CN115024310A - 一种细胞冻干保存剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种细胞冻干保存剂及其制备方法，该细胞冻干保存剂包括能够与生物制品活性组分的分子形成氢键的冻干保护剂，冻干保护剂包括糖类物质和用于促进糖类的保护作用的聚合物，糖类物质为海藻糖、蔗糖中的一种或两种组合，聚合物能够是白蛋白，该冻干保护剂还包括支撑物，支撑物能够为细胞提供网格状的透明的支架，使细胞能够粘附在玻片上，并保护细胞的完整性，其中，支撑物能够是低熔点琼脂糖。该细胞冻干保存剂还包括用于维持溶液pH值的冻干缓冲液、冻干缓冲液为三羟甲基氨基甲烷‑盐酸缓冲液、磷酸缓冲液、4‑羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液中的一种或者多种组合。

Description

一种细胞冻干保存剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及医学检验技术领域，尤其涉及一种细胞冻干保存剂及其制备方法。
背景技术
基于细胞转染的间接荧光法(CBA)一直是自身免疫疾病的主要检测手段，利用细胞表达全长抗原蛋白，并完成蛋白折叠等蛋白修饰，能够最大程度体现抗原天然空间构象，有利于抗原和抗体反应，因此CBA法的灵敏度、特异度明显高于其他检测方法，例如Elisa。CBA法检测常见于实验室，但是做成产品需要克服细胞无法长期保存的问题。
在生物制品的冷冻干燥过程中，主要有三种效应会导致生物制品中活性组分的变性：低温效应、冻结效应和脱水效应。低温效应，生物制品中活性组分在降温与复温过程的一定温度范围内会发生变性。如对卵清蛋白(ovalbumin)的研究发现，在-10℃～-40℃之间，其活性显著降低，而继续降温到在-192℃，活性几乎没有变化；冻结效应(包括离子浓度的增加、冰晶的形成与生长、pH值变化以及相分离等)，在生物制品的冻结过程中，不断结晶会导致溶液的浓度快速升高。小分子糖在最大冻结浓缩基质中的计算浓度高达80％。当溶液浓度发生变化时，离子浓度增加，促进了化学反应。在生物制品溶液在冻结过程中也会产生大量的冰-水界面。其中活性组分分子，如蛋白质，可能会被吸附到界面上，从而可能破坏蛋白质的天然褶皱结构，最终导致蛋白质变性。在有些生物制品溶液的冻结过程中，溶液的pH值也会发生变化。如在添加有pH值为7的磷酸盐缓冲液(NaH2PO4和Na2HPO4的摩尔比为0.72)的蛋白质溶液冻结过程中，由于NaH2PO4的溶解度远远大于Na2HPO4，当溶液达到三相共晶点时，它们之间的摩尔比为57，最终导致了pH值的很大改变。蛋白质发生物理聚集和化学变性。脱水效应：水溶液中蛋白质经过充分水合作用后，在蛋白质分子表面附着一单层水，这就是所说的水合层(hydration shell)。一般来讲，参与完全水合作用的水含量为0.3～0.35g(水)/g(蛋白质)。而在冻干蛋白质产品中水的含量一般不超过10％，因此，必定有一部分结合水在干燥过程中被除去。结合水的去除很可能破坏蛋白质的天然结构，最终导致蛋白质变性。这是因为富含结合水的蛋白质在脱水过程中暴露在乏水环境中，将质子转化为带电羧酸基团，破坏了蛋白质中电荷平衡，电荷密度的降低可能促进蛋白质分子之间的疏水作用，从而使蛋白质发生聚集。
低分子量化合物：又可以分为酸性物质、中性物质和碱性物质。酸性物质主要为谷氨酸、天冬氨酸、苹果氨酸、乳酸等；中性物质主要为葡萄糖、肌醇、乳糖、蔗糖、棉籽糖、海藻糖、山梨醇D、L-苏氨酸、肌醇、木糖醇等；碱性物质主要为精氨酸和组氨酸等。高分子化合物：主要如白蛋白、明胶、蛋白胨、可溶性淀粉、糊精、肉汁、果胶、阿拉伯胶、羟甲基纤维素、藻类等以及天然混合物如脱脂牛奶、血清等。一般认为，低分子化合物在冻干过程中直接发挥作用；而高分子化合物则是促进低分子化合物的保护作用。因此，制备保护剂配方时，一般多将低、高分子化合物配合使用。
