CN116867370A

CN116867370A - 冻干间充质干细胞

Info

Publication number: CN116867370A
Application number: CN202180094167.7A
Authority: CN
Inventors: 哈比·F·赫里基瓦拉; V·夏尔马; Z·霍拉基瓦拉
Original assignee: Ha BiFHelijiwala
Current assignee: Ha BiFHelijiwala
Priority date: 2020-12-19
Filing date: 2021-12-19
Publication date: 2023-10-10
Also published as: MX2023007271A; JP2024501087A; AU2021402425A9; ZA202307198B; US20240060049A1; EP4262385A1; KR20230157938A; CA3205626A1; WO2022130354A1; AU2021402425A1

Abstract

本发明属于干细胞技术领域。具体地，本公开涉及间充质干细胞的冻干粉末。更具体地，本公开涉及冻干的脂肪组织衍生的间充质干细胞。本公开还涉及冻干的间充质干细胞以经济有效的方式用于长期保存、轻松运输和样品分配的有利用途。

Description

冻干间充质干细胞

相关专利申请

本申请要求2020年12约19日提交的第202021055334号的印度专利申请的优先权和权益，其公开内容通过引用全文纳入本文，等效于在本文中全部再写。

技术领域

本发明涉及干细胞研究领域。具体地，本公开涉及间充质干细胞的冻干粉末。更具体地，本公开涉及冻干的脂肪组织衍生的间充质干细胞。本公开还涉及冻干间充质干细胞以经济有效的方式用于长期保存、轻松运输和样品分配的有利用途。

发明背景

如今，由于导致许多重要器官(例如肝脏和心脏)的终末期衰竭的慢性疾病(例如肝硬化和心肌缺血)的发病率不断增加，器官移植的需求迅速增长。已故捐献者的器官供应量仍然很低，不足以满足不断增长的需求。因此，移植器官的短缺已成为世界范围内的重大危机。为了解决器官短缺的问题，强调在治疗中利用人干细胞的再生医学迅速发展。

干细胞是许多生物医学应用的最终候选者，特别是基于细胞的疗法和再生医学。干细胞分为两大类：从囊胚的内细胞团获得的胚胎干细胞(ESC)和成体干细胞，特别是在成体组织中发现的间充质干细胞(MSC)。MSC在临床应用中相比胚胎干细胞(ESC)和其他体细胞具有许多优势。MSC是具有强免疫抑制特性的多潜能细胞。可以从人体的不同部位(例如骨髓和脂肪组织)获取这些细胞。

脂肪组织作为干细胞来源是广泛可得的，并且相较于其他来源具有多种优势。利用微创采集程序可以轻松获得大量干细胞，并且分离脂肪衍生的间充质基质/干细胞(ASC)将产生大量干细胞，而这对于基于干细胞的治疗和组织工程改造而言至关重要。多项研究提供的证据表明，原位ASC存在于血管周围微环境中，而ASC在天然脂肪组织中的确切定位仍存在争议。ASC通过其粘附塑料的能力而分离。然而，最近的分离和培养技术缺乏标准化。

当前，人脂肪衍生的干细胞(hASC)代表了间充质样干细胞的可行来源，其具有与骨髓衍生的间充质干细胞(BM-MSC)相似的特性和分化潜力，但具有不同且更容易获得的来源——脂肪组织。hASC能够产生有助于正常伤口愈合的几乎所有因子，因此，它们对于所有类型的组织工程改造(TE)和再生医学应用是优选的。人脂肪衍生的干细胞(hASC)目前被认为是对于再生医学而言有吸引力且有效的成体干细胞类型。尽管如此，仍然存在一些需要澄清的问题，包括hASC之间的相互作用机制及其长期安全性。到目前为止，仅进行了少量临床试验。大多数涉及hASC或富含hASC的脂肪移植物的临床试验都是初始阶段的临床试验(I期或II期)，只有1项试验在人对象中达到了IV期(NCT00616135)。

Murphy,MB等(Exp.Mol.Med.2013,45-54)和Fierabracci,A等(Curr.Med.Chem.2016,23,3014-3024)将间充质干/基质细胞(MSC)描述为治疗各种疾病的有效工具，因为它们具有组织保护和修复机制。Galipeau,J等(Cell Stem Cell 2018,22,824-833)注意到MSC的治疗效果，该治疗效果已通过截至2018年3月31日在美国进行的近810项全球临床试验所证明，并治疗了多种疾病。然而，MSC的储存是复杂且昂贵的。MSC储存常用的方法是使用液氮冷冻保存。

截至目前，冷冻保存是长期保存和储存细胞(包括hMSC)的有效方法。冷冻保存采用的原理是利用超低温(约-196℃，例如液氮)来停止细胞的代谢活动，同时维持细胞的生命和细胞功能。冷冻保存对于汇集MSC以获得临床应用(例如基于细胞的疗法和再生医学)所需的细胞计数非常有效。冷冻保存后，非常重要的是保留MSC的功能特性，包括免疫调节特性和多谱系分化能力。此外，在临床应用之前对低温保存的MSC进行生物安全性评估是至关重要的。然而，现有的针对MSC的冷冻保存方法存在明显的局限性，因此需要建立新的或改进的方法，以便更有效地将MSC用于基于干细胞的疗法。

Elia Bari等(Cells 2018,7,190)提供了针对间充质干/基质冻干的分泌蛋白质组(secretome)的试生产工艺，该工艺在经验证的符合良好生产规范(GMP)的细胞工厂中进行。分泌蛋白质组通过超滤从培养物上清液中纯化，添加到冷冻保护剂中，冻干并表征。由此获得了冻干的、“现成即用的”且游离的含有胞外囊泡和蛋白质的可溶性粉末。美国专利申请号2016/0089401A1涉及与使用水性海藻糖介质悬浮细胞相关的方法以及细胞组合物。

总而言之，当前为了有效保存用于临床应用的MSC所面临的挑战是人间充质干细胞的恢复和脱水潜力，即能够使其在没有特殊冷冻保护包装的情况下进行海岸间运输并且能够保留其生长和功能特征。因此，需要旨在改善这种情况的解决方案。

Bissoyi,A.等在一篇关注间充质干细胞冻干和干燥最新进展和未来方向的综述文章中总结道：“由于现有方案无法确保稳健的细胞恢复，因此为了成功地进行MSC的水生生物(hydrobiotic)工程改造，需要加强保护措施。虽然发现冻干和干燥在某些情况下是有效的，但是个别方法的局限性使其实施在一定程度上受到拘束。与此同时，另一个需要解决的关键问题是在长期储存中保持干燥细胞的活力。”(Stem Cells International.第2016卷,Article ID 3604203)。该综述文章为干细胞研究人员提出了挑战，即证明间充质干细胞的冻干保留相当大的细胞活力以及所需的其他优点，例如室温下的样品稳定性，明确的多孔产品结构，易于通过加水或水性溶液来重建以及易于运输。

当前，发明人惊奇地发现，根据本发明的冻干间充质干细胞可以实现约15％至约97％的细胞活力。此外，这些冻干间充质干细胞适合在室温下储存，并且易于运输和分配。

发明内容

考虑到该领域的背景，对于间充质干细胞的使用，发明人发现了这样需求，即需要以能够在保证高细胞活力的情况下将间充质干细胞迅速投入使用的方式保存间充质干细胞。

发明人在干细胞研究领域工作期间令人惊讶地观察到，根据本发明的冻干间充质干细胞具有约15％至约97％的细胞活力。这些根据本发明的冻干的间充质干细胞可以适合在室温下储存，并且易于运输和分配。

