em modalidades dessa composição, o carboidrato pode ser, mas não está limitado a sacarose, glicose misturada com metanol, lactose, trealose, rafinose, dextrano, pectina, hidroxietil amido (HES) e sulfato de celulose e misturas de tais carboidratos. Em algumas modalidades, o carboidrato é a sacarose, lactose, rafinose ou trealose.
[0069] O leite desnatado pode estar presente em qualquer concentração adequada que forneça proteção suficiente para as células ou células encapsuladas durante o congelamento. Em modalidades ilustrativas, o leite em pó pode estar presente em uma composição (solução congelante) da invenção em uma concentração de cerca de 1% (p/v) a cerca de 10% (p/v). Nesse contexto, é observado que o leite desnatado (também conhecido como leite desengordurado) é usado em seu significado regular para se referir ao leite que obtido quando toda a nata (também chamado de gordura do leite) é removida do leite integral. Qualquer leite desnatado/leite desengordurado que esteja disponível pode ser usado na solução/composição de congelamento da invenção. Tipicamente o leite desnatado em pó é usado para a preparação da composição de congelamento da invenção. Portanto, a concentração de leite desnatado dada aqui é referida como % em peso de leite desnatado com base no volume da solução de congelamento.
[0070] O glicerol também pode estar presente em uma composição da invenção em qualquer concentração adequada que forneça proteção suficiente para as células ou células encapsuladas durante o congelamento. Em modalidades ilustrativas, o glicerol pode estar presente em uma solução de congelamento da invenção em uma concentração de cerca de 0,2% (p/v) a cerca de 5% (p/v).
[0071] O carboidrato também pode estar presente em uma composição da invenção em qualquer concentração adequada que forneça proteção suficiente para as células ou células encapsuladas durante o congelamento. Em modalidades ilustrativas, o carboidrato pode estar presente em uma solução de congelamento da invenção em uma concentração de cerca de 1% (p/v) a cerca de 15% (p/v).
[0072] Em modalidades ilustrativas de tal composição, o leite desnatado está presente em uma concentração de cerca de 3% (p/v) a cerca de 8% (p/v), o glicerol está presente em uma concentração de cerca de 0,5% (p/v) cerca de 2% (p/v) e o carboidrato está presente em uma concentração de cerca de 5% (p/v) a cerca de 13% (p/v). Em uma modalidade ilustrativa adicional, a composição de congelamento da invenção contém cerca de 5% (p/v) de leite desnatado, cerca de 1% (p/v) glicerol e cerca de 10% (p/v) de carboidrato. Apenas como ilustração, é observado aqui que tal solução pode ser preparada pela pesagem de 1g de glicerol, 5g de leite em pó desnatado e 10g de trealose em um dispositivo de mediação graduado de 100 mL. Portanto, o volume da solução é de 100 mL com água esterilizada duplamente destilada.
[0073] De acordo com a descrição acima, uma composição da invenção que contenha leite desnatado, glicerol e um carboidrato pode ser usada para congelar células encapsuladas como aqui descrito. Entretanto, tal composição da invenção que contém leite desnatado, glicerol e um carboidrato pode ser usada também para a preparação de células encapsuladas para a liofilização, ou seja, na incubação consecutiva de células encapsuladas com concentrações crescentes de crio- protetor como aqui descrito. Consequentemente, a invenção também está direcionada para um método de preparação de células encapsuladas para a liofilização, cujo método compreende incubar as células em uma composição da invenção que contenha leite desnatado, glicerol e um carboidrato.
[0074] A invenção será ilustrada adicionalmente pelos seguintes exemplos experimentais não limitantes.
