JP2024501087A - 凍結乾燥間葉系幹細胞 - Google Patents

Abstract

本開示は、幹細胞技術の分野に属する。具体的には、本開示は、間葉系幹細胞の凍結乾燥粉末に関する。より具体的には、本開示は、凍結乾燥脂肪組織由来の間葉系幹細胞に関する。本開示はまた、費用効率の高い方法での試料の長期保存、容易な輸送及び流通のための凍結乾燥間葉系幹細胞の有利な使用にも関する。

Description

関連特許出願
本出願は、その開示が、本明細書中に完全に書き直されたかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２０年１２月１９日出願のインド特許出願第２０２０２１０５５３３４号に対する優先権及びその利益を主張する。
本開示は、幹細胞研究の分野に関する。具体的には、本開示は、間葉系幹細胞の凍結乾燥粉末に関する。より具体的には、本開示は、凍結乾燥脂肪組織由来の間葉系幹細胞に関する。本開示はまた、費用効率の高い方法での試料の長期保存、容易な輸送及び流通のための凍結乾燥間葉系幹細胞の有利な使用にも関する。

現在、多くの重要な臓器（例えば、肝臓及び心臓）の末期不全につながる慢性疾患（例えば、肝硬変及び心筋虚血）の発生率の増加により、臓器移植の需要が急速に高まっている。死亡したドナーからの臓器の供給量は依然として少なく、増大する需要を満たすには不十分である。そのため、移植用の臓器不足が世界的に大きな危機となっている。臓器不足の問題を解決するために、ヒト幹細胞を処置に使用することに重点を置いた再生医療が急速に発展している。
幹細胞は、多くの生物医学用途、特に細胞ベースの治療及び再生医療の最終的候補である。幹細胞は、２つの広義のタイプ：胚盤胞の内部細胞塊から得られる胚性幹細胞（ＥＳＣ）と、成体組織で見られる成体幹細胞、特に間葉系幹細胞（ＭＳＣ）に分類される。ＭＳＣは、臨床応用において胚性幹細胞（ＥＳＣ）及び他の体細胞に優る多くの利点を有する。ＭＳＣは、強力な免疫抑制特性を有する多分化能細胞である。それらは人体の種々の場所（例えば、骨髄及び脂肪組織）から採取することができる。
幹細胞源としての脂肪組織は普遍的に入手可能であり、他の供給源と比較していくつかの利点がある。脂肪組織は、侵襲性を最小限に抑えた採取手順で大量に容易に入手可能であり、脂肪由来間葉系間質／幹細胞（ＡＳＣ）を単離すると、幹細胞ベースの治療及び組織工学に不可欠な幹細胞が大量に得られる。いくつかの研究では、ＡＳＣがインサイチュで血管周囲ニッチに存在するという証拠が提供されているが、天然の脂肪組織におけるＡＳＣの正確な局在についてはまだ議論中である。ＡＳＣは、プラスチックに付着するその能力によって単離される。それにもかかわらず、最近の単離及び培養技術には標準化が欠けている。

ヒト脂肪由来幹細胞（ｈＡＳＣ）は現在、間葉様幹細胞の有望な供給源であり、骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭ－ＭＳＣ）と同様の特性及び分化能を有するが、供給源は異なっており、かつより入手しやすいもの－脂肪組織である。ｈＡＳＣは、正常な創傷治癒に寄与するほぼすべての因子を生成することができるため、あらゆるタイプの組織工学（ＴＥ）及び再生医療用途に好まれている。ヒト脂肪由来幹細胞（ｈＡＳＣ）は現在、再生医療にとって魅力的かつ効率的な成体幹細胞タイプとして認識されている。依然として、ｈＡＳＣ間の相互作用のメカニズム及び長期的な安全性など、解明する必要がある問題がある。これまでに少数の臨床試験のみが実行されている。ｈＡＳＣ又はｈＡＳＣ濃縮脂肪移植に関する臨床試験の大部分は、初期段階の臨床試験（第Ｉ相又は第ＩＩ相）であるが、ヒト対象において第ＩＶ相に達した試験は１件のみであった（ＮＣＴ００６１６１３５）。

Murphy, M. B. et.al (Exp. Mol. Med. 2013, 45-54)及びFierabracci, A et.al (Curr. Med. Chem. 2016, 23, 3014-3024)は、組織の保護及び修復メカニズムにより、種々の疾患の処置に効果的なツールとして、間葉系幹／間質細胞（ＭＳＣ）について説明している。Galipeau, J et.al (Cell Stem Cell 2018, 22, 824-833)は、２０１８年３月３１日までに米国で行われた、さまざまな疾患を処置した約８１０件の世界規模の臨床試験によって証明されたＭＳＣの治療有効性を捉えた。しかし、ＭＳＣの保管は複雑かつ高価である。ＭＳＣの保管に一般的に使用されるアプローチは、液体窒素を使用した凍結保存である。

現時点では、凍結保存は、ｈＭＳＣを含む細胞を長期間保存及び保管するために使用される効率的な方法である。凍結保存では、超低温（液体窒素などでおよそ－１９６°Ｃ）を利用して、細胞の生命及び細胞機能を維持しながら細胞の代謝活動を停止する原理が採用されている。凍結保存は、細胞ベースの治療及び再生医療などの臨床応用に必要な細胞計数を取得するために、ＭＳＣをプールするのに非常に効果的である。凍結保存の際には、免疫調節特性及び多系統分化能などを含むＭＳＣの機能特性を保存することが重要である。さらに、臨床応用の前に、凍結保存ＭＳＣの生物学的安全性評価が不可欠である。しかし、ＭＳＣの既存の凍結保存方法は顕著な制限を伴い、幹細胞ベースの治療におけるＭＳＣのより効率的な適用のために確立されるべき新規又は改良された方法の必要性が生じている。

Elia Bari et.al (Cells 2018, 7, 190)は、間葉系幹／間質凍結乾燥セクレトームのパイロット製造プロセスを提供しており、これを検証済みの適正製造基準（ＧＭＰ）準拠の細胞工場で実行した。セクレトームを、限外濾過によって培養上清から精製し、凍結保護剤に加え、凍結乾燥して、特性評価した。細胞外小胞及びタンパク質を含有する、凍結乾燥され、「既製品化された」易溶性粉末が得られた。米国特許出願第２０１６／００８９４０１号は、細胞を懸濁するための水性トレハロース培地の使用に関する細胞組成物及び方法に関する。
全体として、ヒト間葉系幹細胞の回収及び脱水潜在力によって、特別な凍結保護包装なしで全国にわたって出荷できるようにし、その増殖と機能の特徴を維持することが、臨床応用のためＭＳＣを効果的に保存するために現在直面している課題である。この状況を改善することを目的とした解決策が必要である。

Ｂｉｓｓｏｙｉ，Ａ．らは、間葉系幹細胞の凍結乾燥及び乾燥における最近の進歩及び今後の方向性に焦点を当てた総説論文において、「既存のプロトコールでは確実な細胞回収を保証できないため、ＭＳＣのハイドロバイオティックエンジニアリング（ｈｙｄｒｏｂｉｏｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）を成功させるには、保護手段の強化が必要である」と結論付けている。凍結乾燥及び乾燥は、場合によっては効率的であることがわかっているが、個々の方法には限界があるため、その実施には一定の硬直性を伴う。同時に、長期保管における乾燥細胞の生存率の維持も、対処する必要があるもう一つの重要な問題である。」(Stem Cells International. Vol. 2016, Article ID 3604203)。この総説論文は、幹細胞研究者に、相当な細胞生存率の達成、並びに室温での試料の安定性、明確な多孔質製品構造、水又は水溶液の添加による容易な再構成、及び容易な輸送などの他の所望の利点を備えた間葉系幹細胞の凍結乾燥を実証するという課題を残している。
ここで、驚くべきことに、本発明による凍結乾燥間葉系幹細胞によって約１５％～約９７％の細胞生存率を達成することができることが本発明者らによって見出された。さらに、これらの凍結乾燥間葉系幹細胞は室温での保管に好適であり、これにより輸送及び流通が容易になるであろう。

本発明者らは、この分野の背景を考慮して、高い細胞生存率を確保することにより、間葉系幹細胞を用途に迅速に利用できる方法で保存することによる、間葉系幹細胞の使用の必要性を見出した。
本発明者らは、幹細胞研究分野における研究中に、驚くべきことに、本発明に従う凍結乾燥間葉系幹細胞による約１５％～約９７％の細胞生存率を観察した。本発明によるこれらの凍結乾燥間葉系幹細胞は、室温での保管に好適であり得、これにより輸送及び流通が容易になるであろう。
本発明はまた、凍結乾燥から得られる薬学的に許容されるケーキにも関する。

一実施形態では、本開示は、凍結乾燥ＭＳＣを提供する。
一実施形態では、本開示は、間葉系幹細胞の凍結乾燥粉末を提供する。
本明細書に記載される実施形態の一態様では、間葉系幹細胞は、臍帯間葉系幹細胞、胎盤間葉系幹細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞、角膜輪部組織由来間葉系幹細胞、及び骨髄間葉系幹細胞、並びにそれらの組合せからなる群から選択される。
本明細書に記載される実施形態の別の態様では、間葉系幹細胞が、脂肪組織由来間葉系幹細胞である。
本明細書に記載される実施形態の別の態様では、間葉系幹細胞が、ヒト間葉系幹細胞である。
本明細書に記載される実施形態の別の態様では、間葉系幹細胞が、ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞である。
本明細書に記載される実施形態の別の態様では、間葉系幹細胞が、成分の種々の組合せの存在下で異なる凍結乾燥プロトコールに曝露される。

本明細書に記載される実施形態の別の態様では、凍結乾燥混合物中の間葉系幹細胞が、成分の種々の組合せを含む。
本明細書に記載される実施形態の別の態様では、成分を含む間葉系幹細胞凍結乾燥粉末であって、成分が、凍結保護剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）、ヒト血清アルブミン、グリセロール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）からの１種又は複数から選択される、間葉系幹細胞凍結乾燥粉末。
本明細書に記載される実施形態の一態様では、間葉系幹細胞凍結乾燥粉末は、間葉系幹細胞及び凍結乾燥混合物を含む。
本明細書に記載される実施形態の別の態様では、凍結乾燥混合物は、トレハロース、スクロース、ラクトース、グルコース、ラフィノース、デキストラン、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、及びそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１種の凍結保護剤を含む。