冻干保护剂(lyoprotectant)：在冻结和干燥过程中，可以防止活性组分发生变性的物质，如甘油、二甲亚砜(DMSO)、海藻糖、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等；
抗氧化剂(antioxidant)：用作防止生物制品在冷冻干燥过程以及贮藏过程中发生氧化变质的物质，如维生素D、维生素E、蛋白质水解物、硫代硫酸钠等，将不同的抗氧化剂混合起来使用，比单独使用时，具有更高的效力，即混合抗氧化剂具有增效的作用。
酸碱调整剂(buffer agent，PH modifier)：在冷冻干燥过程和贮藏过程中，能将生物制品的pH值调整到活性物质的最稳定区域的物质，如磷酸、山梨醇、EDTA(乙二胺四醋酸二纳)、氨基酸等。
从理论上讲，在生物制品的冷冻干燥过程中，如果糖类与生物制品活性组分的分子形成氢键而替代了原有水的位置，那么，它对这些生物制品就能够提供保护作用。实验证明，单糖(如葡萄糖、半乳糖)对蛋白质的冷冻干燥过程不能起到保护作用，这是因为单糖在冻结过程中只能提供非常微弱的稳定作用，使得蛋白质在脱水干燥前就发生了不可逆变性。而相同浓度的海藻糖在冻结过程和脱水过程中却都能提供有效的保护作用。目前的生物制品的冷冻干燥配方中，一般不单独使用单糖作为保护剂，而是经常和其它赋形剂联用。就冷冻干燥过程而言，无论还原性二糖还是非还原性二糖都具有很好的保护效果，但在生物制品冷冻干燥后的贮藏过程中，由于还原性二糖的存在会使得冻干品发生Maillard反应(蛋白质褐变反应)，最终导致冻干品发生变质。所以，在食品、药品以及生物体的冷冻干燥配方中，蔗糖和海藻糖是最常用的两种保护剂。
在生物制品的冷冻干燥全过程中，表面活性剂既能在冻结和脱水过程中降低冰水界面张力所引起的冻结和脱水变性；又能在复水过程中对活性组分起到润湿剂和重褶皱剂的作用。非离子型表面活性剂具有相对较低的临界胶束浓度(Critical MicelleConcentration，CMC)，通常使用较低浓度就可以满足保护效果。其中吐温系列是最常用的非离子型表面活性剂。
由于在蛋白质溶液的冻结过程中，溶液的浓度逐渐提高。在高浓度时可能会改变溶液的pH值，严重情况下会导致蛋白质变性，从而直接使得生物制品失活。所以，在生物制品的冻干保护剂配方中，往往要添加适量的缓冲剂。
冷冻干燥过程耗时长、耗能多，因此迫切需要对冻干循环进行优化，降低生产成本。在冻干配方中加入适量的叔丁醇(Tertiary Butyl Alcohol)后，冻结时会形成针状结晶；冰晶升华后，留下了管状通道，使水蒸汽流动阻力大大减小，升华速率显著提高。叔丁醇是一种小分子醇，分子式为(CH3)3COH，与水完全互溶，具有低毒性、高蒸汽压，既可以单独作为冻干溶剂，又可以与水组成复合溶剂，目前的研究热点是叔丁醇-水复合溶剂。在药品水溶液中加入叔丁醇能起到以下作用：可以降低干燥层阻力，从而加速了干燥过程，缩短了干燥时间；溶解难溶于水的药品；使产品具有高的比表面积、好的外观、并易于复水；可提高药品溶液和冻干品的稳定性；有一定的抑菌作用。主要是因为不含叔丁醇时，溶液没有形成针状结晶，不利于水蒸汽的质量传递；加入叔丁醇后，形成了针状结晶，冰晶升华后，留下了管状通道，使水蒸汽的流动阻力大大减小。
现有技术中如公开号为CN109280640A的专利文献所提出的一种脐带间充质干细胞冻干粉的制备方法，包括脐带间充质干细胞的分离培养、传代及干细胞冻干粉的制备。将传代培养的细胞培养上清液抽至离心管中后冻存至固态状，再将固态状的冰冻培养基放置于使用封口膜或保鲜膜紧封的冻存瓶中，用注射器针头在封口膜或保鲜膜上扎孔，然后放置于冷冻干燥机上冷冻干燥至固体状，即制得脐带间充质干细胞冻干粉。该方法成本低，能防止冷冻干燥过程中冻干粉样品飞溅到容器外，减少样品尤其是小量或者比较贵重样品的损耗，保证样品的产量；同时能够使冷冻干燥过程中抽气产生的气泡顺利排出，防止气泡沾满容器内壁，保证了样品的质量与外观，但是产品无法长期保存。
此外，一方面由于对本领域技术人员的理解存在差异；另一方面由于发明人做出本发明时研究了大量文献和专利，但篇幅所限并未详细罗列所有的细节与内容，然而这绝非本发明不具备这些现有技术的特征，相反本发明已经具备现有技术的所有特征，而且申请人保留在背景技术中增加相关现有技术之权利。
