WO2020213718A1 - アーバスキュラー菌根菌の培養用培地及び培養方法 - Google Patents

アーバスキュラー菌根菌の培養用培地及び培養方法 Download PDF

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culture
arbuscular mycorrhizal
semi
culturing
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正代司 川口
幸子 田中
幸司 矢野
康紀 秋山
勝晴 齋藤
辰広 江澤
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大学共同利用機関法人自然科学研究機構
公立大学法人大阪
国立大学法人北海道大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to a medium for culturing arbuscular mycorrhizal fungi and a method for culturing arbuscular mycorrhizal fungi.
  • Mycorrhizal fungi coexist with plants to form mycorrhizas, and mainly absorb phosphorus and nitrogen from the hyphae and supply them to the host plant.
  • arbuscular mycorrhizal fungi which is one of the endophytic mycorrhizal fungi, coexists not only with a specific plant but also with a large number of host plants, so its importance in growing agricultural products is important. large.
  • the symbiosis of arbuscular mycorrhizal fungi contributes to the improvement of disease resistance and the promotion of water absorption in addition to the promotion of absorption of phosphorus and the like.
  • arbuscular mycorrhizal fungi since there is concern about the depletion of phosphate ore, which is a phosphorus resource, further utilization of arbuscular mycorrhizal fungi is desired to reduce phosphorus fertilizer.
  • arbuscular mycorrhizal fungi are absolute symbiotic bacteria that require host plant roots
  • host plants are required for their culture.
  • a method for culturing mycorrhizal fungi there is a pot culture method using sterilized soil, sand, or the like.
  • an aeroponic culture method in which the culture is carried out while spraying liquid fertilizer, and an in vitro culture method using transformed carrot hairy roots. Both of these methods are two-way culture methods in which they coexist with the host plant.
  • the two-way culture method has a risk of contamination with various germs, the growth efficiency of mycorrhizal fungi largely depends on the state of the plant, and the cost increases due to securing land for culture. There is a problem, and a simple method capable of purely culturing only arbuscular mycorrhizal fungi is desired.
  • Non-Patent Document 1 pure culture of arbuscular mycorrhizal fungi in modified M medium rarely forms small spore-like structures.
  • Patent Document 1 pure culturing of mycorrhizal fungi can be easily performed by culturing mycorrhizal fungi in a culture medium to which tryptophane dimer and leucylproline are added, and in Patent Document 2, amine or amine It has been reported that pure culture of mycorrhizal fungi can be easily performed by culturing mycorrhizal fungi in a culture medium to which a derivative is added.
  • Patent Document 3 the present inventors in a basal medium in which arbuscular mycorrhizal fungi can be cultivated, for example, a modified M medium, in which linear saturated fatty acids having 13 to 18 carbon atoms, preferably myristic acid, palmitic acid and the like, are used.
  • Arbus by culturing in a medium containing one or more of these salts at a concentration exceeding 2 ⁇ g / mL (about 10 ⁇ M), and further in a medium containing an organic nitrogen source such as strigolactone or peptone. It has been reported that Kuller mycorrhizal fungi can be efficiently and purely cultured.
  • the present invention provides a medium for culturing arbuscular mycorrhizal fungi and a method for culturing arbuscular mycorrhizal fungi, which can improve the culturing efficiency of arbuscular mycorrhizal fungi and can proliferate a large number of large spores. With the goal.
  • the conventional liquid medium has a problem that the hyphae are entangled and agglomerated and cannot grow uniformly in the culture vessel, resulting in poor culture efficiency. It is difficult to add depleted nutrients to the solid medium for a long period of time. There is a problem that it is not suitable for culturing. Therefore, as a result of intensive studies to achieve the above object, the present inventors uniformly cultivate arbuscular mycorrhizal fungi in a culture medium by culturing arbuscular mycorrhizal fungi in a semi-fluid medium. It has been found that it can be proliferated, a large number of larger spores can be proliferated than before, and long-term culture is possible by subculturing or adding nutrients.
  • the present invention has been completed by further studying based on these findings, and provides the following medium for culturing arbuscular mycorrhizal fungi and a method for culturing arbuscular mycorrhizal fungi.
  • Item 1 A medium for culturing arbuscular mycorrhizal fungi that contains a gelling agent and is in a semi-fluid state.
  • Item 2. The medium according to Item 1, which contains the gelling agent in an amount that makes the medium semi-fluid.
  • Item 3. Item 2. The medium according to Item 1 or 2, wherein the gelling agent is a polysaccharide.
  • Item 4. Item 2. The medium according to any one of Items 1 to 3, which is used for pure culture of arbuscular mycorrhizal fungi.
  • Item 6. Item 2. The medium according to any one of Items 1 to 5, which has a viscosity of 0.1 to 100 mPa ⁇ s.
  • Item 7. A method for culturing arbuscular mycorrhizal fungi, which comprises culturing in a semi-fluid medium containing a gelling agent.
  • Item 9. The culture method according to Item 7 or 8, wherein the gelling agent is a polysaccharide.
  • Item 7-The medium further contains at least one selected from the group consisting of saturated fatty acids having 13 to 18 carbon atoms having a concentration exceeding 11.2 ⁇ g / mL, strigolactone, and an organic nitrogen source.
  • the culture method according to any one of 10. Item 12.
  • the culture efficiency of arbuscular mycorrhizal fungi can be improved, and a large number of large spores can be grown.
  • the present invention is a system that enables long-term culture because it is easy to subculture or add nutrients, and enables large-scale production of arbuscular mycorrhizal fungi. Then, by culturing for a long period of time, it becomes possible to proliferate a large amount of spores.
  • arbuscular mycorrhizal fungi can be grown stably and easily as compared with a co-cultivation method with a host plant whose growth largely depends on the state of the plant.
  • n 3 It is a photograph which shows the result of culturing arbuscular mycorrhizal fungi by changing the gelling agent concentration of gellan gum semi-fluid medium, agar semi-fluid medium or ⁇ -carrageenan semi-fluid medium.
  • the medium for culturing arbuscular mycorrhizal fungi of the present invention contains a gelling agent and is characterized in a semi-fluid state.
