CN105324480A

CN105324480A - 含有海藻糖及葡聚糖的哺乳动物细胞移植用溶液

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Publication number: CN105324480A
Application number: CN201480034721.2A
Authority: CN
Inventors: 西村益浩; 和田圭树; 白川智景; 土居雅子
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2013-06-28
Filing date: 2014-06-18
Publication date: 2016-02-10
Anticipated expiration: 2034-06-18
Also published as: MY171390A; RU2663793C2; SG10201710158QA; IL242856B; HK1220225A1; NZ714410A; TW201534722A; PH12015502722A1; JP5998265B2; PH12015502722B1; JP2016034279A; KR20160026863A; CL2015003599A1; JPWO2014208053A1; WO2014208053A1; BR112015030374A2; ZA201507922B; SA515370295B1; CA2913478C; EP3015545A1

Abstract

本发明的课题在于提供细胞移植用溶液和使用所述细胞移植用溶液长期保存哺乳动物细胞的方法，所述细胞移植用溶液能够有效地抑制保存哺乳动物细胞时的细胞死亡。本发明的特征在于，在含有2.0～6.0(w/v)％的海藻糖或其衍生物或它们的盐(海藻糖类)、和4.0～7.0(w/v)％的葡聚糖或其衍生物或它们的盐(葡聚糖类)的细胞移植用生理性水溶液中保存哺乳动物细胞。通过细胞移植用生理性水溶液中含有的海藻糖类和葡聚糖类的效果，能够抑制长期(至少14天)保存哺乳动物细胞时的细胞存活率的降低。作为上述生理性水溶液，优选选自由乳酸林格液、生理盐水、林格液及乙酸林格液组成的组，可以特别合适地举出乳酸林格液或生理盐水。

Description

含有海藻糖及葡聚糖的哺乳动物细胞移植用溶液

技术领域

本发明涉及：在含有2.0～6.0(w/v)％的海藻糖或其衍生物或它们的盐(以下有时称为“海藻糖类”)、和4.0～7.0(w/v)％的葡聚糖或其衍生物或它们的盐(以下有时称为“葡聚糖类”)的细胞移植用生理性水溶液(以下有时称为“本申请的细胞移植用溶液”)中保存哺乳动物细胞的方法；本申请的移植用溶液；和含有移植用细胞的生理性水溶液，其含有哺乳动物细胞、和海藻糖类及葡聚糖类。

背景技术

近年来，由于干细胞研究的迅速发展，向再生医疗中应用的形势高涨，其知识和理解不仅在研究者中、在普通人中也得到了广泛普及。使用干细胞的再生医疗是以利用干细胞所具有的自复制能力和多分化能力、干细胞分泌的因子来恢复因各种疾病而受到损伤的细胞和组织的功能为目的的医疗。若对白血病、再生不良性贫血等血液疑难病患者进行骨髓移植，造血干细胞在患者体内成活，在几乎一生内维持造血能力成为可能。此外，近来很多研究者以使用除造血干细胞以外的干细胞的临床应用为目标，对中枢神经、末梢神经、骨髓、小肠等中的干细胞进行鉴定，已开始实践针对外伤性疾病和组织变性疾病进行组织干细胞移植治疗(非专利文献1～3)。另一方面，癌症免疫细胞疗法是将具有攻击癌症的功能的免疫细胞取出至体外、强化其功能后再次移植回体内的最先进的细胞医疗，并已实践了树突状细胞疫苗疗法、αβT细胞疗法、γδT细胞疗法、CTL疗法、自然杀伤细胞疗法(NK细胞疗法)等利用T细胞的疗法。

在长期保存用于移植治疗中的干细胞、T细胞时，通过在液体中的保存，无法良好地维持细胞存活率。例如，已有报道称将人骨髓干细胞在生理盐水中冷藏保存(4℃)时，细胞存活率在48小时后降低至40％以下，在72小时后降低至20％以下(非专利文献4)。因此，长期保存移植用干细胞、移植用T细胞时，一般进行冷冻保存。但是，由于在冷冻保存液中通常添加有DMSO、甘油等冷冻保存剂，因此，将经冷冻保存的干细胞、T细胞解冻之后，需要在进行移植治疗之前除去移植冷冻保存剂，存在耗费劳力的问题。另外，即使在冷冻保存液中添加冷冻保存剂，冷冻时的水的结晶化对细胞骨架的损伤也大，冻融后的细胞存活率降低也成为问题。因此，当务之急是开发出简便性优异、且能够抑制细胞存活率的降低的细胞保存液。

另一方面，海藻糖(trehalose)为葡萄糖以1,1-糖苷键键合而成的二糖之一。海藻糖呈甜味、且具有高的保水力，因此被用于各种食品、化妆品中。此外，海藻糖具有使细胞膜稳定、抑制细胞损伤的性质，因此被用作移植器官时的器官保护液的有效成分。例如，已研制了ET-Kyoto液、NewET-Kyoto液等含有海藻糖的优异的器官保存液(专利文献1及2，非专利文献5)。

葡聚糖(dextran)是由葡萄糖形成的多糖类之一，作为增稠剂、保湿剂等广泛应用于医药品、化妆品领域中。

本申请的发明人已经报道了使用含有海藻糖的生理性水溶液清洗通过蛋白质分解酶处理从细胞培养容器中剥离的间充质干细胞时，间充质干细胞的细胞死亡受到抑制(专利文献3)。当由于蛋白质分解酶处理而导致细胞受到损伤时，细胞死亡(细胞凋亡等)的途径将被诱导，故而可以认为，上述由海藻糖带来的效果是基于细胞凋亡途径被抑制或细胞损伤的修复功能被促进而产生的。另外，本申请的发明人还报道了在间充质干细胞的悬浮液中添加海藻糖、葡聚糖等糖类时，可以抑制短时间(30分钟～6小时)保存时的间充质干细胞的凝集、存活率的降低(专利文献4)。但是，通过并用海藻糖和葡聚糖，是否能够协同性地抑制间充质干细胞等哺乳动物细胞的细胞存活率降低、并协同性地提高活细胞的比例尚不明确。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利第3253131号公报

专利文献2：国际公开第2007/043698号小册子

专利文献3：国际公开第2012/133575号小册子

专利文献4：日本特开2012-115253号公报

非专利文献

非专利文献1：Gage,F.H.Science287:1433-1438(2000)

非专利文献2：Morrison,S.J.etal.,Cell96:737-749(1999)

非专利文献3：Batle,E.etal.,Cell111:251-263(2002)

非专利文献4：Lane,T.A.etal.,Transfusion49:1471-1481(2009)

非专利文献5：Chem,F.etal.,YonseiMed.J.45:1107-1114(2004)

发明内容

本发明的课题在于提供能够有效地抑制保存哺乳动物细胞时的细胞死亡的细胞移植用溶液、和使用所述细胞移植用溶液长期保存哺乳动物细胞的方法。

如上文所述，本申请的发明人已报道了在添加有海藻糖、葡聚糖等糖类的溶液中短时间(30分钟～6小时)地保存间充质干细胞时，能够抑制细胞存活率降低(专利文献4)。但是，专利文献4记载的发明中，并未显示通过并用海藻糖与葡聚糖而产生的协同效果。在为解决上述课题而反复进行深入研究的过程中，本申请的发明人发现，如果在生理性水溶液中添加海藻糖及葡聚糖使得其成为特定的浓度(分别为2.0～6.0[w/v]％及4.0～7.0[w/v]％)，将人骨髓间充质干细胞(hMSC-BM)、人末梢血T细胞(hPBT)保存在该溶液中时，可以长期(至少14天)协同性地抑制细胞存活率降低，并可以协同性地提高活细胞的比例，从而完成了本发明。

即，本发明涉及：(1)在下述细胞移植用生理性水溶液中保存哺乳动物细胞的方法，所述细胞移植用生理性水溶液含有2.0～6.0(w/v)％的海藻糖或其衍生物或它们的盐、和4.0～7.0(w/v)％的葡聚糖或其衍生物或它们的盐；(2)如上述(1)所述的方法，其特征在于，生理性水溶液选自由乳酸林格液、生理盐水、林格液及乙酸林格液组成的组；(3)如上述(1)或(2)所述的方法，其特征在于，在细胞移植用生理性水溶液中将哺乳动物细胞保存3～14天；(4)如上述(1)～(3)中任一项所述的方法，其特征在于，哺乳动物细胞为哺乳动物间充质干细胞或哺乳动物T细胞；(5)如上述(4)所述的方法，其特征在于，哺乳动物间充质干细胞为人骨髓间充质干细胞，哺乳动物T细胞为人末梢血T细胞。

