WO2020071444A1 - 淡水産微細藻類の培養方法 - Google Patents

淡水産微細藻類の培養方法

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WO2020071444A1
WO2020071444A1 PCT/JP2019/038975 JP2019038975W WO2020071444A1 WO 2020071444 A1 WO2020071444 A1 WO 2020071444A1 JP 2019038975 W JP2019038975 W JP 2019038975W WO 2020071444 A1 WO2020071444 A1 WO 2020071444A1
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WO
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medium
culture
microalgae
ion concentration
haploid
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PCT/JP2019/038975
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English (en)
French (fr)
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進也 宮城島
俊亮 廣岡
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国立研究開発法人科学技術振興機構
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/80—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in fisheries management

Definitions

  • the present invention relates to a method for culturing freshwater microalgae.
  • the present invention also relates to a method for producing a saltwater-resistant microalgae produced in freshwater and a salt-resistant microalgae produced in freshwater produced by the method. More specifically, the present invention relates to a freshwater microalgae suitable for outdoor mass cultivation, particularly for outdoor mass cultivation in seawater, and a method for producing the same.
  • Priority is claimed on Japanese Patent Application No. 2018-187763, filed on October 2, 2018, the content of which is incorporated herein by reference.
  • microalgae have a higher carbon dioxide fixation capacity than terrestrial plants, and do not compete with the growing place for agricultural products, some species are cultured in large quantities, and feed, functional food, cosmetic materials It is used industrially as such. Industrial use of microalgae is limited to expensive functional foods and the like from the viewpoint of cost and the like. In order to suppress the production cost of microalgae and promote industrial use, mass cultivation outdoors is preferred. Outdoor large-scale cultivation has features such as easy management, but has the risk of contamination, is directly affected by the external environment, and also has a problem of invasion of algae predators.
  • microalgae to be mass-cultured outdoors must be resistant to environmental fluctuations (light, temperature, etc.), be cultivable under conditions where other organisms cannot survive, and grow to high density. Conditions such as being possible are required. For this reason, up to the present, only a few species, such as Chlorella, Euglena, Dunaliella, and Spirulina, have been practically used in industry. These algal species have been successfully mass-cultured outdoors, and are used as raw materials for functional foods and supplements.
  • Patent Literature 1 describes a method for producing an oil or fat component, which comprises culturing a salt-tolerant algae in a medium in which the salt concentration is increased stepwise. In the method described in Patent Document 1, when the nitrate content in the medium is measured at a wavelength of 220 nm, when the content becomes 10 mg / L or less, the salt concentration in the second step is increased.
  • Patent Literature 2 discloses that, in culturing alga Pseudochoricytis ellipsoida, which inhabits freshwater and has a hydrocarbon-producing ability, the cultivation is started in order to increase the productivity of the hydrocarbon-producing ability. It is disclosed that a salt is added to the medium after the time until the optical density of the medium reaches half the optical density indicating the saturation state.
  • Patent Document 3 discloses that in culture of the genus Crypthecodinium that produces docosahexaenoic acid, in order to accumulate docosahexaenoic acid in algae, the salt concentration of the culture solution is adjusted to a salt concentration suitable for the growth of the algae.
  • Patent Literatures 1 to 3 A method of culturing while setting the value to 0.1 to 10% by weight higher is disclosed.
  • the methods described in Patent Literatures 1 to 3 are intended to increase the hydrocarbon-producing ability and docosahexaenoic acid-producing ability by applying salt stress to microalgae, and to suppress the contamination risk in outdoor culture. Not something.
  • Cyanidiophyceae which is a single-cell primitive red algae, grow preferentially in sulfate acid hot springs.
  • the genus Ideugome includes the genus Cyanidioschizon, the genus Cyanidium, and the genus Galderia.
  • Cyanidioschizon melolae belonging to the genus Cyanidioschizon does not have a strong cell wall.
  • Cyanidiosisone merolae is composed of a very simple set of organelles, and the genome sequence has been completely decoded. Therefore, it has been used as a model organism for basic research on photosynthetic organisms, and development of genetic modification techniques has been advanced (Non-Patent Documents 1 and 2).
  • Freshwater eosinophilic microalgae belonging to the class Ideyugome can grow in an acidic environment where other organisms cannot grow, and are suitable for outdoor culture. If these microalgae can be given high salt concentration tolerance, they can be cultured in an acidic and high salt concentration environment, and the risk of contamination during outdoor culture is further reduced. In addition, if seawater can be used for culturing, culturing costs can be reduced.
  • the present invention provides a method for culturing freshwater microalgae which can satisfactorily grow freshwater microalgae in a low pH and high sodium ion concentration environment, and can satisfactorily grow in a low pH and high sodium ion concentration environment. It is an object to provide a freshwater microalgae and a method for producing the freshwater microalgae.
  • the present invention includes the following aspects.
  • a method for culturing microalgae wherein a freshwater microalgae is cultured in a medium prepared to have a hydrogen ion concentration of pH 1.0 to 6.0 and a sodium ion concentration of 0.1 to 0.4 M.
  • a method for culturing freshwater microalgae comprising a culturing step of culturing at 15-60 ° C.
  • a method for culturing freshwater microalgae wherein the freshwater microalgae is cultured in a medium prepared to have a hydrogen ion concentration of pH 1.0 to 6.0 and a sodium ion concentration of 0.1 to 0.4 M.
  • the pre-culture step and the freshwater microalgae after the pre-culture step the sodium ion concentration is 1.2 to 5 times the sodium ion concentration in the pre-culture step and the hydrogen ion concentration is pH 1.0 to 6.0.
  • the method for culturing freshwater microalgae according to [1], comprising: a main culturing step of culturing the medium in a medium prepared so that [3] The medium according to [1] or [2], wherein the medium in the main culturing step is a medium prepared to have a hydrogen ion concentration of pH 1.0 to 6.0 and a sodium ion concentration of 0.5 M or more. Culture method of freshwater microalgae.
  • the medium according to [1] or [2], wherein the medium in the main culture step is a medium prepared to have a hydrogen ion concentration of pH 1.0 to 6.0 and a sodium ion concentration of 0.4 M or more.
  • the medium in the main culturing step is a medium prepared by adding at least a nitrogen-containing salt, a phosphorus-containing salt, and an iron-containing salt to seawater and adjusting to a hydrogen ion concentration of pH 1.0 to 6.0.
  • Freshwater microalgae that cannot grow on a medium having a sodium ion concentration of 0.5 M or more were prepared to have a hydrogen ion concentration of pH 1.0 to 6.0 and a sodium ion concentration of 0.1 to 0.4 M.
  • a haploid microalga belonging to the class Ideugome which is a M-Allen medium prepared to have a hydrogen ion concentration of pH 2.0 and a sodium ion concentration of 0.5 M.
  • the culture temperature is 42 ° C.
  • the carbon dioxide concentration is M prepared so that the value calculated by the following formula (1) when cultured statically for 7 days with continuous light of 2% and illuminance of 60 ⁇ mol / m 2 s was 2 or more and the hydrogen ion concentration was pH 2.0.
  • a haploid of the microalga belonging to the class Ideugome according to any one of [10] to [12] is added to seawater with at least a nitrogen-containing salt, a phosphorus-containing salt, and an iron-containing salt,
  • a method for culturing haploid microalgae belonging to the class Ideyugome comprising culturing in a medium prepared to have a hydrogen ion concentration of pH 1.0 to 6.0.
  • the value calculated by the following formula (1) when the culture is allowed to stand for 7 days in a continuous light having a culture temperature of 42 ° C., a carbon dioxide concentration of 2%, and an illuminance of 60 ⁇ mol / m 2 s in an M-Allen medium prepared as follows. Culturing a haploid microalgae belonging to the class Ideugome, wherein is less than 2, in a medium prepared to have a hydrogen ion concentration of pH 1.0 to 6.0 and a sodium ion concentration of 0.4 M or more. Method of culturing freshwater microalgae.
  • a method of culturing freshwater microalgae which can satisfactorily grow freshwater microalgae in a low pH and high sodium ion concentration environment, and which can be satisfactorily grown in a low pH and high sodium ion concentration environment.
  • a freshwater microalgae and a method for producing the freshwater microalgae are provided.
  • Cyanidium sp. HKN1 (haploid) was pre-cultured on M-Allen medium (MA medium), and then MA medium, a medium containing 0.3 M NaCl added to MA medium (MA + 0.3 M NaCl medium), or MA medium Curves of the main culture in the medium (MA + 0.5M NaCl medium) supplemented with 0.5M NaCl, and the pre-culture in the MA + 0.3M NaCl medium followed by the growth in the main culture of MA + 0.5M NaCl medium it is a graph showing the curve (time course of OD 750). It is a graph which shows the growth curve when Cyanidium sp.
  • HKN1 (haploid) is pre-cultured in MA + 0.3M NaCl medium and then main-cultured in seawater medium or MA + 0.5M NaCl medium.
  • Shianijiumu sp HKN1 a (haploid) were precultured in MA + 0.3 M NaCl medium is a graph showing the OD 750 after 7 days the culture in sea water medium pH 2 ⁇ 7.
  • Cyanidium sp. HKN1 (diploid) was pre-cultured in MA medium, and then subjected to main culture in MA medium, MA + 0.3 M NaCl medium or MA + 0.5 M NaCl medium, and growth curve in MA + 0.3 M NaCl medium.
  • HKN1 diploid in MA medium, MA medium + 0.5M NaCl medium, and seawater medium. It is a graph which shows the growth curve when Cyanidium sp. HKN1 (haploid) is cultured in 10 L of seawater medium. 1 shows a molecular phylogenetic tree of microalgae belonging to the genus Ideugome based on the chloroplast ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase / oxygenase large subunit (rbcL) gene. The local bootstrap value by the maximum likelihood method (only described above 50, left) and the posterior probability by the Bayes method (only described above 0.95, right) are shown near each branch.
  • MA medium means M-Allen medium. Specifically, it means a medium having the composition shown in Table 1 and adjusted using sulfuric acid so that the hydrogen ion concentration becomes pH 1.0 to 6.0. When simply described as “MA medium” or “M-Allen medium”, it means a medium to which NaCl has not been added. “M-Allen medium prepared to have a hydrogen ion concentration of pH 2.0” means an MA medium to which pH 2.0 has been adjusted and to which NaCl has not been added.
  • MA medium + 0.3M NaCl medium means an MA medium adjusted to have a NaCl concentration of 0.3M. Specifically, it means a medium having the composition shown in Table 4 and adjusted with sulfuric acid so that the hydrogen ion concentration becomes pH 1.0 to 6.0.
  • the “M-Allen medium prepared to have a hydrogen ion concentration of pH 2.0 and a sodium ion concentration of 0.3 M” means a MA + 0.3 M NaCl medium adjusted to have a pH of 2.0.
  • MA + 0.5M NaCl medium means a MA medium adjusted to have a NaCl concentration of 0.5M. Specifically, it means a medium having the composition shown in Table 5 and adjusted with sulfuric acid so that the hydrogen ion concentration becomes pH 1.0 to 6.0.
  • M-Allen medium prepared to have a hydrogen ion concentration of pH 2.0 and a sodium ion concentration of 0.5 M means a MA + 0.5 M NaCl medium adjusted to have a pH of 2.0.
  • the hydrogen ion concentration (pH) can be any value in the range of pH 1.0 to 6.0 unless otherwise specified.
  • M used for the concentration of a component in a medium represents “mol / L”.
  • the present invention provides a method for culturing freshwater microalgae.
  • the culture method of the present embodiment is a method in which freshwater microalgae are cultured in a medium prepared so that the hydrogen ion concentration is pH 1.0 to 6.0 and the sodium ion concentration is 0.1 to 0.4 M, and the culture temperature is 15 to 60. Culturing at °C.
  • the culturing method includes a pre-culturing step of culturing a freshwater microalgae in a medium prepared to have a hydrogen ion concentration of pH 1.0 to 6.0 and a sodium ion concentration of 0.1 to 0.4 M;
  • the freshwater microalgae after the step is cultured in a medium prepared so that the sodium ion concentration is 1.2 to 5 times the sodium ion concentration in the pre-culture step and the hydrogen ion concentration is pH 1.0 to 6.0.
  • a main culturing step includes a pre-culturing step of culturing a freshwater microalgae in a medium prepared to have a hydrogen ion concentration of pH 1.0 to 6.0 and a sodium ion concentration of 0.1 to 0.4 M;
  • the freshwater microalgae after the step is cultured in a medium prepared so that the sodium ion concentration is 1.2 to 5 times the sodium ion concentration in the pre-culture step and the hydrogen ion concentration is pH
  • the culturing method of the present embodiment is characterized in that before the main culture in the acidic medium with a high salt concentration, the preculture is performed in an acidic medium with a sodium ion concentration of 0.1 to 0.4 M. I do. By performing such pre-culture, even freshwater microalgae having no salt tolerance can be satisfactorily grown in a medium having a high salt concentration comparable to that of seawater.
  • the sodium ion concentration and the hydrogen ion concentration (pH) of the medium in the pre-culture step mean the sodium ion concentration and the pH at the start of the culture in the pre-culture step, respectively.
  • the medium at the start of the preculture step has a “sodium ion concentration of 0.1 to 0.4 M” and a “pH of 1.0 to 6.0”, the sodium ion concentration or pH fluctuates during the preculture period. Even if the value falls outside the above range, it is included in the pre-culture step of the culture method of the present embodiment.
  • the sodium ion concentration and the pH of the medium in the main culture step mean the sodium ion concentration and the pH at the start of the culture in the main culture step, respectively.
  • the culture medium at the start of the main culture step is “the sodium ion concentration is 1.2 to 5 times the sodium ion concentration in the pre-culture step” and “pH 1.0 to 6.0”, during the main culture period, Even when the sodium ion concentration or pH fluctuates outside the above range, it is included in the main culturing step of the culturing method of the present embodiment.
  • the culture method of the present embodiment is applicable to freshwater microalgae capable of growing under acidic conditions of pH 1.0 to 6.0.
  • “Freshwater microalgae” means microalgae that live in freshwater bodies.
  • the sodium ion concentration of fresh water is usually less than 0.05% by mass.
  • the freshwater area is not particularly limited, and includes rivers, lakes and marshes, hot springs, groundwater, and the like, and is preferably a freshwater area under acidic conditions with a pH of 1.0 to 6.0.
  • Preferred examples of the freshwater area under such acidic conditions include acidic hot springs (sulfuric acid hot springs and the like).
  • microalgae means single-celled algae.
  • Examples of the freshwater microalgae capable of growing under acidic conditions of pH 1.0 to 6.0 include, for example, microalgae belonging to the class Cyanidiophyceae.
  • the taxonomic class is classified into Rhodophyta and Cyanidiophyceae on the taxonomic basis.
  • three genera of the genus Cyanidioschizon, the genus Cyanidium, and the genus Galderia are classified into the class Ideugome.
  • the microalgae belonging to the class Ideyugome many types of microalgae have been known so far and will not be enumerated here.
  • FIG. The phylogenetic tree using the sequence is shown.
  • the culture method of the present embodiment is preferably applied to freshwater microalgae having no salt tolerance among freshwater microalgae.
  • “having no salt tolerance” means that when cultured in seawater or a medium having a sodium ion concentration equivalent to seawater (about 0.5 M), a medium for freshwater microalgae (a sodium ion concentration of 0.05 M or less) ) Means that growth is suppressed (including the inability to grow) as compared to the case of culturing.
  • the growth rate is preferably reduced by 60% or more, more preferably by 80% or more, as compared with the growth rate in a freshwater microalgae medium.
  • Examples of freshwater microalgae that can grow under acidic conditions of pH 1.0 to 6.0 and do not have salt tolerance include microalgae belonging to the class Ideugome shown in FIG.
  • a haploid of a microalga belonging to the genus Cyanidium, a haploid of a microalga belonging to the genus Cyanidiochisone melorae, Garderia and the like can be mentioned.
  • Some microalgae belonging to the class Ideyugome can take a haploid cell form or a diploid cell form.
  • the present inventors provide a method for obtaining a cell group having a haploid cell morphology from a cell group having a diploid cell morphology, and conversely, a method for obtaining a cell group having a haploid cell morphology from a cell group having a haploid cell morphology.
  • a method for obtaining a morphological cell group is provided (WO 2019/107385).
  • diploid microalgae belonging to the genus Cyanidium have salt tolerance, but haploids do not.
  • Specific examples of the microalgae belonging to the genus Cyanidium having haploid and diploid cell morphologies include, for example, Cyanidium sp. Strain YFU3 (FERM P-22334) (hereinafter referred to as “YFU3 strain”). ), And Cyanidium sp. HKN1 strain (FERM P-22333) (hereinafter referred to as “HKN1 strain”), and the like, closely related species, mutant strains, and progeny thereof.
  • the diploid cell morphology is referred to as “YFU3 strain (diploid)” and haploid cell morphology.
  • the cell morphology is described as "YFU3 strain (haploid)”.
  • the diploid cell morphology and the haploid cell morphology are described separately for the HKN1 strain, the diploid cell morphology is referred to as “HKN1 strain (diploid)” and haploid. Is described as “HKN1 strain (haploid)”.
  • YFU3 strain or "HKN1 strain”
  • Whether algae are diploid or haploid can be determined by checking the copy number of the same locus. That is, if the copy number of the same locus is 1, it is determined to be haploid. It is also possible to determine that the algae are haploid using a next-generation sequencer or the like. For example, a sequence read of the whole genome is acquired by a next-generation sequencer or the like, the sequence reads are assembled, and the sequence read is mapped to a sequence obtained by assembling. In diploids, base differences between alleles are found in various regions on the genome, but in haploids, only one allele is present, so no such region is found.
  • cells are stained with a nuclear staining reagent such as DAPI, and compared with cells known to be haploid, cells showing the same fluorescence luminance are determined to be haploid, and the fluorescence is approximately doubled. Cells exhibiting luminance may be determined to be diploid.
  • cells are stained with a nuclear staining reagent such as DAPI, and compared with cells known to be diploid, cells showing the same fluorescence luminance are determined to be diploid, and about 1/2 times May be determined to be haploid.
  • the YFU3 strain (haploid) is a single-celled red algae isolated from high-temperature acidic water of a hot spring in Yufu City, Oita Prefecture, Japan.
  • YFU3 strain deposited on May 30, 2017 as Accession No. FERM P-22334 at the Patent and Microorganisms Depositary of the National Institute of Technology and Evaluation (2-5-8 Kazusa Kamatari, Kisarazu-shi, Chiba, Japan) It has been transferred to the International Depositary on April 20, 2018 as Accession No. FERM BP-22334.
  • the HKN1 strain is a single-celled red algae isolated from high-temperature acidic water of a hot spring in Hakone-machi, Ashigarashimo-gun, Kanagawa, Japan.
  • the HKN1 strain (haploid) was deposited on May 30, 2017, under the accession number FERM P-22333, at the Patent and Microorganisms Depositary of the National Institute of Technology and Evaluation, and under the accession number FERM BP-22333, 2018. Transferred to the International Depositary on April 20, 2008.
  • the freshwater microalgae to which the culture method of the present embodiment is applied may be isolated from a freshwater area such as an acidic hot spring, or may be obtained from a culture collection or the like.
  • a freshwater area such as an acidic hot spring
  • a culture collection or the like for example, Cyanidiosisone Merolae is available from the National Institute for Environmental Studies Microbial Strain Preservation Facility (16-2 Onogawa, Tsukuba, Ibaraki, Japan), American Type Culture Collection (ATCC; 10801 University Boulevard Manassas, VA 20110 USA) )).
  • the freshwater microalgae to which the culture method of the present embodiment is applied is not limited to those isolated from the natural world, but may be those in which natural freshwater microalgae are mutated. Mutations may be spontaneous or artificial.
  • cyanidiochisone melorae has a small genome size (about 16 Mbp) and has completed decoding of the genome sequence (Matsuzaki Met et al., Nature. 2004 2004 Apr 8; 428 (6983): 653-7). .), Easy to make genetic modification. Therefore, for example, the culture method of the present embodiment may be applied to a transformant of cyanidiosizon melorae produced by genetic modification (for example, a transformant with an enhanced nutritional component). If the genetic modification is possible, the culture method of the present embodiment may be applied to a transformant of another freshwater microalgae.
  • some microalgae belonging to the genus Gardenia can take a haploid cell form and a diploid cell form.
  • a haploid cell morphology can be obtained by culturing a diploid microalga belonging to the genus Gardenia for a certain period of time (for example, about 1 to 3 weeks).
  • a medium for culturing diploid cells to obtain haploid cells for example, acidic hot spring drainage medium, Tsukahara mineral spring medium (Hirooka et al., 2016, Front in Microbiology) and the like can be suitably used.
  • the culture method of the present embodiment is also applicable to a haploid microalga belonging to the genus Gardenia or a transformant thereof.
  • microalgae belonging to the genus Gardenia for example, Partita (NBRC 102759); Sulfuraria (SAG108.79, etc.) and the like.
  • the microalgae belonging to the genus Gardenia may be isolated from a freshwater body such as an acidic hot spring, or may be obtained from a culture collection or the like.
  • the culture collection includes NITE Biological Resource Center (NRBC; 2-49-10 Nishihara, Shibuya-ku, Tokyo, Japan) and GEORG-AUGUST-UNIVERITY GOTTING ultra ⁇ Collection ⁇ of ⁇ Algae (SAG).
  • haploid algal cells often do not have strong cell walls.
  • Alploid cells in the form of haploid cells having no strong cell wall can be destroyed by relatively mild treatment such as neutralization treatment, hypotonic treatment, and freeze-thaw treatment.
  • relatively mild treatment such as neutralization treatment, hypotonic treatment, and freeze-thaw treatment.
  • “having no strong cell wall” means that cell rupture is caused by any of the following cell rupture treatments (A) to (C).
