CN116769616A - 一种突变体文库及利用其筛选黑曲霉中高表达或低表达位点的方法和应用 - Google Patents

一种突变体文库及利用其筛选黑曲霉中高表达或低表达位点的方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于筛选黑曲霉中表达位点的突变体文库，所述突变体文库是通过在出发菌株黑曲霉S1691中随机插入葡萄糖氧化酶基因表达盒PpptA‑godA‑TtrpC构建获得的；其中，所述出发菌株黑曲霉S1691是在菌株S549的基础上依次敲除了葡萄糖氧化酶基因god1，god2，god3，god4获得的。本发明将通过构建突变文库，挖掘和筛选黑曲霉中显著影响基因表达的基因组整合位点，建立基因表达与插入位点的映射关系，为从基因组尺度上揭示黑曲霉位置效应的分布规律和产生机理奠定基础，同时为利用合成生物学技术优化黑曲霉底盘细胞提供分子工具。

Description

一种突变体文库及利用其筛选黑曲霉中高表达或低表达位点 的方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其是一种突变体文库及利用其筛选黑曲霉中高表达或低表达位点的方法和应用。
背景技术
黑曲霉是一种重要工业微生物，可生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶等超过30种酶制剂，加之其出色的蛋白质分泌能力，黑曲霉也被开发为强大的蛋白表达宿主。另外，作为出色的丝状真菌底盘，经过代谢网络改造，黑曲霉也被用于多种复杂化合物的发酵生产。在代谢网络的改造中，基因元件和功能模块在黑曲霉中多以基因组整合的形式发挥作用。影响基因表达效率的因素包括启动子强度、基因拷贝数、基因整合位点等。目前已在多种模式生物，如大肠杆菌、酿酒酵母、拟南芥、人类细胞中发现存在基因表达的位置效应，插入基因本身可能会激活或抑制某些基因的表达水平或活性，改变代谢网络平衡，影响菌株的生长代谢。然而在黑曲霉中，关于基因组基因整合位点与基因表达元件表达水平之间的关系的相关信息匮乏，缺乏系统地挖掘鉴定。
通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术上存在的问题，提供一种突变体文库及利用其筛选黑曲霉中高表达或低表达位点的方法和应用。
本发明解决技术问题所采用的技术方案是：
一种用于筛选黑曲霉中表达位点的突变体文库，所述突变体文库是通过在出发菌株黑曲霉S1691中随机插入葡萄糖氧化酶基因表达盒PpptA-godA-TtrpC构建获得的；
其中，所述出发菌株黑曲霉S1691是在菌株S549的基础上依次敲除了葡萄糖氧化酶基因god1，god2，god3，god4获得的。
上述S549菌株是已公开文献(DOI：10.27359/d.cnki.gtqgu.2020.000424)中所用菌株。
进一步地，所述葡萄糖氧化酶基因利用NCBI对黑曲霉ATCC1015的葡萄糖氧化酶编码基因进行检索，god1序列在NCBI-locus_tag是ANI_1_1992014；god2序列在NCBI-loc us_tag是ANI_1_1678104；god3序列在NCBI-locus_tag是ANI_1_1398064；god4序列在NCBI-locus_tag是ANI_1_748094；
或者，所述葡萄糖氧化酶基因表达盒PpptA-godA-TtrpC中基因godA序列在GenBank是AAA32695.1；
或者，所述葡萄糖氧化酶基因godA来源于黑曲霉ATCC 1015的cDNA；
或者，所述葡萄糖氧化酶基因表达盒PpptA-godA-TtrpC的构建步骤如下：
构建葡萄糖氧化酶基因表达盒PpptA-godA-TtrpC过表达菌株：以S834菌株cDNA为模板，gox-F、gox-R为引物进行PCR扩增godA基因，以S834菌株基因组为模板，Ttrpc-F、Ttrpc-R为引物进行PCR扩增TtrpC终止子序列片段，其中godA核苷酸序列为SEQ IDNO.1，TtrpC核苷酸序列为SEQ ID NO.3；将godA基因及Ttrpc终止子序列片段与经BamH I单酶切线性化后的出发载体pLH331进行连接，经双酶切验证获得质粒pLH1360；以S469菌株基因组为模板，pptA-F、pptA-R为引物进行PCR扩增，pptA基因序列起始密码子上游1000bp作为PpptA启动子序列片段，其中PpptA核苷酸序列为SEQ ID NO.4；将PpptA启动子序列片段与经Xho I单酶切线性化后的载体pLH1360进行连接，经双酶切验证获得质粒pLH1424；将含有质粒pLH1424的农杆菌转化至黑曲霉宿主菌株，经转化子筛选和潮霉素抗性基因重组获得随机插入葡萄糖氧化酶基因表达盒PpptA-godA-TtrpC菌株；
其中，gox-F的核苷酸序列为SEQ ID NO.5，gox-R的核苷酸序列为SEQ ID NO.6，Ttrpc-F的核苷酸序列为SEQ ID NO.7，Ttrpc-R的核苷酸序列为SEQ ID NO.8，pptA-F的核苷酸序列为SEQ ID NO.9，pptA-R的核苷酸序列为SEQ ID NO.10。
如上所述的突变体文库的构建方法，包括如下步骤：
(1)农杆菌介导转化法：
将含有质粒的农杆菌与黑曲霉宿主菌株S1691在IM平板共培养，然后将共培养物转接于含有200μM头孢噻肟，100μg/mL氨苄青霉素，100μg/mL链霉素，250μg/mL潮霉素B的CM平板中，28℃培养直至形成单克隆；挑取单克隆转接于PDA，PDA+Hyg的固体培养基上，在两种培养基上均生长的转化子，即为潮霉素抗性的godA基因过表达菌株；
(2)定性筛选：采用邻联茴香胺显色法，将获得的黑曲霉转化子点接于平板显色培养基，28℃培养2d，将配制好的邻联茴香胺显色液平铺在平板显色培养基上，观察至红色物质及透明圈出现，进行红色圈深浅定性比对，通过红色圈深浅来筛选突变体文库，比对照菌S2350(amyA位点)显色深的为高表达位点，比对照菌S2350(amyA位点)显色浅的为低表达位点。
进一步地，所述平板显色培养基的成分为：0％～8％葡萄糖，0％～0.5％酵母浸出物，0％～0.02％尿素，0％～0.07％KH2PO4，0％～0.02％MgSO4·7H2O，0％～0.1％玉米浆，调节pH＝7，0％～1.3％CaCO3，1.8％琼脂；其中，所有组分的取值均不为0；
所述邻联茴香胺显色液的成分为：溶液Ⅰ：每0.1g邻联茴香胺溶于10ml甲醇中；溶液Ⅱ：质量分数为18％的葡萄糖水溶液；溶液Ⅲ：90U/ml辣根过氧化酶溶液；
制备方法为：将每10ml含质量分数为1％的琼脂糖的去离子水加热溶化，待冷却到60℃以下，立即加入2ml溶液Ⅱ、200μl溶液Ⅰ、400μl溶液Ⅲ，混匀，得到邻联茴香胺显色液。
一种利用如上所述的突变体文库筛选黑曲霉中高表达或低表达位点的方法，所述方法将葡萄糖氧化酶基因表达盒PpptA-godA-TtrpC整合到黑曲霉基因组中，构建随机插入突变文库，以葡萄糖氧化酶为报告基因，通过邻联茴香胺显色法筛选出突变体文库，再利用PCR扩增技术确定出相应的高表达位点或低表达位点；
其中，以amyA即ASPNIDRAFT_47911位点表达水平的70％及以上为高表达；以amyA即ASPNIDRAFT_47911位点表达水平的70％及以下为低表达。
进一步地，所述方法选取弱启动子PpptA、葡萄糖氧化酶基因godA和色氨酸合成酶C基因的终止子序列TtrpC组成的表达盒PpptA-godA-TtrpC，利用农杆菌介导的遗传转化方法将表达盒随机整合到黑曲霉细胞基因组中；利用邻联茴香胺显色法来功能性验证各菌株的显色情况，利用HPLC定量分析各菌株的葡萄糖酸产量，从而来表征在基因组中不同位置上基因表达强度的差异，即筛选出高表达或低表达位点；
