CN111849953B - 一种苏氨酸脱水酶突变体的构建及应用 - Google Patents

一种苏氨酸脱水酶突变体的构建及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种苏氨酸脱水酶突变体的构建及应用,其特征在于,所述的改造是将大肠杆菌来源的苏氨酸脱水酶中的441位脯氨酸替换为亮氨酸。本发明通过结构生物学的方法,预测了该位点的突变,通过将苏氨酸脱水酶进行位点突变,解除了异亮氨酸对苏氨酸脱水酶的反馈抑制。将上述突变的基因连接到表达质粒上,并在宿主菌如大肠杆菌中过量表达,显著提高了异亮氨酸的产量。与同样过量表达野生型苏氨酸脱水酶基因的质粒重组菌株相比,含有本发明苏氨酸脱水酶突变体的大肠杆菌产异亮氨酸能力提高一倍。

Description

一种苏氨酸脱水酶突变体的构建及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种用于L-异亮氨酸(isoleucine)、L-亮氨酸(leucine)及L-缬氨酸(valine)生产关键酶苏氨酸脱水酶突变体的构建及其应用,即通过改造源自肠杆菌科的酶苏氨酸脱水酶,并将其转入肠杆菌科中。使其能够将苏氨酸(葡萄糖)转化为α-酮戊二酸进一步转化为L-异亮氨酸、L-亮氨酸或L-缬氨酸,从而在肠杆菌中实现L-异亮氨酸、L-亮氨酸或L-缬氨酸的大量积累。
背景技术
L-异亮氨酸是人体八种必需氨基酸之一,同时又是三种支链氨基酸之一,是合成人体激素与酶类的原料,因其特殊的结构和功能,在人类生命代谢中占有特别重要的地位。目前,L-异亮氨酸的应用涉及医药品、保健品及精细化工品行业,其中以L-异亮氨酸为原料的产品包含配制营养型复合氨基酸输液制剂和保健品等,例如以L-异亮氨酸为主要原料生产的肝安干糖浆、治肝灵口服液,对治疗各种肝脏疾病具有显著疗效,因此其在食品和医药行业具有广泛的应用及商业价值。国际上氨基酸生产厂家主要有日本味之素、协和发酵、田边制药以及德国Degussa等4家公司,均以发酵法生产。日本在L-异亮氨酸产量、品质和技术水平均居世界领先地位。L-异亮氨酸产酸率为35g/L左右、提取率在70%。日本味之素公司占有全球医药及食品用氨基酸市场60%的市场份额,味之素公司巴西分公司也将于2006年正式生产L-异亮氨酸。近年来,随着国内各生产厂家产量的增加,我国L-异亮氨酸的产量增大,主要有湖北宜药集团公司宜昌三峡药业有限公司、无锡晶石氨基酸公司(年产120吨药用L-异亮氨酸)、南宁安力泰药业有限责任公司(年产量100吨)等。
我国生产L-异亮氨酸存在的主要技术水平问题为:生产规模较小、发酵技术落后、菌株产酸水平低发酵产物的提取技术落后等问题。其中最关键的技术问题为菌株产酸水平低,而菌株产酸低的根本原因为无法解决L-异亮氨酸生产途径中关键酶的反馈抑制问题。苏氨酸脱水酶催化苏氨酸脱氨生成α-酮戊二酸其受到了产物L-异亮氨酸的反馈抑制作用,其是L-异亮氨酸生产途径中的最主要的限速步骤。改造苏氨酸脱水酶以解除L-异亮氨酸对其的反馈抑制作用是解决菌株产酸水平低的关键。
发明内容
本发明的所要解决的问题是,通过计算机辅助设计获得一种不受异亮氨酸别构调控作用的苏氨酸脱水酶的突变基因,该突变基因所编码的突变型酶能够提高L-异亮氨酸产酸菌株的生产能力。本发明还提供编码这一突变基因的核苷酸或其核苷酸序列的片段、类似物或者衍生物。
本发明的苏氨酸脱水酶突变基因,其特征在于,所述的改造是将大肠杆菌来源的苏氨酸脱水酶中的441位点由脯氨酸突变为亮氨酸。
上述的苏氨酸脱水酶突变基因的核苷酸序列苷酸序列为SEQ ID NO:1。
本发明的更进一步要解决的问题是提供编码上述苏氨酸脱水酶突变体的基因,该基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
本发明的更进一步要解决的问题是考虑到密码子的简并性,编码本发明苏氨酸脱水酶突变体的基因序列可以有多种,但优选为埃希氏属的偏好密码子。
本发明的更进一步要解决的问题是本发明还包括有表达苏氨酸脱水酶突变体的重组质粒。
本发明的更进一步要解决的问题是本发明还包括有表达苏氨酸脱水酶突变体的重组质粒转化或转导至宿主细胞及其后代。
本发明的更进一步要解决的问题是本发明还包括有表达苏氨酸脱水酶突变体的重组质粒转化或转导至宿主细胞及其后代,提高宿主细胞异亮氨酸产量的方法。
附图说明
图1是野生型(WT)和突变型(P441L)TD在不同浓度异亮氨酸存在时的相对酶活
具体实施方式
下面结合实例对本发明做进一步说明,在实施例中未注明具体条件的实验方法,通常可按常规条件,如萨姆布鲁克(J.Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件,或按照设备或试剂生产厂商所建议的条件运行。
实施例1、苏氨酸脱水酶突变体的获得
1.苏氨酸脱水酶表达质粒及定点突变的实现