EXEMPLOS Exemplo 1: Liofilização com adição gradativa de crio-protetor à solução de incubação
[0075] Dados experimentais:
[0076] As bactérias probióticas Lactobacillus acidophilus foram encapsuladas, liofilizadas, reidratadas e testadas quanto à atividade metabólica como uma medida da viabilidade. As cápsulas foram analisadas quanto à integridade estrutural depois da liofilização e da reidratação. Encapsulação bacteriana
[0077] Uma cultura de bactérias de Lactobacillus acidophilus em uma densidade óptica de 1 OD em um comprimento de onda de 600nm, foi coletada e encapsulada em sulfato de sódio e celulose e cloreto de poli-dialil dimetil amônio (pDADMAC - também conhecido com o seu nome da International Nomenclature Cosmetic Ingredient (INCI) Ge18). As bactérias encapsuladas foram cultivadas em meio de Man, Rogosa e Sharpe (MRS) a 37°C com agitação a 50 rpm. Crio-dessecação (Liofilização)
[0078] As bactérias encapsuladas e as bactérias livres foram congeladas em um banho de etanol/gelo seco usando a adição gradativa de leite desnatado 5%, glicerol 1% ou DMSO em água estéril duplamente destilada como crio-protetor e depois armazenadas a - 80°C. O meio de congelamento para as bactérias livres é o mesmo das bactérias encapsuladas exceto que ele não foi adicionado de modo gradativo.
[0079] Para as células bacterianas encapsuladas, os crio-protetores foram adicionados de uma maneira gradativa como a seguir:
[0080] Procedimento geral (para a "diluição seriada" do meio de cultura:
[0081] Usando um máximo de 1000 cápsulas por ml ou qualquer múltiplo desse, as cápsulas (contendo as bactérias) foram colocadas em um tubo falcon de 50 mL contendo meio MRS fresco. A essa suspensão celular (solução de incubação), 0,5 mL/mL de meio de congelamento foram adicionados como crio-protetor para fornecer um meio de congelamento com uma concentração de 50% do crio-protetor (v/v). Em termos ilustrativos, se o volume total da suspensão celular era de 1 mL, então 0,5 mL de meio foram removidos e 0,5 mL de meio de congelamento para fornecer uma diluição de 50% de ambos. As células encapsuladas foram incubadas por 25 minutos e depois 50% adicionais (v/v) da solução de incubação foram trocados pelo meio de criopreservação (isto é, no caso de um volume total de 1 mL, então 0,5 mL foram removidos e 0,5 mL de meio de congelamento foram adicionados para fornecer uma concentração de 75% (v/v) do meio de congelamento. A incubação foi realizada de novo por 25 minutos antes em etapas subsequentes, novamente 50% do meio de incubação foi substituído por meio de congelamento. Na última etapa de incubação, o meio das cápsulas é de 100% meio de congelamento. (86) Adição gradativa de crio-protetor DMSO
[0082] 16 cápsulas foram colocadas em um tubo falcon de 50 mL contendo 9 ml de meio MRS fresco. A essa suspensão celular (solução de incubação), 200 μl de DMSO foram adicionados como crio-protetor para fornecer uma concentração inicial de DMSO de aproximadamente 2% (v/v). As células encapsuladas foram incubadas por 25 minutos e depois mais 200 μl de DMSO foram adicionados para fornecer uma concentração de DMSO de cerca de 4,2% (v/v). A incubação foi realizada novamente por 25 minutos antes em 3 etapas subsequentes, um adicional de 200 μl de DMSO foram adicionados para fornecer uma concentração de DMSO de 10% (1 mL de DMSO em 10 mL de solução de incubação). (87) Adição gradativa de uma mistura de leite desnatado/glicerol como crio-protetor (leite desnatado 5% e glicerol 1% em água)