其中，所述弱启动子PpptA的核苷酸序列为SEQ.ID NO.4，葡萄糖氧化酶基因godA的核苷酸序列为SEQ.ID NO.1，色氨酸合成酶C基因的终止子序列TtrpC的核苷酸序列为SEQ.ID NO.3。
进一步地，确定出相应的高表达或低表达位点的具体方法为：
应用上述突变体文库菌株，收获其孢子，以2×106个/mL接种于黑曲霉液体培养基中，28℃，200rpm条件下培养24h收获菌体；滤布过滤收获菌体，蒸馏水冲洗菌体2-3次，然后用液氮研磨菌体，提取其基因组，通过PCR扩增技术找出整合位点，在JGI上检索其在基因组的位置。
优选的，上述控制基因转录的启动子为黑曲霉NpgA蛋白启动子PpptA；
进一步地，所述葡萄糖氧化酶基因表达盒PpptA-godA-TtrpC的构建步骤如下：
构建葡萄糖氧化酶基因表达盒PpptA-godA-TtrpC过表达菌株：以S834菌株cDNA为模板，gox-F、gox-R为引物进行PCR扩增godA基因，以S834菌株基因组为模板，Ttrpc-F、Ttrpc-R为引物进行PCR扩增TtrpC终止子序列片段，其中godA核苷酸序列为SEQ IDNO.1，TtrpC核苷酸序列为SEQ ID NO.3；将godA基因及Ttrpc终止子序列片段与经BamH I单酶切线性化后的出发载体pLH331进行连接，经双酶切验证获得质粒pLH1360；以S469菌株基因组为模板，pptA-F、pptA-R为引物进行PCR扩增，pptA基因序列起始密码子上游1000bp作为PpptA启动子序列片段，其中PpptA核苷酸序列为SEQ ID NO.4；将PpptA启动子序列片段与经Xho I单酶切线性化后的载体pLH1360进行连接，经双酶切验证获得质粒pLH1424；将含有质粒pLH1424的农杆菌转化至黑曲霉宿主菌株，经转化子筛选和潮霉素抗性基因重组获得随机插入葡萄糖氧化酶基因表达盒PpptA-godA-TtrpC菌株；
其中，gox-F的核苷酸序列为SEQ ID NO.5，gox-R的核苷酸序列为SEQ ID NO.6，Ttrpc-F的核苷酸序列为SEQ ID NO.7，Ttrpc-R的核苷酸序列为SEQ ID NO.8，pptA-F的核苷酸序列为SEQ ID NO.9，pptA-R的核苷酸序列为SEQ ID NO.10；
或者，邻联茴香胺显色法定性筛选突变体文库的方法，步骤如下：
(1)将上述突变体文库菌株接种于平板显色培养基上，28℃培养箱中培养48h；
(2)将配制好的邻联茴香胺显色液平铺在平板显色培养基上，每隔2h记录一下显色情况，观察至红色物质及透明圈出现，进行红色圈深浅定性比对，通过红色圈深浅来筛选突变体文库，比对照菌S2350(amyA位点)显色深的为高表达位点，比对照菌S2350(amyA位点)显色浅的为低表达位点；
其中，所述平板显色培养基的成分为：0％～8％葡萄糖，0％～0.5％酵母浸出物，0％～0.02％尿素，0％～0.07％KH2PO4，0％～0.02％MgSO4·7H2O，0％～0.1％玉米浆，调节pH＝7，0％～1.3％CaCO3，1.8％琼脂；其中，所有组分的取值均不为0；
所述邻联茴香胺显色液的成分为：溶液Ⅰ：每0.1g邻联茴香胺溶于10ml甲醇中；溶液Ⅱ：质量分数为18％的葡萄糖水溶液；溶液Ⅲ：90U/ml辣根过氧化酶溶液；
制备方法为：将每10ml含质量分数为1％的琼脂糖的去离子水加热溶化，待冷却到60℃以下，立即加入2ml溶液Ⅱ、200μl溶液Ⅰ、400μl溶液Ⅲ，混匀，得到邻联茴香胺显色液。
进一步地，所述黑曲霉中高表达位点位点包括：117#：Aspni7|chr_501:839960-840058(GENE ID:ANI_1_286154)、20#：Aspni7|chr_402:1790024-1790232(GENE ID:ANI_1_974024)、75#：Aspni7|chr_603:213359-213546(GENE ID:ANI_1_1322184)、9#：Aspni7|chr_701:446894-447217(GENE ID:ANI_1_234094)和28#：
Aspni7|chr_402:1114661-1114936(GENE ID:ANI_1_596024)，低表达位点包括：2#：Aspni7|chr_503:350667-350745(GENE ID:ANI_1_1080144)、39#：
Aspni7|chr_304:1375731-1375776(GENE ID:ANI_1_782134)和7#：
Aspni7|chr_301:525561-525661(GENE ID:ANI_1_1566104)；
其中，以amyA即ASPNIDRAFT_47911位点表达水平的70％及以上为高表达；以amyA即ASPNIDRAFT_47911位点表达水平的70％及以下为低表达。
如上所述的突变体文库在黑曲霉中高表达或低表达位点筛选方面中的应用。
本发明取得的有益效果是：
1、本发明将通过构建突变文库，挖掘和筛选黑曲霉中显著影响基因表达的基因组整合位点，建立基因表达与插入位点的映射关系，为从基因组尺度上揭示黑曲霉位置效应的分布规律和产生机理奠定基础，同时为利用合成生物学技术优化黑曲霉底盘细胞提供分子工具。
2、本发明利用带有报告基因的表达框载体随机整合产生了突变体文库，再结合位点筛选方法将其中报告基因高表达和低表达细胞系筛选出来。筛选出的高/低表达位点，可为后续定点整合功能元件/模块提供工具。
3、本发明所使用的位点筛选方法原理简单易操作，表征结果清晰可见。
4、本发明从全基因组尺度上研究黑曲霉的位点效应以及基因高表达(以amyA(ASPNIDRAFT_47911)位点水平的70％及以上为高表达)和低表达(以amyA(ASPNIDRAFT_47911)表达水平的70％及以下为低表达)的位点，筛选获得黑曲霉的高表达位点如Aspni7|chr_501:839960-840058(GENE ID:ANI_1_286154)、Aspni7|chr_402:1790024-1790232(GENE ID:ANI_1_974024)、Aspni7|chr_603:213359-213546(GENE ID:ANI_1_1322184)、Aspni7|chr_701:446894-447217(GENE ID:ANI_1_234094)、Aspni7|chr_402:1114661-1114936(GENE ID:ANI_1_596024)，和黑曲霉的低表达位点如Apni7|chr_503:350667-350745(GENE ID:ANI_1_1080144)、Aspni7|chr_301:525561-525661(GENE ID:ANI_1_1566104)、Aspni7|chr_304:1375731-1375776(GENE ID:ANI_1_782134)，从而为利用黑曲霉表达外源基因提供理论依据和指导。
5、本发明的目的是从全基因组尺度上研究黑曲霉的位置效应，挖掘鉴定黑曲霉中基因高表达和低表达的位点，从而为利用黑曲霉表达内/外源基因提供理论依据和工具。
6、本发明涉及黑曲霉中位置效应的评估，以及基因高表达或低表达位点的挖掘鉴定，涉及一系列在黑曲霉中基因高表达或低表达的位点以及实现表达位点定点整合基因表达的载体如pLH1424和pLH1445。
