TW201518500A - 裸藻屬微型藻類、多醣類之製造方法及有機化合物之製造方法 - Google Patents

裸藻屬微型藻類、多醣類之製造方法及有機化合物之製造方法 Download PDF

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Akira Akashi
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Abstract

本發明提供一種至少具有多糖類之產生能力之裸藻屬微型藻類，其係纖細裸藻(Euglena gracilis)EOD-1株(寄存編號FERM BP-11530)或其變異株。本發明提供一種多糖類之製造方法，其係藉由以至少具有多糖類之產生能力之裸藻屬微型藻類作為產生多糖類之生物進行培養而製造多糖類，該裸藻屬微型藻類係纖細裸藻(Euglena gracilis)EOD-1株(寄存編號FERM BP-11530)或其變異株。本發明提供一種有機化合物之製造方法，其係藉由對至少具有多糖類之產生能力之裸藻屬微型藻類進行培養而製造選自由多糖類、脂質、維生素C、維生素E、色素及蛋白質所組成之群中之至少1種有機化合物，該裸藻屬微型藻類係纖細裸藻(Euglena gracilis)EOD-1株(寄存編號FERM BP-11530)或其變異株。

Description

裸藻屬微型藻類、多醣類之製造方法及有機化合物之製造方法 [相關申請之相互參照]
本申請案主張日本專利特願2013-067558號之優先權，且藉由引用而將該申請案併入至本案說明書之記載中。
本發明係關於一種裸藻屬微型藻類、多糖類之製造方法及有機化合物之製造方法。
裸藻屬微型藻類亦稱為眼蟲，作為藉由進行培養而產生綠裸藻糖(Paramylon)等多糖類等之微生物而為人所知。
先前，作為裸藻屬微型藻類，已知有各種者，例如已知纖細裸藻(Euglena gracilis)NIES-48株(專利文獻1)。
該裸藻屬微型藻類係藉由進行培養而產生綠裸藻糖等多糖類並將該多糖類儲存於細胞內。
又，根據培養條件，該裸藻屬微型藻類可將所儲存之多糖類轉換為蠟酯，或者亦可產生多糖類且產生蛋白質。並且，產生並儲存於該微型藻類之細胞內之多糖類、脂質、蛋白質等有機化合物可用於燃料或食品等用途。
然而，該裸藻屬微型藻類有產生多糖類等有機化合物之性能未 必充分之問題。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]日本專利特開平07-070207號公報
本發明係鑒於上述問題等，其課題在於提供一種至少可充分地產生多糖類之裸藻屬微型藻類。又，本發明之課題在於提供一種可充分地獲得多糖類之多糖類之製造方法。又，本發明之課題在於提供一種可充分地獲得選自由多糖類、脂質、維生素C、維生素E、色素及蛋白質所組成之群中之至少1種有機化合物的有機化合物之製造方法。
為了解決上述問題，本發明之裸藻屬微型藻類之特徵在於：其係作為纖細裸藻(Euglena gracilis)EOD-1株(寄存編號FERM BP-11530)或其變異株，且至少具有多糖類之產生能力。
本發明之多糖類之製造方法之特徵在於：其係藉由以至少具有多糖類之產生能力之裸藻屬微型藻類作為產生多糖類之生物進行培養而製造多糖類，該裸藻屬微型藻類係纖細裸藻(Euglena gracilis)EOD-1株(寄存編號FERM BP-11530)或其變異株。
作為本發明之多糖類之製造方法之一態樣，可採用上述培養中所使用之培養液包含葡萄糖15~30g/L之態樣。
又，作為本發明之多糖類之製造方法之另一態樣，可採用上述培養中所使用之培養液包含酵母分解物之態樣。
又，作為本發明之多糖類之製造方法之另一態樣，可採用上述培養中所使用之培養液具有AF6培養基之組成之態樣。
又，作為本發明之多糖類之製造方法之另一態樣，可採用上述多糖類為綠裸藻糖之態樣。
本發明之有機化合物之製造方法之特徵在於：藉由對至少具有多糖類之產生能力之裸藻屬微型藻類進行培養而製造選自由多糖類、脂質、維生素C、維生素E、色素及蛋白質所組成之群中之至少1種有機化合物，該裸藻屬微型藻類係纖細裸藻(Euglena gracilis)EOD-1株(寄存編號FERM BP-11530)或其變異株。
圖1係對Euglena gracilis之18S rRNA(ribosomal Ribonucleic Acid，核糖體核糖核酸)基因鹼基序列進行比較之表。
圖2係表示使用18S rRNA基因製作之系統樹(Genealogical tree)之圖。
圖3A係表示RAPD((Random Amplified Polymorphic，隨機擴增多態性)解析之譜帶(Band pattern)之照片。
圖3B係表示RAPD解析之譜帶之照片。
圖3C係表示RAPD解析之譜帶之照片。
圖4係表示異養培養中之微型藻類之葡萄糖轉換率及微型藻類之乾燥重量的圖表。