  • Algal cells are suspended in an isotonic solution of pH 7 and left for one week or more.
  • Algae cells are suspended in distilled water and left for 1 minute or more.
  • C The algal cells are dried and suspended in an isotonic solution at pH 7.
  • the isotonic solution include a pH 7 buffer solution containing 10% sucrose and 20 mM HEPES.
  • examples of the drying treatment include drying in a refrigerator (4 ° C.) and freeze-drying.
  • the drying treatment the precipitate of algal cells collected by centrifugation is used.
  • the drying treatment time depends on the amount of algal cells, and is, for example, 3 days or more.
  • the cell rupture was determined by centrifuging (1,500 ⁇ g, 3 minutes) the algal cell suspension after the cell rupture treatment (A) to (C) above.
  • the determination can be made by determining the ratio of the amount of protein in the centrifugal supernatant to the total amount of protein therein. Specifically, when the rupture rate determined by the following equation is 20% or more, it can be determined that cell rupture has occurred.
  • the algal cells in the algal cell suspension are observed under an optical microscope (for example, at a magnification of 600), and the proportion of cells in which cell rupture has occurred is about 10% or more of the total algal cells, preferably about 20%. In this case, it may be determined that cell rupture has occurred.
  • the cells in which cell rupture is caused by the cell rupture treatment of any of the above (A) to (C) are pH 7 It can be said that the cell undergoes cell rupture under the above conditions. If microalgae whose cells rupture under the condition of pH 7 are difficult to grow in an external environment when they flow out of the culture tank, contamination to the environment can be suppressed. When the algal cell does not have a strong cell wall, the cell wall is not normally observed by observation with an optical microscope (for example, at a magnification of 600). It should be noted that whether or not cell rupture occurs due to mild hypotonic treatment under conditions of pH 6 or less does not affect the determination as to whether or not the microalga does not have a strong cell wall.
  • the pre-culture step is a step of culturing freshwater microalgae in a medium prepared so as to have a hydrogen ion concentration of pH 1.0 to 6.0 and a sodium ion concentration of 0.1 to 0.4M.
  • the medium used in the preculture step is not particularly limited as long as the medium has a sodium ion concentration of 0.1 to 0.4 M and a pH of 1.0 to 6.0.
  • a medium prepared by adding 0.1 to 0.4 M sodium ions to a general freshwater microalgae medium and adjusting the pH to 1.0 to 6.0 can be preferably used.
  • the culture medium for freshwater microalgae is not particularly limited, and an appropriate medium may be appropriately selected depending on the type of freshwater microalgae to be cultured.
  • Examples of the culture medium for freshwater microalgae include an inorganic salt medium containing a nitrogen source, a phosphorus source, an iron source, trace elements (such as zinc, boron, cobalt, copper, manganese, and molybdenum).
  • examples of the nitrogen source include ammonium salts, nitrates, nitrites, urea, amines and the like
  • examples of the phosphorus source include phosphates and phosphites
  • examples of the iron source include iron chloride, Iron sulfate, iron citrate and the like.
  • Specific examples of the culture medium for freshwater microalgae include, for example, 2 ⁇ Allen medium (Allen MB. Arch. Microbiol.
  • M-Allen medium Minoda A et al. Plant Cell Physiol. 2004) 45: 667-71.
  • MA2 medium Ohnuma M et al. Plant Cell Physiol. 2008 Jan; 49 (1): 117-20.
  • MA medium the M-Allen medium
  • the sodium ion concentration may be appropriately selected within the range of 0.1 to 0.4 M according to the sodium ion concentration in the main culture step described later. More specifically, a sodium ion concentration 0.2 to 0.8 times the sodium ion concentration expected in the main culture step can be selected.
  • the sodium ion concentration is preferably 0.5 times or more, more preferably 0.5 to 0.7 times, and more preferably 0.5 to 0.6 times the sodium ion concentration in the main culture step. Is more preferred.
  • the sodium ion concentration in the pre-culture step is preferably 0.25 M or more, and is preferably 0.25 to 0.35 M.
  • Adjustment of the sodium ion concentration of the medium may be performed using a commercially available sodium ion reagent or using sodium chloride.
  • natural seawater, concentrated seawater, artificial seawater and the like are diluted so that the sodium ion concentration becomes 0.1 to 0.4 M, and appropriately added with a nitrogen source, a phosphorus source, an iron source, a trace element, and the like. You may.
  • natural seawater those obtained by filtering surface water or deep seawater can be used, and commercially available products can also be used.
  • Natural seawater Commercial products of natural seawater include, for example, Nazyme 10 (surface water of 10 m of Izu), Najim 800 (800 m of Izu Akazawa deep sea water) (both from Japan QCE bluelab division) and the like.
  • Commercial products of artificial seawater include, for example, Daigo IMK medium, Daigo artificial seawater SP (both from Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.).
  • the concentration of main ions contained in natural seawater is known as the concentration of main ions contained in natural seawater, particularly in the surface layer of seawater.
  • This composition appears to be a common composition in the surface oceans, and it is well known that salinity varies in different regions. Therefore, it is difficult to define the salt concentration of seawater, but there is no doubt that sodium is the main metal in metal ions. Therefore, the inventors have determined that seawater conditions are used when the sodium ion concentration generally exceeds 0.4 M.
  • the sodium ion concentration closer to the seawater condition is 0.45 M or more, more preferably 0.5 M or more.
  • the hydrogen ion concentration may be appropriately selected within the range of pH 1.0 to 6.0 depending on the type of freshwater microalgae.
  • the pH is preferably 1.0 to 5.0, and more preferably 1.0 to 3.0.
  • the pH of the medium can be adjusted using, for example, an inorganic acid such as sulfuric acid or hydrochloric acid, or an inorganic base such as potassium hydroxide.
  • a pH buffer may be optionally added to the medium in order to suppress pH fluctuation during the culture.
  • the preculture step can be started by inoculating freshwater microalgae cells into the medium.
  • Temperature conditions in the pre-culture step may be appropriately selected according to the type of freshwater microalgae.
  • the culturing temperature can be, for example, 15 to 60 ° C, preferably 15 to 50 ° C, and more preferably 30 to 50 ° C.
  • the culture temperature is preferably 30 to 50 ° C.
  • Light conditions in the pre-culture step may be appropriately selected according to the type of freshwater microalgae. Generally, 5 to 2000 ⁇ mol / m 2 s can be exemplified.
  • the freshwater microalgae are microalgae belonging to the class Ideugome, preferably 5 to 1500 ⁇ mol / m 2 s.
  • the light condition may be continuous light, and a light-dark cycle (10 L: 14 D or the like) may be provided.
  • the pre-culture step may be performed under natural light.
  • the CO 2 conditions in the pre-culture step may be appropriately selected according to the type of freshwater microalgae. Generally, a condition of 0.04 to 5% CO 2 can be exemplified. In the case where the freshwater microalgae are microalgae belonging to the class Ideugome, the condition of 0.04 to 3% CO 2 is preferable.
  • the genus Gardenia has a high tolerance to high CO 2 concentration and can grow even with 100% CO 2. Therefore, when the freshwater microalgae is a microalga belonging to the genus Gardenia, 100% CO 2 conditions may be used. Further, the CO 2 condition may be a CO 2 concentration in the atmosphere.
  • the culture method in the pre-culture step is not particularly limited, and a method generally used as a culture method for microalgae may be used. Specific examples include stationary culture, aeration culture (200 to 400 mL @ air / min or the like), shaking culture (100 to 200 rpm or the like), and the like.
  • the culture period in the pre-culture step is not particularly limited, but requires a period from the end of the induction period to the beginning of the logarithmic phase, usually requires 3 days or more, and is preferably 5 days or more. Preferably it is 7 days or more.
  • the upper limit of the preculture period is not particularly limited, but it is not suitable to maintain the growth of microalgae in the main culture, if performed before finishing the logarithmic phase and approaching the stationary phase.
  • the preculture period is preferably 3 to 20 days, more preferably 5 to 15 days, and even more preferably 7 to 10 days.
  • the scale of the preculture can be selected according to the scale of the main culture.
  • preculture can be performed on a small scale, and is usually performed at 0.1 to 1000 mL.
  • mass production is performed industrially in the main culture, the preculture may be performed in about 1 to 10 L.
  • the freshwater microalgae after the preculture step are adjusted so that the sodium ion concentration is 1.2 to 5 times the sodium ion concentration in the preculture step and the hydrogen ion concentration is pH 1.0 to 6.0. This is a step of culturing in the medium prepared in the above.
  • the medium used in the main culturing step has a sodium ion concentration of 1.2 to 5 times the medium used in the pre-culturing step, and is 0.4 M or more, preferably 0.45 M or more, in terms of sodium ion concentration.
  • a material having a concentration of 0.5 M or more can be used.
  • the hydrogen ion concentration is not particularly limited as long as the medium has a pH of 1.0 to 6.0.
  • a medium obtained by adding sodium ion at the above concentration to a general freshwater microalgae medium and adjusting the pH to 1.0 to 6.0 can be preferably used.
  • Examples of the culture medium for freshwater microalgae include those similar to those described in the above “[Preculture step]”.
  • the medium used in the main culture step may be one in which a nitrogen source, a phosphorus source, an iron source, a trace element, and the like are appropriately added to seawater to adjust the pH to 1.0 to 6.0.
  • the seawater may be natural seawater, artificial seawater, or diluted seawater.
  • Commercial products of natural seawater and artificial seawater include the same products as those described in the above “[Pre-culture step]”.
  • the cost can be suppressed by using natural seawater.
  • Natural seawater may be surface water or deep ocean water. Natural seawater is preferably one from which impurities have been removed by filtration or the like.
  • the nitrogen source, phosphorus source, iron source, trace elements, and the like to be added to seawater may be appropriately selected according to the type of freshwater microalgae.
  • the freshwater microalgae are microalgae belonging to the class Ideugome, it is preferable to add at least a nitrogen-containing salt, a phosphorus-containing salt, and an iron-containing salt to seawater.
  • the nitrogen-containing salt include nitrogen-containing inorganic salts such as ammonium salt, nitrate, and nitrite. Among them, ammonium salts (such as ammonium sulfate) are preferable as the nitrogen-containing salt.
  • the amount of the ammonium salt to be added to seawater is exemplified by an ammonium ion concentration of 20 to 100 mM.
  • Examples of the phosphorus-containing salt include phosphorus-containing inorganic salts such as phosphate and phosphite. Among them, a phosphate (such as potassium dihydrogen phosphate) is preferable as the phosphorus-containing salt.
  • Examples of the amount of the phosphate added to seawater include a phosphate ion concentration of 2 to 10 mM.
  • Examples of the iron-containing salt include iron (III) chloride, iron (II) sulfate, iron (II) citrate, and hydrates thereof. Among them, iron (III) chloride is preferable as the iron-containing salt.
  • Examples of the amount of the iron-containing salt added to seawater include an iron ion concentration of 0.1 to 2 mM.
  • trace elements such as boric acid, manganese, zinc, molybdenum, cobalt, and copper to seawater.
  • trace elements such as boric acid, manganese, zinc, molybdenum, cobalt, and copper
  • preferred examples of the medium used in the main culturing step include "seawater medium” described in Table 9 below.
  • the sodium ion concentration of the medium used in the main culture step is not particularly limited, but is 1.1 to 5 times, preferably 1.2 to 5 times the sodium ion concentration in the pre-culture step, and is 1.4 to 2 times. More preferably, it is 1.5 times to 2 times.
  • the sodium ion concentration is about 0.4 M or more, and a medium of 1 M or less is used depending on the type of microalgae used.
  • a sodium ion concentration of 0.5 M or more can be used in order to suppress contamination of other organisms.
  • the sodium ion concentration may be 0.5 to 1M. Adjustment of the sodium ion concentration of the medium can be performed in the same manner as in the medium in the pre-culture step.
  • the hydrogen ion concentration may be appropriately selected within the range of pH 1.0 to 6.0 depending on the type of freshwater microalgae.
  • the pH is preferably 1.0 to 5.0, and more preferably 1.0 to 3.0.
  • a lower pH such as pH 1.0 to 2.0
  • the pH of the medium can be adjusted in the same manner as in the medium in the pre-culture step.
  • the main culturing step can be started by inoculating the culture solution from the pre-culturing step into the medium in the main culturing step.
  • the culture scale in the main culture step can be appropriately selected depending on the purpose. For example, when breeding microalgae or selecting a mutant strain, main culture can be performed on a small scale, and is usually performed at about 10 mL to 10 L. In the case where industrial mass production is performed in the main culture, the culture may be performed at about 20 to 5000 L. When performing a large-scale culture of 500 L, outdoor culture may be performed.
  • the temperature conditions, light conditions, CO 2 conditions, and culture method in the main culture step can be the same as the above-described pre-culture conditions.
  • the culture may be performed outdoors.
  • the temperature condition, the light condition, and the CO 2 condition can be the conditions of the external environment where the culture tank is installed. Even when the main culture step is performed outdoors, the culture is performed under acidic conditions of pH 1.0 to 6.0, so that contamination of other organisms can be suppressed.
  • a haploid microalga belonging to the class Ideugome is used as a freshwater microalgae, it is difficult to survive in an environment of pH 7, and therefore, even when released from an outdoor culture tank to the external environment, the haploid microalgae is released. Environmental pollution is suppressed.
  • the culture period in the main culture step is not particularly limited, and the culture can be continued until a desired amount of biomass is obtained. Alternatively, the growth state of the microalgae may be confirmed, and the culture may be performed until the stationary phase is reached.
  • freshwater microalgae can be satisfactorily grown in a medium having a low pH and a high sodium ion concentration in a short induction period from the start of culture. Therefore, even in the case of outdoor culture, invasion of other organisms can be effectively suppressed. Also, microalgae belonging to the class Ideyugome (especially haploids) die under neutral conditions, so that microalgae belonging to the class Ideyugome (especially haploids) may be released from the mass culture system into the environment. Biological containment, if any, is possible. Therefore, the present invention can be suitably applied to outdoor large-scale culture of freshwater microalgae that produces useful substances.
  • the present invention provides a method for producing a freshwater microalgae capable of growing on a medium prepared to have a hydrogen ion concentration of pH 1.0 to 6.0 and a sodium ion concentration of 0.5 M or more.
  • the method for producing a freshwater microalgae according to the present embodiment is characterized in that a freshwater microalgae that cannot grow on a medium having a sodium ion concentration of 0.5 M or more is treated with a hydrogen ion concentration of pH 1.0 to 6.0 and a sodium ion concentration of 0.1.
  • the freshwater microalgae used in the method of the present embodiment is a freshwater microalga that cannot grow on a medium having a sodium ion concentration of 0.5 M or more. Whether the freshwater microalgae cannot grow on a medium having a sodium ion concentration of 0.5 M or more is determined by culturing the target freshwater microalgae on a medium having a sodium ion concentration of 0.5 M or more, and over time. It can be confirmed by measuring the cell turbidity (OD 750 ).
  • the freshwater microalgae can be determined to be a freshwater microalga that cannot grow on a medium having a sodium ion concentration of 0.5 M or more. Further, the freshwater microalgae are preferably capable of growing at a pH of 1.0 to 6.0. Examples of such freshwater microalgae include haploids of microalgae belonging to the genus Cyanidium. Specific examples of haploid microalgae belonging to the genus Cyanidium include the HKN1 strain (haploid) and the YFU3 strain (haploid).
  • the method of the present embodiment includes a step of culturing the freshwater microalgae as described above in a medium having a sodium ion concentration of 0.1 to 0.4 M and a pH of 1.0 to 6.0. This step can be performed in the same manner as in “[Pre-culture step]” of the above “ ⁇ Culture method of freshwater microalgae>”.
  • salt-tolerant freshwater microalgae having no salt tolerance can be grown in a pH 1.0 to 6.0 medium having a sodium chloride concentration of 0.5 M or more by imparting salt tolerance.
  • a freshwater microalgae can be obtained.
  • invasion of other organisms is suppressed.
  • microalgae belonging to the class Ideyugome (especially haploids) die under neutral conditions, so that microalgae belonging to the class Ideyugome (especially haploids) may be released from the mass culture system into the environment.
  • Biological containment, if any, is possible. Therefore, the freshwater microalgae can be suitably used for outdoor mass culture.
  • the haploid microalgae belonging to the class Ideugome grows in a medium having a high salt concentration such as 0.5 M of sodium ion concentration. Diploids cannot grow. However, if the culture method according to one embodiment of the present invention obtains salt tolerance during the pre-culture period, it can grow even in a medium having a sodium ion concentration of 0.5M. At this time, there is a feature that logarithmic growth is started after a shorter induction period than during the pre-culture period, and this feature is the same even when the medium is further subcultured.
  • the haploid algae of the present invention which has acquired salt tolerance, do not grow or grow poorly when they are subcultured in a MA medium to which NaCl is not added. Whether the growth is good or not can be determined by comparing with the culture conditions of the control. In one embodiment of the present invention, the number of cells in the initial state of the culture and the number of cells increased during a predetermined period have elapsed. Consider depending on the ratio. Specifically, it is calculated by the equation (1). The number of cells is determined by measuring the absorbance OD of the culture solution at 750 nm. The predetermined period is 7 days. When the value of the formula (1) is 2 or more, the growth is good, and when the value is less than 2, the growth is poor.
  • the causes of poor growth are that it takes time to acclimate to environmental conditions, and that the haploid microalgae belonging to the class Ideugome belong to the osmotic pressure of hypertonic solution because they do not have strong cell walls. May have been destroyed and died. Although it is conceivable to observe that cells have been destroyed by using a microscope, it is difficult to ensure quantitativeness. Therefore, in one embodiment of the present invention, quantitative consideration is performed by measuring the amount of phycocyanin, which is the content of cells.
  • the present invention is a haploid microalgae belonging to the class Ideugome, in a MA medium prepared to have a hydrogen ion concentration of pH 2.0 and a sodium ion concentration of 0.5 M, and a culture temperature of 42 ° C.
  • the value calculated by the following formula (1) when cultured for 7 days with continuous light having a carbon dioxide concentration of 2% and an illuminance of 60 ⁇ mol / m 2 s is 2 or more.
  • a haploid microalgae belonging to the class Ideyugome which has a value calculated by the following formula (1) of less than 2 when statically cultured with continuous light having a carbon dioxide concentration of 2% and an illuminance of 60 ⁇ mol / m 2 s for 7 days.
  • I will provide a. (OD 750 value after culture initiation 7 days - OD 750 value at the start of cultivation) / culture speed indicated by (7 ⁇ culture at the start OD 750 value) (1)
  • the “MA medium prepared to have a hydrogen ion concentration of pH 2.0 and a sodium ion concentration of 0.5 M” is a medium described in Table 5 in Examples (hereinafter, also referred to as “MA + 0.5 M NaCl medium”).
  • the haploid microalgae belonging to the class Acacia sapiens of the present embodiment can grow on MA + 0.5M NaCl medium.
  • the growth rate calculated by the following formula (1) is obtained by static culture in MA + 0.5M NaCl medium under the conditions of a culture temperature of 42 ° C., a carbon dioxide concentration of 2%, and an illuminance of 60 ⁇ mol / m 2 s in continuous light. Is 2 or more. (OD 750 value after culture initiation 7 days - OD 750 value at the start of cultivation) / (7 ⁇ culture at the start OD 750 value) (1)
  • the “OD 750 value at the start of culture” means the absorbance of the culture solution measured at a wavelength of 750 nm at the start of culture (0 hour).
  • a haploid microalgae belonging to the class Ideugome is inoculated into a MA + 0.5M NaCl medium so that the OD 750 at the start of the culture is 0.1, and the culture is started.
  • the “OD 750 value 7 days after the start of culture” means the absorbance of the culture solution measured at a wavelength of 750 nm seven days (168 hours) after the start of culture.
  • the absorbance of the culture solution can be measured with an absorbance meter.
  • the cultivation is carried out by stationary culturing for 7 days under the conditions of a continuous temperature of 42 ° C., a carbon dioxide concentration of 2%, and an illuminance of 60 ⁇ mol / m 2 s.
  • the culture scale is not particularly limited.
  • the culture can be performed using a 24-well plate with 1 mL of a culture solution.
  • haploid microalgae belonging to the class of the natural genus Ideugome cannot grow on MA + 0.5M NaCl medium. Therefore, when the haploid microalgae belonging to the class of the natural genus Ideugome are cultured in the MA + 0.5M NaCl medium, the value calculated by the above formula (1) is less than 2. However, since the haploid microalgae belonging to the class Ideugome belonging to the class of the present invention have resistance to a high sodium ion concentration, they can be satisfactorily grown even in a MA + 0.5M NaCl medium.
  • the value calculated by the above formula (1) becomes 2 or more.
  • the value of the haploid microalgae belonging to the class Acacia lutea of the present embodiment, when cultured in MA + 0.5M (NaCl medium, is preferably 3 or more, and more preferably 4 or more. Is more preferable.
  • the haploid microalgae belonging to the class Ideugome of the present embodiment are cultured in a MA medium at 42 ° C. under a continuous light having a carbon dioxide concentration of 2% and an illuminance of 60 ⁇ mol / m 2 s.
  • the value calculated by the equation (1) is less than 2.
  • the MA medium is a medium described in Table 1 in Examples.
  • a haploid of a microalga belonging to the class Lepidoptera is inoculated into a MA medium so that the OD 750 at the start of the culture is 0.1, and the culture is started.
  • the cultivation is carried out by stationary culturing for 7 days under the conditions of a continuous temperature of 42 ° C., a carbon dioxide concentration of 2%, and an illuminance of 60 ⁇ mol / m 2 s.
  • the culture scale is not particularly limited.
  • the culture can be performed using a 24-well plate with 1 mL of a culture solution.
  • the value calculated by the above formula (1) is usually 2 or more.
