CN109563468B

CN109563468B - 通过压滤和在陶瓷膜上的切向流过滤分离酶与里氏木霉

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Publication number: CN109563468B
Application number: CN201780045492.8A
Authority: CN
Inventors: M.F.本沙巴内; R.鲁塞
Original assignee: National Academy Of Agrifood And Environment; IFP Energies Nouvelles IFPEN
Current assignee: National Academy Of Agrifood And Environment; IFP Energies Nouvelles IFPEN
Priority date: 2016-07-22
Filing date: 2017-07-11
Publication date: 2023-03-31
Anticipated expiration: 2037-07-11
Also published as: ZA201900023B; JP2019520842A; MX2019000502A; US11274122B2; FR3054141B1; CN109563468A; US20200031864A1; AU2017299082A1; CA3031396A1; FR3054141A1; BR112019000802A2; EP3487983A1; AU2017299082B2; JP6942406B2; AU2017299082A8; WO2018015228A1

Abstract

本发明涉及一种将来自培养基的酶混合物与霉菌里氏木霉分离的方法，该培养基获自由霉菌生产酶，在该方法中：从停止生产开始，在不大于30小时的时间段内在内衬有孔隙尺寸为3‑20µm的织物的压滤机上对所述培养基施以分离，从而获得具有在600 nm下小于2.5的经校准的光密度OD的滤液；在具有0.5至1.4µm的截留阈值的陶瓷膜上对所获得的液相施以切向流微量过滤，从而经校准的在600 nm下的OD不超过0.1。

Description

通过压滤和在陶瓷膜上的切向流过滤分离酶与里氏木霉

本发明涉及一种分离在包含里氏木霉丝状霉菌的培养基中含有的纤维素水解酶和半纤维素水解酶的方法。

本发明具体地在由木质纤维素生物质生产糖、生物燃料或生物化学分子的方法的范围内。

这种类型的方法包括采用例如由丝状霉菌里氏木霉生产的酶混合物预处理的生物质的酶水解步骤。本发明涉及这种酶混合物和丝状霉菌里氏木霉的分离。

存在单独地或连续地使用的多种分离技术。

现有技术

在分离酶与霉菌的情况下，申请人的申请WO-2016/16182推荐以下序列：

- 通过滗析进行的第一分离。在一些情况下，可以添加絮凝剂从而提高分离效率，

- 通过离心进行的第二分离，从而降低丸粒率（也称为丸粒含量），

- 微量过滤（切向流过滤(tangential filtration)），从而除去任何痕量微生物，

- 超滤的最终步骤，从而浓缩酶。

在工业方法中连续使用的滗析和离心为根据密度不同并通过对介质施以离心力进行的固/液分离方法。

滗析器为装配螺旋的离心机，其转筒绕横轴旋转。它们主要用于净化具有大丸粒率或具有高悬浮物质含量（大于15%并通常为约30%，并甚至最高至60%）的混合物（两相滗析器）。滗析能够将这个含量降低至约5%。通过以4000 G离心样品测量丸粒率5分钟。其对应于固体所占体积相对于样品总体积的百分比。

采用具有小于15%的丸粒率的溶液进行离心，并能够将这个丸粒率降低至小于2%，或甚至小于1%的值。离心能够净化由滗析产生的浑浊液体。

其在很多领域中使用：水处理、食品加工、生物技术、制药工业等。

根据待分离的物质的尺寸实施通过切向流过滤或超滤进行的分离方法。它们使用膜。

因此，在微量过滤的情况下，颗粒具有0.1 µm至10 µm的尺寸。这个方法用于分离例如微生物，例如丝状霉菌。出于经济原因，其通常为用过的有机膜。

超滤用于分离具有1至100 nm的直径的物质。此类膜能够使小分子（水、盐）通过并阻止大分子量分子（聚合物、蛋白质等）。它们用于浓缩，例如蛋白质或酶。

能够影响分离性能水平的因素基本上是分子尺寸、分子形状、它们的电荷、膜性质和操作条件。

所述膜由它们的物理化学性质表征。一般而言，三种主要类型的膜区分成：

- 有机（天然或合成）膜，

- 矿物（无机或陶瓷）膜，

- 复合膜。

有机膜由纤维素聚合物（例如醋酸纤维素）制成。它们具有低生产成本，但不能用于分离可能水解它们的纤维素。

基于合成聚合物例如尼龙和聚砜的有机膜相比于先前的那些具有很多优点并且最广泛地用于分离酶（蛋白质）。

矿物膜具有非常良好的耐化学品性、机械强度和耐热性，但比有机膜更昂贵（大约贵10倍）。它们用于各种工艺的生物技术中，例如果汁的净化、奶制品中细菌的消除或酒精饮品（果酒和白酒(wine)、啤酒、苹果酒）的净化。它们在水处理中也具有应用。