发明内容
针对现有技术的不足，本申请提出了一种细胞冻干保存剂，所述细胞冻干保存剂包括能够与生物制品活性组分的分子形成氢键的冻干保护剂，所述冻干保护剂包括糖类物质和用于促进糖类的保护作用的聚合物，所述糖类物质为海藻糖、蔗糖中的一种或两种组合，所述聚合物能够是白蛋白，所述冻干保护剂还包括支撑物，所述支撑物能够为细胞提供网格状的透明的支架，使细胞能够粘附在玻片上，并保护细胞的完整性，其中，所述支撑物能够是低熔点琼脂糖。
据一种优选的实施方式，所述细胞冻干保存剂还包括用于维持溶液pH值的冻干缓冲液、所述冻干缓冲液为三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、磷酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液中的一种或者多种组合。
据一种优选的实施方式，所述冻干保护剂还包括填充剂，所述填充剂能够为细胞的活性组分提供支撑结构，其中，所述填充剂能够是多元醇。
据一种优选的实施方式，所述细胞冻干保存剂还包括用于防止冻干样品变质的防腐剂，所述防腐剂能够穿透细胞膜，进而抑制对微生物呼吸至关重要的特定酶，以达到抑制微生物活性的目的。
据一种优选的实施方式，所述冻干保护剂中，所述糖类物质与总质量的质量比为5％-8％，所述聚合物与总质量的质量比为1％-5％，所述多元醇与总质量的质量比为1％-3％，所述防腐剂与总质量的质量比为0.05％，所述低熔点琼脂糖浓度为0.1％。
据一种优选的实施方式，所述细胞冻干保存剂经其和固定的细胞共孵育并真空冷冻干燥获得，其中，所述细胞为表达外源基因的HEK293T细胞或者Hela细胞。
根据一种优选的实施方式，所述外源基因包括自身免疫性疾病相关抗原蛋白。
一种细胞冻干品的制备方法，包括以下步骤：细胞的培养：将表达外源基因的细胞接种到处理好的玻璃板上；细胞的固定：使用4％PFA或者100％甲醇或者丙酮进行固定；细胞冻干保存剂的制备：在冻干缓冲液的基础上，按比例添加冻干保护剂和防腐剂，充分混匀，并用滤膜过滤；真空冷冻干燥：将以上步骤固定的细胞和所述细胞冻干保存剂共孵育，进行-60℃～-50℃预冻、-50℃～-40℃主冻干、-50℃～-40℃后冻干。
在细胞冻存过程中，预冻对冻干产品的均一性有很大影响。若预冻没有冻结完全，冷冻温度不够低，则产品冻结不实，在进入第一阶段升华干燥时，产品可能出现沸腾现象而引起喷瓶，或出现冻干后制品表面凹凸不平的现象，影响冻干制品的外观以及冻干效果。由于冻干溶液不是纯净物，均为混合物，因此冻干溶液的结冰是逐步的，并非在某一个温度点全部转变成固体状态的，这些都会影响冻干制品的冻干曲线，以及板层温度和冻干制品的温度之差的变化也可能是产品质量变化的原因之一，因此，本发明根据制品要求的升温速率，首先制定出搁板升温速率曲线，将实测的搁板升温速率与对应时刻要求的升温速率曲线相比较，确定冻干机的通断时间比例，并不断修正这个比例使实际升温曲线跟踪要求的降温曲线，并针对预冻步骤的温度控制精细化处理，这种方式能较准确的进行过程控制。在进行预冻步骤前，由于所需要冻存的细胞的不同会受到不同的冷冻影响，在预冻前需要针对具体细胞配制细胞冻干保存剂，其中细胞冻干保存剂中的大分子聚合物和聚阴离子化合物的选择及其分子量和在溶液中的浓度等因素，冻干过程中细胞必须处于高渗状态。因此，针对不同种类细胞需通过以上配方进行调试以达到最优效果，再加上细胞的冻干首先使细胞冰冻，由液态变成固态，然后使箱体内的细胞在抽气减压、升温的同时，水分升华，逐步达到干燥的目的，配置不同的冻干液所用的试剂种类不一致，或者在使用试剂种类一致时而试剂浓度不一致，这些都会影响冻干制品的冻干曲线，针对细胞冻干保存剂而言，温度可能会引起水中聚团大小在分布上的变化，从而导致细胞冻干保存剂性质缺乏恒定性，基于此，为获得均匀一致、表面光滑、稳定的产品，本发明包括一种预冻过程的温度控制方法：在固定的细胞和所述细胞冻干保存剂混合后，从中取样测定温度曲线，根据所述温度曲线得出预冻时的第一梯度温度T1；优选地，所述温度曲线可通过取样后多次实验测定，共熔点低冻干制品则预冻的温度低，所述温度曲线的温度则低；装液量多则冻干时间长。