本明細書に記載される実施形態の一態様では、少なくとも１種の凍結保護剤はトレハロースである。
本明細書に記載される実施形態の一態様では、少なくとも１種の凍結保護剤はデキストランである。
本明細書に記載される実施形態の一態様では、少なくとも１種の凍結保護剤は、トレハロースとデキストランとの組合せを含む。
本明細書に記載される実施形態の別の態様では、凍結乾燥混合物がヒト血清アルブミンを含む。
本明細書に記載される実施形態のさらに別の態様では、凍結乾燥混合物はグリセロールを含む。
本明細書に記載される実施形態のさらに別の態様では、凍結乾燥混合物はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。実施形態の一態様では、凍結乾燥混合物は、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６０００、及び／又はＰＥＧ８０００を含む。
本明細書に記載される実施形態の別の態様では、凍結乾燥混合物が、（ａ）ヒト血清アルブミン、及び（ｂ）トレハロースを含む。
本明細書に記載される実施形態の別の態様では、凍結乾燥混合物が、（ａ）ヒト血清アルブミン、（ｂ）トレハロース、及び（ｃ）グリセロールを含む。

本明細書に記載される実施形態の別の態様では、凍結乾燥混合物が、（ａ）ヒト血清アルブミン、（ｂ）トレハロース、（ｃ）グリセロール、及び（ｄ）デキストランを含む。
本明細書に記載される実施形態の別の態様では、凍結乾燥混合物が、（ａ）ヒト血清アルブミン、（ｂ）トレハロース、（ｃ）グリセロール、及び（ｄ）デキストランを含む。

本明細書に記載される実施形態の別の態様では、凍結乾燥混合物が、（ａ）ヒト血清アルブミン、（ｂ）トレハロース、（ｃ）グリセロール、（ｄ）デキストラン、及び（ｅ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。
本明細書に記載される実施形態の別の態様では、凍結乾燥混合物が、（ａ）ヒト血清アルブミン、（ｂ）トレハロース、（ｃ）グリセロール、（ｄ）デキストラン、及び（ｅ）ＰＥＧ４００を含む。
本明細書に記載される実施形態の別の態様では、凍結乾燥混合物が、（ａ）ヒト血清アルブミン、（ｂ）トレハロース、（ｃ）グリセロール、（ｄ）デキストラン、並びに（ｅ）ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６０００、及び／又はＰＥＧ８０００を含む。
本明細書に記載される実施形態の別の態様では、凍結乾燥混合物が、（ａ）ヒト血清アルブミン、（ｂ）トレハロース、（ｃ）ＰＥＧ４００、及び（ｄ）ＰＥＧ８０００を含む。

本発明の一態様では、間葉系幹細胞の凍結乾燥から得られる薬学的に許容されるケーキが記載される。
本発明の別の態様では、凍結乾燥間葉系幹細胞は、室温で保管される。
本発明の別の態様では、凍結乾燥間葉系幹細胞は、安全であり、輸送が容易である。
本発明の別の態様では、凍結乾燥間葉系幹細胞は輸送後に安定である。
本明細書に記載される実施形態の一態様では、間葉細胞の凍結乾燥粉末は、間葉系幹細胞と、本明細書に記載の凍結乾燥混合物とを含み、凍結乾燥後の間葉系幹細胞の生存率が、約１５％～約９７％の間に維持される。
本明細書に記載される実施形態の一態様では、間葉細胞の凍結乾燥粉末は、間葉系幹細胞と、本明細書に記載の凍結乾燥混合物とを含み、凍結乾燥後の間葉系幹細胞の生存率が、約２５％～約９０％の間に維持される。
本明細書に記載される実施形態の別の態様では、間葉細胞の凍結乾燥粉末は、間葉系幹細胞と、本明細書に記載の凍結乾燥混合物とを含み、凍結乾燥後の間葉系幹細胞の生存率が、約０％～約３０％に減少又は低下する。

本明細書に記載される実施形態の別の態様では、凍結乾燥粉末中の凍結乾燥間葉系幹細胞は、長期保存が可能である。さらに、凍結乾燥粉末は、費用効率の高い方法で試料の輸送及び流通が容易になるという追加の利点を提供する。
本明細書に記載される実施形態のさらに別の態様では、凍結乾燥間葉系幹細胞の薬学的に許容されるケーキを提供する。
本明細書に記載される実施形態の別の態様では、間葉系幹細胞が、ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞である、凍結乾燥間葉系幹細胞の薬学的に許容されるケーキ。
本明細書に記載される実施形態の別の態様では、凍結乾燥間葉系幹細胞の薬学的に許容されるケーキは、固体、粉末又は粒状材料であり得る。

本明細書に記載される実施形態の別の態様では、凍結乾燥間葉系幹細胞の薬学的に許容されるケーキは、質量でケーキの最大５パーセントの水を含有する。
本明細書に記載される実施形態の別の態様では、間葉系幹細胞は、成分の種々の組合せの存在下で異なる凍結乾燥プロトコールに曝露される、凍結乾燥間葉系幹細胞の薬学的に許容されるケーキ。
本明細書に記載される実施形態の別の態様では、凍結乾燥混合物中の間葉系幹細胞が、成分の種々の組合せを含む、凍結乾燥間葉系幹細胞の薬学的に許容されるケーキ。
本明細書に記載される実施形態の別の態様では、成分が、凍結保護剤、ヒト血清アルブミン、グリセロール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）からの１種又は複数から選択される、凍結乾燥間葉系幹細胞の薬学的に許容されるケーキ。
本明細書に記載される実施形態の別の態様では、成分を含む凍結乾燥間葉系幹細胞の薬学的に許容されるケーキであって、成分がヒト血清アルブミンである。
本明細書に記載される実施形態の別の態様では、凍結保護剤が、トレハロース、スクロース、ラクトース、グルコース、ラフィノース、デキストラン、マンニトール、ソルビトール又はキシリトールのうちの１種又はいくつかの混合物から選択される、成分。
本明細書に記載される実施形態の別の態様では、凍結乾燥後の間葉系幹細胞の生存率が、約２５％～約９０％の間である、凍結乾燥間葉系幹細胞の薬学的に許容されるケーキ。

本明細書に記載の一実施形態では、凍結乾燥ＭＳＣを含む組成物を提供する。本明細書に記載される実施形態の一態様では、ＭＳＣの凍結乾燥粉末を含む組成物を提供する。
本明細書に記載の別の実施形態では、凍結乾燥ＭＳＣを含む医薬組成物を提供する。本明細書に記載される実施形態の一態様では、ＭＳＣの凍結乾燥粉末を含む医薬組成物を提供する。本明細書に記載の医薬組成物はまた、当業者に知られている１種又は複数のアンチケーキング剤を含有することもできる。
本明細書に開示される一実施形態では、凍結乾燥ＭＳＣを含むキットを提供する。本明細書に開示される実施形態の一態様では、ＭＳＣの凍結乾燥粉末を含むキットを提供する。本明細書に開示される実施形態の別の態様では、凍結乾燥ＭＳＣを含む医薬組成物を含むキットを提供する。本明細書に開示される実施形態のさらに別の態様では、ＭＳＣの凍結乾燥粉末を含む医薬組成物を含むキットを提供する。

本明細書に記載される実施形態の一態様では、間葉系幹細胞は、凍結乾燥後、陽性マーカーを発現する。実施形態の一態様では、陽性マーカーは、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ４４、ＣＤ２９、ＣＤ１３、ＣＤ１６６、ＣＤ１０、ＣＤ４９ｅ及びＣＤ５９からなる群から選択される１種又は複数を含む。
本明細書に記載される実施形態の一態様では、間葉系幹細胞は、凍結乾燥後、陰性マーカーを発現しない。実施形態の一態様では、陰性マーカーは、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ５６及びＣＤ１４６からなる群から選択される１種又は複数を含む。
本明細書の実施形態のこれら及び他の態様は、以下の説明と併せて考慮すると、よりよく認識され、理解されるであろう。しかし、以下の説明は、好ましい実施形態及びその多数の特定の詳細を示しているが、例示として与えられており、限定するものではないことを理解されたい。本明細書の実施形態の精神から逸脱することなく、本明細書の実施形態の範囲内で多くの変更及び修正を行うことができ、本明細書に記載の実施形態にはそのような修正すべてが含まれる。

組合せ４Ａ～４Ｇの凍結乾燥ケーキの代表的な画像を示す。 組合せ５Ａ～５Ｘの凍結乾燥ケーキの代表的な画像を示す。 組合せ６Ａ～６Ｚの凍結乾燥ケーキの代表的な画像を示す。 組合せ７Ａ～７Ｘの凍結乾燥ケーキの代表的な画像を示す。 組合せ８Ａ～８Ｍの凍結乾燥ケーキの代表的な画像を示す。 組合せ９Ａ～９Ｋの凍結乾燥ケーキの代表的な画像を示す。 組合せ１０Ａ及び１０Ｂの凍結乾燥ケーキの代表的な画像を示す。 組合せ１１Ａ～１１Ｖの凍結乾燥ケーキの代表的な画像を示す。 組合せ１２Ａ～１２Ｆの凍結乾燥ケーキの代表的な画像を示す。

上で述べたように、全体として、ヒト間葉系幹細胞の回収及び脱水潜在力によって、特別な凍結保護包装なしで全国にわたって出荷できるようにし、その増殖と機能の特徴を維持する必要性が、臨床応用のためＭＳＣを効果的に保存するために残っている。
本発明者らは、驚くべきことに、本明細書に記載の間葉系幹細胞の凍結乾燥粉末によって、凍結乾燥後の間葉系幹細胞の生存率が約１５％～約９７％維持されることを見出した。これらの凍結乾燥間葉系幹細胞が、室温での保管に好適であることは、さらに驚くべきことであった。加えて、凍結乾燥間葉系幹細胞が２℃～８℃での保管に好適であることが見出されたことは驚くべきことであった。

本明細書で説明される実施形態、及びその種々の特徴及び有利な詳細は、以下の説明で詳述される非限定的な実施形態を参照してより完全に説明される。本明細書の実施形態を不必要に分かりにくくしないように、周知の成分及び処理技術の説明は省略する。本明細書で使用される実施例は、単に本明細書の実施形態を実施する方法の理解を容易にし、さらに当業者が本明細書の実施形態を実施できるようにすることを意図している。したがって、これらの実施例は、本明細書の実施形態の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