  • the haploid microalgae belonging to the class Lepidoptera of the present embodiment have resistance to a high sodium ion concentration, but have a reduced ability to grow at a low sodium ion concentration. Therefore, when the haploid microalgae belonging to the class Ideugome of the present embodiment are cultured in the MA medium, the value calculated by the formula (1) becomes 2 or more.
  • the value calculated by the above formula (1) when cultured in an MA medium is preferably less than 1.8, and less than 1.5 or more. Is more preferable.
  • the haploid microalgae belonging to the class Ideugome of the present embodiment preferably have a mortality of 30% or more, more preferably 40% or more, and more preferably 50% or more when suspended in a MA medium. Is more preferable. If the kill rate is 30% or more, it is difficult for the algal cells to survive in an environment where the sodium ion concentration is low even if the algal cells are released into the environment. Therefore, even when cultured in an open culture system outdoors, contamination to the environment hardly occurs.
  • PC concentration represents a phycocyanin concentration.
  • the PC concentration can be determined by measuring the absorbance at 620 nm and 678 nm of the suspension after any one of the treatments 1 to 3, using a spectrophotometer equipped with an integrating sphere.
  • the PC concentration can be calculated from the absorbance at 620 nm and 678 nm by the following equation.
  • PC concentration ( ⁇ g / ml) 138.5 ⁇ A 620 ⁇ 35.49 ⁇ A 678
  • the haploid microalgae belonging to the class Lepidoptera of the present embodiment have one or more of the following characteristics (a) to (c), and the haploids of any of the following (a) to (c): It is more preferable to have the following three characteristics, and it is more preferable to have all the following characteristics (a) to (c).
  • the growth rate is lower for 7 days after the start of culture in a medium having a sodium ion concentration of 0.05 M or less and a pH of 1.0 to 6.0.
  • C Compared to the growth rate for 7 days after the start of culturing in a medium having a sodium ion concentration of 0.05 M or less and a pH of 1.0 to 6.0, the sodium ion concentration is 0.5 M or less and the sodium ion concentration is 0.5 M
  • the growth rate is high for 7 days after the start of the culture in the 6.0 medium.
  • Natural microalga belonging to the class Ideyugome refers to microalgae belonging to the class Ideyugome, which inhabits the natural world, or microalgae of the type having properties similar to those of the microalgae.
  • the natural microalgae may be isolated from nature and maintained by culturing in a medium having a sodium ion concentration of 0.05 M or less and a pH of 1.0 to 6.0.
  • Natural haploid of microalga belonging to the class Ideyugome is obtained from a haploid microalga belonging to the class Ideyugome belonging to the natural world or a diploid of a microalga belonging to the class Ideyugome belonging to the natural world.
  • a diploid microalgae belonging to the natural class Ideugome is cultured for a certain period of time (eg, about 1 to 3 weeks) in a medium prepared to have a sodium ion concentration of 0.05 M or less and a pH of 1.0 to 6.0. ), Meiotic microalgae cultured under certain conditions and physically selected under a microscope to obtain haploid microalgae belonging to the natural class Ideyugome.
  • Whether or not the haploid microalgae belonging to the class Ideyugome class has the characteristics of the above (a) is determined by combining the haploids of the microalgae and the natural microalgae of the same species as the microalgae with sodium ion It can be determined by culturing in a medium having a concentration of 0.5 M and having a pH of 1.0 to 6.0 and comparing the growth rates for 7 days after the start of culturing. If the growth rate is greater than a haploid of a natural microalgae, it is determined that the microalgae has the characteristics of the above (a).
  • Whether the haploid microalgae belonging to the class Ideyugome class has the characteristics of the above (b) is determined by combining the haploid microalgae with a natural microalgae of the same species as the microalgae with sodium ion It can be determined by culturing in a medium having a concentration of 0.05 M or less at a pH of 1.0 to 6.0 and comparing the growth rates for 7 days after the start of the culture. If the growth rate is lower than the haploid of a natural microalgae, it is determined that the microalgae has the characteristics of the above (b).
  • the haploids of the microalgae are determined to have a pH of 1.0 to 6.0 with a sodium ion concentration of 0.05 M or less. It can be determined by culturing in a medium of pH 0 and a medium having a sodium ion concentration of 0.5 M and a pH of 1.0 to 6.0, and comparing the growth rates in both mediums for 7 days after the start of the culture.
  • the growth rate in a medium having a sodium ion concentration of 0.5 M and a pH of 1.0 to 6.0 is lower than the growth rate in a medium having a sodium ion concentration of 0.05 M or less and a pH of 1.0 to 6.0. If it is larger, it is determined that the microalgae has the characteristics of the above (c).
  • Examples of the culture medium having a sodium ion concentration of 0.5 M and a pH of 1.0 to 6.0 and the culture medium having a sodium ion concentration of 0.05 M or less and a pH of 1.0 to 6.0 include the above-mentioned “ ⁇ Freshwater microalgae”. Culture method>”. Examples of the culture conditions in the above (a) to (c) include stationary culture under the conditions of continuous temperature of 42 ° C., carbon dioxide concentration of 2%, and illuminance of 60 ⁇ mol / m 2 s.
  • the culture scale is not particularly limited. For example, the culture can be performed using a 24-well plate with 1 mL of a culture solution.
  • the haploid of the microalgae belonging to the class Lepidoptera of the present embodiment can be obtained by the method for producing a freshwater microalgae of the embodiment.
  • haploids of microalgae belonging to the class Ideyugogome include haploids of cyanidiosison melorae, microalgae belonging to cyanidium, and haploids of microalgae belonging to genus Gardenia.
  • Specific examples of haploid microalgae belonging to the genus Cyanidium include the HKN1 strain (haploid) and the YFU3 strain (haploid).
  • haploid microalgae belonging to the genus Gardenia include G. cerevisiae.
  • a haploid of a microalga belonging to the genus Cyanidium or a genus of microalgae belonging to the genus Gardenia is preferable, a haploid of a microalga belonging to the genus Cyanidium is more preferable, and the HKN1 strain (haploid) or the YFU3 strain (haploid) ) Is more preferable, and the HKN1 strain (haploid) is particularly preferable.
  • the microalgae belonging to the class Lepidoptera of the present embodiment can grow on a medium having a sodium ion concentration of 0.6 M or more and a pH of 1.0 to 6.0, and a pH of 1.0 or more having a sodium ion concentration of 0.7 M or more. More preferably, the medium can grow in a medium having a sodium ion concentration of 0.9 M or more, more preferably in a medium having a sodium ion concentration of 0.9 M or more. It is particularly preferred that the medium can grow in a medium of 0.0 to 6.0.
  • the microalgae belonging to the class Acacia catechu of the present embodiment may be capable of growing on a medium having a sodium ion concentration of 1 M or more and a pH of 1.0 to 6.0.
  • the microalgae belonging to the class Ideugome of the present embodiment are cultured in a medium having a sodium ion concentration of 0.5 M and having a pH of 1.0 to 6.0, and then cultured at pH 1.0 to 6.0 having a sodium ion concentration of 0.5 M. It is preferable that the growth rate is maintained even when the cells are subcultured on a new medium. This allows the microalgae of the present embodiment to be subcultured and maintained in a medium having a sodium ion concentration of 0.5 M and a pH of 1.0 to 6.0.
  • microalgae of the present embodiment maintained as described above can be satisfactorily proliferated even if the microalgae of the present embodiment is cultured at a desired time in a large amount in a medium having a sodium ion concentration of 0.5 M and a pH of 1.0 to 6.0. be able to.
  • the seawater contains at least a nitrogen-containing salt, a phosphorus-containing salt, and an iron-containing salt.
  • Good growth can be achieved using a culture medium that has been added and adjusted to pH 1.0 to 6.0. Specific examples of such a medium include those similar to those described in “[Main culture step]” of “ ⁇ Culture method for freshwater microalgae>”.
  • the haploid microalgae belonging to the class Ideugome of the present embodiment can satisfactorily proliferate in an environment having a high sodium ion concentration and a low pH, they can be suitably used for outdoor mass culture.
  • M-Allen medium having the composition shown in Table 1 was prepared. Specifically, medium components other than A2 Fe stock were mixed, adjusted to pH 2.0 with sulfuric acid, and then sterilized by an autoclave. After autoclaving, 4 mL of filter-sterilized A2Fe stock was added to obtain a MA medium. Tables 2 and 3 show the compositions of A2 trace element and A2 Fe stock, respectively.
  • Tables 4 and 5 show the compositions of the MA + 0.3M NaCl medium and the MA + 0.5M NaCl medium, respectively.
  • A2 @ trace @ element and A2 @ Fe @ stock in Tables 4 and 5 are as shown in Tables 2 and 3, respectively.
  • each medium when used for pre-culture or main culture, each medium may be described as follows.
  • MA medium Medium (A) MA + 0.3M NaCl medium: Medium (B) MA + 0.5M NaCl medium: Medium (C)
  • MA medium When used for main culture MA medium: Medium (a) MA + 0.3M NaCl medium: Medium (b) MA + 0.5M NaCl medium: Medium (c)
  • the growth status of the microalgae was confirmed by cell turbidity (OD 750 ). Specifically, the absorbance at 750 nm of the algae culture was measured using an absorbance meter (SmartSpec Plus from BIO-RAD) to determine the cell turbidity (OD 750 ).
  • Cyanidium sp. HKN1 was cultured by static culture in a CO 2 incubator in both preculture and main culture, unless otherwise specified.
  • the culture temperature was 42 ° C., continuous light having an illuminance of 60 ⁇ mol / m 2 s was used, and the CO 2 concentration was 2%.
  • the culture was performed in a 24-well plate with 1 mL of the culture solution.
  • the culture of Xianidiosisone merolae 10D was performed by aeration culture (300 mL ambient air / min) in both preculture and main culture unless otherwise specified.
  • the culture temperature was 42 ° C., and continuous light having an illuminance of 60 ⁇ mol / m 2 s was used.
  • the culture was performed in a 24-well plate with 1 mL of the culture solution.
  • the culture was performed in a 24-well plate with 1 mL of the culture solution.
  • DAPI staining As follows. After adding glutaraldehyde to the culture solution to a final concentration of 1% (w / v), DAPI was added to the culture solution to a final concentration of 3 ⁇ g / mL, and observed with a fluorescence microscope.
  • vacuoles The presence of vacuoles was observed by quinacrine staining as follows. After adding a 1 M Tris-HCl (pH 8.0) buffer to the culture solution to a final concentration of 100 mM, quinacrine was added to a final concentration of 40 ⁇ g / mL, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 15 minutes. . After centrifugation (1500 g, 5 minutes), the supernatant was discarded, the MA medium was added to the precipitate, the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 30 minutes, and observed with a fluorescence microscope.
  • Tris-HCl pH 8.0
  • HKN1 Cyanidium sp. HKN1 (haploid) (hereinafter sometimes abbreviated as "HKN1 (haploid)”) was pre-cultured for one week using an MA medium (medium (A)). After the preculture, the culture was statically cultured for 7 days using the medium (a), (b), or (c) (main culture). During the culture, to measure over time media OD 750, was confirmed growth situation of HKN1 (1 haploid). HKN1 (haploid) was pre-cultured for one week using MA + 0.3 M NaCl (medium (B)). After the preculture, the culture was statically cultured for 7 days using the medium (a), (b), or (c) (main culture). During the culture, to measure over time media OD 750, was confirmed growth situation of HKN1 (1 haploid). The results are shown in Table 6 and FIG. FIG. 1 is a graph showing changes in OD 750 shown in Table 1.
  • Example 2 Nazyme 10 (surface water: Japan QCE bluelab division) was used as natural seawater. Each component of the MA medium was added to seawater (Nazyme 10), and HKN1 (haploid) was cultured, and it was confirmed which component in the MA medium contributed to the growth of HKN1 (haploid).
  • the media used in the main culture are shown in Tables 7 and 8.
  • MA media components shown in Tables 7 and 8 were added to Nazyme 10, and the pH was adjusted to 2.0 with sulfuric acid to prepare Media 1 to 17. Since magnesium and calcium were abundant in seawater, MgSO 4 and CaCl 2 were not added to the culture media 1 to 16. Medium 17 was supplemented with MgSO 4 and CaCl 2 corresponding to MA medium as a positive control.
  • HKN1 (haploid) was pre-cultured for one week in MA + 0.3M NaCl medium (medium (B)), and then main-cultured in MA + 0.5M NaCl medium (positive control) (medium (c)) or seawater medium for 7 days. did. During the culture, to measure over time media OD 750, was confirmed growth situation of HKN1 (1 haploid). The results are shown in Table 10 and FIG. FIG. 2 is a graph showing changes in OD 750 shown in Table 10.
  • HKN1 haploid
  • Example 4 In order to confirm the influence of pH on the growth of HKN1 (haploid), seawater media in which the pH was changed between pH 2 and 7 were prepared. The pH was adjusted using sulfuric acid or potassium hydroxide. HKN1 (haploid) was pre-cultured with MA + 0.3M NaCl (medium (B)) for one week, and then main-cultured for 7 days in each seawater medium whose pH was adjusted as described above. After completion of the main culture, the OD 750 of the final medium was measured to confirm the growth status of HKN1 (haploid). The results are shown in Table 11 and FIG. FIG. 3 is a graph of OD 750 shown in Table 11.
  • HKN1 haploid
  • Table 11 and FIG. 3 HKN1 (haploid) was able to grow at pH 6 or lower, but was not able to grow at pH 7.
  • the pH decreases with the growth of the algae. Therefore, it is necessary to maintain a pH around neutral by adding a buffer or an alkaline substance. .
  • HKN1 (diploid) Cyanidium sp. HKN1 (diploid) (hereinafter sometimes abbreviated as "HKN1 (diploid)”) was pre-cultured for one week using an MA medium (medium (A)). After the preculture, the culture was statically cultured for 7 days using the medium (a), (b), or (c) (main culture). During the main culture, the OD 750 of the medium was measured over time to confirm the growth status of HKN1 (diploid). HKN1 (diploid) was pre-cultured for one week using MA + 0.3M NaCl (medium (B)). After the preculture, the culture was statically cultured for 7 days using the medium (a), (b), or (c) (main culture). During the main culture, the OD 750 of the medium was measured over time to confirm the growth status of HKN1 (diploid). The results are shown in Table 12 and FIG. FIG. 4 is a graph showing changes in OD 750 shown in Table 12.
  • HKN1 diploid
  • HKN1 (diploid) was pre-cultured in MA + 0.3M NaCl medium (medium (B)) for one week, and then main-cultured in MA + 0.5M NaCl medium (positive control) (medium (c)) or seawater medium for 7 days. did.
  • the OD 750 of the medium was measured over time to confirm the growth status of HKN1 (diploid). The results are shown in Table 13 and FIG. FIG. 5 is a graph showing changes in OD 750 shown in Table 13.
  • HKN1 diploid
  • Xianidiosisone merolae 10D (hereinafter sometimes abbreviated as “10D”) was pre-cultured for one week using an MA medium (medium (A)). After the preculture, the culture was statically cultured for 7 days using the medium (a), (b), or (c) (main culture). During the main culture, the OD 750 of the medium was measured over time to confirm the growth status of 10D. In addition, 10D was pre-cultured for one week using MA + 0.3M NaCl (medium (B)). After the preculture, the culture was statically cultured for 7 days using the medium (a), (b), or (c) (main culture). During the main culture, the OD 750 of the medium was measured over time to confirm the growth status of 10D. The results are shown in Table 14 and FIG. FIG. 6 is a graph showing changes in OD 750 shown in Table 14.
  • 10D showed the same growth when the preculture was the medium (A) and when the main culture was the medium (a) and the medium (b).
  • the main culture was the medium (c) when the main culture was the medium (c), the OD 750 gradually decreased until the third day of the main culture, but recovered on the fifth day, and thereafter, the growth rate was equivalent to that of the medium (a) and the medium (b). showed that.
  • the preculture was the medium (B) even when the main culture was the medium (c), the same growth as in the above medium (a) and medium (b) was shown from the start of the culture.
  • Example 8 10D was pre-cultured for one week in MA + 0.3M NaCl medium (medium (B)), and then main-cultured in MA + 0.5M NaCl medium (positive control) (medium (c)) or seawater medium for 7 days. During the main culture, the OD 750 of the medium was measured over time to confirm the growth status of 10D. The results are shown in Table 15 and FIG. FIG. 7 is a graph showing changes in OD 750 shown in Table 15.
  • 10D showed the same growth rate when the main culture was performed in either the medium (c) or the seawater medium.
  • HKN1 (haploid) in a MA medium culture was precultured for one week in the MA medium + 0.3 M NaCl, and then transplanted to the MA medium + 0.5 M NaCl medium, and then cultured for 7 days in a CO 2 incubator (2% CO 2 ). This was designated as MA medium + 0.5M NaCl medium culture product.
  • HKN1 (haploid) cultured for one week in MA medium was pre-cultured for one week in MA medium + 0.3 M NaCl, then transplanted to seawater medium, and allowed to stand in a CO 2 incubator (2% CO 2 ) for 7 days.
  • the cells were cultured. This was used as a seawater medium culture product.
  • qualitative analysis of polyphosphoric acid was performed by DAPI, and qualitative analysis of vacuoles was performed by quinacrine.
  • FIG. 8 shows the results.
  • the MA medium culture, the MA medium + 0.5M NaCl medium culture, and the seawater medium culture were stained with DAPI, polyphosphoric acid was observed only in the MA medium culture.
  • the vacuoles, which are said to contain polyphosphoric acid were stained with quinacrine, there was no difference in how the vacuoles were stained.
  • Example 10 Culture was performed in the same manner as in Example 9 except that HKN1 (diploid) was used as the algae, and three types of cultures of a MA medium culture product, a MA medium + 0.5M NaCl medium culture product, and a seawater medium culture product were performed. The product was manufactured.
  • qualitative analysis of polyphosphoric acid was performed by DAPI, and qualitative analysis of vacuoles was performed by quinacrine.
  • FIG. 9 shows the results. Polyphosphoric acid could not be confirmed in the MA medium culture product, but in the MA medium + 0.5 M NaCl medium culture product and the seawater culture product, polyphosphoric acid was observed mainly in the vicinity of the surface layer. In addition, vacuoles that are said to contain polyphosphoric acid were similarly observed in all cultures.
  • Example 11 10D was pre-cultured for one week using MA medium (medium (A)) or MA + 0.3M NaCl (medium (B)). After the preculture, main culture was performed for 7 days in an MA medium in which the NaCl concentration was changed between 0 and 1000 mM. After completion of the main culture, the final OD 750 of the medium was measured to confirm the growth status of 10D. Table 16 shows the results. After the preculture in the medium (B), the algal cells obtained by main culture of 10D in a MA + 0.5M NaCl medium (medium (c)) for 7 days were used to obtain the algae cells in the MA medium (medium (a)) or MA + 0. The cells were subcultured in a 5M NaCl medium (medium (c)) and cultured for further 7 days. After the completion of the culture, the final OD 750 of the medium was measured to confirm the growth status of 10D. Table 17 shows the results.
  • the OD 750 of the medium at the start of main culture and at the time of subculture was adjusted to 0.1.
  • Table 17 “Formulas (1)-(A)” indicate values calculated by Formula (1) for microalgae that were precultured in the medium (A) and then main cultured at the NaCl concentrations shown in the table. “Formulas (1)-(B)” indicate the values calculated by the formula (1) for the microalgae pre-cultured in the medium (B) and then main-cultured at the NaCl concentration shown in the table.
  • the OD 750 is ⁇ 0.1, the value cannot be calculated by the equation (1), and therefore, “ ⁇ ” is used.
  • HKN1 (haploid) was pre-cultured for one week using MA medium (medium (A)) or MA + 0.3M NaCl (medium (B)). After the preculture, main culture was performed for 7 days in an MA medium in which the NaCl concentration was changed between 0 and 1000 mM. After completion of the main culture, the OD 750 of the final medium was measured to confirm the growth status of HKN1 (haploid). The results are shown in Table 18.
  • algal cells obtained by main culture of HKN1 (haploid) in a MA + 0.5M NaCl medium (medium (c)) for 7 days were transferred to an MA medium (medium (a) )) Or MA + 0.5M NaCl medium (medium (c)) and further cultured for 7 days.
  • the OD 750 of the final medium was measured to confirm the growth status of HKN1 (haploid). The results are shown in Table 19.
  • Example 13 HKN1 (diploid) was pre-cultured for one week using MA medium (medium (A)) or MA + 0.3M NaCl (medium (B)). After the preculture, main culture was performed for 7 days in an MA medium in which the NaCl concentration was changed between 0 and 1000 mM. After completion of the cultivation, the OD 750 of the final medium was measured to confirm the growth situation of HKN1 (2 diploid). The results are shown in Table 20.
  • algal cells obtained by main culture of HKN1 (diploid) in a MA + 0.5M NaCl medium (medium (c)) for 7 days were transferred to an MA medium (medium (a) )) Or MA + 0.5M NaCl medium (medium (c)) and further cultured for 7 days.
  • the OD 750 of the final medium was measured to confirm the growth status of HKN1 (diploid). The results are shown in Table 21.
  • Galdieria partita (NBRC 102759) (haploid) was pre-cultured for one week using MA medium (medium (A)) or MA + 0.3M NaCl (medium (B)). After the preculture, main culture was performed for 7 days in an MA medium in which the NaCl concentration was changed between 0 and 1000 mM. After completion of the main culture, the final OD 750 of the medium was measured. The growth status of partita (haploid) was confirmed. The results are shown in Table 22.
  • G.A The algal cells obtained by main culturing partita (haploid) for 7 days were subcultured in MA medium (medium (a)) or MA + 0.5M NaCl medium (medium (c)) and cultured for further 7 days. After completion of the culture, the OD 750 of the final medium was measured. The growth status of partita (haploid) was confirmed. The results are shown in Table 23.
  • the growth pre-cultured in the medium (B) was more suppressed in the medium cultured in the NaCl ⁇ ⁇ 0 mM medium than in the culture pre-cultured in the medium (A).