优选地，所述第一梯度温度T1高于所述共晶点的温度，以使得所述冻干制品产生的晶体均一且体积小，有利于后续的晶体的升华过程，从而使冻干制品中的水分在水分能够形成晶体，进而通过升华过程去除的条件下能形成均一的小体积晶体减小对细胞的损伤；检测细胞与细胞冻干保存剂冻干前的温度为T0，并计算所述第一温度梯度T1与所述细胞与细胞冻干保存剂的温度T0的差值，当所述第一温度梯度T1与所述细胞与细胞冻干保存剂预冻前的温度T0的差值为70℃以下时，延长预冻时间至少1.5h，当所述第一温度梯度与所述细胞与细胞冻干保存剂预冻前的温度T0的差值为70～75℃时，延长所述预冻时间至少1h，当所述第一温度梯度与所述细胞与细胞冻干保存剂预冻前的温度T0的差值为80℃以上时，延长预冻时间至少0.5h，以使所述细胞与细胞冻干保存剂充分冻结。
根据一种优选的实施方式，该方法可包括：检测冻干机搁板间的温差，当温差小于1℃时，所述冻干机维持原本冻干时间；当所述温差大于1℃，且每超过1℃增加至少0.5h冻干时间；由于所使用的冻干机的产品系数存在差异，冻干机搁板间的温差差异过大会导致冻干过程中的冻干制品的降温速率不均，进而可能导致机械效应与溶质效应损伤细胞，使得冻干后的复原效果差，因此，基于温度的差值延长预冻时间能将冻干制品充分冻结，使细胞的冻干状况更具均一性；在所述细胞与细胞冻干保存剂达到所述第一温度梯度T1后，将预冷温度下调至第二温度梯度T2，优选地，所述第二温度梯度T2低于所述共晶点温度。只有冻结到共晶点温度以下，才能保证制品冻实，所有的水分凝结，全部变成固体状态，其中，所述第一温度梯度的T1高于所述第二温度梯度T2。细胞与细胞冻干保存剂混合后的结冰是逐步的，会先出现冰点，在冰点，第一种成分开始结冰，随着温度的降低，溶液逐步冻结，直到温度降到共晶点以后，全部溶液才会都变成固体，因此本发明将所述细胞与细胞冻干保存剂冻结到共晶点温度以下，进而能保证制品冻实，所有的水分凝结，全部变成固体状态，并且其中的水会先开始结晶，冰晶的生长使得溶质逐步析出造成溶液的浓缩，即电解质的浓缩，而蛋白质对电解质的浓度极为敏感的，电解质浓度的增加会引起蛋白质的变性，而蛋白质的变性会引起生命体的死亡，电解质浓度增加也会引起细胞脱水而死亡。这种溶质效应在某一温度范围明显，这个范围在水的冰点和该液体的固化温度之间，因此本发明的温度曲线根据实际细胞与混合溶液的成分制定，并将预冻温度最终控制于共晶点以下，基于此能够以较高的降温速率越过溶质效应的温度范围，减弱溶质效应给细胞带来的损伤。本发明先将冻干机预冷至降温曲线的第一温度梯度T1，再放入细胞产品急速冷冻，形成细微冰晶，使其来不及产生机械效应，避免了细胞内外冰晶生长而损伤细胞膜，保护细胞形态、防止细胞膜破裂而造成的细胞死亡。同时也让所产生的冰晶体积均一，为小体积，为后续的干燥步骤做铺垫，且小的冰晶溶解快，冰晶越小干燥后越能反映产品的原来结构以达到比大冰晶更优质的冻存效果。
相较于现有技术，本发明的优点在于：将细胞与细胞冻干保存剂混合后经过真空冷冻干燥，可以长期保存，并用于后期的免疫荧光检测，具有稳定性好等优点。
附图说明
图1为显微镜下细胞在玻片上培养的状态；
图2为显微镜下细胞冷冻冻干并复溶后的状态；
图3为显微镜下转染膜蛋白AQP4 HEK293T细胞正常免疫荧光状态；
图4为显微镜下转染膜蛋白AQP4 HEK293T细胞冷冻冻干后状态；
图5为显微镜下转染胞质蛋白(Titin)Hela细胞正常免疫荧光状态
图6为显微镜下转染胞质蛋白(Titin)Hela细胞冷冻冻干后状态；
图7为显微镜下转染膜蛋白NF155的Hela细胞正常免疫荧光状态；
图8为显微镜下转染膜蛋白NF155的Hela细胞冷冻冻干后状态。
具体实施方式
下面结合附图对本发明进行详细说明。