特に指示がない限り、本開示及び添付の特許請求の範囲で使用される、成分の量、分子量などの特性、反応条件などを表すすべての数字は、すべての場合において「約」という用語によって修飾されるものとして理解されるべきである。したがって、特に異議を唱えない限り、本開示及び添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメーターは、本発明によって得ようとする所望の特性に応じて変化し得る近似値である。最低限、及び均等論の適用を特許請求の範囲に限定する試みとしてではなく、各数値パラメーターは、少なくとも報告された有効桁数を考慮して、通常の丸め手法を適用することによって解釈されるべきである。実施形態の広い範囲を示す数値範囲及びパラメーターが近似値であるにもかかわらず、特定の実施例に示された数値は、可能な限り正確に報告される。しかし、いずれの数値も、それぞれの試験測定値に見られる標準偏差から必然的に生じる一定の誤差を本質的に含む。

本明細書では、範囲は、「約」１つの特定の値から、及び／又は「約」別の特定の値までとして表現することができる。このような範囲が表現される場合、特に文脈で別段の指示がない限り、ある特定の値から及び／又は他の特定の値までの範囲－１も具体的に企図され、開示されると考えられる。同様に、先行する「約」を使用して値が近似値として表される場合、特に文脈で別段の指示がない限り、特定の値が別の具体的に企図された実施形態を形成し、開示されたものとみなされるべきであることが理解されるであろう。特に文脈で別段の指示がない限り、範囲のそれぞれの端点は、他の端点との関係において、及び他の端点とは無関係に、どちらにおいても重要であることがさらに理解されるであろう。最後に、明示的に開示された範囲内に含まれる個々の値及び値の部分範囲のすべても具体的に企図されており、特に文脈で別段の指示がない限り、開示されたものとみなされるべきであることを理解すべきである。前述の内容は、特定の場合にこれらの実施形態の一部又は全部が明示的に開示されるかどうかに関係なく適用される。

ここで例示的な実施形態を参照し、本明細書ではそれを説明するために特定の言語を使用する。しかし、それによって本発明の範囲を限定するものではないことを理解すべきである。本明細書に示されている本発明の特徴の変更及びさらなる修正、及び本明細書に示されているような本発明の原理の追加の応用は、関連分野の当業者及び本開示を所有する者には思いつくであろうが、本発明の範囲内にあると考えられる。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、その内容に別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。本明細書で引用される特許、特許出願、及び文献を含むすべての参考文献は、その全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。

本明細書で使用される「薬剤（ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎ）」という用語は、医薬、若しくは医薬品、又は単に薬物を指し；これは、疾患の診断、治癒、処置、又は予防に使用される。「薬剤」という用語は、薬物又は医薬の投与とも呼ぶこともできる。
本明細書で使用される「コンフルエンシー」という用語は、各細胞が占める面積、１ｍｌ当たりの生細胞、細胞が占める面積の比率、及び利用可能な総面積、増殖曲線の直線下の面積を指す。細胞培養生物学において、コンフルエンシーとは、細胞培養皿又はフラスコ内の細胞数の尺度として一般的に使用される用語であり、細胞による皿又はフラスコの被覆率を指す。例えば、１００％コンフルエンシーとは、皿が細胞で完全に覆われ、したがって、細胞が増殖する余地がなくなったことを意味し；一方、５０％コンフルエンシーとは、皿のおよそ半分が覆われており、細胞が増殖する余地がまだあることを意味する。

本明細書で使用される「細胞生存率」という用語は、集団内の生きた健康な細胞の割合の尺度を指す。典型的には、細胞生存率アッセイは、代謝活性、ＡＴＰ含有量、又は細胞増殖の測定を通じて細胞の健康状態の読み取りを提供する。生存率アッセイは、臓器、細胞、又は組織が生存状態を維持又は回復する能力を決定するために作成されたアッセイである。生存率は、０及び１の整数、又はより容易に理解される場合は０％～１００％の範囲の定量化可能な指標を使用することによって、生と死の全か無かの状態から区別することができる。生存率は、細胞、組織、及び臓器の物理的特性を通じて観察することができる。これらの一部には、機械的活動、精子及び顆粒球などの運動性、筋肉組織又は細胞の収縮、細胞機能における有糸分裂活動などが含まれる。生存率アッセイは、生物の生命力レベルを測定するためのより正確な基礎を提供する。
生存率アッセイは、生物対非生物の相違より多くの知見をもたらす可能性がある。本開示の一実施形態によれば、生存率アッセイを使用して、凍結乾燥の成功を評価することができる。

本明細書で使用される「フローサイトメトリー」という用語は、細胞又は粒子の集団の物理的及び化学的特徴を検出及び測定するために使用される技術を指す。本プロセスでは、細胞又は粒子を含有する試料を流体中に懸濁させ、フローサイトメーター機器に注入する。フローサイトメトリーでは個々の細胞を分析し、これにより、試料の不均一性を判定することができる。生存率は最終的に個々の細胞の性質であるため、有意義な結果を得るにはこのようなアプローチが不可欠である。単一細胞レベルでのフローサイトメトリー分析により、複数の細胞特性の分布を決定することができ、これにより、「最大生存率」から死、場合により分解にいたるまでのスペクトルで特徴づけることができる細胞の部分集団の識別が可能になる。

ＭＳＣは、典型的には、ＣＤ７３、ＣＤ９０、及びＣＤ１０５の共発現によって識別される。ＭＳＣ検出の代替方法を実証するために、一般に増殖したＭＳＣを、ＭＳＣマーカーＣＤ７３、ＣＤ９０、及びＣＤ１０５についてスクリーニングする。ＭＳＣマーカーＣＤ７３、ＣＤ９０、及びＣＤ１０５はフローサイトメトリーによって検出した。フローサイトメトリーは、細胞懸濁液中の生細胞を定量するための迅速かつ信頼性の高い方法を提供する。細胞生存率の判定は、細胞毒性薬及び環境要因への反応時、又はがん及びその他の疾患状態の進行中など、細胞の生理学的状態を評価する場合に非常に重要である。加えて、分析から除外するために細胞懸濁液中の死細胞を検出することが、多くの場合必要である。死細胞は、非特異的な抗体結合又は蛍光プローブの不要な取り込みの結果としてアーチファクトを生成する場合がある。２つの細胞集団を識別する１つの方法は、色素排除によるものである。生細胞には、非生細胞の損傷した透過性膜を容易に透過するさまざまな色素を除外する無傷の膜がある。７－アミノアクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）を含む、いくつかの異なる蛍光色素を使用して死細胞を染色することができる。７－ＡＡＤは、一般に生細胞から除外される膜不透過性色素である。これは、Ｇ－Ｃ濃縮領域の塩基対の間に挿入されることにより、二本鎖ＤＮＡに結合する。７－ＡＡＤは、アルゴンレーザーによって４８８ｎｍで励起することができる。７－ＡＡＤは、比較的大きなストークスシフトを有し、最大波長６４７ｎｍで発光する。これらのスペクトル特性により、７－ＡＡＤは、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）及びフィコエリトリン（ＰＥ）など、４８８ｎｍで励起される他の蛍光色素と組み合わせて使用することができる。

「凍結乾燥又はフリーズドライ」という用語は、材料を凍結させた後、昇華、つまり、氷が液相を残して直接蒸気に変わることを意味するもの、によって凍結水を除去するために使用されるプロセスを指す。一般に、フリーズドライ又は凍結乾燥技術は、化合物又は製剤を溶解、懸濁、又は乳化させ；得られた溶液、懸濁液、又はエマルジョンを凍結させ；次に、それに真空を適用して、材料を溶解、懸濁、又は乳化するために使用された凍結塊内の溶媒及び他の液体を昇華／蒸発させることである。凍結乾燥／フリーズドライは、温度に敏感な食品又は特に薬剤など、ある特定の物質を穏やかに保存するために最もよく使用される方法である。ここで、物質は凍結状態で乾燥しており、水又は別の溶媒を加えると、特に容易に元の状態に戻り得る。これにより、プロセスは一般に、出発製品の温度が－７０℃まで凍結されることに基づいている。乾燥プロセスは、耐圧容器（凍結乾燥機）内で高真空下で行われ、昇華によって水分が除去され、フリーズドライ物質が得られる。

薬学的に許容されるケーキは、再構成後に経口若しくは非経口的に投与することができ、又は再構成せずに経口的に飲み込むことができる。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容されるケーキ」とは、ある特定の望ましい性質、例えば、薬学的に許容される、長期安定性、短い再構成時間、洗練された外観及び再構成時の元の溶液の性質の維持などを有する、凍結乾燥後に残る非崩壊固形医薬品を指す。薬学的に許容されるケーキは、固体、粉末又は粒状材料であり得る。本明細書で使用される場合、「間葉系幹細胞の凍結乾燥粉末」は、凍結乾燥間葉系幹細胞の薬学的に許容されるケーキを指すこともできる。薬学的に許容されるケーキは、質量でケーキの最大５パーセントの水を含有することもできる。

本発明で使用される「成分」という用語は、医薬品に定型的に使用される医薬賦形剤を指す。成分又は賦形剤の例としては、抗酸化剤、緩衝液、キレート剤、及び凍結保護剤が挙げられる。凍結保護剤の例としては、糖、ＰＥＧ、及びある特定の無機塩が挙げられる。ポリマーの例としては、ポリビニルピロリジン（ＰＶＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びポリビニルアルコール（ＰＶＡ）が挙げられる。本発明による最も好ましい成分は、凍結保護剤、ヒト血清アルブミン、グリセロール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はポリビニルピロリジン（ＰＶＰ）のうちの１種又は複数から選択される。
「凍結保護剤」という用語は、活性成分（例えば、この場合間葉系幹細胞）を保護するために製剤に加えられる物質を指す。凍結保護剤は、凍結乾燥中の物に損傷を防ぐために加えられる物質である。凍結保護剤は一般に、発生する脱水の影響を受けやすい製品を保護するために凍結乾燥に使用される化合物である。凍結保護剤としては定型的に、糖、ポリアルコール、及びそれらの誘導体が挙げられる。好ましい実施形態では、凍結保護剤は、トレハロース、スクロース、ラクトース、グルコース、ラフィノース、デキストラン、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、及びそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１種の糖である。