[0083] Nesse exemplo, 100 cápsulas grandes feitas a mão foram colocadas em um tubo falcon de 50 mL contendo 9 ml de meio MRS fresco. 5 mL de meio MRS foram retirados do tubo falcon e 5 mL de uma solução de incubação contendo leite desnatado como crio-protetor (leite desnatado 5% (p/v) e glicerol 1% (p/v) em água) foram adicionados nas etapas de incubação consecutivas subsequentes. Nesse experimento, foram realizadas seis etapas de incubação, nas quais a concentração do crio-protetor foi aumentada na ordem de 50%, 75%, 87,5%, 93,5%, 97% e 100%, significando que na última etapa de incubação as células encapsuladas estão no meio de congelamento. O período de incubação em cada etapa depois da adição do crio-protetor de leite desnatado foi de aproximadamente 25 minutos. No final de cada etapa de incubação, as cápsulas depositaram através da gravidade, permitindo dessa maneira que o meio de incubação seja removido através de pipetação. Depois da última etapa de incubação com leite desnatado 5% (p/v) e glicerol 1% (p/v) em água, ambas as bactérias encapsuladas congeladas e bactérias livres foram então diretamente submetidas nessa solução de congelamento (isto é, sem qualquer etapa de lavagem) à liofilização por uma noite. Para a liofilização, primeiramente as cápsulas mais meio de congelamento 100% são congelados instantaneamente usando um banho de etanol/gelo seco 96%. O pélete congelado pode então ser armazenado a -80°C ou enviado para a liofilização imediatamente. Qualquer máquina de liofilização pode ser usada para o processo de liofilização seguindo as instruções do fabricante. Para os presentes experimentos, o equipamento Thermo Scientific ModulyoD-230 foi usado. Os resultados desses experimentos são mostrados na Figura1 a Fgura 9. Como pode ser visto a partir das imagens de microscopia em campo claro das cápsulas da Figura 1, a incubação consecutiva das cápsulas no método da presente invenção fornece, depois da reidratação, uma encapsulação intacta e, portanto, intensifica a integridade estrutural da encapsulação. Veja também, com relação a isso, as imagens mostradas na Figura 4 e na Figura 5, que mostram que as cápsulas de sulfato de celulose que foram tratadas usando uma modalidade do método inventivo (usando concentrações crescentes de leite desnatado nas etapas de incubação) e depois liofilizadas em nitrogênio líquido ou etanol/gelo seco, mantêm sua forma esférica original com uma superfície lisa depois da reidratação enquanto que, como evidenciado pelas imagens mostradas nas Figuras 6 a 9, as cápsulas que foram liofilizadas em vários tampões sem crio-protetor estão danificadas em grande extensão ou destruídas.
[0084] Em adição à manutenção da integridade estrutural das cápsulas com as células aí contidas, o método de liofilização da invenção também fornece uma sobrevida significativamente maior das células encapsuladas. A Figura 2 mostra o efeito protetor das cápsulas (intactas) sobre as bactérias testadas durante a liofilização quando se usa na preparação do congelamento, uma solução de incubação que contém quantidades crescentes de leite desnatado e glicerol como crio- protetores. O efeito protetor foi examinado pelo teste de viabilidade que foi feito um dia depois da liofilização seguida pela reidratação das bactérias liofilizadas. A viabilidade foi comparada com células bacterianas encapsuladas recentemente como referência e é expressa em % de viabilidade. Como ilustrado na Figura 2, depois de serem submetidas ao método de liofilização da invenção, as cápsulas protegem as bactérias da liofilização (viabilidade de 98% nas bactérias encapsuladas comparada com 25% de viabilidade nas células livres), significando que a viabilidade das bactérias encapsuladas é significativamente maior do que aquela das bactérias livres.
[0085] A Figura 3 mostra a comparação das duas soluções de incubação diferentes usadas no presente exemplo (solução de incubação 1: meio MRS contendo quantidades crescentes de DMSO como crio-protetor, solução de incubação 2 contendo quantidades crescentes de leite desnatado com relação à sobrevida das bactérias durante a liofilização. Como ilustrado na Figura 3, a incubação com uma concentração crescente de leite desnatado (apesar de haver glicerol como um crio-protetor adicional) fornece uma taxa de sobrevida inalterada em comparação com as células bacterianas recentemente encapsuladas que não foram submetidas a liofilização, enquanto que o tratamento com DMSO funciona, mas é menos eficiente com uma taxa de sobrevida de apenas 9%.
