KR20160033129A - 캡슐화 세포의 동결-건조 방법, 동결 건조된 캡슐화 세포, 동결 건조된 캡슐화 세포를 함유하는 조성물, 및 상기 세포 및 조성물의 용도 - Google Patents

캡슐화 세포의 동결-건조 방법, 동결 건조된 캡슐화 세포, 동결 건조된 캡슐화 세포를 함유하는 조성물, 및 상기 세포 및 조성물의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 일반적으로 동결-건조 캡슐화 세포의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 수득된 동결 건조 세포 뿐만 아니라 상기 동결 건조 캡슐화 세포를 포함하는 조성물, 및 상기 세포의 다양한 용도, 예를 들면, 약학적, 기능성 식품(nutraceutical), 식품 첨가제, 또는 화장료 첨가제로서의 용도를 제공한다. 또한, 본 발명은 탈지유, 글리세롤, 및 탄수화물을 함유하는 신규한 조성물을 제공하며, 예를 들면, 캡슐화 세포의 동결-건조를 위해 사용될 수 있다.

Description

캡슐화 세포의 동결-건조 방법, 동결 건조된 캡슐화 세포, 동결 건조된 캡슐화 세포를 함유하는 조성물, 및 상기 세포 및 조성물의 용도 {A METHOD OF FREEZE-DRYING ENCAPSULATED CELLS, FREEZE-DRIED ENCAPSULATED CELLS, COMPOSITIONS CONTAINING FREEZE-DRIED ENCAPSULATED CELLS AND USES OF SUCH CELLS AND COMPOSITIONS}
본 출원은 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 본 출원에서 원용되고 있는, 2013년 07월 02일자로 유럽특허청에 제출된 유럽특허출원 13174681.0에 대한 우선권을 주장한다.
본 발명은 일반적으로 동결-건조 캡슐화 세포의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 수득된 동결 건조 세포뿐만 아니라 상기 동결 건조 캡슐화 세포를 포함하는 조성물, 및 상기 세포의 다양한 용도, 예를 들면, 약학적, 기능성 식품(nutraceutical), 식품 첨가제 또는 화장료 첨가제로서의 용도를 제공한다. 또한, 본 발명은 탈지유, 글리세롤 및 탄수화물을 함유하는 신규한 조성물을 제공하며, 예를 들면, 캡슐화 세포의 동결-건조를 위해 사용될 수 있다.
세계 보건기구(WHO)에 따르면, 프로바이오틱스는 적정량을 투여할 때, 인체에 건강상의 이익을 가져다주는 살아있는 미생물이다. 특히, 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus)는 일반적인 행복의 주요한 요소인 장 건강을 촉진한다. 프로바이오틱스 제품들은 안정성 및 생존력 보장을 위한 몇몇의 공정 단계를 필요로 한다. 이들은 저장 및 소비되는 과정에서 위장관을 통과하는 동안 부정적인 영향을 받을 수 있다.
많은 프로바이오틱 제품들은 사용하기 전까지 보존을 위하여 동결-건조된다. 우선, 이들은 급속 냉동되고, 뒤이어 진공 상태에서 탈수된다. 상기 동결-건조 과정은 식품 첨가제, 식품 보충제, 또는 기능성 식품(nutraceutical)으로서, 프로바이오틱 세균의 안정성 및 생존력 유지에 중요하다.
기술적으로, 리오필라이세이션(lyophilisation), 리오필라이제이션(lyophilization), 또는 크라이오데시케이션(cryodesiccation)으로 알려진 동결-건조(freeze-drying)는, 액체 샘플의 냉각, 냉각 가능한 용액에서 아이스로의 전환, 결정화 가능한 용질의 결정화 및 비동결된 혼합물과 연관된 비결정화 용질을 포함하는 무정형의 매트릭스 형성, 뒤이은 무정형 매트릭스로부터 수분의 증발(승화)로 정의된다. 상기 무정형의 매트릭스에서 냉각된 수분의 증발(승화)은 무정형 매트릭스에서 냉각된 수분을 고체상에서 기체상으로 직접 승화시킬 수 있도록 일반적으로 주변 압력을 감소시키는 방법을 통해 수행된다. 상기 동결 건조의 큰 장점은 저장 과정에서 물질을 안정화시킨다는 점이다.
아울러, 동결-건조는 캡슐화 세포의 해동에 따른 위험이 없다는 장점이 있다 (Santivarangkna, C., Kulozik, U. and Foerst, P. (2007) Alternative drying processes for the industrial preservation of lactic acid starter cultures. Biotechnology Progress, 23(2), 302-315). 동결 건조 이후 세균 세포의 주요한 사멸은 막 견고성(membrane integrity)의 상실 및 거대분자(macromolecule)의 변성에 기인한다는 점이 보고된 바 있다 (Franks, F. (1995) "Protein destabilization at low temperatures". Advances in Protein Chemistry, 46, 105-139; Thammavongs, et al (1996) "Physiological response of Enterococcus faecalis JH2-2 to cold shock: Growth at low temperatures and freezing/thawing challenge" Letter in Applied Microbiology, 23(6), 398-402; De Angelis, M. and Gobbetti, M. (2004) "Environmental stress responses in Lactobacillus: A review" Proteomics, 4(1), 106- 122.).
셀룰로오스 설페이트에서 세균의 캡슐화는, 동결-건조 동안 세균을 보호하는 효과를 가져다 줄 수 있다는 사실이 보고된 바 있다. 어느 한 연구에서는 위장액 유사 물질에서 인큐베이션될 때, 부피가 팽창하는 캡슐화 물질로 알지네이트-키토산을 이용하였다(Paulraj Kanmani, R. Satish Kumar, N. Yuvaraj, K. A. Paari, V. Pattukumar, and Venkatesan Aral (2011) Cryopreservation and Microencapsulation of a Probiotic in Alginate-chitosan Capsules Improves Survival in Simulated Gastrointestinal Conditions. Biotechnology and Bioprecess Engineering, (16) 1106-1114.). 또한, Kanmani et al.의 연구에서는 위액 유사 물질과 접촉될 때, 소듐 알지네이트-키토산으로 코팅된 마이크로캡슐은 10% 정도 줄어듦이 기재된 바 있다.
따라서 상기 동결 건조 과정에서의 세포에 대한 유해한 작용은 소듐 셀룰로오스 설페이트로 마이크로캡슐화시킴으로써 해소할 수 있으며, 이는 캡슐화 물질이 캡슐의 안정성 및 캡슐화 세포의 생존율을 향상시켜주기 때문이다. 그러나 동결 건조 과정에서의 세균 세포와 같은 세포에 대한 유해한 작용을 극복해야 할 필요성이 여전히 존재한다.
본 발명은 신규한 캡슐화 세포의 동결-건조 방법, 상기 방법에 의해 수득된 캡슐화 세포 및 상기 캡슐화 세포의 용도 및 상기 캡슐화 세포를 함유하는 조성물을 제공함으로써, 이러한 필요성을 해결한다.
제1 양태로서, 본 발명의 개시는 캡슐화 세포의 동결-건조 방법을 제공하며, 상기 방법은 적어도 2번의 연속적인 인큐베이션 단계를 포함하고, 상기 캡슐화 세포는 적절한 기간에 걸쳐 동결방지제를 함유하는 인큐베이션 용액에서 각각의 인큐베이션 단계에 인큐베이션되며, 상기 인큐베이션 용액 내 동결방지제의 농도는 각각의 후속 인큐베이션 단계에서 증가된다.
제2 양태로서, 본 발명의 개시는 여기에 기술된 바와 같이, 캡슐화 세포의 동결-건조 방법에 의해 수득된 동결-건조 캡슐화 세포를 제공한다.
제3 양태로서, 본 발명의 개시는 여기서 기술된 바와 같이, 적절한 담체 및 캡슐화 세포의 동결-건조 방법에 의해 수득된 세포를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직한 실시예에서, 상기 조성물은 예를 들면, 사람 또는 동물을 위한 식품 보조제, 비누 제제(formulation), 화장료 조성물, 또는 약학적 조성물일 수 있다.
제4 양태로서, 본 발명의 개시는 여기서 기술된 바와 같이, 설사, 항생제에 의해 유발된 설사, 관절염, 비만, 과민성 대장 증후군, 속쓰림, 만성 피로 증후군, 위장암 및 장 내 세균 개체수의 불균형에 의해 고통을 받는 다른 형태의 질병의 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 동결-건조 캡슐화 세포 또는 동결-건조 캡슐화 세포를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함한다.
제5 양태로서, 본 발명의 개시는 여기서 기술된 바와 같이, 설사, 항생제에 의해 유발된 설사, 관절염, 비만, 과민성 대장 증후군, 속쓰림, 만성 피로 증후군, 위장암 및 장 내 세균 개체수의 불균형에 의해 고통을 받는 다른 형태의 질병의 치료 또는 예방하기 위한 동결-건조 캡슐화 세포 또는 동결-건조 캡슐화 세포를 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.
제6 양태로서, 본 발명의 개시는 여기서 기술된 바와 같이, 약학적, 식품 첨가제 또는 화장료 첨가제로서, 동결-건조 캡슐화 세포 또는 동결-건조 캡슐화 세포를 포함하는 조성물의 용도를 제공한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 식품 첨가제로 이용될 때, 상기 식품은 요거트, 커티지 치즈, 또는 버터 밀크와 같은 우유-기반 제품일 수 있다. 본 발명의 다른 실시예에서는, 여기서 기술된 바와 같이, 식품 첨가제로 이용될 때, 동결-건조 캡슐화 세포 또는 동결-건조 캡술화 세포를 포함하는 조성물은 식품을 함유하는 식품 패키지의 분리된 구획(compartment)에 저장된다.
제7 양태로서, 본 발명의 개시는 동결-건조를 위한 캡슐화 세포의 제조방법을 제공하며, 상기 방법은 적어도 2번의 연속적인 인큐베이션 단계를 포함하고, 상기 캡슐화 세포는 적절한 기간에 걸쳐 동결방지제를 함유하는 인큐베이션 용액에서 각각의 인큐베이션 단계에 인큐베이션되며, 상기 인큐베이션 용액 내 동결방지제의 농도는 각각의 후속 인큐베이션 단계에서 증가된다.
제8 양태로서, 본 발명의 개시는 동결-건조된 캡슐화 세포, 원핵 세포 또는 동결 건조된 캡슐화 효모 세포를 제공한다.
제9 양태로서, 본 발명의 개시는 세포의 동결을 위하여 적절한 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 탈지유, 글리세롤 및 탄수화물을 포함한다.
제10 양태로서, 본 발명의 개시는 동결-건조를 위한 캡슐화 세포의 제조방법을 제공하며, 상기 방법은 탈지유, 글리세롤 및 탄수화물을 포함하는 조성물에서 캡슐화 세포를 인큐베이션하는 것을 포함한다.
제11 양태로서, 본 발명의 개시는 동결-건조를 위한 캡슐화 세포를 제조하기 위하여 탈지유, 글리세롤 및 탄수화물을 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.
제12 양태로서, 본 발명의 개시는 캡슐화 세포 동결을 위하여 탈지유, 글리세롤 및 탄수화물을 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명은 캡슐화 세포의 동결-건조 방법을 제공하며, 상기 방법은 적어도 2번의 연속적인 인큐베이션 단계를 포함한다. 상기 캡슐화 세포는 적절한 기간에 걸쳐 동결방지제를 함유하는 인큐베이션 용액에서 각각의 인큐베이션 단계에 인큐베이션되며, 상기 인큐베이션 용액 내 동결방지제의 농도는 각각의 후속 인큐베이션 단계에서 증가된다. 본 발명자들은 이러한 방법이 동결-건조 과정 동안 및 이전 모두에 캡슐(캡슐화 물질)의 (구조적)견고성에 대한 보호 효과를 제공함을 확인하였다. 아울러, 캡슐화된 세포의 캡슐의 수명(shelf-life)을 연장시켜주며, 캡슐화 세포의 생존율을 현저하게 증진시킬 수 있음을 확인하였다(cf. 실시예). 메카니즘적 측면에서, 이론에 구속되는 것을 바라는 바는 아니지만, 본 발명에서, 캡슐화 세포를 본 발명의 방법의 적어도 2번의 연속적인 인큐베이션 단계를 거치게 하는 것은 캡슐이 쭈그러드는 것(crumpling)을 막는다고 생각된다.