本发明还涉及：(6)细胞移植用生理性水溶液，其含有2.0～6.0(w/v)％的海藻糖或其衍生物或它们的盐、和4.0～7.0(w/v)％的葡聚糖或其衍生物或它们的盐；(7)如上述(6)所述的细胞移植用生理性水溶液，其特征在于，生理性水溶液选自由乳酸林格液、生理盐水、林格液及乙酸林格液组成的组；(8)如上述(6)或(7)所述的细胞移植用生理性水溶液，其特征在于，哺乳动物细胞为哺乳动物间充质干细胞或哺乳动物T细胞；(9)如上述(8)所述的细胞移植用生理性水溶液，其特征在于，哺乳动物间充质干细胞为人骨髓间充质干细胞，哺乳动物T细胞为人末梢血T细胞。

本发明还涉及：(10)含有移植用细胞的生理性水溶液，其含有哺乳动物细胞、和2.0～6.0(w/v)％的海藻糖或其衍生物或它们的盐、及4.0～7.0(w/v)％的葡聚糖或其衍生物或它们的盐；(11)如上述(10)所述的含有移植用细胞的生理性水溶液，其特征在于，生理性水溶液选自由乳酸林格液、生理盐水、林格液及乙酸林格液组成的组；(12)如上述(10)或(11)所述的含有移植用细胞的生理性水溶液，其特征在于，哺乳动物细胞为哺乳动物间充质干细胞或哺乳动物T细胞；(13)如上述(12)所述的含有移植用细胞的生理性水溶液，其特征在于，哺乳动物间充质干细胞为人骨髓间充质干细胞，哺乳动物T细胞为人末梢血T细胞。

作为本发明的其他实施方式，可以举出：生理性水溶液与海藻糖或其衍生物或它们的盐和葡聚糖或其衍生物或它们的盐的组合用于保存哺乳动物细胞的应用；生理性水溶液与海藻糖或其衍生物或它们的盐和葡聚糖或其衍生物或它们的盐的组合用于制备哺乳动物细胞的移植用溶液的应用，更详细而言，上述海藻糖或其衍生物或它们的盐和葡聚糖或其衍生物或它们的盐是抑制细胞存活率降低的有效成分。

根据本发明，能够抑制长期(至少14天)保存含有间充质干细胞等干细胞、T细胞等白细胞的细胞悬浮液时的细胞存活率的降低，因此，不仅可以将再生医疗、癌症治疗中的优质移植用细胞悬浮液供往细胞悬浮液的制造地区或其周边地区，而且也可以将其供往遥远地区；另外，医药品出货时的品质保证检查包括无菌试验，根据日本药局方的规定，无菌检查需要14天的时间，而根据本发明，即使在上述细胞悬浮液被制造并被实施了上述无菌检查之后，也仍能够提供优质的细胞悬浮液。

附图说明

图1是表示对使用11种哺乳动物细胞移植用溶液(S、LR、“LR+1％D”、“LR+3％D”、“LR+5％D”、“LR+7％D”、“LR+3％T”、“LR+3％T+1％D”、“LR+3％T+3％D”、“LR+3％T+5％D”及“LR+3％T+7％D”溶液：参见实施例1的“1-1-1细胞移植用溶液”)将hMSC-BM保存14天时的细胞存活率进行分析而得的结果的图。纵轴中，以细胞存活率(％)的形式示出活细胞相对于总细胞数的比例(平均值±标准偏差，n＝4)。需要说明的是，作为对照示出保存前的Dulbecco磷酸缓冲盐水(D-PBS[-])(以下简称为“PBS”。)溶液中的细胞存活率(图中横轴的“P”)。

图2是表示对使用11种哺乳动物细胞移植用溶液(S、LR、“LR+1％D”、“LR+3％D”、“LR+5％D”、“LR+7％D”、“LR+3％T”、“LR+3％T+1％D”、“LR+3％T+3％D”、“LR+3％T+5％D”及“LR+3％T+7％D”溶液[分别为图中横轴的“2～12”]：参见实施例1的“1-1-1细胞移植用溶液”)将hMSC-BM保存3天、7天及14天时的细胞存活率进行分析而得的结果的图。纵轴中，以细胞存活率(％)的形式示出活细胞相对于总细胞数的比例(平均值±标准偏差，n＝4)。需要说明的是，作为对照示出保存前(0天后)的PBS溶液中的细胞存活率(图中横轴的“1”)。

图3是表示对使用13种哺乳动物细胞移植用溶液(S、LR、“LR+1％T”、“LR+3％T”、“LR+5％T”、“LR+7％T”、“LR+10％T”、“LR+5％D”、“LR+5％D+1％T”、“LR+5％D+3％T”、“LR+5％D+5％T”、“LR+5％D+7％T”及“LR+5％D+10％T”溶液：参见实施例2的“2-1-1细胞移植用溶液”)将hMSC-BM保存14天时的细胞存活率进行分析而得的结果的图。纵轴中，以细胞存活率(％)的形式示出活细胞相对于总细胞数的比例(平均值±标准偏差，n＝4)。需要说明的是，作为对照示出保存前的PBS溶液中的细胞存活率(图中横轴的“P”)。

图4是表示对使用11种哺乳动物细胞移植用溶液(S、LR、“LR+1％T”、“LR+3％T”、“LR+5％T”、“LR+7％T”、“LR+5％D”、“LR+5％D+1％T”、“LR+5％D+3％T”、“LR+5％D+5％T”及“LR+5％D+7％T”溶液[分别为图中横轴的“2～12”]：参见实施例2的“2-1-1细胞移植用溶液”)将hMSC-BM保存3天、7天及14天时的细胞存活率进行分析而得的结果的图。纵轴中，以细胞存活率(％)的形式示出活细胞相对于总细胞数的比例(平均值±标准偏差，n＝4)。需要说明的是，作为对照示出保存前(0天后)的PBS溶液中的细胞存活率(图中横轴的“1”)。

图5是表示对使用11种哺乳动物细胞移植用溶液(S、LR、LRD、LRTD、“LRD+GL”、“LRD+SR”、“LRD+MN”、“LRD+LC”、“LRD+RF”、“LRD+ML”及“LRD+SC”溶液：参见实施例3的“3-1-1细胞移植用溶液”)将hMSC-BM保存14天时的细胞存活率进行分析而得的结果的图。纵轴中，以细胞存活率(％)的形式示出活细胞相对于总细胞数的比例(平均值±标准偏差，n＝4)。图中的“*”表示经Dunnett检验，相对于LRD存在统计学上的显著性差异(P<0.05)。

图6是表示对使用11种哺乳动物细胞移植用溶液(S、LR、LRT、LRTD、“LRT+GL”、“LRT+SR”、“LRT+MN”、“LRT+LC”、“LRT+RF”、“LRT+ML”及“LRT+SC”溶液：参见实施例4的“4-1-1细胞移植用溶液”)将hMSC-BM保存14天时的细胞存活率进行分析而得的结果的图。纵轴中，以细胞存活率(％)的形式示出活细胞相对于总细胞数的比例(平均值±标准偏差，n＝4)。图中的“*”表示经Dunnett检验，相对于LRT存在统计学上的显著性差异(P<0.05)。

图7是表示对使用11种哺乳动物细胞移植用溶液(S[大塚生食注]、LR[LactecInjection]、LRD[含有5(w/v)％葡聚糖的LactecInjection]、LRT[含有3(w/v)％海藻糖的LactecInjection]、“LR+GL”[含有葡萄糖的LactecInjection]、“LR+SR”[含有山梨糖醇的LactecInjection]、“LR+MN”[含有甘露糖醇的LactecInjection]、“LR+LC”[含有乳糖的LactecInjection]、“LR+RF”[含有棉子糖的LactecInjection]、“LR+ML”[含有麦芽糖的LactecInjection]、及“LR+SC”[含有蔗糖的LactecInjection]溶液)将hMSC-BM保存14天时的细胞存活率进行分析而得的结果的图。纵轴中，以细胞存活率(％)的形式示出活细胞相对于总细胞数的比例(平均值±标准偏差，n＝4)。图中的“***”表示经Dunnett检验，相对于LR存在统计学上的显著性差异(P<0.001)。

图8是表示对使用10种哺乳动物细胞移植用溶液(LR、LRTD、S、STD、5％糖、5％糖TD、林格、林格TD、Veen及VeenTD溶液：参见实施例5的“5-1-1细胞移植用溶液”)将hMSC-BM保存14天时的细胞存活率进行分析而得的结果的图。纵轴中，以细胞存活率(％)的形式示出活细胞相对于总细胞数的比例(平均值±标准偏差，n＝4)。需要说明的是，作为对照示出保存前的PBS溶液中的细胞存活率(图中横轴的“P”)。