  • the method for culturing arbuscular mycorrhizal fungi of the present invention is characterized by culturing in a medium containing a gelling agent and in a semi-fluid state.
  • Arbuscular mycorrhizal fungi are endophytic mycorrhizal fungi and are composed of about 300 species of fungi belonging to the subphylum Glomeromycotina. Arbuscular mycorrhizal fungi have a symbiotic relationship with more than 80% of land plants. It is estimated that it can be built.
  • the bacterial species of arbuscular mycorrhizal fungi used in the present invention is not particularly limited, and any bacterial species of arbuscular mycorrhizal fungi can be used. Examples of arbuscular mycorrhizal fungi include Rhizophagus irregularis and Rhizophagus clarus.
  • the present invention is characterized in that a semi-fluid medium is used for culturing arbuscular mycorrhizal fungi, and by using the semi-fluid medium, the culture efficiency of arbuscular mycorrhizal fungi can be improved, and a large number of large spores can be grown. Is possible. In addition, since it is easy to subculture and add a medium, long-term culture is possible. By using a semi-fluid medium, arbuscular mycorrhizal fungi can be grown more uniformly in a culture vessel than in a liquid medium.
  • the “semi-fluidity (state)” in the present invention is a state between a liquid and a solid, and exhibits fluidity when a physical force such as stirring or shaking is applied from the outside, but it should be allowed to stand still. For example, it means a property that has less convection than a liquid medium.
  • the "semi-fluid (state)" in the present invention is not particularly limited as long as the effect of the present invention can be obtained, and a medium is added in a state in which the hyphae of arbuscular mycorrhizal fungi can be stretched straight to some extent. It is preferable that the medium can be aspirated with a pipette or the medium can be mixed.
  • the semi-fluid state of the medium is realized by adding a gelling agent to the medium.
  • the gelling agent is not particularly limited as long as it can be used as a medium for culturing microorganisms and the medium can be semi-fluidized, and either a natural or artificial gelling agent can be used. There may be.
  • Such gelling agents include, for example, gellan gum, agar, gelatin, silica gel, acrylamide, glucomannan, methylcellulose, arabic gum, starch, sodium alginate, carrageenan, bentonite, alginate, collagen, molten quartz, water-soluble starch, poly.
  • Examples thereof include acrylate, cellulose, polyethylene glycol, polyethylene oxide, polyvinyl alcohol, dextran and polysaccharide.
  • Polysaccharides are preferable, gellan gum, agar and carrageenan are more preferable, and gellan gum is particularly preferable.
  • the gelling agent can be used alone or in combination of two or more in the medium.
  • the amount of the gelling agent added to the medium is not particularly limited, and it is preferable that the amount of the gelling agent is in a semi-fluid state.
  • the amount of such addition is, for example, 0.01 to 0.15% (w / v), preferably 0.025 to 0.1% (w / v), and agar is used as the gelling agent.
  • agar is used as the gelling agent.
  • carrageenan is used as a gelling agent, for example, 0.03 to 0.25% (w / v).
  • this concentration is the concentration required to maintain the semi-fluid state at a general culture temperature of about 20 to 40 ° C, and if it is lower than this temperature, a smaller amount of gelling agent is used, and this temperature. If it is higher, it is desirable to use a larger amount of gelling agent.
  • the medium of the present invention contains at least one selected from the group consisting of (1) saturated fatty acids having 13 to 18 carbon atoms having a concentration exceeding 2 ⁇ g / mL, (2) strigolactone, and (3) an organic nitrogen source. It is preferred that more seeds are included.
  • saturated fatty acids (and strigolactone and / or organic nitrogen source) having 13 to 18 carbon atoms to the medium, in pure culture of arbuscular mycorrhizal fungi. , The amount of spore formation can be increased.
  • the saturated fatty acid having 13 to 18 carbon atoms may be either a linear fatty acid or a branched chain fatty acid (iso fatty acid, anteiso fatty acid, etc.), for example, myristic acid having 14 carbon atoms, pentadecic acid having 15 carbon atoms, and 16 carbon atoms. Palmitic acid and stearic acid having 18 carbon atoms can be mentioned. Of these, myristic acid and palmitic acid are preferable.
  • the saturated fatty acid having 13 to 18 carbon atoms one kind or two or more kinds can be used. Further, the saturated fatty acid may be used in a free state or in a salt state.
  • the salt is not particularly limited, and examples thereof include sodium salt, potassium salt, magnesium salt, calcium salt, and ammonium salt.
  • a water-soluble salt eg, potassium salt
  • the saturated fatty acid in the present invention also includes a salt of the saturated fatty acid.
  • the concentration of saturated fatty acids having 13 to 18 carbon atoms in the medium can be appropriately determined, and is preferably a concentration exceeding 2 ⁇ g / mL, more preferably 5 ⁇ g / mL or more, and further preferably 10 ⁇ g / mL or more. Yes, particularly preferably 20 ⁇ g / mL or more.
  • the upper limit of the concentration may be such that it does not inhibit the growth of mycorrhizal fungi, preferably 1 g / mL, more preferably 0.1 g / mL, still more preferably 10 mg / mL, and particularly preferably 2 mg. / mL.
  • Strigolactone is a substance isolated and identified as a hyphal branching inducer (BF).
  • the concentration of strigolactone in the medium can be appropriately determined, preferably 0.1 ng / mL or more, more preferably 0.5 ng / mL or more, still more preferably 1 ng / mL or more, and particularly preferably 10 ng / mL or more.
  • the upper limit of the concentration may be a range that does not adversely affect the concentration, and is preferably 1 mg / mL, more preferably 0.5 mg / mL, still more preferably 0.1 mg / mL, and particularly preferably 10 ⁇ g / mL.
  • the basal medium is not particularly limited as long as it can be used for culturing arbuscular mycorrhizal fungi.
  • the basal medium is a medium containing assimilating sugars such as glucose, mannose, xylose, fructose, galactose, sucrose, lactose, and raffinose and inorganic salts such as sodium hydrogen phosphate as essential constituents, and if necessary.