本申请提出了一种适用于细胞的冻干保存剂，细胞冻干保存剂包括用于维持溶液pH值的冻干缓冲液、用于与生物制品活性组分的分子形成氢键的冻干保护剂和用于防止冻干样品变质的防腐剂，冻干缓冲液为三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、磷酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液中的一种或者多种组合，冻干保护剂包括糖类物质和聚合物，其中，海藻糖是一种天然糖类，其是由特殊双糖分子构成的非还原性糖，非常稳定，能够在高温、高寒、干燥失水等恶劣的条件下在细胞表面形成特殊的保护膜，有效地保护生物分子结构不被破坏，从而维持生命体的生命过程和生物特征。因此，糖类物质可以为海藻糖、蔗糖中的一种或两种组合，可在冻结和干燥过程中防止活性组分发生变性。
根据一种优选的实施方式，聚合物用于促进糖类的保护作用，能提高生物制品混合溶液的玻璃化转变温度等有利因素，聚合物类保护剂一般同时起着低温保护剂和脱水保护剂的作用，其中，聚合物类保护剂可以是聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、牛血清(BSA)、右旋糖苷(dextran)、聚乙二醇(PEG)等。优选地，该聚合物能够为白蛋白，具体可以是牛血清白蛋白(BSA)。
根据一种优选的实施方式，冻干保护剂还包括填充剂，填充剂能够为细胞的活性组分提供支撑结构，其中，填充剂能够是多元醇。有鉴于甘露醇在水中易溶，在无菌溶液中较稳定，不易被空气氧化，因此多元醇可以是甘露醇。在生物制品的冷冻干燥过程中，甘露醇在慢速冻结时会结晶，从而为活性组分提供支撑结构，同时甘露醇也不会与活性组分发生反应。山梨醇是甘露醇的同分异构体，但其溶解度比甘露醇大，在常温下呈粘稠状透明液体。而丙三醇为无色透明的粘稠状液体，其熔点17.9℃，沸点290℃，并且吸水性强，能从空气中吸取水分。因此，多元醇可以为丙三醇、甘露醇中的一种或两种组合。能防止有效组分随水蒸气一起升华逸散，并使有效组分成形的物质。冻干保护剂还包括支撑物，支撑物能够为细胞提供网格状的透明的支架，使细胞能够粘附在玻片上，并保护细胞的完整性，支撑物能够是低熔点琼脂糖。
根据一种优选的实施方式，防腐剂能够通过阻断细胞活性组分的氧化反应的方式防止冻干样品变质，其中，该方式能够是抑制细胞活性组分的氧化还原反应的酶活性或消耗环境氧。优选地，抗氧化的作用机理以其还原性为依据，可以是抗氧化剂的自身氧化，消耗冻干样品内部和环境中的氧，使冻干样品物料不被氧化，也可以是是抗氧化剂给出电子或氢原子，阻断冻干样品的氧化链式反应，还可以是抗氧化剂通过抑制氧化酶的活性而防止冻干样品的氧化变质。优选地，该防腐剂为Proclin 300。
根据一种优选的实施方式，冻干保护剂中，糖类物质与总质量的质量比为5％-8％，聚合物与总质量的质量比为1％-5％，多元醇与总质量的质量比为1％-3％，防腐剂与总质量的质量比为0.05％，低熔点琼脂糖浓度为0.1％。
根据一种优选的实施方式，细胞冻干保存剂经其和固定的细胞共孵育并真空冷冻干燥获得，其中，细胞为表达外源基因的HEK293T细胞或者Hela细胞。
根据一种优选的实施方式，外源基因包括自身免疫性疾病相关抗原蛋白。
一种细胞冻干品的制备方法，包括以下步骤：细胞的培养：将表达外源基因的细胞接种到处理好的玻璃板上；细胞的固定：使用4％PFA或者100％甲醇或者丙酮进行固定；细胞冻干保存剂的制备：在冻干缓冲液的基础上，按比例添加冻干保护剂和防腐剂，充分混匀，并用滤膜过滤；真空冷冻干燥：将步骤固定的细胞和细胞冻干保存剂共孵育，进行-60℃～-50℃预冻、-50℃～-40℃主冻干、-50℃～-40℃后冻干。