7、本发明从基因组的尺度上研究黑曲霉的位点效应，以及基因高表达或低表达的筛选，建立基因表达与插入位点的对应关系，筛选获得黑曲霉的高表达位点如Aspni7|chr_501:839960-840058(GENE ID:ANI_1_286154)、Aspni7|chr_402:1790024-1790232(GENEID:ANI_1_974024)、Aspni7|chr_603:213359-213546(GENE ID:ANI_1_1322184)、Aspni7|chr_701:446894-447217(GENE ID:ANI_1_234094)、Aspni7|chr_402:1114661-1114936(GENE ID:ANI_1_596024)，和黑曲霉的低表达位点如Apni7|chr_503:350667-350745(GENE ID:ANI_1_1080144)、Aspni7|chr_301:525561-525661(GENE ID:ANI_1_1566104)、Aspni7|chr_304:1375731-1375776(GENE ID:ANI_1_782134)，为以黑曲霉细胞为底盘细胞表达外源代谢产物提供了理性设计的依据。
附图说明
图1为本发明中构建的godA表达载体质粒pLH1424图谱；
图2为本发明中对godA基因表达质粒pLH1424双酶切验证图(EcoR V/Bgl II，7657bp/4998bp)，其中M为DNAMarker，1-2为EcoRV/Bgl II双酶切验证质粒；
图3为本发明中构建的godA中间载体质粒pLH1360图谱；
图4为本发明中对godA中间载体质粒pLH1360双酶切验证图(EcoR V/Bgl II，7657bp/3992bp)，其中M为DNAMarker，1-2为EcoRV/Bgl II双酶切验证质粒；
图5为本发明中构建的godA定点表达载体质粒pLH1445图谱；
图6为本发明中对godA基因定点表达质粒pLH1445双酶切验证图(HindIII/BglII，7682bp/5281bp/3173bp)，其中M为DNAMarker，1-2为HindIII/Bgl II双酶切验证质粒；
图7为本发明中S1691和godA/OE突变体文库菌株的12h邻联茴香胺显色图；其中，S1691为出发菌，S2350为定点表达(amyA位点)godA对照菌株，S2144为回复突变对照菌株，2#-117#为获得的过表达godA随机插入突变体文库菌株；
图8为本发明中在黑曲霉基因组中寻找插入位点原理图；
图9为本发明中定量分析表达位点菌株的葡萄糖酸产量图；其中，S1691为出发菌，S2350为定点表达(amyA位点)godA对照菌株，S2144为回复突变对照菌株，2#-117#为获得的过表达godA随机插入突变体文库菌株；
图10为本发明中葡萄糖氧化酶基因godA定点表达黑曲霉菌株的基因组验证图；其中M：GeneRuler 1kb DNALadder；N：阴性对照(水)；P：阳性对照(S1691基因组)；1-8为获得的转化子；
图11为本发明中突变体文库菌株PCR结果图；其中M：GeneRuler 5000bp DNALadder；2#-117#为获得的突变体文库菌株。
具体实施方式
为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例所表示的范围。
本发明中所使用的的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所使用的各物质质量均为常规使用质量。
一种用于筛选黑曲霉中表达位点的突变体文库，所述突变体文库是通过在出发菌株黑曲霉S1691中随机插入葡萄糖氧化酶基因表达盒PpptA-godA-TtrpC构建获得的；
其中，所述出发菌株黑曲霉S1691是在菌株S549的基础上依次敲除了葡萄糖氧化酶基因god1，god2，god3，god4获得的。
上述S549菌株是已公开文献(DOI：10.27359/d.cnki.gtqgu.2020.000424)中所用菌株。
较优地，所述葡萄糖氧化酶基因利用NCBI对黑曲霉ATCC1015的葡萄糖氧化酶编码基因进行检索，god1序列在NCBI-locus_tag是ANI_1_1992014；god2序列在NCBI-locus_tag是ANI_1_1678104；god3序列在NCBI-locus_tag是ANI_1_1398064；god4序列在NC BI-locus_tag是ANI_1_748094；
或者，所述葡萄糖氧化酶基因表达盒PpptA-godA-TtrpC中基因godA序列在GenBank是AAA32695.1；
或者，所述葡萄糖氧化酶基因godA来源于黑曲霉ATCC 1015的cDNA；
或者，所述葡萄糖氧化酶基因表达盒PpptA-godA-TtrpC的构建步骤如下：
构建葡萄糖氧化酶基因表达盒PpptA-godA-TtrpC过表达菌株：以S834菌株cDNA为模板，gox-F、gox-R为引物进行PCR扩增godA基因，以S834菌株基因组为模板，Ttrpc-F、Ttrpc-R为引物进行PCR扩增TtrpC终止子序列片段，其中godA核苷酸序列为SEQ IDNO.1，TtrpC核苷酸序列为SEQ ID NO.3；将godA基因及Ttrpc终止子序列片段与经BamH I单酶切线性化后的出发载体pLH331进行连接，经双酶切验证获得质粒pLH1360；以S469菌株基因组为模板，pptA-F、pptA-R为引物进行PCR扩增，pptA基因序列起始密码子上游1000bp作为PpptA启动子序列片段，其中PpptA核苷酸序列为SEQ ID NO.4；将PpptA启动子序列片段与经Xho I单酶切线性化后的载体pLH1360进行连接，经双酶切验证获得质粒pLH1424；将含有质粒pLH1424的农杆菌转化至黑曲霉宿主菌株，经转化子筛选和潮霉素抗性基因重组获得随机插入葡萄糖氧化酶基因表达盒PpptA-godA-TtrpC菌株；
其中，gox-F的核苷酸序列为SEQ ID NO.5，gox-R的核苷酸序列为SEQ ID NO.6，Ttrpc-F的核苷酸序列为SEQ ID NO.7，Ttrpc-R的核苷酸序列为SEQ ID NO.8，pptA-F的核苷酸序列为SEQ ID NO.9，pptA-R的核苷酸序列为SEQ ID NO.10。
如上所述的突变体文库的构建方法，包括如下步骤：
(1)农杆菌介导转化法：
将含有质粒的农杆菌与黑曲霉宿主菌株S1691在IM平板共培养，然后将共培养物转接于含有200μM头孢噻肟，100μg/mL氨苄青霉素，100μg/mL链霉素，250μg/mL潮霉素B的CM平板中，28℃培养直至形成单克隆；挑取单克隆转接于PDA，PDA+Hyg的固体培养基上，在两种培养基上均生长的转化子，即为潮霉素抗性的godA基因过表达菌株；
(2)定性筛选：采用邻联茴香胺显色法，将获得的黑曲霉转化子点接于平板显色培养基，28℃培养2d，将配制好的邻联茴香胺显色液平铺在平板显色培养基上，观察至红色物质及透明圈出现，进行红色圈深浅定性比对，通过红色圈深浅来筛选突变体文库，比对照菌S2350(amyA位点)显色深的为高表达位点，比对照菌S2350(amyA位点)显色浅的为低表达位点。
较优地，所述平板显色培养基的成分为：0％～8％葡萄糖，0％～0.5％酵母浸出物，0％～0.02％尿素，0％～0.07％KH2PO4，0％～0.02％MgSO4·7H2O，0％～0.1％玉米浆，调节pH＝7，0％～1.3％CaCO3，1.8％琼脂；其中，所有组分的取值均不为0；
所述邻联茴香胺显色液的成分为：溶液Ⅰ：每0.1g邻联茴香胺溶于10ml甲醇中；溶液Ⅱ：质量分数为18％的葡萄糖水溶液；溶液Ⅲ：90U/ml辣根过氧化酶溶液；
制备方法为：将每10ml含质量分数为1％的琼脂糖的去离子水加热溶化，待冷却到60℃以下，立即加入2ml溶液Ⅱ、200μl溶液Ⅰ、400μl溶液Ⅲ，混匀，得到邻联茴香胺显色液。
一种利用如上所述的突变体文库筛选黑曲霉中高表达或低表达位点的方法，所述方法将葡萄糖氧化酶基因表达盒PpptA-godA-TtrpC整合到黑曲霉基因组中，构建随机插入突变文库，以葡萄糖氧化酶为报告基因，通过邻联茴香胺显色法筛选出突变体文库，再利用PCR扩增技术确定出相应的高表达位点或低表达位点；