  • Examples of the known basal medium include M medium, modified M medium, and SC medium. From the viewpoint of sporulation, a medium containing an organic nitrogen source such as peptone is preferable. In addition, unsaturated fatty acids with 14-18 carbon atoms, such as palmitoleic acid (C16: 1), can be added to the medium if desired. In addition, the pH of the medium is adjusted as necessary. The pH of the medium is preferably on the acidic side, especially 5-7, at the time of use.
  • the viscosity of the medium of the present invention is not particularly limited as long as the medium is in a semi-fluid state, and is preferably 0.1 to 100 mPa ⁇ s, more preferably 0.5 to 80 mPa ⁇ s, and particularly preferably 1.0 to 60 mPa. ⁇ S.
  • the viscosity may be present at any time before, during or after culturing, and it is particularly desirable to have the viscosity before culturing.
  • the viscosity is determined by RE85 type cone plate rotational viscometer (manufactured by Toki Sangyo Co., Ltd., cone spindle: 1 ° 34'X R24) or HBDV3 TCP type cone plate rotational viscometer (manufactured by Brookfield, cone spindle:). It is a value measured using CPA-42Z) with a rotation speed of 50 rpm.
  • the culturing conditions (temperature, culturing time, etc.) of the culturing method of the present invention are not particularly limited as long as the arbuscular mycorrhizal fungi can be cultivated, and are carried out under the same conditions as the general culturing method for mycorrhizal fungi, for example. be able to.
  • the culture temperature is usually 20 to 35 ° C, preferably 28 ° C. Further, it is desirable that the culture is not a co-culture method with a host plant but a pure culture of arbuscular mycorrhizal fungi alone, and it is also desirable to carry out a static culture.
  • the culture method of the present invention uses a semi-fluid medium, the medium can be added during the culture, so that long-term culture can be performed. Further, in the culture method of the present invention, subculture may be performed.
  • the arbuscular mycorrhizal fungi obtained by pure culture using the medium of the present invention do not include the root tissue of the plant because it is not a symbiotic culture with the host plant.
  • the culture efficiency of arbuscular mycorrhizal fungi can be improved, and a large number of large spores can be grown.
  • the present invention is a system that enables long-term culture because it is easy to subculture or add nutrients, and enables large-scale production of arbuscular mycorrhizal fungi. By culturing for such a long period of time, it is possible to proliferate a large amount of spores (it is possible to proliferate 1 to 6000 times as many spores in 4 months).
  • arbuscular mycorrhizal fungi can be grown stably and easily as compared with a co-cultivation method with a host plant whose growth largely depends on the state of the plant.
  • a large number of large spores can be grown as compared with pure culture in a solid medium.
  • composition of additives such as vitamins (final concentration) Glycine (Nakarai Tesk Co., Ltd.): 3 mg / L, Thiamine-HCl (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.): 100 ⁇ g / L, Pyridoxine-HCl (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.): 100 ⁇ g / L, Nicotinic acid (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.): 500 ⁇ g / L, Myo-inositol (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.): 50 mg / L
  • composition of additives such as modified vitamins (final concentration) Glycine (Nakarai Tesk Co., Ltd.): 3 mg / L, Thiamine-HCl (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.): 10 mg / L, Pyridoxine-HCl (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.): 100 ⁇ g / L, Nicotinic acid (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.): 500 ⁇ g / L, Myo-inositol (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.): 50 mg / L, potassium myristate (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.): 400 ⁇ M, GR24 (Synthetic strigolactone) (synthesized by the inventor): 100 nM, Peptone (BD Difco Bacto TM -Peptone): 1 g / L
  • ⁇ Culture method> Culture of medium coexisting with host M medium containing 0.3% (w / v) gellan gum (Phytagel, SIGMA-ALDRICH) was autoclaved, and after adding additives such as vitamins, 1 petri dish (STAR SDish 9015 ver.2, RIKEN) 20 ml per 20 ml was dispensed. Carrot hairy roots were placed on this medium at 3-4 cm and cultured at 28 ° C in the dark for 2 weeks. In addition, 10 arbuscular mycorrhizal fungus (Risofagus clarus) spores were inoculated near hairy roots per petri dish and cultured at 28 ° C in the dark for 7 weeks.
  • the modified M medium was sterilized by autoclave, and after adding the modified vitamins, 25 ml was dispensed per 1 flask (cell culture flask 75 cm 2 No.90075, TPP). 20 arbuscular mycorrhizal fungus (Resofagas clarus) spores were inoculated into a medium per flask and cultured in a dark place at 28 ° C for 2 months. 25 ml of the same medium was added, and the cells were subsequently cultured for 2 months.
  • the culture was dispensed into 25 ml (1/2 volume) flasks (cell culture flask 75 cm 2 No.90075, TPP), 75 ml of the same medium was added, and the cells were continuously cultured for 1 month. Further, the culture was dispensed into 10 ml (1/20 volume) flasks (cell culture flask 75 cm 2 No.90075, TPP), 40 ml of the same medium was added, and the cells were continuously cultured for 1 month.
  • ⁇ Viscosity measurement> Modified M medium containing gellan gum (Phytagel, SIGMA-ALDRICH), agar (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) or ⁇ -carrageenan (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) at the concentrations shown in Table 1 was autoclaved and sterilized with modified vitamins. Etc. Additives were added.
  • Gellan gum semi-fluid medium is 0.01% (w / v) -0.15% (w / v)
  • agar semi-fluid medium is 0.05% (w / v) -0.35% (w / v)
  • ⁇ -carrageenan semi-fluid medium is 0.03
  • the cells were cultured in a concentration range of% (w / v) to 0.25% (w / v), but at any gelling agent concentration, hyphae spread and grew in the culture flask, and daughter spores were formed.