根据一种优选的实施方式，S1：细胞贴片培养：HEK293T细胞在10cm培养皿中培养，待细胞密度达到80～90％时消化传代，分到新的放有玻片(包被液提前处理)的培养皿中；细胞转染：HEK293T细胞在玻片上培养，待细胞密度达到50～70％时进行质粒转染；细胞固定：转染后24h，如图1所示，拍照记录细胞形态，对转染细胞进行固定操作，使用预冷的甲醇或4％PFA固定10分钟。S2：细胞冻干保存剂的制备：配制0.01M PBS buffer，调节pH值为7.4，在此基础上按照细胞冻干保存剂的质量依次添加8％海藻糖、3％丙三醇、3％BSA、0.05％Proclin300、0.1％低熔点琼脂糖，溶解后定容、混匀，并用0.22μm滤膜过滤处理后得到细胞冻干保存剂。S3：冻干：首先将4％PFA固定的细胞和细胞冻干保存剂4℃孵育4h(以6cm培养皿中的4*4cm的玻片为例，加入2ml细胞冻干保存剂)，然后按以下冻干曲线进行冻干操作，得到冻干细胞。
表1为细胞冻干保存剂的冻干曲线
Figure BDA0003754188450000101
S4：复溶：上述步骤制备得到的冻干细胞，加入2ml纯水复溶，并拍照记录细胞复溶之后的形态，如图2所示。结果表明，实施例一中进行冻干并复溶后的细胞和培养的细胞相比，具有清晰的细胞轮廓，并且形态正常。
根据一种优选的实施方式，对制备的过表达水通道蛋白(AQP4)HEK293T细胞采用三种不同的细胞冻干保存剂进行冻干前后的活性、稳定性进行一系列的对比。过表达水通道蛋白(AQP4)HEK293T细胞在冻干前后的检测效果比较，结果如图3～4所示。结果表明，使用同一个人的AQP4抗体阳性血清，冻干并复溶后的细胞在荧光检测效果方面具有和湿细胞相当的表现，膜蛋白AQP4在HEK293T细胞中冻干处理后仍然具有较好的抗原性。
根据一种优选的实施方式，对制备的过表达肌联蛋白(Titin)Hela细胞采用细胞冻干保存剂进行冻干前后的活性、稳定性进行一系列的对比。过表达肌联蛋白(Titin)Hela细胞在冻干前后的检测活性比较，结果如图5～6所示。结果表明，使用同一个人的Titin抗体阳性血清，冻干并复溶后的细胞在荧光检测效果方面具有相当的表现，胞内蛋白Titin在Hela细胞中冻干处理后仍然具有较好的抗原性。
根据一种优选的实施方式，对制备的过表达NF155蛋白Hela细胞采用细胞冻干保存剂进行冻干前后的抗原性、稳定性进行一系列的对比。过表达NF155蛋白Hela细胞在冻干前后的检测活性比较，结果如图7～8所示。结果表明，使用同一个人的NF155抗体阳性血清，冻干并复溶后的细胞在荧光检测效果方面具有相当的表现，膜蛋白NF155在Hela细胞中冻干处理后仍然具有较好的抗原性。
一种预冻过程的温度控制方法：S5：取样测定温度曲线，根据温度曲线得出预冻时的第一梯度温度T1，温度曲线可通过取样后多次实验测定，分别需考虑，共熔点低冻干制品则预冻的温度低，温度曲线的温度则低，装液量多则冻干时间长。优选地，第一梯度温度T1高于共晶点的温度，以使得冻干制品产生的晶体均一且体积小，有利于后续的晶体的升华过程，从而使冻干制品中的水分在水分能够形成晶体，进而通过升华过程去除的条件下能形成均一的小体积晶体减小对细胞的损伤；S6：检测细胞、细胞冻干保存剂冻干前的温度为T0，并计算第一温度梯度T1与细胞、细胞冻干保存剂的温度T0的差值，当第一温度梯度T1与细胞、细胞冻干保存剂预冻前的温度T0的差值为70℃以下时，延长预冻时间1.5h，当第一温度梯度与细胞、细胞冻干保存剂预冻前的温度T0的差值为70～75℃时，延长预冻时间为1h，当第一温度梯度与细胞、细胞冻干保存剂预冻前的温度T0的差值为80℃以上时，延长预冻时间0.5h；S7：检测冻干机搁板间的温差，当温差小于1℃时，冻干机维持原本冻干时间；当温差大于1℃，且每超过1℃增加0.5h冻干时间；S8：在细胞与细胞冻干保存剂达到第一温度梯度T1后，将预冷温度下调至第二温度梯度T2。
本发明经过不断的筛选调试，得到了一种适用于细胞的细胞冻干保存剂，并利用真空冷冻干燥技术，优化冻干工艺，将表达目标蛋白的细胞制备成细胞冻干产品。本发明可使膜蛋白和胞质蛋白在真空冷冻干燥过程中保存较好的抗原性，冻干前面细胞在免疫荧光检测中表现大体相当。复溶后的细胞仍然保持细胞形态完整。复溶后的细胞在2～8℃环境中可稳定保存30天以上。连续3次冻干批次的细胞都能很好的重复检测的阳性结果。冻干工艺简单，容易批量生产。