本发明还涉及由冻干产生的药学上可接受的饼(cake)。

在一个实施方式中，本公开提供了冻干的MSC。

在一个实施方式中，本公开提供了间充质干细胞的冻干粉末。

在本文所述实施方式的一方面中，间充质干细胞选自下组：脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脂肪组织衍生的间充质干细胞、角膜缘组织衍生的间充质干细胞和骨髓间充质干细胞及其组合。

在本文所述实施方式的另一方面中，间充质干细胞是脂肪组织衍生的间充质干细胞。

在本文所述实施方式的另一方面中，间充质干细胞是人间充质干细胞。

在本文所述实施方式的另一方面中，间充质干细胞是人脂肪组织衍生的间充质干细胞。

在本文所述实施方式的另一方面中，间充质干细胞在各种成分组合存在的情况下暴露于不同的冻干方案。

在本文所述实施方式的另一方面中，冻干混合物中的间充质干细胞包含成分的各种组合。

在本文所述实施方式的另一方面中，间充质干细胞冻干粉末包含成分，其中所述成分选自冻干保护剂、人血清白蛋白、甘油、聚乙二醇(PEG)中的一种或多种。

在本文所述实施方式的一方面中，间充质干细胞的冻干粉末包含间充质干细胞和冻干混合物。

在本文所述实施方式的另一方面中，冻干混合物包含至少一种选自下组的冻干保护剂：海藻糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、棉子糖、葡聚糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇及其混合物。

在本文所述实施方式的一方面中，至少一种冻干保护剂是海藻糖。

在本文所述实施方式的一方面中，至少一种冻干保护剂是葡聚糖。

在本文所述实施方式的一方面中，至少一种冻干保护剂包括海藻糖和葡聚糖的组合。

在本文所述实施方式的另一方面中，冻干混合物包含人血清白蛋白。

在本文所述实施方式的另一方面中，冻干混合物包含甘油。

在本文所述实施方式的另一方面中，冻干混合物包含聚乙二醇(PEG)。在该实施方式的一方面中，冻干混合物包含PEG 400、PEG 6000和/或PEG 8000。

在本文所述实施方式的另一方面中，冻干混合物包含：(a)人血清白蛋白和(b)海藻糖。

在本文所述实施方式的另一方面中，冻干混合物包含：(a)人血清白蛋白、(b)海藻糖和(c)甘油。

在本文所述实施方式的另一方面中，冻干混合物包含：(a)人血清白蛋白、(b)海藻糖、(c)甘油和(d)葡聚糖。

在本文所述实施方式的另一方面中，冻干混合物包含：(a)人血清白蛋白、(b)海藻糖、(c)甘油、(d)葡聚糖和(e)聚乙二醇(PEG)。

在本文所述实施方式的另一方面中，冻干混合物包含：(a)人血清白蛋白、(b)海藻糖、(c)甘油、(d)葡聚糖和(e)PEG 400。

在本文所述实施方式的另一方面中，冻干混合物包含：(a)人血清白蛋白，(b)海藻糖，(c)甘油，(d)葡聚糖，和(e)PEG 400、PEG 6000和/或PEG 8000。

在本文所述实施方式的另一方面中，冻干混合物包含：(a)人血清白蛋白、(b)海藻糖、(c)PEG 400和(d)PEG 8000。

在本发明的一方面中，描述了由冻干间充质干细胞产生的药学上可接受的饼。

在本发明的另一方面中，冻干间充质干细胞在室温下保存。

在本发明的另一方面中，冻干间充质干细胞安全且易于运输。

在本发明的另一方面中，冻干间充质干细胞在运输后是稳定的。

在本文所述实施方式的一方面中，间充质细胞的冻干粉末包含间充质干细胞和本文所述的冻干混合物，其中间充质干细胞的活力在冻干后维持在约15％至约97％之间。

在本文所述实施方式的一方面中，间充质细胞的冻干粉末包含间充质干细胞和本文所述的冻干混合物，其中间充质干细胞的活力在冻干后维持在约25％至约90％之间。

在本文所述实施方式的另一方面中，间充质细胞的冻干粉末包含间充质干细胞和本文所述的冻干混合物，其中间充质干细胞的活力在冻干后降低或下降约0％至约30％。

在本文所述实施方式的另一方面中，冻干粉末中的冻干间充质干细胞能够长期保存。此外，冻干粉末还提供了其他优势，即以经济高效的方式轻松运输和分配样品。

在本文所述实施方式的另一方面中，描述了冻干间充质干细胞在药学上可接受的饼。

在本文所述实施方式的另一方面中，描述了冻干间充质干细胞在药学上可接受的饼，其中所述间充质干细胞是人脂肪组织衍生的间充质干细胞。

在本文所述实施方式的另一方面中，冻干间充质干细胞在药学上可接受的饼可以是固体、粉末或颗粒材料。

在本文所述实施方式的另一方面中，冻干间充质干细胞在药学上可接受的饼含有按饼重量计最多5％的水。

在本文所述实施方式的另一方面中，描述了冻干间充质干细胞在药学上可接受的饼，其中间充质干细胞在成分的各种组合存在的情况下暴露于不同的冻干方案。

在本文所述实施方式的另一方面中，描述了冻干间充质干细胞在药学上可接受的饼，其中冻干混合物中的间充质干细胞包含成分的各种组合。

在本文所述实施方式的另一方面中，描述了冻干间充质干细胞在药学上可接受的饼，其中成分选自冻干保护剂、人血清白蛋白、甘油、聚乙二醇(PEG)中的一种或多种。

在本文所述的实施方式的另一方面中，冻干间充质干细胞在药学上可接受的饼包含成分，其中所述成分是人血清白蛋白。

在本文所述实施方式的另一方面中，在所述成分中，所述冻干保护剂选自海藻糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、棉子糖、葡聚糖、甘露醇、山梨醇或木糖醇中的一种或几种的混合物。

在本文所述的实施方式的另一方面中，描述了冻干间充质干细胞在药学上可接受的饼，其中间充质干细胞活力在冻干后的为约25％至约90％。

在本文所述一个实施方式中，提供了包含冻干MSC的组合物。在本文所述的实施方式的一方面中，提供了包含MSC的冻干粉末的组合物。

在本文所述的另一个实施方式中，提供了包含冻干MSC的药物组合物。在本文所述的实施方式的一方面中，提供了包含MSC冻干粉末的药物组合物。本文所述的药物组合物还可以包含一种或多种本领域普通技术人员已知的抗结块剂。

在本文公开的一个实施方式中，提供了包含冻干MSC的试剂盒。在本文公开的实施方式的一方面中，提供了包含MSC的冻干粉末的试剂盒。在本文公开的实施方式的另一方面中，提供了包含药物组合物的试剂盒，所述药物组合物包含冻干MSC。在本文公开的实施方式的另一方面中，提供了包含药物组合物的试剂盒，所述药物组合物包含MSC的冻干粉末。