Exemplo 2: Efeito da trealose e do leite desnatado como crio-protetores sobre a sobrevida de Lactobacillus encapsulados em sulfato de sódio e celulose
[0086] Nesse exemplo, a sobrevida de Lactobacillus acidophilus encapsulados liofilizados foi testada com ou sem trealose 10% como um crio-protetor suplementar quando armazenado sob condições ambientais. A solução de liofilização que também foi usada para a etapa de incubação consecutiva era uma solução aquosa contendo leite desnatado 5% (p/v), glicerol 1% (p/v) e trealose 10% (p/v).
[0087] Detalhes Experimentais:
[0088] Um frasco previamente congelado das bactérias probióticas, Lactobacillus acidophilus foi descongelado de -80°C e 20 μl foram adicionados em 50 mL de meio MRS. As bactérias foram subsequentemente cultivadas por uma noite a 37°C com velocidade de agitação de 50 rpm. No dia seguinte, a densidade óptica da cultura bacteriana foi determinada a 600 nm (OD600) em um Tecan Infinite M200. Tipicamente, uma leitura em OD600 de 1 corresponde a quando as bactérias estão na fase de crescimento exponencial. As bactérias devem estar na fase de crescimento exponencial quando encapsuladas.
[0089] Para a encapsulação das bactérias, 100 ul de uma cultura bacteriana com uma leitura de OD600 de 1 foram misturados com 2 ml de sulfato de sódio e celulose 1,8% contendo cloreto de sódio 0,9%. Uma seringa de 5 mL e uma agulha 23G foram usadas para o processo de encapsulação. A cultura de bactérias foi misturada com o sulfato de sódio e celulose e gotejada em um banho de congelamento contendo 150 mL de pDADMAC 1,3% (24 kDa), cloreto de sódio 0,9%. As cápsulas foram deixadas congelar no pDADMAC por 4 min. Subsequentemente, 300 mL de 1X Salina Tamponada com Fosfato foram adicionados e as cápsulas lavadas por 8 min. 300 mL de solução de lavagem foram então removidos e 400 mL adicionais de PBS foram adicionados e as cápsulas lavadas por um adicional de 4 min. A solução de lavagem foi então drenada e um adicional de 3 x 100 mL de lavagem com PBS, depois 3 x 30 mL de MRS fresco foi realizado. As cápsulas foram então transferidas para um frasco cônico de 250 mL com 100 mL de meio MRS fresco. Essas cápsulas foram cultivadas por uma noite a 37°C com uma velocidade de agitação de 50 rpm.
[0090] Para as bactérias livres, 5 mL da cultura da noite de células de Lactobacillus com uma OD600 = 1, foram transferidos para um tubo falcon de 15 mL e centrifugados a 3000 g por 5 min. O pélete bacteriano foi suspenso novamente em 5 mL de meio de criopreservação (leite desnatado 5% (p/v), glicerol 1% (p/v) em água) com ou sem trealose 10% (p/v). As bactérias suspensas novamente foram então aliquotadas em porções de 10 x 0,5 mL em tubos falcon de 15 mL. 5 μL das células suspensas novamente foram colocados em cada um dos 4 poços de uma placa de 96 poços e um ensaio com Alamar Blue foi realizado para determinar a atividade metabólica das células bacterianas. Alamar Blue® é um indicador da viabilidade celular comprovado que usa o poder de redução natural das células vivas para converter a resazurina na molécula fluorescente, resorufina. A resazurina, um corante indicador não fluorescente, é convertida em resorufina vermelha brilhante fluorescente através de reações de redução de células metabolicamente ativas. A quantidade de fluorescência produzida é proporcional ao número de células vivas. 100 μL de meio MRS fresco e 10 μL do reagente Alamar Blue foram adicionados a 5 μL de amostra de bactéria e as amostras incubadas a 37°C com uma velocidade de agitação de 50 rpm por 1 h. A placa de ensaio de Alamar Blue foi lida em um Tecan Infinite M200. O resto das células bacterianas livres no meio crio-protetor é congelado em um banho de etanol/gelo seco e depois armazenadas a -80°C.