其中，以amyA即ASPNIDRAFT_47911位点表达水平的70％及以上为高表达；以amyA即ASPNIDRAFT_47911位点表达水平的70％及以下为低表达。
较优地，所述方法选取弱启动子PpptA、葡萄糖氧化酶基因godA和色氨酸合成酶C基因的终止子序列TtrpC组成的表达盒PpptA-godA-TtrpC，利用农杆菌介导的遗传转化方法将表达盒随机整合到黑曲霉细胞基因组中；利用邻联茴香胺显色法来功能性验证各菌株的显色情况，利用HPLC定量分析各菌株的葡萄糖酸产量，从而来表征在基因组中不同位置上基因表达强度的差异，即筛选出高表达或低表达位点；
其中，所述弱启动子PpptA的核苷酸序列为SEQ.ID NO.4，葡萄糖氧化酶基因godA的核苷酸序列为SEQ.ID NO.1，色氨酸合成酶C基因的终止子序列TtrpC的核苷酸序列为SEQ.ID NO.3。
较优地，确定出相应的高表达或低表达位点的具体方法为：
应用上述突变体文库菌株，收获其孢子，以2×106个/mL接种于黑曲霉液体培养基中，28℃，200rpm条件下培养24h收获菌体；滤布过滤收获菌体，蒸馏水冲洗菌体2-3次，然后用液氮研磨菌体，提取其基因组，通过PCR扩增技术找出整合位点，在JGI上检索其在基因组的位置。
优选的，上述控制基因转录的启动子为黑曲霉NpgA蛋白启动子PpptA；
较优地，所述葡萄糖氧化酶基因表达盒PpptA-godA-TtrpC的构建步骤如下：
构建葡萄糖氧化酶基因表达盒PpptA-godA-TtrpC过表达菌株：以S834菌株cDNA为模板，gox-F、gox-R为引物进行PCR扩增godA基因，以S834菌株基因组为模板，Ttrpc-F、Ttrpc-R为引物进行PCR扩增TtrpC终止子序列片段，其中godA核苷酸序列为SEQ IDNO.1，TtrpC核苷酸序列为SEQ ID NO.3；将godA基因及Ttrpc终止子序列片段与经BamH I单酶切线性化后的出发载体pLH331进行连接，经双酶切验证获得质粒pLH1360；以S469菌株基因组为模板，pptA-F、pptA-R为引物进行PCR扩增，pptA基因序列起始密码子上游1000bp作为PpptA启动子序列片段，其中PpptA核苷酸序列为SEQ ID NO.4；将PpptA启动子序列片段与经Xho I单酶切线性化后的载体pLH1360进行连接，经双酶切验证获得质粒pLH1424；将含有质粒pLH1424的农杆菌转化至黑曲霉宿主菌株，经转化子筛选和潮霉素抗性基因重组获得随机插入葡萄糖氧化酶基因表达盒PpptA-godA-TtrpC菌株；
其中，gox-F的核苷酸序列为SEQ ID NO.5，gox-R的核苷酸序列为SEQ ID NO.6，Ttrpc-F的核苷酸序列为SEQ ID NO.7，Ttrpc-R的核苷酸序列为SEQ ID NO.8，pptA-F的核苷酸序列为SEQ ID NO.9，pptA-R的核苷酸序列为SEQ ID NO.10；
或者，邻联茴香胺显色法定性筛选突变体文库的方法，步骤如下：
(1)将上述突变体文库菌株接种于平板显色培养基上，28℃培养箱中培养48h；
(2)将配制好的邻联茴香胺显色液平铺在平板显色培养基上，每隔2h记录一下显色情况，观察至红色物质及透明圈出现，进行红色圈深浅定性比对，通过红色圈深浅来筛选突变体文库，比对照菌S2350(amyA位点)显色深的为高表达位点，比对照菌S2350(amyA位点)显色浅的为低表达位点；
其中，所述平板显色培养基的成分为：0％～8％葡萄糖，0％～0.5％酵母浸出物，0％～0.02％尿素，0％～0.07％KH2PO4，0％～0.02％MgSO4·7H2O，0％～0.1％玉米浆，调节pH＝7，0％～1.3％CaCO3，1.8％琼脂；其中，所有组分的取值均不为0；
所述邻联茴香胺显色液的成分为：溶液Ⅰ：每0.1g邻联茴香胺溶于10ml甲醇中；溶液Ⅱ：质量分数为18％的葡萄糖水溶液；溶液Ⅲ：90U/ml辣根过氧化酶溶液；
制备方法为：将每10ml含质量分数为1％的琼脂糖的去离子水加热溶化，待冷却到60℃以下，立即加入2ml溶液Ⅱ、200μl溶液Ⅰ、400μl溶液Ⅲ，混匀，得到邻联茴香胺显色液。
较优地，所述黑曲霉中高表达位点位点包括：117#：Aspni7|chr_501:839960-840058(GENE ID:ANI_1_286154)、20#：Aspni7|chr_402:1790024-1790232(GENE ID:ANI_1_974024)、75#：Aspni7|chr_603:213359-213546(GENE ID:ANI_1_1322184)、9#：Aspni7|chr_701:446894-447217(GENE ID:ANI_1_234094)和28#：
Aspni7|chr_402:1114661-1114936(GENE ID:ANI_1_596024)，低表达位点包括：2#：Aspni7|chr_503:350667-350745(GENE ID:ANI_1_1080144)、39#：
Aspni7|chr_304:1375731-1375776(GENE ID:ANI_1_782134)和7#：
Aspni7|chr_301:525561-525661(GENE ID:ANI_1_1566104)；
其中，以amyA即ASPNIDRAFT_47911位点表达水平的70％及以上为高表达；以amyA即ASPNIDRAFT_47911位点表达水平的70％及以下为低表达。
如上所述的突变体文库在黑曲霉中高表达或低表达位点筛选方面中的应用。
具体地，相关的制备及检测如下：
实施例1——出发菌株S1691的构建：
将含有质粒pLH733(Δgod1)的农杆菌与黑曲霉宿主菌株S549在IM平板共培养(具体方法参见已公开文献：DOI：10.27359/d.cnki.gtqgu.2020.000424，上述S549菌株是已公开文献(DOI：10.27359/d.cnki.gtqgu.2020.000424)中所用菌株。)，然后将共培养物转接于含有200μM头孢噻肟，100μg/mL氨苄青霉素，100μg/mL链霉素，250μg/mL潮霉素B的CM(DOI：10.27359/d.cnki.gtqgu.2020.000424)平板中，28℃培养直至形成单克隆。挑取单克隆转接于含有潮霉素B的PDA平板，筛选潮霉素B抗性转化子提取基因组验证，收集正确转化子孢子接种于含有30μg/mL多西环素平板上，诱导hph抗性筛选标记从基因组上切除，获得潮霉素敏感的god1基因敲除菌株S1260(Δgod1)。将含有质粒pLH739(Δgod3)的农杆菌与黑曲霉宿主菌株S1260在IM平板共培养，利用上述方法，获得潮霉素敏感的god3基因敲除菌株S1491(Δgod1，Δgod3)。将含有质粒pLH741(Δgod4)的农杆菌与黑曲霉宿主菌株S1491在IM平板共培养，利用上述方法，获得潮霉素敏感的god4基因敲除菌株S1573(Δgod1，Δgod3，Δgod4)。将含有质粒pLH763(Δgod2)的农杆菌与黑曲霉宿主菌株S1573在IM平板共培养，利用上述方法，最终获得潮霉素敏感的god2基因敲除菌株S1691(Δgod1，Δgod3，Δgod4，Δgod2)。本实验上述质粒pLH733(Δgod1)，pLH763(Δgod2)，pLH739(Δgod3)，pLH741(Δgod4)均为现有技术，均已在已公开文献中记载并公开：周宇涛.黑曲霉葡萄糖氧化酶编码基因的鉴定与功能研究[D].天津:天津科技大学,2020.中获得。本发明中含有质粒pLH733(Δgod1)，pLH763(Δgod2)，pLH739(Δgod3)，pLH741(Δgod4)的农杆菌是本领域公知的，可以通过周宇涛.黑曲霉葡萄糖氧化酶编码基因的鉴定与功能研究[D].天津:天津科技大学,2020.中记载的内容获得。