圖5係表示光異養培養中之微型藻類之培養時間與微型藻類之乾燥重量的圖表。
圖6係表示利用pH值條件不同之各培養基進行光異養培養時之微型藻類之培養時間與微型藻類之乾燥重量的圖表。
圖7係表示利用pH值條件不同之各培養基進行光異養培養時之微型藻類之培養時間與微型藻類之乾燥重量的圖表。
圖8A係表示於光異養培養中自好氧條件轉變為厭氧條件時之微型藻類之培養時間與每個細胞之綠裸藻糖含有率的圖表。
圖8B係表示於光異養培養中自好氧條件轉變為厭氧條件時之微型藻類之培養時間與每一培養液之綠裸藻糖量的圖表。
圖9A係表示於光異養培養中自好氧條件轉變為厭氧條件時之微型藻類之培養時間與每個細胞之脂質含有率的圖表。
圖9B係表示於光異養培養中自好氧條件轉變為厭氧條件時之微型藻類之培養時間與每一培養液之脂質量的圖表。
以下，對本發明之裸藻屬微型藻類之一實施形態詳細地進行說明。
本實施形態之裸藻屬微型藻類係作為纖細裸藻(Euglena gracilis)EOD-1株(寄存編號FERM BP-11530)或其變異株之至少具有多糖類之產生能力者(以下，簡稱為裸藻屬微型藻類或微型藻類)。
本實施形態之裸藻屬微型藻類發揮至少可充分地產生多糖類之效果。
上述裸藻屬微型藻類係一面於水中浮游一面生存之生物。又，上述裸藻屬微型藻類為單細胞性，係雖根據細胞株而稍有不同，但大小大致為10μm至50μm之微小藻類。
將上述裸藻屬微型藻類之性質之詳細情況示於以下。
(裸藻屬微型藻類之形態性質)
上述裸藻屬微型藻類之營養體細胞具有鞭毛並活躍地運動。又，細胞之形狀為大致紡錘形。於細胞內，除核、葉綠體、線粒體等通常之細胞器(Organelle)以外，亦具有稱為眼點(Eyespot)之紅色小器官。
(裸藻屬微型藻類之生理學或生物化學性質)
(1)培養基：可於主要包含淡水之培養液中增殖(即便利用源自廢水之有機物亦可增殖)。
(2)光合作用能力：可進行利用光合作用之光自營(Autotrophy)增殖。
(3)所含色素：包含葉綠素a、葉綠素b及其他類胡蘿蔔素類。
(4)同化儲存物質：蛋白質、脂質(蠟酯)、多糖類(綠裸藻糖)。
(5)增殖溫度範圍：15℃~35℃(最佳溫度25℃)。
(6)較佳之增殖pH值範圍：pH值3.5~5.5(其中，即便於左述pH值範圍以外，亦可進行增殖)
(裸藻屬微型藻類之基因資訊)
上述裸藻屬微型藻類具有序列編號1所表示之18S rDNA(18S rRNA基因)。
再者，18S rRNA基因之解析可藉由通常用作微型藻類之鑑定方法之方法而進行。具體而言，18S rRNA基因之解析例如可藉由實施例中所記載之方法而進行。
上述裸藻屬微型藻類之18S rRNA基因中之鹼基序列可使用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool，局部序列排比檢索基本工具)同源性檢索，與自基因庫(GenBank)獲得之已知之裸藻屬微型藻類之18S rRNA基因的鹼基序列進行比較。對與已知之裸藻屬微型藻類之序列同源性之一致程度進行比較，結果係示於下文之實施例中。
再者，作為資料庫，亦可使用EMBL(European Molecular Biology Laboratory，歐洲分子生物學實驗室)、DDBJ(DNA Data Bank of Japan，日本核酸資料庫)等。
進而，可使用分子系統樹製作軟體Mega5程式(Tamura等人，2011,Mol.Biol.Evol.28：2731-2739)，藉由最佳方法製作分子系統樹。關於所製作之分子系統樹，將詳細情況示於下文之實施例中。
藉由如上所述之方法，根據後述實施例之結果，上述裸藻屬微型藻類被鑑定為纖細裸藻(Euglena gracilis)，且被命名為纖細裸藻 (Euglena gracilis)EOD-1株。
上述纖細裸藻(Euglena gracilis)EOD-1株係於2013年6月28日(原寄存日2013年3月25日)在獨立行政法人製品評價技術基盤機構專利生物寄存中心(NITE-IPOD(NITE International Patent Organism Depositary)(郵編292-0818，日本千葉縣木更津市上總鐮足2-5-8 120號室)於布達佩斯條約之規定下，以寄存編號FERM BP-11530之形式進行國際寄存。
如上所述，上述裸藻屬微型藻類於細胞內具有葉綠體，因此可藉由光合作用而進行增殖。即，上述裸藻屬微型藻類為光自營生物。
又，即便使用葡萄糖等有機營養素作為營養素，上述裸藻屬微型藻類亦可進行增殖。即，上述裸藻屬微型藻類亦為異養生物。
如此，上述裸藻屬微型藻類可僅藉由光自營而進行增殖，可僅藉由異養而進行增殖，即便同時進行光自營及異養，亦可增殖。
上述變異株例如係藉由實施通常之突變處理、或由繼代培養所產生之適應或自然變異而製作。
