CN112322699A

CN112322699A - 一种定量测定破囊壶菌纤维素酶活性的方法

Info

Publication number: CN112322699A
Application number: CN202011317393.0A
Authority: CN
Inventors: 汪光义; 刘媛媛; 谢宁栋; 李佳倩
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: CHINA OCEAN MINERAL RESOURCES RESEARCH AND DEVELOPMENT ASSOCIATION; Tianjin University
Priority date: 2020-11-23
Filing date: 2020-11-23
Publication date: 2021-02-05

Abstract

本发明公开一种定量测定破囊壶菌纤维素酶活性的方法，包括培养基的制备、试剂的配制、种子液的制备、麸皮发酵培养基的接种、还原糖标准曲线的绘制、纤维素酶活性的测定、菌株纤维素酶活性曲线的绘制，根据计算得出的纤维素酶活性，绘制纤维素酶活性随时间的变化曲线。使用相对廉价的试剂对破囊壶菌的纤维素酶活性做出定量。该方法使用的麸皮液体发酵培养基，添加的氮源为无机氮源，避免了使用有机氮源带来的干扰，使菌株可以利用麸皮作为唯一碳源进行生长和产酶。

Description

一种定量测定破囊壶菌纤维素酶活性的方法

技术领域

本发明涉及海洋微生物领域，特别涉及具有纤维素降解能力的单细胞异养原生生物破囊壶菌纤维素酶活性测定的方法。

背景技术

破囊壶菌于1936年首次被发现，现被分类至管毛生物界(Stramenopila)、不等鞭毛门(Heterokontophyta)、网粘菌纲(Labyrinthulomycetes)、破囊壶菌目(Thraustochytriales)、破囊壶菌科(Thraustochytriaceae)，主要包含Aurantiochytrium、Schizochytrium、Oblongichytrium、Thraustochytrium、Botryochytrium、Parietichytrium、Sicyoidochytrium、Japonochytrium、Ulkenia、Labyrinthulochytrium和Monorhizochytrium等11个属。它们主要分布于海洋、河口、盐水湖和红树林等区域，可通过渗透、吞噬、寄生等多种方式参与海洋营养循环，大多在海洋植物及藻类的残渣上进行腐生，有着很高的生物多样性。在海洋沉积物和沉降碎屑中，特别是海草碎屑和红树林碎屑等较难降解的有机颗粒物中，破囊壶菌的生物量可超过细菌。破囊壶菌在这些富营养生境的大量分布暗示了它们在海洋有机质降解过程中的潜在贡献。

针对可培养菌株的研究表明，破囊壶菌具有广泛的胞外酶活性，从而初步揭示了它们参与海洋有机物降解的作用机理及潜在的生态效应。研究破囊壶菌纤维素酶的生产能力，有助于揭示破囊壶菌在降解海洋有机质及陆源植物碎屑过程中的重要作用，从而帮助我们进一步理解它们的生态功能和碳循环功能。此外，研究破囊壶菌的纤维素降解能力，以及它们对木质纤维素水解产物的潜在耐受性和利用能力，有助于其在工业领域更好的应用。

发明内容

本发明为克服现有技术的不足，提出一种定量测定破囊壶菌纤维素酶活性的方法。本发明提供一种简单并且准确的测定破囊壶菌菌株纤维素酶活性的方法，通过绘制纤维素酶活性随时间变化曲线，直观的判断菌株的纤维素降解能力，对于具有降解纤维素能力的破囊壶菌，定量的测定其纤维素酶活性的大小。

本发明的技术方案是一种定量测定破囊壶菌纤维素酶活性的方法，包括如下步骤：

1、培养基的制备

在本发明中，主要使用两种培养基：

1)M4液体培养基：葡萄糖(20g/L)，蛋白胨(1.5g/L)，酵母(1g/L)，KH₂PO₄(0.25g/L)，海盐(33g/L)。

2)麸皮液体发酵培养基：麸皮(30g/L),(NH₄)₂SO₄(5g/L)，MgSO₄·7H₂O(0.5g/L)，NaCl(0.5g/L)，K₂HPO₄(0.5g/L)，自然pH。

上述培养基按照其成分，准确称量，加入对应比例的超纯水，搅拌，分装至所需要规格的锥形瓶中，使用高压灭菌锅115℃灭菌21分钟，培养基配制完成。

2、试剂的配制：

1)DNS试剂的配制：酒石酸钾钠182g，溶于500ml蒸馏水中，加热，于热溶液中依次加入3，5-二硝基水杨酸6.3g，262ml 2mol/L的NaOH溶液(20.96g NaOH溶解于262ml蒸馏水)，苯酚5g，无水亚硫酸钠5g，搅拌至溶，冷却后用蒸馏水定容至1000ml，贮于棕色瓶中，室温保存，室温下存放7天后使用，保质期6个月。