最后，复合膜由一个聚合物部分沉积在为多微孔的另一部分上而构成。已经开发了后面的膜主要用于反渗透。

在这个领域的现有技术中存在大量信息。

专利US 3 398 055教导由里氏木霉生产的纤维素酶的分离和纯化。在真空下采用旋转过滤器分离霉菌。使用棉花分离酶并采用碱性溶液洗脱。

专利申请US-2014/0295525提出霉菌木霉属的酶的两步分离。这个方法描述两个超滤步骤中酶的浓缩，该酶先前已经经历了固/液分离步骤。在通过超滤进行的第一分离步骤中，膜具有100 000 (Da)至200 000 (Da)的MWCO，即大约0.01µm至0.02 µm截留阈值。渗余物在具有5000至50 000的MWCO的膜上通至第二超滤步骤中并混合包含酶的两个液体。

该专利表明这个方法能够在单一超滤步骤中解决膜污染和纤维素酶聚集的问题，甚至在超滤步骤之前具有在陶瓷过滤器或非织造材料中分离固体颗粒时也如此。

在该专利中，尽管所述酶的尺寸为10 kDa至100 Da，但渗余物中的酶的渗余量是显著的。这个专利因此主要描述酶浓缩步骤的优化。

在浓缩来自霉菌里氏木霉的酶混合物的情况下，在采用具有0.8µm的尺寸，并因此具有为专利申请US-2014/0295525所述的那些的40至80倍的孔的有机膜时能够令人惊讶地注意到这个酶渗余现象的存在。这样非常不利于酶分离产率。

本发明提出一种分离方法，其包括：

- 在压滤机上分离霉菌里氏木霉的步骤，有利地，其必须在生产之后30或24小时中进行，

- 然后，在矿物膜上进行的微量过滤步骤，

- 任选地，然后，在矿物膜或有机膜上进行的浓缩步骤。

注意到在压滤机上分离然后在矿物膜上微量过滤，并然后任选在矿物膜上超滤的序列能够获得在产率和效率方面特别良好的结果。

发明内容

更具体地，本发明提出将来自培养基的酶混合物与霉菌里氏木霉分离的方法，所述培养基获自由霉菌生产酶，在该方法中：

- 从停止生产开始，在小于或等于30小时，优选小于或等于24小时的时间段内在内衬有孔隙尺寸为3-20 µm的织物的压滤机上对所述培养基施以分离，从而获得具有在600nm下小于2.5的经校准的光密度OD的滤液；和

- 在具有0.5至1.4µm的截留阈值的陶瓷膜上对所获得的液相施以切向流微量过滤，从而经校准的OD 600 nm不超过0.1。

有利地，在没有预先冷却的情况下在压滤机上对所述培养基施以分离。优选地，在压滤机上分离之前不对培养基施以滗析和/或离心。

在压滤机上的分离以及微量过滤在20-30℃下，优选在22-27℃下进行。

有利地，以最多10重量%的比例将滤液再循环至为压滤机供料的培养基。

在压滤机上的分离结束时（即压实之后），一般获得5-10重量%滤饼（滤饼的固含量为至少20重量%，一般为20重量%至65重量%或20-45重量%，通常约25-35重量%）和90-95重量%滤液。由压滤机产生的滤液的丸粒率（固体所占体积相对于样品总体积的百分比，通过以4000 G离心样品测量5分钟）小于1.5%。

