CN117947102A - 一种发酵-分离耦合制备赤潮藻溶藻物质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种发酵‑分离耦合制备赤潮藻溶藻物质的方法及其在控制米氏凯伦藻赤潮中的应用，属于有害赤潮处理的微生物学领域。本发明通过假交替单胞菌FDHY‑MZ2以半连续发酵的方式在50L发酵罐中进行发酵，通过板框过滤器分离出溶藻物质的同时补加等量新鲜培养基，使溶藻物质产量提高了60%。通过预装6%硅藻土为助滤层，提高发酵液板框过滤的效率，分离后上清液浊度低，与发酵液相比，成粉后溶藻效率高。经板框过滤器分离的上清液冷冻干燥粉剂产量为34.23±0.87 g/L。每升指数期阶段的米氏凯伦藻仅需0.14g该菌粉，在24小时内即可完全杀灭。

Description

一种发酵-分离耦合制备赤潮藻溶藻物质的方法
技术领域
本发明涉及环境微生物应用领域，具体涉及一种用于发酵-分离耦合制备赤潮藻溶藻物质的方法及应用。
背景技术
米氏凯伦藻是福建沿海常见的有毒甲藻，会引发鱼类大量死亡，对海洋环境和渔业养殖造成巨大破坏。控制有害赤潮的方法主要可分为物理、化学和生物3类方法。生物法具有特异性强、低成本、低毒、环境友好等特点，细菌在赤潮发生和消亡过程中起到了重要的作用，因此也是生物法控制有害藻华的研究热点。
菌杀藻机制主要分为直接杀藻和间接杀藻。根据前期研究已确定假交替单胞菌FDHY-MZ2对米氏凯伦藻有杀藻作用，其通过释放胞外物质间接溶藻，因此溶藻有效物质在发酵上清液中。通过构建分离耦合体系，以过滤的方法，可将发酵液的固体颗粒与液体分离。大规模发酵生产其发酵液过滤除菌方法有：板框过滤、真空转鼓分离及离心分离等，由于发酵后期的发酵液生物量高，使用普通过滤介质，其滤孔易被堵塞，上清液分离难度大，而添加硅藻土为助滤剂能发挥筛分作用、深度效应和吸附作用，用硅藻土涂覆到滤布上，可提供较多的空间截留滤液中的固体颗粒，大部份滤液通道仍然保持畅通，起到不断更新滤床的作用。半连续发酵不仅拥有分批发酵和分批补料发酵的优，不断补充养分，维持良好的生长环境，保持菌体的活力，还弥补了这两种发酵方式的不足，减少种子液培养及接种环节以降低污染风险，及时移出目的产物缓解反馈抑制，保证目的代谢物持续产出，有效提高产物产出效率。
由于细菌菌体在溶藻过程中性能稳定性直接决定了抑藻效果，在实验室规模下的液体菌剂性能不稳定且运输不便，因此将液体菌剂制成干粉，如在低温条件下经真空冷冻干燥制成干粉菌剂，可有效避免性能不稳定和运输不便的问题。
发明内容
本发明提供一种发酵-分离耦合制备赤潮藻溶藻物质的方法及应用，由溶藻菌经发酵罐发酵放大培养后，于板框过滤器进行溶藻物质的分离，分离后的产物可制成干粉用于米氏凯伦藻赤潮的控制。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
(1)平板培养：使用假交替单胞菌FDHY-MZ2平板培养，平板菌种培养方法为，以划线的方式将假交替单胞菌FDHY-MZ2接种到固体平板培养基上，在25℃下培养24h。
(2)种子培养：将平板培养后的菌种转接到的种子培养基，装液量为40％，在25℃，150rpm下培养24h，然后将一级种子液以5％的接种量重新接入新鲜培养基中，装液量为40％，在20℃，150rpm下培养二级种子液48h。
(3)发酵培养：将种子培养阶段得到的二级种子液以3％的接种量接入装有新鲜培养基的5L发酵罐中，装液量为60％，在20℃，转速300rpm，通气量30L/min条件下，发酵培养三级种子液24h；然后将三级种子液以3％的接种量接入装有新鲜液体培养基的50L发酵罐中，装液量为60％，在20℃、转速450rpm、通气量30L/min条件下发酵培养。
(4)溶藻产物分离：反复批次发酵过程中包含多个赤潮藻溶藻物质放出和补料循环，发酵每隔48h，通过有硅藻土滤泥的板框过滤器中放出一定量的发酵液，得到具有赤潮藻溶藻物质的上清液，再补充等量的新鲜优化培养基。
进一步地，发酵分离耦合过程中，发酵液的稀释率为20％，每48h为一次连续发酵。在发酵至第一周期结束(第48h)时放出罐中20％发酵液，同时补加等量灭菌新鲜优化培养基，持续发酵48h后，于第二周期(第96h)、第三周期(第144h)分别放出20％发酵液，同时补加等量灭菌新鲜优化培养基。