[0091] Depois de cultivar por uma noite, as cápsulas contendo as bactérias foram lavadas com 3 x 50 mL de meio MRS fresco no frasco de 250 mL primeiro e depois colocadas no tubo falcon de 15 mL com 10 mL de meio MRS fresco. 5 mL de meio MRS foram retirados e 5 mL de meio de criopreservação (como para as bactérias livres) com ou sem trealose 10% (p/v) foram adicionados. As cápsulas foram incubadas nessa suspensão por 25 minutos, depois 5 mL do meio foram removidos e substituídos por 5 mL de meio de criopreservação fresco (com ou sem trealose 10% como apropriado). Esse procedimento foi repetido por um adicional de 4 vezes, elevando assim a proporção de meio de criopre- servação de 50% depois da primeira adição do meio de criopreservação para 98,5% finalmente. Subsequentemente, 1 cápsula do meio foi colocada em cada um dos 4 poços de uma placa de 96 poços e um ensaio com Alamar Blue foi realizado para determinar o nível de atividade metabólica das células bacterianas nas cápsulas. 10 μL de reagente Alamar Blue e 100 ul de meio MRS fresco foram adicionados a cada poço contendo as cápsulas e as amostras incubadas a 37°C com uma velocidade de agitação de 50 rpm por 1 h. A placa de ensaio com Alamar Blue foi lida em um Tecan Infinite M200. 4 cápsulas do meio de criopreservação foram colocadas em tubos falcon de 15 mL com 500 μL de solução de liofilização aquosa contendo leite em pó 5%m com ou sem trealose 10% (conforme apropriado). Essas cápsulas foram então congeladas e uma banho de etanol/gelo seco e depois armazenadas a -80°C.
[0092] Os tubos falcon contendo as bactérias livres ou as cápsulas com o leite desnatado crio-protetor com ou sem trealose 10% foram liofilizados por uma noite usando um liofilizador ThermoScientific Modulyo D-230. Para testar a sobrevida das bactérias liofilizadas, em cada ponto de tempo amostras em duplicata dos Lactobacillus livres liofilizados e dos Lactobacillus encapsulados foram reidratadas usando 500 μL de água Millipore ou 5 a 10 mL de meio mRS, respectivamente, por 5 min. Um ensaio com Alamar Blue foi então realizado em ambos Lactobacillus livres e Lactobacillus em cápsulas. O ensaio consistiu em replicatas quadruplicadas de cada uma das seguintes condições para cada uma das amostras em duplicata:
[0093] 1. Amostras em branco (100 μL de meio MRS + 10 μL de Alamar Blue)
[0094] 2. Amostras de Lactobacillus livres liofilizados com trealose (5 μL de cultura reidratada + 100 μL de meio MRS + 10 μL de Alamar Blue)
[0095] 3. Amostras de Lactobacillus livres liofilizados sem trealose (5 μL de cultura reidratada + 100 μL de meio MRS + 10 μL de Alamar Blue)
[0096] 4. Amostras de bactérias encapsuladas liofilizadas com trealose (1 cápsula por poço + 100 μL de meio MRS + 10 μL de Alamar Blue)
[0097] 5. Amostras de bactérias encapsuladas liofilizadas sem trealose (1 cápsula por poço + 100 μL de meio MRS + 10 μL de Alamar Blue)
[0098] As amostras foram incubadas a 37°C com uma velocidade de agitação de 50 rpm por 1 h. A placa de ensaio com Alamar Blue foi lida em um Tecan Infinite M200, Os pontos de tempo nos quais as amostras foram reidratadas foram as semanas 1, 2, 3, 4, 6, 7 e 8 depois da liofilização para avaliar a viabilidade das bactérias depois da criopreservação com leite desnatado 5%, glicerol 1% e com ou sem trealose 10% em temperatura ambiente durante um período de 2 meses depois da liofilização.