苏氨酸脱水酶在大肠杆菌中由ilvA基因通过PCR由大肠杆菌基因组获得。同样采用PCR的方法扩增质粒pET28a,获得共同的重复序列,采用In Fusion酶进行连接,获得质粒pET28a-ilvA。实验中采用的引物见表1。
基因的定点突变利用Stratagene系列
Figure BDA0002546839690000032
XL-Ⅱ定点突变试剂盒实现,通过引物P441L-F/P441L-R(见表1)对质粒pET28a-ilvA通过PCR引入突变位点P441L,即将ilvA 441位的脯氨酸替换为亮氨酸。获得的质粒经过PCR产物回收,除去PCR体系中的酶及缓冲体系中的盐离子后,采用Dpn1酶切1h,除去甲基化的模板质粒DNA。处理后的质粒进行化学转化,转入感受态细胞E.coli TransT1。正确突变质粒命名为pET28a-ilvA-P441L,携带的TD 441位突变体核苷酸序列为SEQ ID NO:2,翻译的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
表1:引物表
Figure BDA0002546839690000031
实施例2、ilvA突变体的体外效果检测
1、蛋白的表达及纯化
首先从平板上挑BL21(DE3)(pET28a-ilvA)(过量表达ilvA野生型基因),BL21(DE3)(pET28a-ilvA)(过量表达ilvA-P441L突变型基因)的单菌落接于5ml含50μg/ml卡纳青霉素的LB培养基中,37度200rpm培养5小时至OD600为1.0左右。取2ml OD为1.0左右的一级种子液,转接于100ml含100μg/ml卡纳青霉素的新鲜LB培养基中,采用20度培养过夜。收集菌体后,超声波破碎菌体10分钟,超声1秒停3秒,用镍柱对蛋白进行纯化。通过BCA(Bicinchoninic Acid)法进行蛋白定量,用SDS-PAGE的方法确定蛋白纯度。结果表明蛋白纯度均大于90%。
2、体外实验(TD活力测定)
采用纯化后的蛋白测定异亮氨酸对其的别构调控程度。酶活反应体系为苏氨酸10mM,PLP 20mM,磷酸钾缓冲液50mM(pH=7.5),在测定调控效果时异亮氨酸浓度分别为10mM、2.5mM、1mM、0.5mM、0.2mM、0.1mM、0.01mM,以及适量的TD,总反应体系为0.2ml。置于96孔板上检测信号变化。各个数据均进行了3次平行试验及2次重复试验以保证试验结果的可靠性。
酶活检测结果如图1所示,在两者的初始酶活几乎相同的情况下,野生型TD在浓度为0.1mM以上异亮氨酸存在时,其酶活仅为无异亮氨酸的10%左右。而其突变型TD在低浓度异亮氨酸存在时,异亮氨酸由抑制剂变为了激活剂,而当10mM异亮氨酸存在时,其几乎不受异亮氨酸的反馈抑制作用。
实施例3:突变体的应用
1、发酵方法
将上述构建的菌株中在摇瓶中培养,培养基成分如下:
表2:培养基的配方组分
Figure BDA0002546839690000041
Figure BDA0002546839690000051
发酵液通过加入0.5M的HCl中和CaCO3后,测定OD600值。每隔3小时会加入50-100μL氨水调节pH≥7。在37℃和200rpm的条件下振荡培养至OD600约为0.8,加入诱导剂IPTG至终浓1mmol·L-1,继续培养28小时,离心收集菌体。
2、发酵结果:
在相同的发酵条件下,过量表达TD基因的三株菌,生长及耗糖情况基本一致,但在28小时残糖及苏氨酸耗尽时,过量表达突变型的TD可以产3.81g/L的异亮氨酸,而过量表达野生型的TD只能产1.23g/L的酸,突变体比野生型菌株脂肪酸产量提高200%。
表3:发酵28h,异亮氨酸终产量
Figure BDA0002546839690000052
上述结果表明,本发明的突变体的重组质粒转入大肠杆菌后,都具有显著提高异亮氨酸产量的作用,提高异亮氨酸的产量是提高异亮氨酸为前体的其它化合物产量的基础,因而具有很好的应用前景。
序列表
<110> 滨州医学院
<120> 一种苏氨酸脱水酶突变体的构建及应用
<141> 2020-06-19
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 514
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Ala Asp Ser Gln Pro Leu Ser Gly Ala Pro Glu Gly Ala Glu Tyr
1 5 10 15
Leu Arg Ala Val Leu Arg Ala Pro Val Tyr Glu Ala Ala Gln Val Thr
20 25 30
Pro Leu Gln Lys Met Glu Lys Leu Ser Ser Arg Leu Asp Asn Val Ile
35 40 45