上述突變處理可使用通常之誘變劑(Mutagenic agent)而進行。作為誘變劑，例如可列舉具有誘變劑作用之藥劑、紫外線等。作為具有誘變劑作用之藥劑，例如可列舉：鏈黴素、氧氟沙星、乙基甲磺酸鹽、N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍、溴尿嘧啶等核苷酸鹼基類似物、或吖啶類等。
繼而，對本發明之多糖類之製造方法之一實施形態進行說明。
本實施形態之多糖類之製造方法係藉由對上述裸藻屬微型藻類進行培養而製造至少多糖類者。
本實施形態之多糖類之製造方法發揮可充分地獲得多糖類之效果。
詳細而言，本實施形態之多糖類之製造方法具有於至少包含水 之培養液中培養上述裸藻屬微型藻類之培養步驟。
作為上述培養液，較佳為包含促進微型藻類之增殖之營養素與水者。
作為上述營養素，可列舉無機營養素或有機營養素等。
作為上述無機營養素，例如可列舉含氮無機化合物、含磷無機化合物等。又，作為上述無機營養素，例如可列舉：鉀離子、鐵離子、錳離子、鈷離子、鋅離子、銅離子、鉬離子、鎳離子等。
上述無機營養素之培養液之濃度通常為眾所周知之程度的濃度。
作為上述有機營養素，例如可列舉：葡萄糖(Glucose)，果糖(Fructose)等單糖類，維生素B6、B12等維生素類，精胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、甘胺酸、組胺酸等胺基酸，蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸、乙酸等有機酸，乙醇等醇類等。
作為上述培養液之組成，例如採用後述「AF-6培養基」之組成、「Cramer-Myers培養基」之組成、「Hutner培養基」之組成、或與該等組成類似之組成等。
於上述培養步驟中，培養液較佳為包含作為碳源之葡萄糖15~30g/L。又，培養液較佳為包含酵母分解物(後述)。又，培養液較佳為具有AF6培養基之組成。
上述培養步驟例如可於收容混合有上述培養液與微型藻類者之槽內等實施。
於上述培養步驟中，藉由對微型藻類照射光，可使微型藻類進行光合作用。即，於上述培養步驟中，可進行光自營培養。
於上述培養步驟中，若對微型藻類照射光，則微型藻類可藉由光合作用而將二氧化碳導入至細胞內，一面產生至少綠裸藻糖等多糖類一面進行增殖。進而，微型藻類可一面產生蛋白質、及脂質、色素 或維生素類等二次代謝物等一面進行增殖。
上述培養步驟中對微型藻類照射之光只要為使微型藻類進行光合作用者，則並無特別限定。作為該光，例如採用源自太陽之自然光、或源自照明之光等人工光等。
上述光自營培養步驟中所照射之光之強度並無特別限定，但通常為50μmol/m2．s~200μmol/m2．s。
於上述培養步驟中，可交替地重複對微型藻類照射光之時間與不對微型藻類照射光之時間。
即，於上述培養步驟中，可交替地重複進行光自營培養之時間與未進行光自營培養之時間。
於上述培養步驟中，照射光之時間通常為相當於出現陽光之白天時間之8小時~15小時。又，為了抑制微型藻類之光合作用而不照射光之黑暗條件之時間通常為相當於未出現陽光之夜晚時間之9小時~16小時。該等時間可根據狀況或目的而變化。
再者，所謂不照射光之黑暗條件下，係光合作用光量子通量密度(PPFD，Photosynthetic Photon Flux Density)為50μmol/m2．s以下之條件。
另一方面，於上述培養步驟中，亦可於上述營養素中之有機營養素之存在下進行培養微型藻類之異養培養。於上述培養步驟中，若於有機營養素之存在下培養微型藻類，則微型藻類可將有機營養素導入至細胞內，一面產生至少綠裸藻糖等多糖類一面進行增殖。
即，於上述培養步驟中，可進行光自營培養及異養培養中之至少一者。
於上述培養步驟中，就可進一步促進微型藻類之增殖之方面而言，較佳為同時進行光自營培養及異養培養之兩者。即，於上述培養步驟中，較佳為進行光異養培養。
作為於上述異養培養或光異養培養中所使用之有機營養素，較佳為採用可利用上述裸藻屬微型藻類之乙醇等醇、葡萄糖或果糖等單糖類等、或含有該等成分之廢棄物等。進而，就可更確實地促進上述裸藻屬微型藻類之增殖之方面而言，較佳為併用酵母或酵母分解物(以下，亦稱為酵母萃取物)作為有機營養素。
再者，作為包含上述各有機營養素之至少一部分者，可列舉：釀造酒、蒸餾酒、清酒粕、蒸餾酒粕、糖蜜、赤糖蜜等。並且，該等酒類等可作為有機營養素之供給源而用於異養培養或光異養培養。
上述釀造酒係利用酵母使包含糖分之原料進行酒精醱酵(Alcohol fermentation)而製造者，且係未實施蒸餾處理者。
上述釀造酒由於未進行蒸餾處理，含有由酵母所生成之酒精醱酵代謝物，因此除乙醇、水以外，亦含有酵母所產生之葡萄糖(Glucose)等糖類、蛋白質、胺基酸、維生素、磷、鉀等營養素。
作為上述釀造酒，可列舉：啤酒、清酒、葡萄酒、以穀物為原料之釀造酒、以豆類為原料之釀造酒、以薯類為原料之釀造酒、或以糖為原料之釀造酒等。
上述啤酒係藉由如下方法而製造者：利用麥芽內之酵素使至少麥芽中所含之澱粉糖化而產生糖分，進而利用啤酒酵母使該糖分進行酒精醱酵。即，只要為至少使用麥芽作為原料而如上所述般製造者，則即便為進而使用其他原料者，亦包含於本說明書中之啤酒中。