需要注意的是，上述具体实施例是示例性的，本领域技术人员可以在本发明公开内容的启发下想出各种解决方案，而这些解决方案也都属于本发明的公开范围并落入本发明的保护范围之内。本领域技术人员应该明白，本发明说明书及其附图均为说明性而并非构成对权利要求的限制。本发明的保护范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种细胞冻干保存剂，所述细胞冻干保存剂包括能够与生物制品活性组分的分子形成氢键的冻干保护剂，所述冻干保护剂包括糖类物质和用于促进糖类的保护作用的聚合物，所述糖类物质为海藻糖、蔗糖中的一种或两种组合，所述聚合物能够是白蛋白，其特征在于，所述冻干保护剂还包括支撑物，所述支撑物能够为细胞提供网格状的透明的支架，使细胞能够粘附在玻片上，并保护细胞的完整性，其中，所述支撑物能够是低熔点琼脂糖。
2.根据权利要求1所述的一种细胞冻干保存剂，其特征在于，所述细胞冻干保存剂还包括用于维持溶液pH值的冻干缓冲液、所述冻干缓冲液为三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、磷酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液中的一种或者多种组合。
3.根据权利要求1或2所述的一种细胞冻干保存剂，其特征在于，所述冻干保护剂还包括填充剂，所述填充剂能够为细胞的活性组分提供支撑结构，其中，所述填充剂能够是多元醇。
4.根据权利要求1～3任一项所述的一种细胞冻干保存剂，其特征在于，所述细胞冻干保存剂还包括用于防止冻干样品变质的防腐剂，所述防腐剂能够穿透细胞膜，进而抑制对微生物呼吸至关重要的特定酶，以达到抑制微生物活性的目的。
5.根据权利要求1～4任一项所述的一种细胞冻干保存剂，其特征在于，所述冻干保护剂中，所述糖类物质与总质量的质量比为5％-8％，所述聚合物与总质量的质量比为1％-5％，所述多元醇与总质量的质量比为1％-3％，所述防腐剂与总质量的质量比为0.05％，所述低熔点琼脂糖浓度为0.1％。
6.根据权利要求1～5任一项所述的一种细胞冻干保存剂，其特征在于，所述细胞冻干保存剂经其和固定的细胞共孵育并真空冷冻干燥获得，其中，所述细胞为表达外源基因的HEK293T细胞或者Hela细胞。
7.根据权利要求1～6任一项所述的一种细胞冻干保存剂，其特征在于，所述外源基因包括自身免疫性疾病相关抗原蛋白。
8.一种基于根据权利要求1～7任一项所述的一种细胞冻干保存剂的细胞冻干品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：细胞的培养：将表达外源基因的细胞接种到处理好的玻璃板上；细胞的固定：使用4％PFA或者100％甲醇或者丙酮进行固定；细胞冻干保存剂的制备：在冻干缓冲液的基础上，按比例添加冻干保护剂和防腐剂，充分混匀，并用滤膜过滤；真空冷冻干燥：将步骤固定的细胞和所述细胞冻干保存剂共孵育，进行-60℃～-50℃预冻、-50℃～-40℃主冻干、-50℃～-40℃后冻干。
9.一种基于根据权利要求1～7任一项所述的一种细胞冻干保存剂的预冻过程的温度控制方法，其特征在于，包括以下步骤：在固定的细胞和所述细胞冻干保存剂混合后，取样测定温度曲线，根据所述温度曲线得出预冻时的第一梯度温度T1；检测细胞与细胞冻干保存剂冻干前的温度为T0，并计算所述第一温度梯度T1与所述细胞与细胞冻干保存剂的温度T0的差值，当所述第一温度梯度T1与所述细胞与细胞冻干保存剂预冻前的温度T0的差值为70℃以下时，延长预冻时间至少1.5h，当所述第一温度梯度与所述细胞与细胞冻干保存剂预冻前的温度T0的差值为70～75℃时，延长所述预冻时间至少1h，当所述第一温度梯度与所述细胞与细胞冻干保存剂预冻前的温度T0的差值为80℃以上时，延长预冻时间至少0.5h。
10.根据权利要求9所述的一种预冻过程的温度控制方法，其特征在于，包括以下步骤：检测冻干机搁板间的温差，当温差小于1℃时，所述冻干机维持原本冻干时间；当所述温差大于1℃，则每超过1℃增加至少0.5h冻干时间；在所述细胞与细胞冻干保存剂达到所述第一温度梯度T1后，将预冷温度下调至第二温度梯度T2，其中，低于所述第二温度梯度T2低于所述细胞与细胞冻干保存剂的共晶点的温度，所述第一温度梯度T1大于所述第二温度梯度T2。