ヒト血清アルブミンは、ヒトの血漿中に存在する主要なタンパク質である。アルブミンの主な機能は、血液の浸透圧を維持することである。アルブミンは、水、カチオン（Ｃａ２＋、Ｎａ＋、Ｋ＋など）、脂肪酸、ホルモン、ビリルビン、チロキシン（Ｔ４）、及び医薬品（バルビツール酸塩を含む）に結合する。アルブミンは、健康なヒトの総タンパク質含有量のおよそ５０％に相当する。ヒトアルブミンは、小さな球状タンパク質（分子量：６６．５ｋＤａ）であり、３つのリピートホモログドメイン（部位Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩ）で構成された５８５アミノ酸の単鎖からなる。各ドメインは２つの別個のサブドメイン（Ａ及びＢ）で構成されている。

ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、典型的には、可溶性、球状、及び非グリコシル化単量体タンパク質と呼ばれており；主にステロイド、脂肪酸、及び甲状腺ホルモンのキャリアタンパク質として機能し、細胞外液量の安定化に重要な役割を果たす。ＨＳＡは、重篤な火傷、出血性ショック、低タンパク血症、胎児赤芽球症、及び肝硬変による腹水の処置に臨床的に広く使用されている。ＨＳＡは、ワクチン及び治療用タンパク質治療薬の賦形剤として、またワクチン及び医薬品の製造における細胞培養培地のサプリメントとしても使用されている。
ミコース又はトレマロースとしても知られるトレハロースは、２つのａ－グルコース単位間のａ，ａ－１，１－グルコシド結合によって形成されるアルファ結合二糖である。トレハロースの化学名は（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）－２－（ヒドロキシメチル）－６－［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）－３，４，５－トリヒドロキシ－６－（ヒドロキシメチル）オキサン－２－イル］オキシオキサン－３，４，５－トリオール（ＩＵＰＡＣ命名規則）である。

デキストランは、主にガラス転移温度が高く、室温での保管が可能であるため、乾燥タンパク質製剤の多糖凍結保護剤として頻繁に使用されている。不活性添加剤として、デキストランは医薬品の保存剤として使用するのに特に好適である。その結果、生物学的製剤を含む、保存剤としてデキストランを含む多数の薬物が市場で流通している。デキストランは、強固で洗練されたケーキ構造を形成して、急速に凍結乾燥することができる、優れた非晶質増量剤を提供する。デキストランを凍結乾燥中にスクロース又はトレハロースと一緒に使用すると、保管安定性が向上する。
グリセロールは、プロパンの１、２、及び３位がヒドロキシ基で置換された構造を有するトリオールである。グリセロールは、オスモライト、溶媒、界面活性剤、ヒト代謝物、藻類代謝物、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）代謝物、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）代謝物、及びマウス代謝物としての役割を果たす。グリセロールは、アルジトール及びトリオールである。

ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、酸化エチレンと水とが縮合して作製される製品であり、種々の誘導体を含むことができ、種々の機能を有する。多くのＰＥＧタイプは親水性であるため、浸透促進剤として好んで使用され、皮膚科用局所製剤に多用されている。ＰＥＧは、その多くの非イオン性誘導体とともに、界面活性剤、乳化剤、クレンジング剤、保湿剤、及びスキンコンディショナーとして化粧品に広く利用されている。
ポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００）は、低レベルの毒性を有する低分子量グレードのポリエチレングリコールである。ＰＥＧ４００は非常に親水性が高いため、水に溶けにくい薬物の溶解性及び生物学的利用能を増大させる薬物製剤の有用な成分となる。ＰＥＧ４００は、目の乾燥に伴う灼熱感、刺激及び／又は不快感を軽減するための点眼液に使用されている。ＰＥＧ「４００」は、特定のＰＥＧの平均分子量が４００であることを示す。
ポリエチレングリコール８０００（ＰＥＧ８０００）は、主に種々の製剤の溶媒として使用される高分子ポリエチレングリコール（マクロゴール）である。高分子量ＰＥＧは、水及びアルコールなどの有機溶媒に可溶である。これを他の分子量のＰＥＧとブレンドして、所望の特性、すなわち粘度を達成することができる。

「トリプシン処理」は、タンパク質を分解するタンパク質分解酵素であるトリプシンを使用して、培養されている容器から接着細胞を剥離する細胞剥離のプロセスである。トリプシンは、細胞培養物に加えられると、細胞が容器に接着できるようにするタンパク質を分解する。
細胞培養の継代数は、培養が継代培養された回数、つまり採取され、複数の「娘」細胞培養フラスコに再播種された回数の記録である。細胞をトリプシン処理して凍結させ、次いで解凍して再播種すると、冷凍庫内で一次的中断が発生する場合でも、これは１回の継代に相当する。

本明細書で使用される「室温」とは、通常の保管条件を指し、気候条件に応じて、乾燥した清潔な換気の良い領域で、－２５℃～３０℃の間又は最高４５℃の室温で保管することを意味する。「室温」は、作業領域の一般的な温度を指す場合もある。
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」は、本明細書に記載の凍結乾燥間葉系幹細胞（ＭＳＣ）又はＭＳＣの凍結乾燥粉末の治療有効量を指す。医薬組成物は、凍結乾燥間葉系幹細胞（ＭＳＣ）又はＭＳＣの凍結乾燥粉末の、それを必要とする対象への投与を容易にすることができる、薬学的に許容される担体などの他の成分と組み合わせてもよい。
「薬学的に許容される担体」という用語は、対象に重大な刺激を引き起こさず、凍結乾燥間葉系幹細胞（ＭＳＣ）又はＭＳＣの凍結乾燥粉末の生物学的活性及び特性を無効にしない担体又は希釈剤を指す。薬学的に許容される担体としては、生理食塩水、リンゲル液、リン酸緩衝生理食塩水、及び当技術分野で公知の他の担体が挙げられるが、これらに限定されない。

以下は、本開示の態様である。
一実施形態では、本開示は、凍結乾燥間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を提供する。
一実施形態では、本開示は、間葉系幹細胞の凍結乾燥粉末を提供する。
本明細書に記載される実施形態の一態様では、間葉系幹細胞は、臍帯間葉系幹細胞、胎盤間葉系幹細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞、角膜輪部組織由来間葉系幹細胞、及び骨髄間葉系幹細胞、並びにそれらの組合せからなる群から選択される。
本明細書に記載される実施形態の別の態様では、間葉系幹細胞が、脂肪組織由来間葉系幹細胞である。
本明細書に記載される実施形態の別の態様では、間葉系幹細胞が、ヒト間葉系幹細胞である。
本明細書に記載される実施形態の別の態様では、間葉系幹細胞が、ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞である。
本明細書に記載される実施形態の別の態様では、間葉系幹細胞は、成分の種々の組合せの存在下で異なる凍結乾燥プロトコールに曝露される。

本明細書に記載される実施形態の別の態様では、凍結乾燥混合物中の間葉系幹細胞が、成分の種々の組合せを含む。
本明細書に記載される実施形態の別の態様では、成分を含む間葉系幹細胞凍結乾燥粉末であって、成分が、凍結保護剤、ヒト血清アルブミン、グリセロール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）からの１種又は複数から選択される、間葉系幹細胞凍結乾燥粉末。
本明細書に記載される実施形態の一態様では、間葉系幹細胞凍結乾燥粉末は、間葉系幹細胞及び凍結乾燥混合物を含む。
本明細書に記載される実施形態の別の態様では、凍結乾燥混合物は、トレハロース、スクロース、ラクトース、グルコース、ラフィノース、デキストラン、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、及びそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１種の凍結保護剤を含む。

本明細書に記載される実施形態の一態様では、少なくとも１種の凍結保護剤はトレハロースである。
本明細書に記載される実施形態の一態様では、少なくとも１種の凍結保護剤はデキストランである。
本明細書に記載される実施形態の一態様では、少なくとも１種の凍結保護剤は、トレハロースとデキストランとの組合せを含む。
本明細書に記載される実施形態の別の態様では、凍結乾燥混合物がヒト血清アルブミンを含む。
本明細書に記載される実施形態のさらに別の態様では、凍結乾燥混合物はグリセロールを含む。

本明細書に記載される実施形態のさらに別の態様では、凍結乾燥混合物はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。実施形態の一態様では、凍結乾燥混合物は、ＰＥＧ４００、及び／又はＰＥＧ８０００を含む。
本明細書に記載される実施形態の別の態様では、凍結乾燥混合物が、（ａ）ヒト血清アルブミン、及び（ｂ）トレハロースを含む。
本明細書に記載される実施形態の別の態様では、凍結乾燥混合物が、（ａ）ヒト血清アルブミン、（ｂ）トレハロース、及び（ｃ）グリセロールを含む。
本明細書に記載される実施形態の別の態様では、凍結乾燥混合物が、（ａ）ヒト血清アルブミン、（ｂ）トレハロース、（ｃ）グリセロール、及び（ｄ）デキストランを含む。
本明細書に記載される実施形態の別の態様では、凍結乾燥混合物が、（ａ）ヒト血清アルブミン、（ｂ）トレハロース、（ｃ）グリセロール、（ｄ）デキストラン、及び（ｅ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。
本明細書に記載される実施形態の別の態様では、凍結乾燥混合物が、（ａ）ヒト血清アルブミン、（ｂ）トレハロース、（ｃ）グリセロール、（ｄ）デキストラン、及び（ｅ）ＰＥＧ４００を含む。
本明細書に記載される実施形態の別の態様では、凍結乾燥混合物が、（ａ）ヒト血清アルブミン、（ｂ）トレハロース、（ｃ）ＰＥＧ４００、及び（ｄ）ＰＥＧ８０００を含む。

本発明の一態様では、間葉系幹細胞の凍結乾燥から得られる薬学的に許容されるケーキが記載される。
本発明の別の態様では、凍結乾燥間葉系幹細胞は、室温で保管される。
本発明の別の態様では、凍結乾燥間葉系幹細胞は、安全であり、輸送が容易である。
本発明の別の態様では、凍結乾燥間葉系幹細胞は輸送後に安定である。
本明細書に記載される実施形態の一態様では、間葉細胞の凍結乾燥粉末は、間葉系幹細胞と、本明細書に記載の凍結乾燥混合物とを含み、凍結乾燥後の間葉系幹細胞の生存率が、約１５％～約９７％の間に維持される。