作為上述麥芽，通常可使用大麥之麥芽。
上述清酒(日本酒)係利用麹使米中所含之澱粉糖化而產生糖分，進而利用酵母使該糖分進行酒精醱酵而製造者。
上述葡萄酒係利用酵母使至少葡萄果汁進行酒精醱酵而製造者。
作為上述酵母，例如可列舉屬於酵母菌(Saccharomyces)屬者，具 體而言，可列舉釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等。
又，作為上述酵母，例如可列舉：所謂清酒酵母、所謂葡萄酒酵母、或所謂啤酒酵母等。
作為上述酵母分解物(酵母萃取物)，可列舉：藉由上述酵母進行自我分解而產生之酵母自我分解物、使酵母與熱水接觸並破壞細胞壁而成者、或利用酵素破壞酵母之細胞壁而成者等。
於上述培養步驟中，為了維持微型藻類之氧呼吸，可將包含氧之氣體供至培養液中。又，於上述培養步驟中，為了促進微型藻類之光合作用，可將包含二氧化碳之氣體供至培養液中。
該氣體之供給可藉由對培養液進行曝氣、攪拌培養液等而進行。
具體而言，於上述培養步驟中，為了對微型藻類供給呼吸用氧，例如可利用空氣對培養液進行曝氣。又，於上述培養步驟中，為了促進微型藻類之光合作用，例如可利用相對較多地包含二氧化碳之廢氣等對培養液進行曝氣。
於上述培養步驟中，較佳為一面藉由曝氣等於培養液中供給氧及二氧化碳，一面同時進行光自營培養及異養培養。即，於上述培養步驟中，為了促進微型藻類之氧呼吸及光合作用，較佳為一面藉由曝氣等將包含氧及二氧化碳之兩者之氣體供至培養液中，一面於有機營養素之存在下進行異養培養，且藉由照射光而進行光異養培養。
於上述培養步驟中，可藉由在白天等一面對微型藻類照射光一面於培養液中供給二氧化碳而促進微型藻類之光合作用。又，於夜晚等未照射光時，可於有機營養素之存在下於培養液中供給空氣而對微型藻類進行異養培養。
藉由以上述方式實施培養步驟，有如下優點：進一步促進微型藻類之增殖，並且，進一步促進由微型藻類所形成之綠裸藻糖之產生 等。
上述培養步驟中之培養溫度只要為微型藻類可進行增殖之溫度，則並無特別限定。作為該培養溫度(培養液之溫度)，具體而言，例如採用15℃~35℃，較佳為採用20℃~30℃。
上述培養步驟中之培養液之pH值只要為微型藻類可進行增殖之pH值，則並無特別限定。作為該pH值，例如採用2.5~5.5。
再者，為了調整培養液之pH值，可將如鹽酸之無機酸添加至培養液中，亦可將如乙酸之有機酸添加至培養液中。藉由將有機酸添加至培養液中，有微型藻類可利用該有機酸作為有機營養素進行增殖之優點。
又，為了調整培養液之pH值，亦可將鹼劑添加至培養液中。作為鹼劑，通常可使用氫氧化鈉或氫氧化鉀等。
於上述培養步驟中，為了使上述裸藻(Euglena)屬微型藻類產生蠟酯，可抑制對培養液之氧之供給。
具體而言，於上述培養步驟中，例如可藉由停止對培養液之曝氣、或將不含氧之惰性氣體等供至培養液中等，而於厭氧條件下培養微型藻類。
於上述培養步驟中，藉由在厭氧條件下進一步培養於細胞內儲存有綠裸藻糖等多糖類之微型藻類，裸藻屬微型藻類可將綠裸藻糖轉變為蠟酯並將該脂質儲存於細胞內。
於上述培養步驟中，就可進一步促進蠟酯之產生之方面而言，較佳為於厭氧條件下且未照射光之黑暗條件下培養微型藻類。
另一方面，於上述培養步驟中，為了使上述裸藻(Euglena)屬微型藻類產生蛋白質，可一面於培養液中供給氧，一面於包含氮之無機營養素或包含氮之有機營養素之存在下培養微型藻類。
於上述培養步驟中，藉由以上述方式培養微型藻類，可一面使 微型藻類增殖，一面使微型藻類產生多糖類、脂質或蛋白質等有機化合物並於微型藻類之細胞內儲存此種有機化合物。
又，於上述培養步驟中，藉由適當地調整培養條件，亦可使微型藻類產生上述有機化合物以外之色素、維生素C或維生素E等維生素類、蛋白質、次亞麻油酸、二十碳四烯酸，二十碳五烯酸等高度不飽和脂肪酸或飽和脂肪酸等脂肪酸等有機化合物。
並且，於細胞內儲存有該等有機化合物之微型藻類可用作能用於食品、醫藥品、飼料、化學處理品、或燃料等各種用途之生質。
作為上述多糖類，例如可列舉綠裸藻糖(β-1,3-葡聚糖)。綠裸藻糖係約700個葡萄糖鍵結而成者。
作為上述脂質，例如可列舉蠟酯。蠟酯係高級脂肪酸與高級醇進行酯鍵結而成者，作為蠟酯，例如可列舉C-14之脂肪酸與C-14之高級醇進行酯鍵結而成者。
再者，於本實施形態之多糖類之製造方法中，可進行與後述有機化合物之製造方法同樣之步驟。
繼而，對本發明之有機化合物之製造方法之一實施形態進行說明。
本實施形態之有機化合物之製造方法係藉由進行上述培養方法(培養步驟)，而以選自由多糖類、脂質、維生素C、維生素E、色素及蛋白質所組成之群中之至少1種作為有機化合物而製造者。
本實施形態之有機化合物之製造方法可發揮充分地獲得選自由多糖類、脂質、維生素C、維生素E、色素及蛋白質所組成之群中之至少1種有機化合物之效果。