在本文所述实施方式的另一方面中，间充质干细胞在冻干后表达阳性标志物。在实施方式的一方面中，阳性标志物包含选自CD90、CD105、CD73、CD44、CD29、CD13、CD166、CD10、CD49e和CD59的一种或多种。

在本文所述实施方式的一方面中，间充质干细胞在冻干后不表达阴性标志物。在实施方式的一方面中，阴性标志物包含选自下组中的一种或多种：由CD34、CD45、CD14、CD11b、CD19、CD56和CD146。

当结合下文描述考虑时，将更好地认识和理解本文所述实施方式的这些和其他方面。然而，应当理解的是，以下描述虽然指示了优选实施方式及其许多具体细节，但是以说明而非限制性的方式给出。在不脱离本文所述实施方式的精神的情况下，可以在本文所述实施方式的范围内做出许多改变和修改，并且本文所述实施方式包括所有这样的修改。

附图简要说明

图1显示组合4A至4G的冻干饼的代表性图像。

图2显示组合5A至5X的冻干饼的代表性图像。

图3显示组合6A至6Z的冻干饼的代表性图像。

图4显示组合7A至7X的冻干饼的代表性图像。

图5显示组合8A至8M的冻干饼的代表性图像。

图6显示组合9A至9K的冻干饼的代表性图像。

图7显示组合10A和10B的冻干饼的代表性图像。

图8显示组合11A至11V的冻干饼的代表性图像。

图9显示组合12A至12A的冻干饼的代表性图像。

具体实施方式

如上所述，仍然需要全面恢复人间充质干细胞和脱水潜力，使它们能够在没有特殊冷冻保护包装的情况下进行海岸间运输，并保留其生长和功能特征，以便有效地保存用于临床应用的MSC。

发明人现在令人惊奇地发现，本文所述的间充质干细胞的冻干粉末在冻干后保持约15％至约97％的间充质干细胞活力。更令人惊讶的是，这些冻干间充质干细胞适合在室温下保存。此外，令人惊讶地发现，冻干间充质干细胞适合在2℃至8℃保存。

本文所述实施方式及其各种特征和有利细节将通过参考以下描述中详述的非限制性实施方式来更全面地解释。省略了对公知的组分和处理技术的描述，以免不必要地使本文的实施方式变得模糊。本文使用的示例仅旨在促进对可以实施本文所述实施方式的方式的理解以及进一步使本领域技术人员能够实施本文所述实施方式。因此，示例不应被解释为限制本文实施方式的范围。

除非另有说明，本公开内容和所附权利要求中使用的表示成分的量、性质(诸如分子量、反应条件等)的所有数字应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。因此，除非有相反的指示，否则本公开和所附权利要求中阐述的数值参数是近似值，可以根据本发明寻求获得的所需性质而变化。至少，不应试图将等效原则的应用限制在权利要求的范围内，每个数值参数至少应根据报告的有效数字的位数和采用常用的四舍五入规则进行解释。虽然表示实施方式广义范围的数值范围和参数是近似值，但是具体示例中给出的数值是尽可能准确的。然而，任何数值本身都包含一定的误差，这是由其各自的测试测量中发现的标准偏差造成的。

在本文中，范围可以表述为从“约”某一特定值和/或至“约”另一特定值。当表达这样的范围时，还具体考虑并认为公开的是从一个特定值和/或到另一特定值的范围-1，除非上下文另外具体指出。类似地，当通过使用先行词“约”将数值表示为近似值时，应理解的是该特定值构成了应被视为公开的另一具体设想的实施方式，除非上下文另外具体指出。还应当理解，每个范围的端点相对于另一个端点并且独立于另一个端点都是重要的，除非上下文另外具体指出。最后，应当理解的是，还具体设想了明确公开的范围内包含的所有单独的数值和数值的子范围，并认为其也是公开的，除非上下文另外具体指出。无论在特定情况下是否明确公开了这些实施方式中的一些或全部，前述内容均适用。

现在将参考示例性实施方式，在本文中使用特定的语言对其加以描述。然而，应理解这些实施方式不是旨在限制本发明的范围。任何相关领域普通技术人员基于本说明书能够想到的对本文所描述的本发明特征的替代和进一步改进、以及本文所描述的本发明原理的任何其它应用，都认为在本发明的范围内。必须注意的是，在本说明书和所附权利要求书中使用的单数形式的“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数的指代对象，除非上下文另有明确说明。本说明书引用的所有专利、专利申请和参考文献均通过引用全文纳入本文。

本文所用的术语“药物”是指药物或药品，或简称为“药”；其用于诊断、治愈、治疗或预防疾病。术语“药物治疗”也可以指药物或药品的给予。

本文所用的术语“汇合度”是指各细胞占据每毫升活细胞的面积，细胞所占面积与可用总面积的比例，生长曲线线以下的面积。在细胞培养生物学中，汇合度是通常用来衡量细胞培养皿或烧瓶中细胞数量的术语，并且是指细胞对培养皿或烧瓶的覆盖程度。例如，100％汇合意指细胞完全覆盖培养皿，并因此不再有空间供细胞生长；而50％汇合意指覆盖大约一半的培养皿，并且仍有细胞生长的空间。

本文使用的术语“细胞活力”是指群体内存活的健康细胞比例的量度。通常，细胞活力测定通过测量代谢活动、ATP含量或细胞增殖来提供细胞健康状况的读出。活力测定是确定器官、细胞或组织维持或恢复生存状态的能力的测定。通过使用范围在整数0和1之间的可量化指数，或者更容易理解的话，范围在0％至100％之间的可量化指数，可以将活力与生和死的全有或全无(all-or-nothing)状态区分开来。活力可以通过细胞、组织和器官的物理性质来观察。这些物理性质中的一些包括机械活动，运动性，例如精子和粒细胞的运动性，肌肉组织或细胞的收缩，细胞功能中的有丝分裂活动等。活力测定为测量生物体的活力水平提供了更精确的基础。

相比存活与未存活的差异，活力测定可以带来更多的发现。根据本公开的一个实施方式，活力测定可用于评估冻干的成功。

本文使用的术语“流式细胞术”是指用于检测和测量细胞或颗粒群体的物理和化学特征的技术。在该过程中，含有细胞或颗粒的样品悬浮于液体并注入流式细胞仪仪器中。流式细胞术分析单个细胞，从而能够确定样品的异质性。由于活力最终是单个细胞的特征，因此这样的方法对于获得有意义的结果至关重要。以单细胞水平进行流式细胞术分析能够确定多种细胞特性的分布，从而能够识别细胞亚群，这些细胞亚群的特征可以包括从“最大活力”到死亡，甚至可能地，包括降解。