本明細書に記載される実施形態の一態様では、間葉細胞の凍結乾燥粉末は、間葉系幹細胞と、本明細書に記載の凍結乾燥混合物とを含み、凍結乾燥後の間葉系幹細胞の生存率が、約２５％～約９０％の間に維持される。
本明細書に記載される実施形態の別の態様では、間葉細胞の凍結乾燥粉末は、間葉系幹細胞と、本明細書に記載の凍結乾燥混合物とを含み、凍結乾燥後の間葉系幹細胞の生存率が、約０％～約３０％に減少又は低下する。
本明細書に記載される実施形態の別の態様では、凍結乾燥粉末中の凍結乾燥間葉系幹細胞は、長期保存が可能である。さらに、凍結乾燥粉末は、費用効率の高い方法で試料の輸送及び流通が容易になるという追加の利点を提供する。
本明細書に記載される実施形態のさらに別の態様では、凍結乾燥間葉系幹細胞の薬学的に許容されるケーキを提供する。

本明細書に記載される実施形態の別の態様では、間葉系幹細胞が、ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞である、凍結乾燥間葉系幹細胞の薬学的に許容されるケーキ。
本明細書に記載される実施形態の別の態様では、凍結乾燥間葉系幹細胞の薬学的に許容されるケーキは、固体、粉末又は粒状材料であり得る。
本明細書に記載される実施形態の別の態様では、凍結乾燥間葉系幹細胞の薬学的に許容されるケーキは、質量でケーキの最大５パーセントの水を含有する。
本明細書に記載される実施形態の別の態様では、間葉系幹細胞は、成分の種々の組合せの存在下で異なる凍結乾燥プロトコールに曝露される、凍結乾燥間葉系幹細胞の薬学的に許容されるケーキ。
本明細書に記載される実施形態の別の態様では、凍結乾燥混合物中の間葉系幹細胞が、成分の種々の組合せを含む、凍結乾燥間葉系幹細胞の薬学的に許容されるケーキ。
本明細書に記載される実施形態の別の態様では、成分が、凍結保護剤、ヒト血清アルブミン、グリセロール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）からの１種又は複数から選択される、凍結乾燥間葉系幹細胞の薬学的に許容されるケーキ。
本明細書に記載される実施形態の別の態様では、成分を含む凍結乾燥間葉系幹細胞の薬学的に許容されるケーキであって、成分がヒト血清アルブミンである。

本明細書に記載される実施形態の別の態様では、凍結保護剤が、トレハロース、スクロース、ラクトース、グルコース、ラフィノース、デキストラン、マンニトール、ソルビトール又はキシリトールのうちの１種又はいくつかの混合物から選択される、成分。
本明細書に記載される実施形態の別の態様では、凍結乾燥後の間葉系幹細胞の生存率が、約１５％～約９７％の間である、凍結乾燥間葉系幹細胞の薬学的に許容されるケーキ。

本開示は、間葉系幹細胞及び凍結乾燥混合物を含む間葉系幹細胞の凍結乾燥粉末であって、凍結乾燥後の間葉系幹細胞の生存率が約１５％～約９７％の間に維持される、間葉系幹細胞の凍結乾燥粉末を提供する。一実施形態では、凍結乾燥後の間葉系幹細胞の生存率が、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、約３０％、約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、約３９％、約４０％、約４１％、約４２％、約４３％、約４４％、約４５％、約４６％、約４７％、約４８％、約４９％、約５０％、約５１％、約５２％、約５３％、約５４％、約５５％、約５６％、約５７％、約５８％、約５９％、約６０％、約６１％、約６２％、約６３％、約６４％、約６５％、約６６％、約６７％、約６８％、約６９％、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、又は約９７％に維持される。

本明細書に記載される実施形態の別の態様では、凍結乾燥後の間葉系幹細胞の生存率が約２５％～約９０％の間である、凍結乾燥間葉系幹細胞の薬学的に許容されるケーキ。
本開示は、間葉系幹細胞及び凍結乾燥混合物を含む間葉系幹細胞の凍結乾燥粉末であって、凍結乾燥後の間葉系幹細胞の生存率が約２５％～約９０％の間に維持される、間葉系幹細胞の凍結乾燥粉末を提供する。一実施形態では、間葉系幹細胞の生存率が、凍結乾燥後、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、約３０％、約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、約３９％、約４０％、約４１％、約４２％、約４３％、約４４％、約４５％、約４６％、約４７％、約４８％、約４９％、約５０％、約５１％、約５２％、約５３％、約５４％、約５５％、約５６％、約５７％、約５８％、約５９％、約６０％、約６１％、約６２％、約６３％、約６４％、約６５％、約６６％、約６７％、約６８％、約６９％、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、又は約９０％に維持される。
一実施形態では、間葉系幹細胞の生存率が、凍結乾燥後、約０％～約３０％に低下する。実施形態の一態様では、凍結乾燥後の間葉系幹細胞の生存率が、約０．１％、約０．５％、約１％、約２．５％、約５％、約７．５％、約１０％、約１２．５％、約１５％、約１７．５％、約２０％、約２２．５％、約２５％、約２７．５％、約３０％、約３２．５％、約３５％、約３７．５％、又は約４０％に減少する。

本明細書に開示される一実施形態では、間葉系幹細胞は、臍帯間葉系幹細胞、胎盤間葉系幹細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞、角膜輪部組織由来間葉系幹細胞、骨髄間葉系幹細胞、及びそれらの組合せからなる群から選択され得る。
本明細書に開示される一実施形態では、凍結乾燥混合物は、少なくとも１種の抗酸化剤、少なくとも１種の糖、少なくとも１種の膜安定剤、少なくとも１種の高分子量分子を含むがこれらに限定されない凍結保護剤を含む。実施形態の一態様では、少なくとも１種の糖は、トレハロース、スクロース、ラクトース、グルコース、ラフィノース、デキストラン、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、及びそれらの組合せからなる群から選択される。

本明細書に開示される実施形態の一態様では、少なくとも１種の糖は、約２５ｍＭ～約１０００ｍＭの量で存在する。好ましい実施形態では、少なくとも１種の糖は、約２５ｍＭ、約５０ｍＭ、約７５ｍＭ、約１００ｍＭ、約１２５ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１７５ｍＭ、約２００ｍＭ、約２２５ｍＭ、約２５０ｍＭ、約２７５ｍＭ、約３００ｍＭ、約３２５ｍＭ、約３５０ｍＭ、約３７５ｍＭ、約４００ｍＭ、約４２５ｍＭ、約４５０ｍＭ、約４７５ｍＭ、約５００ｍＭ、約５２５ｍＭ、約５５０ｍＭ、約５７５ｍＭ、約６００ｍＭ、約６２５ｍＭ、約６５０ｍＭ、約６７５ｍＭ、約７００ｍＭ、約７２５ｍＭ、約７５０ｍＭ、約７７５ｍＭ、約８００ｍＭ、約８２５ｍＭ、約８５０ｍＭ、約８７５ｍＭ、約９００ｍＭ、約９２５ｍＭ、約９５０ｍＭ、約９７５ｍＭ、又は約１０００ｍＭの量で存在する。一実施形態では、少なくとも１種の糖はトレハロースである。

本明細書に開示される実施形態の一態様では、少なくとも１種の糖は、全凍結乾燥混合物の約０．０１％（ｗ／ｗ）～約１０％（ｗ／ｗ）の量で存在する。実施形態の別の態様では、少なくとも１種の糖は、全凍結乾燥混合物の約０．０１％（ｗ／ｗ）、約０．０２％（ｗ／ｗ）、約０．０３％（ｗ／ｗ）、約０．０４％（ｗ／ｗ）、約０．０５％（ｗ／ｗ）、約０．０６％（ｗ／ｗ）、約０．０７％（ｗ／ｗ）、約０．０８％（ｗ／ｗ）、約０．０９％（ｗ／ｗ）、約０．１％（ｗ／ｗ）、約０．１５％（ｗ／ｗ）、約０．２％（ｗ／ｗ）、約０．２５％（ｗ／ｗ）、約０．３％（ｗ／ｗ）、約０．３５％（ｗ／ｗ）、約０．４％（ｗ／ｗ）、約０．４５％（ｗ／ｗ）、約０．５％（ｗ／ｗ）、約０．６％（ｗ／ｗ）、約０．７％（ｗ／ｗ）、約０．８％（ｗ／ｗ）、約０．９％（ｗ／ｗ）、約１％（ｗ／ｗ）、約１．５％（ｗ／ｗ）、約２％（ｗ／ｗ）、約２．５％（ｗ／ｗ）、約３％（ｗ／ｗ）、約３．５％（ｗ／ｗ）、約４％（ｗ／ｗ）、約４．５％（ｗ／ｗ）、約５％（ｗ／ｗ）、約５．５％（ｗ／ｗ）、約６％（ｗ／ｗ）、約６．５％（ｗ／ｗ）、約７％（ｗ／ｗ）、約７．５％（ｗ／ｗ）、約８％（ｗ／ｗ）、約８．５％（ｗ／ｗ）、約９％（ｗ／ｗ）、約９．５％（ｗ／ｗ）、又は約１０％（ｗ／ｗ）の量で存在する。一実施形態では、少なくとも１種の糖はデキストランである。

本明細書に開示される実施形態の別の態様では、少なくとも１種の糖は、約２５ｍＭ～約１０００ｍＭの量のトレハロース及び全凍結乾燥混合物の約０．０１％（ｗ／ｗ）～約５％（ｗ／ｗ）の量のデキストランを含む。
本明細書に開示される一実施形態では、凍結乾燥混合物は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む。本明細書に開示される別の実施形態では、ＨＳＡは、全凍結乾燥混合物の約０．０１％（ｗ／ｗ）～約１０％（ｗ／ｗ）の量で存在する。実施形態の別の態様では、ＨＳＡは、全凍結乾燥混合物の約０．０１％（ｗ／ｗ）、約０．０２％（ｗ／ｗ）、約０．０３％（ｗ／ｗ）、約０．０４％（ｗ／ｗ）、約０．０５％（ｗ／ｗ）、約０．０６％（ｗ／ｗ）、約０．０７％（ｗ／ｗ）、約０．０８％（ｗ／ｗ）、約０．０９％（ｗ／ｗ）、約０．１％（ｗ／ｗ）、約０．１５％（ｗ／ｗ）、約０．２％（ｗ／ｗ）、約０．２５％（ｗ／ｗ）、約０．３％（ｗ／ｗ）、約０．３５％（ｗ／ｗ）、約０．４％（ｗ／ｗ）、約０．４５％（ｗ／ｗ）、約０．５％（ｗ／ｗ）、約０．６％（ｗ／ｗ）、約０．７％（ｗ／ｗ）、約０．８％（ｗ／ｗ）、約０．９％（ｗ／ｗ）、約１％（ｗ／ｗ）、約１．５％（ｗ／ｗ）、約２％（ｗ／ｗ）、約２．５％（ｗ／ｗ）、約３％（ｗ／ｗ）、約３．５％（ｗ／ｗ）、約４％（ｗ／ｗ）、約４．５％（ｗ／ｗ）、約５％（ｗ／ｗ）、約５．５％（ｗ／ｗ）、約６％（ｗ／ｗ）、約６．５％（ｗ／ｗ）、約７％（ｗ／ｗ）、約７．５％（ｗ／ｗ）、約８％（ｗ／ｗ）、約８．５％（ｗ／ｗ）、約９％（ｗ／ｗ）、約９．５％（ｗ／ｗ）、又は約１０％（ｗ／ｗ）の量で存在する。