其中，關於維生素C、維生素E、色素及蛋白質，可藉由進行多糖類之製造方法而與多糖類一同製造。
較佳為，本實施形態之有機化合物之製造方法具有上述培養步 驟、進而提高培養後之微型藻類之分量之濃縮步驟、及藉由進一步減少經過濃縮步驟之微型藻類之水分而將微型藻類乾燥之乾燥步驟。再者，於上述有機化合物之製造方法中，未必需要濃縮步驟或乾燥步驟。
上述濃縮步驟例如可藉由使用通常之濃縮裝置而進行。
作為上述濃縮裝置，具體而言，例如可列舉利用懸浮濃縮、重力濃縮、膜濃縮、帶式濃縮等增加微型藻類之分量而進行濃縮之裝置。又，作為上述濃縮裝置，為了進一步增加微型藻類之分量，可使用脫水裝置。
作為上述脫水裝置，具體而言，例如可列舉：真空脫水機、加壓脫水機(壓濾機)、帶式壓製機、螺旋壓力機、離心濃縮脫水機(螺旋離心機)、或多重圓盤脫水機等。
根據所製造之多糖類、脂質、蛋白質等之利用用途，上述濃縮步驟可僅藉由濃縮裝置而進行，亦可藉由濃縮裝置及脫水裝置之兩者而進行。
上述乾燥步驟例如可藉由將經過濃縮步驟之微型藻類加熱、或將經過濃縮步驟之微型藻類置於減壓下等而進行。
經過上述濃縮步驟之微型藻類、或經過乾燥步驟之微型藻類係可於細胞內含有多糖類、脂質、維生素C、維生素E、色素及蛋白質中之至少1種者，因此例如可直接用於食品等用途。
又，經過濃縮步驟之微型藻類、或經過上述乾燥步驟之微型藻類藉由視需要實施通常之萃取處理而將多糖類、脂質、維生素C、維生素E、色素及蛋白質中之至少1種以有機化合物之形式自微型藻類中提取。所提取之有機化合物例如可用於食品原料或燃料之用途。
作為上述萃取處理，例如採用利用乙醇或己烷等有機溶劑萃取上述有機化合物之萃取處理、或利用次臨界狀態之CO2溶劑萃取上述 脂質等之萃取處理等。
上述實施形態之裸藻屬微型藻類、多糖類之製造方法及有機化合物之製造方法係如上述所例示，但本發明並不限定於上述例示之裸藻屬微型藻類、多糖類之製造方法及有機化合物之製造方法。
又，可於不損及本發明之效果之範圍內採用通常之裸藻屬微型藻類、多糖類之製造方法及有機化合物之製造方法中所使用之各種態樣。
即，本發明並不限定於上述實施形態，可於本發明之所計劃之範圍內適當變更設計。又，本發明之作用效果亦並不限定於上述實施形態。
可認為，此次所揭示之實施形態之所有方面均為例示，並未加以限制。本發明之範圍並非藉由上述說明表示而係藉由申請專利範圍來表示。又，本發明之範圍包含與申請專利範圍均等之含義及範圍內之所有變更。
[實施例]
繼而，列舉實施例更詳細地說明本發明，但本發明並不限定於該等。
(裸藻屬微型藻類之提取及單離)
將自長崎縣之湖澤提取之湖水接種於AF-6培養基(後述)中，一面於室溫下照射螢光燈之光一面培養2個月。
利用微量吸管將培養後之培養基中之對象微型藻類單離。於AF-6培養基中，一面對經單離之微型藻類照射螢光燈之光，一面於室溫下進行培養。
(裸藻屬微型藻類之鑑定)
[鹼基序列之測定]
為了確認經單離之微型藻類為屬於裸藻屬之種類，進行下述操 作。
即，使用裸藻屬微型藻類18S rRNA基因專用引子組(Zakrys等人，2002,Journal of Phycology 38：1190-1199)並藉由DNA測序儀(Beckman Coulter公司製造之「CEQ8000」)而測定所培養之裸藻屬微型藻類之18S rRNA基因的鹼基序列。將所測定之鹼基序列示於序列表之序列編號1。
[鹼基序列之比較]
使用BLAST同源性檢索，將所測定之鹼基序列與自GenBank獲得之已知之裸藻屬微型藻類之18S rRNA基因的鹼基序列進行比較。又，對與已知之裸藻屬微型藻類之序列同源性之一致程度進行比較。將經單離之裸藻屬微型藻類之18S rRNA基因之鹼基序列與已知之裸藻屬微型藻類之18S rRNA基因之鹼基序列的比較表示於圖1。
又，使用分子系統樹製作軟體Mega5程式(Tamura等人，2011,Mol.Biol.Evol.28：2731-2739)，利用最佳方法製作分子系統樹。將該系統樹示於圖2。
其結果，確認如上所述般單離之微型藻類為屬於裸藻屬之種類(Euglena gracilis Klebs)。再者，圖2中之EOD-1株之Ka、Kb、Na及Nb係對單離之微型藻類之試驗樣品賦予之記號。使用任一試驗樣品均可獲得同樣之結果。
[RAPD解析]
進而，為了比較經單離之裸藻屬微型藻類與已知之裸藻屬微型藻類，藉由RAPD解析(Random Amplified Polymorphic DNA)(參考文獻：Williams等人，(1990)Nucleic Aids Res.18(22),6531-6535)而獲得經單離之裸藻屬微型藻類之譜帶與國立環境研究所保存株6株之譜帶。
RAPD解析中之PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈反應) 條件如下所述。
樣品數：3
引子1：AAATCGGGCTG：RAPD-6序列編號2
酵素：Ex Taq(TAKARA公司製造)
反應緩衝液量：50μL