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Abstract

開示されているのは、ゲル化剤を含み、半流動状態であるアーバスキュラー菌根菌培養用の培地、及びゲル化剤を含み、半流動状態である培地で培養することを特徴とする、アーバスキュラー菌根菌の培養方法である。

Description

アーバスキュラー菌根菌の培養用培地及び培養方法
　本発明は、アーバスキュラー菌根菌培養用の培地、及びアーバスキュラー菌根菌の培養方法に関する。
　菌根菌は植物と共生して菌根を作り、その菌糸から主としてリン及び窒素を吸収して宿主植物に供給する。中でも内生菌根菌の1種であるアーバスキュラー菌根菌(arbuscular mycorrhizal fungi)は、特定の植物とのみ共生するのではなく、多数の宿主植物と共生するので、農産物の育成における重要性は大きい。また、アーバスキュラー菌根菌の共生は、リン等の吸収促進の他にも、耐病性の向上及び水分吸収の促進にも貢献する。特に、リン資源であるリン鉱石の枯渇が懸念されていることから、リン肥料を軽減するためにもアーバスキュラー菌根菌の更なる活用が望まれる。
　ところで、アーバスキュラー菌根菌は宿主植物根を必要とする絶対共生菌であるため、その培養のために宿主植物が必要となる。菌根菌を培養する方法として、殺菌した土壌、砂などを利用したポット培養法がある。また、ポット培養法の改良法として、液体肥料を噴霧しながら培養するエアロポニック培養法、形質転換したニンジン毛状根を用いるin vitro系培養法などもある。これらのいずれの方法も、宿主植物との共生による二者培養法である。
　しかしながら、二者培養法は、雑菌の混入(コンタミネーション)の危険性がある、菌根菌の増殖効率が植物の状態に大きく依存する、培養のための土地の確保などによりコストが高くなるといった問題点があり、アーバスキュラー菌根菌のみを純粋培養できる簡便な方法が望まれる。
　これまでのところ、アーバスキュラー菌根菌を改変M培地で純粋培養すると、まれに小さな胞子様の構造を形成することが報告されている(非特許文献１)。また、純粋培養する方法として、特許文献１ではトリプトファンダイマー及びロイシルプロリンを加えた培養基で菌根菌を培養することで菌根菌の純粋培養が容易にできることが、特許文献２ではアミン又はアミン誘導体を加えた培養基で菌根菌を培養することで菌根菌の純粋培養が容易にできることが報告されている。
　特許文献３では、本発明者らは、アーバスキュラー菌根菌を培養し得る基礎培地、例えば改変Ｍ培地中に、炭素数が１３～１８の直鎖飽和脂肪酸、好ましくはミリスチン酸、パルミチン酸及びそれらの塩の１種又は２種以上を２μｇ／ｍＬ（約１０μＭ）を越える濃度で含む培地、さらにはストリゴラクトン、ペプトンのような有機性窒素源を含む培地中で培養することで、アーバスキュラー菌根菌を効率よく純粋培養できることを報告している。
　しかしながら、今まで開発されたアーバスキュラー菌根菌の純粋培養の方法は、固形培地又は液体培地を利用した方法であり、増殖した胞子が小さく未熟であったり、大量培養には課題があった。
日本国特開2009-95332号公報 日本国特開2014-68600号公報 日本国特開2018-170973号公報
Hildebrandt, U., Ouziad, F., Marner, F. J. & Bothe, H. The bacterium Paenibacillus validus stimulates growth of the arbuscular mycorrhizal fungus Glomus intraradices up to the formation of fertile spores. FEMS Microbiol. Lett. 254, 258-267 (2006).
　本発明は、アーバスキュラー菌根菌の培養効率を向上でき、大型胞子を多数増殖させることが可能である、アーバスキュラー菌根菌培養用の培地及びアーバスキュラー菌根菌の培養方法を提供することを目的とする。
　従来の液体培地は菌糸が絡まって塊になることで培養容器内で均一に増殖できず、培養効率が悪くなるという問題があり、固形培地は枯渇した栄養等の追加が困難であり、長期の培養には適さないという問題がある。そこで、本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、半流動培地を用いてアーバスキュラー菌根菌を培養することで、培養容器内でアーバスキュラー菌根菌を均一に増殖させることができ、従来より大きな胞子を多数増殖させることができる上、継代もしくは栄養を追加することで長期間の培養が可能となるという知見を得た。
　本発明は、これら知見に基づき、更に検討を重ねて完成されたものであり、次のアーバスキュラー菌根菌培養用の培地、及びアーバスキュラー菌根菌の培養方法を提供するものである。
項１．ゲル化剤を含み、半流動状態であるアーバスキュラー菌根菌培養用の培地。
項２．前記ゲル化剤を培地が半流動状態となる量で含む、項１に記載の培地。
項３．前記ゲル化剤が、多糖類である、項１又は２に記載の培地。
項４．アーバスキュラー菌根菌の純粋培養用である、項１～３のいずれか一項に記載の培地。
項５．2μg/mLを越える濃度の炭素数13～18の飽和脂肪酸、ストリゴラクトン、及び有機性窒素源からなる群から選択される少なくとも1種を更に含む、項１～４のいずれか一項に記載の培地。
項６．粘度が0.1～100 mPa・sである、項１～５のいずれか一項に記載の培地。
項７．ゲル化剤を含み、半流動状態である培地で培養することを特徴とする、アーバスキュラー菌根菌の培養方法。
項８．前記ゲル化剤が、培地が半流動状態となる量で培地中に含まれる、項７に記載の培養方法。
項９．前記ゲル化剤が、多糖類である、項７又は８に記載の培養方法。
項１０．アーバスキュラー菌根菌の純粋培養方法である、項７～９のいずれか一項に記載の培養方法。
項１１．2μg/mLを越える濃度の炭素数13～18の飽和脂肪酸、ストリゴラクトン、及び有機性窒素源からなる群から選択される少なくとも1種が、培地中に更に含まれる、項７～１０のいずれか一項に記載の培養方法。
項１２．前記培地の粘度が0.1～100 mP・sである、請求項７～１１のいずれか一項に記載の培養方法。
　本発明の培地及び培養方法によれば、アーバスキュラー菌根菌の培養効率を向上でき、大型胞子を多数増殖させることが可能となる。