연속적인 인큐베이션 단계 동안 인큐베이션 용액 내 동결방지제의 농도 증가 (용어, “동결방지제는 이하에서 단일 동결방지제 및 둘 또는 그 이상의 동결방지제의 혼합물/조합물을 나타낸다.)는 다양한 방법을 통해 달성될 수 있다. 예를 들면, 각각의 인큐베이션 단계에서 캡슐화 세포의 현탁액에 동결방지제 스탁(stock) 용액을 첨가할 수 있다. 예를 들면, 만일 동결방지제로 DMSO, 포름아마이드, N-메틸아세트아마이드(MA), 또는 프로판다이올이 사용될 경우, 순수 동결방지제의 스탁(stock) 용액(100% stock solution)이 사용될 수 있고, 각각의 인큐베이션 단계에서 일정량의 스탁(stock) 용액이 동결방지제의 농도를 증가시키기 위하여 상기 세포 현탁액에 첨가될 수 있다(실시예 1). 대안적으로, 예를 들어, 동결방지제의 농도를 증가시키기 위한 starting/stock 용액으로서, 캡슐화 세포를 동결-건조시키는 용액(동결용액 또는 동결배지)이 사용될 수 있다. 마지막 동결 용액의 사용은 본 발명의 목적 상, 후속 인큐베이션 단계를 위해 여분의 stock 용액을 준비할 필요가 없다는 이점이 있다. 이러한 처리방법은 인큐베이션 단계에서 동결방지제 혼합물, 예를 들면, 글리세롤과 탈지유 파우더의 혼합물, 또는 탈지유, 글리세롤, 및 수크로오스 또는 트레할로스와 같은 탄수화물의 혼합물이 사용될 때, 인큐베이션 단계의 처리를 단순화시킨다. 이 경우, 준비된 동결 용액은(예를 들면, 5%(w/v) 탈지유 및 1%(v/v) 글리세롤의 수용액, 5%(w/v) 탈지유, 1%(v/v) 글리세롤, 10%(w/v) 수크로오스 또는 트레할로스와 같은 탄수화물의 수용액) 각각의 인큐베이션 단계에서 "연속 희석(serially dilute)"될 수 있으며, 상기 캡슐화 세포를 포함하는 배지는 보관된다. 상기 "연속 희석"은 예를 들면, 하기의 방법에 따라 달성될 수 있다. 캡슐화 세포가 존재하는 세포 배지의 절반을 각각의 바이알로부터 제거하고, 동일한 부피의 동결용액을 첫 번째 인큐베이션 단계에서 첨가한다. 이후, 캡슐화 세포는 적절한 기간 동안 인큐베이션된 후, 다시 인큐베이션 혼합물의 50%를 제거하고, 동일한 부피의 동결용액을 두 번째 인큐베이션 단계에서 첨가한다. 이러한 과정은 원하는 만큼 반복 실시할 수 있으며, 이를 통해 각각의 인큐베이션 단계에서 동결방지제의 농도를 증가시킬 수 있다. 원한다면, 마지막 인큐베이션 단계는 동결용액 내에서 수행될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, “동결-건조”는 리오필라이세이션(lyophilisation), 리오필라이제이션(lyophilization), 또는 크라이오데시케이션(cryodesiccation)으로 알려져 있으며, 보통의 의미로 액체 샘플의 냉각, 냉각 가능한 용액에서 아이스로의 전환, 결정화 가능한 용질의 결정화 및 비동결된 혼합물과 연관된 비결정화 용질을 포함하는 무정형의 매트릭스 형성, 뒤이은 무정형 매트릭스로부터 수분의 증발(승화)을 나타내는 것으로 사용된다. 이러한 과정은, 무정형 매트릭스에서 냉각된 수분을 고체상에서 기체상으로 직접 승화시킬 수 있도록 일반적으로 주변 압력보다 감소된 조건 하에서 수행된다. 동결-건조는 전형적으로 전처리, 동결, 1차 건조 및 2차 건조 단계를 포함한다.
상기 전처리 단계는 목적하는 산물을, 즉 여기서는 캡슐화 세포, 동결 단계 전에 처리하는 모든 방법을 포함한다. 상기 전처리 단계는, 예를 들면, 세포의 세척, 제제의 변형(즉, 안정성의 증진 및/또는 처리과정을 향상시킬 수 있는 성분의 첨가), 또는 높은 증기압을 갖는 용매의 감소, 또는 표면적의 증가를 포함한다.
상기 동결 단계는 캡슐화 세포를 동결시킴에 적절한 모든 방법을 포함한다. 작은 규모로, 예를 들면, 연구실에서, 동결은 동결-건조 플라스크에 물질을 넣고, 쉘 프레져(shell freezer)로 알려진 베스(bath)에서 상기 플라스크를 회전시키며, 예를 들면, 동결기계, 에탄올 또는 메탄올과 같은 알코올과 혼합된 드라이 아이스, 또는 액체 질소를 통해 냉각시킬 수 있다. Themo Fisher Scientific Inc.사의 Thermo Scientific Moduyo Freeze-Dry Systemrhk 같은 상업적으로 이용 가능한 동결-건조 장치를 사용하는 것도 물론 가능하다. 큰 규모로, 동결은 일반적으로 구매할 수 있는 온도 조절이 가능한 동결-건조 기계를 사용한다. 캡슐화 세포를 동결할 때, 상기 동결은 아이스 결정의 형성을 피하기 위하여 일반적으로 급속으로 수행된다. 일반적으로, 동결 온도는 -50℃와 -80℃ 사이이다.
다음 단계는 1차 건조 단계이다. 1차 건조 단계 동안, 압력은 낮아지며(전형적으로 몇 밀리바(millibars) 범위), 물의 승화를 위해 충분한 열이 물질에 공급된다. 필요한 열의 양은 승화에서 승화하는 분자‘ 잠열을 이용하여 계산될 수 있다. 상기 건조 초기단계에서, 상기 물질 내 95%의 물이 승화된다. 지나치게 과한 열이 가해지면, 상기 물질의 구조가 변형될 수 있기 때문에 이러한 단계는 천천히 진행된다(제조에서 있어서, 며칠이 소요될 수 있다.).
2차 건조 단계는 동결 건조에서 마지막 단계로서 수행될 수 있다. 상기 2차 건조 단계는 1차 건조 단계에서 아이스가 제거된 후, 만약에 존재할 수 있는 비동결된 물 분자를 제거하는 것을 목표로 한다. 이 단계에서 온도는 물 분자와 동결된 물질간 형성된 물리-화학적 상호관계를 깨기 위하여 일반적으로 1차 건조 단계보다 높게, 심지어는 0℃ 이상일 수 있다. 이 단계에서는 탈착(desorption)을 촉진하기 위하여 일반적으로 압력을 낮춘다(전형적으로 마이크로바(microbars) 범위, 또는 1 파스칼의 일부). 상기 동결-건조 단계를 마친 후, 상기 동결-건조 캡슐화 세포의 패키징 및/또는 추가 사용을 위해 저장되기 전, 질소와 같은 불활성 가스로 진공 부분을 나눈다.
본원에 기술된 바와 같이, 본 발명의 방법은 당업자에 의해 이해되는 “전처리”를 포함할 수 있고, 하기 기술한 바와 같이, 종래에 알려진 캡슐화 또는 자유(비캡슐화) 세포와 같은 물질의 동결 및 건조방법과 함께 이용될 수 있다.
따라서 적어도 2번의 연속적인 인큐베이션 단계는 임의의 적절한 후속 동결-건조 단계로 수행될 수 있다. 또한, 본 발명은 동결-건조를 위한 캡슐화 세포의 제조방법을 제공하며, 상기 방법은 적어도 2번의 연속적인 인큐베이션 단계를 포함하고, 상기 캡슐화 세포는 적절한 기간에 걸쳐 동결방지제를 함유하는 인큐베이션 용액에서 각각의 인큐베이션 단계에 인큐베이션되며, 상기 인큐베이션 용액 내 동결방지제의 농도는 각각의 후속 인큐베이션 단계에서 증가된다. 따라서 뒤이은 발명은 동결-건조 방법을 참조하여 보다 상세히 설명될 것이며, 모든 이러한 실시예는 여기에서 정의되는 동결-건조를 위한 캡슐화 세포 제조방법에 관한 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 방법에서, 적어도 2번의 연속적인 인큐베이션 단계의 적절한 임의의 횟수는 원하는 효과, 예를 들면, 동결-건조 후 캡슐화 세포의 생존율을 얻을 수 있는 충분한 횟수로 수행될 수 있다. 예시적인 실시예에서, 상기 방법은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10번의 인큐베이션 단계를 포함하며, 상기 인큐베이션 단계에서, 동결방지제의 농도는 증가된다. 각각의 인큐베이션 단계에서, 인큐베이션은 임의의 적절한 기간, 예를 들면, 원하는 장기 안정화 및/또는 캡슐화 세포의 생존율을 달성할 수 있는 기간에 걸처 수행될 수 있다. 적절한 인큐베이션 횟수뿐만 아니라, 인큐베이션 기간은 경험적으로, 예를 들면, 재수화에 뒤이은, 동결-건조 후 캡슐화 세포의 생존율을 평가함으로서, 결정될 수 있다(이와 관련된 실시예 참조). 몇몇의 실시예에서, 인큐베이션 기간은 전형적으로 각각의 인큐베이션 단계마다 약 수 분에서 약 수 시간이다(또한, 이와 관련된 실시예에서, 세균 세포는 각각의 인큐베이션 단계에서 약 25분 동안 수행될 수 있음을 개시하고 있다.). 상기 인큐베이션은 캡슐화 물질 및 세포에 의한 동결방지제의 흡수를 향상시키기 위하여, 교반이 없는 상태 또는 교반(예를 들면, 쉐이킹(shaking) 또는 롤링(rolling))과 함께 수행될 수 있다.
본 발명의 방법의 몇몇 실시예에서, 동일한 동결방지제 또는 동일한 동결방지제 혼합물이 각각의 인큐베이션 단계에서 사용될 수 있다. 동결방지제는 캡슐화에 사용되는 물질 또는 캡슐화 세포의 동결-건조에 기인한 손상으로부터 보호할 수 있는 임의의 화합물일 수 있다. 적절한 동결방지제의 일례로서, 탈지유, 글리세롤, 디메틸설폭사이드(DMSO), 포름아마이드, 포름아마이드와 DMSO의 혼합물, N-메틸아세트아마이드(MA), 폴리비닐피롤리돈, 프로판디올(1,2-프로판디올, 또는 1,3-프로판디올, 또는 이들의 혼합물), 프로필렌 글리콜, 혈청 알부민, 메탄올과 혈청 알부민의 혼합물, 탄수화물 및 알지네이트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 동결방지제로 사용될 수 있는 알지네이트의 일례로서, Satialgine® 알지네이트 또는 Algogel® 알지네이트일 수 있으며, 이들은 Cargill로부터 구할 수 있다(cf. P. Capelaa et al, "Effect of cryoprotectants, prebiotics and microencapsulation on survival of probiotic organisms in yoghurt and freeze-dried yoghurt" Food Research International Volume 39, Issue 2, March 2006, Pages 203-211).