  • those pre-cultured in the medium (B) had a lower growth inhibition rate than those pre-cultured in the medium (A).
  • FIG. Partita (diploid) was pre-cultured for one week using MA medium (medium (A)) or MA + 0.3M NaCl (medium (B)). After the preculture, main culture was performed for 7 days in an MA medium in which the NaCl concentration was changed between 0 and 1000 mM. After completion of the main culture, the final OD 750 of the medium was measured. The growth status of partita (diploid) was confirmed. The results are shown in Table 24.
  • G.A After pre-culture in the medium (B), G.A.
  • the algal cells obtained by main culture of partita (diploid) for 7 days were subcultured in MA medium (medium (a)) or MA + 0.5M NaCl medium (medium (c)), and further cultured for 7 days. After completion of the culture, the OD 750 of the final medium was measured. The growth status of partita (diploid) was confirmed. The results are shown in Table 25.
  • the growth in the medium having a high NaCl concentration tended to be improved as compared with the medium pre-cultured in the medium (A).
  • Galdieria sulphuraria (SAG108.79) (haploid) was pre-cultured for one week using MA medium (medium (A)) or MA + 0.3M NaCl (medium (B)). After the preculture, main culture was performed for 7 days in an MA medium in which the NaCl concentration was changed between 0 and 1000 mM. After completion of the main culture, the final OD 750 of the medium was measured. The growth status of Sulfuraria (haploid) was confirmed. The results are shown in Table 26.
  • G.A After pre-culture in the medium (B), G.A.
  • the algal cells obtained by main culture of Sulfuraria (haploid) for 7 days were subcultured in MA medium (medium (a)) or MA + 0.5M NaCl medium (medium (c)), and further cultured for 7 days. After completion of the culture, the OD 750 of the final medium was measured. The growth status of Sulfuraria (haploid) was confirmed. The results are shown in Table 27.
  • FIG. Sulfuraria (diploid) was precultured for one week using MA medium (medium (A)) or MA + 0.3M NaCl (medium (B)). After the preculture, main culture was performed for 7 days in an MA medium in which the NaCl concentration was changed between 0 and 1000 mM. After completion of the main culture, the final OD 750 of the medium was measured. The growth status of Sulfuraria (diploid) was confirmed. The results are shown in Table 28.
  • G.A The algal cells obtained by main culture of S. sulphuraria (diploid) for 7 days were subcultured in MA medium (medium (a)) or MA + 0.5M NaCl medium (medium (c)), and further cultured for 7 days. After completion of the culture, the OD 750 of the final medium was measured. The growth status of Sulfuraria (diploid) was confirmed. The results are shown in Table 29.
  • the growth in the medium with a high NaCl concentration tended to be higher in the medium pre-cultured in the medium (B) than in the medium pre-cultured in the medium (A).
  • the preculture was performed at a NaCl concentration of 0.3 M, and the NaCl of 0.5 M or more was compared with the preculture performed at 0 M NaCl. It was confirmed that the growth in the main culture at the concentration was improved. As a result, the value calculated by the equation (1) became 2 or more. In addition, after culturing at a NaCl concentration of 0.3 M or more, it was confirmed that the growth at a 0 M NaCl concentration was suppressed as compared with the case of pre-culturing with 0 M NaCl.
  • the growth rate in a medium having a NaCl concentration of 0.5 M tended to be higher than that in a medium having a NaCl concentration of 0 M. It was also confirmed that after main culture at a NaCl concentration of 0.5 M, it was possible to subculture to a medium having a NaCl concentration of 0.5 M. In addition, it was confirmed that by performing the preculture at a NaCl concentration of 0.3 M, even a haploid freshwater microalgae could grow in a high NaCl concentration range of 500 to 1000 mM. When outdoor culture is assumed, salt concentration may fluctuate during culture due to evaporation of water or inflow of rainwater.
  • HKN1 (haploid) was pre-cultured in MA + 0.3M NaCl medium (medium (B)) for 7 days, and further pre-cultured in seawater medium for one week.
  • the above-mentioned HKN1 (haploid) was subcultured in 10 L of a seawater medium, and main culture was performed.
  • the main culture was performed in a greenhouse, and the light, temperature, and CO 2 concentration were not controlled.
  • the main culture was performed by aeration culture, and the culture period was from May 13, 2019 to July 1, 2019.
  • the culture was sampled periodically and the absorbance at 750 nm was measured. The result is shown in FIG. As shown in FIG. 10, it was confirmed that even on a 10 L scale, it was possible to grow well in a seawater medium.
  • HKN1 (haploid) was cultured in MA medium, MA + 0.3M NaCl medium, or MA + 0.5 NaCl medium for 7 days.
  • the culture was centrifuged (1500 ⁇ g, 5 minutes), the supernatant was removed, and the pellet was collected.
  • Each algal cell collected as a pellet was treated by any of the following treatments 1 to 3.
  • Treatment 1 Suspended in 2 mL of MA medium and vortexed for 10 minutes.
  • Treatment 2 Suspended in 2 mL of the same medium as used in the above culture, and vortexed for 10 minutes.
  • Treatment 3 After suspending in 0.1 mL of the same medium as that used for the culture, freeze at -196 ° C., make up to 2 mL with the same medium as the medium used for the culture, and vortex for 10 minutes. Shake.
  • the kill rate of the algal cells by Treatment 1 was calculated by the following formula.
  • ⁇ Death rate (%) ⁇ (PC concentration after treatment 2 ⁇ PC concentration after treatment 1) / (PC concentration after treatment 2 ⁇ PC concentration after treatment 3) ⁇ ⁇ 100
  • PC concentration was measured by measuring the absorbance at 620 nm and 678 nm using a spectrophotometer (UV-2600; Shimadzu Corporation) equipped with an integrating sphere (ISR-2600Plus; Shimadzu Corporation).
  • the PC concentration was calculated by the following equation.
  • PC concentration ( ⁇ g / ml) 138.5 ⁇ A 620 ⁇ 35.49 ⁇ A 678
  • Example 20 The killing rate of algal cells by the above treatment 1 was calculated in the same manner as in Example 19, except that 10D was used instead of HKN1 (haploid). The results are shown in Table 31.
  • Example 21 G.K. Except for using partita (haploid), the killing rate of algal cells by the treatment 1 was calculated in the same manner as in Example 19. Table 32 shows the results.
  • Example 22 G.K. Except for using Sulfuraria (haploid), the killing rate of algal cells by the treatment 1 was calculated in the same manner as in Example 19. The results are shown in Table 33.
  • freshwater microalgae which can satisfactorily grow freshwater microalgae in a low pH and high sodium ion concentration environment, and can be satisfactorily grown in a low pH and high sodium ion concentration environment And a method for producing the freshwater microalgae.
  • freshwater microalgae can be cultured in large quantities with inexpensive seawater, which is useful for producing useful substances using algae. Furthermore, if freshwater microalgae are cultured in large quantities, they are expected to absorb atmospheric carbon dioxide.

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Abstract

淡水産微細藻類の培養方法であって、淡水産細藻類を、水素イオン濃度ｐＨ１．０～６．０、ナトリウムイオン濃度０．１～０．４Ｍとなるように調製した培地で、培養温度が１５～６０℃で培養する培養工程を含む、淡水産微細藻類の培養方法。

Description

淡水産微細藻類の培養方法
　本発明は、淡水産微細藻類の培養方法に関する。また、耐塩性が付与された淡水産微細藻類の生産方法及び当該生産方法により得られた耐塩性の淡水産微細藻類に関する。より具体的には、屋外大量培養、特に海水での屋外大量培養に適した淡水産微細藻類及びその生産方法に関する。
　本願は、２０１８年１０月２日に、日本に出願された特願２０１８－１８７７６３号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　微細藻類は、陸上植物と比較して、高い二酸化炭素固定能力を有すること、及び農産物と生育場所が競合しないことから、いくつかの種は、大量培養されて、飼料、機能性食品、化粧品材料等として産業的に利用されている。
　微細藻類の産業上利用については、コスト面等から、高価な機能性食品等の利用形態に限られている。微細藻類の生産コストを抑制して産業利用を促進するためには、屋外における大量培養が好ましい。屋外大量培養は、管理が簡易などの特徴を有するものの、コンタミネーションのリスクがあり、また直接外部環境の影響を受けるほか、藻類捕食者等の侵入も問題となる。そのようなリスクを回避するため、屋外大量培養を行う微細藻類としては、環境変動（光、温度等）に耐性を有すること、他の生物が生存できないような条件で培養できること、高密度まで増殖可能であること、等の条件が求められる。
　そのため、現在までに、産業的に実用化されているのは、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、ユーグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ）、ドナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）、スピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）等の数種に限られている。これらの藻類種は、屋外大量培養に成功しており、機能性食品やサプリメントの原料として利用されている。
　他の生物が生存できない環境としては、例えば、海水のような高塩濃度環境が挙げられる。有用微細藻類を高塩濃度培地で培養することに関しては、例えば、特許文献１～３の報告がある。
　特許文献１には、耐塩性藻類を、段階的に塩濃度を増加させた培地で培養することを特徴とする油脂成分を産生する方法が記載されている。特許文献１に記載の方法では、２２０ｎｍの波長において、培地中の硝酸塩含有量を測定した場合、該含有量が、１０ｍｇ/Ｌ以下となるときに、２段階目の塩濃度を増加させることを特徴としている。
　特許文献２には、淡水に生息し、炭化水素類産生能を有する藻類シュードコリシスチス・エリプソイディア（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ　ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ）の培養において、その炭化水素生産能の生産性を高めるために、培養を開始してから培地の光学濃度が飽和状態を示す光学濃度の２分の１の光学濃度に達するまでの間に、培地に塩を投入することが開示されている。
　特許文献３には、ドコサヘキサエン酸を産生するクリプセコディニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ)属の培養において、藻体内にドコサヘキサエン酸を蓄積させるために、培養液の食塩濃度を前記藻類の生育に好適な食塩濃度より０．１～１０重量％高い値に設定して培養する方法が開示されている。
　特許文献１～３に記載の方法は、微細藻類に塩ストレスを与えて、炭化水素生産能やドコサヘキサエン酸生産能を高めようとするものであり、屋外培養におけるコンタミネーションリスクの抑制を目的とするものではない。
　一方、単細胞原始紅藻であるイデユコゴメ綱（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）に属する微細藻類は、硫酸酸性温泉において優先増殖する。イデユコゴメ綱には、シアニディオシゾン（Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ）属、シアニジウム（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ）属、ガルデリア（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ）属がある。シアニディオシゾン属に属するシアニディオシゾン・メロラエ（Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ　ｍｅｒｏｌａｅ）は、強固な細胞壁を有さない。シアニディオシゾン・メロラエは、極めて単純な細胞小器官セットにより構成されており、ゲノム配列の解読が完了している。そのため、光合成生物の基礎研究のためのモデル生物として利用されており、遺伝子改変技術の開発も進められている（非特許文献１、２）。
国際公開第２０１５／２５５５２号 特開２０１３－１０２７４８号公報 特開平０７－０７５５５７号公報
Fujiwara T et al.(2013) Gene targeting in the red alga Cyanidioschyzon merolae: single- and multi-copy insertion using authentic and chimeric selection markers. PLOS ONE. Sep 5;8(9):e73608. Fujiwara T et al.(2015) A nitrogen source-dependent inducible and repressible gene expression system in the red alga Cyanidioschyzon merolae. Front Plant Sci. Aug 26;6:657.
　イデユコゴメ綱に属する淡水産の好酸性微細藻類は、他の生物が生育できないような酸性環境下で生育可能であり、屋外培養に適している。これらの微細藻類に、高塩濃度耐性を付与できれば、酸性かつ高塩濃度の環境で培養することができ、屋外培養時のコンタミネーションリスクがさらに低下する。また、培養に海水を利用することができれば、培養コストを抑制することができる。
　そこで、本発明は、低ｐＨ且つ高ナトリウムイオン濃度環境下で淡水産微細藻類を良好に増殖させることができる淡水産微細藻類の培養方法、低ｐＨ且つ高ナトリウムイオン濃度環境下で良好に増殖可能な淡水産微細藻類、及び当該淡水産微細藻類の生産方法を提供することを課題とする。
　本発明は、以下の態様を含む。
［１］微細藻類の培養方法であって、淡水産微細藻類を、水素イオン濃度ｐＨ１．０～６．０、ナトリウムイオン濃度０．１～０．４Ｍとなるように調製した培地で、培養温度が１５～６０℃で培養する培養工程を含む、淡水産微細藻類の培養方法。
［２］淡水産微細藻類の培養方法であって、淡水産微細藻類を、水素イオン濃度ｐＨ１．０～６．０、ナトリウムイオン濃度０．１～０．４Ｍとなるように調製した培地で培養する前培養工程と、前記前培養工程後の淡水産微細藻類を、ナトリウムイオン濃度が前記前培養工程における前記ナトリウムイオン濃度の１．２～５倍であり水素イオン濃度ｐＨ１．０～６．０となるように調製した培地で培養する本培養工程と、を含む、［１］に記載の淡水産微細藻類の培養方法。
［３］前記本培養工程における前記培地が、水素イオン濃度ｐＨ１．０～６．０、ナトリウムイオン濃度０．５Ｍ以上となるように調製した培地である、［１］又は［２］に記載の淡水産微細藻類の培養方法。
［４］前記本培養工程における前記培地が、水素イオン濃度ｐＨ１．０～６．０、ナトリウムイオン濃度０．４Ｍ以上となるように調製した培地である、［１］又は［２］に記載の淡水産微細藻類の培養方法。
［５］前記本培養工程における前記培地が、海水に、窒素含有塩、リン含有塩及び鉄含有塩を少なくとも添加し、且つ水素イオン濃度ｐＨ１．０～６．０となるように調製した培地である、［１］～［４］のいずれかに記載の淡水産微細藻類の培養方法。