进一步地，板框过滤器采用0.22μm孔径的混合纤维CN-CA复合膜，采用矩形平板膜组件，膜器为板框式结构，一维平板薄层流道，尺寸为300mm×300mm。
进一步地，滤泥采用6％的硅藻土溶液，将硅藻土按6％的比例溶于10L水中抽入板框过滤器中，形成硅藻土滤泥。
(5)假交替单胞菌发酵上清液的溶藻粉剂制备方法：将上清液放入-20℃冰箱冷冻，冷冻完全后打开冷冻干燥机，待其温度降至-80℃后放入冰冻的上清液，冻干24h，产量为34.23±0.87g/L。每升指数期阶段的米氏凯伦藻仅需0.14g该菌粉，在24小时内即可完全杀灭。因此可在防控米氏凯伦藻赤潮中应用。
本发明的主要效果及优点：
1、发酵分离耦合系统既能不断补充养分，维持良好的生长环境，保持菌体的活力，还减少了种子液培养及接种环节以降低污染风险。及时移出目的产物缓解反馈抑制，保证目的代谢物持续产出，有效提高产物产出效率。
2、将溶藻上清液制成冷冻干燥粉剂可有效避免性能不稳定和运输不便的问题，其产量为34.23±0.87g/L，最佳溶藻有效其剂量为0.014g/100mL，大大提高了溶藻效率。
3、假交替单胞菌FDHY-MM2来源于海洋环境，其发酵上清液所制备的干粉对环境友好，使用过程中不会造成二次污染，在控制米氏凯伦藻赤潮方面具有很好的应用前景。
附图说明
图1为分离耦合系统流程图。
图2为稀释率为20％的50L半连续发酵各指标变化；其中A：干重，B：OD600，C：总糖，D：溶藻率，E：溶氧(DO)，F：pH。
图3稀释率为20％的50L半连续发酵的尾气分析仪数值变化；其中A：CO2，B：O2，C：CER，D：RQ。
图4为发酵液经板框过滤器分离耦合后上清液的澄清度。
图5为经板框过滤器后的发酵上清液溶藻率。
图6为发酵上清液冷冻干燥粉。
图7为不同冷冻干燥粉剂添加量下的溶藻效果。
图8为不同粉剂添加下米氏凯伦藻的细胞数量变化。
图9为米氏凯伦藻在不同粉剂添加量作用下的叶绿素荧光参数变化。
图10为不同粉剂添加量作用下的米氏凯伦藻光响应曲线。
图11为不同粉剂添加量对米氏凯伦藻光响应曲线拟合参数的影响。
具体实施方式
本发明中，米氏凯伦藻培养条件：米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)用L1培养基进行培养，盐度30‰，培养于20℃光照培养箱中，光照强度80μmol photons·m-2·s-1，光暗周期14h:10h。
溶藻效率计算方法：溶藻效率(％)＝(1-实验组藻细胞浓度/对照组藻细胞浓度)×100％。其中米氏凯伦藻的藻细胞浓度用0.1mL水样计数板通过显微镜计数。
实施例1发酵分离耦合系统制备发酵上清液及过程检测
假交替单胞杆菌FDHY-MZ2(GenBank:OM060674；Microbiol Spectr.2022Jun 29；10(3):e0042922.)种子液的制备方法步骤为：
(1)活化：从-80℃冰箱取出保存的假交替单胞杆菌FDHY-MZ2，在超净工作台里通过接种环在固体2216E培养基平板上划线，25℃活化培养24h。其中，固体2216E培养基配方为：细菌学蛋白胨5g/L、酵母提取物1g/L、磷酸高铁0.01g/L、海盐30g/L、琼脂粉15g/L；pH7.5。
(2)一级种子液制备：假交替单胞杆菌FDHY-MZ2活化后挑取单菌落到装有2216E液体培养基的100mL锥形瓶中，在装液量40％、温度25℃、转速150rpm条件下培养24h，得到一级种子液。其中，2216E液体培养基配方为：细菌学蛋白胨5g/L、酵母提取物1g/L、磷酸高铁0.01g/L、海盐30g/L；pH 7.5。
(3)二级种子液制备：将一级种子液以5％(v/v)的接种量接种到装有2216E优化液体培养基的250mL锥形瓶中，在装液量40％、温度20℃、转速150rpm条件下培养48h，得到二级种子液。其中，2216E优化液体培养基配方为：2216E液体培养基+0.5wt％蛋白胨+1.5wt％淀粉；pH 7.5。