　また、本発明は、継代もしくは栄養の追加が容易なことから長期間の培養を可能にするシステムであり、アーバスキュラー菌根菌の大規模生産が可能となる。そして、長期間の培養を行うことで胞子を大量に増殖させることが可能となる。
　本発明は、増殖が植物の状態に大きく依存する宿主植物との共存培養法と比較して、安定的且つ簡便にアーバスキュラー菌根菌を増殖させることができる。
アーバスキュラー菌根菌を液体培地、固形培地又は半流動培地を用いて培養した結果を示す写真である。 アーバスキュラー菌根菌の宿主共存培養、又は固形培地若しくは半流動培地を用いた純粋培養における娘胞子形成量を示すグラフである。 アーバスキュラー菌根菌の寒天半流動培地又はゲランガム半流動培地を用いた純粋培養における娘胞子形成量を示すグラフである。グラフの値は平均値±標準偏差を示す。n=3 アーバスキュラー菌根菌をゲランガム半流動培地、寒天半流動培地又はκ-カラギーナン半流動培地のゲル化剤濃度を変化させて培養した結果を示す写真である。
　以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
　なお、本明細書において「含む(comprise)」とは、「本質的にからなる(essentially consist of)」という意味と、「のみからなる(consist of)」という意味をも包含する。
　本発明のアーバスキュラー菌根菌培養用の培地は、ゲル化剤を含み、半流動状態であることを特徴とする。
　本発明のアーバスキュラー菌根菌の培養方法は、ゲル化剤を含み、半流動状態である培地で培養することを特徴とする。
　アーバスキュラー菌根菌は、内生菌根菌であり、グロムス亜門(Glomeromycotina)に属する300種程度の菌類で構成されており、アーバスキュラー菌根菌は陸上植物の8割以上と共生関係を築くことができると推定されている。本発明で使用するアーバスキュラー菌根菌の菌種は、特に限定されず、アーバスキュラー菌根菌のいずれの菌種も用いることができる。アーバスキュラー菌根菌としては、例えば、リゾファガス・イレギュラリス(Rhizophagus irregularis)、リゾファガス・クラルス(Rhizophagus clarus)などが挙げられる。
　本発明では、アーバスキュラー菌根菌の培養に半流動培地を使用することを特徴としており、半流動培地を用いることでアーバスキュラー菌根菌の培養効率を向上でき、大型胞子を多数増殖させることが可能となる。また、継代及び培地の追加が容易なことから長期間の培養が可能となる。半流動培地を用いることで、液体培地に比べて培養容器内でアーバスキュラー菌根菌を均一に増殖させることができるようになる。
　本発明における「半流動(状態)」とは、液体と固体の間の状態であり、外部から攪拌、振とうなどの物理的な力を加えた時には流動性を示すが、静置していれば液体培地に比べて対流が少ないような性状を意味する。本発明における「半流動(状態)」とは、本発明の効果が得られる状態のものであれば特に制限されず、アーバスキュラー菌根菌の菌糸がある程度まっすぐに伸張可能な状態、培地を添加するためにピペットで吸引することが可能な状態、又は培地を混ぜ合わせることが可能な状態であれば好ましい。
　培地の半流動状態は、培地中にゲル化剤を添加することによって実現される。このようなゲル化剤としては、微生物培養用の培地で使用可能であって培地を半流動化できるものであれば特に限定されず使用することができ、天然及び人工のゲル化剤のいずれであってもよい。そのようなゲル化剤としては、例えば、ゲランガム、寒天、ゼラチン、シリカゲル、アクリルアミド、グルコマンナン、メチルセルロース、アラビアガム、スターチ、アルギン酸ナトリウム、カラギーナン、ベントナイト、アルギナート、コラーゲン、融解石英、水溶性デンプン、ポリアクリレート、セルロース、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキサイド、ポリビニルアルコール、デキストラン、ポリサッカライドなどが挙げられる。好ましくは多糖類、より好ましくはゲランガム、寒天及びカラギーナンであり、特に好ましくはゲランガムである。ゲル化剤は、培地中で1種単独で又は2種以上を組み合わせて使用することができる。
　ゲル化剤の培地への添加量は、特に限定されず、培地が半流動状態となる量であることが好ましい。そのような添加量としては、ゲル化剤としてゲランガムを使用する場合は、例えば0.01～0.15%(w/v)、好ましくは0.025～0.1%(w/v)であり、ゲル化剤として寒天を使用する場合は、例えば0.05～0.5%(w/v)、好ましくは0.1～0.3%(w/v)であり、ゲル化剤としてカラギーナンを使用する場合は、例えば0.03～0.25%(w/v)、好ましくは0.05～0.1%(w/v)である。ただし、この濃度は20～40℃程度の一般的な培養温度において半流動状態を維持するのに必要な濃度であって、この温度より低い場合はより少量のゲル化剤が使用され、この温度より高い場合はより多量のゲル化剤を使用することが望ましい。
　本発明の培地には、(1)2μg/mLを越える濃度の炭素数13～18の飽和脂肪酸、(2)ストリゴラクトン、及び(3)有機性窒素源からなる群から選択される少なくとも1種が更に含まれることが好ましい。特許文献３で報告されているように、培地中に炭素数13～18の飽和脂肪酸(並びにストリゴラクトン及び／又は有機性窒素源)を添加することで、アーバスキュラー菌根菌の純粋培養において、胞子の形成量を増加させることできる。
　炭素数13～18の飽和脂肪酸としては、直鎖脂肪酸、分岐鎖脂肪酸(イソ脂肪酸、アンテイソ脂肪酸など)のいずれでもよく、例えば、炭素数14のミリスチン酸、炭素数15のペンタデシル酸、炭素数16のパルミチン酸、炭素数18のステアリン酸などが挙げられる。中でも、好ましくはミリスチン酸、パルミチン酸である。炭素数13～18の飽和脂肪酸としては、1種又は2種以上を使用できる。また、飽和脂肪酸は遊離の状態で使用してもよいし又は塩の状態で使用してもよい。塩としては、特に限定されず、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩などが挙げられる。好ましくは、水溶性の塩(例えば、カリウム塩)である。なお、本発明における飽和脂肪酸には、飽和脂肪酸の塩も含まれる。