MSC通常通过CD73、CD90和CD105的共表达来识别。为了证明MSC检测的其他方法，通常对扩增的MSC进行针对MSC标志物CD73、CD90和CD105的筛选。MSC标志物CD73、CD90和CD105通过流式细胞术检测。流式细胞术提供了定量细胞悬浮液中活细胞的快速且可靠的方法。在评估细胞的生理状态时，例如细胞毒性药物和环境因素反应，或在癌症和其他疾病状态的进展过程中，细胞活力的确定至关重要。此外，通常需要检测细胞悬浮液中的死细胞，以将其排除在分析之外。由于非特异性抗体结合或不需要的荧光探针吸收，死细胞可能会产生伪影。鉴定两个细胞群的一种方法是通过染料排除。活细胞具有排除多种染料的完整的膜，而这些染料很容易穿透非活细胞受损的渗透膜。几种不同的荧光染料可用于对非活细胞进行染色，包括7-氨基放线菌素D(7-AAD)。7-AAD是活细胞通常排除的不透膜染料。其通过插入富含GC区域的碱基对之间来与双链DNA结合。7-AAD可以用氩激光在488nm处激发。其具有相对大的斯托克斯位移，最大发射波长为647nm。由于这些光谱特性，7-AAD可以与在488nm处激发的其他荧光染料(例如异硫氰酸荧光素(FITC)和藻红蛋白(PE))联用。

术语“冻干或冷冻干燥”是指将材料冷冻，然后通过升华去除冷冻水的过程；这意味着冰直接变成蒸气，并留下液相。通常，冷冻干燥或冻干技术是溶解、悬浮或乳化化合物或制剂；冷冻所得溶液、悬浮液或乳液；然后对其抽真空，以升华/蒸发冷冻物质中用于溶解、悬浮或乳化材料的溶剂和其他液体。对于温和保存某些物质，例如温度敏感的食品或特别是药物，冻干/冷冻干燥是最常用的方法。此时，物质在冷冻状态下干燥并且可以想起添加水或其他溶剂，以特别容易恢复到其原始状态。为此，该过程通常基于将起始产品的温度冷冻至-70℃。干燥过程在耐压容器(冻干机)中在高真空下进行，其中水通过升华抽出，并获得冻干物质。

药学上可接受的饼可在重建后口服或肠胃外施用，或无需重建而经口吞服。本文所用的“药学上可接受的饼”是指冻干后剩余的不塌陷的固体药物产品，其具有某些所需的特性，例如药学上可接受、长期稳定性、重建时间短、外观精致以及在重建后保持原始溶液的特性。药学上可接受的饼可以是固体、粉末或颗粒材料。如本文所用，“间充质干细胞的冻干粉末”还可以指冻干间充质干细胞在药学上可接受的饼。药学上可接受的饼还可以含有按饼重量计最多5％的水。

本发明中使用的术语“成分”是指医药产品中常规使用的药物赋形剂。成分或赋形剂的示例包括抗氧化剂、缓冲剂、螯合剂和冻干保护剂。冻干保护剂的示例包括糖、PEG和某些无机盐。聚合物的示例包括聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)和聚乙烯醇(PVA)。根据本发明最优选的成分选自冻干保护剂、人血清白蛋白、甘油、聚乙二醇(PEG)或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)中的一种或多种。

术语“冻干保护剂”是指添加到制剂中以保护活性成分(例如，本申请中的间充质干细胞)的物质。它是添加到正在冻干的物品中以防止损坏的物质。通常，冻干保护剂是在冻干中用于保护对发生脱水敏感的产品的化合物。冻干保护剂通常包括糖、多元醇及其衍生物。在一个优选的实施方式中，冻干保护剂是选自下组的至少一种糖：海藻糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、棉子糖、葡聚糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇及其组合。

人血清白蛋白是人血浆中存在的主要蛋白质。白蛋白的主要功能是保持血液的胶体渗透压。它结合水、阳离子(例如Ca2+、Na+和K+)、脂肪酸、激素、胆红素、甲状腺素(T4)和药物(包括巴比妥类药物)。白蛋白约占健康人体中全部蛋白质含量的50％。人白蛋白是小球状蛋白质(分子量：66.5kDa)，其由组成三个重复的同源结构域(位点I、II和III)的585个氨基酸的单链组成。各结构域包含两个独立的子结构域(A和B)。

人血清白蛋白(HSA)通常是指可溶性、球状且非糖基化的单体蛋白；它主要功能是作为类固醇、脂肪酸和甲状腺激素的运载体蛋白，并且在稳定胞外液体积方面发挥重要作用。HSA在临床上广泛地用于治疗严重烧伤、失血性休克、低蛋白血症、胎儿骨髓成红血细胞增多症、肝硬化引起的腹水。HSA还用作疫苗或治疗性蛋白药物的赋形剂以及疫苗和药物生产中的细胞培养基补充剂。

海藻糖(trehalose)也称为mycose或tremalose，是由两个α-葡萄糖单元之间的a,a-1,1-葡萄糖苷键形成的α-连接二糖。它的化学名称为(2R,3S,4S,5R,6R)-2-(羟甲基)-6-[(2R,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟甲基)氧杂-2-基]氧杂环己烷-3,4,5-三醇(IUPAC命名惯例)。

葡聚糖经常用作干燥蛋白制剂中的多糖冻干保护剂，主要是由于其玻璃转变温度高，可以在室温下储存。作为一种惰性添加剂，葡聚糖特别适合用作药品中的防腐剂。因此，市场上有许多含有葡聚糖作为防腐剂的药物，包括生物制剂。葡聚糖提供了优异的无定形填充剂，其可以快速冻干，形成坚固、精致的饼状结构。当葡聚糖在冻干过程中与蔗糖或海藻糖联用时，可提高储存稳定性。

甘油是具有丙烷结构的三醇，其1、2和3位被羟基取代。它具有渗透剂、溶剂、洗涤剂、人代谢物、藻类代谢物、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)代谢物、大肠杆菌代谢物和小鼠代谢物的作用。它是糖醇和三醇。

聚乙二醇(PEG)是由环氧乙烷和水缩合而成的产品，可含有多种衍生物并具有多种功能。因为许多PEG类型都是亲水性的，所以有利地将它们用作渗透增强剂，并大量用于局部皮肤病制剂中。PEG及其许多非离子衍生物广泛地用于化妆品，作为表面活性剂、乳化剂、清洁剂、保湿剂和皮肤调理剂。

聚乙二醇400(PEG 400)是具有低毒性的低分子量等级的聚乙二醇。它非常亲水，这使其成为药物制剂中的有用成分，以增加弱水溶性药物的溶解度和生物利用度。它用于眼用溶液，以缓解眼睛干燥后的灼烧感、刺激和/或不适。PEG“400”表示特定PEG的平均分子量为400。

聚乙二醇8000(PEG 8000)是高分子聚乙二醇(macrogol)，主要用作各种制备物的溶剂。高分子量PEG可溶于水和诸如醇的有机溶剂。它可以与其他分子量的PEG混合，以获得所需的特性，即粘度。

“胰蛋白酶化”是使用胰蛋白酶(一种分解蛋白质的蛋白水解酶)进行细胞解离的过程，以将贴壁细胞从培养容器中解离出来。当添加到细胞培养物中时，胰蛋白酶分解蛋白质，使细胞能够粘附在容器上。

细胞培养的传代数是培养物经过传代培养(即，收获和重新接种到多个“子”细胞培养瓶中)的次数的记录。当细胞经胰蛋白酶消化以便冷冻，然后解冻并重新接种时，这代表一次传代，虽然在冰箱中静止一段时间。

本文所用的“室温”是指正常储存条件，这意味着在干燥、清洁、通风良好的区域中在-25℃至30℃或高达45℃之间的室温(取决于气候条件)储存。“室温”也可以指工作区域中的普遍温度。