图9是表示对使用5种哺乳动物细胞移植用溶液(S、LR、LRT、LRD及LRTD)将hPBT保存1天、3天、7天及14天时的细胞存活率进行分析而得的结果的图。纵轴中，以细胞存活率(％)的形式示出活细胞相对于总细胞数的比例(平均值±标准偏差，n＝6)。需要说明的是，作为对照示出保存前(0天后)的PBS溶液中的细胞存活率(图中横轴的“P”)。

具体实施方式

本发明的保存哺乳动物细胞的方法是在用途被限定为“用于细胞移植”的、含有2.0～6.0(w/v)％的海藻糖类和4.0～7.0(w/v)％的葡聚糖类的生理性水溶液(本申请的细胞移植用溶液)中保存哺乳动物细胞的方法，更详细而言，本申请的细胞移植用溶液含有海藻糖类和葡聚糖类作为抑制细胞存活率降低的有效成分。保存在本申请的细胞移植用溶液中的哺乳动物细胞的密度通常在10³～10¹⁰个/mL的范围内。

对于本申请的含有移植用细胞的溶液而言，哺乳动物细胞通常被包含在本申请的细胞移植用溶液中。本申请的含有移植用细胞的溶液可以通过下述方法制备：在本申请的细胞移植用溶液中添加哺乳动物细胞；或者，在含有哺乳动物细胞的生理性水溶液中添加海藻糖类使得其浓度成为2.0～6.0(w/v)％，并且添加葡聚糖类使得其浓度成为4.0～7.0(w/v)％。

作为本发明中的哺乳动物，可以举出小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等啮齿类，兔等兔形目，猪、牛、山羊、马、绵羊等有蹄目，狗、猫等食肉目，人、猴、猕猴、食蟹猴、狨猴、猩猩(orangutanan)、黑猩猩等灵长类等，其中，可以合适地举出小鼠、猪、人。

作为适用于本申请的细胞移植用溶液、本申请的含有移植用细胞的溶液中的生理性水溶液，只要是利用钠、钾等对盐浓度、糖浓度等进行调整以使得其渗透压与体液、细胞液大致相同的等渗水溶液，则不受特别限制，具体而言，可以举出生理盐水、具有缓冲效果的生理盐水(磷酸缓冲生理盐水[Phosphatebufferedsaline；PBS]、Tris缓冲生理盐水[TrisBufferedSaline；TBS]、HEPES缓冲生理盐水等)、林格液、乳酸林格液、乙酸林格液、碳酸氢盐林格液、5％葡萄糖水溶液、动物细胞培养用基础培养基(DMEM、EMEM、RPMI-1640、α-MEM、F-12、F-10、M-199等)、等渗剂(葡萄糖、D-山梨糖醇、D-甘露糖醇、乳糖、氯化钠等)等，其中，优选选自由乳酸林格液、生理盐水、林格液及乙酸林格液组成的组，可以特别合适地举出乳酸林格液或生理盐水。生理性水溶液可以是市售的，也可以是自行制备的。作为市售的生理性水溶液，可以举出大塚生食注(OtsukaPharmaceutialFactory,Inc.制)(生理盐水溶液)、林格液“OTSUKA”(OtsukaPharmaceutialFactory,Inc.制)(林格液)、Lactec(注册商标)Injection(OtsukaPharmaceutialFactory,Inc.制)(乳酸林格液)、Veen-F输注液(兴和创药公司制)(乙酸林格液)、大塚糖液5％(OtsukaPharmaceutialFactory,Inc.制)(5％葡萄糖水溶液)、BICANATE输注液(OtsukaPharmaceutialFactory,Inc.制)(碳酸氢盐林格液)。本说明书中，“等渗”是指渗透压在250～380mOsm/l的范围内。

在本申请的细胞移植用溶液、本申请的含有移植用细胞的溶液中，可以根据需要适宜地补充稳定剂(例如，人血清白蛋白、聚乙二醇等)、缓冲剂(例如，磷酸盐缓冲液、乙酸钠缓冲液)、螯合剂(例如，EDTA、EGTA、柠檬酸、水杨酸盐)、氨基酸(例如，谷氨酰胺、丙氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸、酪氨酸等非必需氨基酸)、维生素类(例如，氯化胆碱、泛酸、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醛、核黄素、盐酸硫胺素、抗坏血酸、生物素、肌醇等)、助溶剂、保存剂、抗氧化剂等添加物。

作为在本申请的细胞移植用溶液中保存哺乳动物细胞时的保存时间，只要是能够抑制细胞存活率降低、提高活细胞的比例的时间(时期)即可，例如为12小时以上、1天以上、2天以上、3天以上、7天以上，另外，如果哺乳动物细胞的保存时间过长，则有可能对细胞的生存产生不良影响，因此，从避免对细胞存活率的不良影响的观点考虑，通常为21天以下，较优选为16天以下，更优选为14天以下。因此，作为上述保存时间，通常为12小时～21天、1～21天、2～21天、3～21天、或7～21天，较优选为12小时～16天、1～16天、2～16天、3～16天、或7～16天，更优选为12小时～14天、1～14天、2～14天、3～14天、或7～14天，最优选为3～14天。对于保存在本申请的细胞移植用溶液中的哺乳动物细胞，可以采用台盼蓝(TrypanBlue)染色法、TUNEL法、Nexin法、FLICA法等能够检测出细胞死亡的已知方法来确认细胞死亡被抑制。

对于在本申请的细胞移植用溶液中保存哺乳动物细胞时的保存温度而言，只要是不使细胞移植用溶液冻结、且细胞能够增殖的温度即可，通常为0～37℃、优选为0～25℃(室温)的范围内。

作为上述海藻糖类中的海藻糖，除了作为两分子α-葡萄糖以1,1-糖苷键键合而成的二糖类的α,α-海藻糖以外，还可以举出作为α-葡萄糖和β-葡萄糖以1,1-糖苷键键合而成的二糖类的α,β-海藻糖、作为两分子β-葡萄糖以1,1-糖苷键键合而成的二糖类的β,β-海藻糖，其中，优选α,α-海藻糖。上述海藻糖可以通过化学合成、利用微生物的生产、利用酶的生产等任意已知方法来制造，也可以使用市售品。例如，可以举出α,α-海藻糖(株式会社林原公司制)、α,α-海藻糖(和光纯药公司制)等市售品。

作为上述海藻糖类中的海藻糖衍生物，只要为在二糖类的海藻糖上键合有1个或更多个糖单元的糖基海藻糖类即可，没有特别限定，糖基海藻糖类包括葡糖基海藻糖、麦芽糖基海藻糖、麦芽三糖基海藻糖(Maltotriosyltrehalose)等。

作为上述海藻糖类中的海藻糖、其衍生物的盐，例如可以举出盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、磷酸盐、硝酸盐、硫酸盐、乙酸盐、丙酸盐、甲苯磺酸盐、琥珀酸盐、草酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、乙醇酸盐、甲磺酸盐、丁酸盐、戊酸盐、柠檬酸盐、富马酸盐、马来酸盐、苹果酸盐等酸加成盐，钠盐、钾盐、钙盐等金属盐，铵盐、烷基铵盐等。需要说明的是，上述盐在使用时制成溶液来使用，其作用优选与使用海藻糖的情况效果相同。上述盐类也可以形成水合物或溶剂合物，此外，可以单独使用任一种或适宜地组合使用2种以上。

作为上述葡聚糖类中的葡聚糖，只要是由D-葡萄糖形成的多糖(C₆H₁₀O₅)_n、且以α1→6键为主链则不受特别限制，作为葡聚糖的重均分子量(Mw)，例如，可以举出葡聚糖40(Mw＝40000)、葡聚糖70(Mw＝70000)等。上述葡聚糖可以通过化学合成、利用微生物的生产、利用酶的生产等任意已知方法来制造，也可以使用市售品。例如，可以举出低分子葡聚糖L注射液(LOWMOLECULARDEXTRANLINJECTION)(OtsukaPharmaceutialFactory,Inc.制)、葡聚糖70(Dextran70)(东京化成工业公司制)等市售品。

作为上述葡聚糖类中的葡聚糖衍生物，包含硫酸葡聚糖、羧基化葡聚糖、二乙基氨基乙基(DEAE)-葡聚糖等。

作为上述葡聚糖类中的葡聚糖、其衍生物的盐，例如可以举出盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、磷酸盐、硝酸盐、硫酸盐、乙酸盐、丙酸盐、甲苯磺酸盐、琥珀酸盐、草酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、乙醇酸盐、甲磺酸盐、丁酸盐、戊酸盐、柠檬酸盐、富马酸盐、马来酸盐、苹果酸盐等酸加成盐，钠盐、钾盐、钙盐等金属盐，铵盐、烷基铵盐等。需要说明的是，上述盐在使用时制成溶液来使用，其作用优选与使用葡聚糖的情况效果相同。上述盐类也可以形成水合物或溶剂合物，此外，可以单独使用任一种或适宜地组合使用2种以上。