实施例2——过表达葡萄糖氧化酶基因godA质粒的构建：
质粒pLH1424(图1)，是由实验室现存质粒pLH331载体(中国专利，专利号：ZL201810985901.9)经改造而来。
具体构建过程如下：以S834(DOI：10.27359/d.cnki.gtqgu.2020.000424)菌株cDNA为模板，gox-F、gox-R为引物进行PCR扩增godA基因，以S834(中国知网，文献号DOI：10.27359/d.cnki.gtqgu.2020.000424)菌株基因组为模板，Ttrpc-F、Ttrpc-R为引物进行PCR扩增TtrpC终止子序列片段，其中godA核苷酸序列为SEQ ID NO.1，长度为1770bp，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2，长度为589aa，TtrpC核苷酸序列为SEQ ID NO.3，长度为712bp。应用诺唯赞C113-ClonExpress-MultiS One Step Cloning Kit试剂盒将godA基因及TtrpC终止子序列片段与经BamH I单酶切线性化后的出发载体pLH331进行连接，连接产物经转化大肠杆菌JM109感受态细胞，并均匀涂布于含有100μg/mL卡那霉素的LB培养皿中，37℃过夜培养，挑取单克隆，经双酶切验证(图2)获得质粒pLH1360(图3)。
以S469(中国专利，专利号：ZL201810985901.9)菌株基因组为模板，pptA-F、pptA-R为引物进行PCR扩增，pptA基因序列起始密码子上游1000bp作为PpptA启动子序列片段，其中PpptA核苷酸序列为SEQ ID NO.4，长度为1000bp。应用诺唯赞C113-ClonExpress-MultiSOne Step Cloning Kit试剂盒将PpptA启动子序列片段与经Xho I单酶切线性化后的载体pLH1360进行连接,连接产物经转化大肠杆菌JM109感受态细胞，并均匀涂布于含有100μg/mL卡那霉素的LB培养皿中，37℃过夜培养，挑取单克隆，经双酶切验证(图4)获得质粒pLH1424。
实施例3——定点表达葡萄糖氧化酶基因godA质粒的构建：
质粒pLH1445(图5)，是由实验室现存质粒pLH924(文献
DOI:10.3389/fmicb.2022.1009491)载体经改造而来。
具体构建过程如下：以上述实施例2中pLH1424为模板，PpptA-F，PTtrpc-R为引物进行PCR扩增PpptA+godA+Ttrpc序列片段，应用诺唯赞C113-ClonExpress-MultiS One StepCloning Kit试剂盒将上述表达框序列片段与经Sac I/BamH I双酶切线性化后的载体pLH924进行连接,连接产物经转化大肠杆菌JM109感受态细胞，并均匀涂布于含有100μg/mL卡那霉素的LB培养皿中，37℃过夜培养，挑取单克隆，经双酶切验证(图6)获得质粒pLH1445。
实施例4——葡萄糖氧化酶基因godA定点表达黑曲霉菌株的构建：
将含有质粒pLH1445的农杆菌与黑曲霉宿主菌株S1691在IM平板共培养，然后将共培养物转接于含有200μM头孢噻肟，100μg/mL氨苄青霉素，100μg/mL链霉素，250μg/mL潮霉素B的CM平板中，28℃培养直至形成单克隆。挑取单克隆转接于含有潮霉素B的PDA平板和含有草铵膦的MM平板上，筛选潮霉素B抗性和草铵膦敏感转化子(即在两种培养基上均不生长的转化子)提取基因组验证，如图10所示，与阳性对照S1691有长度差，差值为1386bp即为正确的转化子。收集正确转化子孢子接种于PDA平板上，获得正确的godA基因定点表达菌株。
实施例5——突变体文库构建：
将含有质粒pLH1424的农杆菌与黑曲霉宿主菌株S1691在IM平板共培养，然后将共培养物转接于含有200μM头孢噻肟，100μg/mL氨苄青霉素，100μg/mL链霉素，250μg/mL潮霉素B的CM平板中，28℃培养直至形成单克隆。挑取单克隆转接于PDA，PDA+Hyg的固体培养基上，在两种培养基上均生长的转化子，即获得潮霉素抗性的随机插入葡萄糖氧化酶基因表达盒(PpptA-godA-TtrpC)菌株。
邻联茴香胺显色法定性筛选：
(1)将上述黑曲霉菌株接种于平板显色培养基上，28℃培养箱中培养48h。
(2)将配制好的邻联茴香胺显色液平铺在平板显色培养基上，每隔2h记录一下显色情况，观察至红色物质及透明圈出现，进行红色圈深浅定性比对。筛选的突变体文库为图7。通过显色图可以直观看出，比对照菌S2350(amyA位点)显色深的依次是117#，20#，75#，9#，28#；比对照菌S2350(amyA位点)显色浅的为2#，5#，7#，11#，39#。
优选的，上述邻联茴香胺显色法功能性验证的平板显色培养基成分如下：0％～8％葡萄糖，0％～0.5％酵母浸出物，0％～0.02％尿素，0％～0.07％KH2PO4，0％～0.02％MgSO4·7H2O，0％～0.1％玉米浆，调节pH＝7，0％～1.3％CaCO3，1.8％琼脂，其中，所有组分的取值均不为0。
邻联茴香胺显色液成分如下：溶液Ⅰ：0.5g邻联茴香胺溶于50ml甲醇中；溶液Ⅱ：20％葡萄糖水溶液；溶液Ⅲ：150U/ml辣根过氧化酶。
将10ml含1％琼脂糖的去离子水加热溶化，待冷却到60℃以下立即加入2ml溶液Ⅱ，200μl溶液Ⅰ，400μl溶液Ⅲ，混匀。
实施例6——表达位点测定方法：
具体步骤为：
(1)提取基因组：应用上述表达位点菌株，收获其孢子，以2×106个/mL接种于黑曲霉液体培养基中，28℃，200rpm条件下培养24h收获菌体。滤布过滤收获菌体，蒸馏水冲洗菌体2-3次，然后用液氮研磨菌体，提取其基因组。
(2)酶切基因组：①在表达元件pLH1424上选择识别四个碱基序列的限制性内切酶，首选酶切位点是粘性末端的酶，平末端也可以(例如AluⅠ、AccII、HaeIII)，本实施例所选的酶切位点为AluI。②离表达元件末端最近的酶切位点到已知序列末端大约存在50-500bp(方便设计引物及提高连接效率)。
酶切体系：
选择合适温度酶切合适时间：即AluⅠ、AccII为37℃酶切1h，HaeIII为37℃酶切3h，再用PCR产物纯化试剂盒将酶切后的DNA回收，最后洗脱于50ul无菌水中。
(3)连接：将上步处理好的基因组与Linker连接。
Linker的处理：
AP-Ablunt(10μM)：5μl
AP-B blunt(10μM)：5μl
H2O：40μl
混合后，96℃2min，在室温中放置(10～20min)退火后放置-20℃保存备用。
连接体系：
16℃过夜或者25℃连接2h(根据T4 DNAligase说明书进行)，放置-20℃保存备用。
(4)外侧引物PCR扩增
Template:1μl连接产物(第3步的产物)
Primerpair:P1-ad,P2
PCR条件：用50ul体系
(5)内侧引物PCR扩增
Template:1μl混合物(第4步的产物)
Primerpair:P1-ad,P3
Taqpolymerase用50ul体系
(6)电泳切胶回收测序
第二轮扩增后取5ul电泳观察是否有明显主条带(同时将酶切的基因组，第一轮扩增产物同样取5ul电泳)，若有主条带则可以多扩增电泳切胶回收。若无主条带，可以适当增加延伸时长，或者改变基因组酶切时间。
用1.5％的琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的条带，根据PCR结果，判断直接PCR产物送测序，测序引物为P1-ad,P3。根据测序结果在JGI上检索其在基因组的位置，图8为原理示意图。图11为PCR结果图，2#-117#为获得的突变体文库菌株，将PCR产物送测序，鉴定出其在基因组上的位置。