동결방지제로 사용될 수 있는 탄수화물의 일례로서, 수크로오스, 메탄올과 혼합된 글루코오스, 락토오스, 트레할로스, 라피노오스, 덱스트란, 펙틴(예를 들면, UnipectineTM은, Cargill로부터 구할 수 있으며, 동결방지제로서 P. Capelaa et al, Food Research International Volume 39, supra에 기술되어 있다.), 하이드록시에틸전분 (HES) 및 셀룰로오스 설페이트일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 인큐베이션 용액 내 2 또는 그 이상의 동결방지제 혼합물이 이용될 수 있다. 예를 들면, 글리세롤과 탈지유의 혼합물, 탄수화물(cf. the Example Section)과 탈지유의 혼합물이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 실시예에서, 인큐베이션 과정 동안 두 번째(또는 그 이상) 동결방지제의 농도는 일정하게 유지한 채, 어느 하나의 동결방지제의 농도만을 연속적인 인큐베이션 단계에서 증가시킬 수 있다. 이러한 일 실시예로서, 농도가 일정하게 유지되는 동결방지제는 수크로오스, 메탄올과 혼합된 글루코오스, 락토오스, 트레할로스, 라피노오스, 또는 덱스트란으로부터 선택될 수 있다. 어느 한 특정 실시예에서, 적어도 2번의 연속적인 인큐베이션 단계에서 탄수화물(예를 들면, 수크로오스, 메탄올과 혼합된 글루코오스, 락토오스, 트레할로스, 라피노오스, 또는 덱스트란)의 농도는 일정하게 유지된 채, 적어도 2번의 연속적인 인큐베이션 각각의 단계에서 탈지유의 농도는 증가되었다.
임의의 적절한(캡슐화된) 세포는 본 발명에 사용될 수 있다. 상기 캡슐화 세포는 진핵 세포 또는 원핵 세포, 또는, 여러 진핵 세포들 또는 여러 원핵 세포들의 혼합일 수 있다. 또한, 상기 세포는 진핵 세포와 원핵 세포의 혼합일 수 있다. 진핵 세포의 일례로서, 포유류 세포, 균류 세포, 또는 효모 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 포유류 세포를 위한 예시적인 일례로서, Wikstrom et al. "Viability of freeze dried microencapsulated human retinal pigment epithelial cells" Eur. J. Pharm. Sci. Volume 47, Issue 2, 29 September 2012, Pages 520-526 or the mesenchymal stem cells described by Gordon et al, 2001, "Recovery of human mesenchymal stem cells following dehydration and rehydration" Cryobiology 43, 182.에 기재된 인간 망막 색소 세포(RPE)일 수 있다. 적절한 효모 세포의 몇몇 예시적인 일례로서, 사카로마이세스(Saccharomyces), 데바로마이세스 (Debaromyces), 칸디다(Candida), 피키아(Pichia) 및 토룰롭시스 (Torulopsis)를 포함할 수 있다. 균류 세포의 일례로서, 아스페르길루스(Aspergillus), 리조퍼스(Rhizopus), 무코르(Mucor), 또는 페니실리움(Penicillium)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 이용되는 원핵 세포는 세균 세포일 수 있다. 상기 세균 세포는 호기성 또는 비호기성 세포일 수 있다. 본 발명의 방법의 예시적인 일례로서, 세균 세포는 비피도박테리움(Bifidobacterium), 박테로이데스(Bacteroides), 클로스트리디움(Clostridium), 푸소박테리움(Fusobacterium), 멜리소코쿠스(Melissococcus), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 스트렙토코커스(Streptococcus), 엔테로코커스(Enterococcus), 락토코커스(Lactococcus), 스타필로코커스(Staphylococcus),펩토스트렙토코커스(Peptostrepococcus), 바실러스(Bacillus), 페디오코커스(Pediococcus), 마이크로코커스(Micrococcus), 루코노스톡(Leuconostoc), 웨이셀라(Weissella), 에어로코커스(Aerococcus), 오에노코커스(Oenococcus), 게오바실러스(Geobacillus), 락토바실러스(Lactobacillus) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 몇몇 실시예에서, 상기 세포는 여기서 기술된 바와 같이 인큐베이션되는 세포는 프로바이오틱 세포이다. 적절한 프로바이오틱 세포의 일례로서, 세레비지에(Saccharomyces cereviseae), 바실러스 코아굴란스(Bacillus coagulans), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 비피도박테리움 인굴라툼(Bifidobacterium angulatum), 비피도박테리움 아니말리스(Bifidobacterium animalis), 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis), 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium), 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus faecalis), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 아밀로보루스(Lactobacillus amylovorus), 락토바실러스 알리멘타리우스(Lactobacillus alimentarius), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 카세이 아종. 카세이(Lactobacillus casei subsp . casei), 락토바실러스 카세이 시로타(Lactobacillus casei Shirota), 락토바실러스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus), 락토바실러스 델브루엑키 아종. 락티스(Lactobacillus delbrueckii subsp . lactis), 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 파르시미누스(Lactobacillus farciminus), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 존소니이(Lactobacillus johnsonii), 락토바실러스 락티(Lactobacillus lacti), 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 펜토사세우스(Lactobacillus pentosaceus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 람노서스 (락토바실러스 GG)(Lactobacillus rhamnosus (Lactobacillus GG)), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sake), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 락토바실러스 써모톨레란스(Lactobacillus thermotolerans), 락토바실러스 무코사에(Lactobacillus mucosae), 마이크로코커스 바리안스(Micrococcus varians), 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici), 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus), 페디오코커스 에시디락티시 (Pediococcus acidilactici), 페디오코커스 할로필루스(Pediococcus halophilus), 스트렙토코커스 페칼리스(Streptococcus faecalis), 스트렙토코커스 써모필루스(Streptococcus thermophilus), 스타필로코커스 카르노수스(Staphylococcus carnosus) 스타필로코커스 자일로수스(Staphylococcus xylosus) 및 이들의 조합을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 몇몇 실시예에서, 특히, 세균 세포 또는 효모와 같은 진핵 세포가 이용되는 경우, 상기 세포들이 캡슐화될 때, 지수 성장기(exponential growth phase)일 수 있다. 그러나 다른 성장 단계에 있는, 캡슐화되고 후속적으로 동결-건조된 세포, 예를 들면 컨플루언스(confluence) 상태로 성장된 세포일 수도 있다 (cf. in this respect Wikstrom et al, Eur. J. Pharm, Sci. (2012) supra).
본 발명의 전형적인 실시예에서, 상기 세포는 다공성 캡슐 벽을 갖는 마이크로캡슐로 캡슐화된 세포이다. 상기 다공성 캡슐 벽(쉘)은 알지네이트 중합체, 콜라겐, 젤라틴, 키토산, 아가로오스, 폴리-라이신 중합체, 셀룰로오스 설페이트 중합체 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질로 이루어질 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, “캡슐화”는 당해 기술분야 내에서의 통상적인 의미에 따라 사용될 수 있다. 본원에서 사용된 캡슐화는, 캡슐화 물질의 중심부로서, 캡슐 벽 내 전부가 함유되어 있는 내부 매트릭스 또는 세포 주변에 연속적인 코팅을 형성하는 과정을 말한다. 캡슐화는 세포와 같은 물질을 매트릭스를 통해 또는 그 안에서 포착시키는 것을 말하는 “고정화(immobilisation)”와 구분되어야 한다. 캡슐화와 반대로, 표면에 노출될 고정화 인자의 비율에 따라 불특정한 입자 크기를 갖는 임의적인 과정이다. 캡슐화 또는 마이크로캡슐화(두 용어는 혼용됨.)는 주변으로부터 중심 물질의 분리를 돕고, 이에 따른 중심 물질의 수명을 연장하고, 안정성을 증진시킨다. 중심 물질 주변의 마이크로캡슐화 시약에 의해 형성된 구조는 벽(wall) 또는 쉘(shell)로 알려져 있다. 벽 시스템의 특성은 일반적으로 중심물질을 보호할 수 있도록 설계되며, 작은 분자들은 다공성 벽 (막과 같은 역할)의 내외를 통과할 수 있는 반면, 중심물질은 점진적으로 특정 조건 하에서 배출된다. 임의의 캡슐과 캡슐화 물질은 여기서 기술된 바와 같이, 동결-건조 방법에 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 캡슐은 서브마이크론에서 수 밀리미터일 수 있으며, 다른 형상일 수 있다.
상기 개시된 내용과 일치하게, 알지네이트, 전분, 크산탄 검, 구아 검, 러스트 빈 검 및 카라기난 검뿐만 아니라 유청 단백질과 같은 다양한 식용 등급의 바이오폴리머들이, 예를 들면, 산 민감성 미생물 세포들의 보호를 위해 마이크로캡슐화 물질로 성공적으로 테스트되어왔다. Islam et ah "Microencapsulation of Live Probiotic Bacteria" J. Microbiol. Biotechnol. (2010), 20(10), 1367-1377를 살펴보면, 모든 캡슐화 물질 또는 모든 프로바이오틱 세포들은 본 발명에 적용될 수 있다. 모든 캡슐화 물질에 대한 개요, 예를 들면, 본 발명에서 이용될 수 있는 미생물 세포는 국제특허출원 WO 2012/101167, “Protection Of Microbial Cells From Acidic Degradatioin”에 제시되어 있다.
세포의 캡슐화 물질로 바람직하게 사용되는 알지네이트 중합체는 순수 알지네이트 중합체, 변형된 알지네이트-전분 중합체, 알지네이트-이눌린-잔탄 검, 알지네이트와 폴리 L-라이신 중합체, 키토산/알지네이트 중합체 및 키토산/잔탄 중합체일 수 있다. 알지네이트 캡슐화 물질의 다양한 예시들은 Wikstrom et al, supra 또는 국제특허출원 WO 2012/101167 및 상기 국제출원의 참조문헌에 개시되어 있다.
본 발명의 다른 실시예에서, 캡슐화 물질은 셀룰로오스 설페이트 중합체일 수 있다. 상기 중합체는 임의의 알려진 셀룰로오스 설페이트 중합체는 소듐 셀룰로스 설페이트(NaCS)/폴리-디알릴 디메틸 암모니움 클로라이드(poly[diallyl(dimethyl)ammoniumchloride]) (pDADMAC)로부터 형성된 복합체를 포함하는 셀룰로오스 설페이트 폴리머일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 알지네이트 캡슐화 물질의 다양한 예시는 국제특허출원 WO 2012/101167 및 상기 국제출원의 참조문헌에 개시되어 있다.
캡슐화 세포를 동결 건조시키는 본 발명의 방법의 일 실시예(또는 동결 건조를 위한 캡슐화 세포의 제조방법)에서, 상기 캡슐화 세포는 적어도 2번의 인큐베이션 단계 후, 중간 세척단계 없이 적절한 동결 건조 배지로 이동된다. 특히, 상기 “세척 단계”는 동결방지제가 전혀 없는 세척 버퍼/배지와 인큐베이션된 세포에 접촉되는 과정을 의미한다.
본 발명의 다른 실시예에서, 세균 세포와 같은 캡슐화 세포는 마지막 인큐베이션 단계 이후, 적절한 동결 건조배지에서 동결-건조된다. 이러한 실시예에서, 상기 동결 건조 배지 역시 동결방지제를 함유할 수 있다. 이러한 실시예에서, 상기 동결 건조 배지는 인큐베이션 용액으로서 동일한 동결방지제를 함유할 수 있다.