如本文所用，“药物组合物”是指治疗有效量的本文所述的冻干间充质干细胞(MSC)或MSC的冻干粉末。药物组合物可以与其他组分例如药学上可接受的运载体组合，它们可以促进将冻干间充质干细胞(MSC)或MSC的冻干粉末给予有需要的对象。

术语“药学上可接受的运载体”是指不会对对象造成显著刺激并且不会消除冻干间充质干细胞(MSC)或MSC的冻干粉末的生物活性和性质的运载体或稀释剂。药学上可接受的运载体可以包括但不限于生理盐水、林格氏液(ringer)、磷酸盐缓冲盐水和本领域已知的其他运载体。

以下是本公开的方面。

在一个实施方式中，本公开提供了冻干间充质干细胞(MSC)。

在本文所述实施方式的另一方面中，在各种成分组合存在的情况下将间充质干细胞暴露于不同的冻干方案。

在本文所述实施方式的另一方面中，所述间充质干细胞冻干粉包含成分，其中所述成分选自冻干保护剂、人血清白蛋白、甘油、聚乙二醇(PEG)中的一种或多种。

在本文所述实施方式的另一方面中，冻干混合物包含甘油。

在本文所述实施方式的另一方面中，冻干混合物包含聚乙二醇(PEG)。在该实施方式的一方面中，冻干混合物包含PEG 400和/或PEG 8000。

在本发明的另一方面中，冻干间充质干细胞在室温下保存。

在本文所述的实施方式的另一方面中，描述了冻干间充质干细胞在药学上可接受的饼，其中间充质干细胞活力在冻干后的为约15％至约97％。

本公开提供了包含间充质干细胞和冻干混合物的间充质干细胞的冻干粉末，其中间充质干细胞在冻干后的活力维持在约15％至约97％。在一个实施方式中，间充质干细胞在冻干后的活力维持在约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％,at about 25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％、约40％、约41％、约42％、约43％、约44％、约45％、约46％、约47％、约48％、约49％、约50％、约51％、约52％、约53％、约54％、约55％、约56％、约57％、约58％、约59％、约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％或约97％。

本公开提供了包含间充质干细胞和冻干混合物的间充质干细胞的冻干粉末，其中间充质干细胞在冻干后的活力维持在约25％至约90％。在一个实施方式中，间充质干细胞在冻干后的活力维持在约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％、约40％、约41％、约42％、约43％、约44％、约45％、约46％、约47％、约48％、约49％、约50％、约51％、约52％、约53％、约54％、约55％、约56％、约57％、约58％、约59％、约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％或约90％。

在一个实施方式中，间充质干细胞在冻干后的活力降低至约0％至约30％。在实施方式的一方面中，间充质干细胞在冻干后的活力降低至约0.1％、约0.5％、约1％、约2.5％、约5％、约7.5％、约10％、约12.5％、约15％、约17.5％、约20％、约22.5％、约25％、约27.5％、约30％、约32.5％、约35％、约37.5％或约40％。

在本文公开的一个实施方式中，间充质干细胞可以选自下组：脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脂肪组织衍生的间充质干细胞、角膜缘组织衍生的间充质干细胞、骨髓间充质干细胞及其组合。

在本文公开的一个实施方式中，冻干混合物包含冻干保护剂，其包括但不限于至少一种抗氧化剂、至少一种糖、至少一种膜稳定剂、至少一种高分子量分子。在实施方式的一方面中，至少一种糖选自下组：海藻糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、棉子糖、葡聚糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇及其组合。

在本文公开的实施方式的一方面中，至少一种糖以约25mM至约1000mM的量存在。在优选的实施方式中，至少一种糖以约25mM、约50mM、约75mM、约100mM、约125mM、约150mM、约175mM、约200mM、约225mM、约250mM、约275mM、约300mM、约325mM、约350mM、约375mM、约400mM、约425mM、约450mM、约475mM、约500mM、约525mM、约550mM、约575mM、约600mM、约625mM、约650mM、约675mM、约700mM、约725mM、约750mM、约775mM、约800mM、约825mM、约850mM、约875mM、约900mM、约925mM、约950mM、约975mM或约1000mM的量存在。在一个实施方式中，至少一种糖是海藻糖。

在本文公开的实施方式的一方面中，至少一种糖以总冻干混合物的约0.01％(w/w)至约10％(w/w)的量存在。在实施方式的另一方面中，至少一种糖以总冻干混合物的约0.01％(w/w)、约0.02％(w/w)、约0.03％(w/w)、约0.04％(w/w)、约0.05％(w/w)、约0.06％(w/w)、约0.07％(w/w)、约0.08％(w/w)、约0.09％(w/w)、约0.1％(w/w)、约0.15％(w/w)、约0.2％(w/w)、约0.25％(w/w)、约0.3％(w/w)、约0.35％(w/w)、约0.4％(w/w)、约0.45％(w/w)、约0.5％(w/w)、约0.6％(w/w)、约0.7％(w/w)、约0.8％(w/w)、约0.9％(w/w)、约1％(w/w)、约1.5％(w/w)、约2％(w/w)、约2.5％(w/w)、约3％(w/w)、约3.5％(w/w)、约4％(w/w)、约4.5％(w/w)、约5％(w/w)、约5.5％(w/w)、约6％(w/w)、约6.5％(w/w)、约7％(w/w)、约7.5％(w/w)、约8％(w/w)、约8.5％(w/w)、约9％(w/w)、约9.5％(w/w)或约10％(w/w)的量存在。在一个实施方式中，至少一种糖是葡聚糖。

在本文公开的实施方式的另一方面中，至少一种糖包含海藻糖和葡聚糖，所述海藻糖的量为约25mM至约1000mM量，所述葡聚糖的量为总冻干混合物的约0.01％(w/w)至约5％(w/w)。

在本文公开的一个实施方式中，冻干混合物包含人血清白蛋白(HSA)。在本文公开的另一实施方式中，HSA以总冻干混合物的约0.01％(w/w)至约10％(w/w)的量存在。在实施方式的另一方面中，HSA以总冻干混合物的约0.01％(w/w)、约0.02％(w/w)、约0.03％(w/w)、约0.04％(w/w)、约0.05％(w/w)、约0.06％(w/w)、约0.07％(w/w)、约0.08％(w/w)、约0.09％(w/w)、约0.1％(w/w)、约0.15％(w/w)、约0.2％(w/w)、约0.25％(w/w)、约0.3％(w/w)、约0.35％(w/w)、约0.4％(w/w)、约0.45％(w/w)、约0.5％(w/w)、约0.6％(w/w)、约0.7％(w/w)、约0.8％(w/w)、约0.9％(w/w)、约1％(w/w)、约1.5％(w/w)、约2％(w/w)、约2.5％(w/w)、约3％(w/w)、约3.5％(w/w)、约4％(w/w)、约4.5％(w/w)、约5％(w/w)、约5.5％(w/w)、约6％(w/w)、约6.5％(w/w)、约7％(w/w)、约7.5％(w/w)、约8％(w/w)、约8.5％(w/w)、约9％(w/w)、约9.5％(w/w)或约10％(w/w)的量存在。