作为本发明的哺乳动物细胞，除了在再生医疗等中经由血管施予的哺乳动物干细胞以外，还可以举出经静脉施予至I型糖尿病患者的哺乳动物胰岛细胞、经静脉施予至癌症患者的哺乳动物树突状细胞、自然杀伤(NK)细胞、αβT细胞、γδT细胞、细胞毒性T细胞(cytotoxicTlymphocyte；CTL)、辅助性T细胞(helperTcells)等T细胞，巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞等白细胞，优选为T细胞。上述细胞可以通过已知的一般性方法分离。例如，对于白细胞、T细胞、辅助性T细胞、细胞毒性T细胞及γδT细胞而言，可以利用下述装置从溶血处理后的末梢血或脐带血试样中进行分离：荧光激活细胞分选仪(fluorescence-activatedcellsorter，FACS)，其使用了与白细胞的细胞表面标志物(CD45)、T细胞的细胞表面标志物(CD3)、辅助性T细胞的细胞表面标志物(CD4)、细胞毒性T细胞(CD8)、γδT细胞的细胞表面标志物(CD39)相对应的抗体；自动磁性细胞分离装置(autoMACS)，其使用了与经荧光物质、生物素、亲和素等标记物质标记的上述细胞表面标志物相对应的抗体、和上述标记物质的相应抗体与MACS珠(磁性微珠)的缀合抗体。作为上述荧光物质，可以举出别藻蓝蛋白(allophycocyanin)(APC)、藻红蛋白(phycoerythrin)(PE)、FITC(fluoresceinisothiocyanate，异硫氰酸荧光素)、AlexaFluor488、AlexaFluor647、AlexaFluor700、PE-TexasRed、PE-Cy5、PE-Cy7等。

此外，上述“干细胞”是指具有自复制能力及分化·增殖能力的未成熟的细胞。干细胞根据分化能力包括亚全能干细胞(pluripotentstemcell)、多能干细胞(multipotentstemcell)、单能干细胞(unipotentstemcell)等亚群。所谓亚全能干细胞，是指虽然其自身不能形成为个体、但具有能分化成构成生物体的所有组织和细胞的能力的细胞。所谓多能干细胞，是指虽不能分化成所有种类的组织和细胞，但具有能分化成多种组织和细胞的能力的细胞。所谓单能干细胞，是指具有能分化成特定的组织和细胞的能力的细胞。

作为亚全能干细胞，可以举出胚胎干细胞(ES细胞)、EG细胞、iPS细胞等。ES细胞可以通过将内部细胞块于饲养细胞(feedercell)上或含有LIF的培养基中进行培养来制造。ES细胞的制造方法已记载在例如WO96/22362、WO02/101057、US5、843、780、US6、200、806、US6、280、718等中。EG细胞可以通过将原始生殖细胞于含有mSCF、LIF及bFGF的培养基中进行培养来制造(Cell,70:841-847,1992)。iPS细胞可以通过向体细胞(例如成纤维细胞、皮肤细胞等)中导入Oct3/4、Sox2及Klf4(根据需要还可导入c-Myc或n-Myc)等重编程因子(Reprogrammingfactor)来制造(Cell,126:p.663-676,2006；Nature,448:p.313-317,2007；NatBiotechno1,26；p,101-106,2008；Cel1131:p.861‐872,2007；Science,318:p.1917-1920,2007；CellStemCells1:p.55-70,2007；NatBiotechnol,25:p.1177-1181,2007；Nature,448:p.318-324,2007；CellStemCells2:p.10-12,2008；Nature451:p.141-146,2008；Science,318:p.1917-1920,2007)。此外，通过对移植体细胞的细胞核而制作获得的早期胚进行培养而建立的干细胞也优选用作为亚全能干细胞(Nature,385,810(1997)；Science,280,1256(1998)；NatureBiotechnology,17,456(1999)；Nature,394,369(1998)；NatureGenetics,22,127(1999)；Proc.Nat1.Acad.Sci.USA,96,14984(1999))，RideoutIII等人(NatureGenetics,24,109(2000))。

作为多能干细胞，可以举出能分化成脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等细胞的间充质干细胞，能分化成白细胞、红细胞、血小板等血细胞系细胞的造血干细胞，能分化成神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞等细胞的神经干细胞，骨髓干细胞、生殖干细胞等成体干细胞等。多能干细胞优选为间充质干细胞。所谓间充质干细胞，是指能分化成成骨细胞、成软骨细胞及成脂肪细胞中的全部或几种的干细胞。多能干细胞可以通过本身已知的方法从生物体分离得到。例如，间充质干细胞可以采用已知的一般性方法从哺乳动物的骨髓、脂肪组织、末梢血、脐带血等中采集。例如，可以通过骨髓穿刺后的造血干细胞等的培养、传代来分离人间充质干细胞(JournalofAutoimmunity,30(2008)163-171)。多能干细胞也可以通过将上述亚全能干细胞于合适的诱导条件下进行培养来获得。间充质干细胞优选为源自人骨髓的间充质干细胞。

作为本发明的哺乳动物细胞，可以举出贴附性的细胞。本说明书中，所谓“贴附性”细胞，是指可通过粘附于支持物上来进行生存、增殖、物质生产的支持物依赖性细胞。作为贴附性干细胞，可以举出亚全能干细胞、间充质干细胞、神经干细胞、骨髓干细胞、生殖干细胞等。贴附性干细胞优选为间充质干细胞或亚全能干细胞

本发明的哺乳动物细胞(群)可以是从生物体内分离而获得的，也可以是在体外进行传代培养而获得的，优选是经分离或纯化而获得的。本说明书中，所谓“分离或纯化”，是指施行将除目标成分以外的成分除去的操作。经分离或纯化而获得的哺乳动物细胞的纯度(相对于总细胞数而言的、哺乳动物干细胞数等目标细胞的比例)通常为30％以上，优选为50％以上，更优选为70％以上，进一步优选为90％以上(例如100％)。

在本申请的细胞移植用溶液中保存的哺乳动物细胞(群)优选为单一细胞(单个细胞，singlecell)状态。本说明书中，所谓“单一细胞状态”，是指未与其他细胞聚集成块(即，未凝集的状态)。单一细胞状态的哺乳动物细胞可以通过用胰蛋白酶/EDTA等对经体外培养的哺乳动物细胞进行酶处理来制备。哺乳动物细胞中含有的单一细胞状态的哺乳动物细胞的比例通常为70％以上，优选为90％以上，更优选为95％以上，进一步优选为99％以上(例如100％)。单一细胞状态的细胞的比例可如下进行确定：将哺乳动物细胞分散于PBS中，于显微镜下对其进行观察，调查随机选择的多个(例如，1000个)细胞是否凝集。

在本申请的细胞移植用溶液中保存的哺乳动物细胞(群)优选处于游离状态。本说明书中，所谓“游离”，是指细胞以不与容纳移植用溶液的容器内壁接触的方式被保持在移植用溶液中。

在本申请的细胞移植用溶液中保存后的哺乳动物细胞发生凝集或沉淀时，优选在移植前通过吹吸或轻拍等该技术领域中的公知方法使细胞悬浮。

以下，通过实施例对本发明进行更具体的说明，但本发明的技术范围并不限定于这些示例。

实施例1

1.对本申请的细胞移植用溶液是否具有抑制细胞存活率降低的协同效果的确认1(将海藻糖的浓度固定为3(w/v)％，评价葡聚糖的浓度变化与协同效果的关系)

1-1材料

1-1-1细胞移植用溶液

S：大塚生食注(OtsukaPharmaceutialFactory,Inc.制)

LR：Lactec(注册商标)Injection(OtsukaPharmaceutialFactory,Inc.制)

LR+1％D：含有1(w/v)％葡聚糖的LactecInjection

LR+3％D：含有3(w/v)％葡聚糖的LactecInjection

LR+5％D：含有5(w/v)％葡聚糖的LactecInjection

LR+7％D：含有7(w/v)％葡聚糖的LactecInjection

LR+3％T：含有3(w/v)％海藻糖的LactecInjection

LR+3％T+1％D：含有3(w/v)％海藻糖及1(w/v)％葡聚糖的LactecInjection

LR+3％T+3％D：含有3(w/v)％海藻糖及3(w/v)％葡聚糖的LactecInjection

LR+3％T+5％D：含有3(w/v)％海藻糖及5(w/v)％葡聚糖的LactecInjection

LR+3％T+7％D：含有3(w/v)％海藻糖及7(w/v)％葡聚糖的LactecInjection

1-1-2细胞移植用溶液的制备

1)在LactecInjection(LR溶液)中添加·溶解海藻糖(株式会社林原公司制)，制备含有3(w/v)％海藻糖的LactecInjection(“LR+3％T”溶液)。