동결 단계(본 발명의 방법 후 수행될 수 있음)에서 이용될 수 있는 적절한 동결방지제의 일예로서, 탈지유, 글리세롤, 디메틸설폭사이드(DMSO), 포름아마이드, 포름아마이드와 DMSO의 혼합물, N-메틸아세트아마이드(MA), 폴리비닐피롤리돈, 프로판디올, 프로필렌 글리콜, 혈청 알부민, 메탄올과 혈청 알부민의 혼합물, 탄수화물 및 알지네이트를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니며, 몇몇 예시적 실시예만을 재차 언급하였다.
적절한 동결방지제 기반의 탄수화물의 일례로서, 수크로오스, 메탄올과 혼합된 글루코오스, 락토오스, 트레할로스, 라피노오스, 덱스트란, 펙틴, 하이드록시에틸전분(HES) 및 셀룰로오스 설페이트를 포함하며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 동결 단계의 전형적인 실시예에서, 동결 건조 배지는 동결 단계에서 선택된 하나 또는 그 이상의 동결방지제를 함유하는 친수성 용액이다.
상기 개시된 내용과 일치하게, 본 발명은 여기서 개시된 방법에서 의해 수득된 동결-건조 캡슐화 세포를 제공한다. 또한, 본 발명은 여기서 개시된 캡슐화 세포와 적절한 담체를 포함하는 조성물을 포함한다. 상기 담체는 예를 들면, 약제, 화장료, 또는 식품에 이용될 수 있는 임의의 전통적인 담체일 수 있다. 이와 함께, 본 발명의 조성물은 식품 보충제, 화장료 조성물, 또는 약학적 조성물일 수 있다.
본 발명의 캡슐화 세포가 포함될 수 있는 화장료 조성물의 일례로서, 비누(액체 또는 고체 모두), 로션, 메이크-업, 크림, 샤워겔, 샤워겔, 배스 솔트 및 헤어 워시와 같은 국소 조성물을 포함할 수 있다. 상기 조성물의 예시적인 일례로서, 락토바실러스(Lactobacillus), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 바실러스 코아굴란스(Bacillus coagulans)(예를 들면, GanedenBC30 ® (Bacillus coagulans GBI-30), 6086 of Ganeden Biotec, Cleveland, Ohio, USA.)와 같은 프로바이오틱 세균 세포를 포함한다. 이러한 화장료 조성물은, 예를 들면, 피부 수분량, 탄력을 향상키고, 눈 아래 붓기, 잔주름, 및 굵은 주름을 감소시키는데 이용될 수 있다.
본 발명에서 수득되는 캡슐화 세포 또는 이러한 캡슐화 세포를 함유하는 조성물이 식품 보충제로 이용되는 경우, 상기 식품은 예를 들면, 시리얼, 또는 요거트, 커드, 푸딩, 커티지 치즈, 버터 밀크와 같은 우유-기반 제품이다. 만일 요거트 또는 푸딩과 같은 식품에 대한 첨가제로 이용되는 경우, 캡슐화 세포는 식품을 함유하는 식품 패키지의 분리된 구획(compartment)에 저장될 수 있다. 예를 들면, 상기 분리된 구획은 이의 내용물, 예를 들면, 본 발명의 캡슐화 세포 또는 예를 들면 요거트 또는 푸딩으로 채워진 식품 패키징의 다른 구획 내 개별적인 조성물이 비워질 수 있도록 구부릴 수 있다. 이러한 분리된 구획을 이용하여, 예를 들면, 섭취 전에 캡술화된 프로바이오틱 세포를 식품에 첨가할 수 있다.
상기 개시된 내용과 일치하게, 또한, 본 발명은 다양한 약학적, 또는 기능성 식품(nutraceutical)의 용도를 제공한다. 이러한 용도로 설사, 항생제에 의해 유발된 설사, 관절염, 비만, 과민성 대장 증후군, 속쓰림, 만성 피로 증후군 및 장 내 세균 개체수의 불균형에 의해 고통을 받는 다른 형태의 질병을 예방 또는 치료하기 위한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 용도를 위하여, 본 발명의 캡슐화 세포 또는 캡슐화 세포를 함유하는 조성물이 개체, 몇몇 바람직한 예시만을 언급하면, 일반적으로 인간과 같은 포유류, 고양이, 개, 양, 소, 돼지, 조류, 어류와 같은 가축에 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 세포의 동결을 위해 적절한 조성물은 제공한다. 상기 세포는 캡슐화 또는 비캡슐화된 세포일 수 있다. 이러한 조성물은 탈지유, 글리세롤 및 탄수화물을 포함한다. 따라서 상기 조성물은 당업계에 널리 알려지거나 여기서 기술된 임의의 동결-건조방법에서 동결 용액(또는 동결보존 용액)으로 사용될 수 있다. 담체는 예를 들면, 전형적으로 (순수)물 또는 염을 함유하는 수용성 용액이다.
상기 조성물의 실시예에서, 상기 탄수화물은 수크로오스, 메탄올과 혼합된 글루코오스, 락토오스, 트레할로스, 라피노오스, 덱스트란, 펙틴, 하이드록시에틸전분(HES) 및 셀룰로오스 설페이트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 몇몇의 실시예에서, 상기 탄수화물은 수크로오스, 락토오스, 라피노오스 또는 트레할로스이다.
탈지유는 동결 과정 동안 세포 또는 캡슐화 세포의 충분한 보호를 위하여 임의의 적절한 농도로 존재할 수 있다. 예시적인 실시예에서, 본 발명의 조성물(동결 용액) 내 존재하는 탈지유의 농도는 약 1%(w/v) 내지 약 10%(w/v)이다. 본 발명에서, 탈지유(skimmed milk)는 일반적으로 우유에 모든 크림(유지방이라고도 함)을 제거하여 수득한 우유를 말한다. 임의의 이용 가능한 탈지유는 본 발명의 동결 용액/조성물에 이용될 수 있다. 전형적으로 탈지유 파우더는 본 발명의 동결 조성물의 제조를 위해 이용된다. 따라서 탈지유 농도는 동결 용액의 부피에 대한 탈지유의 중량-%를 말한다.
또한, 글리세롤도 동결 과정 동안 세포 또는 캡슐화 세포의 충분한 보호를 위하여 임의의 적절한 농도로 존재할 수 있다. 예시적인 실시예에서, 상기 글리세롤은 본 발명의 동결 용액 내 약 0.2%(w/v) 내지 약 5%(w/v)의 농도로 존재할 수 있다.
또한, 상기 탄수화물도 동결 과정 동안 세포 또는 캡슐화 세포의 충분한 보호를 위하여 임의의 적절한 농도로 존재할 수 있다. 예시적인 실시예에서, 상기 탄수화물은 동결 용액 내 약 1%(w/v) 내지 약 15%(w/v)의 농도로 존재할 수 있다.
이러한 조성물의 예시적인 실시예에서, 탈지유는 약 3%(w/v) 내지 약 8%(w/v)의 농도로 존재하고, 글리세롤은 0.5%(w/v) 내지 약 2%(w/v)의 농도로 존재하며, 탄수화물은 약 5%(w/v) 내지 약 13%(w/v)의 농도로 존재할 수 있다. 다른 예시적인 일 실시예에서, 본 발명의 동결 조성물은 약 5%(w/v)의 탈지유, 약 1%(w/v)의 글리세롤, 약 10%(w/v)의 탄수화물을 함유할 수 있다. 이러한 실시예를 위하여, 1g의 글리세롤, 5g의 탈지유 파우더 및 10g의 트레할로스를 그레듀에이티드 측정 장치에 덜어 놓은 후, 2번 증류시킨 멸균수를 첨가하여 100ml의 용액을 제조하였다.
상기 개시된 내용과 일치하게, 탈지유, 글리세롤, 및 탄수화물을 함유하는 본 발명의 조성물은 여기에 기술된 바와 같이, 캡슐화 세포의 동결을 위해 이용될 수 있다. 그러나 탈지유, 글리세롤 및 탄수화물을 함유하는 본 발명의 조성물은 또한, 여기에 기술된 바와 같이, 동결방지제의 농도가 증가하는 캡슐화 세포의 연속적인 인큐베이션 단계에서, 동결 건조를 위한 캡슐화 세포의 제조에 이용될 수 있다. 따라서 본 발명은 동결-건조를 위한 캡슐화 세포의 제조방법을 제공하고, 상기 방법은 탈지유, 글리세롤, 및 탄수화물을 함유하는 본 발명의 조성물에서 캡슐화세포를 인큐베이팅하는 단계를 포함한다.
본 발명은 일반적으로 동결-건조 캡슐화 세포의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 수득된 동결 건조 세포뿐만 아니라 상기 동결 건조 캡슐화 세포를 포함하는 조성물, 및 상기 세포의 다양한 용도, 예를 들면, 약학적, 기능성 식품(nutraceutical), 식품 첨가제, 또는 화장료 첨가제로서의 용도를 제공한다. 또한, 본 발명은 탈지유, 글리세롤, 및 탄수화물을 함유하는 신규한 조성물을 제공하며, 예를 들면, 캡슐화 세포의 동결-건조를 위해 사용될 수 있다.
비-제한적 실시예 및 첨부된 도면과 함께 고려할 경우, 본 발명은 발명의 상세한 설명을 참조하여 보다 잘 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 동결방지제로 5% 탈지유 파우더 및 1% 글리세롤을 동결방지제로 사용한 본 발명의 방법에 따라 처리된 동결 건조 상태의 캡술화된 락토바실러스 아시도필루스의 명시야 현미경 이미지를 나타낸 것으로서, 상기 세포는 동결방지제의 농도가 증가하는 인큐베이션 용액에서 각각의 인큐베이션 단계에 인큐베이션 되었다. 상기 동결방지제의 증가하는 농도는 각각의 인큐베이션 단계의 연속 희석, 동결방지제(5% 탈지유 파우더 및 1% 글리세롤)가 첨가된 100%, 50%, 25%, 12.5%, 6.25%, 3.125%, 0%의 세균 성장 용액에 따라 달성된다.
도 2는 동결-건조 동안 락토바실러스 아시도필루스 캡슐의 보호효과를 나타낸 것으로서, 동결방지제로 탈지유 및 글리세롤(5% 탈지유 및 1% 글리세롤 수용액)을 함유한 인큐베이션 용액을 이용하였다. 상기 보호효과는 동결-건조 세균의 재수화 후, 생존율 테스트를 통해 측정되었다. 상기 생존율은 참고로 신선한 캡슐화 세균 세포와 비교하였으며, % 생존율로 표기하였다.
도 3은 동결-건조 동안 두 가지의 다른 동결 배지/인큐베이션 용액 (인큐베이션 용액 1: DMSO를 동결방지제로 함유하는 de Man Rogosa and Shape(MRS) 배지, 인큐베이션 용액 2: 5% 탈지유 및 1% 글리세롤 수용액)에 따른 락토바실러스 아시도필루스의 생존율을 비교한 것이다.
도 4는 동결-건조 후 재수화된 빈 캡슐의 명시야 현미경 이미지를 나타낸 것이다. 동결 배지로는 1% 글리세롤이 첨가된 탈지유가 사용되었으며, 동결-건조 전 동결단계는 액체 질소를 이용하여 수행하였다.
도 5는 동결-건조 후 재수화된 빈 캡슐의 명시야 현미경 이미지를 나타낸 것이다. 동결 배지로는 1% 글리세롤이 첨가된 탈지유가 사용되었으며, 동결-건조 전 동결단계는 에탄올/드라이 아이스 베스로 수행하였다.
도 6은 에탄올/드라이 아이스베스에서 전-동결 단계를 거친 후, 동결방지제 없이 PBS(phosphate buffered saline)로 동결-건조된 빈 캡슐의 명시야 현미경 이미지를 나타낸 것이다.