在本文公开的一个实施方式中，冻干混合物包含一种或多种通常用于保存生物材料的多元醇(例如甘油)。在本文公开的实施方式的一方面中，冻干混合物包含甘油，所述甘油的量为总冻干混合物的约0.01％(w/w)至约5％(w/w)。在实施方式的另一方面中，甘油以总冻干混合物的约0.01％(w/w)、约0.02％(w/w)、约0.03％(w/w)、约0.04％(w/w)、约0.05％(w/w)、约0.06％(w/w)、约0.07％(w/w)、约0.08％(w/w)、约0.09％(w/w)、约0.1％(w/w)、约0.15％(w/w)、约0.2％(w/w)、约0.25％(w/w)、约0.3％(w/w)、约0.35％(w/w)、约0.4％(w/w)、约0.45％(w/w)、约0.5％(w/w)、约0.6％(w/w)、约0.7％(w/w)、约0.8％(w/w)、约0.9％(w/w)、约1％(w/w)、约1.5％(w/w)、约2％(w/w)、约2.5％(w/w)、约3％(w/w)、约3.5％(w/w)、约4％(w/w)、约4.5％(w/w)和约5％(w/w)的量存在。

在本文公开的一个实施方式中，冻干混合物包含PEG 400。在本文公开的另一实施方式中，PEG 400以总冻干混合物的约0.01％(w/w)至约10％(w/w)的量存在。在实施方式的另一方面中，HSA以总冻干混合物的约0.01％(w/w)、约0.02％(w/w)、约0.03％(w/w)、约0.04％(w/w)、约0.05％(w/w)、约0.06％(w/w)、约0.07％(w/w)、约0.08％(w/w)、约0.09％(w/w)、约0.1％(w/w)、约0.15％(w/w)、约0.2％(w/w)、约0.25％(w/w)、约0.3％(w/w)、约0.35％(w/w)、约0.4％(w/w)、约0.45％(w/w)、约0.5％(w/w)、约0.6％(w/w)、约0.7％(w/w)、约0.8％(w/w)、约0.9％(w/w)、约1％(w/w)、约1.5％(w/w)、约2％(w/w)、约2.5％(w/w)、约3％(w/w)、约3.5％(w/w)、约4％(w/w)、约4.5％(w/w)、约5％(w/w)、约5.5％(w/w)、约6％(w/w)、约6.5％(w/w)、约7％(w/w)、约7.5％(w/w)、约8％(w/w)、约8.5％(w/w)、约9％(w/w)、约9.5％(w/w)或约10％(w/w)的量存在。

在本文公开的实施方式的另一方面中，间充质干细胞在冻干后表达阳性标志物。在实施方式的一方面中，阳性标志物包含选自下组的一种或多种标志物：CD90、CD44、CD29、CD105、CD13、CD34、CD73、CD166、CD10、CD49e和CD59。在本文所述的实施方式的另一方面中，至少约60％至约98％的间充质干细胞在冻干后表达选自下组的一种或多种标志物：CD90、CD44、CD29、CD105、CD13、CD34、CD73、CD166、CD10、CD49e和CD59。在本文所述实施方式的又一方面中，至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少96％、至少约97％或至少约98％的间充质干细胞在冻干后表达选自下组的一种或多种标志物：CD90、CD44、CD29、CD105、CD13、CD34、CD73、CD166、CD10、CD49e和CD59。

在本文公开的实施方式的另一方面中，间充质干细胞在冻干后表达阴性标志物。在实施方式的一方面中，阴性标志物包含选自下组中的一种或多种：CD31、CD45、CD14、CD11b、CD19、CD56和CD146。在本文所述的实施方式的另一方面中，不超过约2％至约20％的间充质干细胞在冻干后表达选自下组的一种或多种标志物：CD31、CD45、CD14、CD11b、CD19、CD56和CD146。在另一实施方式中，不超过约2％、不超过约4％、不超过约6％、不超过约8％、不超过约10％、不超过约12％、不超过约14％、不超过约16％、不超过约18％或不超过约20％的间充质干细胞在冻干后表达选自下组的一种或多种标志物：CD31、CD45、CD14、CD11b、CD19、CD56和CD146。

在本文所述实施方式的一个方面，可以在体外繁殖期间的不同传代评价和比较冻干后的间充质干细胞的染色体、基因组和表观基因组谱。

在本文所述实施方式的一方面，冻干间充质干细胞在冻干后变成饼。这样的饼应该是药学上可接受的。本文所用的“药学上可接受的饼”是指冻干后剩余的不塌陷的固体药物产品，其具有某些所需的特性，例如药学上可接受、长期稳定性、重建时间短、外观精致以及在重建后保持原始溶液的特性。药学上可接受的饼可以是固体、粉末或颗粒材料。药学上可接受的饼还可以含有按饼重量计最多5％的水。

虽然已经根据本发明具体实施方式描述了本发明，但是某些修改和等同物对于本领域技术人员来说将是显而易见的并且旨在包括在本发明的范围内。

实施例

以下将结合具体实施方式对本发明进行进一步说明，并且本发明的优点和特征通过描述将会变得更加清楚。然而，这些实施方式仅是示例性的，并不构成对本公开范围的任何限制。本领域技术人员应当理解的是，在不脱离本公开的精神和范围的情况下，可以对本公开的技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换都落入本发明的保护范围内。

实施例1

冻干对间充质干细胞(MSC)的影响通过在存在各种成分组合的情况下将细胞暴露于不同的冻干方案来研究。在冻干之前和之后分析细胞的活力。

a.细胞悬浮液制备

细胞在生长培养基(DMEM-LG)中生长以达到90％汇合度。达到90％汇合度后，将细胞在37℃下暴露于DMEM-LG中的100mM海藻糖中24小时。然后对细胞进行胰蛋白酶消化并重悬于9种不同的冻干溶液组合中。使用一部分细胞悬液通过流式细胞术进行冻干前活力和细胞表面标志物分析。

所有溶液在不含酚红、葡萄糖和L-谷氨酰胺(载剂)的DMEM-LG中制备。

从上表可以看出，通过7AAD染色分析观察到的冻干前细胞活力为78.96％。细胞表面标志物分析显示，65.71％的细胞群表达CD90，65.18％的细胞群表达CD73，56.25％的细胞群表达CD105。

b.通过流式细胞术进行冻干后活力分析

冻干细胞的活力在冻干后17天通过7AAD染色分析。将冻干产品的每种组合分别在1X PBS中重建，并将细胞在300g下离心以获得沉淀。将沉淀在1X PBS中重悬。然后用7AAD染料对细胞进行染色，以通过流式细胞术分析细胞活力。

将根据表2中的间充质干细胞冻干混合物的各种组合进行冻干。冻干后，将冻干产品用20mm铝翻盖密封并在2-8℃下保存至少14天。

细胞活力％的计算将冻干前活力视为100％；即细胞活力％＝(冻干后活力％X100)/(冻干前活力％)

活力减少％通过将冻干前活力％减去冻干后活力％来计算。

**组合“d”——显示了7AAD活力染色后非常低的细胞计数。仅捕获了约2000个事件。

实施例2

类似于实施例1，冻干对间充质干细胞(MSC)的影响通过在存在各种成分组合的情况下将细胞暴露于不同的冻干方案来研究。在冻干之前和之后分析细胞的活力。

a.细胞悬浮液制备

从上表可以看出，通过7AAD染色分析观察到的冻干前细胞活力为66.71％。细胞表面标志物分析显示，80.12％的细胞群表达CD90，91.20％的细胞群表达CD73，38.75％的细胞群表达CD105。