2)在低分子葡聚糖L注射液(含有10[w/v]％葡聚糖的LactecInjection)(OtsukaPharmaceutialFactory,Inc.制)(“LR+10％D”溶液)中添加·溶解海藻糖(株式会社林原公司制)，制备含有3(w/v)％海藻糖及10(w/v)％葡聚糖的LactecInjection(“LR+3％T+10％D”溶液)。

3)用LR溶液对“LR+10％D”溶液进行稀释，制备含有规定浓度(1、3、5及7[w/v]％)的葡聚糖的LactecInjection(“LR+1、3、5及7％D”溶液)。

4)用“LR+3％T”溶液对“LR+3％T+10％D”溶液进行稀释，制备含有3(w/v)％海藻糖及规定浓度(1、3、5及7[w/v]％)的葡聚糖的LactecInjection(“LR+3％T+1、3、5及7％D”溶液)。

1-1-3哺乳动物细胞的制备

按照以下〔1〕～〔8〕所示的步骤制备人骨髓间充质干细胞(HumanMesenchymalStemCellsfromBoneMarrow[hMSC-BM])(Lonza公司制)，用于本实验。

〔1〕使用75cm²烧瓶，在人间充质干细胞专用培养基试剂盒(Lonza公司)(以下称为“MSC培养基”)的存在下，于37℃、5％CO₂培养箱中培养hMSC-BM。在显微镜下观察细胞的状态，培养至汇合度(confluent)达到约80％左右。

〔2〕用吸液器(aspirator)除去MSC培养基，每个烧瓶以8mL的PBS(Invitrogen公司制)来漂洗hMSC-BM。

〔3〕用吸液器除去PBS，向每个烧瓶中加入3.75mL的胰蛋白酶-EDTA(Lonza公司制)，于室温静置5分钟。

〔4〕一边在显微镜下观察一边缓慢摇晃，直至90％左右的hMSC-BM剥离。

〔5〕向每个烧瓶中加入3.75mL的MSC培养基，使胰蛋白酶反应停止，通过吹吸回收hMSC-BM，移至50mL离心管中。

〔6〕在600×g、25℃的条件下实施5分钟的离心分离。

〔7〕用吸液器除去作为上清液的MSC培养基，向每个烧瓶中加入4mL的PBS(Invitrogen公司制)，悬浮hMSC-BM沉淀(沉淀物)。

〔8〕采集10μL的hMSC-BM悬浮液，用细胞计数盘计测细胞数，添加PBS(Invitrogen公司制)以使得细胞浓度成为5×10⁵个细胞/mL后，进行冰冷。

1-2方法

为了确认本申请的细胞移植用溶液是否具有抑制细胞存活率降低的协同效果，按照以下〔1〕～〔3〕所示的步骤进行了实验。

〔1〕使用FINPIPETTE(100-1000μL)将通过上述“1-1-3哺乳动物细胞的制备”的步骤〔7〕中制备的hMSC-BM悬浮液注入至15mL尖底离心管(conicalcentrifugetube)中，于600×g、25℃的条件下进行5分钟的离心处理。

〔2〕抽吸·除去离心处理后的上清液，悬浮于上述11种细胞移植用溶液中后，在冰箱(4℃条件下)中保存14天。需要说明的是，为了测定保存前的细胞存活率，在抽吸·除去离心处理后的上清液后，悬浮于PBS(Invitrogen公司制)中后立即采集其中的一部分(20μL)，与20μL台盼蓝染色液(Gibco公司制)混合后，在显微镜下使用OneCell计数盘(OneCellCounter)测定总细胞数和死亡细胞数，进行活细胞率的评价(参见图1的“P”)。

〔3〕将hMSC-BM在细胞移植用溶液中保存14天后，将吸头(tip)的尖端插入至目视距底部5mm左右的位置，在该状态下缓慢地搅拌(以500μL液量吹吸5次)，在细胞悬浮的状态下将一部分(20μL)悬浮液采集至1.5mL微量离心管(Microtube)中，与20μL台盼蓝染色液(Gibco公司制)混合后，在显微镜下使用OneCell计数盘测定总细胞数和死亡细胞数，进行活细胞率的评价。

1-3结果

活细胞率的评价结果示于表1及图1。在S溶液、LR溶液中保存hMSC-BM时，几乎未观察到生存的hMSC-BM(S溶液中为小于1％，LR溶液中为1％)，而与此相对，在“LR+1、3、5及7％D”溶液中保存hMSC-BM时，生存的hMSC-BM的比例分别上升至4％、9％、12％及20％(表1、图1)。另外，即使在“LR+3％T”溶液中保存hMSC-BM时，生存的hMSC-BM的比例也上升至4％(表1、图1)。上述结果表明，如果将hMSC-BM等哺乳动物细胞长期保存在生理盐水、乳酸林格液等生理性水溶液中，则细胞几乎全部死亡，但是通过使用含有葡聚糖、海藻糖的生理性水溶液，可以抑制细胞死亡，从而可以提高活细胞的比例。

另外，在“LR+3％T+1、3、5及7％D”溶液中保存hMSC-BM时，生存的hMSC-BM的比例分别为11％、33％、57％及50％，较之在“LR+3％T”溶液中保存hMSC-BM时有所上升(表1、图1)。此外，使用“LR+3％T”及“LR+1％D”溶液时的细胞存活率分别为4％，将二者的值相加的话为8％，而与此相对，使用“LR+3％T+1％D”溶液时的细胞存活率显示为11％的高值(1.4倍)。同样地，将使用“LR+3％T”及“LR+3％D”溶液时的细胞存活率的值相加的话为13％，而与此相对，使用“LR+3％T+3％D”溶液时的细胞存活率显示为33％的高值(2.5倍)，另外，将使用“LR+3％T”及“LR+5％D”溶液时的细胞存活率的值相加的话为16％，而与此相对，使用“LR+3％T+5％D”溶液时的细胞存活率显示为57％的高值(3.6倍)，另外，将使用“LR+3％T”及“LR+7％D”溶液时的细胞存活率的值相加的话为24％，而与此相对，使用“LR+3％T+7％D”溶液时的细胞存活率显示为50％的高值(2.1倍)。上述结果表明，通过并用3％海藻糖和5％左右(4～7％)的葡聚糖，可以协同性地抑制长期保存hMSC-BM等哺乳动物细胞时的细胞存活率降低，从而协同性地提高活细胞的比例。

表1

表1保存14天时的细胞存活率(％)

关于上表中的“细胞存活率(％)”，将活细胞相对于总细胞数的比例表示为细胞存活率(％)(平均值±标准偏差，n＝4)。需要说明的是，保存前的细胞存活率为“93±2(％)”。关于上表中的11种“细胞移植用溶液”，参见实施例1的“1-1-1细胞移植用溶液”。

此外，对于hMSC-BM在细胞移植用溶液中的保存时间，除了14天以外，还以3天、7天进行了研究。结果示于图2。确认到了与将hMSC-BM保存14天的情况相同，将hMSC-BM保存3天、7天时，通过并用3％海藻糖和5％左右(4～7％)的葡聚糖，也可以协同性地抑制长期保存hMSC-BM时的细胞存活率降低，从而协同性地提高活细胞的比例。

实施例2

2.对本申请的细胞移植用溶液是否具有抑制存活率降低的协同效果的确认2(将葡聚糖的浓度固定为5(w/v)％，评价海藻糖的浓度变化与协同效果的关系)

2-1材料

2-1-1细胞移植用溶液

S：大塚生食注(OtsukaPharmaceutialFactory,Inc.制)

LR：LactecInjection(OtsukaPharmaceutialFactory,Inc.制)

LR+1％T：含有1(w/v)％海藻糖的LactecInjection

LR+3％T：含有3(w/v)％海藻糖的LactecInjection

LR+5％T：含有5(w/v)％海藻糖的LactecInjection

LR+7％T：含有7(w/v)％海藻糖的LactecInjection

LR+10％T：含有10(w/v)％海藻糖的LactecInjection

LR+5％D：含有5(w/v)％葡聚糖的LactecInjection

LR+5％D+1％T：含有5(w/v)％葡聚糖及1(w/v)％海藻糖的LactecInjection

LR+5％D+3％T：含有5(w/v)％葡聚糖及3(w/v)％海藻糖的LactecInjection

LR+5％D+5％T：含有5(w/v)％葡聚糖及5(w/v)％海藻糖的LactecInjection

LR+5％D+7％T：含有5(w/v)％葡聚糖及7(w/v)％海藻糖的LactecInjection

LR+5％D+10％T：含有5(w/v)％葡聚糖及10(w/v)％海藻糖的LactecInjection

2-1-2细胞移植用溶液的制备

1)用LactecInjection(LR溶液)对低分子葡聚糖L注射液(含有10[w/v]％葡聚糖的LactecInjection)(OtsukaPharmaceutialFactory,Inc.制)(“LR+10％D溶液”)进行稀释，制备含有5(w/v)％葡聚糖的LactecInjection(“LR+5％D”溶液)。