도 7은 에탄올/드라이 아이스베스에서 전-동결 단계를 거친 후, 10% DMSO가 첨가된 PBS로 동결-건조된 빈 캡슐의 명시야 현미경 이미지를 나타낸 것이다.
도 8은 액체 질소로 전-동결 단계를 거친 후, 동결방지제 없이 MRS로 동결-건조된 빈 캡슐의 명시야 현미경 이미지를 나타낸 것이다.
도 9는 에탄올/드라이 아이스베스에서 전-동결 단계를 거친 후, 동결방지제 없이 MRS로 동결-건조된 빈 캡슐의 명시야 현미경 이미지를 나타낸 것이다.
도 10은 동결-건조 용액 및 후속 인큐베이션을 위해 동결방지제의 농도가 증가하는 인큐베이션 용액으로서, 5% 탈지유, 1% 글리세롤 및 10% 트레할로스의 혼합물을 사용한 본 발명의 동결-건조 방법을 실시한 결과를 나타낸 것이다. 본 실험에서 하기와 같은 샘플이 이용되었다: 1) 탈지유/글리세롤/트레할로스로 동결-건조된 자유(캡슐화되지 않은) 락토바실러스 샘플(마름모), 2) 탈지유/글리세롤/트레할로스 없이 동결-건조된 자유 락토바실러스 샘플(사각형), 3) 인큐베이션 용액에서 탈지유/글리세롤/트레할로스를 동결방지제로 사용한 본 발명의 방법에 의해 동결-건조된 캡슐화된 락토바실러스 세균 샘플(X)(상기 동결방지제의 증가하는 농도는 각각의 인큐베이션 단계의 연속 희석, 동결방지제(5% 탈지유 파우더, 1% 글리세롤 및 10% 트레할로스)가 첨가된, 100%, 50%, 25%, 12.5%, 6.25%, 3.125%, 0%의 세균 성장 용액에 따라 달성된다.) 4) 트레할로스 없이 동결 건조된 캡슐화 락토바실러스 세균 샘플(삼각형). 동결 건조 후, 2달에 걸쳐 실온에서 5% 탈지유, 1% 글리세롤, 10% 트레할로스가 첨가 또는 비첨가된 동결 보존시킨 후, 세균의 생존율을 평가하기 위하여 동결-건조 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8주에 상기 샘플들을 재수화시켰다. 도 10에서의 실험 결과는 두 가지 경우를 갖는 동결-건조 샘플(4번 복제된 샘플)의 복제물의 평균을 나타낸다: 6주에 10% 트레할로스가 첨가된 자유 세균 및 8주에 10% 트레할로스가 첨가된 캡슐화 세균. RFU=Relative fluorescent units.
도 11은 캡슐화 및 동결 건조 후 각기 다른 시점에서의 락토바실러스 카세이 캡슐을 나타낸 것으로서, 도 11a는 캡슐화 후 락토바실러스 카세이 캡슐 중간체, 도 11b는 동결-건조 전 캡슐화 후 1일째 락토바실러스 카세이 캡슐, 도 11c는 재수화된 동결-건조 락토바실러스 카세이 캡슐을 나타낸 것이다.
도 12는 동결-건조 전 또는 후 1일째의 락토바실러스 카세이 캡슐의 생존율을 비교한 것이다.
도 13은 캡슐화 및 동결 건조 후 각기 다른 시점에서의 비피도박테리움 인판티스 롱검 캡슐을 나타낸 것으로서, 13a는 동결-건조 전 캡슐화 후 1일째 비피도박테리움 인판티스 롱검 캡슐, 도 13b는 재수화된 동결-건조된 비피도박테리움 인판티스 롱검 캡슐을 나타낸 것이다.
도 14는 동결-건조 전 또는 후 1일째의 비피도박테리움 인판티스 롱검 캡슐의 생존율을 비교한 것이다.
본 발명은 하기 비제한적 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명될 것이다.
실시예
실시예 1: 인큐베이션 용액에 동결방지제의 다단계 첨가를 통한 동결 건조
실험데이터:
락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus) 프로바이오틱 세포를 캡슐화, 동결건조, 재수화시키고, 생존율의 측정을 통해 대사 활성을 테스트하였다. 구조적 견고성을 분석하기 위하여 상기 캡슐은 동결 건조 및 재수화시킨 후, 분석되었다.
세균의 캡슐화
600mm 파장에서의 1 OD의 광학 밀도에서, 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus)의 배양물을 수득하였고, 소듐 셀룰로오스 설페이트 및 폴리-디알릴 디메틸 암모니움 클로라이드(pDADMAC-international nomenclature cosmetic ingredient (INCI) 명칭으로 Ge18로 알려져 있음.)로 캡슐화되었다. 캡슐화 세포는 37℃에서 50rpm으로 진탕시키면서, Man, Rogosa and Sharpe(MRS) 배지에서 배양되었다.
동결-건조( Lyophilisation )
캡슐화 세균 및 자유(비캡슐화) 세균은 2번 증류한 멸균수에 동결방지제로, 5% 탈지유, 1% 글리세롤 또는 DMSO를 다단계로 첨가하면서 에탄올/드라이 아이스 베스에서 동결시켰고, 이후 -80℃에서 보관되었다. 비캡슐화 세균을 위한 동결 배지는 다단계 첨가가 이루어지지 않은 것만을 제외하고 상기 캡슐화 세균에서의 배지와 동일하였다.
상기 캡슐화 세포를 위하여, 하기와 같이, 동결방지제가 다단계로 첨가되었다:
일반적인 절차(배양배지의 연속 희석)
㎖당 최대 1,000 캡슐 및 임의의 다수 캡슐을 이용하여, 상기 캡슐(세균을 포함)을 신선한 MRS 배지가 첨가된 50㎖ 팔콘 튜브에 넣었다. 세포 현탁액(인큐베이션 용액)에 동결방지제로 0.5㎖/㎖의 동결배지가 첨가되었고, 이로써 동결방지제의 농도가 50%인 동결배지를 제조하였다. 예시적으로, 세포 현탁액의 전체 부피가 1㎖인 경우, 0.5㎖의 배지가 제거되고, 0.5㎖의 동결 배지가 첨가되어, 50% 희석된 배지를 제조하였다. 캡슐화 세포는 25분 동안 인큐베이션되며, 이후, 50%(v/v)의 인큐베이션 용액을 냉동보존 배지로 대체하였다(전체 부피가 1㎖인 경우, 0.5㎖의 배지가 제거되고, 0.5㎖의 동결 배지가 첨가되어, 75%(v/v) 희석된 배지를 제조하였다.). 50%의 인큐베이션 배지가 동결 배지로 대체되는 후속단계 이전에 상기 인큐베이션은 25분 동안 재차 수행될 수 있다. 마지막 인큐베이션 단계로서, 캡슐화세포의 배양 배지는 100% 동결 배지를 사용하였다.
(A) DMSO 동결방지제의 다단계 첨가
16개의 캡슐들을 9㎖의 신선한 MRS 배지가 첨가된 50㎖ 팔콘 튜브에 넣었다. 상기 세포 현탁액(인큐베이션 용액)에 동결방지제로서 200㎕의 DMSO를 첨가하여 최초 DMSO의 농도가 약 2%(v/v)가 되도록 하였다. 상기 캡슐화 세포는 25분 동안 인큐베이션 되었고, 추가적으로 200㎕의 DMSO를 첨가하여 DMSO의 농도가 약 4.2%(v/v)가 되도록 하였다. 최종 DMSO 농도가 10%(10㎖의 인큐베이션 용액 내 1㎖ DMSO)에 이를 수 있도록 200㎕의 DMSO를 첨가하는 3차례의 후속 단계 전, 상기 인큐베이션은 25분 동안 재차 수행되었다.
(B) 동결방지제로서 탈지유/글리세롤 혼합물의 다단계 첨가 (5% 탈지유 및 1% 글리세롤 수용액)
상기 실시예에서, 직접 제작한 100 라지(large) 캡슐들을 9㎖의 신선한 MRS 배지가 첨가된 50㎖ 팔콘 튜브에 넣었다. 5㎖의 MRS 배지는 팔콘 튜브로부터 제거되었고, 후속 인큐베이션 단계에서 동결방지제로서 탈지유를 함유하는 5㎖의 인큐베이션 용액(5% 탈지유(w/v) 및 1% 글리세롤(w/v) 수용액)이 첨가되었다. 본 실험에서, 동결방지제의 농도를 순차적으로 50%, 75%, 87.5%, 93.75% 97%, 100%로 증가시킨 6번의 인큐베이션 단계가 수행되었으며, 마지막 인큐베이션 단계에서, 캡슐화 세포는 동결배지 존재 하에서 수행되었다. 탈지유 동결방지제의 첨가 후, 각 단계에서의 인큐베이션 단계는 약 25분이었다. 각 인큐베이션 단계의 마지막에서, 캡슐들은 중력에 의해 정착되며, 이는 피펫팅을 통한 인큐베이션 배지의 제거를 가능하게 하였다. 5% 탈지유(w/v) 및 1% 글리세롤 (w/v) 수용액에 의한 마지막 인큐베이션 단계 후, 동결된 캡슐화 세포 및 비캡슐화는 직접 동결용액 내에서 밤새도록 동결건조되었다(임의의 세척단계 없이). 동결-건조를 위하여, 우선, 100% 동결배지에 첨가된 캡슐을 96% 에탄올/드라이 아이스 베스를 이용하여 Shock-frozen하였다. 이후, Shock-frozen된 펠릿은 -80℃에서 보관되거나 동결-건조된 상태로 즉시 이동될 수 있다. 임의의 동결-건조 장치가 제조사의 지침에 따라 동결건조 과정을 위해 사용될 수 있다. 이러한 실험의 결과는 도 1 내지 도 9에 나타내었다. 도 1의 캡슐의 명시야 현미경 영상으로부터 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명의 방법에서 캡슐의 연속적인 배양은, 재수화 이후, 손상되지 않은 채로 캡슐화되어 캡슐의 구조적 견고성을 향상시켰다. 또한, 이와 관련하여, 본 발명의 실시예를 통해 처리된(인큐베이션 단계에서 탈지유의 농도를 증가시킴을 통해) 셀룰로오스 설페이트 캡슐을 나타내는 도 4 및 도 5의 이미지를 살펴보면, 액체 질소 또는 에탄올/드라이 아이스로 동결-건조시킨 경우, 재수화 후에도 본래의 매끄러운 표면의 구형 형상이 유지되었던 반면, 도 6 내지 도 9에 나타낸 바와 같이, 동결방지제가 처리되지 않은 채 다양한 버퍼로 동결 건조된 캡슐은 크게 손상되거나 파괴되었다.
세포를 내부에 함유하는 캡슐의 구조적 견고성을 유지하는 것 외에도, 본 발명의 동결-건조 방법은 캡슐화 세포의 상당히 높은 생존율을 제공한다. 도 2는 테스트된 세균에 대한 동결-건조 동안 캡슐의 보호 효과를 보여주며, 사용 시, 동결 세포, 동결방지제로 탈지유와 글리세롤의 양이 증가하는 인큐베이션 용액을 준비하였다. 상기 보호 효과는 동결-건조 세균의 재수화 후, 동결-건조시킨 뒤, 1 일째 생존율 테스트를 통해서 확인하였다. 상기 생존율은 참고로 신선한 캡슐화 세균 세포와 비교하였으며, % 생존율로 표기하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 동결-건조방법을 처리한 경우, 캡슐은 동결-건조로부터 세균을 보호하였으며(캡슐화 세균에서 98% 생존율, 비처리 세포에서는 25% 생존율), 이는 캡슐화된 세균의 생존율을 비 처리된 세균에 비해 상당히 증가시킬 수 있음을 의미한다.