有利地，在压滤结束时获得的滤液的微量过滤进行最多30小时，优选最多24小时的时间段。

优选地，在没有预先冷却的情况下对所述获自压滤机的滤液施以微量过滤。

优选地，在具有0.8至1.4 µm的截留阈值的陶瓷膜上进行切向流微量过滤。

优选地，对在微量过滤之后获得的液相施以超滤，优选在陶瓷膜上进行，并甚至更优选在具有5至15 kDa的截留阈值的陶瓷膜上进行。

优选地，对在微量过滤之后获得的液相施以超滤最多48小时，优选最多24小时的时间段。

在一个优选的实施方案中，使经分离的酶混合物与已经预处理的木质纤维素生物质优选通过蒸汽爆破接触，从而进行酶水解并获得糖汁，所述糖汁经历乙醇发酵，酶水解和发酵单独地或同时地进行，并且所产生的乙醇通过蒸馏分离。

具体实施方式

生产步骤

通过通气发酵在常规生产线中由里氏木霉生产酶混合物。

用于生产酶混合物的方法开始于繁殖期，出于繁殖丝状霉菌和限制迟滞期和污染风险的目的，一般在具有渐增尺寸的小型反应器中进行。

当判断这个生产为充分的（霉菌浓度大于10 g/l，优选大于15 g/l）时，将培养基转移至大体积的最终反应器中。

酶生产方法包括两个时期：

- 在通气封闭反应器中在至少一种碳基生长基质存在下的所述微生物的生长期a），所述生长期采用10至90 g/l的碳基生长基质浓度进行；

- 酶混合物的生产期b），其中引入至少一种碳基诱导物基质，所述碳基诱导物基质选自由乳糖、纤维二糖、槐糖、在纤维素基生物质酶水解产物的单体糖的乙醇发酵之后获得残余物、和/或源自纤维素基生物质的预处理的水溶性戊糖的粗提取物形成的组，所述生产期采用150至400 g/l的碳基生产基质浓度进行。

根据本发明的生产酶混合物的方法中使用的微生物为属于里氏木霉种的霉菌菌株。

最有效的工业菌株为属于里氏木霉种的菌株，将其通过突变-选择工艺改性以改善酶混合物，例如菌株IFP CL847（法国专利FR-B-2 555 803）。也可以使用通过基因重组技术改善的菌株。这些菌株在与它们的生长和酶生产相容的条件下在搅拌并通气的反应器中培养。

根据本发明的方法的所述生长期a）中使用的所述微生物的所述碳基生长基质有利地选自工业可溶性糖，优选选自葡萄糖、乳糖、木糖、在木质纤维素材料的酶水解产物的单体糖的乙醇发酵之后获得的液体残余物和源自经预处理的木质纤维素基质的单体形式的基于半纤维素的部分的提取物，单独地或作为混合物使用。

取决于其性质，在灭菌之前将所述碳基生长基质引入封闭反应器中，或将其单独灭菌并在后者的灭菌之后引入封闭反应器中。

在所述生长期a）中以通常为20至90 g碳基基质/L反应体积的初始浓度使用所述碳基生长基质。

优选地，所述生长期a）进行30至70小时，优选30至40小时的时间段。

优选地，所述生长期a）在pH 4.8下并在20-30℃，一般而言22-27℃，优选约27℃的温度下进行。

在所述生产期b）中使用的所述碳基诱导物基质有利地以分批补料模式(fed-batch phase mode)采用30至80 mg/g细胞/h的限制流量进料。温度一般而言与步骤a）中的相同。

在酶生产步骤结束时，一般而言获得包含10至45 g/l的固体浓度（对应于干霉菌）的培养基。在离心（4000 G，5分钟）之后测量的丸粒率大于15%并通常约30%，并甚至最高达60%。其对应于固体所占体积相对于样品总体积的百分比。

观察到霉菌保持相当比例的液体。

本发明的目的为分离酶与霉菌，然后任选地将它们浓缩。

固/液分离步骤，其中霉菌与液体分离

液体包含酶和残余盐。

申请人进行的测试已经示出压滤机上的分离然后陶瓷膜上的微量过滤(MF)提供比现有技术方案更好的结果，无论是在产率方面还是在效率方面。

此外，测试一般已经示出，对于浓缩酶，在陶瓷膜上的超滤(UF)基本上比有机膜上的更有效。

根据本发明，对培养基施以在压滤机上的分离，其能够最大化酶回收率。

其在霉菌开始自溶之前进行是非常有利的。这是因为这个自溶能够非常不利于压滤机的分离效率。在里氏木霉的情况下，这个时间段小于或等于30小时，并优选小于或等于28小时，并甚至更优选小于或等于24小时。