［６］前記淡水産微細藻類が、イデユコゴメ綱に属する微細藻類である、［１］～［５］のいずれか１つに記載の淡水産微細藻類の培養方法。
［７］ナトリウムイオン濃度が０．５Ｍ以上である培地で増殖できない淡水産微細藻類を、水素イオン濃度ｐＨ１．０～６．０、ナトリウムイオン濃度０．１～０．４Ｍとなるように調製した培地で培養する工程を含む、水素イオン濃度ｐＨ１．０～６．０、ナトリウムイオン濃度０．５Ｍ以上となるように調製した培地で増殖可能な淡水産微細藻類の生産方法。
［８］前記淡水産微細藻類が、シアニジウム属に属する微細藻類の１倍体である、［７］に記載の淡水産微細藻類の生産方法。
［９］前記淡水産微細藻類が、ガルデリア属に属する微細藻類の１倍体である、［７］に記載の淡水産微細藻類の生産方法。
［１０］イデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体であって、水素イオン濃度ｐＨ２．０、ナトリウムイオン濃度０．５Ｍとなるように調製したＭ－Ａｌｌｅｎ培地で、培養温度４２℃、二酸化炭素濃度２％、照度６０μｍｏｌ／ｍ２ｓの連続光で７日間静置培養したときの下記式（１）で算出される値が２以上であり、水素イオン濃度ｐＨ２．０となるように調製したＭ－Ａｌｌｅｎ培地で、培養温度４２℃、二酸化炭素濃度２％、照度６０μｍｏｌ／ｍ２ｓの連続光で７日間静置培養したときの下記式（１）で算出される値が２未満である、イデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体。
　（培養開始７日後のＯＤ７５０値－培養開始時のＯＤ７５０値）／（７×培養開始時ＯＤ７５０値）　　（１）
［１１］水素イオン濃度ｐＨ７の等張液、または蒸留水中で細胞が破裂する、［１０］に記載のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体。
［１２］藻類細胞の乾燥処理を行い、前記乾燥処理後の細胞をｐＨ７の等張液に懸濁すると、前記細胞が破裂する、［１０］または［１１］に記載のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体。
［１３］前記［１０］～［１２］のいずれか１つに記載のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体を、海水に、窒素含有塩、リン含有塩及び鉄含有塩を少なくとも添加し、且つ水素イオン濃度ｐＨ１．０～６．０となるように調製した培地で培養することを含む、イデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体の培養方法。
［１４］前記［１０］～［１２］のいずれか１つに記載のイデユコゴメ綱に属する微細藻類を屋外で培養することを含む、イデユコゴメ綱に属する微細藻類１倍体の培養方法。
［１５］淡水産微細藻類として、イデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体であって、水素イオン濃度ｐＨ２．０、ナトリウムイオン濃度０．５Ｍとなるように調製したＭ－Ａｌｌｅｎ培地で、培養温度４２℃、二酸化炭素濃度２％、照度６０μｍｏｌ／ｍ２ｓの連続光で７日間静置培養したときの下記式（１）で算出される値が２以上であり、水素イオン濃度ｐＨ２．０となるように調製したＭ－Ａｌｌｅｎ培地で、培養温度４２℃、二酸化炭素濃度２％、照度６０μｍｏｌ／ｍ２ｓの連続光で７日間静置培養したときの下記式（１）で算出される値が２未満である、イデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体を、水素イオン濃度ｐＨ１．０～６．０、ナトリウムイオン濃度０．４Ｍ以上となるように調製した培地で培養することを含む、淡水産微細藻類の培養方法。
　（培養開始７日後のＯＤ７５０値－培養開始時のＯＤ７５０値）／（７×培養開始時ＯＤ７５０値）　　（１）
［１６］淡水産微細藻類として、イデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体であって、水素イオン濃度ｐＨ２．０、ナトリウムイオン濃度０．５Ｍとなるように調製したＭ－Ａｌｌｅｎ培地で、培養温度４２℃、二酸化炭素濃度２％、照度６０μｍｏｌ／ｍ２ｓの連続光で７日間静置培養したときの下記式（１）で算出される値が２以上であり、水素イオン濃度ｐＨ２．０となるように調製したＭ－Ａｌｌｅｎ培地で、培養温度４２℃、二酸化炭素濃度２％、照度６０μｍｏｌ／ｍ２ｓの連続光で７日間静置培養したときの下記式（１）で算出される値が２未満である、イデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体を、水素イオン濃度ｐＨ１．０～６．０、ナトリウムイオン濃度０．４Ｍ以上となるように調製した培地で培養することを含む、淡水産微細藻類の生産方法。
　（培養開始７日後のＯＤ７５０値－培養開始時のＯＤ７５０値）／（７×培養開始時ＯＤ７５０値）　　（１）
　本発明によれば低ｐＨ且つ高ナトリウムイオン濃度環境下で淡水産微細藻類を良好に増殖させることができる淡水産微細藻類の培養方法、低ｐＨ且つ高ナトリウムイオン濃度環境下で良好に増殖可能な淡水産微細藻類、及び当該淡水産微細藻類の生産方法が提供される。
シアニジウム・エスピー　ＨＫＮ１（１倍体）をＭ－Ａｌｌｅｎ培地（ＭＡ培地）で前培養した後、ＭＡ培地、ＭＡ培地に０．３ＭのＮａＣｌを添加した培地（ＭＡ＋０．３Ｍ　ＮａＣｌ培地）、又はＭＡ培地に０．５ＭのＮａＣｌを添加した培地（ＭＡ＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ培地）で本培養したときの増殖曲線、並びにＭＡ＋０．３Ｍ　ＮａＣｌ培地で前培養した後、ＭＡ＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ培地で本培養したときの増殖曲線（ＯＤ７５０の経時変化）を示すグラフである。 シアニジウム・エスピー　ＨＫＮ１（１倍体）をＭＡ＋０．３Ｍ　ＮａＣｌ培地で前培養した後、海水培地又はＭＡ＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ培地で本培養したときの増殖曲線を示すグラフである。 シアニジウム・エスピー　ＨＫＮ１（１倍体）をＭＡ＋０．３Ｍ　ＮａＣｌ培地で前培養した後、ｐＨ２～７の海水培地で７日間本培養した後のＯＤ７５０を示すグラフである。 シアニジウム・エスピー　ＨＫＮ１（２倍体）をＭＡ培地で前培養した後、ＭＡ培地、ＭＡ＋０．３Ｍ　ＮａＣｌ培地、又はＭＡ＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ培地で本培養したときの増殖曲線、並びにＭＡ＋０．３Ｍ　ＮａＣｌ培地で前培養した後、ＭＡ＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ培地で本培養したときの増殖曲線を示すグラフである。 シアニジウム・エスピー　ＨＫＮ１（２倍体）をＭＡ＋０．３Ｍ　ＮａＣｌ培地で前培養した後、海水培地又はＭＡ＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ培地で本培養したときの増殖曲線を示すグラフである。 シアニディオシゾン・メロラエ　１０ＤをＭＡ培地で前培養した後、ＭＡ培地、ＭＡ＋０．３Ｍ　ＮａＣｌ培地、又はＭＡ＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ培地で本培養したときの増殖曲線、並びにＭＡ＋０．３Ｍ　ＮａＣｌ培地で前培養した後、ＭＡ＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ培地で本培養したときの増殖曲線を示すグラフである。 シアニディオシゾン・メロラエ　１０ＤをＭＡ＋０．３Ｍ　ＮａＣｌ培地で前培養した後、海水培地又はＭＡ＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ培地で本培養したときの増殖曲線を示すグラフである。 シアニジウム・エスピー　ＨＫＮ１（１倍体）を、ＭＡ培地、ＭＡ培地＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ培地、および海水培地で培養した培養品のポリリン酸と液胞を観察した蛍光顕微鏡写真である。 シアニジウム・エスピーＨＫＮ１（２倍体）を、ＭＡ培地、ＭＡ培地＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ培地、および海水培地で培養した培養品のポリリン酸と液胞を観察した蛍光顕微鏡写真である。 シアニジウム・エスピーＨＫＮ１（１倍体）を、１０Ｌの海水培地で培養したときの増殖曲線を示すグラフである。 葉緑体リブロース１，５－ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ大サブユニット（ｒｂｃＬ）遺伝子に基づくイデユコゴメ綱に属する微細藻類の分子系統樹を示す。各枝の近傍に最尤法によるローカルブートストラップ値（５０以上のみ記載、左）及びベイズ法による事後確率（０．９５以上のみ記載、右）を示す。
　本明細書において、「ＭＡ培地」は、Ｍ－Ａｌｌｅｎ培地を意味する。具体的には、表１に記載の組成を有する培地であって、水素イオン濃度がｐＨ１．０～６．０となるように硫酸を用いて調整した培地を意味する。単に、「ＭＡ培地」又は「Ｍ－Ａｌｌｅｎ培地」と記載する場合、ＮａＣｌを添加していない培地を意味する。「水素イオン濃度ｐＨ２．０となるように調製したＭ－Ａｌｌｅｎ培地」は、ｐＨ２．０となるように調整した、ＮａＣｌを添加していないＭＡ培地を意味する。
　本明細書において、「ＭＡ地＋０．３Ｍ　ＮａＣｌ培地」は、ＮａＣｌ濃度が０．３Ｍとなるように調整したＭＡ培地を意味する。具体的には、表４に記載の組成を有する培地であって、水素イオン濃度がｐＨ１．０～６．０となるように硫酸を用いて調整した培地を意味する。「水素イオン濃度ｐＨ２．０、ナトリウムイオン濃度０．３Ｍとなるように調製したＭ－Ａｌｌｅｎ培地」は、ｐＨ２．０となるように調整したＭＡ＋０．３Ｍ　ＮａＣｌ培地を意味する。
　本明細書において、「ＭＡ＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ培地」は、ＮａＣｌ濃度が０．５Ｍとなるように調整したＭＡ培地を意味する。具体的には、表５に記載の組成を有する培地であって、水素イオン濃度がｐＨ１．０～６．０となるように硫酸を用いて調整した培地を意味する。「水素イオン濃度ｐＨ２．０、ナトリウムイオン濃度０．５Ｍとなるように調製したＭ－Ａｌｌｅｎ培地」は、ｐＨ２．０となるように調整したＭＡ＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ培地を意味する。
　ＭＡ培地、ＭＡ＋０．３Ｍ　ＮａＣｌ培地、及びＭＡ＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ培地において、水素イオン濃度（ｐＨ）は、特に言及がない限り、ｐＨ１．０～６．０の範囲の任意の値であることができる。
　本明細書において、培地中の成分濃度に関して用いられる「Ｍ」は、「ｍｏｌ／Ｌ」を表す。
＜淡水産微細藻類の培養方法＞
　一実施形態において、本発明は、淡水産微細藻類の培養方法を提供する。本実施形態の培養方法は、淡水産細藻類を、水素イオン濃度ｐＨ１．０～６．０、ナトリウムイオン濃度０．１～０．４Ｍとなるように調製した培地で、培養温度が１５～６０℃で培養する培養工程を含む。前記培養方法は、淡水産微細藻類を、水素イオン濃度ｐＨ１．０～６．０、ナトリウムイオン濃度０．１～０．４Ｍとなるように調製した培地で培養する前培養工程と、前記前培養工程後の淡水産微細藻類を、ナトリウムイオン濃度が前記前培養工程における前記ナトリウムイオン濃度の１．２～５倍であり水素イオン濃度ｐＨ１．０～６．０となるように調製した培地で培養する本培養工程と、を含むことが好ましい。
　一実施形態において、本実施形態の培養方法は、高塩濃度の酸性培地で本培養を行う前に、０．１～０．４Ｍのナトリウムイオン濃度の酸性培地で前培養を行うことを特徴とする。かかる前培養を行うことで、耐塩性を有さない淡水産微細藻類であっても、海水と同程度の高塩濃度培地で良好に増殖できるようになる。
　本明細書において、前培養工程における培地のナトリウムイオン濃度及び水素イオン濃度（ｐＨ）とは、前培養工程の培養開始時のナトリウムイオン濃度及びｐＨをそれぞれ意味する。前培養工程の培養開始時の培地が「ナトリウムイオン濃度０．１～０．４Ｍ」であり「ｐＨ１．０～６．０」である限り、前培養期間中に、ナトリウムイオン濃度又はｐＨが変動して前記範囲を外れた場合であっても、本実施形態の培養方法の前培養工程に包含される。
　本培養工程における培地のナトリウムイオン濃度及びｐＨとは、本培養工程の培養開始時のナトリウムイオン濃度及びｐＨをそれぞれ意味する。本培養工程の培養開始時の培地が「ナトリウムイオン濃度が前培養工程におけるナトリウムイオン濃度の１．２～５倍」であり「ｐＨ１．０～６．０」である限り、本培養期間中に、ナトリウムイオン濃度又はｐＨが変動して前記範囲を外れた場合であっても、本実施形態の培養方法の本培養工程に包含される。
（淡水産微細藻類）
　本実施形態の培養方法は、ｐＨ１．０～６．０の酸性条件下で増殖可能な淡水産微細藻類に適用可能である。「淡水産微細藻類」とは、淡水域に生息する微細藻類を意味する。淡水のナトリウムイオン濃度は、通常、０．０５質量％未満である。淡水域は、特に限定されず、河川、湖沼、温泉、地下水等が挙げられるが、ｐＨ１．０～６．０の酸性条件の淡水域であることが好ましい。そのような酸性条件の淡水域としては、酸性温泉（硫酸酸性温泉など）が好ましく例示される。本明細書において、「微細藻類」とは、単細胞の藻類を意味する。
　ｐＨ１．０～６．０の酸性条件下で増殖可能な淡水産微細藻類としては、例えば、イデユコゴメ綱（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）に属する微細藻類が挙げられる。イデユコゴメ綱は、分類学上、紅色植物門（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ）、イデユコゴメ綱（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）に分類される。イデユコゴメ綱には、現在、シアニディオシゾン（Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ）属、シアニジウム（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ）属、及びガルデリア（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ）属の３属が分類されている。イデユコゴメ綱に属する微細藻類としては、これまでに多くの種類の微細藻類が知られておりここで列挙することはしないが、図１１に、イデユコゴメ綱に属する微細藻類の葉緑体ｒｂｃＬ遺伝子の塩基配列を用いた系統樹を示す。
　本実施形態の培養方法は、淡水産微細藻類の中でも、耐塩性を有さない淡水産微細藻類に適用することが好ましい。ここで「耐塩性を有さない」とは、海水又は海水と同等のナトリウムイオン濃度（約０．５Ｍ）の培地で培養した場合に、淡水産微細藻類用培地（ナトリウムイオン濃度０．０５Ｍ以下）で培養した場合と比較して、増殖が抑制されること（増殖できないことを含む）を意味する。前記増殖の抑制は、淡水産微細藻類用培地における増殖速度と比較して、増殖速度が６０％以上低下することが好ましく、８０％以上低下することがより好ましい。ｐＨ１．０～６．０の酸性条件下で増殖可能で耐塩性を有さない淡水産微細藻類としては、図１１に示すイデユコゴメ綱に属する微細藻類を挙げることができる。例えば、シアニジウム属に属する微細藻類の１倍体、シアニディオシゾン・メロラエ、ガルデリア属に属する微細藻類の１倍体等が挙げられる。
　イデユコゴメ綱に属する微細藻類は、１倍体の細胞形態又は２倍体の細胞形態をとることができるものがある。本発明者らは、２倍体の細胞形態をとる細胞群から１倍体の細胞形態をとる細胞群を得る方法や、逆に１倍体の細胞形態を取る細胞群から２倍体の細胞形態をとする細胞群を得る方法を提供している（国際公開第ＷＯ２０１９／１０７３８５号）。
　後述する実施例で示すように、シアニジウム属に属する微細藻類の２倍体は耐塩性を有するが、１倍体は耐塩性を有さない。１倍体及び２倍体の細胞形態を有するシアニジウム属に属する微細藻類の具体例としては、例えば、シアニジウム・エスピー（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ　ｓｐ．）ＹＦＵ３株（ＦＥＲＭ　Ｐ－２２３３４）（以下、「ＹＦＵ３株」という。）、及びシアニジウム・エスピー（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ　ｓｐ．）ＨＫＮ１株（ＦＥＲＭ　Ｐ－２２３３３）（以下、「ＨＫＮ１株」という。）等、並びにこれらの近縁種、変異株、及び子孫が挙げられる。
　以下、ＹＦＵ３株について、２倍体の細胞形態と１倍体の細胞形態とを区別して記載する場合には、２倍体の細胞形態を「ＹＦＵ３株（２倍体）」、１倍体の細胞形態を「ＹＦＵ３株（１倍体）」と記載する。同様に、ＨＫＮ１株について、２倍体の細胞形態と１倍体の細胞形態とを区別して記載する場合には、２倍体の細胞形態を「ＨＫＮ１株（２倍体）」、１倍体の細胞形態を「ＨＫＮ１株（１倍体）」と記載する。単に、「ＹＦＵ３株」又は「ＨＫＮ１株」と記載する場合には、２倍体の細胞形態及び１倍体の細胞形態の両方を包含するものとする。
　藻類が２倍体であるか、１倍体であるかの判定は、同一遺伝子座のコピー数を確認することにより行うことができる。すなわち、同一遺伝子座のコピー数が１であれば、１倍体であると判定される。また、次世代シーケンサー等を用いて、藻類が１倍体であることの判定を行うこともできる。例えば、次世代シーケンサー等で全ゲノムのシーケンスリードを取得し、それらのシーケンスリードをアセンブルした後、アセンブルして得られた配列に対して、シーケンスリードをマッピングする。２倍体ではアレルごとの塩基の違いがゲノム上の様々な領域で見つかるが、１倍体では１アレルしか存在しないため、その様な領域は見つからない。
　あるいは、ＤＡＰＩ等の核染色試薬で細胞を染色し、１倍体であることが既知である細胞と比較して、同等の蛍光輝度を示す細胞を１倍体と判定し、約２倍の蛍光輝度を示す細胞を２倍体と判定してもよい。あるいは、ＤＡＰＩ等の核染色試薬で細胞を染色し、２倍体であることが既知である細胞と比較して、同等の蛍光輝度を示す細胞を２倍体と判定し、約１／２倍の蛍光輝度を示す細胞を１倍体と判定してもよい。
　ＹＦＵ３株（１倍体）は、日本国大分県由布市の温泉の高温酸性水より単離された単細胞紅藻である。ＹＦＵ３株は、２０１７年５月３０日付で、受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ－２２３３４として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８）に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２３３４として、２０１８年４月２０日付で国際寄託に移管されている。
　ＨＫＮ１株は、日本国神奈川県足柄下郡箱根町の温泉の高温酸性水より単離された単細胞紅藻である。ＨＫＮ１株（１倍体）は、２０１７年５月３０日付で、受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ－２２３３３として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託され、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２３３３として、２０１８年４月２０日付で国際寄託に移管されている。
　また、本実施形態の培養方法を適用する淡水産微細藻類は、酸性温泉などの淡水域から単離してもよく、カルチャー・コレクション等から入手してもよい。例えば、シアニディオシゾン・メロラエは、国立研究開発法人国立環境研究所微生物系統保存施設（日本国茨城県つくば市小野川１６－２）、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；10801 University Boulevard Manassas, VA 20110 USA）等から入手することができる。
　また、本実施形態の培養方法を適用する淡水産微細藻類は、自然界から単離されたものに限定されず、天然の淡水産微細藻類に変異が生じたものであってもよい。変異は、自然発生的に生じたものであってもよく、人為的に生じたものであってもよい。例えば、シアニディオシゾン・メロラエは、ゲノムサイズが小さく（約１６Ｍｂｐ）、ゲノム配列の解読が完了しているため（Matsuzaki M et al., Nature. 2004 Apr 8;428(6983):653-7.）、遺伝子改変を行いやすい。したがって、例えば、遺伝子改変により作製されたシアニディオシゾン・メロラエの形質転換体（例えば、栄養成分が強化された形質転換体）に、本実施形態の培養方法を適用してもよい。また、遺伝子改変可能であれば、他の淡水産微細藻類の形質転換体に、本実施形態の培養方法を適用してもよい。
　また、ガルデリア属に属する微細藻類の中にも、１倍体の細胞形態及び２倍体の細胞形態をとることができるものがある。例えば、ガルデリア属に属する微細藻類の２倍体を、一定期間（例えば、１～３週間程度）培養することにより、１倍体の細胞形態を得ることができる。１倍体の細胞を得るために２倍体の細胞を培養する培地としては、例えば、酸性温泉排水培地、塚原鉱泉培地（Hirooka et al. 2016 Front in Microbiology）等が好適に利用可能である。ガルデリア属に属する微細藻類の１倍体又はその形質転換体にも、本実施形態の培養方法を適用可能である。ガルデリア属に属する微細藻類としては、例えば、Ｇ．　ｐａｒｔｉｔａ（ＮＢＲＣ　１０２７５９）、及びＧ．　ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ（ＳＡＧ１０８．７９等）等が挙げられる。ガルデリア属に属する微細藻類は、酸性温泉などの淡水域から単離してもよく、カルチャー・コレクション等から入手してもよい。カルチャー・コレクションとしては、前記シアニディオシゾン・メロラエで挙げたカルチャー・コレクションに加えて、ＮＩＴＥ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅ　Ｃｅｎｔｅｒ（ＮＲＢＣ；日本国東京都渋谷区西原２－４９－１０）、ＧＥＯＲＧ－ＡＵＧＵＳＴ－ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ　ＧＯＴＴＩＮＧＥＮ　ｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｌｇａｅ（ＳＡＧ）等が挙げられる。
　イデユコゴメ綱に属する微細藻類の中でも、１倍体の藻類細胞は強固な細胞壁を有さないことが多い。そのような強固な細胞壁を有さない１倍体の細胞形態の藻類細胞は、中和処理、低張処理、凍結融解処理などの比較的温和な処理により、細胞を破壊することができる。なお、本明細書において、「強固な細胞壁を有さない」とは、下記（Ａ）～（Ｃ）の細胞破裂処理のいずれかで細胞破裂を生じることを意味する。
（Ａ）藻類細胞をｐＨ７の等張液に懸濁し、１週間以上放置する。
（Ｂ）藻類細胞を蒸留水に懸濁し、１分以上放置する。
（Ｃ）藻類細胞の乾燥処理を行い、ｐＨ７の等張液に懸濁する。
　上記（Ａ）～（Ｃ）において、藻類細胞が培養細胞である場合、各処理を行う前に、遠心分離等により培地を除去し、等張液等で藻類細胞を洗浄してもよい。
　上記（Ａ）及び（Ｃ）において、等張液としては、１０％スクロース及び２０ｍＭのＨＥＰＥＳを含むｐＨ７の緩衝液が挙げられる。
　上記（Ｃ）において、乾燥処理としては、冷蔵庫内（４℃）での乾燥、凍結乾燥等が挙げられる。乾燥処理には、遠心分離により回収した藻類細胞の沈殿を用いる。冷蔵庫内で乾燥する場合、乾燥処理時間は、藻類細胞の量によるが、３日以上が例示される。
　また、細胞破裂が生じたか否かは、上記（Ａ）～（Ｃ）の細胞破裂処理後の藻類細胞懸濁液を遠心分離（１，５００×ｇ、３分）し、藻類細胞懸濁液中の全タンパク質量に対する、遠心上清中のタンパク質量の割合を求めることにより、判定することができる。具体的には、下記式により求められる破裂率が、２０％以上である場合に、細胞破裂が生じたと判定することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　あるいは、藻類細胞懸濁液中の藻類細胞を光学顕微鏡（例えば、倍率６００倍）で観察し、細胞破裂が生じている細胞の割合が、藻類細胞全体の１０％程度以上、好ましくは２０％程度以上である場合に、細胞破裂が生じたと判断してもよい。