도 3은 본 실시예에서 2가지의 다른 인큐베이션 용액을 사용한 경우, 동결-건조 동안 세균의 생존율을 비교한 것이다(인큐베이션 용액 1: 동결방지제인 DMSO의 양이 증가하는 MRS 배지, 탈지유의 양이 증가하는 인큐베이션 용액 2). 도 3에 나타낸 바와 같이, DMSO를 처리한 경우에는 오직 9%의 생존율을 보여 비효율적이었던 반면, 탈지유의 농도가 증가하는 인큐베이션 단계(추가적인 동결방지제로 글리세롤)는 동결 건조 처리를 하지 않은 신선한 캡슐화 세포와 비교하여, 생존율의 변화가 존재하지 않았다.
실시예 2: 소듐 셀룰로오스 설페이트 캡슐화된 락토바실러스의 생존율에 대한 동결방지제인 트레할로스 및 탈지유의 효과
본 실시예에서, 적당한 대기 조건에서 보관하는 경우, 동결방지제로 10% 트레할로스와 함께 또는 없이 처리한 경우, 캡슐화된 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus)의 생존율을 평가하였다. 연속적인 인큐베이션 단계를 위해 사용된 동결 건조 용액은 5% 탈지유(w/v), 1% 글리세롤(w/v), 및 10% 트레할로스(w/v)를 함유하는 친수성 용액이 사용되었다.
실험 세부사항:
이전 프로바이오틱 세균의 동결 바이알, 락토바실러스 아시도필루스를 -80℃에서부터 해동시킨 후, 50㎖의 MRS 배지에 20㎕가 첨가되었다. 뒤이어, 상기 세균은 37℃에서 50rpm로 진탕시키면서, 밤새도록 배양되었다. 그 다음날, 600nm (OD600)에서 세균 배지의 광학적 밀도는 Tecan Infinite M200으로 측정되었다. 전형적으로, OD600 값 1은 세균이 지수 성장 단계에 있는 경우이며, 캡슐화하는 경우, 상기 세균은 지수 성장 단계에 있어야 한다.
세균의 캡슐화를 위하여, OD600 값이 1인 세균 배지 100㎕를 0.9% 소듐 클로라이드를 함유하는 1.8% 소듐 셀룰로오스 설페이트 2㎖와 혼합하였다. 5㎖ 시린지(syringe)와 23G 니들(needle)이 상기 캡슐화 과정을 위해 사용되었다. 상기 세균 배지는 소듐 셀룰로오스 설페이트와 혼합되었으며, pDAMDMAC(24KDa), 0.9% 소듐 클로라이드가 함유된 젤라틴 베스에 침지시켰다. 상기 캡슐은 4분 동안 pDADMAC 내에서 젤라틴화되었다. 뒤이어, 300㎖의 1xPBS(Phophate Buffered Saline)가 첨가되었고, 상기 캡슐은 8분 동안 세척되었다. 300㎖의 세척용액을 제거한 후, 400㎖의 PBS가 더 첨가되었으며, 상기 캡슐은 추가적으로 4분 동안 세척되었다. 이후, 세척 용액을 따라내고, 100㎖의 PBS로 3번, 30㎖의 신선한 MRS 배지로 3번 세척하였다. 상기 캡슐들은 100㎖의 신선한 MRS 배지가 첨가된 250㎖의 코니칼 플라스크에 옮겨졌으며, 이후, 37℃에서 50rpm로 진탕시키면서, 밤새도록 인큐베이션되었다.
자유(비캡슐화) 세포를 위하여, 이를 OD600=1에서 5㎖의 락토바실러스 세포 배양물을 15㎖ 팔콘 튜브에 넣었고, 5분 동안 3000g로 원심분리시켰다. 세균 펠렛은 10%(w/v)의 트레할로스가 첨가 또는 첨가되지 않은 5㎖의 동결보존 배지(5% 탈지유(w/v), 1% 글리세롤(w/v)을 함유하는 수용액)에서 재현탁되었다. 이후, 상기 재현탁된 세균은 15㎖의 팔콘 튜브 내 10×0.5㎖의 양으로 분주되었다. 5㎕의 재현탁 세포를 96-웰 플레이트의 4 웰에 넣고, 세균 세포의 대사 활성을 측정하기 위하여 Alamar Blue assay를 수행하였다. Alamar Blue®은 resazurin을 형광물질인 resorufin으로 전환시키는 능력을 감소시키는, 입증된 세포 생존율 표지자이다. 이는 대사적 활성 세포의 반응을 감소시킴으로써, 비형광 표지자 염색제인 Resazurin을 붉은색의 형광물질인 resorufin으로 전환시킨다. 생산되는 형광량은 살아있는 세포의 수에 비례한다. 100㎕의 신선한 MRS 배지 및 10㎕의 Alamar Blue 시약을 5㎕의 세균 샘플에 첨가하고, 상기 샘플은 37℃에서 50rpm으로 진탕시키면서, 인큐베이션되었다. 상기 Alamar Blue assay 플레이트는 Tecan Infinte M200으로 판독되었다. 동결방지 배지 내 나머지 비캡슐화 세포는 에탄올/드라이 아이스 베스에서 동결되었고, -80℃에서 보관되었다.
밤새도록 배양한 후, 캡슐을 함유하는 세균을 250㎖ 플라스크에서 3×50㎖의 신선한 MRS 배지로 세척하고, 10㎖의 신선한 MRS 배지가 첨가된 15㎖ 팔콘 튜브에 넣었다. 5㎖의 MRS 배지를 제거하고, 10%(w/v)의 트레할로스가 첨가 또는 첨가되지 않은 5㎖의 동결보존배지(비캡슐화 세포를 위하여)를 첨가하였다. 상기 캡슐은 25분 동안 현탁액에서 인큐베이션되었고, 5㎖의 배지가 제거되었으며, 5㎖의 신선한 동결보전 배지(적절히 10% 트레할로스가 첨가되거나 첨가되지 않은 채)로 대체되었다. 이러한 과정은 추가적으로 4회 실시하였고, 이에 동결방지제의 비율은 첫 동결보존 배지 첨가 후 50%에서 최종 98.5%까지 증가되었다. 뒤이어, 96웰 플레이트의 각 4웰에 배지로부터 수득한 1 캡슐을 넣고, 캡슐 내 세균 세포의 대사 활성의 정도를 측정하기 위해 Alamar Blue assay를 수행하였다. 10㎕의 Alamar Blue 시약 및 100㎕의 신선한 MRS 배지는 캡슐이 함유되어 있는 각 웰에 첨가하였고, 상기 샘플들은 37℃에서 50rpm으로 1시간 동안 진탕시키면서, 인큐베이션되었다. Alamar Blue assay 플레이트는 Tecan Infinte M200으로 판독되었다. 동결보존 배지로부터 수득한 4개의 캡슐은 10% 트레할로스가 첨가 또는 첨가되지 않은, 5% 탈지유를 함유하는 500㎕의 수용성 동결 건조 용액이 첨가된 15㎖ 팔콘 튜브에 넣었다. 이후, 상기 샘플들은 에탄올/드라이 아이스 베스에서 동결되었고, -80℃에서 보관되었다.
10% 트레할로스가 첨가 또는 비첨가된 탈지유 동결방지제와 함께 상기 비캡슐 세포 또는 캡슐화 세포를 함유하는 팔콘 튜브는 ThermoScientific Modulyo D-230 freeze-drier를 이용하여 밤새도록 동결-건조되었다. 동결-건조된 세균의 생존율을 테스트하기 위하여, 복제되는 각 시점에서, 동결-건조된 비캡슐화 또는 캡슐화 락토바실러스 샘플을 각각 500㎕ Millipore water, 또는 5-10㎖의 MRS 배지를 이용하여 재수화시켰다. 이후, 비캡슐화 또는 캡슐화 락토바실러스에 대한 Alamar Blue assay를 실시하였다. 상기 assay는 하기 조건으로 각각 처리된 네 번의 복제 샘플로 이루어진다.
1. 빈 샘플(100㎕ MRS 배지 + 10㎕ Alamar Blue)
2. 트레할로스가 첨가된 동결-건조 자유(비캡슐) 락토바실러스 샘플(5㎕의 재수화 배양물+ 100㎕ MRS 배지 + 10㎕ Alamar Blue)
3. 트레할로스가 비첨가된 동결-건조 자유(비캡슐) 락토바실러스 샘플(5㎕의 재수화 배양물+ 100㎕ MRS 배지 + 10㎕ Alamar Blue)
4. 트레할로스 첨가된 동결-건조 캡슐화 세균 샘플(웰당 1개의 캡슐+ 100㎕ MRS 배지 + 10㎕ Alamar Blue)
5. 트레할로스가 비첨가된 동결-건조 캡슐화 세균 샘플(웰당 1개의 캡슐+ 100㎕ MRS 배지 + 10㎕ Alamar Blue)
상기 샘플들은 50rpm에서 1시간 동안 진탕시키면서, 37℃에서 인큐베이션되었다. 상기 Alamar Blue assay 플레이트는 Tecan Infinte M200으로 판독되었다. 상기 샘플들이 재수화되는 시점은 동결-건조 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8주였다. 동결 건조 후, 2달에 걸쳐, 실온에서 5% 탈지유, 1% 글리세롤, 10% 트레할로스가 첨가 또는 비첨가된 동결 보존시킨 후, 세균의 생존율을 평가하기 위하여 동결-건조 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8주에 상기 샘플들을 재수화시켰다.
본 실험의 결과는 도 10에 나타내었다. 도 10에서의 실험 결과는 두 가지 경우를 갖는 동결-건조 샘플(4번 복제된 샘플)의 복제물의 평균을 나타낸다: 6주에 10% 트레할로스가 첨가된 비캡슐화 세균 및 8주에 10% 트레할로스가 첨가된 캡슐화 세균, 이 두 경우에 있어서, 전자의 복제물은 현격하게 감소되고 사라졌다 (이유는 불분명함). 생존율은 상대적인 형광 단위(RFU)로 측정되었다. 도 10에 나타낸 바와 같이, 캡슐화 세균 세포가 동결방지제로 동결 배지(5% 탈지유, 1% 글리세롤, 10% 트레할로스)의 농도가 증가하는 용액에서 연속적으로 배양되는 본 발명의 동결-건조 방법은 60% 이상의 세포 생존율을 보였으며, 비캡슐화 세포의 생존율을 상당히 증진시켰다. 탈지유의 농도만을 증가시킨 경우, 세포 생존율은 2주의 보관 기간 동안에만 60% 이상을 나타낸 반면, 10% 트레할로스를 첨가한 경우, 8주의 실험 전 기간 동안, 상당히 증가된 생존율을 유지할 수 있었으며, 이는 캡슐화 세포의 수명을 연장시킴을 의미한다. 또한, 이러한 결과는 본 발명의 방법 및 본 발명의 방법에 의해 수득되는 동결-건조 캡슐화 세포는 사용 전 일정 기간 동안 보관이 필요한 프로바이오틱 세포와 같은 세포에 대한 상용화에 유망한 가능성을 가지고 있음을 보여준다.
실시예 3: 동결방지제로 탈지유, 트레할로스 및 글리세롤을 함유하는 조성물을 통한 캡슐화된 락토바실러스 카세이의 동결-건조
이전 프로바이오틱 세균의 동결 바이알, 락토바실러스 카세이를 -80℃에서부터 해동시킨 후, 50㎖의 MRS 배지에 20㎕ 첨가되었다. 뒤이어, 상기 세균은 37℃에서 50rpm으로 진탕시키면서, 밤새도록 인큐베이션되었다. 그 다음날, 600nm(OD600)에서 세균 배지의 광학적 밀도는 Tecan Infinite M200으로 측정되었다. 전형적으로, OD600 값 1은 세균이 지수 성장 단계에 있는 경우이며, 캡슐화하는 경우, 상기 세균은 지수 성장 단계에 있어야 한다.