[0099] Os resultados desse experimento são mostrados na Figura 10. Cada ponto de tempo na Figura 10 representa a média de amostras em duplicata liofilizadas (cada amostra testada em quadruplicata) com duas exceções: bactérias livres com trealose 10% na semana 6 e bactérias encapsuladas com trealose na semana 8, onde em ambos os casos, uma amostra da duplicata estava completamente degradada (a razão disso não foi esclarecida) e não foi incluída. A taxa de sobrevida foi determinada em unidades relativas de fluorescência (RFU). Como pode ser visto na Figura 10, o método de liofilização inventivo no qual as células bacterianas encapsuladas são consecutivamente incubadas em uma solução que contém concentrações crescentes do meio de congelamento (contendo leite desnatado 5%, glicerol 1%, trealose 10%) como crio-protetor, fornece uma taxa de sobrevida de mais do que 60% das células e, portanto, uma melhora significativa para a taxa de sobrevida das células livres. Apesar dessa taxa de sobrevida de mais de 60% ter sido obtida para um período de armazenamento de duas semanas, para o tratamento das células com concentrações crescentes de leite desnatado apenas, a adição de trealose em uma concentração de 10% (p/v) conseguiu manter essa taxa de sobrevida significativamente aumentada pelo período de teste completo de 8 semanas, o que significa prolongar a vida útil das cápsulas/células encapsuladas. Esses resultados também mostram que o método da invenção e as células encapsuladas liofilizadas que podem ser obtidas por esse método, possuem perspectivas promissoras para aplicações comerciais para células tais como células probióticas (mas também para outras células) nas quais as células são armazenadas por um certo período de tempo até o uso.
Exemplo 3: Liofilização de Lactobacillus casei encapsulados usando uma composição que compreende leite desnatado, trealose e glicerol como crio-protetor
[00100] Um frasco previamente congelado das bactérias probióticas, Lactobacillus casei foi descongelado de -80°C e 20 μl foram adicionados em 50 mL de meio MRS. As bactérias foram subsequentemente cultivadas por uma noite a 37°C com velocidade de agitação de 50 rpm. No dia seguinte, a densidade óptica da cultura bacteriana foi determinada a 600 nm (OD600) em um Tecan Infinite M200. Tipicamente, uma leitura em OD600 de 1 corresponde a quando as bactérias estão na fase de crescimento exponencial. As bactérias devem estar na fase de crescimento exponencial quando encapsuladas.
[00101] Para a encapsulação das bactérias, 100 μL de uma cultura bacteriana com uma leitura de OD600 de 1 foram misturados com 2 ml de sulfato de sódio e celulose 1,8% contendo cloreto de sódio 0,9%. Uma seringa de 5 mL e uma agulha 23G foram usadas para o processo de encapsulação. A cultura de bactérias foi misturada com o sulfato de sódio e celulose e gotejada em um banho de congelamento contendo 150 mL de pDADMAC 1,3% (24 kDa), cloreto de sódio 0,9%. As cápsulas foram deixadas congelar no pDADMAC por 4 min. Subsequentemente, 300 mL de 1X Salina Tamponada com Fosfato foram adicionados e as cápsuas lavadas por 8 min. 300 mL de solução de lavagem foram então removidos e 400 mL adicionais de PBS foram adicionados e as cápsulas lavadas por um adicional de 4 min. A solução de lavagem foi então drenada e um adicional de 3 x 100 mL de lavagem com PBS, depois 3 x 100 mL de meio MRS fresco foi realizado. As cápsulas foram então transferidas para um frasco cônico de 250 mL com 100 mL de meio MRS fresco. Essas cápsulas foram cultivadas por uma noite a 37°C com uma velocidade de agitação de 50 rpm.
[00102] Depois de cultivar por uma noite, as cápsulas contendo as bactérias foram lavadas com 3 x 50 mL de meio MRS fresco no frasco de 250 mL primeiro e depois colocadas no tubo falcon de 15 mL com 10 mL de meio MRS fresco. 5 mL de meio MRS foram retirados e 5 mL de meio de criopreservação (leite desnatado 5% (p/v), glicerol 1% (p/v), trealose 10% (p/v) em água)) foram adicionados. As cápsulas foram incubadas nessa suspensão por 25 minutos, depois 5 mL do meio foram removidos e substituídos por 5 mL de meio de criopreservação fresco. Esse procedimento foi repetido por um adicional de 4 vezes, elevando assim a proporção de meio de criopreservação de 50% depois da primeira adição do meio de criopreservação para 98,5% finalmente.