　上記（Ａ）～（Ｃ）の細胞破裂処理では、ｐＨ７の等張液を用いることができるため、上記（Ａ）～（Ｃ）のいずれかの細胞破裂処理で細胞破裂が生じる細胞は、ｐＨ７の条件下で細胞破裂が生じる細胞であるということができる。
　ｐＨ７の条件下で、その細胞が破裂する微細藻類であれば、培養槽の外に流出した場合に、外部環境で生育することが困難であり、環境へのコンタミネーションを抑制することができる。
　藻類細胞が強固な細胞壁を有さない場合、光学顕微鏡による観察（例えば、倍率６００倍）では、通常、細胞壁が観察されない。なお、ｐＨ６以下の条件での温和な低張処理により細胞破裂が生じるか否かは、強固な細胞壁を有さない微細藻類であるか否かの判定には影響しない。
［前培養工程］
　前培養工程は、淡水産微細藻類を、水素イオン濃度ｐＨ１．０～６．０、ナトリウムイオン濃度０．１～０．４Ｍとなるように調製した培地で培養する工程である。
　前培養工程で用いる培地は、ナトリウムイオン濃度が０．１～０．４Ｍであり、ｐＨが１．０～６．０の培地であれば特に限定されない。例えば、一般的な淡水産微細藻類用培地に、０．１～０．４Ｍのナトリウムイオンを添加し、ｐＨ１．０～６．０に調整したものを好ましく用いることができる。
　淡水産微細藻類用培地は、特に限定されず、培養する淡水産微細藻類の種類に応じて適宜適切なものを選択すればよい。淡水産微細藻類用培地としては、例えば、窒素源、リン源、鉄源、微量元素（亜鉛、ホウ素、コバルト、銅、マンガン、モリブデンなど）等を含む無機塩培地が例示される。例えば、窒素源としては、アンモニウム塩、硝酸塩、亜硝酸塩、尿素、アミン類等が挙げられ、リン源としては、リン酸塩、亜リン酸塩等が挙げられ、鉄源としては、塩化鉄、硫酸鉄、クエン酸鉄等が挙げられる。淡水産微細藻類用培地の具体例としては、例えば、２×Ａｌｌｅｎ培地（Allen MB. Arch. Microbiol. 1959 32:270-277.）、Ｍ－Ａｌｌｅｎ培地（Minoda A et al. Plant Cell Physiol. 2004 45: 667-71.）、ＭＡ２培地（Ohnuma M et al. Plant Cell Physiol. 2008 Jan;49(1):117-20.）等が挙げられる。なお、本明細書においては、Ｍ－Ａｌｌｅｎ培地を「ＭＡ培地」と記載することがある。
　ナトリウムイオン濃度は、０．１～０．４Ｍの範囲内で、後述の本培養工程におけるナトリウムイオン濃度に応じて適宜選択すればよい。より具体的には、本培養工程で予定するナトリウムイオン濃度の０．２～０．８倍のナトリウムイオン濃度を選択することができる。ナトリウムイオン濃度は、本培養工程におけるナトリウムイオン濃度の０．５倍以上であることが好ましく、０．５～０．７倍であることがより好ましく、０．５～０．６倍であることがさらに好ましい。
　例えば、本培養工程におけるナトリウムイオン濃度を海水と同程度（約０．５Ｍ）とする場合、前培養工程におけるナトリウムイオン濃度は０．２５Ｍ以上であることが好ましく、０．２５～０．３５Ｍであることがより好ましく、０．２５～０．３Ｍであることがさらに好ましい。
　培地のナトリウムイオン濃度の調整は、市販のナトリウムイオン試薬を用いてもよく、食塩を用いて行ってもよい。また、天然海水、濃縮海水、人工海水等をナトリウムイオン濃度が０．１～０．４Ｍとなるように希釈し、適宜、窒素源、リン源、鉄源、及び微量元素等を添加して用いてもよい。天然海水としては、表層水又は海洋深層水をろ過したものを使用できるほか、市販品も使用可能である。天然海水の市販品としては、例えば、ナジーム１０（伊豆１０ｍの表層海水）、及びナジーム８００（伊豆赤沢８００ｍ海洋深層水）（いずれも日本ＱＣＥ　ｂｌｕｅｌａｂ事業部）等が挙げられる。人工海水の市販品としては、例えば、ダイゴＩＭＫ培地、ダイゴ人工海水ＳＰ（いずれも日本製薬株式会社）等が挙げられる。
　天然海水、特に海水表層に含まれる主要なイオンの濃度としては、例えば、下記の組成が知られている。この組成は海洋の表層における一般的な組成と思われ、また、地域において塩分濃度が異なることは周知である。そのため、海水の塩分濃度を定義することは困難であるが、金属イオンにおいてはナトリウムが主要な金属であることは疑いない。そこで、発明者らは、概ねナトリウムイオン濃度として０．４Ｍを超える場合は海水条件であるとした。より海水条件に近いナトリウムイオン濃度としては、０．４５Ｍ以上、さらに好ましくは０．５Ｍ以上である。
　ナトリウムイオン　１．０５５６質量％
　マグネシウムイオン　０．１２７２質量％
　カルシウムイオン　０．０４００質量％
　カリウムイオン　０．０３８０質量％
　ストロンチウムイオン　０．０００８質量％
　塩化物イオン　１．８９８０質量％
　硫酸イオン０．２６４９質量％
　臭化物イオン　０．００６５質量％
　炭酸水素イオン　０．０１４０質量％
　フッ化物イオン　０．０００１質量％
　ホウ酸　０．００２６質量％
　水素イオン濃度は、ｐＨ１．０～６．０の範囲内で、淡水産微細藻類の種類に応じて適宜選択すればよい。例えば、淡水産微細藻類が、イデユコゴメ綱に属する微細藻類である場合、ｐＨ１．０～５．０が好ましく、ｐＨ１．０～３．０がより好ましい。
　培地のｐＨ調整は、例えば、硫酸、塩酸等の無機酸、水酸化カリウム等の無機塩基等を用いて行うことができる。また、培養中のｐＨ変動を抑制するために、任意に、ｐＨ緩衝剤を培地に添加してもよい。
　前培養工程は、淡水産微細藻類の細胞を、培地に接種することにより開始することができる。培養開始時の藻類濃度は、特に限定されないが、例えば、ＯＤ７５０＝０．０５～０．５の細胞濁度とすることができる。「ＯＤ７５０」とは、７５０ｎｍでの吸光度を意味する。培養開始時の細胞濁度は、ＯＤ７５０＝０．０５～０．３であることが好ましい。
　前培養工程における温度条件は、淡水産微細藻類の種類に応じて適宜選択すればよい。一般的には、培養温度は、１５～６０℃を例示することができ、好ましくは１５～５０℃、さらに好ましくは３０～５０℃である。淡水産微細藻類が、イデユコゴメ綱に属する微細藻類である場合、培養温度は３０～５０℃が好ましい。
　前培養工程における光条件は、淡水産微細藻類の種類に応じて適宜選択すればよい。一般的には、５～２０００μｍｏｌ／ｍ２ｓを例示することができる。淡水産微細藻類が、イデユコゴメ綱に属する微細藻類である場合、５～１５００μｍｏｌ／ｍ２ｓが好ましい。光条件は、連続光であってもよく、明暗周期（１０Ｌ：１４Ｄなど）を設けてもよい。前培養工程は、自然光下で行ってもよい。
　前培養工程におけるＣＯ２条件は、淡水産微細藻類の種類に応じて適宜選択すればよい。一般的には、０．０４～５％ＣＯ２条件を例示することができる。淡水産微細藻類が、イデユコゴメ綱に属する微細藻類である場合、０．０４～３％ＣＯ２条件が好ましい。イデユコゴメ綱に属する微細藻類の中でも、ガルデリア属は高ＣＯ２濃度耐性が高く、１００％ＣＯ２でも生育可能であるため、淡水産微細藻類がガルデリア属に属する微細藻類である場合には、１００％ＣＯ２条件としてもよい。また、ＣＯ２条件は、大気中ＣＯ２濃度であってもよい。
　前培養工程における培養方法は、特に限定されず、微細藻類の培養方法として一般的に用いられる方法を用いればよい。具体例としては、静置培養、通気培養（２００～４００ｍＬ　ａｉｒ／ｍｉｎなど）、振とう培養（１００～２００ｒｐｍなど）等が挙げられる。
　前培養工程における培養期間は、特に限定されないが、誘導期の期間を終えて対数期にさしかかるまでの期間が必要であり、通常３日以上が必要であり、好ましくは５日以上であり、より好ましくは７日以上である。前培養工程を前記下限日数以上の期間行うことで、本培養工程における淡水産微細藻類の増殖をより良好に維持することができる。前培養期間の上限は、特に限定されないが、対数期を終えて定常期にまでさしかかるまで行うと、本培養において微細藻類の増殖を良好に維持する上で不適切である。前培養期間としては、３～２０日が好ましく、５～１５日がより好ましく、７～１０日がさらに好ましい。
　前培養のスケールは本培養のスケールに応じて選択することが出来る。本培養で微細藻類の育種や変異株の選択等小スケールで培養する場合は、前培養を小スケールで行うことができ、通常は、０．１～１０００ｍＬで行われる。また、本培養で工業的に大量生産が行われる場合には、前培養を１～１０Ｌ程度で行われる場合もある。
［本培養工程］
　本培養工程は、前記前培養工程後の淡水産微細藻類を、ナトリウムイオン濃度が前培養工程におけるナトリウムイオン濃度の１．２～５倍であり水素イオン濃度ｐＨ１．０～６．０となるように調製した培地で培養する工程である。
　本培養工程で用いる培地は、ナトリウムイオン濃度が前記前培養工程で用いた培地の１．２～５倍であり、ナトリウムイオン濃度で換算して０．４Ｍ以上、好ましくは０．４５Ｍ以上、より好ましくは０．５Ｍ以上のものを用いることが出来る。水素イオン濃度は、ｐＨ１．０～６．０の培地であれば特に限定されない。例えば、一般的な淡水産微細藻類用培地に、前記濃度のナトリウムイオンを添加し、ｐＨ１．０～６．０に調整したものを好ましく用いることができる。淡水産微細藻類用培地としては、前記「［前培養工程］」で挙げたものと同様のものが挙げられる。
　本培養工程で用いる培地は、海水に、適宜、窒素源、リン源、鉄源、及び微量元素等を添加し、ｐＨを１．０～６．０に調整したものであってもよい。海水は、天然海水であってもよく、人工海水であってもよく、濃縮海水を希釈したものであってもよい。天然海水及び人工海水の市販品としては、前記「［前培養工程］」で挙げたものと同様のものが挙げられる。本培養工程において、大量培養を行う場合には、天然海水を用いることでコストを抑制することができる。天然海水は、表層水であってもよく、海洋深層水であってもよい。天然海水は、ろ過等を行って、不純物を除去したものが好ましい。海水に添加する窒素源、リン源、鉄源、及び微量元素等は、淡水産微細藻類の種類に応じて適宜選択すればよい。
　淡水産微細藻類が、イデユコゴメ綱に属する微細藻類である場合、海水に、窒素含有塩、リン含有塩及び鉄含有塩を少なくとも添加することが好ましい。
　窒素含有塩としては、アンモニウム塩、硝酸塩、及び亜硝酸塩等の窒素含有無機塩類等が挙げられる。中でも、窒素含有塩としては、アンモニウム塩（硫酸アンモニウムなど）が好ましい。アンモニウム塩の海水への添加量としては、アンモニウムイオン濃度として、２０～１００ｍＭが例示される。
　リン含有塩としては、リン酸塩、及び亜リン酸塩等のリン含有無機塩類等が挙げられる。中でも、リン含有有塩としては、リン酸塩（リン酸二水素カリウムなど）が好ましい。リン酸塩の海水への添加量としては、リン酸イオン濃度として、２～１０ｍＭが例示される。
　鉄含有塩としては、塩化鉄（ＩＩＩ）、硫酸鉄（ＩＩ）、クエン酸鉄（ＩＩ）及びこれらの水和物等が挙げられる。中でも、鉄含有塩としては、塩化鉄（ＩＩＩ）が好ましい。鉄含有塩の海水への添加量としては、鉄イオン濃度として、０．１～２ｍＭが例示される。
　その他、海水には、ホウ酸、マンガン、亜鉛、モリブデン、コバルト、銅等の微量元素を添加することが好ましい。
　淡水産微細藻類がイデユコゴメ綱に属する微細藻類である場合、本培養工程で用いる培地の具体例としては、後述の表９に記載の「海水培地」が好ましく例示される。
　本培養工程で用いる培地のナトリウムイオン濃度は、特に限定されないが、前記前培養工程における前記ナトリウムイオン濃度の１．１～５倍、好ましくは１．２～５倍であり、１．４～２倍であることがより好ましく、１．５～２倍であることがさらに好ましい。本培養工程で海水を利用する場合、ナトリウムイオン濃度は約０．４Ｍ以上であり、用いる微細藻類種によっては１Ｍ以下の培地が用いられる。
　また、本培養工程を屋外で行う場合には、他の生物のコンタミネーションを抑制するために、０．５Ｍ以上のナトリウムイオン濃度を用いることもできる。例えば、ナトリウムイオン濃度を０．５～１Ｍとしてもよい。
　培地のナトリウムイオン濃度の調整は、前記前培養工程における培地と同様に行うことができる。
　水素イオン濃度は、ｐＨ１．０～６．０の範囲内で、淡水産微細藻類の種類に応じて適宜選択すればよい。例えば、淡水産微細藻類が、イデユコゴメ綱に属する微細藻類である場合、ｐＨ１．０～５．０が好ましく、ｐＨ１．０～３．０がより好ましい。
　また、本培養工程を屋外で行う場合には、他の生物のコンタミネーションを抑制するために、より低いｐＨ（ｐＨ１．０～２．０など）を用いることもできる。
　培地のｐＨ調整は、前記前培養工程における培地と同様に行うことができる。
　本培養工程は、前培養工程の培養液を、本培養工程における培地に接種することにより開始することができる。培養開始時の藻類濃度は、特に限定されないが、例えば、ＯＤ７５０＝０．０５～０．５の細胞濁度とすることができる。「ＯＤ７５０」とは、７５０ｎｍでの吸光度を意味する。培養開始時の細胞濁度は、ＯＤ７５０＝０．０５～０．３であることが好ましい。
　本培養工程における培養スケールは、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、微細藻類の育種や変異株の選択等を行う場合は、小スケールで本培養を行うことができ、通常は、１０ｍＬ～１０Ｌ程度で行われる。また、本培養で工業的な大量生産が行われる場合には、２０～５０００Ｌ程度で培養を行ってもよい。５００Ｌの大量培養を行う場合には、屋外培養を行ってもよい。
　本培養工程における温度条件、光条件、ＣＯ２条件及び培養方法は、上述の前培養条件と同様とすることができる。
　また、本培養工程は、屋外で培養を行ってもよい。この場合、温度条件、光条件及びＣＯ２条件は、培養槽が設置された外部環境の条件とすることができる。本培養工程を屋外培養とした場合でも、ｐＨ１．０～６．０の酸性条件下での培養であるため、他の生物の混入を抑制することができる。また、淡水産微細藻類として、イデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体を用いた場合、ｐＨ７の環境下での生存が困難であるため、屋外の培養槽から外部環境に放出された場合でも当該環境の汚染が抑制される。
　本培養工程における培養期間は、特に限定されず、所望のバイオマス量が得られるまで培養を継続することができる。あるいは、微細藻類の生育状況を確認し、定常期となるまで培養を行ってもよい。
　本実施形態の培養方法によれば、淡水産微細藻類を低ｐＨ及び高ナトリウムイオン濃度の培地で、培養開始時から短い誘導期で良好に増殖させることができる。そのため、屋外培養の場合であっても、他の生物の侵入を効果的に抑制することができる。また、イデユコゴメ綱に属する微細藻類（特に１倍体）は中性条件下では死滅するため、仮にイデユコゴメ綱に属する微細藻類（特に１倍体）が大量培養系から環境中に放出される場合があったとしても生物学的封じ込めが可能である。そのため、有用物質を生産する淡水産微細藻類の屋外大量培養に好適に適用することができる。
＜淡水産微細藻類の生産方法＞
　一実施形態において、本発明は、水素イオン濃度ｐＨ１．０～６．０、ナトリウムイオン濃度０．５Ｍ以上となるように調製した培地で増殖可能な淡水産微細藻類の生産方法を提供する。本実施形態の淡水産微細藻類の生産方法は、ナトリウムイオン濃度が０．５Ｍ以上である培地で増殖できない淡水産微細藻類を、水素イオン濃度ｐＨ１．０～６．０、ナトリウムイオン濃度０．１～０．４Ｍとなるように調製した培地で培養する工程を含む。
　本実施形態の方法で用いる淡水産微細藻類は、ナトリウムイオン濃度が０．５Ｍ以上である培地で増殖できない淡水産微細藻類である。
　淡水産微細藻類が、ナトリウムイオン濃度が０．５Ｍ以上である培地で増殖できないか否かは、対象の淡水産微細藻類をナトリウムイオン濃度が０．５Ｍ以上である培地で培養し、経時的に細胞濁度（ＯＤ７５０）を測定することにより確認することができる。培養開始時から、ＯＤ７５０が上昇しない場合には、当該淡水産微細藻類は、ナトリウムイオン濃度が０．５Ｍ以上である培地で増殖できない淡水産微細藻類であると判定することができる。
　また、淡水産微細藻類は、ｐＨ１．０～６．０で増殖可能であることが好ましい。
　そのような淡水産微細藻類としては、例えば、シアニジウム属に属する微細藻類の１倍体が挙げられる。シアニジウム属に属する微細藻類の１倍体の具体例としては、ＨＫＮ１株（１倍体）及びＹＦＵ３株（１倍体）が挙げられる。
　本実施形態の方法は、前記のような淡水産微細藻類を、ナトリウムイオン濃度が０．１～０．４ＭであるｐＨ１．０～６．０の培地で培養する工程を含む。当該工程は、前記「＜淡水産微細藻類の培養方法＞」の「［前培養工程］」と同様に行うことができる。
　本実施形態の方法によれば、耐塩性を有さない淡水産微細藻類に、耐塩性を付与して、塩化ナトリウ濃度が０．５Ｍ以上であるｐＨ１．０～６．０の培地で増殖可能な淡水産微細藻類を得ることができる。当該淡水産微細藻類が生育可能な高塩濃度及び低ｐＨの環境では、他の生物の侵入が抑制される。また、イデユコゴメ綱に属する微細藻類（特に１倍体）は中性条件下では死滅するため、仮にイデユコゴメ綱に属する微細藻類（特に１倍体）が大量培養系から環境中に放出される場合があったとしても生物学的封じ込めが可能である。そのため、当該淡水産微細藻類は屋外大量培養に好適に用いることができる。
＜耐塩性を有するイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体＞
　本発明の１実施形態に係るイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体は、ナトリウムイオン濃度が０．５Ｍのような高塩濃度の培地で生育するが、天然のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体は生育ができない。しかし、本発明の１実施形態に係る培養方法により、前培養期間中に耐塩性を獲得すると、０．５Ｍのナトリウムイオン濃度の培地でも生育できるようになる。このとき、前培養期間中よりも短期間の誘導期の後、対数増殖を開始する特徴があり、この特徴はさらに培地を植え継いでも同様である。しかも、耐塩性獲得をした本発明の１倍体藻類は、ＮａＣｌを添加していないＭＡ培地に植え継ぐと、生育しないかまたは生育が不良となってしまうという特徴がある。
　生育が良好かどうかについては、コントロールの培養条件と比較することによってもできるが、本発明の１実施形態においては、自己の培養初期状態の細胞数と所定期間経過する間に増大した細胞数の比の大小により検討する。具体的には式（１）により計算する。細胞数は培養液の７５０ｎｍにおける吸光度ＯＤを測定することにより求め、所定期間は７日間とし、式（１）の値が２以上の場合は生育が良好であり、２未満の場合は生育が不良であるとする。生育が不良の原因としては、環境条件に馴化するのに時間を要することや、イデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体は強固な細胞壁を持たないために高張液の浸透圧に耐えられず細胞が破壊されて死滅していることが考えられる。細胞が破壊されていることの確認については顕微鏡で観察することが考えられるが、定量性を確保することが困難である。そのため、本発明の１実施形態においては、細胞の内容物であるフィコシアニンの量を測定することで定量的な考察を行う。
　一実施形態において、本発明は、イデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体であって、水素イオン濃度ｐＨ２．０、ナトリウムイオン濃度０．５Ｍとなるように調製したＭＡ培地で、培養温度４２℃、二酸化炭素濃度２％、照度６０μｍｏｌ／ｍ２ｓの連続光で７日間静置培養したときの下記式（１）で算出される値が２以上であり、ＭＡ培地で、培養温度４２℃、二酸化炭素濃度２％、照度６０μｍｏｌ／ｍ２ｓの連続光で７日間静置培養したときの下記式（１）で算出される値が２未満である、イデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体を提供する。
　（培養開始７日後のＯＤ７５０値－培養開始時のＯＤ７５０値）／（７×培養開始時ＯＤ７５０値）で示される培養速度　　（１）
　「水素イオン濃度ｐＨ２．０、ナトリウムイオン濃度０．５Ｍとなるように調製したＭＡ培地」は、実施例における表５に記載される培地（以下、「ＭＡ＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ培地」ともいう）である。本実施形態のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体は、ＭＡ＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ培地で増殖することができる。さらに、ＭＡ＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ培地で、培養温度４２℃、二酸化炭素濃度２％、照度６０μｍｏｌ／ｍ２ｓの連続光の条件で、静置培養したとき、下記式（１）で算出される増殖速度が２以上になるという特徴を有する。
　（培養開始７日後のＯＤ７５０値－培養開始時のＯＤ７５０値）／（７×培養開始時ＯＤ７５０値）　　（１）
　前記式（１）において、「培養開始時のＯＤ７５０値」とは、培養開始時（０時間）において波長７５０ｎｍで測定した培養液の吸光度を意味する。通常、培養開始時のＯＤ７５０値が、０．１となるように、イデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体をＭＡ＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ培地に接種し、培養を開始する。前記式（１）において、「培養開始７日後のＯＤ７５０値」とは、培養開始から７日（１６８時間）後において波長７５０ｎｍで測定した培養液の吸光度を意味する。培養液の吸光度は、吸光度計で測定することができる。
　培養は、培養温度４２℃、二酸化炭素濃度２％、照度６０μｍｏｌ／ｍ２ｓの連続光の条件で、７日間の静置培養で行う。培養スケールは、特に限定されないが、例えば、２４穴プレートを用いて、１ｍＬの培養液で培養することができる。
　天然のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体は、ＭＡ＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ培地で増殖することはできない。そのため、天然のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体をＭＡ＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ培地で培養した場合、前記式（１）で算出される値は、２未満である。しかしながら、本実施形態のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体は、高ナトリウムイオン濃度に対する耐性を有しているため、ＭＡ＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ培地でも良好に増殖することができる。したがって、本実施形態のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体をＭＡ＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ培地で培養した場合、前記式（１）で算出される値が２以上となる。本実施形態のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体は、ＭＡ＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ培地で培養したときの前記式（１）で算出される値が、３以上であることが好ましく、４以上であることがより好ましい。
　上記特徴に加えて、本実施形態のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体は、ＭＡ培地で、培養温度４２℃、二酸化炭素濃度２％、照度６０μｍｏｌ／ｍ２ｓの連続光で静置培養したとき、前記式（１）で算出される値が２未満であるという特徴を有する。ＭＡ培地は、実施例における表１に記載される培地である。通常、培養開始時のＯＤ７５０値が、０．１となるように、イデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体をＭＡ培地に接種し、培養を開始する。培養は、培養温度４２℃、二酸化炭素濃度２％、照度６０μｍｏｌ／ｍ２ｓの連続光の条件で、７日間の静置培養で行う。培養スケールは、特に限定されないが、例えば、２４穴プレートを用いて、１ｍＬの培養液で培養することができる。