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Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992008347A1 (en) * 1988-04-18 1992-05-29 Cryolife, Inc. Cryoprotective agent
CN101368172A (zh) * 2008-10-06 2009-02-18 上海理工大学 一种红细胞的冻干保护剂及其在冻干过程中的使用方法
CN102327289A (zh) * 2011-10-17 2012-01-25 济南环肽医药科技有限公司 一种注射用红细胞冻干粉制剂及其制备方法
WO2012098358A1 (en) * 2011-01-20 2012-07-26 Biopharma Technology Ltd Freeze drying method
CN102746372A (zh) * 2012-07-19 2012-10-24 陕西佰傲再生医学有限公司 一种细胞外基质冷冻干燥保护液及其使用方法
US20160298077A1 (en) * 2013-07-02 2016-10-13 Austrianova Singapore Pte Ltd. A method of freeze-drying encapsulated cells, freeze-dried encapsulated cells, compositions containing freeze-dried encapsulated cells and uses of such cells and compositions
CN113862332A (zh) * 2021-09-17 2021-12-31 浙江大学 琼脂糖在制备生物大分子冻干保护剂中的应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992008347A1 (en) * 1988-04-18 1992-05-29 Cryolife, Inc. Cryoprotective agent
CN101368172A (zh) * 2008-10-06 2009-02-18 上海理工大学 一种红细胞的冻干保护剂及其在冻干过程中的使用方法
WO2012098358A1 (en) * 2011-01-20 2012-07-26 Biopharma Technology Ltd Freeze drying method
CN102327289A (zh) * 2011-10-17 2012-01-25 济南环肽医药科技有限公司 一种注射用红细胞冻干粉制剂及其制备方法
CN102746372A (zh) * 2012-07-19 2012-10-24 陕西佰傲再生医学有限公司 一种细胞外基质冷冻干燥保护液及其使用方法
US20160298077A1 (en) * 2013-07-02 2016-10-13 Austrianova Singapore Pte Ltd. A method of freeze-drying encapsulated cells, freeze-dried encapsulated cells, compositions containing freeze-dried encapsulated cells and uses of such cells and compositions
CN113862332A (zh) * 2021-09-17 2021-12-31 浙江大学 琼脂糖在制备生物大分子冻干保护剂中的应用

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