将根据表6中的间充质干细胞冻干混合物的各种组合进行冻干。冻干后，将冻干产品用20mm铝翻盖密封并在2-8℃下保存至少14天。

b.通过流式细胞术进行冻干后活力分析

冻干细胞的活力在冻干后17天通过7AAD染色分析。简言之，将冻干产品的每种组合分别在1X PBS中重建，并将细胞在300g下离心以获得沉淀。将沉淀在1X PBS中重悬。然后用7AAD染料对细胞进行染色，以通过流式细胞术分析细胞活力。

活力减少％通过将冻干前活力％减去冻干后活力％来计算。

注意到实施例1和实施例2中获得的初步结果，计划并进行了各种实验，以下实施例提供了与目前认为是本发明的最实用和优选的实施方式相关的进一步细节。

实施例3

类似于实施例1和实施例2，冻干对间充质干细胞(MSC)的影响通过在存在各种成分组合的情况下将细胞暴露于不同的冻干方案来研究。在冻干之前和之后分析细胞的活力。

细胞在生长培养基(DMEM-LG)中生长以达到90％汇合度。达到90％汇合度后，将细胞在37℃下暴露于DMEM-LG中的100mM海藻糖中24小时。然后对细胞进行胰蛋白酶消化并重悬于6种冻干溶液组合中。使用一部分细胞悬液通过流式细胞术进行冻干前活力和细胞表面标志物分析。

通过流式细胞术进行冻干前活力和细胞表面标志物分析

从上表可以看出，通过7AAD染色分析观察到的冻干前细胞活力为100％。

将表10中所述的间充质干细胞冻干混合物的各种组合进行冻干。冻干后，将含有冻干产品的小瓶密封并在2-8℃下保存至少14天。

通过流式细胞术进行冻干后活力和细胞表面标志物分析

一组冻干细胞的活力在冻干后2天通过7AAD染色分析。MSC特异性表面标志物通过用相应的抗体对细胞进行染色来分析。

简言之，将冻干产品的每种组合分别在1X PBS中重建，并将细胞在300g下离心以获得沉淀。将沉淀在1X PBS中重悬。然后，用7AAD染料对一部分细胞进行染色，以通过流式细胞术分析细胞活力(其结果示于表12)。剩余的细胞用MSC特异性表面标志物抗体染色(其结果显示在表13中)。

实施例4

根据实施例3中描述的程序，通过流式细胞术对以下冻干溶液的7种组合进行冻干前活力和细胞表面标志物分析(在第P4传代)。

通过流式细胞术进行冻干后活力和细胞表面标志物分析

冻干后10天，根据实施例3中所述程序分析活力和MSC特异性表面标志物。图1显示组合4A至4G的冻干饼的代表性图像。

实施例5

根据实施例3中描述的程序，通过流式细胞术对以下冻干溶液的24种组合进行冻干前活力和细胞表面标志物分析(在第P8传代)。

通过流式细胞术进行冻干前活力和细胞表面标志物分析

通过流式细胞术进行冻干后活力和细胞表面标志物分析

冻干后15天，根据实施例3中所述程序分析活力和MSC特异性表面标志物。图2显示组合5A至5X的冻干饼的代表性图像。

实施例6

根据实施例3中描述的程序，通过流式细胞术对以下冻干溶液的25种组合进行冻干前活力和细胞表面标志物分析(在第P6传代)。

通过流式细胞术进行冻干前活力和细胞表面标志物分析

通过流式细胞术进行冻干后活力和细胞表面标志物分析

冻干后16天，根据实施例3中所述程序分析活力(表24)和MSC特异性表面标志物(表25)。图3显示组合6A至6Z的冻干饼的代表性图像。

实施例7

根据实施例3中描述的程序，通过流式细胞术对以下冻干溶液的23种组合进行冻干前活力和细胞表面标志物分析(在第P6传代)。

通过流式细胞术进行冻干前活力和细胞表面标志物分析

通过流式细胞术进行冻干后活力和细胞表面标志物分析

冻干后18天，根据实施例3中所述程序分析活力和MSC特异性表面标志物。图4显示组合7A至7X的冻干饼的代表性图像。

实施例8

根据实施例3中描述的程序，通过流式细胞术对以下冻干溶液的15种组合进行冻干前活力和细胞表面标志物分析(在第P2传代)。

通过流式细胞术进行冻干后活力和细胞表面标志物分析

冻干后24天，根据实施例3中所述程序分析活力和MSC特异性表面标志物。对于组合8N、8O和8P，冻干产品出现爆裂。图5显示了组合8A至8M的冻干饼的代表性图像。

实施例9

根据实施例3中描述的程序，通过流式细胞术对以下冻干溶液的10种组合进行冻干前活力和细胞表面标志物分析(在第P5传代)。

通过流式细胞术进行冻干后活力和细胞表面标志物分析

冻干后30天，根据实施例3中所述程序分析活力和MSC特异性表面标志物。图6显示组合9A至9K的冻干饼的代表性图像。

实施例10

根据实施例3中描述的程序，通过流式细胞术对以下冻干溶液的2种组合进行冻干前活力和细胞表面标志物分析(在第P4传代)。

通过流式细胞术进行冻干后活力和细胞表面标志物分析

冻干后30天，根据实施例3中所述程序分析活力和MSC特异性表面标志物。图7显示组合10A和10B的冻干饼的代表性图像。

实施例11

根据实施例3中描述的程序，通过流式细胞术对以下冻干溶液的23种组合进行冻干前活力和细胞表面标志物分析(在第P3传代)。

通过流式细胞术进行冻干后活力和细胞表面标志物分析

冻干后48天，根据实施例3中所述程序分析活力和MSC特异性表面标志物。图8显示组合11A至11V的冻干饼的代表性图像。

实施例12

根据实施例3中描述的程序，通过流式细胞术对以下冻干溶液的6种组合进行冻干前活力和细胞表面标志物分析(在第P3传代)。

通过流式细胞术进行冻干后活力和细胞表面标志物分析

冻干后60天，根据实施例3中所述程序分析活力和MSC特异性表面标志物。图9显示组合12A至12A的冻干饼的代表性图像。

实施例13

根据实施例3中描述的程序，通过流式细胞术对以下冻干溶液的4种组合进行冻干前活力和细胞表面标志物分析(在第P8传代)。

通过流式细胞术进行冻干后活力和细胞表面标志物分析

冻干后165天(5.5个月)，根据实施例3中所述程序分析活力和MSC特异性表面标志物。

基于上述实施例，76个组合(例如本文所述的3A、3B、3C、3D、3E、3F、4A、4B、4C、4E、4F、4G、5B、5C、5E、5H、5I、5J、5Q、5R、6B、6C、7A、7B、7C、7D、7E、7F、7G、7H、7I、7J、7K、7L、7M、7N、7O、7P、7Q、7R、7S、7T、7U、7V、7W、8C、8E、8H、8J、8K、8L、8M、10A、10B、11A、11C、11D、11E、11G、11H、11I、11J、11K、11L、11M、11N、11O、11P、11Q、11R、11S、11T、11U、12B、12C、12E)在冻干后显示出活力减少小于30％(活力>70％)。