(4)三级种子液制备：将二级种子液以3％(v/v)的接种量接种到装有2216E优化液体培养基(配方同步骤(3))的5L发酵罐中，在装液量60％、温度20℃、转速300rpm、通气量30L/min条件下发酵培养24h，得到三级种子液。
(5)发酵上清液制备：将三级种子液以3％(v/v)的接种量接种到装有2216E优化液体培养基(配方同步骤(3))的50L发酵罐中，在装液量60％、温度20℃、转速450rpm、通气量30L/min条件下发酵培养，通过有硅藻土滤泥的板框过滤器，装置见图1，每隔48h放出20％发酵液，同时补加等量灭菌新鲜优化培养基。
每隔24h取样测其干重、OD600、总糖、溶藻率、溶氧和pH(图2)。在每次补料放样后，干重和OD600变化呈突降20％后缓慢上升后趋于平缓的趋势，第二、第三次连续发酵的生物量较于上一次发酵总体下降。第一周期(48h)总糖含量降低了0.2g/L，在第二、三次补料后，总糖含量突增，为菌体的生长提供充足的营养物质。以0.01％菌藻比进行溶藻实验，与补料分批发酵中的恒速流加高浓度可溶性淀粉相比，在第一次补料后，溶藻率呈指数上升。在后期补料时，溶藻率维持在60％以上。
根据尾气分析仪的监控，如图3所示，在第一次补料时，CO2的含量突增，第二、三次补料后CO2的含量都快速上升后在持续发酵36h后降回0。O2的变化与CO2相反，在补料后，O2含量下降。从CO2的变化可明显看出，当CO2含量变化明显时，说明细菌消耗大量的营养和氧气进行呼吸作用，是细菌指数生长时期，说明在每次补料之后，细菌都在快速生长。与分批未补料相比，连续的补料发酵有多个快速生长的时期。
实施例2通过板框过滤器上清液的澄清度和溶藻率测定
将每次分离出的上清液与100-500度浊度标准液通过目视比浊法(GB 13200-1991)进行比较，确定样品浊度。如图4所示，第一周期的上清液浊度在100-200度之间，第二周期的上清液浊度在200度左右，第三周期的上清液浊度在400-500度，第四周期的上清液浊度在500左右。说明随着发酵时间的增加，上清液的浊度增加，这是由于随发酵时间增加，生物量增加，发酵液本身不断累积色素和胞外物质，导致板框过滤器中硅藻土吸附的内容物达到饱和，分离效果降低。
经过板框过滤器分离后的发酵上清液溶藻率如图5所示，在经过板框过滤器分离后的上清液与发酵液的溶藻率基本相同，由于已知假交替单胞菌FDHY-MZ2是通过分泌胞外溶藻物质杀藻，分离后的上清液与本身发酵液有相似的溶藻率说明经过板框过滤器不影响溶藻物质的杀藻作用，溶藻物质被较好的分离。
实施例3溶藻物质冷冻干燥粉制备
将上清液放入-20℃冰箱冷冻，冷冻完全后打开冷冻干燥机，待其温度降至-80℃后放入冰冻的上清液，冻干24h，得到溶藻粉剂，产量能达到34.23±0.87g/L，粉剂外观如图6所示。
实施例4上清液冷冻干燥粉剂的溶藻效果
用冷冻干燥粉剂进行不同添加量的实验，添加不同量的溶藻粉剂于100mL对数生长期米氏凯伦藻液，24h后计算其溶藻率。如图7所示随着添加量的增大，冷冻干燥粉剂溶藻效果逐渐增大，当添加量为0.014g/100mL时溶藻效果可达100％，因此冷冻干燥粉剂的最佳有效剂量为0.014g/100mL。
实施例5不同溶藻粉剂添加量下藻细胞数量变化
已知冷冻干燥粉剂24h的最佳有效剂量为0.014g/100mL，为了在光周期下进行叶绿素荧光参数的测定，将24h的最佳有效剂量添加一倍，使取样点在光周期内。图8为0.03g和0.05g作用下，米氏凯伦藻数量的变化情况。在0.03g粉剂添加下，9h内的藻细胞数量随时间递减，在6h时与对照组相比显著下降(p<0.01)；而0.05g添加量下的实验组，在3h处理下，藻细胞数量与对照组相比下降极其显著(p<0.001)，说明在添加量多的实验组中，藻细胞数量在短时间内骤降，且在9h时下降为783cell/mL，为对照组的5％。因此选择0.03g/100mL和0.05g/100mL添加量进行水样荧光仪参数的测定。
实施例6不同溶藻粉剂添加量下叶绿素荧光参数变化