DNA模板量：約0.5ng
PCR之溫度條件：如表1所示。詳細而言，於94℃下以1分鐘進行處理後，進行(94℃ 1分鐘、40℃ 45秒鐘、72℃ 1分鐘)×35次之重複處理，其後於72℃下處理7分鐘。
電泳條件：2.5質量%之瓊脂糖凝膠、100V、40分鐘
[RAPD解析中之比較對象株]
Euglena gracilis NIES-47
Euglena gracilis NIES-48
Euglena gracilis NIES-49
Euglena gracilis NIES-253
Euglena gracilis NIES-286
Euglena gracilis NIES-2149
進而，更換引子，以同樣之方式藉由PCR而進行RAPD解析。
引子2：ATCGGGTCCG：RAPD-4序列編號3
引子3：GCGATCCCCA：RAPD-3序列編號4 再者，上述引子2~4之鹼基序列係Mostafa等人於(2011)Molecules 16,2598-2608中所記載者。
將使用上述引子1進行RAPD解析之結果(譜帶)示於圖3A。又，將使用上述引子2及3進行RAPD解析之結果分別示於圖3B、圖3C。再者，圖3A~圖3C中之EOD-1株之Ka、Na分別與圖2中之Ka、Na對應。
根據RAPD解析之結果可知，如上所述般單離之裸藻屬微型藻類之譜帶與已知之裸藻屬微型藻類之譜帶不同。因此，判斷如上所述般單離之裸藻屬微型藻類為與已知之裸藻屬微型藻類不同之株。
並且，將如上所述般單離之裸藻屬微型藻類命名為纖細裸藻(Euglena gracilis)EOD-1株。
(裸藻屬微型藻類之培養)
為了培養裸藻屬微型藻類，準備下述者，於下述培養條件下進行培養步驟。
「本發明之裸藻屬微型藻類株」：
裸藻屬微型藻類(Euglena gracilis)EOD-1株
(寄存編號：FERM BP-11530)
(已寄存於獨立行政法人製品評價技術基盤機構專利生物寄存中心)
「已知之裸藻屬微型藻類株」：
裸藻屬微型藻類(Euglena gracilis)NIES-48株
(自獨立行政法人國立環境研究所微生物系統保存設施獲取)
「培養容器」：300~500mL燒瓶等，如下所述
「向培養液之氣體之供給」：130rpm之振盪
(藉由振盪培養液而於培養液中供給空氣)
「培養溫度」：28℃
「培養時間」：如下所述
「培養液之pH值」：如下所述
「用於培養之培養液中之成分」：
採用表2、表3所示之組成作為基本組成。
再者，表2所示之組成係於由獨立行政法人國立環境研究所微生物系統保存設施所揭示之「AF-6培養基」之組成中添加「P IV metals」培養基之組成(由獨立行政法人國立環境研究所微生物系統保存設施所揭示)之成分而成者。又，除培養液中所含之營養素以外，為水。
又，表3所示之組成係以Cramer-Myers培養基之組成為基礎者。
「微型藻類之培養前之初始重量」：0.78g/L(乾燥重量)
「有機營養素」：根據培養而適當變更下述者
．葡萄糖
．酵母萃取物(酵母自我分解物)-
製品名「Dried Yeast Extract D-3」日本製藥公司製造
．作為釀造酒之啤酒-市售之啤酒(麥芽之使用率為66.7%以上)
乙醇5體積%
實施例1~4、比較例1~4中，於黑暗條件下進行異養培養，除此以外之實施例及比較例中，進行光異養培養。將對微型藻類進行光異養培養時之培養條件之詳細情況示於以下。
「光照射條件」：12小時光照射後，置於黑暗處12小時
「光之強度」：光合作用光量子通量密度(PPFD)-約100μmol/m2．s或約200μmol/m2．s
(實施例1)
於500mL之長頸燒瓶中，添加表2所示之組合物200mL。進而，以葡萄糖成為15g/L之濃度、酵母萃取物成為5g/L之濃度之方式添加 葡萄糖及酵母萃取物。進而，藉由添加鹽酸而將pH值調整為4.0，從而製備培養液。
並且，於上述培養條件下且於黑暗條件下(即，異養培養條件下)振盪燒瓶，將裸藻屬微型藻類(Euglena gracilis)EOD-1株培養3天，藉此進行培養步驟。
(實施例2~4)
除以培養液中之葡萄糖濃度分別成為20g/L、25g/L、30g/L濃度之方式變更葡萄糖量之方面以外，以與實施例1同樣之方式進行培養步驟。
(比較例1)
除代替裸藻屬微型藻類(Euglena gracilis)EOD-1株而花費5天培養裸藻屬微型藻類(Euglena gracilis)NIES-48株之方面以外，以與實施例1同樣之方式進行培養步驟。
(比較例2~4)
除以培養液中之葡萄糖濃度分別成為20g/L、25g/L、30g/L濃度之方式變更葡萄糖量之方面以外，以與比較例1同樣之方式進行培養步驟。
分別測定各實施例及各比較例之進行培養步驟後之微型藻類之乾燥重量。又，藉由下述計算式而求出所添加之營養素之轉換率。
轉換率(%)=因培養而增加之藻之乾燥重量(g/L)/所消耗之葡萄糖濃度(g/L)
將各實施例及各比較例中之培養後之藻之乾燥重量與轉換率的結果示於圖4。