本明細書に開示される一実施形態では、凍結乾燥混合物は、生物学的材料の保存に従来から使用されている１種又は複数のポリアルコール（例えば、グリセロール）を含む。本明細書に開示される実施形態の一態様では、凍結乾燥混合物は、全凍結乾燥混合物の約０．０１％（ｗ／ｗ）～約５％（ｗ／ｗ）の量のグリセロールを含む。実施形態の別の態様では、グリセロールは、全凍結乾燥混合物の約０．０１％（ｗ／ｗ）、約０．０２％（ｗ／ｗ）、約０．０３％（ｗ／ｗ）、約０．０４％（ｗ／ｗ）、約０．０５％（ｗ／ｗ）、約０．０６％（ｗ／ｗ）、約０．０７％（ｗ／ｗ）、約０．０８％（ｗ／ｗ）、約０．０９％（ｗ／ｗ）、約０．１％（ｗ／ｗ）、約０．１５％（ｗ／ｗ）、約０．２％（ｗ／ｗ）、約０．２５％（ｗ／ｗ）、約０．３％（ｗ／ｗ）、約０．３５％（ｗ／ｗ）、約０．４％（ｗ／ｗ）、約０．４５％（ｗ／ｗ）、約０．５％（ｗ／ｗ）、約０．６％（ｗ／ｗ）、約０．７％（ｗ／ｗ）、約０．８％（ｗ／ｗ）、約０．９％（ｗ／ｗ）、約１％（ｗ／ｗ）、約１．５％（ｗ／ｗ）、約２％（ｗ／ｗ）、約２．５％（ｗ／ｗ）、約３％（ｗ／ｗ）、約３．５％（ｗ／ｗ）、約４％（ｗ／ｗ）、約４．５％（ｗ／ｗ）、及び約５％（ｗ／ｗ）の量で存在する。

本明細書に開示される一実施形態では、凍結乾燥混合物は、ＰＥＧ４００を含む。本明細書に開示される別の実施形態では、ＰＥＧ４００は、全凍結乾燥混合物の約０．０１％（ｗ／ｗ）～約１０％（ｗ／ｗ）の量で存在する。実施形態の別の態様では、ＨＳＡは、全凍結乾燥混合物の約０．０１％（ｗ／ｗ）、約０．０２％（ｗ／ｗ）、約０．０３％（ｗ／ｗ）、約０．０４％（ｗ／ｗ）、約０．０５％（ｗ／ｗ）、約０．０６％（ｗ／ｗ）、約０．０７％（ｗ／ｗ）、約０．０８％（ｗ／ｗ）、約０．０９％（ｗ／ｗ）、約０．１％（ｗ／ｗ）、約０．１５％（ｗ／ｗ）、約０．２％（ｗ／ｗ）、約０．２５％（ｗ／ｗ）、約０．３％（ｗ／ｗ）、約０．３５％（ｗ／ｗ）、約０．４％（ｗ／ｗ）、約０．４５％（ｗ／ｗ）、約０．５％（ｗ／ｗ）、約０．６％（ｗ／ｗ）、約０．７％（ｗ／ｗ）、約０．８％（ｗ／ｗ）、約０．９％（ｗ／ｗ）、約１％（ｗ／ｗ）、約１．５％（ｗ／ｗ）、約２％（ｗ／ｗ）、約２．５％（ｗ／ｗ）、約３％（ｗ／ｗ）、約３．５％（ｗ／ｗ）、約４％（ｗ／ｗ）、約４．５％（ｗ／ｗ）、約５％（ｗ／ｗ）、約５．５％（ｗ／ｗ）、約６％（ｗ／ｗ）、約６．５％（ｗ／ｗ）、約７％（ｗ／ｗ）、約７．５％（ｗ／ｗ）、約８％（ｗ／ｗ）、約８．５％（ｗ／ｗ）、約９％（ｗ／ｗ）、約９．５％（ｗ／ｗ）、又は約１０％（ｗ／ｗ）の量で存在する。

本明細書に記載される実施形態の一態様では、間葉系幹細胞は、凍結乾燥後、陽性マーカーを発現する。実施形態の一態様では、陽性マーカーは、ＣＤ９０、ＣＤ４４、ＣＤ２９、ＣＤ１０５、ＣＤ１３、ＣＤ３４、ＣＤ７３、ＣＤ１６６、ＣＤ１０、ＣＤ４９ｅ及びＣＤ５９からなる群から選択される１種又は複数のマーカーを含む。本明細書に記載される実施形態の別の態様では、間葉系幹細胞の少なくとも約６０％～約９８％が、凍結乾燥後、ＣＤ９０、ＣＤ４４、ＣＤ２９、ＣＤ１０５、ＣＤ１３、ＣＤ３４、ＣＤ７３、ＣＤ１６６、ＣＤ１０、ＣＤ４９ｅ及びＣＤ５９からなる群から選択される１種又は複数のマーカーを発現する。本明細書に記載される実施形態のさらに別の態様では、凍結乾燥後の間葉系幹細胞の少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも９６％、少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％が、ＣＤ９０、ＣＤ４４、ＣＤ２９、ＣＤ１０５、ＣＤ１３、ＣＤ３４、ＣＤ７３、ＣＤ１６６、ＣＤ１０、ＣＤ４９ｅ及びＣＤ５９からなる群から選択される１種又は複数のマーカーを発現する。

本明細書に記載される実施形態の一態様では、間葉系幹細胞は、凍結乾燥後、陰性マーカーを発現する。実施形態の一態様では、陰性マーカーは、ＣＤ３１、ＣＤ４５、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ５６及びＣＤ１４６からなる群から選択される１種又は複数を含む。本明細書に記載される実施形態の別の態様では、間葉系幹細胞の約２％～約２０％以下が、凍結乾燥後、ＣＤ３１、ＣＤ４５、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ５６及びＣＤ１４６からなる群から選択される１種又は複数のマーカーを発現する。さらに別の実施形態では、間葉系幹細胞の約２％以下、約４％以下、約６％以下、約８％以下、約１０％以下、約１２％以下、約１４％、約１６％以下、約１８％以下、又は約２０％以下が、凍結乾燥後、ＣＤ３１、ＣＤ４５、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ５６及びＣＤ１４６からなる群から選択される１種又は複数のマーカーを発現する。
本明細書に記載される実施形態の一態様では、凍結乾燥後の間葉系幹細胞の染色体、ゲノム、及びエピゲノムプロファイルを、インビトロ増殖中の異なる継代で評価及び比較することができる。
本明細書に記載される実施形態の一態様では、凍結乾燥後、凍結乾燥間葉系幹細胞はケーキになる。このようなケーキは薬学的に許容されるべきである。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容されるケーキ」とは、ある特定の望ましい性質、例えば、薬学的に許容される、長期安定性、短い再構成時間、洗練された外観及び再構成時の元の溶液の性質の維持などを有する、凍結乾燥後に残る非崩壊固形医薬品を指す。薬学的に許容されるケーキは、固体、粉末又は粒状材料であり得る。薬学的に許容されるケーキは、質量でケーキの最大５パーセントの水を含有することもできる。
本発明をその特定の実施形態に関して説明してきたが、ある特定の修正及び均等物は当業者には明らかであり、本発明の範囲内に含まれることが意図される。

本開示は、特定の実施形態に関連して以下でさらに説明され、本開示の利点及び特徴はその説明によってより明らかになるであろう。しかし、これらの実施形態は単なる例示であり、本開示の範囲を限定するものではない。当業者は、本開示の技術的解決策の詳細及び形態は、本開示の精神及び範囲から逸脱することなく変更又は置き換えることができるが、これらの修正及び置き換えは、本開示の保護範囲内に含まれることを理解すべきである。

（実施例１）
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）に対する凍結乾燥の効果を、成分の種々の組合せの存在下で細胞を異なる凍結乾燥プロトコールに曝露することによって研究した。凍結乾燥の前後で、細胞の生存率を分析した。

ａ．細胞懸濁液の調製
細胞を増殖培地（ＤＭＥＭ－ＬＧ）で増殖させて、９０％コンフルエンシーに到達させた。９０％コンフルエンスに達したら、細胞をＤＭＥＭ－ＬＧ中の１００ｍＭトレハロースに３７℃で２４時間曝露した。次に細胞をトリプシン処理し、凍結乾燥溶液の９種の異なる組合せに再懸濁した。細胞懸濁液の一部を使用して、フローサイトメトリーによる凍結乾燥前の生存率及び細胞表面マーカー分析を実行した。

すべての溶液を、フェノールレッド、グルコース及びＬ－グルタミンを含まないＤＭＥＭ－ＬＧで調製した（ビヒクル）。

上の表からわかるように、７ＡＡＤ染色によって分析された観察による凍結乾燥前の細胞生存率は７８．９６％である。細胞表面マーカー分析は、細胞集団の６５．７１％がＣＤ９０発現、細胞集団の６５．１８％がＣＤ７３発現、及び細胞集団の５６．２５％がＣＤ１０５発現を示す。

ｂ．フローサイトメトリーによる凍結乾燥後の生存率分析：
凍結乾燥細胞の生存率を、凍結乾燥の１７日後に７ＡＡＤ染色によって分析した。凍結乾燥生成物の各組合せを、１×ＰＢＳ中で個別に再構成し、細胞を３００ｇで遠心分離してペレットを得た。ペレットを、１×ＰＢＳに再懸濁した。次に、細胞を７ＡＡＤ色素で染色し、フローサイトメトリーで細胞生存率を分析した。
表２に示す間葉系幹細胞凍結乾燥混合物の各組合せを、凍結乾燥させた。凍結乾燥後、凍結乾燥生成物を２０ｍｍアルミニウムフリップシールで密封し、２～８℃で最低１４日間保管した。