　炭素数13～18の飽和脂肪酸の培地中濃度は、適宜決定することができ、好ましくは2μg/mLを越える濃度であり、より好ましくは5μg/mL以上であり、更に好ましくは10μg/mL以上であり、特に好ましくは20μg/mL以上である。また、濃度の上限値は、菌根菌の生育を阻害しない程度であればよく、好ましくは1 g/mL、より好ましくは0.1 g/mL、更に好ましくは10 mg/mL、特に好ましくは2 mg/mLである。
　ストリゴラクトンは、菌糸分岐誘導物質(Branching factor：BF)として単離同定された物質である。ストリゴラクトンの培地中濃度は、適宜決定することができ、好ましくは0.1 ng/mL以上、より好ましくは0.5 ng/mL以上、更に好ましくは1 ng/mL以上、特に好ましくは10 ng/mL以上である。また、濃度の上限値は、悪影響を与えない範囲であればよく、好ましくは1 mg/mL、より好ましくは0.5 mg/mL、更に好ましくは0.1 mg/mL、特に好ましくは10μg/mLである。
　これらの飽和脂肪酸及びストリゴラクトンは、いわゆる基礎培地に添加される。
　基礎培地は、アーバスキュラー菌根菌の培養に使用できる培地であれば特に限定されない。基礎培地は必須構成成分として、グルコース、マンノース、キシロース、フルクトース、ガラクトース、スクロース、ラクトース、ラフィノースなどの資化性糖とリン酸水素ナトリウムなどの無機塩を含む培地であり、その他に必要に応じて、酵母粉末、酵母エキス、チアミン、ピリドキシン等の各種ビタミン類、ペプトン、麦芽エキス、NZアミン(カゼインの酵素加水分解物)等の有機性窒素源、無機酸等のpH調整剤などを含む。公知の基礎培地として、例えば、M培地、改変M培地、SC培地が挙げられる。胞子形成の観点からは、ペプトンのような有機性窒素源を含む培地が好ましい。さらに、必要に応じて、パルミトレイン酸(C16:1)のような炭素数が14～18である不飽和脂肪酸を培地に加えることもできる。また、必要に応じて培地のpHが調整される。培地のpHは、使用時において酸性側、特に5～7であることが望ましい。
　本発明の培地の粘度は、培地が半流動状態となる範囲である限り特に限定されず、好ましくは0.1～100 mPa・s、より好ましくは0.5～80 mPa・s、特に好ましくは1.0～60 mPa・sである。当該粘度は、培養前、培養中及び培養後のいずれかの時点で有していればよく、特に培養前に有していることが望ましい。当該粘度は、28℃において、RE85型コーンプレート回転粘度計(東機産業株式会社製、コーンスピンドル：1°34' X R24)又はHBDV3TCP型コーンプレート回転粘度計(ブルックフィールド社製、コーンスピンドル：CPA-42Z)を用いて、回転数を50 rpmとして測定した値である。
　本発明の培養方法の培養条件(温度、培養時間等)は、アーバスキュラー菌根菌を培養可能であれば特に限定されず、例えば、菌根菌の一般的な培養方法と同様の条件により行うことができる。培養温度としては、通常20～35℃、好ましくは28℃である。また、培養は、宿主植物との共存培養法ではなく、アーバスキュラー菌根菌単独の純粋培養であることが望ましく、静置培養で行うことも望ましい。本発明の培養方法では、半流動培地を使用するため、培養中に培地を追加することができるので、長期間の培養を行うことが可能である。さらに、本発明の培養方法では、継代培養を行ってもよい。本発明の培地を使用した純粋培養により得られるアーバスキュラー菌根菌には、宿主植物との共生培養ではないため植物の根の組織は含まれない。
　本発明の培地及び培養方法によれば、アーバスキュラー菌根菌の培養効率を向上でき、大型胞子を多数増殖させることが可能となる。また、本発明は、継代もしくは栄養の追加が容易なことから長期間の培養を可能にするシステムであり、アーバスキュラー菌根菌の大規模生産が可能となる。このような長期間の培養を行うことで胞子を大量に増殖させることが可能となる(4ヶ月で1胞子から6000倍程度の胞子を増殖させることが可能)。本発明は、増殖が植物の状態に大きく依存する宿主植物との共存培養法と比較して、安定的且つ簡便にアーバスキュラー菌根菌を増殖させることができる。また、固形培地での純粋培養と比較しても、大型胞子を多数増殖させることができる。
　以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる。しかし、本発明はこれら実施例等になんら限定されるものではない。
　＜使用菌株＞
　リゾファガス・クラルス(Rhizophagus clarus) HR1
　＜培地の組成＞
　・M培地の組成
MgSO4・7H2O (富士フイルム和光純薬株式会社): 731 mg/L、KNO3 (富士フイルム和光純薬株式会社): 80 mg/L、KCl (ナカライテスク株式会社): 65 mg/L、KH2PO4 (富士フイルム和光純薬株式会社): 4.8 mg/L、Ca(NO3)・4H2O (ナカライテスク株式会社): 288 mg/L、Fe(III)EDTA (株式会社同仁化学研究所): 8 mg/L、MnCl2・4H2O (富士フイルム和光純薬株式会社): 6 mg/L、ZnSO4・7H2O (富士フイルム和光純薬株式会社): 2.65 mg/L、H3BO3 (富士フイルム和光純薬株式会社): 1.5 mg/L、CuSO4・5H2O (富士フイルム和光純薬株式会社): 130 μg/L、Na2MoO4・2H2O (富士フイルム和光純薬株式会社): 2.4 μg/L、KI (富士フイルム和光純薬株式会社): 750 μg/L、Sucrose (ナカライテスク株式会社): 10 g/L
　・ビタミン等添加物の組成(最終濃度)
Glycine (ナカライテスク株式会社): 3 mg/L、Thiamine-HCl (富士フイルム和光純薬株式会社): 100 μg/L、Pyridoxine-HCl (富士フイルム和光純薬株式会社): 100 μg/L、Nicotinic acid (富士フイルム和光純薬株式会社): 500 μg/L、Myo-inositol (富士フイルム和光純薬株式会社): 50 mg/L
　・改変M培地の組成