　天然のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体は、ＭＡ培地で良好に増殖することができる。そのため、天然のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体をＭＡ培地で培養した場合、前記式（１）で算出される値は、通常２以上となる。しかしながら、本実施形態のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体は、高ナトリウムイオン濃度に対する耐性を有する一方、低ナトリウムイオン濃度での増殖能力が低下する。したがって、本実施形態のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体をＭＡ培地で培養した場合、前記式（１）で算出される値が２以上となる。本実施形態のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体は、ＭＡ培地で培養したときの前記式（１）で算出される値が、１．８未満であることが好ましく、１．５未満以上であることがより好ましい。
　本実施形態のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体は、ＭＡ培地に懸濁したときの死滅率が、３０％以上であることが好ましく、４０％以上であることがより好ましく、５０％以上であることがさらに好ましい。前記死滅率が３０％以上であると、環境中に藻類細胞が放出されたとしても、ナトリウムイオン濃度が低い環境中では藻類細胞の生存が難しい。そのため、屋外の開放培養系で培養した場合でも、環境へのコンタミネーションが起こりにくい。
　前記死滅率は、以下のように算出されるものである。
　ＭＡ＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ培地で培養を行った後、２ｍＬの前記培地に懸濁したときにＯＤ７５０＝１となる量の藻類細胞を回収し、下記の処理１～３を行う。
　処理１：ＭＡ培地２ｍＬに懸濁し、ボルテックスで１０分間振盪する。
　処理２：ＭＡ＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ培地２ｍＬに懸濁し、ボルテックスで１０分間振盪する。
　処理３：ＭＡ＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ培地０．１ｍＬに懸濁後、－１９６℃で凍結し、前記培地で２ｍＬとなるようにメスアップし、ボルテックスで１０分間振盪する。
　次いで、下記式により、死滅率を算出する。
　死滅率（％）＝｛（処理２後のＰＣ濃度－処理１後のＰＣ濃度）／（処理２後のＰＣ濃度－処理３後のＰＣ濃度）｝×１００
　前記式中、「ＰＣ濃度」は、フィコシアニン濃度を表す。ＰＣ濃度は、処理１～３のいずれかを行った後の懸濁液について、積分球を取り付けた分光光度計を用いて、６２０ｎｍ及び６７８ｎｍの吸光度を測定することにより求めることができる。ＰＣ濃度は、６２０ｎｍ及び６７８ｎｍの吸光度から、下記式により算出することができる。
　ＰＣ濃度（μｇ／ｍｌ）＝１３８．５×Ａ６２０－３５．４９×Ａ６７８
　本実施形態のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体は、下記（ａ）～（ｃ）のいずれか１つ以上の特徴を有することが好ましく、下記（ａ）～（ｃ）のいずれか２つの特徴を有することがより好ましく、下記（ａ）～（ｃ）の全ての特徴を有することがさらに好ましい。
　（ａ）天然の前記微細藻類の１倍体と比較して、ナトリウムイオン濃度が０．５ＭであるｐＨ１．０～６．０の培地での培養開始後７日間の増殖速度が大きい。
　（ｂ）天然の前記微細藻類の１倍体と比較して、ナトリウムイオン濃度が０．０５Ｍ以下であるｐＨ１．０～６．０の培地での培養開始後７日間の増殖速度が小さい。
　（ｃ）ナトリウムイオン濃度が０．０５Ｍ以下であるｐＨ１．０～６．０の培地での培養開始後７日間の増殖速度と比較して、ナトリウムイオン濃度が０．５ＭであるｐＨ１．０～６．０の培地での培養開始後７日間の増殖速度が大きい。
　「天然のイデユコゴメ綱に属する微細藻類」とは、自然界で生息するイデユコゴメ綱に属する微細藻類又は前記微細藻類と同様の性質を有する当該種類の微細藻類をいう。天然の微細藻類は、自然界から単離され、ナトリウムイオン濃度が０．０５Ｍ以下であるｐＨ１．０～６．０の培地で培養することにより維持されたものであってもよい。
　「天然のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体」とは、自然界で生息するイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体又は自然界で生息するイデユコゴメ綱に属する微細藻類の２倍体から得られた１倍体をいう。ナトリウムイオン濃度が０．０５Ｍ以下であり、ｐＨ１．０～６．０となるように調製された培地で天然のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の２倍体を一定期間（例えば、１～３週間程度）、一定条件で培養し、減数分裂した微細藻類を顕微鏡下において物理的に選択し、天然のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体を得ることができる。
　イデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体が、上記（ａ）の特徴を有するか否かは、当該微細藻類の１倍体と当該微細藻類と同じ種である天然の微細藻類とを、ナトリウムイオン濃度が０．５ＭであるｐＨ１．０～６．０の培地で培養し、培養開始後７日間の増殖速度を比較することにより判定することができる。前記増殖速度が、天然の微細藻類の１倍体よりも大きい場合には、当該微細藻類が上記（ａ）の特徴を有すると判定される。
　イデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体が、上記（ｂ）の特徴を有するか否かは、当該微細藻類の１倍体と当該微細藻類と同じ種である天然の微細藻類とを、ナトリウムイオン濃度が０．０５Ｍ以下であるｐＨ１．０～６．０の培地で培養し、培養開始後７日間の増殖速度を比較することにより判定することができる。前記増殖速度が、天然の微細藻類の１倍体よりも小さい場合には、当該微細藻類が上記（ｂ）の特徴を有すると判定される。
　イデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体が、上記（ｃ）の特徴を有するか否かは、当該微細藻類の１倍体を、ナトリウムイオン濃度が０．０５Ｍ以下であるｐＨ１．０～６．０の培地及びナトリウムイオン濃度が０．５ＭであるｐＨ１．０～６．０の培地で培養し、両培地における培養開始後７日間の増殖速度を比較することにより判定することができる。前記ナトリウムイオン濃度が０．５ＭであるｐＨ１．０～６．０の培地での増殖速度が、ナトリウムイオン濃度が０．０５Ｍ以下であるｐＨ１．０～６．０の培地での増殖速度よりも大きい場合には、当該微細藻類が上記（ｃ）の特徴を有すると判定される。
　ナトリウムイオン濃度が０．５ＭであるｐＨ１．０～６．０の培地、及びナトリウムイオン濃度が０．０５Ｍ以下であるｐＨ１．０～６．０の培地としては、上記「＜淡水産微細藻類の培養方法＞」で挙げた培地と同様の培地が挙げられる。上記（ａ）～（ｃ）における培養条件としては、例えば、培養温度４２℃、二酸化炭素濃度２％、照度６０μｍｏｌ／ｍ２ｓの連続光の条件での静置培養が挙げられる。培養スケールは、特に限定されないが、例えば、２４穴プレートを用いて、１ｍＬの培養液で培養することができる。
　本実施形態のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体は、前記実施形態の淡水産微細藻類の生産方法により得ることができる。イデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体の具体例としては、シアニディオシゾン・メロラエ、シアニジウム属する微細藻類の１倍体、及びガルデリア属に属する微細藻類の１倍体が挙げられる。シアニジウム属に属する微細藻類の１倍体の具体例としては、ＨＫＮ１株（１倍体）及びＹＦＵ３株（１倍体）が挙げられる。ガルデリア属に属する微細藻類の１倍体の具体例としては、Ｇ．　ｐａｒｔｉｔａ、及びＧ．　ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ等が挙げられる。中でも、シアニジウム属に属する微細藻類又はガルデリア属に属する微細藻類の１倍体が好ましく、シアニジウム属に属する微細藻類の１倍体がより好ましく、ＨＫＮ１株（１倍体）又はＹＦＵ３株（１倍体）がさらに好ましく、ＨＫＮ１株（１倍体）が特に好ましい。
　本実施形態のイデユコゴメ綱に属する微細藻類は、ナトリウムイオン濃度が０．６Ｍ以上であるｐＨ１．０～６．０の培地で増殖できることが好ましく、ナトリウムイオン濃度が０．７Ｍ以上であるｐＨ１．０～６．０の培地で増殖できることがより好ましく、ナトリウムイオン濃度が０．８Ｍ以上であるｐＨ１．０～６．０の培地で増殖できることがさらに好ましく、ナトリウムイオン濃度が０．９Ｍ以上であるｐＨ１．０～６．０の培地で増殖できることが特に好ましい。本実施形態のイデユコゴメ綱に属する微細藻類は、ナトリウムイオン濃度が１Ｍ以上であるｐＨ１．０～６．０の培地で増殖できるものであってもよい。
　本実施形態のイデユコゴメ綱に属する微細藻類は、ナトリウムイオン濃度が０．５ＭであるｐＨ１．０～６．０の培地で培養した後、ナトリウムイオン濃度が０．５ＭであるｐＨ１．０～６．０の新たな培地に植え継いだ場合であっても増殖速度が維持されることが好ましい。これにより、本実施形態の微細藻類を、ナトリウムイオン濃度が０．５ＭであるｐＨ１．０～６．０の培地で継体培養して維持することができる。また、前記のように維持した本実施形態の微細藻類を、任意の時期に、ナトリウムイオン濃度が０．５ＭであるｐＨ１．０～６．０の培地で大量培養した場合でも、良好に増殖させることができる。
　本実施形態のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体は、海水と同程度のナトリウムイオン濃度で良好に増殖することができるため、海水に、窒素含有塩、リン含有塩及び鉄含有塩を少なくとも添加し、且つｐＨ１．０～６．０に調整した培地を用いて良好に増殖させることができる。そのような培地の具体例としては、前記「＜淡水産微細藻類の培養方法＞」の「［本培養工程］」で挙げたものと同様のものが挙げられる。
　本実施形態のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体は、高ナトリウムイオン濃度及び低ｐＨの環境で良好に増殖することができるため、屋外大量培養に好適に用いることができる。
　以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
（培地の調製）
　表１に示す組成のＭ－Ａｌｌｅｎ培地（ＭＡ培地）を調製した。具体的には、Ａ２　Ｆe　ｓｔｏｃｋ以外の培地成分を混合し、硫酸でｐＨ２．０に調整した後、オートクレーブにより滅菌した。オートクレーブ滅菌後、フィルター滅菌した４ｍＬのＡ２　Ｆｅ　ｓｔｏｃｋを添加し、ＭＡ培地とした。
　表２及び表３に、Ａ２　ｔｒａｃｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ及びＡ２　Ｆｅ　ｓｔｏｃｋの組成をそれぞれ示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　ＭＡ培地に、０．３Ｍ　ＮａＣｌを加えて、ＭＡ＋０．３Ｍ　ＮａＣｌ培地を調製した。また、ＭＡ培地に、０．５Ｍ　ＮａＣｌを加えて、ＭＡ＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ培地を調製した。ＭＡ＋０．３Ｍ　ＮａＣｌ培地及びＭＡ＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ培地の組成を表４及び表５にそれぞれ示す。表４及び表５中のＡ２　ｔｒａｃｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ及びＡ２　Ｆｅ　ｓｔｏｃｋは、それぞれ表２及び表３に示すものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　以下の実施例において、前記培地を前培養又は本培養に用いる場合、各培地を下記のように表記する場合がある。
前培養に用いる場合
　ＭＡ培地：培地（Ａ）
　ＭＡ＋０．３M　ＮａＣｌ培地：培地（Ｂ）
　ＭＡ＋０．５M　ＮａＣｌ培地：培地（Ｃ）
本培養に用いる場合
　ＭＡ培地：培地（ａ）
　ＭＡ＋０．３M　ＮａＣｌ培地：培地（ｂ）
　ＭＡ＋０．５M　ＮａＣｌ培地：培地（ｃ）
（生育状況の測定）
　微細藻類の生育状況は、細胞濁度（ＯＤ７５０）により確認した。具体的には、吸光度計（ＢＩＯ－ＲＡＤ　社のＳｍａｒｔＳｐｅｃ　Ｐｌｕｓ）を用いて、藻類培養液の７５０ｎｍにおける吸光度を測定し、細胞濁度（ＯＤ７５０）を求めた。
（培養方法）
　シアニジウム・エスピー　ＨＫＮ１の培養は、前培養も本培養もともに、特に断りのない限り、ＣＯ２インキュベーター内での、静置培養により行った。培養温度は４２℃とし、照度６０μｍｏｌ／ｍ２ｓの連続光を用い、ＣＯ２濃度は２％とした。特に断りのない限り、培養は、２４穴プレートで、１ｍＬの培養液で行った。
　シアニディオシゾン・メロラエ　１０Ｄの培養は、前培養も本培養もともに、特に断りのない限り、通気培養（３００ｍＬ　ａｍｂｉｅｎｔ　ａｉｒ／ｍｉｎ）により行った。培養温度は４２℃とし、照度６０μｍｏｌ／ｍ２ｓの連続光を用いた。特に断りのない限り、培養は、２４穴プレートで、１ｍＬの培養液で行った。
　シアニジウム・エスピー　ＨＫＮ１及びシアニディオシゾン・メロラエ　１０Ｄのいずれも、前培養開始時及び本培養開始時の細胞濁度は、ＯＤ７５０＝０．１となるようにした。特に断りのない限り、培養は、２４穴プレートで、１ｍＬの培養液で行った。
（ポリリン酸の定性分析）
　ポリリン酸の存在については次のようにＤＡＰＩ染色により観察した。
　培養液に最終濃度１％（ｗ／ｖ）になる様にｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅを加えた後に、最終濃度が３μｇ／ｍＬになる様にＤＡＰＩを加え、蛍光顕微鏡で観察した。
（液胞の定性分析）
　液胞の存在については次のようにキナクリン染色により観察した。
　培養液に最終濃度が１００ｍＭになる様に１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ　８．０）緩衝液を加えた後に、最終濃度が４０μｇ／ｍＬになる様にキナクリンを加え、１５分間、室温で静置した。遠心後（１５００ｇ、５分）、上澄みを捨て、沈殿にＭＡ培地を加え、３７℃で３０分静置し、蛍光顕微鏡で観察した。
［実施例１］
　シアニジウム・エスピー　ＨＫＮ１（１倍体）（以下、「ＨＫＮ１（１倍体）」と略記する場合がある）を、ＭＡ培地（培地（Ａ））を用いて１週間前培養した。前記前培養後、培地（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）を用いて７日間静置培養した（本培養）。本培養中、経時的に培地のＯＤ７５０を測定して、ＨＫＮ１（１倍体）の生育状況を確認した。
　また、ＨＫＮ１（１倍体）をＭＡ＋０．３Ｍ　ＮａＣｌ（培地（Ｂ））を用いて１週間前培養した。前記前培養後、培地（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）を用いて７日間静置培養した（本培養）。本培養中、経時的に培地のＯＤ７５０を測定して、ＨＫＮ１（１倍体）の生育状況を確認した。
　結果を表６及び図１に示す。図１は、表１に示すＯＤ７５０の変化をグラフにしたものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表６及び図１に示すように、前培養が培地（Ａ）であった場合、本培養が培地（ａ）及び培地（ｂ）のときには同様の増殖を示したが、本培養が培地（ｃ）のときには増殖しなかった。
　一方、前培養が培地（Ｂ）であった場合、本培養が培地（ｃ）のときでも、上記培地（ａ）及び培地（ｂ）の場合と同様の増殖を示した。
［実施例２］
　天然海水としてナジーム１０（表層の海水：日本ＱＣＥ　ｂｌｕｅｌａｂ事業部）を使用した。ＭＡ培地の成分をそれぞれ海水（ナジーム１０）に添加して、ＨＫＮ１（１倍体）を培養し、ＭＡ培地中のどの成分がＨＫＮ１（１倍体）の生育に寄与するのかを確認した。
　本培養に用いた培地を表７～８に示す。ナジーム１０に、表７～８に示すＭＡ培地成分を添加して、硫酸でｐＨ２．０に調整し、培地１～１７を調製した。なお、マグネシウム及びカルシウムは、海水中に豊富に存在するため、培地１～１６では、ＭｇＳＯ４及びＣａＣｌ２を添加しなかった。培地１７は、ポジティブコントロールとして、ＭＡ培地相当のＭｇＳＯ４及びＣａＣｌ２を添加した。
　ＨＫＮ１（１倍体）を培地（Ｂ）で１週間、前培養した後、培地１～１７のいずれかの培地で１０日間、本培養を行った。本培養１０日後、培地のＯＤ７５０を測定し、ＨＫＮ１（１倍体）の生育状況を確認した。結果を表７～８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　表７～８に示すように、培地１６及び培地１７は同等の増殖を示した。これらの結果から、海水に、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、Ａ２　Ｆｅ　ｓｔｏｃｋ、及びＡ２　ｔｒａｃｅ　ｍｅｔａｌ　ｅｌｅｍｅｎｔを添加することにより、ＨＫＮ１（１倍体）の生育に適した海水培地として使用できることが確認できた。
　上記培地１６の組成を表９に示す。以下の実施例で「海水培地」と表記するものは、表９に示す組成の培地である。表９中のＡ２　ｔｒａｃｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ及びＡ２　Ｆｅ　ｓｔｏｃｋは、それぞれ表２及び表３に示すものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
［実施例３］
　ＨＫＮ１（１倍体）をＭＡ＋０．３Ｍ　ＮａＣｌ培地（培地（Ｂ））で１週間前培養し、ＭＡ＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ培地（ポジティブコントロール）（培地（ｃ））又は海水培地で、７日間、本培養した。本培養中、経時的に培地のＯＤ７５０を測定して、ＨＫＮ１（１倍体）の生育状況を確認した。
　結果を表１０及び図２に示す。図２は、表１０に示すＯＤ７５０の変化をグラフにしたものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　表１０及び図２に示すように、ＨＫＮ１（１倍体）は、培地（ｃ）及び海水培地のいずれの培地で本培養を行った場合でも同等の増殖を示した。
［実施例４］
　ＨＫＮ１（１倍体）の生育に及ぼすｐＨの影響を確認するために、ｐＨをｐＨ２～７の間で変化させた海水培地をそれぞれ用意した。ｐＨの調製は、硫酸又は水酸化カリウムを用いて行った。
　ＨＫＮ１（１倍体）をＭＡ＋０．３Ｍ　ＮａＣｌ（培地（Ｂ））で１週間前培養し、上述のようにｐＨを調整した各海水培地で、７日間、本培養した。本培養終了後、最終的な培地のＯＤ７５０を測定して、ＨＫＮ１（１倍体）の生育状況を確認した。
　結果を表１１、及び図３に示す。図３は、表１１に示すＯＤ７５０をグラフにしたものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　表１１及び図３に示すように、ＨＫＮ１（１倍体）は、ｐＨ６以下では増殖できるが、ｐＨ７では増殖できなかった。なお、一般的に、アンモニアを窒素源とする培地で藻類を増殖させると、藻類の増殖に伴いｐＨが低下するため、緩衝剤やアルカリ性物質を加えてｐＨを中性付近に維持する必要がある。しかしながら、好酸性のＨＫＮ１（１倍体）でｐＨ調整の必要はなかった。
［実施例５］
　シアニジウム・エスピー　ＨＫＮ１（２倍体）（以下、「ＨＫＮ１（２倍体）」と略記する場合がある）を、ＭＡ培地（培地（Ａ））を用いて１週間前培養した。前記前培養後、培地（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）を用いて７日間静置培養した（本培養）。本培養中、経時的に培地のＯＤ７５０を測定して、ＨＫＮ１（２倍体）の生育状況を確認した。
　また、ＨＫＮ１（２倍体）をＭＡ＋０．３Ｍ　ＮａＣｌ（培地（Ｂ））を用いて１週間前培養した。前記前培養後、培地（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）を用いて７日間静置培養した（本培養）。本培養中、経時的に培地のＯＤ７５０を測定して、ＨＫＮ１（２倍体）の生育状況を確認した。
　結果を表１２及び図４に示す。図４は、表１２に示すＯＤ７５０の変化をグラフにしたものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　表１２及び図４に示すように、ＨＫＮ１（２倍体）は、培地（Ａ）及び培地（Ｂ）のいずれの培地で前培養を行った場合でも、培地（ａ）、培地（ｂ）及び培地（ｃ）の本培養で同等の増殖速度を示した。
［実施例６］
　ＨＫＮ１（２倍体）をＭＡ＋０．３Ｍ　ＮａＣｌ培地（培地（Ｂ））で１週間前培養し、ＭＡ＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ培地（ポジティブコントロール）（培地（ｃ））又は海水培地で、７日間、本培養した。本培養中、経時的に培地のＯＤ７５０を測定して、ＨＫＮ１（２倍体）の生育状況を確認した。
　結果を表１３及び図５に示す。図５は、表１３に示すＯＤ７５０の変化をグラフにしたものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　表１３及び図５に示すように、ＨＫＮ１（２倍体）は、培地（ｃ）及び海水培地のいずれの培地で本培養を行った場合でも同等の増殖速度を示した。
［実施例７］
　シアニディオシゾン・メロラエ　１０Ｄ（以下、「１０Ｄ）」と略記する場合がある）を、ＭＡ培地（培地（Ａ））を用いて１週間前培養した。前記前培養後、培地（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）を用いて７日間静置培養した（本培養）。本培養中、経時的に培地のＯＤ７５０を測定して、１０Ｄの生育状況を確認した。
　また、１０ＤをＭＡ＋０．３Ｍ　ＮａＣｌ（培地（Ｂ））を用いて１週間前培養した。前記前培養後、培地（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）を用いて７日間静置培養した（本培養）。本培養中、経時的に培地のＯＤ７５０を測定して、１０Ｄの生育状況を確認した。
　結果を表１４及び図６に示す。図６は、表１４に示すＯＤ７５０の変化をグラフにしたものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　表１４及び図６に示すように、１０Ｄは、前培養が培地（Ａ）であった場合、本培養が培地（ａ）及び培地（ｂ）のときには同様の増殖を示した。一方、本培養が培地（ｃ）のときには、本培養３日までは徐々にＯＤ７５０が低下したが、５日目に回復し、その後は培地（ａ）及び培地（ｂ）と同等の増殖速度を示した。
　一方、前培養が培地（Ｂ）であった場合、本培養が培地（ｃ）のときでも、培養開始時から、上記培地（ａ）及び培地（ｂ）の場合と同様の増殖を示した。
［実施例８］
　１０ＤをＭＡ＋０．３Ｍ　ＮａＣｌ培地（培地（Ｂ））で１週間前培養し、ＭＡ＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ培地（ポジティブコントロール）（培地（ｃ））又は海水培地で、７日間、本培養した。本培養中、経時的に培地のＯＤ７５０を測定して、１０Ｄの生育状況を確認した。
　結果を表１５及び図７に示す。図７は、表１５に示すＯＤ７５０の変化をグラフにしたものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　表１５及び図７に示すように、１０Ｄは、培地（ｃ）及び海水培地のいずれの培地で本培養を行った場合でも同等の増殖速度を示した。
［実施例９］
　ＭＡ培地で１週間培養したＨＫＮ１（１倍体）を、ＯＤ７５０＝０．１となるようにＭＡ培地に移植して、７日間、ＣＯ２インキュベーター内（２％ＣＯ２）で静置培養し、ＨＫＮ１（１倍体）のＭＡ培地培養品とした。　ＭＡ培地で１週間培養したＨＫＮ１（１倍体）を、ＭＡ培地＋０．３Ｍ　ＮａＣｌで１週間前培養した後、ＭＡ培地＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ培地に移植し、７日間、ＣＯ２インキュベーター内（２％ＣＯ２）で静置培養した。これを、ＭＡ培地＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ培地培養品とした。
　ＭＡ培地で１週間培養したＨＫＮ１（１倍体）を、ＭＡ培地＋０．３Ｍ　ＮａＣｌで１週間前培養した後、海水培地に移植し、７日間、ＣＯ２インキュベーター内（２％ＣＯ２）で静置培養した。これを海水培地培養品とした。
　各培地培養品について、ＤＡＰＩによりポリリン酸の定性分析を、キナクリンにより液胞の定性分析を行った。
　結果を図８に示す。