这种在压滤机上的分离结束时，获得包含霉菌的滤饼和包含酶的液体。

在陶瓷膜上对所获得的液体施以切向流微量过滤，然后任选地施以超滤，优选通过切向流过滤进行。

这是因为已经能够注意到在有机膜上的微量过滤导致获得显著酶渗余，这对于分离产率不利。这个现象是出乎预料的，因为孔尺寸是产生的最大酶尺寸的最高达100倍。尚不可能为这个现象提供解释。

另一方面，还注意到当使用矿物膜时，这个现象受到限制。因此，酶回收产率处于高水平。

下文详细解释通过压滤机进行的分离、微量过滤和超滤。

在压滤机上的分离：

一旦生产结束，停止通气和pH调节。有利地添加防腐剂，例如苯甲酸钠。

当消耗掉分批补料时期的全部糖时或当消耗的基础速度（其与蛋白质的生产速度成比例）已经减慢（速度低于30%或更多）时停止生产。

在自溶之前的时期内进行在压滤机上的分离。

已经注意到保持温度低于40℃并优选低于30℃是重要的。高于这个温度时，分离效率降低很多。

在压滤机上分离之前没有冷却步骤。这意味着没有寻求冷却；在其中进行生产步骤的设备和压滤设备之间的转移期间温度可能稍微降低；这个降低可能是3℃或更少。因此，分离通常在与步骤a）的生产时期基本上相同的温度下，即17至30℃或20-30℃，一般而言22-27℃，并通常约25℃的温度下进行。这一般为环境温度。

压滤机内衬有织物，并一般没有膜板。织物的孔隙尺寸为3至20 µm，优选3至7 µm并优选5 µm。一般获得5重量%至10重量%滤饼和90重量%至95重量%滤液。

在压滤机上的分离能够以一步或两步进行。

在压滤机上的分离一般而言在两步中进行：在压力P1下过滤的第一步骤和在高于P1的压力P2下压实的第二步骤。一般而言，压力P1为1.2至6 bar，P2为5至10 bar。

当分离在单一步骤中进行时，没有压实，而只有在P1下进行的步骤。

滤饼的干燥度取决于施加的压力。

目的是回收最大量的尽可能清澈的滤液。

为了实现这个目的，推荐将第一滤液部分（一般而言最浑浊的）再循环至供料槽。这个再循环不能超过滤液体积的10%。在良好的分离和可渗透滤饼的情况下，推荐向滤饼添加水从而将其洗涤并回收最大量的蛋白质。

另一方式，其可以单独或连续使用以进行如上所述的再循环，能够使滤饼中的霉菌裂解，这在冷却步骤之后进行。然后，霉菌释放酶，然后回收酶。这个过程记载于申请WO-2016/016182中。

进行分离从而获得具有小于2.5的经校准的OD（光密度）600 nm的液体（或悬浮液）（经校准是指减去等于0.22 µm滤液的吸光度）。采用常规实验室光谱测定法对样品进行这个测量。

丸粒率（4000 g / 5 min）一般低于1.5%。

采用矿物膜的微量过滤

这个步骤必须能够从滤液中除去全部霉菌。其以经校准的OD 600nm不超过0.1（减去等于0.22 µm滤液的吸光度）的方式进行。

优选地，以与通过压滤机进行分离相同的方式，在最多30小时或最多28小时或优选最多24小时的时间段内对滤液施以微量过滤。通常，可以采用压滤机在线进行微量过滤。

关于温度，优选不降低（不寻求冷却）。这样能够保持满意的产品流速。温度因此一般为17至30℃或20至30℃并一般而言22-27℃，通常为25℃。这一般为环境温度。

待使用的膜具有0.5至1.4 µm，优选0.6至1.4 µm并优选0.8至1.4 µm的截留阈值。

可以通过透析过滤（添加水至渗余物，然后通过微量过滤）最大化酶产率。

采用矿物膜或有机膜进行的超滤

这个步骤能够浓缩由霉菌，特别是里氏木霉产生的酶。酶混合物为几种酶的复合混合物(complex mixture)，其尺寸为1×10⁴ g/mol (10 kDa)至10×10⁴ g/mol (100kDa)。

这个超滤步骤一般在20-30℃，并一般在22-27℃，并通常在约25℃的温度下进行。其与微量过滤尽可能紧密地（时间上）进行总是有利的。推荐48小时的最大时间段，并且这个时间段优选小于或等于24小时。