Leu Val Lys Arg Glu Asp Arg Gln Pro Val His Ser Phe Lys Leu Arg
50 55 60
Gly Ala Tyr Ala Met Met Ala Gly Leu Thr Glu Glu Gln Lys Ala His
65 70 75 80
Gly Val Ile Thr Ala Ser Ala Gly Asn His Ala Gln Gly Val Ala Phe
85 90 95
Ser Ser Ala Arg Leu Gly Val Lys Ala Leu Ile Val Met Pro Thr Ala
100 105 110
Thr Ala Asp Ile Lys Val Asp Ala Val Arg Gly Phe Gly Gly Glu Val
115 120 125
Leu Leu His Gly Ala Asn Phe Asp Glu Ala Lys Ala Lys Ala Ile Glu
130 135 140
Leu Ser Gln Gln Gln Gly Phe Thr Trp Val Pro Pro Phe Asp His Pro
145 150 155 160
Met Val Ile Ala Gly Gln Gly Thr Leu Ala Leu Glu Leu Leu Gln Gln
165 170 175
Asp Ala His Leu Asp Arg Val Phe Val Pro Val Gly Gly Gly Gly Leu
180 185 190
Ala Ala Gly Val Ala Val Leu Ile Lys Gln Leu Met Pro Gln Ile Lys
195 200 205
Val Ile Ala Val Glu Ala Glu Asp Ser Ala Cys Leu Lys Ala Ala Leu
210 215 220
Asp Ala Gly His Pro Val Asp Leu Pro Arg Val Gly Leu Phe Ala Glu
225 230 235 240
Gly Val Ala Val Lys Arg Ile Gly Asp Glu Thr Phe Arg Leu Cys Gln
245 250 255
Glu Tyr Leu Asp Asp Ile Ile Thr Val Asp Ser Asp Ala Ile Cys Ala
260 265 270
Ala Met Lys Asp Leu Phe Glu Asp Val Arg Ala Val Ala Glu Pro Ser
275 280 285
Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Met Lys Lys Tyr Ile Ala Leu His Asn
290 295 300
Ile Arg Gly Glu Arg Leu Ala His Ile Leu Ser Gly Ala Asn Val Asn
305 310 315 320
Phe His Gly Leu Arg Tyr Val Ser Glu Arg Cys Glu Leu Gly Glu Gln
325 330 335
Arg Glu Ala Leu Leu Ala Val Thr Ile Pro Glu Glu Lys Gly Ser Phe
340 345 350
Leu Lys Phe Cys Gln Leu Leu Gly Gly Arg Ser Val Thr Glu Phe Asn
355 360 365
Tyr Arg Phe Ala Asp Ala Lys Asn Ala Cys Ile Phe Val Gly Val Arg
370 375 380
Leu Ser Arg Gly Leu Glu Glu Arg Lys Glu Ile Leu Gln Met Leu Asn
385 390 395 400
Asp Gly Gly Tyr Ser Val Val Asp Leu Ser Asp Asp Glu Met Ala Lys
405 410 415
Leu His Val Arg Tyr Met Val Gly Gly Arg Pro Ser His Pro Leu Gln
420 425 430
Glu Arg Leu Tyr Ser Phe Glu Phe Leu Glu Ser Pro Gly Ala Leu Leu
435 440 445
Arg Phe Leu Asn Thr Leu Gly Thr Tyr Trp Asn Ile Ser Leu Phe His
450 455 460
Tyr Arg Ser His Gly Thr Asp Tyr Gly Arg Val Leu Ala Ala Phe Glu