根據圖4理解，可認為裸藻屬微型藻類(Euglena gracilis)EOD-1株之生質產量高於已知之NIES-48株。
(實施例5)
除使用300ml之錐形瓶之方面、使用相對於表2所示之組合物50mL以源自啤酒之乙醇濃度成為2.5體積%之方式添加有啤酒之培養液之方面、未將酵母萃取物添加至培養液中之方面、重複12小時之光照射環境與12小時之黑暗環境而進行培養之方面、將培養時間設為7天之方面以外，以與實施例1同樣之方式培養裸藻屬微型藻類(Euglena gracilis)EOD-1株，藉此進行培養步驟。再者，將光合作用光量子通量密度(PPFD)設為約100μmol/m2．s。
(實施例6)
除以上述酵母萃取物濃度成為2g/L之方式將酵母萃取物添加至培養液中之方面以外，以與實施例5同樣之方式進行培養步驟。
(比較例5)
除代替裸藻屬微型藻類(Euglena gracilis)EOD-1株而培養裸藻屬微型藻類NIES-48株之方面以外，以與實施例5同樣之方式進行培養步驟。
(比較例6)
除以上述酵母萃取物濃度成為2g/L之方式將酵母萃取物添加至培養液中之方面以外，以與比較例5同樣之方式進行培養步驟。
一面進行實施例5、6、比較例5、6之培養步驟，一面分別測定培養1、2、3、4、5、7天後之微型藻類之乾燥重量。將其結果示於圖5。
根據圖5理解，可知裸藻屬微型藻類(Euglena gracilis)EOD-1株即便於光異養培養之條件下培養，亦具有高於已知之NIES-48株之生產性。
(實施例7~12)
除使用表3所示之組合物代替表2所示之組合物之方面、將將培養液之初始pH值分別變更為pH值5.5、pH值6.0、pH值7.0、pH值8.0、 pH值8.5或pH值9.0之方面、將培養時間變更為10天之方面以外，以與實施例5同樣之方式進行培養步驟。
一面進行實施例7~12之培養步驟，一面經時性地分別測定培養後之微型藻類之乾燥重量。將其結果示於圖6。
(實施例13~17)
除使用表3所示之組合物代替表2所示之組合物之方面、將光合作用光量子通量密度(PPFD)設為約200μmol/m2．s之方面、將培養液之初始pH值分別變更為pH值3.5、pH值4.0、pH值4.5、pH值5.0或PH值5.5之方面、將培養時間變更為10天之方面以外，以與實施例5同樣之方式進行培養步驟。
(實施例18、19)
除使用表3所示之組合物代替表2所示之組合物之方面、將培養液之初始pH值分別變更為pH值3.5或pH值5.5之方面、將培養時間變更為10天之方面以外，以與實施例5同樣之方式進行培養步驟。
一面進行實施例13~19之培養步驟，一面經時性地分別測定培養後之微型藻類之乾燥重量。將其結果示於圖7。
(實施例20)
除將培養時間設為7天之方面以外，以與實施例5同樣之方式培養裸藻屬微型藻類(Euglena gracilis)EOD-1株，藉此進行培養步驟。
再者，自培養開始至2天後，藉由振盪燒瓶而設為好氧條件下之培養，其後，停止振盪，供給惰性氣體(氮氣)，藉此設為厭氧條件下之培養。
(比較例7)
除代替裸藻屬微型藻類(Euglena gracilis)EOD-1株而培養裸藻屬微型藻類(Euglena gracilis)NIES-48株之方面以外，以與實施例20同樣之方式進行培養步驟。
再者，自培養開始至4天後，藉由振盪燒瓶而設為好氧條件下之培養，其後，停止振盪，供給惰性氣體(氮氣)，藉此設為厭氧條件下之培養。
每天測定由實施例20及比較例7之培養所產生之綠裸藻糖及脂質(蠟酯)之量。
培養後之綠裸藻糖量之測定係以下述順序進行。即，將培養後之微型藻類與培養液之混合物(40mL)添加至離心管中，進行離心分離。於離心分離後之沈澱物中添加純水而使其懸浮，再次重複2次離心分離之操作。然後，於離心分離後之沈澱物中添加少量純水而使其懸浮，將懸浮物冷凍乾燥。以上述方式去除培養液之成分。
繼而，於稱量過之離心管(成為空白值)中準確地稱取冷凍乾燥後之微型藻類之細胞400mg左右。添加丙酮而使其懸浮，去除離心分離後之上清液。重複5次左右利用丙酮之洗淨操作直至上清液之顏色消失。以上述方式去除微型藻類所產生之色素成分。
繼而，使用十二烷基硫酸鈉溶液，進行去除綠裸藻糖以外之成分之操作。即，於去除色素成分後之殘留成分中，添加1%之十二烷基硫酸鈉(SDS，Sodium Dodecyl Sulfonate)溶液20mL而使其懸浮後，於100℃下加熱10分鐘。然後，去除離心分離後之上清液。重複2次上述操作後，使用純水代替SDS溶液重複3次同樣之操作而將SDS洗淨去除。
最後，連同離心管一起放入至105℃之乾燥器內而將水分去除，測定添加有綠裸藻糖之離心管之重量。然後，根據與上述空白值之差而求出綠裸藻糖量。
另一方面，培養後之蠟酯量之測定係藉由BLIGHT-DYER法而進行。
實施例20及比較例7之培養中，將經時性地測定綠裸藻糖之量之 結果示於圖8A及圖8B。又，將經時性地測定脂質(蠟酯)之量之結果示於圖9A及圖9B。