这个步骤能够浓缩有用的蛋白质至150 g/l +/- 10 g/l。待实现的体积浓度因数VCF的值取决于初始蛋白质浓度。

可以在这个步骤结束时将附加计量的防腐剂添加至渗余物中。推荐例如0.1%至0.35%的苯甲酸钠的添加量。

优选使用矿物膜用于超滤。例如使用具有5至15 kDa，优选8-12，通常约10 kDa的截留阈值的管状陶瓷膜。

在一些情况下，可以使用有机膜，但需要谨慎并只能在由供应商推荐的条件下使用。

特别有利地，根据本发明的方法用于在用于由木质纤维素生物质生产糖汁、生物燃料（例如乙醇）或生物化学分子的方法中分离酶。

这些方法包括木质纤维素生物质的预处理步骤（例如蒸汽爆破）；在酶（由里氏木霉分泌）存在下对经预处理的生物质施以酶水解，对载有糖汁的水解产物施以发酵（例如酒精发酵）并分离期望的产物（例如酒精）（例如通过蒸馏）。

本发明所特别良好应用的方法包括通过蒸汽爆破进行的木质纤维素生物质的预处理；在例如由里氏木霉分泌的酶存在下对经预处理的生物质施以酶水解，其中酶与里氏木霉根据本发明的方法分离，对载有糖汁的水解产物施以酒精发酵并通过蒸馏分离乙醇。

可以单独地或同时地进行酶水解和发酵。

应该注意到，证明在生产乙醇同时原位生产酶的工厂的情况下超滤步骤在大部分时间内是不需要的。

实施例

实施例1表明采用有机膜进行的微量过滤获得差的酶渗透率。这个问题在实施例2中采用矿物膜解决。实施例3比较采用常规分离方法或采用专利申请中所述的方法进行的两个序列。实施例4示出大体积规模下分离的完全平衡。

实施例编号1：在有机膜上进行的微量过滤的测试（对比例）

获自生产期的待处理的培养基具有以下组合物：

● 40 g/l蛋白质

● 20 g/l生物质（霉菌里氏木霉）。

在通过压滤机进行分离之后，在各种微量过滤膜上测试滤液。

图1和2示出采用具有0.1至0.8 µm的孔隙尺寸的有机膜进行的实验室测试结果：膜MFG1：0.1 µm的截留阈值（聚砜），MFG2：0.2 µm（聚砜）， MFG8：0.8 µm（聚砜），MFP5：0.5 µm（氟代）。

VCF表示体积浓度因数。

注意到这些膜对酶的低渗透率。

渗透率定义为渗透物（其通过膜）中酶浓度与渗余物（其保留）中的浓度之间的比率。

实施例2：在陶瓷膜上进行的微量过滤测试

同样的滤液与截留阈值为0.14、0.45、0.8和1.4 µm的4个膜一起使用。

所使用的方法是对每个过滤平行地测试4个截留阈值。所使用的工具为中试过滤设备，其能够在同一个外壳中容纳4个不同的膜。其具有一个渗透物出口/膜和单一渗余物环路。因此，能够针对4个膜平行地研究渗透物流速的变化并生产样品。

酶浓度的测试反映差异。

获自压滤机的滤液具有38.2 g/l的酶浓度。最终渗余物定量测定为44.3 g/l。

因此，存在低浓度的渗余物，其表明由一个或多个膜产生的渗余量。4个渗透物的酶浓度如下：

截留阈值(µm)	0.14	0.45	0.8	1.4
					渗透物中的酶浓度(g/l)	17.1	17.0	33.9	38.1

与初始渗余物比较，看出在0.8和1.4 µm下由过滤获得的浓度接近初始溶液的浓度。另一方面，对于药筒，在0.14和0.45 µm下存在显著的酶渗余量。采用具有0.8 µm的截留阈值的矿物膜获得的蛋白质浓度为采用具有同样的截留阈值的有机膜获得的蛋白质浓度（实施例2）的大约4.3倍。