465 470 475 480
Leu Gly Asp His Glu Pro Asp Phe Glu Thr Arg Leu Asn Glu Leu Gly
485 490 495
Tyr Asp Cys His Asp Glu Thr Asn Asn Pro Ala Phe Arg Phe Phe Leu
500 505 510
Ala Gly
<210> 2
<211> 1545
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggctgact cgcaacccct gtccggtgct ccggaaggtg ccgaatattt aagagcagtg 60
ctgcgcgcgc cggtttacga ggcggcgcag gttacgccgc tacaaaaaat ggaaaaactg 120
tcgtcgcgtc ttgataacgt cattctggtg aagcgcgaag atcgccagcc agtgcacagc 180
tttaagctgc gcggcgcata cgccatgatg gcgggcctga cggaagaaca gaaagcgcac 240
ggcgtgatca ctgcttctgc gggtaaccac gcgcagggcg tcgcgttttc ttctgcgcgg 300
ttaggcgtga aggccctgat cgttatgcca accgccaccg ccgacatcaa agtcgacgcg 360
gtgcgcggct tcggcggcga agtgctgctc cacggcgcga actttgatga agcgaaagcc 420
aaagcgatcg aactgtcaca gcagcagggg ttcacctggg tgccgccgtt cgaccatccg 480
atggtgattg ccgggcaagg cacgctggcg ctggaactgc tccagcagga cgcccatctc 540
gaccgcgtat ttgtgccagt cggcggcggc ggtctggctg ctggcgtggc ggtgctgatc 600
aaacaactga tgccgcaaat caaagtgatc gccgtagaag cggaagactc cgcctgcctg 660
aaagcagcgc tggatgcggg tcatccggtt gatctgccgc gcgtagggct atttgctgaa 720
ggcgtagcgg taaaacgcat cggtgacgaa accttccgtt tatgccagga gtatctcgac 780
gacatcatca ccgtcgatag cgatgcgatc tgtgcggcga tgaaggattt attcgaagat 840
gtgcgcgcgg tggcggaacc ctctggcgcg ctggcgctgg cgggaatgaa aaaatatatc 900
gccctgcaca acattcgcgg cgaacggctg gcgcatattc tttccggtgc caacgtgaac 960
ttccacggcc tgcgctacgt ctcagaacgc tgcgaactgg gcgaacagcg tgaagcgttg 1020
ttggcggtga ccattccgga agaaaaaggc agcttcctca aattctgcca actgcttggc 1080
gggcgttcgg tcaccgagtt caactaccgt tttgccgatg ccaaaaacgc ctgcatcttt 1140
gtcggtgtgc gcctgagccg cggcctcgaa gagcgcaaag aaattttgca gatgctcaac 1200
gacggcggct acagcgtggt tgatctctcc gacgacgaaa tggcgaagct acacgtgcgc 1260
tatatggtcg gcggacgtcc atcgcatccg ttgcaggaac gcctctacag cttcgaattc 1320
ctggaatcac cgggcgcgct gctgcgcttc ctcaacacgc tgggtacgta ctggaacatt 1380
tctttgttcc actatcgcag ccatggcacc gactacgggc gcgtactggc ggcgttcgaa 1440
cttggcgacc atgaaccgga tttcgaaacc cggctgaatg agctgggcta cgattgccac 1500
gacgaaacca ataacccggc gttcaggttc tttttggcgg gttag 1545
<210> 3