实施例7——定量分析表达位点菌株的位点差异：
葡萄糖酸产量定量分析:
(1)收获上述菌株孢子，以2×106个/mL接种于50mL黑曲霉葡萄糖酸发酵培养基中，28℃，200rpm条件下培养72-120h。
(2)收集发酵液，每2ml发酵液中加入2ml 2M HCl，中和碳酸钙。
(3)12000rpm，离心5-10min，收集上清液。
(4)利用HPLC测定各菌株上清液中的葡萄糖酸产量。结果如图9所示。
优选的，上述定量分析表达位点菌株位点差异的黑曲霉葡萄糖酸发酵培养基的主要成分如下：0％～20％葡萄糖，0％～0.065％KH2PO4，0％～0.002％MgSO4·7H2O，0％～0.02％尿素，0％～0.1％玉米浆，调节pH＝7，CaCO32g/50ml，其中，所有组分的取值均不为0。
小结：发酵水平与显色表征结果一致，位点的表达强度最高的是117#：Aspni7|chr_501:839960-840058(GENE ID:ANI_1_286154)，其次是20#：Aspni7|chr_402:1790024-1790232(GENE ID:ANI_1_974024)、75#：
Aspni7|chr_603:213359-213546(GENE ID:ANI_1_1322184)、9#：Aspni7|
chr_701:446894-447217(GENE ID:ANI_1_234094)和28#：Aspni7|chr_402:1114661-1114936(GENE ID:ANI_1_596024)，较低的表达位点如2#：Aspni7|chr_503:350667-350745(GENEID:ANI_1_1080144)、39#：Aspni7|chr_304:1375731-1375776(GENEID:ANI_1_782134)和7#：Aspni7|chr_301:525561-525661(GENE ID:ANI_1_1566104)。
表1实施例中所用引物序列
其中，上述LB培养基、PDA培养基、IM培养基、CM培养基、MM培养基与公开文献孙菁等在amdS为筛选标记的黑曲霉遗传转化体系的建立(孙菁,等.中国农业科技导报,2020,22(09):179-187.)中记载的相同。
本发明中相关序列如下：
SEQ.ID NO.1：godA的核苷酸序列1770bp
CTGCCACACTACATCAGGAGCAATGGCATTGAAGCCAGCCTCCTGACTGATCCCAAG
GATGTCTCCGGCCGCACGGTCGACTACATCATCGCTGGTGGAGGTCTGACTGGACTC
ACCACCGCTGCTCGTCTGACGGAGAACCCCAACATCAGTGTGCTCGTCATCGAAAGT
GGCTCCTACGAGTCGGACAGAGGTCCTATCATTGAGGACCTGAACGCCTACGGCGAC
ATCTTTGGCAGCAGTGTAGACCACGCCTACGAGACCGTGGAGCTCGCTACCAACAAT
CAAACCGCGCTGATCCGCTCCGGAAATGGTCTCGGTGGCTCTACTCTAGTGAATGGTG
GCACCTGGACTCGCCCCCACAAGGCACAGGTTGACTCTTGGGAGACTGTCTTTGGAA
ATGAGGGCTGGAACTGGGACAATGTGGCCGCCTACTCCCTCCAGGCTGAGCGTGCTC
GCGCACCAAATGCCAAACAGATCGCTGCTGGCCACTACTTCAACGCATCCTGCCATG
GTGTTAATGGTACTGTCCATGCCGGACCCCGCGACACCGGCGATGACTATTCTCCCAT
CGTCAAGGCTCTCATGAGCGCTGTCGAAGACCGGGGCGTTCCCACCAAGAAAGACT
TCGGATGCGGTGACCCCCATGGTGTGTCCATGTTCCCCAACACCTTGCACGAAGACC
AAGTGCGCTCCGATGCCGCTCGCGAATGGCTACTTCCCAACTACCAACGTCCCAACC
TGCAAGTCCTGACCGGACAGTATGTTGGTAAGGTGCTCCTTAGCCAGAACGGCACCA
CCCCTCGTGCCGTTGGCGTGGAATTCGGCACCCACAAGGGCAACACCCACAACGTTT
ACGCTAAGCACGAGGTCCTCCTGGCCGCGGGCTCCGCTGTCTCTCCCACAATCCTCG
AATATTCCGGTATCGGAATGAAGTCCATCCTGGAGCCCCTTGGTATCGACACCGTCGT
TGACCTGCCCGTCGGCTTGAACCTGCAGGACCAGACCACCGCTACCGTCCGCTCCCG
CATCACCTCTGCTGGTGCAGGACAGGGACAGGCCGCTTGGTTCGCCACCTTCAACGA
GACCTTTGGTGACTATTCCGAAAAGGCACACGAGCTGCTCAACACCAAGCTGGAGC
AGTGGGCCGAAGAGGCCGTCGCCCGTGGCGGATTCCACAACACCACCGCCTTGCTCA
TCCAGTACGAGAACTACCGCGACTGGATTGTCAACCACAACGTCGCGTACTCGGAAC
TCTTCCTCGACACTGCCGGAGTAGCCAGCTTCGATGTGTGGGACCTTCTGCCCTTCAC
CCGAGGATACGTTCACATCCTCGACAAGGACCCCTACCTTCACCACTTCGCCTACGAC
CCTCAGTACTTCCTCAACGAGCTGGACCTGCTCGGTCAGGCTGCCGCTACTCAACTG
GCCCGCAACATCTCCAACTCCGGTGCCATGCAGACCTACTTCGCTGGGGAGACTATCC
CCGGTGATAACCTCGCGTATGATGCCGATTTGAGCGCCTGGACTGAGTACATCCCGTA
CCACTTCCGTCCTAACTACCATGGCGTGGGTACTTGCTCCATGATGCCGAAGGAGATG
GGCGGTGTTGTTGATAATGCTGCCCGTGTGTATGGTGTGCAGGGACTGCGTGTCATTG
ATGGTTCTATTCCTCCTACGCAAATGTCGTCCCATGTCATGACGGTGTTCTATGCCATG
GCGCTAAAAATTTCGGATGCTATCTTGGAAGATTATGCTTCCATGCAGTGA
SEQ.ID NO.2：godA的氨基酸序列589aa
LPHYIRSNGIEASLLTDPKDVSGRTVDYIIAGGGLTGLTTAARLTENPNISVLVIESGSYESD
RGPIIEDLNAYGDIFGSSVDHAYETVELATNNQTALIRSGNGLGGSTLVNGGTWTRPHKA
QVDSWETVFGNEGWNWDNVAAYSLQAERARAPNAKQIAAGHYFNASCHGVNGTVHA
GPRDTGDDYSPIVKALMSAVEDRGVPTKKDFGCGDPHGVSMFPNTLHEDQVRSDAARE
WLLPNYQRPNLQVLTGQYVGKVLLSQNGTTPRAVGVEFGTHKGNTHNVYAKHEVLLA
AGSAVSPTILEYSGIGMKSILEPLGIDTVVDLPVGLNLQDQTTATVRSRITSAGAGQGQAA
WFATFNETFGDYSEKAHELLNTKLEQWAEEAVARGGFHNTTALLIQYENYRDWIVNHNV