2)在LR溶液中添加·溶解海藻糖(株式会社林原公司制)，制备含有10(w/v)％海藻糖的LactecInjection(“LR+10％T”溶液)。

3)在“LR+5％D”溶液中添加·溶解海藻糖(株式会社林原公司制)，制备含有5(w/v)％葡聚糖及10(w/v)％海藻糖的LactecInjection(“LR+5％D+10％T”溶液)。

4)用LR溶液对“LR+10％T”溶液进行稀释，制备含有规定浓度(1、3、5及7[w/v]％)的海藻糖的LactecInjection(“LR+1、3、5及7％T”溶液)。

5)用“LR+5％D”溶液对“LR+5％D+10％T”溶液进行稀释，制备含有5(w/v)％葡聚糖及规定浓度(1、3、5及7[w/v]％)的海藻糖的LactecInjection(“LR+5％D+1、3、5及7％T”溶液)。

2-2结果

通过实施例1的“1-1-3哺乳动物细胞的制备”中所示的方法制备hMSC-BM后，使用上述13种细胞移植用溶液，按照实施例1的“1-2方法”中所示的步骤进行实验。结果示于表2及图3。与实施例1的结果相同，在S溶液、LR溶液中保存hMSC-BM时，几乎或完全未观察到生存的hMSC-BM(S溶液中为1％，LR溶液中为0％)。在“LR+1、3、5、7及10％T”溶液中保存hMSC-BM时，生存的hMSC-BM的比例分别为2％、6％、7％、5％及3％，而与此相对，在“LR+5％D+1、3、5、7及10％T”溶液中保存hMSC-BM时，生存的hMSC-BM的比例分别为30％、48％、49％、30％及14％，大幅上升(表2、图3)。特别地，使用“LR+5％D”及“LR+1％T”溶液时的细胞存活率分别为11％及2％，将二者的值相加的话为13％，而与此相对，使用“LR+5％D+1％T”溶液时的细胞存活率显示为30％的高值(2.3倍)。同样地，将使用“LR+5％D”及“LR+3％T”溶液时的细胞存活率的值相加的话为17％，而与此相对，使用“LR+5％D+3％T”溶液时的细胞存活率显示为48％的高值(2.8倍)，另外，将使用“LR+5％D”及“LR+5％T”溶液时的细胞存活率的值相加的话为18％，而与此相对，使用“LR+5％D+5％T”溶液时的细胞存活率显示为49％的高值(2.7倍)，另外，将使用“LR+5％D”及“LR+7％T”溶液时的细胞存活率的值相加的话为16％，而与此相对，使用“LR+5％D+7％T”溶液时的细胞存活率显示为30％的高值(1.9倍)。上述结果表明，通过并用3％左右(2～6％)的海藻糖和5％葡聚糖，可以协同性地抑制长期保存hMSC-BM等哺乳动物细胞时的细胞存活率降低，从而协同性地提高活细胞的比例。

表2

表2保存14天时的细胞存活率(％)

关于上表中的“细胞存活率(％)”，将活细胞相对于总细胞数的比例表示为细胞存活率(％)(平均值±标准偏差，n＝4)。需要说明的是，保存前的细胞存活率为“95±2(％)”。关于上表中的13种“细胞移植用溶液”，参见实施例2的“2-1-1细胞移植用溶液”。

此外，对于hMSC-BM在细胞移植用溶液中的保存时间，除了14天以外，还以3天、7天进行了研究。结果示于图4。确认到了与将hMSC-BM保存14天的情况相同，将hMSC-BM保存3天、7天时，通过并用3％左右(2～6％)的海藻糖和5％葡聚糖，也可以协同性地抑制长期保存hMSC-BM时的细胞存活率降低，从而协同性地提高活细胞的比例。

综合实施例1及2的结果可知，通过并用3％左右(2～6％)的海藻糖和5％左右(4～7％)的葡聚糖，可以协同性地抑制长期(至少14天)保存hMSC-BM等哺乳动物细胞时的细胞存活率降低，从而协同性地提高活细胞的比例。

实施例3

3.使用并用了葡聚糖和其他糖类的细胞移植用溶液时的细胞存活率降低抑制效果的研究

3-1材料

3-1-1细胞移植用溶液

S：大塚生食注(OtsukaPharmaceutialFactory,Inc.制)

LR：LactecInjection(OtsukaPharmaceutialFactory,Inc.制)

LRD：含有5(w/v)％葡聚糖的LactecInjection

LRTD：含有3(w/v)％海藻糖及5(w/v)％葡聚糖的LactecInjection

LRD+GL：含有5(w/v)％葡聚糖及1.6(w/v)％葡萄糖的LactecInjection

LRD+SR：含有5(w/v)％葡聚糖及1.6(w/v)％山梨糖醇的LactecInjection

LRD+MN：含有5(w/v)％葡聚糖及1.6(w/v)％甘露糖醇的LactecInjection

LRD+LC：含有5(w/v)％葡聚糖及3.0(w/v)％乳糖的LactecInjection

LRD+RF：含有5(w/v)％葡聚糖及4.8(w/v)％棉子糖的LactecInjection

LRD+ML：含有5(w/v)％葡聚糖及3.0(w/v)％麦芽糖的LactecInjection

LRD+SC：含有5(w/v)％葡聚糖及3.0(w/v)％蔗糖的LactecInjection

3-1-2细胞移植用溶液的制备

1)按照实施例1的“1-1-2细胞移植用溶液的制备”中记载的方法，制备含有5(w/v)％葡聚糖的LactecInjection(“LRD”溶液)、含有3(w/v)％海藻糖及5(w/v)％葡聚糖的LactecInjection(“LRTD”溶液)。

2)在“LRD”溶液中添加·溶解葡萄糖(和光纯药工业株式会社制)，制备含有5(w/v)％葡聚糖及1.6(w/v)％葡萄糖的LactecInjection(“LRD+GL”溶液)。

3)在“LRD”溶液中添加·溶解山梨糖醇(和光纯药工业株式会社制)，制备含有5(w/v)％葡聚糖及1.6(w/v)％山梨糖醇的LactecInjection(“LRD+SR”溶液)。

4)在“LRD”溶液中添加·溶解甘露糖醇(和光纯药工业株式会社制)，制备含有5(w/v)％葡聚糖及1.6(w/v)％甘露糖醇的LactecInjection(“LRD+MN”溶液)。

5)在“LRD”溶液中添加·溶解乳糖(和光纯药工业株式会社制)，制备含有5(w/v)％葡聚糖及3.0(w/v)％乳糖的LactecInjection(“LRD+LC”溶液)。

6)在“LRD”溶液中添加·溶解棉子糖(和光纯药工业株式会社制)，制备含有5(w/v)％葡聚糖及4.8(w/v)％棉子糖的LactecInjection(“LRD+RF”溶液)。

7)在“LRD”溶液中添加·溶解麦芽糖(和光纯药工业株式会社制)，制备含有5(w/v)％葡聚糖及3.0(w/v)％麦芽糖的LactecInjection(“LRD+ML”溶液)。

8)在“LRD”溶液中添加·溶解蔗糖(和光纯药工业株式会社制)，制备含有5(w/v)％葡聚糖及3.0(w/v)％蔗糖的LactecInjection(“LRD+SC”溶液)。需要说明的是，对上述7种糖类(葡萄糖、山梨糖醇、甘露糖醇、乳糖、棉子糖、麦芽糖及蔗糖)进行了浓度调整，以使得其渗透压与3(w/v)％海藻糖相同。

3-2结果

通过实施例1的“1-1-3哺乳动物细胞的制备”中所示的方法制备hMSC-BM后，使用上述11种细胞移植用溶液，按照实施例1的“1-2方法”中所示的步骤进行实验。结果示于图5。与实施例1、2的结果相同，将海藻糖与葡聚糖并用时，呈现出了协同性地抑制将hMSC-BM保存14天时的细胞存活率降低、活细胞率上升的结果(图5中的“LRTD”与“LRD”、“LR”、“S”的比较)。另一方面，代替海藻糖而将7种糖类(葡萄糖、山梨糖醇、甘露糖醇、乳糖、棉子糖、麦芽糖及蔗糖)与葡聚糖并用时，细胞存活率与单独使用葡聚糖时相比几乎没有改变(图5中的“LRD”与“LRD+GL”、“LRD+SR”、“LRD+MN”、“LRD+LC”、“LRD+RF”、“LRD+ML”、“LRD+SC”的比较)。该结果表明，与海藻糖不同，上述7种糖类不具有抑制长期保存hMSC-BM等哺乳动物细胞时的细胞死亡、提高细胞移植用溶液中的活细胞率的效果。