(但是一定要注意，3，5-二硝基水杨酸和NaOH的加入时间一定要很近，或者是先加入NaOH。否则会产生难溶的沉淀，导致配制溶液失败。且配置过程中，溶液加热温度不宜超过50摄氏度。)

2)柠檬酸缓冲液(pH4.8，0.05mol/L)：C6H8O7·H2O：4.8323g，C6H5O7-Na3·2H2O：7.9407g。先溶解于少量蒸馏水，后定容到1000mL。

3)1.0％CMC-Na溶液：10.0g羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶解于柠檬酸缓冲液(pH4.8，0.05mol/L)中，并定容到1000mL。

3、种子液的制备：

在液体发酵之前，需首先进行种子液的制备，从MV固体平板上挑取一环菌体到M4液体培养基进行培养，在28℃、180rpm的摇床培养数天，使其菌株达到对数生长期。

4、麸皮发酵培养基的接种：

在对数生长期将种子液取出，将种子液取出至灭菌后的离心管中，在4000rpm，25℃的离心机中离心10分钟，弃去上清液，下层菌体使用灭菌的人工海水(海盐(33g/L))洗两遍，以上操作均为无菌操作。将第二次海水洗完的菌体除去上清液，接种至麸皮液体培养基中，在180rpm，28℃的摇床里培养数天，每个时间点取出3个平行样的锥形瓶，用于纤维素酶活的测定。

5、还原糖标准曲线的绘制：

为测定菌株纤维素酶活，通过测定还原糖含量来计算纤维素酶活。所以，首先进行还原糖标准曲线的绘制。以OD值为横坐标，葡萄糖的浓度(mg/ml)为纵坐标，做出标准曲线。

6、纤维素酶活性的测定：

纤维素酶的测定过程，需设置样品本身的空白对照组，具体设置过程见下表：

菌株纤维素酶活性通过还原糖的测定来实现。还原糖的测定采用标准的DNS试剂法测定。

分别在指定时间点取出样品，发酵培养基的菌液离心取上清，从离心的上清液中取0.2ml的粗酶液，根据以下的测定步骤进行实验，最后在520nm波长下测定吸光度。从标准曲线查出葡萄糖mg/ml数，求出样品中还原糖含量。

7、菌株纤维素酶活性曲线的绘制：

根据计算得出的纤维素酶活性，使用Origin软件绘制纤维素酶活性随时间的变化曲线。

有益效果

该发明具备以下优势：

1.使用相对廉价的试剂对破囊壶菌的纤维素酶活性做出定量。

2.该方法使用的麸皮液体发酵培养基，添加的氮源为无机氮源，避免了使用有机氮源带来的干扰，使菌株可以利用麸皮作为唯一碳源进行生长和产酶。

3.根据该实验方法，绘制得到纤维素酶活随时间的变化曲线，可以直观的判断纤维素酶活。

附图说明

图1还原糖标准曲线；

图2菌株Y-32的纤维素酶活性曲线。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。

本申请实施例以破囊壶菌Y-32为例，但并不对本发明作任何限制，其它的破囊壶菌也可以用于本发明：

1、培养基的制备

a)M4液体培养基：葡萄糖(20g/L)，蛋白胨(1.5g/L)，酵母(1g/L)，KH₂PO₄(0.25g/L)，海盐(33g/L)。

b)麸皮液体发酵培养基：麸皮(30g/L),(NH₄)₂SO₄(5g/L)，MgSO₄·7H₂O(0.5g/L)，NaCl(0.5g/L)，K₂HPO₄(0.5g/L)，自然pH。

上述培养基按照其成分，准确称量，加入对应比例的超纯水，搅拌，使用高压灭菌锅115℃灭菌21分钟，培养基配制完成。其中，麸皮发酵培养基分装至100mL的锥形瓶中，每个锥形瓶30mL发酵培养基。

2、种子液的制备：

对菌株Y-32进行种子液的制备，从MV固体平板上挑取一环菌体到120ml的M4液体培养基进行培养，在28℃、180rpm的摇床培养4天，使菌株生长至对数生长期。

3、麸皮发酵培养基的接种：

在第4天将种子液取出，将种子液取3mL至10mL的离心管中，在4000rpm，25℃的离心机中离心10分钟，弃去上清液，下层菌体使用灭菌的人工海水(海盐(33g/L))洗两遍。将第二次海水洗完的菌体除去上清液，接种至30ml的麸皮液体培养基中，在180rpm，28℃的摇床里培养7天，分别在第0、1、2、3、4、5、6、7天取出3个平行样的锥形瓶，用于纤维素酶活的测定。

4、还原糖标准曲线的绘制：

为测定菌株纤维素酶活，通过测定还原糖含量来计算纤维素酶活。所以，首先进行还原糖标准曲线的绘制。配置1g/L的葡萄糖标准液，分别取葡萄糖标准液(1mg/ml)0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0ml于试管中，用蒸馏水补足至1.0ml,分别准确加入DNS试剂2ml，沸水水浴5min，流水冷却至常温，用蒸馏水补足到15ml。在520nm的波长下测定吸光度。以OD值为横坐标，葡萄糖的浓度(mg/ml)为纵坐标，做出标准曲线。