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 3
tgagatccgg ctgctaacaa ag 22
<210> 4
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agtcatgcta gccatatggc tgc 23
<210> 5
<211> 33
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atggctagca tgactatggc tgactcgcaa ccc 33
<210> 7
<211> 35
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agcagccgga tctcactaac ccgccaaaaa gaacc 35
<210> 6
<211> 30
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgcgcccggt gattcctgga attcgaagct 30
<210> 8
<211> 30
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
caggaatcac cgggcgcgct gctgcgcttc 30

Claims (6)

1.一种苏氨酸脱水酶突变体,是对苏氨酸脱水酶进行遗传改造获得的,其特征在于,所述的改造是将大肠杆菌来源的苏氨酸脱水酶中的441位点由脯氨酸突变为亮氨酸;所述突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
2.一种基因,所述的基因用于编码权利要求1所述的苏氨酸脱水酶突变体。
3.如权利要求2所述的基因,其核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
4.一种重组质粒,其特征在于所述的重组质粒用于表达权利要求1所述的苏氨酸脱水酶突变体。
5.一种提高异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸产量的方法,是在大肠杆菌中表达权利要求1所述的苏氨酸脱水酶突变体。
6.如权利要求5所述的方法,其特征在于是将权利要求4所述的重组质粒转入大肠杆菌中。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10132947A1 (de) * 2000-09-12 2002-03-21 Degussa Für das rodA-Gen kodierte Nukleotidsequenzen
KR20180134695A (ko) * 2017-06-09 2018-12-19 대상 주식회사 L-로이신 생산능이 개선된 변이 균주 및 이를 이용한 l-로이신의 제조 방법
CN109554324A (zh) * 2018-12-14 2019-04-02 江南大学 一株产l-异亮氨酸的黄色短杆菌重组菌及其构建方法
CN110305829A (zh) * 2019-06-25 2019-10-08 天津科技大学 一种生产l-异亮氨酸的基因工程菌及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10132947A1 (de) * 2000-09-12 2002-03-21 Degussa Für das rodA-Gen kodierte Nukleotidsequenzen
KR20180134695A (ko) * 2017-06-09 2018-12-19 대상 주식회사 L-로이신 생산능이 개선된 변이 균주 및 이를 이용한 l-로이신의 제조 방법
CN109554324A (zh) * 2018-12-14 2019-04-02 江南大学 一株产l-异亮氨酸的黄色短杆菌重组菌及其构建方法
CN110305829A (zh) * 2019-06-25 2019-10-08 天津科技大学 一种生产l-异亮氨酸的基因工程菌及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A mutation affecting the valine sensitivity of the acetohydroxyacid synthase III isoenzyme in E. coli K-12.;Grimaldi, G;《Biochemical and biophysical research communications》;19810831;第101卷(第4期);第1233-1240页 *

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