实施例3：

实施例3能够比较采用常规方法或采用专利申请的方法进行的两个序列。

获自生产期的待处理的培养基具有以下组合物：

● 39 g/l蛋白质

● 16.5 g/l生物质（霉菌里氏木霉）。

实施例3a：在有机膜上的滗析器、离心机和MF（微量过滤）和在有机膜上的UF（超滤）的常规序列。

获得以下性能水平：

● 滗析：丸粒率从30%降低至5%，但蛋白质显著损失。产率70%。

● 离心：丸粒率从5%降低至1.5%而没有显著损失。产率95%。

● 在0.8 µm下的有机MF：丸粒率从1.5%降低至约0%。0.3的低渗透率。产率50%。

● 有机UF 10 kDa：200 g/l的酶浓度。产率80%。

这个序列的总产率为27%。通过将来自滗析和离心步骤的丸粒和来自MF步骤的渗余物再循环并对它们施以进一步分离循环（离心、MF、UF），其能够接近50%产率。

根据本发明的实施例3b

在压滤机上的分离，然后在陶瓷膜上的MF和在陶瓷膜上的UF的序列。

获得以下性能水平：

● 在压滤机上的分离：丸粒率从30%降低至1.5%而没有显著损失。产率 95%。

● 陶瓷MF (1.4 µm)：丸粒率从1.5%降低至约0%。0.9的高渗透率。产率90%。

● 陶瓷UF 10 kDa：200 g/l的酶浓度。产率90%。

不进行任何这个序列的再循环的总产率为77%。

鉴于这些结果，注意到在生产乙醇并原位生产酶的工厂的情况下不需要UF步骤。结果，产率为86%。

此外，MF过滤在陶瓷膜上比在有机膜上更有效得多。此外，在陶瓷膜上的产率，无论其通过MF还是UF进行，比采用有机膜的产率高得多。

实施例编号4：采用根据本发明的序列进行的中试测试

这个测试使用在6 m³反应器中产生的培养基。其特征如下：

- 培养基的质量：4260 kg

- 蛋白质浓度：38 g/l

- 生物质浓度：15 g/l。

在压滤机上的分离：

在生产步骤之后立即进行分离，并且没有将产物冷却。温度为27℃。

在这个步骤中，寻求通过在压滤机上的分离消除大部分霉菌。

所使用的工具包括10个板，其总过滤表面积为3 m²。这能够每批次形成10个霉菌滤饼，其为30 mm厚并且在压实之前具有30 L的总体积。所使用的织物为具有5 µm孔隙尺寸的复丝。

该分离在三个步骤中进行：

- 第一步骤由采用5 bar的上游压力的过滤构成，其同时随时间监控过滤速率。

- 在第二步骤期间，停止压滤机的进料，并且通过施加较高的压力(9 bar)压实霉菌滤饼。这个第二步骤压制霉菌并最大化酶回收率。

- 第三步骤由拆卸（回收）滤饼构成，将滤饼称重。

应该注意到已经能够进行滤饼的洗涤从而最小化损失量，或使霉菌裂解，但这在这个实施例的情况下没有实现。

总共需要14次过滤/压实从而处理全部培养基(4260 kg)。

下表示出质量平衡分离。

图3示出随时间变化的过滤量的变化和图4示出随进料压力变化的过滤量的变化。

在第一步（在5 bar下过滤）中，这个批次持续的时间为25分钟。

在前几分钟，过滤流速是高的（500至700 l/m²/h）。霉菌“粘住”织物并充当过滤介质。压力提高并且过滤流速降低。一般而言，当流速与初始流速相比过低（例如，低于10%或20%）时并且根据过滤时间的初始目标决定停止过滤。

注意到在所生产的各个批次之间没有显著差别。这示出过滤产物的能力在操作期间没有变化（其总共延续少于12小时）。

在压实之前每批次的平均质量为263±30 kg。平均过滤速率为210 kg/m²/h。

然后，进行压实(9 bar)，该压实持续平均10分钟并且采用30 kg/m²/h的平均流速能够每批次回收平均15 kg液体。每批次所获得的滤饼的平均质量为15±1.5 kg。

滤饼相对于滤液的重量百分比平均为5.4%，并且其平均SC（固含量）为25重量%，即如果不洗涤滤饼，这个步骤中的蛋白质损失为4.05重量%。

在压滤步骤之后的蛋白质回收产率为95.4%。

通过在矿物陶瓷上的微量过滤进行的分离：

然后，将获自压滤机的滤液分成几个样品，其通过在具有0.8和1.4 µm的孔隙尺寸的矿物膜上的微量过滤处理。测试目标为比较它们对包含酶和霉菌的压滤滤液的性能水平，其中目标体积浓度因数为10。微量过滤然后是透析过滤，其能够最小化蛋白质损失（水添加量对应于5体积渗余物）。