[00103] Finalmente, cápsulas do meio de criopreservação foram colocadas em tubos falcon de 15 mL com 500 μL de solução de liofilização aquosa contendo leite desnatado 5%, glicerol 1% e trealose 10%. Essas cápsulas foram então congeladas em um banho de etanol/gelo seco e depois armazenadas a -80°C.
[00104] Como pode ser visto nas Figuras 11A a 11C que mostram as células encapsuladas antes e depois da encapsulação (Figura 11A mostra cápsulas de Lactobacillus casei imediatamente depois da encapsulação, Figura 11B mostra cápsulas de Lactobacillus casei um dia depois da encapsulação e a Figura 11C mostra cápsulas de Lactobacillus casei liofilizadas reidratadas), as cápsulas de Lactobacillus casei apareceram intactas depois da liofilização, significando não terem sido afetadas pela liofilização.
[00105] Em adição ao exame visual, a viabilidade das bactérias Lactobacillus casei encapsuladas foi avaliada antes da liofilização e depois da liofilização como explicado acima no Exemplo 2. Como pode ser visto na Figura 12, o resultado mostra que a viabilidade das bactérias Lactobacillus casei foi afetada pela liofilização, significando que a viabilidade completa foi conseguida depois da liofilização. Portanto, o Exemplo 3 confirma a eficácia e a adequabilidade do método de liofilização e a respectiva composição da presente invenção.
Exemplo 4: Liofilização de Bifidobacterium infantis longum usando uma composição que compreende leite desnatado, trealose e glicerol como crio-protetor
[00106] Bifidobacterium infantis longum são um exemplo de bactérias anaeróbicas estritas. As células foram cultivadas sob condições anaeró- bicas em meio MRS, a 37°C e 50 rpm por uma noite. Gaspak (BD) foi usado para criar um ambiente estritamente anaeróbico durante a cultura.
[00107] Depois do cultivo, as Bifidobactérias foram encapsuladas usando sulfato de sódio e celulose como descrito no Exemplo 2 e 3, entretanto, sob condições anaeróbicas. Depois da cultura por uma noite, as cápsulas contendo as bactérias foram lavadas com 3 x 50 mL de meio MRS fresco no frasco de 250 mL primeiro primeiro e depois colocadas em um tubo falcon de 15 mL com 10 mL de meio MRS fresco. 5 mL de meio MRS foram retirados e 5 mL de meio de criopreservação (com leite desnatado 5% (p/v), glicerol 1% (p/v), trealose 10% (p/v) em água) foram adicionados. As cápsulas foram incubadas nessa suspensão por 25 minutos, depois 5 mL do meio foram removidos e substituídos por 5 mL de meio de criopreservação fresco. Esse procedimento foi repetido por um adicional de 4 vezes, elevando assim a proporção de meio de criopreservação de 50% depois da primeira adição do meio de criopreservação para 98,5% finalmente.
[00108] Finalmente, cápsulas do meio de criopreservação foram colocadas em tubos falcon de 15 mL com 500 μL de solução de liofilização aquosa contendo leite em pó 5%, glicerol 1% e trealose 10%. Essas cápsulas foram então congeladas e um banho de etanol/gelo seco e depois armazenadas a -80°C.
[00109] Como pode ser visto na Figura 13, que mostra as células encapsuladas antes e depois da encapsulação (Figura 13A mostra cápsulas imediatamente um dia depois da encapsulação antes da liofilização, Figura 11B mostra cápsulas de Bifidobacterium infantis longum liofilizadas reidratadas), as cápsulas de Bifidobacterium infantis longum pareceram discretamente menos intactas depois da liofilização.