实施例4

4.使用并用了海藻糖和其他糖类的细胞移植用溶液时的细胞存活率降低抑制效果的研究

4-1材料

4-1-1细胞移植用溶液

S：大塚生食注(OtsukaPharmaceutialFactory,Inc.制)

LR：LactecInjection(OtsukaPharmaceutialFactory,Inc.制)

LRT：含有3(w/v)％海藻糖的LactecInjection

LRTD：含有3(w/v)％海藻糖及5(w/v)％葡聚糖的LactecInjection

LRT+GL：含有3(w/v)％海藻糖及1.6(w/v)％葡萄糖的LactecInjection

LRT+SR：含有3(w/v)％海藻糖及1.6(w/v)％山梨糖醇的LactecInjection

LRT+MN：含有3(w/v)％海藻糖及1.6(w/v)％甘露糖醇的LactecInjection

LRT+LC：含有3(w/v)％海藻糖及3.0(w/v)％乳糖的LactecInjection

LRT+RF：含有3(w/v)％海藻糖及4.8(w/v)％棉子糖的LactecInjection

LRT+ML：含有3(w/v)％海藻糖及3.0(w/v)％麦芽糖的LactecInjection

LRT+SC：含有3(w/v)％海藻糖及3.0(w/v)％蔗糖的LactecInjection

4-1-2细胞移植用溶液的制备

1)按照实施例1的“1-1-2细胞移植用溶液的制备”中记载的方法，制备含有3(w/v)％海藻糖的LactecInjection(“LRT”溶液)、含有3(w/v)％海藻糖及5(w/v)％葡聚糖的LactecInjection(“LRTD”溶液)。

2)在“LRT”溶液中添加·溶解葡萄糖(和光纯药工业株式会社制)，制备含有3(w/v)％海藻糖及1.6(w/v)％葡萄糖的LactecInjection(“LRT+GL”溶液)。

3)在“LRT”溶液中添加·溶解山梨糖醇(和光纯药工业株式会社制)，制备含有3(w/v)％海藻糖及1.6(w/v)％山梨糖醇的LactecInjection(“LRT+SR”溶液)。

4)在“LRT”溶液中添加·溶解甘露糖醇(和光纯药工业株式会社制)，制备含有3(w/v)％海藻糖及1.6(w/v)％甘露糖醇的LactecInjection(“LRT+MN”溶液)。

5)在“LRT”溶液中添加·溶解乳糖(和光纯药工业株式会社制)，制备含有3(w/v)％海藻糖及3.0(w/v)％乳糖的LactecInjection(“LRT+LC”溶液)。

6)在“LRT”溶液中添加·溶解棉子糖(和光纯药工业株式会社制)，制备含有3(w/v)％海藻糖及4.8(w/v)％棉子糖的LactecInjection(“LRT+RF”溶液)。

7)在“LRT”溶液中添加·溶解麦芽糖(和光纯药工业株式会社制)，制备含有3(w/v)％海藻糖及3.0(w/v)％麦芽糖的LactecInjection(“LRT+ML”溶液)。

8)在“LRT”溶液中添加·溶解蔗糖(和光纯药工业株式会社制)，制备含有3(w/v)％海藻糖及3.0(w/v)％蔗糖的LactecInjection(“LRT+SC”溶液)。需要说明的是，对上述7种糖类(葡萄糖、山梨糖醇、甘露糖醇、乳糖、棉子糖、麦芽糖及蔗糖)进行了浓度调整，以使得其渗透压与5(w/v)％葡聚糖相同。

4-2结果

通过实施例1的“1-1-3哺乳动物细胞的制备”中所示的方法制备hMSC-BM后，使用上述11种细胞移植用溶液，按照实施例1的“1-2方法”中所示的步骤进行实验。结果示于图6。与实施例1～3的结果相同，将葡聚糖与海藻糖并用时，呈现出了协同性地抑制将细胞保存14天时的细胞存活率降低、活细胞率上升的结果(图6中的“LRTD”与“LRT”、“LR”、“S”的比较)。另一方面，代替葡聚糖而将7种糖类(葡萄糖、山梨糖醇、甘露糖醇、乳糖、棉子糖、麦芽糖及蔗糖)与海藻糖并用时，细胞存活率与单独使用海藻糖时相比几乎没有改变(图6中的“LRT”与“LRT+GL”、“LRT+SR”、“LRT+MN”、“LRT+LC”、“LRT+RF”、“LRT+ML”、“LRT+SC”的比较)。该结果表明，与葡聚糖不同，上述7种糖类不具有抑制长期保存hMSC-BM等哺乳动物细胞时的细胞死亡、提高细胞移植用溶液中的活细胞率的效果。

此外，进行了单独使用7种糖类(葡萄糖、山梨糖醇、甘露糖醇、乳糖、棉子糖、麦芽糖及蔗糖)而不将其与海藻糖或葡聚糖并用的情况下的实验，确认了上述7种糖类不具有抑制长期保存hMSC-BM等哺乳动物细胞时的细胞死亡、提高细胞移植用溶液中的活细胞率的效果(图7)。

实施例5

5.本申请的细胞移植用溶液中的生理性水溶液的研究

5-1材料

5-1-1细胞移植用溶液

LR：LactecInjection(OtsukaPharmaceutialFactory,Inc.制)

LRTD：含有3(w/v)％海藻糖及5(w/v)％葡聚糖的LactecInjection

S：大塚生食注(OtsukaPharmaceutialFactory,Inc.制)

STD：含有3(w/v)％海藻糖及5(w/v)％葡聚糖的大塚生食注

5％糖：大塚糖液5％(OtsukaPharmaceutialFactory,Inc.制)

5％糖TD：含有3(w/v)％海藻糖及5(w/v)％葡聚糖的大塚糖液5％

林格：林格液“OTSUKA”(OtsukaPharmaceutialFactory,Inc.制)

林格TD：含有3(w/v)％海藻糖及5(w/v)％葡聚糖的林格液“OTSUKA”

Veen：Veen-F输注液(兴和创药公司制)

VeenTD：含有3(w/v)％海藻糖及5(w/v)％葡聚糖的Veen-F输注液

5-1-2细胞移植用溶液的制备

2)在大塚生食注(OtsukaPharmaceutialFactory,Inc.制)中添加·溶解海藻糖(株式会社林原公司制)及葡聚糖40(名糖产业株式会社制)，制备含有3(w/v)％海藻糖及5(w/v)％葡聚糖的大塚生食注(“STD”溶液)。

3)在大塚糖液5％(OtsukaPharmaceutialFactory,Inc.制)中添加·溶解海藻糖(株式会社林原公司制)及葡聚糖40(名糖产业株式会社制)，制备含有3(w/v)％海藻糖及5(w/v)％葡聚糖的大塚糖液5％(“5％糖TD”溶液)。

4)在林格液“OTSUKA”(OtsukaPharmaceutialFactory,Inc.制)中添加·溶解海藻糖(株式会社林原公司制)及葡聚糖40(名糖产业株式会社制)，制备含有3(w/v)％海藻糖及5(w/v)％葡聚糖的林格液“OTSUKA”(“林格TD”溶液)。

5)在Veen-F输注液(兴和创药公司制)中添加·溶解海藻糖(株式会社林原公司制)及葡聚糖40(名糖产业株式会社制)，制备含有3(w/v)％海藻糖及5(w/v)％葡聚糖的Veen-F输注液(“VeenTD”溶液)。

5-2结果

通过实施例1的“1-1-3哺乳动物细胞的制备”中所示的方法制备hMSC-BM后，使用上述10种细胞移植用溶液，按照实施例1的“1-2方法”中所示的步骤进行实验。结果示于图8。将大塚生食注(OtsukaPharmaceutialFactory,Inc.制)、林格液“OTSUKA”(OtsukaPharmaceutialFactory,Inc.制)、Veen-F输注液(兴和创药公司制)用作细胞移植用溶液中的生理性水溶液时，与使用LactecInjection(OtsukaPharmaceutialFactory,Inc.制)时同样地，呈现出了抑制将hMSC-BM保存14天时的细胞死亡、细胞移植用溶液中的活细胞率上升的结果(图8中的“S”和“STD”的比较、“林格”和“林格TD”的比较、“Veen”和“VeenTD”的比较)。另一方面，使用大塚糖液5％(OtsukaPharmaceutialFactory,Inc.制)时，没有确认到抑制将hMSC-BM保存14天时的细胞死亡的效果(图8中的“5％糖”和“5％糖TD”的比较)。以上结果表明，作为生理性水溶液至少使用生理盐水溶液、乳酸林格液、林格液及乙酸林格液时，可观察到由海藻糖和葡聚糖的并用产生的活细胞率降低抑制效果。