（実施例２）
実施例１と同様に、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）に対する凍結乾燥の効果を、成分の種々の組合せの存在下で細胞を異なる凍結乾燥プロトコールに曝露することによって研究した。凍結乾燥の前後で、細胞の生存率を分析した。

ａ．細胞懸濁液の調製
細胞を増殖培地（ＤＭＥＭ－ＬＧ）で増殖させて、９０％コンフルエンシーに到達させた。９０％コンフルエンスに達したら、細胞をＤＭＥＭ－ＬＧ中の１００ｍＭトレハロースに３７℃で２４時間曝露した。次に細胞をトリプシン処理し、凍結乾燥溶液の９種の異なる組合せに再懸濁した。細胞懸濁液の一部を使用して、フローサイトメトリーによる凍結乾燥前の生存率及び細胞表面マーカー分析を実行した。

すべての溶液を、フェノールレッド、グルコース及びＬ－グルタミンを含まないＤＭＥＭ－ＬＧで調製した（ビヒクル）。

上の表からわかるように、７ＡＡＤ染色によって分析された観察による凍結乾燥前の細胞生存率は６６．７１％である。細胞表面マーカー分析は、細胞集団の８０．１２％がＣＤ９０発現、細胞集団の９１．２０％がＣＤ７３発現、及び細胞集団の３８．７５％がＣＤ１０５発現を示す。
表６に示す間葉系幹細胞凍結乾燥混合物の各組合せを、凍結乾燥させた。凍結乾燥後、凍結乾燥生成物を２０ｍｍアルミニウムフリップシールで密封し、２～８℃で最低１４日間保管した。

ｂ．フローサイトメトリーによる凍結乾燥後の生存率分析：
凍結乾燥細胞の生存率を、凍結乾燥の１７日後に７ＡＡＤ染色によって分析した。簡単に言うと、凍結乾燥生成物の各組合せを、１×ＰＢＳ中で個別に再構成し、細胞を３００ｇで遠心分離してペレットを得た。ペレットを、１×ＰＢＳに再懸濁した。次に、細胞を７ＡＡＤ色素で染色し、フローサイトメトリーで細胞生存率を分析した。

実施例１及び実施例２で得られた初期結果に留意して、種々の実験を計画し実行した、以下の実施例は、現在本発明の最も実用的で好ましい実施形態と考えられるものに関連してさらに詳細を提供する。

（実施例３）
実施例１及び実施例２と同様に、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）に対する凍結乾燥の効果を、成分の種々の組合せの存在下で細胞を異なる凍結乾燥プロトコールに曝露することによって研究した。凍結乾燥の前後で、細胞の生存率を分析した。

細胞を増殖培地（ＤＭＥＭ－ＬＧ）で増殖させて、９０％コンフルエンシーに到達させた。９０％コンフルエンスに達したら、細胞をＤＭＥＭ－ＬＧ中の１００ｍＭトレハロースに３７℃で２４時間曝露した。次に細胞をトリプシン処理し、凍結乾燥溶液の６種の組合せに再懸濁した。細胞懸濁液の一部を使用して、フローサイトメトリーによる凍結乾燥前の生存率及び細胞表面マーカー分析を実行した。

すべての溶液を、フェノールレッド、グルコース及びＬ－グルタミンを含まないＤＭＥＭ－ＬＧで調製した（ビヒクル）。
フローサイトメトリーによる凍結乾燥前の生存率及び細胞表面マーカー分析

上の表からわかるように、７ＡＡＤ染色によって分析された観察による凍結乾燥前の細胞生存率は１００％である。
表１０に記載のように、間葉系幹細胞凍結乾燥混合物の各組合せを、凍結乾燥させた。凍結乾燥後、凍結乾燥生成物を含有するバイアルを密封し、２～８０℃で最低１４日間保管した。
フローサイトメトリーによる凍結乾燥後の生存率及び細胞表面マーカー分析：
凍結乾燥細胞の１セットの生存率を、凍結乾燥２日後に７ＡＡＤ染色によって分析した。ＭＳＣ特異的表面マーカーを、対応する抗体で細胞を染色することによって分析した。
簡単に言うと、凍結乾燥生成物の各組合せを、１×ＰＢＳ中で個別に再構成し、細胞を３００ｇで遠心分離してペレットを得た。ペレットを、１×ＰＢＳに再懸濁した。次に、細胞の一部を７ＡＡＤ色素で染色し、フローサイトメトリーにより細胞生存率を分析した（その結果を表１２に示す）。残りの細胞を、ＭＳＣ特異的表面マーカー抗体で染色した（その結果を表１３に示す）。

（実施例４）
フローサイトメトリーによる凍結乾燥溶液の以下の７種の組合せについての凍結乾燥前の生存率及び細胞表面マーカー分析を、実施例３に記載の手順に従って実行した（継代番号：Ｐ４）。

すべての溶液を、フェノールレッド、グルコース及びＬ－グルタミンを含まないＤＭＥＭ－ＬＧで調製した（ビヒクル）。

フローサイトメトリーによる凍結乾燥後の生存率及び細胞表面マーカー分析
凍結乾燥の１０日後、実施例３に記載の手順に従って、生存率及びＭＳＣ特異的表面マーカーを分析した。図１は、組合せ４Ａ～４Ｇの凍結乾燥ケーキの代表的な画像を示す。

（実施例５）
フローサイトメトリーによる凍結乾燥溶液の以下の２４種の組合せについての凍結乾燥前の生存率及び細胞表面マーカー分析を、実施例３に記載の手順に従って実行した（継代番号：Ｐ８）。

すべての溶液を、フェノールレッド、グルコース及びＬ－グルタミンを含まないＤＭＥＭ－ＬＧで調製した（ビヒクル）。
フローサイトメトリーによる凍結乾燥前の生存率及び細胞表面マーカー分析

フローサイトメトリーによる凍結乾燥後の生存率及び細胞表面マーカー分析：
凍結乾燥の１５日後、実施例３に記載の手順に従って、生存率及びＭＳＣ特異的表面マーカーを分析した。図２は、組合せ５Ａ～５Ｘの凍結乾燥ケーキの代表的な画像を示す。

（実施例６）
フローサイトメトリーによる凍結乾燥溶液の以下の２５種の組合せについての凍結乾燥前の生存率及び細胞表面マーカー分析を、実施例３に記載の手順に従って実行した（継代番号：Ｐ６）。

すべての溶液を、フェノールレッド、グルコース及びＬ－グルタミンを含まないＤＭＥＭ－ＬＧで調製した（ビヒクル）。
フローサイトメトリーによる凍結乾燥前の生存率及び細胞表面マーカー分析

フローサイトメトリーによる凍結乾燥後の生存率及び細胞表面マーカー分析：
凍結乾燥の１６日後、実施例３に記載の手順に従って、生存率（表２４）及びＭＳＣ特異的表面マーカー（表２５）を分析した。図３は、組合せ６Ａ～６Ｚの凍結乾燥ケーキの代表的な画像を示す。

（実施例７）
フローサイトメトリーによる凍結乾燥溶液の以下の２３種の組合せについての凍結乾燥前の生存率及び細胞表面マーカー分析を、実施例３に記載の手順に従って実行した（継代番号：Ｐ６）。

すべての溶液を、フェノールレッド、グルコース及びＬ－グルタミンを含まないＤＭＥＭ－ＬＧで調製した（ビヒクル）。
フローサイトメトリーによる凍結乾燥前の生存率及び細胞表面マーカー分析

フローサイトメトリーによる凍結乾燥後の生存率及び細胞表面マーカー分析：
凍結乾燥の１８日後、実施例３に記載の手順に従って、生存率及びＭＳＣ特異的表面マーカーを分析した。図４は、組合せ７Ａ～７Ｘの凍結乾燥ケーキの代表的な画像を示す。

（実施例８）
フローサイトメトリーによる凍結乾燥溶液の以下の１５種の組合せについての凍結乾燥前の生存率及び細胞表面マーカー分析を、実施例３に記載の手順に従って実行した（継代番号：Ｐ２）。

すべての溶液を、フェノールレッド、グルコース及びＬ－グルタミンを含まないＤＭＥＭ－ＬＧで調製した（ビヒクル）。

フローサイトメトリーによる凍結乾燥後の生存率及び細胞表面マーカー分析：
凍結乾燥の２４日後、実施例３に記載の手順に従って、生存率及びＭＳＣ特異的表面マーカーを分析した。８Ｎ、８Ｏ、及び８Ｐの組合せでは、凍結乾燥生成物は吹き出しを示した。図５は、組合せ８Ａ～８Ｍの凍結乾燥ケーキの代表的な画像を示す。

（実施例９）
フローサイトメトリーによる凍結乾燥溶液の以下の１０種の組合せについての凍結乾燥前の生存率及び細胞表面マーカー分析を、実施例３に記載の手順に従って実行した（継代番号：Ｐ５）。

すべての溶液を、フェノールレッド、グルコース及びＬ－グルタミンを含まないＤＭＥＭ－ＬＧで調製した（ビヒクル）。

フローサイトメトリーによる凍結乾燥後の生存率及び細胞表面マーカー分析：
凍結乾燥の３０日後、実施例３に記載の手順に従って、生存率及びＭＳＣ特異的表面マーカーを分析した。図６は、組合せ９Ａ～９Ｋの凍結乾燥ケーキの代表的な画像を示す。

（実施例１０）
フローサイトメトリーによる凍結乾燥溶液の以下の２種の組合せについての凍結乾燥前の生存率及び細胞表面マーカー分析を、実施例３に記載の手順に従って実行した（継代番号：Ｐ４）。

すべての溶液を、フェノールレッド、グルコース及びＬ－グルタミンを含まないＤＭＥＭ－ＬＧで調製した（ビヒクル）。

フローサイトメトリーによる凍結乾燥後の生存率及び細胞表面マーカー分析：
凍結乾燥の３０日後、実施例３に記載の手順に従って、生存率及びＭＳＣ特異的表面マーカーを分析した。図７は、組合せ１０Ａ～１０Ｂの凍結乾燥ケーキの代表的な画像を示す。

（実施例１１）
フローサイトメトリーによる凍結乾燥溶液の以下の２３種の組合せについての凍結乾燥前の生存率及び細胞表面マーカー分析を、実施例３に記載の手順に従って実行した（継代番号：Ｐ３）。