AYSELFLDTAGVASFDVWDLLPFTRGYVHILDKDPYLHHFAYDPQYFLNELDLLGQAAA
TQLARNISNSGAMQTYFAGETIPGDNLAYDADLSAWTEYIPYHFRPNYHGVGTCSMMP
KEMGGVVDNAARVYGVQGLRVIDGSIPPTQMSSHVMTVFYAMALKISDAILEDYASMQ
SEQ.ID NO.3：Ttrpc的核苷酸序列712bp
CTTAACGTTACTGAAATCATCAAACAGCTTGACGAATCTGGATATAAGATCGTTGGTG
TCGATGTCAGCTCCGGAGTTGAGACAAATGGTGTTCAGGATCTCGATAAGATACGTTC
ATTTGTCCAAGCAGCAAAGAGTGCCTTCTAGTGATTTAATAGCTCCATGTCAACAAGA
ATAAAACGCGTTTTCGGGTTTACCTCTTCCAGATACAGCTCATCTGCAATGCATTAATG
CATTGACTGCAACCTAGTAACGCCTTNCAGGCTCCGGCGAAGAGAAGAATAGCTTAG
CAGAGCTATTTTCATTTTCGGGAGACGAGATCAAGCAGATCAACGGTCGTCAAGAGA
CCTACGAGACTGAGGAATCCGCTCTTGGCTCCACGCGACTATATATTTGTCTCTAATTG
TACTTTGACATGCTCCTCTTCTTTACTCTGATAGCTTGACTATGAAAATTCCGTCACCA
GCNCCTGGGTTCGCAAAGATAATTGCATGTTTCTTCCTTGAACTCTCAAGCCTACAGG
ACACACATTCATCGTAGGTATAAACCTCGAAATCANTTCCTACTAAGATGGTATACAAT
AGTAACCATGCATGGTTGCCTAGTGAATGCTCCGTAACACCCAATACGCCGGCCGAAA
CTTTTTTACAACTCTCCTATGAGTCGTTTACCCAGAATGCACAGGTACACTTGTTTAGA
GGTAATCCTTCTT
SEQ.ID NO.4：PpptA的核苷酸序列1000bp
GTGAGGGAGGATTTTCTCCACGACGGGTGCGCGGATAAAGACGGCGGGGAAAG
CGGGTTGATTAGCGCCCAGGAAGGGCAAGTCGAGAGGAGCCTGGAAACTCTCCGTC
TGACGGCCAAAATGATTGCGATTGACGCGCACGTCCAGCCCACCGATCAGATCCTGG
CCACCCTTCTTTGTGCGGTTGGCTGACTCGGCGAGGAGGATCAGACCGGCGCAGGTA
CCCCAAGTAGGCCTCCGGTGGACCCTGAGATGGTAATTAGCATACACATAGAGCAACT
GTGCAGAACACCGATAAGACATACTTGACAAAGTCTCGCAAAGGCTCCAAGAGGTTG
GACCTGGCGGCAACAAGGGCCATGGTTGTGCTTTCACCTCCGGGCAGCACCAGCGCA
TCGCATCGCTCGAGTTCCTGCGGGGTGCGCACTTCGATGAAGTCCCATTGCGAGGCG
GAACTGCGGTCTTTGGCGGGCAAATCGGCGGCCGCACTCTTCAGCAATTGGATATGTT
CGTAGAAGGCGCCTTGCAAGGCGAGCACGCCGACGGTGATGCAGCCCATGGCGAAG
TATAGGATCTGAGAGTGTGGCGGCAGCAACAGAACTATGACTCCAAACTCTCTATACT
TTATTTGATGGGAGCAACGCCGCCTTATGTCAGCGGATCAATGTCGGACCGCTTATCA
CCACGTGCTGCCCCGCGTTCAGCCTCGGACATTTGGGGGCCATCATTAACATCATGAG
TTCAATGTCTTTTTTGCTTTGCTGTGATAATACGCTGGTTGCGGTCTTTAACATAAGAC
TCCGAGATTCGTCATTAGAACAGTTTAATCTCAGAATGTATCAATGACCCTCGTGGAG
AACTAACCCAACCCCTCACTTCACCTCATCTCACCTCCGCATAGACGCCCGATCTCCT
CACATCAGCTACACCACTACATCTCACTCAATTGAACACACCACCACCACAACAGCC
TCATACCCAACCCAACCAACCCACAATG
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

Claims (10)

1.一种用于筛选黑曲霉中表达位点的突变体文库，其特征在于：所述突变体文库是通过在出发菌株黑曲霉S1691中随机插入葡萄糖氧化酶基因表达盒PpptA-godA-TtrpC构建获得的；
其中，所述出发菌株黑曲霉S1691是在菌株S549的基础上依次敲除了葡萄糖氧化酶基因god1，god2，god3，god4获得的。
2.根据权利要求1所述的突变体文库，其特征在于：所述葡萄糖氧化酶基因利用NCBI对黑曲霉ATCC1015的葡萄糖氧化酶编码基因进行检索，god1序列在NCBI-locus_tag是AN I_1_1992014；god2序列在NCBI-locus_tag是ANI_1_1678104；god3序列在NCBI-locus_tag是ANI_1_1398064；god4序列在NCBI-locus_tag是ANI_1_748094；
或者，所述葡萄糖氧化酶基因表达盒PpptA-godA-TtrpC中基因godA序列在GenBank是AAA32695.1；
或者，所述葡萄糖氧化酶基因godA来源于黑曲霉ATCC 1015的cDNA；
或者，所述葡萄糖氧化酶基因表达盒PpptA-godA-TtrpC的构建步骤如下：
构建葡萄糖氧化酶基因表达盒PpptA-godA-TtrpC过表达菌株：以S834菌株cDNA为模板，gox-F、gox-R为引物进行PCR扩增godA基因，以S834菌株基因组为模板，Ttrpc-F、Ttrpc-R为引物进行PCR扩增TtrpC终止子序列片段，其中godA核苷酸序列为SEQ ID NO.1，TtrpC核苷酸序列为SEQ ID NO.3；将godA基因及Ttrpc终止子序列片段与经BamH I单酶切线性化后的出发载体pLH331进行连接，经双酶切验证获得质粒pLH1360；以S469菌株基因组为模板，pptA-F、pptA-R为引物进行PCR扩增，pptA基因序列起始密码子上游1000bp作为PpptA启动子序列片段，其中PpptA核苷酸序列为SEQ ID NO.4；将PpptA启动子序列片段与经Xho I单酶切线性化后的载体pLH1360进行连接，经双酶切验证获得质粒pLH1424；将含有质粒pLH1424的农杆菌转化至黑曲霉宿主菌株，经转化子筛选和潮霉素抗性基因重组获得随机插入葡萄糖氧化酶基因表达盒PpptA-godA-TtrpC菌株；
其中，gox-F的核苷酸序列为SEQ ID NO.5，gox-R的核苷酸序列为SEQ ID NO.6，Ttrpc-F的核苷酸序列为SEQ ID NO.7，Ttrpc-R的核苷酸序列为SEQ ID NO.8，pptA-F的核苷酸序列为SEQ ID NO.9，pptA-R的核苷酸序列为SEQ ID NO.10。
3.如权利要求1或2所述的突变体文库的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)农杆菌介导转化法：