根據圖8A及圖8B可理解，與先前之裸藻屬微型藻類(Euglena gracilis)NIES-48株相比，裸藻屬微型藻類(Euglena gracilis)EOD-1株之綠裸藻糖之產生速度快於NIES-48株。又，EOD-1株之每個細胞之綠裸藻糖含量約為55%以上，多於NIES-48株。
又，根據圖9A及圖9B可理解，裸藻屬微型藻類(Euglena gracilis)EOD-1株之脂質(蠟酯)之產生速度更快，且每個細胞之蠟酯含量於更短期間內變高。
進而，利用下述表4及表5所示之組成之培養基於下述培養條件下進行培養步驟。
(實施例21)
藉由光異養培養而將作為微型藻類之上述EOD-1株培養2天。
(比較例8)
藉由光異養培養而將作為微型藻類之上述NIES-48株培養2天。
採用於使Hutner之培養基改變者(以下亦稱為「改良Hutner培養基」)中添加有葡萄糖30g/L之培養基作為培養基。具體之組成如表4所示，又，除液體中所含之營養素以外，為水。使用具有下述表5之組成之含微量金屬之溶液作為表4中之含微量金屬的溶液。除微量金屬成分以外，為水。
培養方法之詳細情況如下所述。
「培養液」：藉由鹽酸而將pH值調整為4.0
「培養容器」：500mL長頸燒瓶
「培養前之添加」：將培養液200mL與培養前微型藻類收容於長頸燒瓶中
(由於合併了初始生質量，因此就EOD-1株而言合計為220mL， 就NIES-48株而言合計為236mL)
「培養時之溫度」：28℃
「培養時之明暗條件」：於遮光之黑暗條件下培養
「培養時之好氧條件」：於振盪機上安裝長頸燒瓶，以130rpm之往返振盪進行運轉，藉此於培養液中供給空氣
以與上述同樣之方式算出培養2天後之藻之乾燥重量(生質產量)與葡萄糖的轉換率。將結果示於表6。
根據表6可理解，與先前之裸藻屬微型藻類(Euglena gracilis)NIES-48株相比，裸藻屬微型藻類(Euglena gracilis)EOD-1株之生質生產能力更優異，又，具有更優異之葡萄糖轉換率。
[產業上之可利用性]
本發明之微型藻類、本發明之多糖類之製造方法及本發明之有機化合物之製造方法係藉由對綠裸藻糖等多糖類、蠟酯等脂質、蛋白質等有機化合物進行培養而獲得，故而可較佳地使用。
所獲得之有機化合物可於儲存於微型藻類之細胞內之狀態下或以利用萃取處理等進行提取之方式用於健康食品、醫藥品、飼料、化學處理品或燃料等用途。具體而言，作為藉由培養而儲存於微型藻類之細胞內之有機化合物之脂質例如係自細胞內提取而較佳地用作燃料的原料。
【生物材料寄存】
國內寄存資訊【請依寄存機構、日期、號碼順序註記】
1.食品工業發展研究所；103年07月07日；BCRC 980027
國外寄存資訊【請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記】
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<160> 4
<210> 1
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<213> 纖細裸藻
<400> 1
<210> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引子1之序列
<400> 2
<210> 3
<211> 10
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<223> 用於引子2之序列
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<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於引子3之序列
<400> 4

Claims (7)

  1. 一種裸藻屬微型藻類，其係纖細裸藻(Euglena gracilis)EOD-1株(寄存編號FERM BP-11530)或其變異株，且至少具有多糖類之產生能力。
  2. 一種多糖類之製造方法，其係藉由以如請求項1之裸藻屬微型藻類作為產生多糖類之生物進行培養而製造多糖類。
  3. 如請求項2之多糖類之製造方法，其中上述培養中所使用之培養液包含葡萄糖15~30g/L。
  4. 如請求項2或3之多糖類之製造方法，其中上述培養中所使用之培養液包含酵母分解物。
  5. 如請求項2至4中任一項之多糖類之製造方法，其中上述培養中所使用之培養液具有AF6培養基之組成。
  6. 如請求項2至5中任一項之多糖類之製造方法，其中上述多糖類為綠裸藻糖。
  7. 一種有機化合物之製造方法，其係藉由對如請求項1之裸藻屬微型藻類進行培養而製造選自由多糖類、脂質、維生素C、維生素E、色素及蛋白質所組成之群中之至少1種有機化合物。
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