すべての溶液を、フェノールレッド、グルコース及びＬ－グルタミンを含まないＤＭＥＭ－ＬＧで調製した（ビヒクル）。

フローサイトメトリーによる凍結乾燥後の生存率及び細胞表面マーカー分析：
凍結乾燥の４８日後、実施例３に記載の手順に従って、生存率及びＭＳＣ特異的表面マーカーを分析した。図８は、組合せ１１Ａ～１１Ｖの凍結乾燥ケーキの代表的な画像を示す。

（実施例１２）
フローサイトメトリーによる凍結乾燥溶液の以下の６種の組合せについての凍結乾燥前の生存率及び細胞表面マーカー分析を、実施例３に記載の手順に従って実行した（継代番号：Ｐ３）。

すべての溶液を、フェノールレッド、グルコース及びＬ－グルタミンを含まないＤＭＥＭ－ＬＧで調製した（ビヒクル）。

フローサイトメトリーによる凍結乾燥後の生存率及び細胞表面マーカー分析：
凍結乾燥の６０日後、実施例３に記載の手順に従って、生存率及びＭＳＣ特異的表面マーカーを分析した。図９は、組合せ１２Ａ～１２Ｆの凍結乾燥ケーキの代表的な画像を示す。

（実施例１３）
フローサイトメトリーによる凍結乾燥溶液の以下の４種の組合せについての凍結乾燥前の生存率及び細胞表面マーカー分析を、継代番号：Ｐ８で、実施例３に記載の手順に従って実行した。

すべての溶液を、フェノールレッド、グルコース及びＬ－グルタミンを含まないＤＭＥＭ－ＬＧで調製した（ビヒクル）。

フローサイトメトリーによる凍結乾燥後の生存率及び細胞表面マーカー分析：
凍結乾燥の１６５日（５．５か月）後、実施例３に記載の手順に従って、生存率及びＭＳＣ特異的表面マーカーを分析した。

上記の実施例から、本明細書に記載される、３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、３Ｅ、３Ｆ、４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、４Ｅ、４Ｆ、４Ｇ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｅ、５Ｈ、５Ｉ、５Ｊ、５Ｑ、５Ｒ、６Ｂ、６Ｃ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｄ、７Ｅ、７Ｆ、７Ｇ、７Ｈ、７Ｉ、７Ｊ、７Ｋ、７Ｌ、７Ｍ、７Ｎ、７Ｏ、７Ｐ、７Ｑ、７Ｒ、７Ｓ、７Ｔ、７Ｕ、７Ｖ、７Ｗ、８Ｃ、８Ｅ、８Ｈ、８Ｊ、８Ｋ、８Ｌ、８Ｍ、１０Ａ、１０Ｂ、１１Ａ、１１Ｃ、１１Ｄ、１１Ｅ、１１Ｇ、１１Ｈ、１１Ｉ、１１Ｊ、１１Ｋ、１１Ｌ、１１Ｍ、１１Ｎ、１１Ｏ、１１Ｐ、１１Ｑ、１１Ｒ、１１Ｓ、１１Ｔ、１１Ｕ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｅなどの７６種の組合せは、凍結乾燥後の生存率の減少が３０％未満である（生存率＞７０％）ことを示した。
以下の表５４に、凍結乾燥後の細胞生存率の比較結果を要約し、ここで、凍結乾燥細胞は２～８℃で保存し、凍結乾燥後の細胞生存率について種々の時点で分析した。

CN=組合せ番号;PL=凍結乾燥後
上の表の結果は、種々の組合せが再現可能な細胞生存率を示し、長期間（２～１６５日）保管した後でも安定であることを示している。

Claims (37)

1. 間葉系幹細胞の凍結乾燥粉末。
2. 間葉系幹細胞が、臍帯間葉系幹細胞、胎盤間葉系幹細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞、角膜輪部組織由来間葉系幹細胞、及び骨髄間葉系幹細胞、並びにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の間葉系幹細胞凍結乾燥粉末。
3. 間葉系幹細胞が、脂肪組織由来間葉系幹細胞である、請求項１に記載の間葉系幹細胞凍結乾燥粉末。
4. 間葉系幹細胞が、ヒト間葉系幹細胞である、請求項１に記載の間葉系幹細胞凍結乾燥粉末。
5. 間葉系幹細胞が、ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞である、請求項１に記載の間葉系幹細胞凍結乾燥粉末。
6. 間葉系幹細胞が、成分の種々の組合せの存在下で異なる凍結乾燥プロトコールに曝露される、請求項１～５のいずれか１項に記載の間葉系幹細胞凍結乾燥粉末。
7. 凍結乾燥混合物中の間葉系幹細胞が、成分の種々の組合せを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の間葉系幹細胞凍結乾燥粉末。
8. 請求項７に記載の成分を含む間葉系幹細胞凍結乾燥粉末であって、成分が、凍結保護剤、ヒト血清アルブミン、グリセロール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）からの１種又は複数から選択される、間葉系幹細胞凍結乾燥粉末。
9. 請求項７に記載の成分を含む間葉系幹細胞凍結乾燥粉末であって、成分がヒト血清アルブミンである、間葉系幹細胞凍結乾燥粉末。
10. 凍結保護剤が、トレハロース、スクロース、ラクトース、グルコース、ラフィノース、デキストラン、マンニトール、ソルビトール又はキシリトールのうちの１種又はいくつかの混合物から選択される、請求項８に記載の成分。
11. 凍結保護剤がトレハロースである、請求項８及び１０に記載の成分。
12. 凍結保護剤がデキストランである、請求項８及び１０に記載の成分。
13. 凍結乾燥保護剤が、トレハロースとデキストランとの組合せである、請求項８及び１０に記載の成分。
14. 凍結乾燥混合物中の間葉系幹細胞が、ヒト血清アルブミンを含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の間葉系幹細胞凍結乾燥粉末。
15. 凍結乾燥混合物中の間葉系幹細胞が、（ａ）ヒト血清アルブミン、及び（ｂ）トレハロースを含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の間葉系幹細胞凍結乾燥粉末。
16. 凍結乾燥混合物中の間葉系幹細胞が、（ａ）ヒト血清アルブミン、（ｂ）トレハロース、及び（ｃ）グリセロールを含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の間葉系幹細胞凍結乾燥粉末。
17. 凍結乾燥混合物中の間葉系幹細胞が、（ａ）ヒト血清アルブミン、（ｂ）トレハロース、（ｃ）グリセロール、及び（ｄ）デキストランを含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の間葉系幹細胞凍結乾燥粉末。
18. 凍結乾燥混合物中の間葉系幹細胞が、（ａ）ヒト血清アルブミン、（ｂ）トレハロース、（ｃ）グリセロール、（ｄ）デキストラン、及び（ｅ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の間葉系幹細胞凍結乾燥粉末。
19. 凍結乾燥混合物中の間葉系幹細胞が、（ａ）ヒト血清アルブミン、（ｂ）トレハロース、（ｃ）グリセロール、（ｄ）デキストラン、及び（ｅ）ＰＥＧ４００を含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の間葉系幹細胞凍結乾燥粉末。
20. 凍結乾燥後の間葉系幹細胞の生存率が約１５％～約９７％の間である、請求項１～１９のいずれか１項に記載の間葉系幹細胞凍結乾燥粉末。
21. 凍結乾燥後の間葉系幹細胞の生存率が約２５％～約９０％の間である、請求項１～１９のいずれか１項に記載の間葉系幹細胞凍結乾燥粉末。
22. 凍結乾燥後の間葉系幹細胞の生存率が約０％～約３０％に減少又は低下する、請求項１～２０のいずれか１項に記載の間葉系幹細胞凍結乾燥粉末。
23. 凍結乾燥後に薬学的に許容されるケーキを形成する、請求項１～２２のいずれか１項に記載の凍結乾燥間葉系幹細胞。
24. 凍結乾燥間葉系幹細胞が、長期保存、費用効果の高い方法での試料の容易な輸送及び流通に有利である、請求項１～２３のいずれか１項に記載の間葉系幹細胞凍結乾燥粉末。
25. 室温で保管される、請求項１～２４のいずれか１項に記載の凍結乾燥間葉系幹細胞。
26. 安全であり、輸送が容易である、請求項１～２４のいずれか１項に記載の凍結乾燥間葉系幹細胞。
27. 輸送後に安定である、請求項１～２４のいずれか１項に記載の凍結乾燥間葉系幹細胞。
28. 凍結乾燥間葉系幹細胞の薬学的に許容されるケーキ。
29. 間葉系幹細胞が、ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞である、請求項２８に記載の凍結乾燥間葉系幹細胞の薬学的に許容されるケーキ。
30. 固体、粉末又は粒状材料であり得る、請求項２８に記載の凍結乾燥間葉系幹細胞の薬学的に許容されるケーキ。
31. 質量でケーキの最大５パーセントの水を含有する、請求項２８～３０に記載の凍結乾燥間葉系幹細胞の薬学的に許容されるケーキ。
32. 間葉系幹細胞が、成分の種々の組合せの存在下で異なる凍結乾燥プロトコールに曝露される、請求項２８～３０のいずれか１項に記載の凍結乾燥間葉系幹細胞の薬学的に許容されるケーキ。
33. 凍結乾燥混合物中の間葉系幹細胞が、成分の種々の組合せを含む、請求項２８～３０のいずれか１項に記載の凍結乾燥間葉系幹細胞の薬学的に許容されるケーキ。
34. 成分が、凍結保護剤、ヒト血清アルブミン、グリセロール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）からの１種又は複数から選択される、請求項２８～３０のいずれか１項に記載の凍結乾燥間葉系幹細胞の薬学的に許容されるケーキ。
35. 請求項３４に記載の成分を含む凍結乾燥間葉系幹細胞の薬学的に許容されるケーキであって、成分がヒト血清アルブミンである、凍結乾燥間葉系幹細胞の薬学的に許容されるケーキ。
36. 凍結保護剤が、トレハロース、スクロース、ラクトース、グルコース、ラフィノース、デキストラン、マンニトール、ソルビトール又はキシリトールのうちの１種又はいくつかの混合物から選択される、請求項３４に記載の成分。
37. 凍結乾燥後の間葉系幹細胞の生存率が約１５％～約９７％の間である、請求項２８～３４のいずれか１項に記載の凍結乾燥間葉系幹細胞の薬学的に許容されるケーキ。

Images