5、纤维素酶活性的测定：

分别在第0、1、2、3、4、5、6、7天取出样品，发酵培养基的菌液离心取上清，从离心的上清液中取0.2ml的粗酶液，根据以下的测定步骤进行实验，最后在520nm波长下测定吸光度。从标准曲线查出葡萄糖mg/ml数，求出样品中还原糖含量。

6、菌株纤维素酶活性曲线的绘制：

根据纤维素酶活性，使用Origin软件绘制菌株Y-32纤维素酶活性随时间的变化曲线。

7、结果分析：

a)本实验还原糖标准曲线R²为0.9982，说明试验数据与拟合函数之间的吻合程度较好，该标准曲线可用于后续实验。

b)根据本发明的实验方法，获得了菌株Y-32的纤维素酶活性随时间的变化曲线。平行数据的标准差较低，菌株Y-32在培养的第3天达到纤维素酶活性的最大值。

该实施例证明，该实验方法可成功用于破囊壶菌菌株纤维素酶活性的测定，可成功的绘制菌株纤维素酶活性曲线。

Claims

1.一种定量测定破囊壶菌纤维素酶活性的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)培养基的制备

2)试剂的配制：

3)种子液的制备：在液体发酵之前，需首先进行种子液的制备，从MV固体平板上挑取一环菌体到M4液体培养基进行培养；

4)麸皮发酵培养基的接种；

5)还原糖标准曲线的绘制：

为测定菌株纤维素酶活，通过测定还原糖含量来计算纤维素酶活；

首先进行还原糖标准曲线的绘制，以OD值为横坐标，葡萄糖的浓度(mg/ml)为纵坐标，做出标准曲线；

6)纤维素酶活性的测定：菌株纤维素酶活性通过还原糖的测定来实现，还原糖的测定采用标准的DNS试剂法测定；

7)菌株纤维素酶活性曲线的绘制：根据计算得出的纤维素酶活性，绘制纤维素酶活性随时间的变化曲线。

2.根据权利要求1所述的一种定量测定破囊壶菌纤维素酶活性的方法，其特征在于，所述步骤1)主要使用两种培养基：

a)M4液体培养基：葡萄糖(20g/L)，蛋白胨(1.5g/L)，酵母(1g/L)，KH₂PO₄(0.25g/L)，海盐(33g/L)；

b)麸皮液体发酵培养基：麸皮(30g/L),(NH₄)₂SO₄(5g/L)，MgSO₄·7H₂O(0.5g/L)，NaCl(0.5g/L)，K₂HPO₄(0.5g/L)，自然pH；

3.根据权利要求1所述的一种定量测定破囊壶菌纤维素酶活性的方法，其特征在于，所述步骤2)包括：

a)DNS试剂的配制：酒石酸钾钠182g，溶于500ml蒸馏水中，加热，于热溶液中依次加入3，5-二硝基水杨酸6.3g，262ml 2mol/L的NaOH溶液(20.96g NaOH溶解于262ml蒸馏水)，苯酚5g，无水亚硫酸钠5g，搅拌至溶，冷却后用蒸馏水定容至1000ml，贮于棕色瓶中，室温保存，室温下存放7天后使用，保质期6个月；

b)柠檬酸缓冲液(pH4.8，0.05mol/L)：C6H8O7·H2O：4.8323g，C6H5O7-Na3·2H2O：7.9407g。先溶解于少量蒸馏水，后定容到1000mL；

c)1.0％CMC-Na溶液：10.0g羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶解于柠檬酸缓冲液(pH4.8，0.05mol/L)中，并定容到1000mL。

4.根据权利要求1所述的一种定量测定破囊壶菌纤维素酶活性的方法，其特征在于，所述步骤4)在对数生长期将种子液取出，将种子液取出至灭菌后的离心管中，在4000rpm，25℃的离心机中离心10分钟，弃去上清液，下层菌体使用灭菌的人工海水(海盐(33g/L))洗两遍，以上操作均为无菌操作；

将第二次海水洗完的菌体除去上清液，接种至麸皮液体培养基中，在180rpm，28℃的摇床里培养数天，每个时间点取出3个平行样的锥形瓶，用于纤维素酶活的测定。

5.根据权利要求1所述的一种定量测定破囊壶菌纤维素酶活性的方法，其特征在于，所述步骤6)分别在指定时间点取出样品，发酵培养基的菌液离心取上清，从离心的上清液中取0.2ml的粗酶液，根据以下的测定步骤进行实验，最后在520nm波长下测定吸光度，从标准曲线查出葡萄糖mg/ml数，求出样品中还原糖含量。