溶藻粉剂与发酵液作用方式相同，在一定时间段内，其最大光合效率和实际光合效率均呈下降趋势，与细胞数量变化趋势相同。其中，高粉剂添加量的最大光合效率(Fv/Fm)在6h与对照组相比有差异(p<0.05)，9h时两种添加量下，(Fv/Fm)均显著下降(p<0.01)，0.05g添加量的实验组其最大光合效率下降为对照组的17％，0.03g添加量下降为对照组的58％(图9A)；而实际光合效率(图9B)，在3h时0.05g添加量下，其数值与对照组相比显著下降(p<0.01)，作用6h后0.03g的添加量的实验组与对照组相比显著降低(p<0.01)，直至作用9h时，高粉剂添加量下的实际光合效率下降为0，低粉剂添加量作用下的实际光合效率仍有0.2。
实施例7不同溶藻粉剂添加量下米氏凯伦藻的光响应曲线
图10为米氏凯轮藻在不同添加量溶藻粉剂胁迫下，不同取样点的光响应曲线，其中图10(A)为0.03g添加量下光响应的变化情况，可以看出随取样时间的增加，对照组的曲线变化幅度不大，实验组的电子传递效率降低，相比于0.03g实验组图10(B)而言，0.05g的添加量下的电子传递速率随时间增加而下降更显著(p<0.05)。
从曲线拟合的三个参数(图11)可以更明显看出溶藻粉剂对米氏凯伦藻光合效果的影响，其中三个拟合参数的对照组在实验期间均没有显著变化，随作用时间增加，添加量越多的实验组α值下降越快，在9h时两个添加量的实验组均显著降低；在3h时实验组的rETRmax值均显著降低，尤其是0.05g的添加量下，rETRmax值降到几乎为0；在低添加量下，随时间增加，Ik值呈梯度下降，高添加量下，Ik值在3h时显著降低，且在9h时降为对照组的7％。

Claims (9)

1.一种发酵-分离耦合制备赤潮藻溶藻物质的方法，其特征在于，所述发酵分离耦合系统可连续制备溶藻物质，由溶藻菌经发酵罐发酵放大培养后，获得发酵液，于板框过滤器进行溶藻物质的分离。
2.根据权利要求1所述的一种发酵-分离耦合制备赤潮藻溶藻物质的方法，其特征在于，所述溶藻菌发酵罐发酵放大培养，具体包括如下步骤：假交替单胞菌FDHY-MZ2活化后经逐级种子液培养放大后，以3%的接种量接种到装有优化培养基的50 L发酵罐中，在装液量60%、温度20℃、转速450 rpm、通气量30 L/min条件下发酵培养，每隔48 h放出一定量的发酵液到板框过滤器，再补充等量的新鲜优化培养基到发酵罐；所述优化培养基成分为：2216E液体培养基+0.5wt%蛋白胨+1.5wt%淀粉；pH 7.5。
3.根据权利要求1所述的一种发酵-分离耦合制备赤潮藻溶藻物质的方法，其特征在于，所述板框过滤器进行溶藻物质的分离，具体包括如下步骤：将发酵液泵入有硅藻土滤泥的板框过滤器得到过滤液即为赤潮藻溶藻物质。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵分离耦合过程中，发酵液的稀释率为20%，每48 h为一次连续发酵；在发酵至第一周期结束时放出罐中20%发酵液，同时补加等量灭菌新鲜优化培养基，持续发酵48 h后，于第二周期、第三周期分别放出20%发酵液，同时补加等量灭菌新鲜优化培养基；所述第一周期为48h，第二周期为96h，第三周期为144h。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述板框过滤器采用0.22 μm孔径的混合纤维CN-CA复合膜，采用矩形平板膜组件，膜器为板框式结构，一维平板薄层流道，尺寸为300 mm×300 mm。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述板框过滤器的滤泥采用6%的硅藻土溶液，将硅藻土按6%的比例溶于10 L水中抽入板框过滤器中，形成硅藻土滤泥。
7.一种赤潮防控粉剂的制备方法，其特征在于，利用权利要求1所述发酵液制备得到。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将发酵液的上清液放入-20℃冰箱冷冻24h，启动冷冻干燥机，待其温度降至-80℃后放入冰冻的上清液，冷冻干燥24 h。
9.一种利用权利要求7-8任一所述的溶藻粉剂在控制米氏凯伦藻赤潮现场中的应用。
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