세균의 캡슐화를 위하여, OD600 값이 1인 세균 배지 100㎕를 0.9% 소듐 클로라이드를 함유하는 1.8% 소듐 셀룰로오스 설페이트 2㎖와 혼합하였다. 5㎖ 시린지(syringe)와 23G 니들(needle)이 상기 캡슐화 과정을 위해 사용되었다. 상기 세균 배지는 소듐 셀룰로오스 설페이트와 혼합되었으며, 150㎖의 1.3% pDAMDMAC(24KDa), 0.9% 소듐 클로라이드가 함유된 젤라틴 베스에 침지시켰다. 상기 캡슐은 4분 동안 pDADMAC 내에서 젤라틴화되었다. 뒤이어, 300㎖의 1xPBS (Phophate Buffered Saline)가 첨가되었고, 상기 캡슐은 8분 동안 세척되었다. 300㎖의 세척 용액을 제거한 후, 400㎖의 PBS를 더 첨가하였으며, 상기 캡슐은 추가적으로 4분 동안 세척되었다. 이후, 세척 용액을 따라내고, 3×100㎖의 PBS로, 3×30㎖의 신선한 MRS 배지로 세척하였다. 이후, 상기 캡슐은 100㎖의 신선한 MRS 배지가 첨가된 250㎖ 코니칼 플라스크로 옮겨졌으며, 37℃에서 50rpm에서 진탕시키면서, 밤새도록 인큐베이션되었다.
밤새도록 배양한 후, 캡슐을 함유하는 세균을 250㎖ 플라스크에서 50㎖의 신선한 MRS 배지로 세 번 세척하고, 10㎖의 신선한 MRS 배지가 첨가된 15㎖ 팔콘 튜브에 넣었다. 5㎖의 MRS 배지를 제거하고, 5㎖의 동결보존 배지(5% 탈지유(w/v), 1% 글리세롤(w/v), 10%(w/v)가 함유된 수용액)이 첨가되었다. 상기 캡슐은 25분 동안 현탁액에서 인큐베이션되었고, 5㎖의 배지가 제거되고 5㎖의 신선한 동결보존 배지로 대체되었다. 이러한 과정은 추가적으로 4차례 반복 수행되었고, 그 결과, 동결방지제의 비율은 첫 동결보존 배지 첨가후 50%에서 최종 98.5%까지 증가되었다.
끝으로, 5% 탈지유, 1% 글리세롤 및 10% 트레할로스를 함유하는 500㎕의 수용성 동결 건조 용액이 첨가된 15㎖ 팔콘 튜브에 동결보존 배지로부터 수득한 캡슐을 넣었다. 이후, 상기 샘플들은 에탄올/드라이 아이스 베스에서 동결되었고, -80℃에서 보관되었다.
캡슐화 전 또는 후의 캡슐화 세포를 보여주는 도 11A 내지 도 11C에 나타낸 바와 같이(도 11A는 캡슐화 직후 락토바실러스 카세이 캡슐, 도 11B는 동결 건조 전 캡슐화 후 1일째 락토바실러스 카세이의 캡슐, 및 도 11C는 재수화된 동결-건조 락토바실러스 카세이 캡슐), 락토바실러스 카세이 캡슐은 동결-건조 후에도 손상되지 않았으며, 이는 동결-건조에 대한 영향이 없음을 의미한다.
육안에 의한 검사 외에도, 상기 실시예 2와 같은 방법으로 동결 건조 전 또는 후, 캡슐화 락토바실러스 카세이 세균의 생존율을 측정하였다. 도 12에 나타낸 바와 같이, 상기 결과는 락토바실러스 카세이 세균의 생존율에 동결-건조가 영향을 미치며, 이는 동결 건조 후, 생존율이 회복됨을 의미한다. 따라서 실시예 3에서는 동결-건조 방법 및 본 발명의 개별적인 조성물의 효율성과 안정성을 확인하였다.
실시예 4: 동결방지제로 탈지유, 트레할로스 및 글리세롤을 함유하는 조성물을 이용한 캡슐화된 비피도박테리움 인판티스 롱검의 동결 건조
비피도박테리움 인판티스 롱검은 전형적인 혐기성 세균 중 하나이다. 따라서 상기 세포는 혐기성 조건 하, 50rpm 및 37℃의 MRS 배지에서 밤새도록 배양되었다. 배양기간 동안 엄격한 혐기성 환경을 조성하고자 Gaspak(BD)를 사용하였다.
배양된 비피도박테리아는 실시예 2 및 3에 기술된 바와 같이, 소듐 셀룰로오스 설페이트를 이용하여 캡슐화되었으며, 다만 혐기성 조건 하에서 진행되었다. 밤새도록 배양시킨 후, 캡슐을 함유하는 세균을 250㎖ 플라스크에서 3×50㎖의 신선한 MRS 배지로 세척하고, 10㎖의 신선한 MRS 배지가 첨가된 15㎖ 팔콘 튜브에 넣었다. 5㎖의 MRS 배지를 제거하고, 5㎖의 동결보존 배지(5% 탈지유(w/v), 1% 글리세롤 (w/v), 10%(w/v)가 함유된 수용액)이 첨가되었다. 상기 캡슐은 25분 동안 현탁액에서 인큐베이션되었고, 5㎖의 배지가 제거되었으며, 5㎖의 신선한 동결보존 배지로 대체되었다. 이러한 과정은 추가적으로 4차례 반복 수행되었고, 그 결과, 동결방지제의 비율은 첫 동결보존 배지 첨가 후 50%에서 최종 98.5%까지 증가되었다.
끝으로, 5% 탈지유, 1% 글리세롤 및 10% 트레할로스를 함유하는 500㎕의 수용성 동결 건조 용액이 첨가된 15㎖ 팔콘 튜브에 동결보존 배지로부터 수득한 캡슐을 넣었다. 이후, 상기 샘플들은 에탄올/드라이 아이스 베스에서 동결되었고, -80℃에서 보관되었다.
캡슐화 전 또는 후의 캡슐화 세포를 보여주는 도 13에 나타낸 바와 같이(도 13a는 동결 건조 전 캡슐화 후 1일째 비피도박테리움 인판티스 롱검 캡슐, 및 도 13b는 재수화된 동결-건조 비피도박테리움 인판티스 롱검 캡슐), 비피도박테리움 인판티스 롱검 캡슐은 동결-건조 후에도 크게 손상되지 않았다.
육안에 의한 검사 외에도, 상기 실시예 2와 같은 방법으로 동결 건조 전 또는 후, 캡슐화된 비피도박테리움 인판티스 세균의 생존율을 측정하였다. 도 14에 나타낸 바와 같이, 비피도박테리움 인판티스 롱검의 생존율에 동결-건조가 어느 정도 영향을 미쳤으며, 도 14에 보여주는 바와 같이, 동결-건조 후 50%의 생존율을 나타내었다. 그러나 비캡슐화 비피도박테리움 인판티스는 더욱 낮을 것으로 생각된다. 또한, 동결-건조 과정에서 완전히 건조된 캡슐에 의해 높은 생존율을 기대할 수 있다. 따라서 실시예 4에서는 동결-건조 방법 및 본 발명의 개별적인 조성물의 효율성 안정성을 확인하였다.
본 발명에 예시적으로 개시된 실시 태양들을 본 발명에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들의 부재 하에서 적합하게 실행할 수 있다. 따라서 예를 들어 "포함하는", "구성되는", "함유하는" 등의 용어들은 광범위하고 제한 없이 해석될 것이다. 추가로, 본 발명에 사용되는 용어 및 표현들은 제한이 아닌 개시의 용어로서 사용되었으며, 상기와 같은 용어 및 표현들의 사용에서 도시되고 개시된 특징들 또는 그의 부분들의 임의의 등가물을 제외하고자 하는 것이 아니라, 다양한 변형들이 특허청구된 발명의 범위 내에서 가능함을 인정하는 것이다. 따라서 본 실시 태양들을 바람직한 실시 태양 및 임의의 특징들에 의해 구체적으로 개시하였지만, 이들의 변형 및 변화들이 당해 분야의 숙련가들에 의해 복원될 수 있으며, 상기와 같은 변형 및 변화들이 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주됨은 물론이다.
또한, 일반적인 명세 내에 있는 보다 좁은 종 및 아속 그룹도 또한 본 발명의 부분을 형성한다. 이는 삭제된 물질을 본 발명에서 구체적으로 인용하든 인용하지 않던간에, 임의의 주제 물질을 상기 속으로부터 제거한다는 단서 또는 부정적인 한정과 함께 본 발명의 일반적인 개시를 포함한다.
또한, 특징들이 마쿠시 그룹에 의해 개시되는 경우, 당해 분야의 숙련가들은 상기 명세가 또한 상기 마쿠시 그룹의 임의의 개별적인 구성원 또는 구성원들의 하위그룹에 의해 개시됨을 알 것이다. 추가의 실시 태양들은 하기 특허청구범위로부터 자명해질 것이다.

Claims (55)

  1. 적어도 2번의 연속적인 인큐베이션 단계(consecutive incubation steps)를 포함하는, 캡슐화 세포의 동결-건조(freeze-drying) 방법으로서, 상기 캡슐화 세포는 적절한 기간에 걸쳐 동결방지제를 함유하는 인큐베이션 용액에서 각각의 인큐베이션 단계에 인큐베이션되며, 상기 인큐베이션 용액 내 동결방지제의 농도는 각각의 후속 인큐베이션 단계에서 증가되는 것인, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10번의 인큐베이션 단계를 포함하며, 상기 각각의 인큐베이션 단계에서 동결방지제의 농도는 증가되는 것인, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    각각의 인큐베이션 단계에서 동일한 동결방지제가 이용되는 것인, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 동결방지제는 탈지유, 글리세롤, 디메틸설폭사이드(DMSO), 포름아마이드, 포름아마이드와 DMSO의 혼합물, N-메틸아세트아마이드(MA), 폴리비닐피롤리돈, 프로판디올, 프로필렌 글리콜, 혈청 알부민, 메탄올과 혈청 알부민의 혼합물, 탄수화물 및 알지네이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 탄수화물은 수크로오스, 메탄올과 혼합된 글루코오스, 락토오스, 트레할로스, 라피노오스, 덱스트란, 펙틴, 하이드록시에틸전분(HES), 및 셀룰로오스 설페이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서,
    상기 동결방지제는 탈지유와 탄수화물의 혼합물인 것인, 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 탄수화물은 수크로오스, 메탄올과 혼합된 글루코오스, 락토오스, 트레할로스, 라피노오스, 및 덱스트란으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 탈지유의 농도는 상기 적어도 2번의 연속적인 인큐베이션 단계 각각에서 증가되는 것인, 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 탄수화물의 농도는 상기 적어도 2번의 연속적인 인큐베이션 단계 각각에서 일정하게 유지되는 것인, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 캡슐화 세포는 진핵 세포 또는 원핵 세포인, 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 진핵 세포는 포유류 세포, 균류 세포, 또는 효모 세포인, 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 효모 세포는 사카로마이세스(Saccharomyces), 데바로마이세스(Debaromyces), 칸디다(Candida), 피키아(Pichia) 및 토룰롭시스(Torulopsis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 균류 세포는 아스페르길루스(Aspergillus), 리조퍼스(Rhizopus), 무코르(Mucor) 및 페니실리움(Penicillium)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  14. 제10항에 있어서,
    상기 원핵 세포는 세균 세포인, 방법.