微量过滤工具包括在每个外壳上具有0.33m²的过滤表面积的3个膜。

第一个测试能够选择1.4 µm膜，其在同样的跨膜压下比0.8 µm膜具有更好的过滤性能水平。确实，对于第一个测试，渗透物的流量稳定在100 l/m²/h，对于第二个测试，渗透物的流量稳定在60 l/m²/h，最高达7.5的体积浓度因数(VCF)。两个膜能够净化产物（在铺板在PDA介质上的渗透物上没有霉菌生长）。

图5示出渗余物和渗透物中蛋白质浓度的变化。其示出两个膜对蛋白质的渗透性非常好。膜的渗透率在1.4 µm下更好并且大于0.9。回忆到对于有机膜，其为0.2-0.4，甚至在0.8 µm的孔隙尺寸下也如此。

在矿物膜上进行MF之后的蛋白质回收产率为相对于初始步骤的93.3%。

然后，通过在矿物膜上进行UF浓缩酶，回收产率为92%，即86%的总产率。

Claims

1.一种将来自培养基的酶混合物与霉菌里氏木霉分离的方法，该培养基获自由霉菌生产酶，在该方法中：

-从停止生产开始，在小于或等于30小时的时间段内在内衬有孔隙尺寸为3-20μm的织物的压滤机上对所述培养基施以分离，从而获得具有在600nm下小于2.5的经校准的光密度OD的滤液；和

-在具有0.5至1.4μm的截留阈值的陶瓷膜上对所获得的液相施以切向流微量过滤，从而经校准的OD 600nm不超过0.1。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述时间段小于或等于24小时。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中在没有预先冷却的情况下在压滤机上对所述培养基施以分离。

4.如权利要求1或2所述的方法，其中在压滤机上分离结束时，获得5-10重量％滤饼和90-95重量％的滤液。

5.如权利要求1或2所述的方法，其中获自压滤机的滤液的丸粒率小于1.5％，所述丸粒率是指固体所占体积相对于样品总体积的百分比，其通过以4000G离心样品5分钟测得。

6.如权利要求1或2所述的方法，其中以最多10重量％的比例将滤液再循环至为压滤机供料的培养基中。

7.如权利要求1或2所述的方法，其中在压滤结束时获得的滤液的微量过滤在最多30小时的时间段内进行。

8.如权利要求7所述的方法，其中在压滤结束时获得的滤液的微量过滤在最多24小时的时间段内进行。

9.如权利要求1或2所述的方法，其中在没有预先冷却的情况下对所述获自压滤机的滤液施以微量过滤。

10.如权利要求1或2所述的方法，其中在压滤机上的分离以及微量过滤在20-30℃下进行。

11.如权利要求10所述的方法，其中在压滤机上的分离以及微量过滤在22-27℃下进行。

12.如权利要求1或2所述的方法，其中切向流微量过滤在具有0.8至1.4μm的截留阈值的陶瓷膜上进行。

13.如权利要求1或2所述的方法，其中在压滤机上分离之前不对所述培养基施以滗析和/或离心。

14.如权利要求1或2所述的方法，其中微量过滤在陶瓷膜上进行。

15.如权利要求1或2所述的方法，其中在具有5至15kDa的截留阈值的陶瓷膜上对在微量过滤之后获得的液相施以超滤。

16.如权利要求1或2所述的方法，其中对在微量过滤之后获得的液相施以超滤最多48小时的时间段。

17.如权利要求1或2所述的方法，其中对在微量过滤之后获得的液相施以超滤最多24小时的时间段。

18.如前权利要求1或2所述的方法，其中使经分离的酶混合物与已经预处理的木质纤维素生物质接触，从而进行酶水解并获得糖汁，所述糖汁经历乙醇发酵，所述酶水解和发酵独立地或同时地进行，并且产生的乙醇通过蒸馏分离。

19.如前权利要求18所述的方法，其中使经分离的酶混合物与已经通过蒸汽爆破预处理的木质纤维素生物质接触。