下表54总结了冻干后细胞活力的比较结果，其中将冻干细胞储存在2-8℃并在不同时间点分析冻干后细胞活力。

CN＝组合编号；PL＝冻干后

上表的结果表明，各种组合显示出可再生的细胞活力，甚至在储存较长天数(2至165天)后仍保持稳定。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种间充质干细胞冻干粉。

2.如权利要求1所述的间充质干细胞冻干粉，其中，所述间充质干细胞选自下组：脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脂肪组织衍生的间充质干细胞、角膜缘组织衍生的间充质干细胞和骨髓间充质干细胞及其组合。

3.如权利要求1所述的间充质干细胞冻干粉末，其中，所述间充质干细胞是脂肪组织衍生的间充质干细胞。

4.如权利要求1所述的间充质干细胞冻干粉末，其中，所述间充质干细胞是人间充质干细胞。

5.如权利要求1所述的间充质干细胞冻干粉末，其中，所述间充质干细胞是人脂肪组织衍生的间充质干细胞。

6.如权利要求1-5中任一项所述的间充质干细胞冻干粉末，其中，所述间充质干细胞在成分的各种组合存在的情况下暴露于不同的冻干方案。

7.如权利要求1-5中任一项所述的间充质干细胞冻干粉末，其中，冻干混合物中的所述间充质干细胞包含成分的各种组合。

8.如权利要求7所述的包含成分的间充质干细胞冻干粉，其中所述成分选自冻干保护剂、人血清白蛋白、甘油、聚乙二醇(PEG)中的一种或多种。

9.如权利要求7所述的包含成分的间充质干细胞冻干粉，其中所述成分为人血清白蛋白。

10.如权利要求8所述的包含成分的间充质干细胞冻干粉，其中，所述冻干保护剂选自海藻糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、棉子糖、葡聚糖、甘露醇、山梨醇或木糖醇中的一种或几种的混合物。

11.如权利要求8和10所述的包含成分的间充质干细胞冻干粉，其中，所述冻干保护剂是海藻糖。

12.如权利要求8和10所述的包含成分的间充质干细胞冻干粉，其中，所述冻干保护剂是葡聚糖。

13.如权利要求8和10所述的包含成分的间充质干细胞冻干粉，其中，所述冻干保护剂是海藻糖和葡聚糖的组合。

14.如权利要求1-13中任一项所述的间充质干细胞冻干粉末，其中，其中冻干混合物中的所述间充质干细胞包含人血清白蛋白。

15.如权利要求1-13中任一项所述的间充质干细胞冻干粉末，其中，其中冻干混合物中的所述间充质干细胞包含：(a)人血清白蛋白和(b)海藻糖。

16.如权利要求1-13中任一项所述的间充质干细胞冻干粉末，其中，其中冻干混合物中的所述间充质干细胞包含：(a)人血清白蛋白、(b)海藻糖和(c)甘油。

17.如权利要求1-13中任一项所述的间充质干细胞冻干粉末，其中，其中冻干混合物中的所述间充质干细胞包含：(a)人血清白蛋白、(b)海藻糖、(c)甘油和(d)葡聚糖。

18.如权利要求1-13中任一项所述的间充质干细胞冻干粉末，其中，其中冻干混合物中的所述间充质干细胞包含：(a)人血清白蛋白、(b)海藻糖、(c)甘油、(d)葡聚糖和(e)聚乙二醇(PEG)。

19.如权利要求1-13中任一项所述的间充质干细胞冻干粉末，其中，其中冻干混合物中的所述间充质干细胞包含：(a)人血清白蛋白、(b)海藻糖、(c)甘油、(d)葡聚糖和(e)PEG400。

20.如权利要求1-13中任一项所述的间充质干细胞冻干粉末，其中，所述间充质干细胞的活力在冻干后维持在约15％至约97％之间。

21.如权利要求1-13中任一项所述的间充质干细胞冻干粉末，其中，所述间充质干细胞的活力在冻干后维持在约25％至约90％之间。

22.如权利要求1-20中任一项所述的间充质干细胞冻干粉末，其中，所述间充质干细胞的活力在冻干后降低或减少约0％至约30％。

23.如权利要求1-22中任一项所述的间充质干细胞冻干粉末，其中，所述冻干间充质干细胞在冻干后形成药学上可接受的饼。

24.如权利要求1-23中任一项所述的间充质干细胞冻干粉，其中，所述冻干间充质干细胞的优势在于以经济有效的方式长期保存、轻松运输和样品分配。

25.如权利要求1-24中任一项所述的间充质干细胞冻干粉，其在室温下保存。

26.如权利要求1-24中任一项所述的间充质干细胞冻干粉，其安全且易于运输。

27.如权利要求1-24中任一项所述的间充质干细胞冻干粉，其在运输后是稳定的。

Claims

1.一种间充质干细胞冻干粉。

10.如权利要求8所述的成分，其中，所述冻干保护剂选自海藻糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、棉子糖、葡聚糖、甘露醇、山梨醇或木糖醇中的一种或几种的混合物。

11.如权利要求8和权利要求10所述的成分，其中，所述冻干保护剂是海藻糖。

12.如权利要求8和权利要求10所述的成分，其中，所述冻干保护剂是葡聚糖。

13.如权利要求8和权利要求10所述的成分，其中，所述冻干保护剂是海藻糖和葡聚糖的组合。

23.如权利要求1-22中任一项所述的冻干间充质干细胞，其在冻干后形成药学上可接受的饼。

25.如权利要求1-24中任一项所述的冻干间充质干细胞，其在室温下保存。

26.如权利要求1-24中任一项所述的冻干间充质干细胞，其安全且易于运输。

27.如权利要求1-24中任一项所述的冻干间充质干细胞，其在运输后是稳定的。

28.一种冻干间充质干细胞在药学上可接受的饼。

29.如权利要求28所述的冻干间充质干在细胞药学上可接受的饼，其中，所述间充质干细胞是人脂肪组织衍生的间充质干细胞。

30.如权利要求28所述的冻干间充质干细胞在药学上可接受的饼，其可以是固体、粉末或颗粒材料。

31.如权利要求28-30所述的冻干间充质干细胞在药学上可接受的饼，其含有按所述饼重量计最多5％的水。

32.如权利要求28-30中任一项所述的冻干间充质干细胞在药学上可接受的饼，其中，所述间充质干细胞在成分的各种组合存在的情况下暴露于不同的冻干方案。

33.如权利要求28-30中任一项所述的冻干间充质干细胞在药学上可接受的饼，其中，冻干混合物中的所述间充质干细胞包含成分的各种组合。

34.如权利要求28所述的冻干间充质干细胞在药学上可接受的饼，其中所述成分选自冻干保护剂、人血清白蛋白、甘油、聚乙二醇(PEG)中的一种或多种。

35.如权利要求34所述的含有成分的冻干间充质干细胞在药学上可接受的饼，其中所述成分为人血清白蛋白。

36.如权利要求34所述的成分，其中，所述冻干保护剂选自海藻糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、棉子糖、葡聚糖、甘露醇、山梨醇或木糖醇中的一种或几种的混合物。

37.如权利要求28-34中任一项所述的冻干间充质干细胞在药学上可接受的饼，其中，所述间充质干细胞的活力在冻干后维持在约15％至约97％之间。