将含有质粒的农杆菌与黑曲霉宿主菌株S1691在IM平板共培养，然后将共培养物转接于含有200μM头孢噻肟，100μg/mL氨苄青霉素，100μg/mL链霉素，250μg/mL潮霉素B的CM平板中，28℃培养直至形成单克隆；挑取单克隆转接于PDA，PDA+Hyg的固体培养基上，在两种培养基上均生长的转化子，即为潮霉素抗性的godA基因过表达菌株；
(2)定性筛选：采用邻联茴香胺显色法，将获得的黑曲霉转化子点接于平板显色培养基，28℃培养2d，将配制好的邻联茴香胺显色液平铺在平板显色培养基上，观察至红色物质及透明圈出现，进行红色圈深浅定性比对，通过红色圈深浅来筛选突变体文库，比对照菌S2350显色深的为高表达位点，比对照菌S2350显色浅的为低表达位点。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：所述平板显色培养基的成分为：0％～8％葡萄糖，0％～0.5％酵母浸出物，0％～0.02％尿素，0％～0.07％KH2PO4，0％～0.02％MgSO4·7H2O，0％～0.1％玉米浆，调节pH＝7，0％～1.3％CaCO3，1.8％琼脂；其中，所有组分的取值均不为0；
所述邻联茴香胺显色液的成分为：溶液Ⅰ：每0.1g邻联茴香胺溶于10ml甲醇中；溶液Ⅱ：质量分数为18％的葡萄糖水溶液；溶液Ⅲ：90U/ml辣根过氧化酶溶液；
制备方法为：将每10ml含质量分数为1％的琼脂糖的去离子水加热溶化，待冷却到60℃以下，立即加入2ml溶液Ⅱ、200μl溶液Ⅰ、400μl溶液Ⅲ，混匀，得到邻联茴香胺显色液。
5.一种利用如权利要求1或2所述的突变体文库筛选黑曲霉中高表达或低表达位点的方法，其特征在于：所述方法将葡萄糖氧化酶基因表达盒PpptA-godA-TtrpC整合到黑曲霉基因组中，构建随机插入突变文库，以葡萄糖氧化酶为报告基因，通过邻联茴香胺显色法筛选出突变体文库，再利用PCR扩增技术确定出相应的高表达位点或低表达位点；
其中，以amyA即ASPNIDRAFT_47911位点表达水平的70％及以上为高表达；以amyA即ASPNIDRAFT_47911位点表达水平的70％及以下为低表达。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述方法选取弱启动子PpptA、葡萄糖氧化酶基因godA和色氨酸合成酶C基因的终止子序列TtrpC组成的表达盒PpptA-godA-TtrpC，利用农杆菌介导的遗传转化方法将表达盒随机整合到黑曲霉细胞基因组中；利用邻联茴香胺显色法来功能性验证各菌株的显色情况，利用HPLC定量分析各菌株的葡萄糖酸产量，从而来表征在基因组中不同位置上基因表达强度的差异，即筛选出高表达或低表达位点；
其中，所述弱启动子PpptA的核苷酸序列为SEQ.ID NO.4，葡萄糖氧化酶基因godA的核苷酸序列为SEQ.ID NO.1，色氨酸合成酶C基因的终止子序列TtrpC的核苷酸序列为SEQ.IDNO.3。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：确定出相应的高表达或低表达位点的具体方法为：
应用上述突变体文库菌株，收获其孢子，以2×106个/mL接种于黑曲霉液体培养基中，28℃，200rpm条件下培养24h收获菌体；滤布过滤收获菌体，蒸馏水冲洗菌体2-3次，然后用液氮研磨菌体，提取其基因组，通过PCR扩增技术找出整合位点，在JGI上检索其在基因组的位置。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述葡萄糖氧化酶基因表达盒PpptA-godA-TtrpC的构建步骤如下：
构建葡萄糖氧化酶基因表达盒PpptA-godA-TtrpC过表达菌株：以S834菌株cDNA为模板，gox-F、gox-R为引物进行PCR扩增godA基因，以S834菌株基因组为模板，Ttrpc-F、Ttrpc-R为引物进行PCR扩增TtrpC终止子序列片段，其中godA核苷酸序列为SEQ ID NO.1，TtrpC核苷酸序列为SEQ ID NO.3；将godA基因及Ttrpc终止子序列片段与经BamH I单酶切线性化后的出发载体pLH331进行连接，经双酶切验证获得质粒pLH1360；以S469菌株基因组为模板，pptA-F、pptA-R为引物进行PCR扩增，pptA基因序列起始密码子上游1000bp作为PpptA启动子序列片段，其中PpptA核苷酸序列为SEQ ID NO.4；将PpptA启动子序列片段与经Xho I单酶切线性化后的载体pLH1360进行连接，经双酶切验证获得质粒pLH1424；将含有质粒pLH1424的农杆菌转化至黑曲霉宿主菌株，经转化子筛选和潮霉素抗性基因重组获得随机插入葡萄糖氧化酶基因表达盒PpptA-godA-TtrpC菌株；
其中，gox-F的核苷酸序列为SEQ ID NO.5，gox-R的核苷酸序列为SEQ ID NO.6，Ttrpc-F的核苷酸序列为SEQ ID NO.7，Ttrpc-R的核苷酸序列为SEQ ID NO.8，pptA-F的核苷酸序列为SEQ ID NO.9，pptA-R的核苷酸序列为SEQ ID NO.10；
或者，邻联茴香胺显色法定性筛选突变体文库的方法，步骤如下：
(1)将上述突变体文库菌株接种于平板显色培养基上，28℃培养箱中培养48h；
(2)将配制好的邻联茴香胺显色液平铺在平板显色培养基上，每隔2h记录一下显色情况，观察至红色物质及透明圈出现，进行红色圈深浅定性比对，通过红色圈深浅来筛选突变体文库，比对照菌S2350显色深的为高表达位点，比对照菌S2350显色浅的为低表达位点；
其中，所述平板显色培养基的成分为：0％～8％葡萄糖，0％～0.5％酵母浸出物，0％～0.02％尿素，0％～0.07％KH2PO4，0％～0.02％MgSO4·7H2O，0％～0.1％玉米浆，调节pH＝7，0％～1.3％CaCO3，1.8％琼脂；其中，所有组分的取值均不为0；
所述邻联茴香胺显色液的成分为：溶液Ⅰ：每0.1g邻联茴香胺溶于10ml甲醇中；溶液Ⅱ：质量分数为18％的葡萄糖水溶液；溶液Ⅲ：90U/ml辣根过氧化酶溶液；
制备方法为：将每10ml含质量分数为1％的琼脂糖的去离子水加热溶化，待冷却到60℃以下，立即加入2ml溶液Ⅱ、200μl溶液Ⅰ、400μl溶液Ⅲ，混匀，得到邻联茴香胺显色液。
9.根据权利要求5至8任一项所述的方法，其特征在于：所述黑曲霉中高表达位点位点包括：117#：Aspni7|chr_501:839960-840058(GENE ID:ANI_1_286154)、20#：
Aspni7|chr_402:1790024-1790232(GENE ID:ANI_1_974024)、75#：
Aspni7|chr_603:213359-213546(GENE ID:ANI_1_1322184)、9#：Aspni7|
chr_701:446894-447217(GENE ID:ANI_1_234094)和28#：Aspni7|chr_402:1114661-1114936(GENE ID:ANI_1_596024)，低表达位点包括：2#：Aspni7|chr_503:350667-350745(GENE ID:ANI_1_1080144)、39#：Aspni7|chr_304:1375731-1375776(GENE ID:ANI_1_782134)和7#：Aspni7|chr_301:525561-525661(GENE ID:ANI_1_1566104)；
其中，以amyA即ASPNIDRAFT_47911位点表达水平的70％及以上为高表达；以amyA即ASPNIDRAFT_47911位点表达水平的70％及以下为低表达。
10.如权利要求1或2所述的突变体文库在黑曲霉中高表达或低表达位点筛选方面中的应用。
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