实施例6

6.对本申请的细胞移植用溶液是否具有抑制细胞存活率降低的协同效果的确认3(使用hMSC-BM以外的哺乳动物细胞进行评价)

针对在使用hMSC-BM以外的其他哺乳动物细胞时是否也同样能够确认到本申请的细胞移植用溶液所具有的细胞存活率降低抑制效果进行了确认。

6-1材料

6-1-1细胞移植用溶液

S：大塚生食注(OtsukaPharmaceutialFactory,Inc.制)

LR：LactecInjection(OtsukaPharmaceutialFactory,Inc.制)

LRT：含有3(w/v)％海藻糖的LactecInjection

LRD：含有5(w/v)％葡聚糖的LactecInjection

LRTD：含有3(w/v)％海藻糖及5(w/v)％葡聚糖的LactecInjection

6-1-2细胞移植用溶液的制备

按照实施例1的“1-1-2细胞移植用溶液的制备”中记载的方法，制备含有3(w/v)％海藻糖的LactecInjection(“LRT”溶液)、含有5(w/v)％葡聚糖的LactecInjection(“LRD”溶液)、含有3(w/v)％海藻糖及5(w/v)％葡聚糖的LactecInjection(“LRTD”溶液)。

6-2方法

〔1〕在50mL的尖底离心管中添加18mL室温的RPMI培养基(Gibco公司制)。

〔2〕松开冷冻保存有人末梢血T细胞(HumanPeripheralBloodTCells；hPBT)(CELLAPPLICATIONS,Inc.制)的保存容器(小瓶)的盖，解除压力后盖上盖子。

〔3〕在37℃的恒温槽中一边轻轻搅拌一边使其融化。

〔4〕将融化后的细胞移至添加有上述RPMI培养基的尖底离心管中。

〔5〕在400×g、25℃的条件下进行5分钟的离心处理，抽吸上清液并回收细胞，悬浮于每瓶10mL的PBS(Invitrogen公司制)中。

〔6〕使用OneCell计数盘测定细胞数量，添加PBS(Invitrogen公司制)以使得细胞浓度成为5×10⁵个细胞/mL后，进行冰冷。

〔7〕使用FINPIPETTE(100-1000μL)将细胞悬浮液注入至12个15mL尖底离心管中(各0.5mL)，在400×g、25℃的条件下进行5分钟的离心处理，回收细胞。

〔8〕抽吸·除去上清液，将hPBT悬浮于上述5种细胞移植用溶液中后，在冰箱(4℃条件下)中保存。需要说明的是，为了测定保存前的细胞存活率，在抽吸·除去离心处理后的上清液后，悬浮于PBS(Invitrogen公司制)中后立即采集其中的一部分(20μL)，与20μL台盼蓝染色液(Gibco公司制)混合后，在显微镜下使用OneCell计数盘测定总细胞数和死亡细胞数，进行活细胞率的评价(参见图9的“P”)。

〔9〕在细胞移植用溶液中保存hPBT后，在第1天、第3天、第7天及第14天将吸头的尖端插入至目视距底部5mm左右的位置，在该状态下缓慢地搅拌(以250μL液量吹吸5次)，在细胞悬浮的状态下将一部分(20μL)悬浮液采集至1.5mL微量离心管中，与20μL台盼蓝染色液(Gibco公司制)混合后，在显微镜下使用OneCell计数盘测定总细胞数和死亡细胞数，进行活细胞率的评价。

6-3结果

活细胞率的评价结果示于表3及图9。将hPBT在S溶液及LR溶液中保存1天时的细胞存活率分别降低至18％及29％(表3及图9中的1天后的“S”及“LR”)。另外，将hPBT在LRT溶液及LRD溶液中保存1天时的细胞存活率得到了改善，分别为37％及49％，但未确认到显著性差异(表3及图9中的1天后的“LRT”及“LRD”)。另一方面，将hPBT在LRTD溶液中保存1天时的细胞存活率显示为82％的高值，并且，与在LR溶液中保存时相比，确认到了显著性差异(表3及图9中的1天后的“LRTD”)。上述结果表明，将海藻糖与葡聚糖并用时，可以有效地抑制hPBT的细胞存活率降低。

上述由海藻糖和葡聚糖的并用产生的效果，在将hPBT保存3天、7天及14天时变得更为显著。即，与单独使用海藻糖或葡聚糖的情况相比，并用海藻糖和葡聚糖时细胞存活率高2倍以上，另外，确认到了由海藻糖和葡聚糖的并用产生的协同效果(表3及图9中的3天后、7天后及14天后的“LRTD”)。特别是在保存7天的情况下，LRT溶液及LRD溶液中生存的hPBT的比例分别为13％及17％，将二者的值相加的话为30％，而与此相对，LRTD溶液中生存的hPBT的比例显示为57％的高值(1.9倍)，确认到了由海藻糖和葡聚糖的并用产生的高协同效果。上述结果表明，在使用hMSC-BM以外的哺乳动物细胞(hPBT)时，也同样能够确认到由海藻糖和葡聚糖的并用产生的活细胞率降低抑制效果。

表3

表3保存hPBT时的细胞存活率(％)

关于上表中的“细胞存活率(％)”，将活细胞相对于总细胞数的比例表示为细胞存活率(％)(平均值±标准偏差，n＝6)。表中的“*”及“***”表示经Dunnett检验，相对于LR存在统计学上的显著性差异(分别为P<0.05及P<0.001)。需要说明的是，保存前的细胞存活率为“92±3(％)”。关于上表中的5种“细胞移植用溶液”，参见实施例6的“6-1-1细胞移植用溶液”。

产业上的可利用性

根据本发明，能够抑制长期保存含有MSC等干细胞、T细胞等白细胞的细胞悬浮液时的存活率降低、提供优质的细胞悬浮液，因此，在再生医疗等移植医疗领域、癌症治疗领域中是有用的。

Claims

1.在下述细胞移植用生理性水溶液中保存哺乳动物细胞的方法，所述细胞移植用生理性水溶液含有2.0～6.0(w/v)％的海藻糖或其衍生物或它们的盐、和4.0～7.0(w/v)％的葡聚糖或其衍生物或它们的盐。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，生理性水溶液选自由乳酸林格液、生理盐水、林格液及乙酸林格液组成的组。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在细胞移植用生理性水溶液中将哺乳动物细胞保存3～14天。

4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于，哺乳动物细胞为哺乳动物间充质干细胞或哺乳动物T细胞。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，哺乳动物间充质干细胞为人骨髓间充质干细胞，哺乳动物T细胞为人末梢血T细胞。

6.细胞移植用生理性水溶液，其含有2.0～6.0(w/v)％的海藻糖或其衍生物或它们的盐、和4.0～7.0(w/v)％的葡聚糖或其衍生物或它们的盐。

7.如权利要求6所述的细胞移植用生理性水溶液，其特征在于，生理性水溶液选自由乳酸林格液、生理盐水、林格液及乙酸林格液组成的组。

8.如权利要求6或7所述的细胞移植用生理性水溶液，其特征在于，哺乳动物细胞为哺乳动物间充质干细胞或哺乳动物T细胞。

9.如权利要求8所述的细胞移植用生理性水溶液，其特征在于，哺乳动物间充质干细胞为人骨髓间充质干细胞，哺乳动物T细胞为人末梢血T细胞。

10.含有移植用细胞的生理性水溶液，其含有哺乳动物细胞，和2.0～6.0(w/v)％的海藻糖或其衍生物或它们的盐、及4.0～7.0(w/v)％的葡聚糖或其衍生物或它们的盐。

11.如权利要求10所述的含有移植用细胞的生理性水溶液，其特征在于，生理性水溶液选自由乳酸林格液、生理盐水、林格液及乙酸林格液组成的组。

12.如权利要求10或11所述的含有移植用细胞的生理性水溶液，其特征在于，哺乳动物细胞为哺乳动物间充质干细胞或哺乳动物T细胞。

13.如权利要求12所述的含有移植用细胞的生理性水溶液，其特征在于，哺乳动物间充质干细胞为人骨髓间充质干细胞，哺乳动物T细胞为人末梢血T细胞。