[00110] Em adição ao exame visual, a viabilidade das bactérias Bifidobacterium infantis encapsuladas foi avaliada antes da liofilização e depois da liofilização como explicado acima no Exemplo 2. Como pode ser visto na Figura 14, a viabilidade de Bifidobacterium infantis longun foi afetada de alguma maneira pela liofilização, já que a Figura 14 mostra que cerca de 50% das bactérias estavam viáveis depois da liofilização. Entretanto, é considerado que a viabilidade das bactérias Bifidobacterium infantis (não encapsuladas) será muito menor. Em adição, pode ser esperada uma maior viabilidade pelas cápsulas que são perfeitamente secas durante o processo de liofilização. Portanto, o Exemplo 4 também confirma a eficácia e a adequabilidade do método de liofilização e a respectiva composição da presente invenção.
[00111] A invenção, ilustrativamente descrita aqui pode ser adequadamente praticada na ausência de qualquer elemento ou elementos, limitação ou limitações não especificamente descritos aqui. Portanto, por exemplo, as expressões "compreendendo" "incluindo", "contendo", etc. devem ser lidas expansivamente e sem limitação. Adicionalmente, as expressões e termos empregados aqui têm sido usados como termos de descrição e não de limitação e não há intenção no uso de tais termos e expressões de excluir quaisquer equivalentes dos aspectos mostrados e descritos ou porções desses, mas é reconhecido que várias modificações são possíveis dentro do escopo da invenção reivindicada. Portanto, deve ser compreendido que embora a presente invenção tenha sido descrita especificamente pelas modalidades exemplificadoras e aspectos opcionais, a modificação e variação das invenções incorporadas aqui descritas, podem ser utilizadas por aqueles versados na técnica e que tais modificações e variações são consideradas estar dentro do escopo dessa invenção.
[00112] A invenção foi descrita amplamente e genericamente. Cada uma das espécies mais restritas e grupos subgenéricos que estão dentro da descrição genérica, também fazem parte da invenção. Isso inclui a descrição genérica da invenção com uma condição ou limitação negativa de remover qualquer assunto em questão de gênero, não obstante o material removido ter sido ou não especificamente citado aqui.
[00113] Outras modalidades estão dentro das reivindicações em anexo. Em adição, onde características ou aspectos da invenção estão descritos em termos de grupos de Markush, aqueles versados na técnica reconhecerão que a invenção também está descrita em termos de qualquer membro individual ou subgrupo de membros do grupo de Markush.

Claims (5)

1. Composição adequada para congelar células encapsuladas, caracterizada pelo fato de que compreende leite desnatado, glicerol e um carboidrato, em que o leite desnatado está presente em uma concentração de 3% (p/v) a 8% (p/v), glicerol está presente em uma concentração de 0,5% (p/v) a 2% (p/v) e o carboidrato é trealose e está presente em uma concentração de 5% (p/v) a 13% (p/v).
2. Uso de uma composição, como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é para o congelamento de células encapsuladas, em que as células encapsuladas são células bacterianas ou células de levedura.
3. Uso, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que as células de levedura são selecionadas a partir do grupo consistindo em Saccharomyces, Debaryomyces, Candida, Pichia e Torulopsis.
4. Uso, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que as células bacterianas são selecionadas a partir do grupo consistindo em Bifidobacterium, Bacteroides, Clostridium, Fusobacterium, Melissococcus, Propionibacterium, Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus, Staphylococcus, Peptostreptococcus, Bacillus, Pediococcus, Micrococcus, Leuconostoc, Weissella, Aerococcus, Oenococcus, Geobacillus e Lactobacillus.
5. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, caracterizado pelo fato de que as células são células probióticas, preferencialmente em que as células probióticas são selecionadas a partir do grupo consistindo em Saccharomyces cerevisiae, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bifidobacterium angulatum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium longum, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casei subsp. casei, Lactobacillus casei Shirota, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus farciminus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus lacti, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus pentosaceus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus (Lactobacillus GG), Lactobacillus sake, Lactobacillus salivarius, Lactococcus lactis, Micrococcus varians, Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus acidilactici, Pediococcus halophilus, Streptococcus faecalis, Streptococcus thermophilus, Staphylococcus carnosus, e Staphylococcus xylosus.
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