MgSO4・7H2O (富士フイルム和光純薬株式会社): 731 mg/L、KNO3 (富士フイルム和光純薬株式会社): 80 mg/L、KCl (ナカライテスク株式会社): 65 mg/L、KH2PO4 (富士フイルム和光純薬株式会社): 4.8 mg/L、Ca(NO3)・4H2O (ナカライテスク株式会社): 288 mg/L、Fe(III)EDTA (株式会社同仁化学研究所): 8 mg/L、MnCl2・4H2O (富士フイルム和光純薬株式会社): 3 mg/L、ZnSO4・7H2O (富士フイルム和光純薬株式会社): 1.3 mg/L、H3BO3 (富士フイルム和光純薬株式会社): 1.5 mg/L、CuSO4・5H2O (富士フイルム和光純薬株式会社): 65 μg/L、Na2MoO4・2H2O (富士フイルム和光純薬株式会社): 1.2 μg/L、KI (富士フイルム和光純薬株式会社): 750 μg/L、Sucrose (ナカライテスク株式会社): 1 g/L、Glucose (富士フイルム和光純薬株式会社): 1 g/L、MES (株式会社同仁化学研究所)(pH 6.5): 10 mM
　・改変ビタミン等添加物の組成(最終濃度)
Glycine (ナカライテスク株式会社): 3 mg/L、Thiamine-HCl (富士フイルム和光純薬株式会社): 10 mg/L、Pyridoxine-HCl (富士フイルム和光純薬株式会社): 100 μg/L、Nicotinic acid (富士フイルム和光純薬株式会社): 500 μg/L、Myo-inositol (富士フイルム和光純薬株式会社): 50 mg/L、ミリスチン酸カリウム(富士フイルム和光純薬株式会社): 400 μM、GR24 (合成ストリゴラクトン)(発明者により合成): 100 nM、ペプトン(BD Difco BactoTM-Peptone): 1 g/L
　＜培養方法＞
　・宿主共存培地培養
　0.3%(w/v)ゲランガム(Phytagel, SIGMA-ALDRICH)を添加したM培地をオートクレーブ滅菌し、ビタミン等添加物を添加後、1シャーレ(STAR SDish 9015 ver.2, 理科研株式会社)あたり20 mlずつ分注した。この培地にニンジン毛状根を3～4 cmのせ、28℃暗所で2週間培養した。それにアーバスキュラー菌根菌(リゾファガス・クラルス)胞子を1シャーレ当たり10個毛状根付近に植菌し、28℃暗所で7週間培養した。
　・固形培地培養
　0.3%(w/v)ゲランガムを添加した改変M培地をオートクレーブ滅菌し、改変ビタミン等添加物を添加後1シャーレ(STAR SDish 9015 ver.2, 理科研株式会社)あたり20 mlずつ分注した。アーバスキュラー菌根菌(リゾファガス・クラルス)胞子を1シャーレあたり5個培地に植菌し、28℃暗所で6週間培養した。
　・液体培地培養
　改変M培地をオートクレーブ滅菌し、改変ビタミン類添加後1フラスコ(細胞培養フラスコ 75 cm2 No.90075、TPP)あたり25 mlずつ分注した。アーバスキュラー菌根菌(リゾファガス・クラルス)胞子を1フラスコあたり20個培地に植菌し、28℃暗所で2ヶ月間培養した。同様の培地を25 ml追加し、ひき続き2ヶ月間培養した。
　・半流動培地培養
　0.05%(w/v)ゲランガムを添加した改変M培地をオートクレーブ滅菌し、改変ビタミン等添加物を添加後1フラスコ(細胞培養フラスコ 75 cm2 No.90075、TPP)あたり25 mlずつ分注した。アーバスキュラー菌根菌(リゾファガス・クラルス)胞子を1フラスコあたり100個培地に植菌し、28℃暗所で1ヶ月間培養した。同様の培地を25 ml追加し、ひき続き1ヶ月間培養した。培養物を25 mlずつ(1/2量)フラスコ(細胞培養フラスコ 75 cm2 No.90075、TPP)に分注し、同様の培地を75 ml追加し、ひき続き1ヶ月間培養した。さらに培養物を10 mlずつ(1/20量)フラスコ(細胞培養フラスコ 75 cm2 No.90075、TPP)に分注し、同様の培地を40 ml追加し、ひき続き1ヶ月間培養した。
　・寒天半流動培地培養とゲランガム半流動培地培養との比較
　0.2%(w/v)寒天(Agar)又は0.05%(w/v)ゲランガムを添加した改変M培地をオートクレーブ滅菌し、改変ビタミン等添加物を添加後1フラスコあたり30 mlずつ分注した。アーバスキュラー菌根菌(リゾファガス・クラルス)胞子を1フラスコあたり20個培地に植菌し、28℃暗所で7週間培養した。
　・各種ゲル化剤を用いた半流動培地培養
　0.01%(w/v)、0.025%(w/v)、0.05%(w/v)、0.15%(w/v)のゲランガム(Phytagel, SIGMA-ALDRICH)、0.05%(w/v)、0.1%(w/v)、0.2%(w/v)、0.35%(w/v)の寒天(富士フイルム和光純薬株式会社)又は0.03%(w/v)、0.05%(w/v)、0.1%(w/v)、0.25%(w/v)のκ-カラギーナン(富士フイルム和光純薬株式会社)を添加した改変M培地をオートクレーブ滅菌し、改変ビタミン等添加物を添加した。これらの培地を、25 cm2の細胞培養フラスコ(No.90025、TPP)に1フラスコあたり15 mlずつ分注した。アーバスキュラー菌根菌(リゾファガス・クラルス)胞子を1フラスコあたり20個培地に植菌し、28℃暗所で5週間培養した。
　＜粘度測定＞
　表１の濃度のゲランガム(Phytagel, SIGMA-ALDRICH)、寒天(富士フイルム和光純薬株式会社)又はκ-カラギーナン(富士フイルム和光純薬株式会社)を添加した改変M培地をオートクレーブ滅菌し、改変ビタミン等添加物を添加した。粘度測定にはRE85型コーンプレート回転粘度計(東機産業株式会社、コーンスピンドル：1°34' X R24、回転数：50 rpm)若しくはHBDV3TCP型コーンプレート回転粘度計(ブルックフィールド、コーンスピンドル：CPA-42Z、回転数：50 rpm)を用いた。なお、測定温度は28℃で測定時間は5分間とした。
　結果
　・アーバスキュラー菌根菌純粋培養における液体培地、固形培地、半流動培地の培養比較(図１)
　アーバスキュラー菌根菌(リゾファガス・クラルス)胞子を液体培地、固形培地、半流動培地を用いて培養した。液体培地では、菌糸は成長したが、液体中を広がることができず、菌糸が塊となり、娘胞子も形成されたが、半流動培地と比較して小さく少なかった。固形培地では菌糸は広がって成長し、娘胞子も形成されたが、菌糸の成長が数週間で止まった。半流動培地では菌糸は広がって成長し、娘胞子も形成され、培地を定期的に添加することにより、菌糸と娘胞子は形成され続けた。
　・宿主共存培養と固形培地、半流動培地を用いた純粋培養における娘胞子形成量との比較(図２)