  15. 제11항에 있어서,
    상기 세균 세포는 비피도박테리움(Bifidobacterium), 박테로이데스(Bacteroides), 클로스트리디움(Clostridium), 푸소박테리움(Fusobacterium), 멜리소코쿠스(Melissococcus), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 스트렙토코커스(Streptococcus), 엔테로코커스(Enterococcus), 락토코커스(Lactococcus), 스타필로코커스(Staphylococcus), 펩토스트렙토코커스(Peptostrepococcus), 바실러스(Bacillus), 페디오코커스(Pediococcus), 마이크로코커스(Micrococcus), 루코노스톡(Leuconostoc), 웨이셀라(Weissella), 에어로코커스(Aerococcus), 오에노코커스(Oenococcus), 게오바실러스(Geobacillus) 및 락토바실러스(Lactobacillus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  16. 제10항에 있어서,
    상기 세포는 프로바이오틱 세포인, 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 프로바이오틱 세포는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cereviseae), 바실러스 코아굴란스(Bacillus coagulans), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 비피도박테리움 인굴라툼(Bifidobacterium angulatum), 비피도박테리움 아니말리스(Bifidobacterium animalis), 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis), 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium), 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus faecalis), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 아밀로보루스(Lactobacillus amylovorus), 락토바실러스 알리멘타리우스(Lactobacillus alimentarius), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 카세이 아종. 카세이(Lactobacillus casei subsp . casei), 락토바실러스 카세이 시로타(Lactobacillus casei Shirota), 락토바실러스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus), 락토바실러스 델브루엑키 아종. 락티스(Lactobacillus delbrueckii subsp . lactis), 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 파르시미누스(Lactobacillus farciminus), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 존소니이(Lactobacillus johnsonii), 락토바실러스 락티(Lactobacillus lacti), 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 펜토사세우스(Lactobacillus pentosaceus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 람노서스 (락토바실러스 GG)(Lactobacillus rhamnosus (Lactobacillus GG)), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sake), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 락토바실러스 써모톨레란스(Lactobacillus thermotolerans), 락토바실러스 무코사에(Lactobacillus mucosae), 마이크로코커스 바리안스(Micrococcus varians), 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici), 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus), 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici), 페디오코커스 할로필루스(Pediococcus halophilus), 스트렙토코커스 페칼리스(Streptococcus faecalis), 스트렙토코커스 써모필루스(Streptococcus thermophilus), 스타필로코커스 카르노수스(Staphylococcus carnosus), 및 스타필로코커스 자일로수스(Staphylococcus xylosus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 캡슐화될 때 지수 성장기(exponential growth phase)인 것인, 방법.
  19. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 다공성의 캡슐 벽을 갖는 마이크로캡슐에 캡슐화되는 것인, 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 다공성의 캡슐 벽은 알지네이트 중합체, 콜라겐, 젤라틴, 키토산, 아가로오스, 폴리-라이신 중합체, 셀룰로오스 설페이트 중합체 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 소재로 이루어지는 것인, 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 알지네이트 중합체는 순수 알지네이트 중합체, 변형된 알지네이트-전분 중합체, 알지네이트-이눌린-잔탄 검, 알지네이트와 폴리 L-라이신 중합체, 키토산/알지네이트 중합체 및 키토산/잔탄 중합체로부터 선택되는 것인, 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 셀룰로오스 설페이트 중합체는 소듐 셀룰로스 설페이트(NaCS)/폴리-디알릴 디메틸 암모니움 클로라이드(poly[diallyl(dimethyl)ammoniumchloride]) (pDADMAC)로부터 형성된 복합체를 포함하는 것인, 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 캡슐화 세포는 중간 세척 단계 없이 적합한 동결 건조 배지로 이동되는 것인, 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 캡슐화 세균 세포는 마지막 인큐베이션 단계 후에 적합한 동결 건조 배지에서 동결건조되는 것인, 방법.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 동결 건조 배지는 동결방지제를 함유하는 것인, 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서,
    상기 동결 건조 배지는 인큐베이션 용액으로서, 동일한 동결방지제를 함유하는 것인, 방법.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 동결방지제는 탈지유, 글리세롤, 디메틸설폭사이드(DMSO), 포름아마이드, 포름아마이드와 DMSO의 혼합물, N-메틸아세트아마이드(MA), 폴리비닐피롤리돈, 프로판디올, 프로필렌 글리콜, 혈청 알부민, 메탄올과 혈청 알부민의 혼합물, 탄수화물 및 알지네이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  28. 제27항에 있어서,
    상기 탄수화물은 수크로오스, 메탄올과 혼합된 글루코오스, 락토오스, 트레할로스, 라피노오스, 덱스트란, 펙틴, 하이드록시에틸전분(HES) 및 셀룰로오스 설페이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  29. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 동결 건조 배지는 동결방지제를 함유하는 수용성 용액인 것인, 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득된 동결-건조된 캡슐화 세포.
  31. 제30항의 캡슐화 세포 및 적합한 담체를 포함하는 조성물.
  32. 제31항에 있어서,
    상기 조성물은 식품 보조제, 비누 제제, 화장료 조성물 또는 약학적 조성물인 것인, 조성물.
  33. 제31항 또는 제32항의 조성물, 또는 제25항의 캡슐화 세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 설사, 항생제에 의해 유발된 설사, 관절염, 비만, 과민성 대장 증후군, 속쓰림(heartburn), 만성 피로 증후군 및 장 내 세균 개체수의 불균형에 의해 고통을 받는 다른 형태의 질병을 예방 또는 치료하는 방법.
  34. 제31항 또는 제32항의 조성물, 또는 제30항의 캡슐화 세포의 설사, 항생제에 의해 유발된 설사, 관절염, 비만, 과민성 대장 증후군, 속쓰림(heartburn), 만성 피로 증후군, 위장암 및 장 내 세균 개체수의 불균형에 의해 고통을 받는 다른 형태의 질병을 예방 또는 치료하기 위한 용도.
  35. 제31항 또는 제32항의 조성물, 또는 제30항의 캡슐화 세포의 약학적, 식품 첨가제 또는 화장료 첨가제로서의 용도.
  36. 제35항에 있어서,
    상기 식품은 우유-기반 제품인, 용도.
  37. 제36항에 있어서,
    상기 우유-기반 제품은 요거트, 커티지 치즈, 또는 버터 밀크인, 용도.
  38. 제36항 내지 37항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 식품 첨가제로서의 용도, 제30항의 캡슐화 세포, 또는 제31항 또는 제32항의 조성물은 식품을 함유하는 식품 패키지의 분리된 구획(compartment)에 저장하기 위한 것인, 용도.
  39. 제35항에 있어서,
    상기 화장료 첨가제는 비누, 로션, 메이크-업, 크림, 샤워겔, 배스 솔트, 및 헤어 워시로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 용도.
  40. 적어도 2번의 연속적인 인큐베이션 단계(consecutive incubation steps)를 포함하는, 동결-건조(freeze-drying)를 위한 캡슐화 세포의 제조방법으로서, 상기 캡슐화 세포는 적절한 기간에 걸쳐 동결방지제를 함유하는 인큐베이션 용액에서 각각의 인큐베이션 단계에 인큐베이션되며, 상기 인큐베이션 용액 내 동결방지제의 농도는 각각의 후속 인큐베이션 단계에서 증가되는 것인, 방법.
  41. 동결-건조된 캡슐화 세포, 원핵 세포, 또는 동결 건조된 캡슐화 효모 세포.
  42. 제41항에 있어서,
    상기 원핵 세포는 세균 세포인, 세포.
  43. 제42항에 있어서,
    상기 세균 세포는 비피도박테리움(Bifidobacterium), 박테로이데스(Bacteroides), 클로스트리디움(Clostridium), 푸소박테리움(Fusobacterium), 멜리소코쿠스(Melissococcus), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 스트렙토코커스(Streptococcus), 엔테로코커스(Enterococcus), 락토코커스(Lactococcus), 스타필로코커스(Staphylococcus), 펩토스트렙토코커스(Peptostrepococcus), 바실러스(Bacillus), 페디오코커스(Pediococcus), 마이크로코커스(Micrococcus), 루코노스톡(Leuconostoc), 웨이셀라(Weissella), 에어로코커스(Aerococcus), 오에노코커스(Oenococcus), 게오바실러스(Geobacillus) 및 락토바실러스(Lactobacillus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 세포.
  44. 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 프로바이오틱 세포인, 세포.
  45. 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 프로바이오틱 세포는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cereviseae), 바실러스 코아굴란스(Bacillus coagulans), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 비피도박테리움 인굴라툼(Bifidobacterium angulatum), 비피도박테리움 아니말리스(Bifidobacterium animalis), 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis), 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium), 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus faecalis), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 아밀로보루스(Lactobacillus amylovorus), 락토바실러스 알리멘타리우스(Lactobacillus alimentarius), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 카세이 아종. 카세이(Lactobacillus casei subsp . casei), 락토바실러스 카세이 시로타(Lactobacillus casei Shirota), 락토바실러스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus), 락토바실러스 델브루엑키 아종. 락티스(Lactobacillus delbrueckii subsp . lactis), 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 파르시미누스(Lactobacillus farciminus), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 존소니이(Lactobacillus johnsonii), 락토바실러스 락티(Lactobacillus lacti), 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 펜토사세우스(Lactobacillus pentosaceus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 람노서스 (락토바실러스 GG)(Lactobacillus rhamnosus (Lactobacillus GG)), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sake), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 마이크로코커스 바리안스(Micrococcus varians), 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici), 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus), 페디오코커스 에시디락티시 (Pediococcus acidilactici), 페디오코커스 할로필루스(Pediococcus halophilus), 스트렙토코커스 페칼리스(Streptococcus faecalis), 스트렙토코커스 써모필루스(Streptococcus thermophilus), 스타필로코커스 카르노수스(Staphylococcus carnosus), 및 스타필로코커스 자일로수스(Staphylococcus xylosus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 세포.
  46. 탈지유, 글리세롤 및 탄수화물을 포함하는 캡슐화 세포의 동결에 적합한 조성물.
  47. 제46항에 있어서,
    상기 탄수화물은 수크로오스, 메탄올과 혼합된 글루코오스, 락토오스, 트레할로스, 라피노오스, 덱스트란, 펙틴, 하이드록시에틸전분(HES), 셀룰로오스 설페이트 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 조성물.
  48. 제47항에 있어서,
    상기 탄수화물은 수크로오스, 락토오스, 라피노오스 또는 트레할로스인, 조성물.
  49. 제46항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 탈지유는 약 1%(w/v) 내지 약 10%(w/v)의 농도로 존재하는 것인, 조성물.
  50. 제46항 내지 제49항에 있어서,
    상기 글리세롤은 약 0.2%(w/v) 내지 약 5%(w/v)의 농도로 존재하는 것인, 조성물.
  51. 제46항 내지 제50항에 있어서,
    상기 탄수화물은 약 1%(w/v) 내지 약 15%(w/v)의 농도로 존재하는 것인, 조성물.
  52. 제51항에 있어서,
    상기 탈지유는 약 3%(w/v) 내지 약 8%(w/v)의 농도로 존재하고, 글리세롤은 0.5%(w/v) 내지 약 2%(w/v)의 농도로 존재하며, 탄수화물은 약 5%(w/v) 내지 약 13%(w/v)의 농도로 존재하는 것인, 조성물.
  53. 동결-건조를 위한 캡슐화 세포의 제조를 위한 제46항 내지 제52항 중 어느 한 항의 조성물의 용도.
  54. 캡슐화 세포의 동결을 위한 제46항 내지 제52항 중 어느 한 항의 조성물의 용도.
  55. 제46항 내지 제52항 중 어느 한 항의 조성물에서 캡슐화 세포를 인큐베이션하는 것을 포함하는, 동결-건조를 위한 캡슐화 세포의 제조방법.
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