　ＭＡ培地培養品、ＭＡ培地＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ培地培養品、海水培地培養品をＤＡＰＩで染色したところ、ＭＡ培地培養品にのみポリリン酸が認められた。ポリリン酸が存在すると言われる液胞をキナクリンで染色したところ、液胞の染色のされ方に違いはなかった。
［実施例１０］
　藻類としてＨＫＮ１（２倍体）を用いたこと以外は実施例９と同様にして培養して、ＭＡ培地培養品、ＭＡ培地＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ培地培養品、及び海水培地培養品の３種類の培養品を製造した。それぞれ、実施例９と同様に、ＤＡＰＩによりポリリン酸の定性分析を、キナクリンにより液胞の定性分析を行った。
　結果を図９に示す。ＭＡ培地培養品にはポリリン酸が確認できなかったが、ＭＡ培地＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ培地培養品および海水培地培養品では、表層付近を中心にポリリン酸が観察された。また、ポリリン酸が存在すると言われる液胞はいずれの培養品も同様に観察された。
［実施例１１］
　１０Ｄを、ＭＡ培地（培地（Ａ））又はＭＡ＋０．３Ｍ　ＮａＣｌ（培地（Ｂ））を用いて１週間前培養した。前記前培養後、ＮａＣｌ濃度を０～１０００ｍＭの間で変化させたＭＡ培地で、７日間、本培養した。本培養終了後、最終的な培地のＯＤ７５０を測定して、１０Ｄの生育状況を確認した。結果を表１６に示す。
　また、培地（Ｂ）での前培養後、ＭＡ＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ培地（培地（ｃ））で１０Ｄを７日間本培養して得られた藻類細胞を、ＭＡ培地（培地（ａ））又はＭＡ＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ培地（培地（ｃ））に植え継ぎ、さらに７日間培養した。培養終了後、最終的な培地のＯＤ７５０を測定して、１０Ｄの生育状況を確認した。結果を表１７に示す。
　本培養開始時及び植え継ぎ時の培地のＯＤ７５０は０．１となるようにした。以下の実施例１２～１７でも同様とした。表１７中、「式（１）－（Ａ）」は、培地（Ａ）で前培養した後、表に示すＮａＣｌ濃度で本培養した微細藻類の式（１）で算出した値を示す。「式（１）－（Ｂ）」は、培地（Ｂ）で前培養した後、表に示すＮａＣｌ濃度で本培養した微細藻類の式（１）で算出した値を示す。以下、実施例１２～１７でも同様である。ＯＤ７５０が＜０．１であるものは、式（１）で値を算出できないため、「－」とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
　表１６に示すように、培地（Ｂ）で前培養したものでは、培地（Ａ）で前培養したものと比較して、ＮａＣｌ　０ｍＭの培地で本培養した場合の増殖が抑制された。一方、５００ｍＭ以上の高ＮａＣｌ濃度では、培地（Ａ）で前培養したものでは、増殖が認められなかったのに対し、培地（Ｂ）で前培養したものでは５００ｍＭの高塩濃度でも増殖が確認された。
　表１７に示すように、培地（ｃ）で本培養した後、培地（ａ）に植え継いだものでは増殖が抑制されたが、培地（ｃ）に植え継いだものでは、良好な増殖が見られた。
　また、培地（ｃ）で本培養して得られた藻類細胞は、培養液を遠心後に藻類細胞を回収し、ｐＨ７の蒸留水に投入したところ、細胞が破裂することが確認された。　
［実施例１２］
　ＨＫＮ１（１倍体）を、ＭＡ培地（培地（Ａ））又はＭＡ＋０．３Ｍ　ＮａＣｌ（培地（Ｂ））を用いて１週間前培養した。前記前培養後、ＮａＣｌ濃度を０～１０００ｍＭの間で変化させたＭＡ培地で、７日間、本培養した。本培養終了後、最終的な培地のＯＤ７５０を測定して、ＨＫＮ１（１倍体）の生育状況を確認した。結果を表１８に示す。
　また、培地（Ｂ）での前培養後、ＭＡ＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ培地（培地（ｃ））でＨＫＮ１（１倍体）を７日間本培養して得られた藻類細胞を、ＭＡ培地（培地（ａ））又はＭＡ＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ培地（培地（ｃ））に植え継ぎ、さらに７日間培養した。培養終了後、最終的な培地のＯＤ７５０を測定して、ＨＫＮ１（１倍体）の生育状況を確認した。結果を表１９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
　表１８に示すように、培地（Ｂ）で前培養したものでは、ＮａＣｌ　０ｍＭの培地で本培養した場合の増殖が認められなかった。一方、４００ｍＭ以上の高ＮａＣｌ濃度では、培地（Ａ）で前培養したものでは、増殖が認められなかったのに対し、培地（Ｂ）で前培養したものでは４００ｍＭ以上の高塩濃度でも増殖が確認された。　
　表１９に示すように、培地（ｃ）で本培養した後、培地（ａ）に植え継いだものでは増殖が抑制されたが、培地（ｃ）に植え継いだものでは、良好な増殖が見られた。
［実施例１３］
　ＨＫＮ１（２倍体）を、ＭＡ培地（培地（Ａ））又はＭＡ＋０．３Ｍ　ＮａＣｌ（培地（Ｂ））を用いて１週間前培養した。前記前培養後、ＮａＣｌ濃度を０～１０００ｍＭの間で変化させたＭＡ培地で、７日間、本培養した。本培養終了後、最終的な培地のＯＤ７５０を測定して、ＨＫＮ１（２倍体）の生育状況を確認した。結果を表２０に示す。
　また、培地（Ｂ）での前培養後、ＭＡ＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ培地（培地（ｃ））でＨＫＮ１（２倍体）を７日間本培養して得られた藻類細胞を、ＭＡ培地（培地（ａ））又はＭＡ＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ培地（培地（ｃ））に植え継ぎ、さらに７日間培養した。培養終了後、最終的な培地のＯＤ７５０を測定して、ＨＫＮ１（２倍体）の生育状況を確認した。結果を表２１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
　表２０に示すように、培地（Ｂ）で前培養したものでは、培地（Ａ）で前培養したものと比較して、ＮａＣｌ低濃度の培地で本培養した場合の増殖が若干抑制される傾向にあった。一方、８００ｍＭ以上の高ＮａＣｌ濃度では、培地（Ａ）で前培養したものでは、増殖が認められなかったのに対し、培地（Ｂ）で前培養したものでは８００ｍＭ以上の高塩濃度でも増殖が確認された。
　表２１に示すように、培地（ｃ）で本培養した後、培地（ａ）に植え継いだもの及び培地（ｃ）に植え継いだもののいずれも、良好な増殖が見られた。
［実施例１４］
　Ｇａｌｄｉｅｒｉａ　ｐａｒｔｉｔａ　（ＮＢＲＣ　１０２７５９）（１倍体）を、ＭＡ培地（培地（Ａ））又はＭＡ＋０．３Ｍ　ＮａＣｌ（培地（Ｂ））を用いて１週間前培養した。前記前培養後、ＮａＣｌ濃度を０～１０００ｍＭの間で変化させたＭＡ培地で、７日間、本培養した。本培養終了後、最終的な培地のＯＤ７５０を測定して、Ｇ．　ｐａｒｔｉｔａ（１倍体）の生育状況を確認した。結果を表２２に示す。
　また、培地（Ｂ）での前培養後、ＭＡ＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ培地（培地（ｃ））でＧ．　ｐａｒｔｉｔａ（１倍体）を７日間本培養して得られた藻類細胞を、ＭＡ培地（培地（ａ））又はＭＡ＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ培地（培地（ｃ））に植え継ぎ、さらに７日間培養した。培養終了後、最終的な培地のＯＤ７５０を測定して、Ｇ．　ｐａｒｔｉｔａ（１倍体）の生育状況を確認した。結果を表２３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
　表２２に示すように、培地（Ｂ）で前培養したものでは、培地（Ａ）で前培養したものと比較して、ＮａＣｌ　０ｍＭの培地で本培養した場合の増殖が抑制された。一方、７００ｍＭ以上の高ＮａＣｌ濃度では、培地（Ｂ）で前培養したものは、培地（Ａ）で前培養したものと比較して、増殖抑制率が低かった。
　表２３に示すように、培地（ｃ）で本培養した後、培地（ａ）に植え継いだものでは増殖が抑制されたが、培地（ｃ）に植え継いだものでは、良好な増殖が見られた。
［実施例１５］
　Ｇ．　ｐａｒｔｉｔａ（２倍体）を、ＭＡ培地（培地（Ａ））又はＭＡ＋０．３Ｍ　ＮａＣｌ（培地（Ｂ））を用いて１週間前培養した。前記前培養後、ＮａＣｌ濃度を０～１０００ｍＭの間で変化させたＭＡ培地で、７日間、本培養した。本培養終了後、最終的な培地のＯＤ７５０を測定して、Ｇ．　ｐａｒｔｉｔａ（２倍体）の生育状況を確認した。結果を表２４に示す。
　また、培地（Ｂ）での前培養後、ＭＡ＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ培地（培地（ｃ））でＧ．　ｐａｒｔｉｔａ（２倍体）を７日間本培養して得られた藻類細胞を、ＭＡ培地（培地（ａ））又はＭＡ＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ培地（培地（ｃ））に植え継ぎ、さらに７日間培養した。培養終了後、最終的な培地のＯＤ７５０を測定して、Ｇ．　ｐａｒｔｉｔａ（２倍体）の生育状況を確認した。結果を表２５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
　表２４に示すように、培地（Ｂ）で前培養したものでは、培地（Ａ）で前培養したものと比較して、高ＮａＣｌ濃度の培地での増殖が向上する傾向があった。
　表２５に示すように、培地（ｃ）で本培養した後、培地（ａ）に植え継いだもの及び培地（ｃ）に植え継いだもののいずれも、良好な増殖が見られた。
［実施例１６］
　Ｇａｌｄｉｅｒｉａ　ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ（ＳＡＧ１０８．７９）（１倍体）を、ＭＡ培地（培地（Ａ））又はＭＡ＋０．３Ｍ　ＮａＣｌ（培地（Ｂ））を用いて１週間前培養した。前記前培養後、ＮａＣｌ濃度を０～１０００ｍＭの間で変化させたＭＡ培地で、７日間、本培養した。本培養終了後、最終的な培地のＯＤ７５０を測定して、Ｇ．　ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ（１倍体）の生育状況を確認した。結果を表２６に示す。
　また、培地（Ｂ）での前培養後、ＭＡ＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ培地（培地（ｃ））でＧ．　ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ（１倍体）を７日間本培養して得られた藻類細胞を、ＭＡ培地（培地（ａ））又はＭＡ＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ培地（培地（ｃ））に植え継ぎ、さらに７日間培養した。培養終了後、最終的な培地のＯＤ７５０を測定して、Ｇ．　ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ（１倍体）の生育状況を確認した。結果を表２７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
　表２６に示すように、培地（Ｂ）で前培養したものでは、培地（Ａ）で前培養したものと比較して、ＮａＣｌ　０ｍＭの培地で本培養した場合の増殖が抑制された。一方、７００ｍＭ以上の高ＮａＣｌ濃度では、培地（Ａ）で前培養したものでは、増殖が認められなかったのに対し、培地（Ｂ）で前培養したものでは７００ｍＭ以上の高塩濃度でも増殖が確認された。
　表２７に示すように、培地（ｃ）で本培養した後、培地（ａ）に植え継いだものでは増殖が抑制されたが、培地（ｃ）に植え継いだものでは、良好な増殖が見られた。
［実施例１７］
　Ｇ．　ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ（２倍体）を、ＭＡ培地（培地（Ａ））又はＭＡ＋０．３Ｍ　ＮａＣｌ（培地（Ｂ））を用いて１週間前培養した。前記前培養後、ＮａＣｌ濃度を０～１０００ｍＭの間で変化させたＭＡ培地で、７日間、本培養した。本培養終了後、最終的な培地のＯＤ７５０を測定して、Ｇ．　ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ（２倍体）の生育状況を確認した。結果を表２８に示す。
　また、培地（Ｂ）での前培養後、ＭＡ＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ培地（培地（ｃ））でＧ．　ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ（２倍体）を７日間本培養して得られた藻類細胞を、ＭＡ培地（培地（ａ））又はＭＡ＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ培地（培地（ｃ））に植え継ぎ、さらに７日間培養した。培養終了後、最終的な培地のＯＤ７５０を測定して、Ｇ．　ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ（２倍体）の生育状況を確認した。結果を表２９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
　表２８に示すように、培地（Ｂ）で前培養したものでは、培地（Ａ）で前培養したものと比較して、高ＮａＣｌ濃度の培地での増殖が向上する傾向があった。
　表２９に示すように、培地（ｃ）で本培養した後、培地（ａ）に植え継いだもの及び培地（ｃ）に植え継いだもののいずれも、良好な増殖が見られた。
　上記の結果を総合すると、１倍体の淡水産微細藻類では、０．３ＭのＮａＣｌ濃度で前培養を行うことにより、０ＭのＮａＣｌで前培養したときと比較して、０．５Ｍ以上のＮａＣｌ濃度で本培養したときの増殖が向上することが確認された。これにより、前記式（１）で算出される値が２以上となった。また、０．３Ｍ以上のＮａＣｌ濃度で培養を行った後は、０ＭのＮａＣｌで前培養したときと比較して、０ＭのＮａＣｌ濃度での増殖が抑制されることが確認された。また、０．３ＭのＮａＣｌ濃度で前培養を行うことにより、０ＭのＮａＣｌ濃度の培地での増殖速度よりも、０．５ＭのＮａＣｌ濃度の培地での増殖速度が上昇する傾向にあった。また、０．５ＭのＮａＣｌ濃度で本培養した後、０．５ＭのＮａＣｌ濃度の培地への植え継ぎが可能なことも確認された。
　また、０．３ＭのＮａＣｌ濃度で前培養を行うことにより、１倍体の淡水産微細藻類でも、５００～１０００ｍＭの高ＮａＣｌ濃度の範囲で増殖可能であることが確認された。屋外培養を想定した場合、水の蒸発や、雨水の流入により、培養中に塩濃度が変動することが考えられる。上記の結果より、０．３ＭのＮａＣｌ濃度で前培養したイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体は、塩濃度の変動に対する寛容性を示し、屋外培養に十分耐えることが示された。
［実施例１８］
　ＨＫＮ１（１倍体）を、ＭＡ＋０．３Ｍ　ＮａＣｌ培地（培地（Ｂ））で７日間前培養した後、さらに海水培地で１週間前培養した。次いで、前記のＨＫＮ１（１倍体）を、１０Ｌの海水培地に植え継いで本培養を行った。本培養は、ビニールハウス中で行い、光、温度及びＣＯ２濃度の制御は行わなかった。本培養は、通気培養で行い、培養期間は、２０１９年５月１３日～２０１９年７月１日とした。定期的に培養液をサンプリングし、７５０ｎｍの吸光度を測定した。その結果を図１０に示す。
　図１０に示すように、１０Ｌのスケールでも、海水培地で良好に増殖できることが確認された。
［実施例１９］
　ＨＫＮ１（１倍体）を、ＭＡ培地、ＭＡ＋０．３Ｍ　ＮａＣｌ培地、又はＭＡ＋０．５　ＮａＣｌ培地で７日間培養した。２ｍＬの培地に懸濁したときに、ＯＤ７５０＝１となる量の藻類細胞を含む培養液を３本のマイクロチューブに回収した。培養液の遠心分離（１５００×ｇ、５分）を行い、上清を除去し、ペレットを回収した。ペレットとして回収した各藻類細胞を、下記処理１～３のいずれかで処理した。
　処理１：ＭＡ培地２ｍＬに懸濁し、ボルテックスで１０分間振盪した。
　処理２：前記培養に用いた培地と同じ培地２ｍＬに懸濁し、ボルテックスで１０分間振盪した。
　処理３：前記培養に用いた培地と同じ培地０．１ｍＬに懸濁後、－１９６℃で凍結し、前記培養に用いた培地と同じ培地で２ｍＬとなるようにメスアップし、ボルテックスで１０分間振盪した。
　藻類細胞が壊れると、細胞内容物が培地中に放出され、フィコシアニン（ＰＣ）が酸性の培地に晒されて退色する。凍結処理（処理３）により、藻類細胞が１００％死滅すると仮定し、下記式により処理１による藻類細胞の死滅率を算出した。
　死滅率（％）＝｛（処理２後のＰＣ濃度－処理１後のＰＣ濃度）／（処理２後ＰＣ濃度－処理３後のＰＣ濃度）｝×１００
　ＰＣ濃度は、積分球（ＩＳＲ－２６００Ｐｌｕｓ；島津製作所）を取り付けた分光光度計（ＵＶ－２６００；島津製作所）を用いて、６２０ｎｍ及び６７８ｎｍの吸光度を測定することにより測定した。ＰＣ濃度は、以下の式により算出した。
　ＰＣ濃度（μｇ／ｍｌ）＝１３８．５×A６２０－３５．４９×A６７８
　結果を表３０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000031
　表３０に示すように、ＭＡ＋０．３Ｍ　ＮａＣｌ培地又はＭＡ＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ培地で培養した藻類細胞は、ＭＡ培地への再懸濁により細胞が壊れやすくなっていることが確認された。
［実施例２０］
　ＨＫＮ１（１倍体）に替えて１０Ｄを用いたこと以外は、実施例１９と同様の方法で、前記処理１による藻類細胞の死滅率を算出した。その結果を表３１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000032
　表３１に示すように、ＭＡ＋０．３Ｍ　ＮａＣｌ培地又はＭＡ＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ培地で培養した藻類細胞は、ＭＡ培地への再懸濁により細胞が壊れやすくなっていることが確認された。また、ＭＡ＋０．３Ｍ　ＮａＣｌ培地で培養した藻類細胞に比べて、ＭＡ＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ培地で培養した藻類細胞の方が、死滅率が高くなった。
［実施例２１］
　ＨＫＮ１（１倍体）に替えてＧ．　ｐａｒｔｉｔａ（１倍体）を用いたこと以外は、実施例１９と同様の方法で、前記処理１による藻類細胞の死滅率を算出した。その結果を表３２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000033
　表３２に示すように、ＭＡ＋０．３Ｍ　ＮａＣｌ培地又はＭＡ＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ培地で培養した藻類細胞は、ＭＡ培地への再懸濁により細胞が壊れやすくなっていることが確認された。また、ＭＡ＋０．３Ｍ　ＮａＣｌ培地で培養した藻類細胞に比べて、ＭＡ＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ培地で培養した藻類細胞の方が、死滅率が高くなった。
［実施例２２］
　ＨＫＮ１（１倍体）に替えてＧ．　ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ（１倍体）を用いたこと以外は、実施例１９と同様の方法で、前記処理１による藻類細胞の死滅率を算出した。その結果を表３３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000034
　表３３に示すように、ＭＡ＋０．３Ｍ　ＮａＣｌ培地又はＭＡ＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ培地で培養した藻類細胞は、ＭＡ培地への再懸濁により細胞が壊れやすくなっていることが確認された。また、ＭＡ＋０．３Ｍ　ＮａＣｌ培地で培養した藻類細胞に比べて、ＭＡ＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ培地で培養した藻類細胞の方が、死滅率が高くなった。
　本発明によれば、低ｐＨ且つ高ナトリウムイオン濃度環境下で淡水産微細藻類を良好に増殖させることができる淡水産微細藻類の培養方法、低ｐＨ且つ高ナトリウムイオン濃度環境下で良好に増殖可能な淡水産微細藻類、及び当該淡水産微細藻類の生産方法が提供される。
　本発明によれば、安価に入手できる海水により淡水酸微細藻類を大量に培養することができるので、藻類を利用した有用物質の生産に有用である。さらに、淡水酸微細藻類が大量に培養されれば、それによって大気中の二酸化炭素を吸収することも期待される。

Claims (12)

  1. 　淡水産微細藻類の培養方法であって、
    　淡水産細藻類を、水素イオン濃度ｐＨ１．０～６．０、ナトリウムイオン濃度０．１～０．４Ｍとなるように調製した培地で、培養温度が１５～６０℃で培養する培養工程を含む、
    　淡水産微細藻類の培養方法。
  2. 　淡水産微細藻類の培養方法であって、
    　淡水産微細藻類を、水素イオン濃度ｐＨ１．０～６．０、ナトリウムイオン濃度０．１～０．４Ｍとなるように調製した培地で培養する前培養工程と、
    　前記前培養工程後の淡水産微細藻類を、ナトリウムイオン濃度が前記前培養工程における前記ナトリウムイオン濃度の１．２～５倍であり水素イオン濃度ｐＨ１．０～６．０となるように調製した培地で培養する本培養工程と、
    　を含む、請求項１に記載の淡水産微細藻類の培養方法。
  3. 　前記本培養工程における前記培地が、水素イオン濃度ｐＨ１．０～６．０、ナトリウムイオン濃度が０．４Ｍ以上となるように調製培地である、請求項１又は２に記載の淡水産微細藻類の培養方法。
  4. 　前記本培養工程における前記培地が、海水に、窒素含有塩、リン含有塩及び鉄含有塩を少なくとも添加し、且つ水素イオン濃度ｐＨ１．０～６．０となるように調製した培地である、請求項１～３のいずれか一項に記載の淡水産微細藻類の培養方法。
  5. 　前記淡水産微細藻類が、イデユコゴメ綱に属する微細藻類である、請求項１～４のいずれか一項に記載の淡水産微細藻類の培養方法。
  6. 　ナトリウムイオン濃度が０．５Ｍ以上である培地で増殖できない淡水産微細藻類を、水素イオン濃度ｐＨ１．０～６．０、ナトリウムイオン濃度０．１～０．４Ｍとなるように調製した培地で培養する工程を含む、水素イオン濃度ｐＨ１．０～６．０、ナトリウムイオン濃度０．５Ｍ以上となるように調製した培地で増殖可能な淡水産微細藻類の生産方法。
  7. 　前記淡水産微細藻類が、シアニジウム属に属する微細藻類の１倍体である、請求項６に記載の淡水産微細藻類の生産方法。
  8. 　イデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体であって、
    　水素イオン濃度ｐＨ２．０、ナトリウムイオン濃度０．５Ｍとなるように調製したＭＡ培地で、培養温度４２℃、二酸化炭素濃度２％、照度６０μｍｏｌ／ｍ２ｓの連続光で７日間静置培養したときの下記式（１）で算出される値が２以上であり、
    　水素イオン濃度ｐＨ２．０となるように調整したＭＡ培地で、培養温度４２℃、二酸化炭素濃度２％、照度６０μｍｏｌ／ｍ２ｓの連続光で７日間静置培養したときの下記式（１）で算出される値が２未満である、
    　イデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体。
    　（培養開始７日後のＯＤ７５０値－培養開始時のＯＤ７５０値）／（７×培養開始時ＯＤ７５０値）　　（１）
  9. 　水素イオン濃度ｐＨ７の等張液、または蒸留水中で細胞が破裂する、請求項８に記載のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体。
  10. 　藻類細胞の乾燥処理を行い、前記乾燥処理後の細胞をｐＨ７の等張液に懸濁すると、前記細胞が破裂する、
    　請求項８又は９に記載のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体。
  11. 　請求項８～１０のいずれか一項に記載のイデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体を、海水に、窒素含有塩、リン含有塩及び鉄含有塩を少なくとも添加し、且つ水素イオン濃度ｐＨ１．０～６．０となるように調製した培地で培養することを含む、
    　イデユコゴメ綱に属する微細藻類の１倍体の培養方法。
  12. 　請求項８～１０のいずれか一項に記載のイデユコゴメ綱に属する微細藻類を屋外で培養することを含む、イデユコゴメ綱に属する微細藻類の培養方法。
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