　アーバスキュラー菌根菌(リゾファガス・クラルス)胞子をニンジン毛状根に宿主として感染させ培養することで得られた娘胞子形成量と固形培地、半流動培地を用いた純粋培養における娘胞子形成量の比較を行った。宿主共存培地、固形培地ではどちらも数週間で胞子形成が止まるが、半流動培地では培地を定期的に添加することにより娘胞子は形成され続け、他の培地よりも多く娘胞子を形成した。また、再度の実験により同様の結果が得られた。
　・アーバスキュラー菌根菌純粋培養における寒天半流動培地培養とゲランガム半流動培地培養との比較(図３)
　アーバスキュラー菌根菌(リゾファガス・クラルス)胞子の寒天半流動培地とゲランガム半流動培地とを用いた培養の比較を行った。寒天の半流動培地を用いた場合もゲランガム半流動培地と同様に娘胞子の形成が見られた。
　・濃度を変化させた各ゲル化剤を含む培地の粘度(表１)
　表１の濃度のゲル化剤を含む培地の粘度の測定を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　・アーバスキュラー菌根菌純粋培養におけるゲランガム半流動培地、寒天半流動培地又はκ-カラギーナン半流動培地のゲル化剤濃度を変化させた培養比較(図４)
　ゲランガム半流動培地、寒天半流動培地又はκ-カラギーナン半流動培地のゲル化剤濃度を変化させたときのアーバスキュラー菌根菌(リゾファガス・クラルス)の培養比較を行った。ゲランガム半流動培地は0.01%(w/v)～0.15%(w/v)、寒天半流動培地は0.05%(w/v)～0.35%(w/v)、κ-カラギーナン半流動培地は0.03%(w/v)～0.25%(w/v)の濃度範囲で培養したが、いずれのゲル化剤濃度でも菌糸は培養フラスコ内で広がって成長し、娘胞子が形成された。

Claims (12)

  1. 　ゲル化剤を含み、半流動状態であるアーバスキュラー菌根菌培養用の培地。
  2. 　前記ゲル化剤を培地が半流動状態となる量で含む、請求項１に記載の培地。
  3. 　前記ゲル化剤が、多糖類である、請求項１又は２に記載の培地。
  4. 　アーバスキュラー菌根菌の純粋培養用である、請求項１～３のいずれか一項に記載の培地。
  5. 　2μg/mLを越える濃度の炭素数13～18の飽和脂肪酸、ストリゴラクトン、及び有機性窒素源からなる群から選択される少なくとも1種を更に含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の培地。
  6. 　粘度が0.1～100 mPa・sである、請求項１～５のいずれか一項に記載の培地。
  7. 　ゲル化剤を含み、半流動状態である培地で培養することを特徴とする、アーバスキュラー菌根菌の培養方法。
  8. 　前記ゲル化剤が、培地が半流動状態となる量で培地中に含まれる、請求項７に記載の培養方法。
  9. 　前記ゲル化剤が、多糖類である、請求項７又は８に記載の培養方法。
  10. 　アーバスキュラー菌根菌の純粋培養方法である、請求項７～９のいずれか一項に記載の培養方法。
  11. 　2μg/mLを越える濃度の炭素数13～18の飽和脂肪酸、ストリゴラクトン、及び有機性窒素源からなる群から選択される少なくとも1種が、培地中に更に含まれる、請求項７～１０のいずれか一項に記載の培養方法。
  12. 　前記培地の粘度が0.1～100 mPa・sである、請求項７～１１のいずれか一項に記載の培養方法。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6576457B1 (en) * 2000-12-15 2003-06-10 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Fungal media and methods for continuous propagation of vesicular-arbuscular mycorrhizal (VAM) fungi in root organ culture
US20050124065A1 (en) * 2003-12-04 2005-06-09 Shihe Fan Method of ex vitro sowing, germination, growth and conversion of plant somatic embryos or germinants, and nutrient medium used therefor
JP2016528906A (ja) * 2013-08-30 2016-09-23 シンプランタ ゲーエムベーハー ウンド ツェーオー カーゲー 液体培養におけるアーバスキュラ菌根菌類の連続的増殖および大量生産のためのシステムおよび方法
JP2018170973A (ja) * 2017-03-31 2018-11-08 公立大学法人大阪府立大学 菌根菌の培養培地

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6576457B1 (en) * 2000-12-15 2003-06-10 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Fungal media and methods for continuous propagation of vesicular-arbuscular mycorrhizal (VAM) fungi in root organ culture
US20050124065A1 (en) * 2003-12-04 2005-06-09 Shihe Fan Method of ex vitro sowing, germination, growth and conversion of plant somatic embryos or germinants, and nutrient medium used therefor
JP2016528906A (ja) * 2013-08-30 2016-09-23 シンプランタ ゲーエムベーハー ウンド ツェーオー カーゲー 液体培養におけるアーバスキュラ菌根菌類の連続的増殖および大量生産のためのシステムおよび方法
JP2018170973A (ja) * 2017-03-31 2018-11-08 公立大学法人大阪府立大学 菌根菌の培養培地

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